JP2021530973A - Ａｔｘｎ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

本発明は、ＡＴＸＮ３タンパク質の発現を阻害することができる、ＡＴＸＮ３ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列に相補的なアンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチド（オリゴマー）に関する。ＡＴＸＮ３発現の阻害は、脊髄小脳失調症の治療に有益である。

Description

本発明は、ＡＴＸＮ３の発現を阻害することができる、ＡＴＸＮ３ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列に相補的なアンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチド（オリゴマー）に関する。ＡＴＸＮ３の発現の阻害は、脊髄小脳失調症３（マカド・ジョゼフ病（ＭＪＤ））などの、脊髄小脳失調症の治療に有益である。

マカド・ジョゼフ病（ＭＪＤ）としても知られている脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）は、９種類のポリグルタミン伸張病の１つであり、世界で最も共通している、優性遺伝の運動失調である。ＳＣＡ３におけるある種の症状は症候性治療法に応答し得るが、この、執拗に進行し致命的な神経変性病に対する効果的な治療は、依然として存在しない。この病気は、疾患タンパク質であるＡＴＸＮ３（Ａｔａｘｉｎ３）において、異常に長いポリグルタミン路をコードするＡＴＸＮ３遺伝子における、ＣＡＧ反復伸張により引き起こされる。毒性のＡｔａｘｉｎ−３タンパク質は、ＳＣＡ３患者の脳組織で頻繁に観察されるアグリゲートと関連している。

ＡＴＸＮ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、ヒト疾患の線維芽細胞と、完全長ヒト変異体ＡＴＸＮ３遺伝子を発現するマウスモデルとの両方において、病原性ＡＴＸＮ３タンパク質の量を低減することができることを、Ｍｏｏｒｅらは報告した（Ｍｏｏｒｅら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１７；７：２００−２１０）。したがって、ＡＳＯが媒介するＡＴＸＮ３の標的化が、ＳＣＡ３に対する治療アプローチとして提案された。

固定された核酸を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、作用強度を改善する潜在性を有するものの、動物において著しい毒性（肝毒性）を引き起こすことを、Ｓｗａｙｚｅら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００７；３５（２）：６８７−７００．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｄｅｃ １９）は報告する。

Ｔｏｏｎｅｎらはアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し、予想されるＡＴＸＮ３のエクソンスプライシングシグナルをマスクし、ＡＴＸＮ３ ｐｒｅ−ｍＲＮＡからスキップするエクソン１０をもたらした。エクソン１０をスキップすることにより、毒性ポリグルタミン伸張を欠きながら、ユビキチン結合および切断機能を保持する切頭Ａｔａｘｉｎ−３タンパク質の形成がもたらされた（Ｔｏｏｎｅｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２０１７，Ｖｏｌｕｍｅ ８：２３２−２４２）。

国際公開第２０１３／１３８３５３号、国際公開第２０１５／０１７６７５号、国際公開第２０１８／０８９８０５号、および国際公開第２０１９／２１７７０８号は、ＳＣＡ３の治療にて使用するための、ヒトＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドについて開示している。

発明の目的
本発明は、インビトロまたはインビボでのアンチセンス阻害のための、ＡＴＸＮ３転写物（ＡＴＸＮ３）の領域を同定し、ＡＴＸＮ３ ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの、これらの領域を標的とする、ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、脊髄小脳失調症の治療に有用なヒトＡＴＸＮ３を阻害するオリゴヌクレオチドを同定する。

発明の説明
本発明は、哺乳動物ＡＴＸＮ３（Ａｔａｘｉｎ３）標的核酸を標的とする、１０〜３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、哺乳動物ＡＴＸＮ３を発現する細胞内で哺乳動物ＡＴＸＮ３の発現を阻害することができる。

哺乳動物ＡＴＸＮ３標的核酸は例えば、ヒト、サル、またはマウスＡＴＸＮ３標的核酸であることができる。

本発明は、１０〜３０ヌクレオチド長のＬＮＡギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１に対して完全に相補性であるといった、少なくとも９０％相補性であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＡＴＸＮ３を発現する細胞内でヒトＡＴＸＮ３の発現を阻害することができる。

本発明は、表２、４、５、および６に示すオリゴヌクレオチド塩基配列からなる群から選択される連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＡＴＸＮ３を発現する細胞内で、ヒトＡＴＸＮ３の発現を阻害することができる）、または薬学的に許容されるその塩を提供する。

本発明は、表２、４、５、および６に示すオリゴヌクレオチド塩基配列からなる群から選択される連続ヌクレオチド配列を含むＬＮＡギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＬＮＡギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＡＴＸＮ３を発現する細胞内で、ヒトＡＴＸＮ３の発現を阻害することができる）、または薬学的に許容されるその塩を提供する。

本発明は、連続ヌクレオチド配列 配列番号１１２２を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＡＴＸＮ３を発現する細胞内でヒトＡＴＸＮ３の発現を阻害することができる）、または薬学的に許容されるその塩を提供する。

本発明は、連続ヌクレオチド配列 配列番号１８１３を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＡＴＸＮ３を発現する細胞内でヒトＡＴＸＮ３の発現を阻害することができる）、または薬学的に許容されるその塩を提供する。

本発明は、連続ヌクレオチド配列 配列番号１８１２を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＡＴＸＮ３を発現する細胞内でヒトＡＴＸＮ３の発現を阻害することができる）、または薬学的に許容されるその塩を提供する。

本発明は、連続ヌクレオチド配列 配列番号１８０９を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＡＴＸＮ３を発現する細胞内でヒトＡＴＸＮ３の発現を阻害することができる）、または薬学的に許容されるその塩を提供する。

本発明は、連続ヌクレオチド配列 配列番号１８０７を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＡＴＸＮ３を発現する細胞内でヒトＡＴＸＮ３の発現を阻害することができる）、または薬学的に許容されるその塩を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

本発明は、長さが１２〜２４、例えば１２〜１８ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表２、４、５、および６に示すオリゴヌクレオチド塩基配列から選択される配列に存在する、少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む連続ヌクレオチド配列を含む。

本発明は、長さが１２〜２４、例えば１２〜１８ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表２、４、５、および６に示すオリゴヌクレオチド塩基配列から選択される配列に存在する、少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含む連続ヌクレオチド配列を含む。

本発明は、長さが１２〜２４、例えば１２〜１８ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表２、４、５、および６に示すオリゴヌクレオチド塩基配列から選択される配列に存在する、少なくとも１４個の連続ヌクレオチドを含む連続ヌクレオチド配列を含む。

本発明は、長さが１２〜２４、例えば１２〜１８ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表２、４、５、および６に示すオリゴヌクレオチド塩基配列から選択される配列に存在する、少なくとも１６個の連続ヌクレオチドを含む連続ヌクレオチド配列を含む。

本発明は、長さが１２〜２４、例えば１２〜１８ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表２、４、５、および６に示すオリゴヌクレオチド塩基配列から選択される配列に存在する、連続ヌクレオチドを含む連続ヌクレオチド配列を含む。

本発明は、長さが１２〜２４、例えば１２〜１８ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４〜配列番号１０８９；配列番号１０９９〜１１２７；および配列番号１１３７〜１９８８；配列番号１０９９〜１１２７；および１１３７〜１９８８から選択される配列に存在する、少なくとも１０個の連続ヌクレオチドに１００％同一である連続ヌクレオチド配列を含む。

本発明は、長さが１２〜２４、例えば１２〜１８ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４〜配列番号１０８９；配列番号１０９９〜１１２７；および配列番号１１３７〜１９８８から選択される配列に存在する、少なくとも１２個の連続ヌクレオチドに１００％同一である連続ヌクレオチド配列を含む。

本発明は、長さが１２〜２４、例えば１２〜１８ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４〜配列番号１０８９；配列番号１０９９〜１１２７；および配列番号１１３７〜１９８８から選択される配列に存在する、少なくとも１４個の連続ヌクレオチドに１００％同一である連続ヌクレオチド配列を含む。

本発明は、長さが１２〜２４、例えば１２〜１８ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表２、４、５、および６に示すオリゴヌクレオチド塩基配列から選択される配列に存在する、少なくとも１６個の連続ヌクレオチドに１００％同一である連続ヌクレオチド配列を含む。

本発明は、長さが１２〜２４、例えば１２〜１８ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表２、４、５、および６に示すオリゴヌクレオチド塩基配列から選択される配列に１００％同一である連続ヌクレオチド配列を含む。

本発明は、本明細書にて開示したアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、１０９９＿１、１１００＿１、１１０１＿１、１１０２＿１、１１０３＿１、１１０４＿１、１１０５＿１、１１０６＿１、１１０７＿１、１１０８＿１、１１０９＿１、１１１０＿１、１１１１＿１、１１１２＿１、１１１３＿１、１１１４＿１、１１１５＿１、１１１６＿１、１１１７＿１、１１１８＿１、１１１９＿１、１１２０＿１、１１２１＿１、１１２２＿１、１１２３＿１、１１２４＿１、１１２５＿１、１１２６＿１、および１１２７＿１からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、本明細書にて開示したアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、実施例２における表に示す化合物からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、本明細書にて開示したアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、実施例３における表に示す化合物からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、本明細書にて開示したアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、実施例４における表に示す化合物からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、化合物番号１１２２＿６２、１１２２＿６７、１１２２＿３３、１８５６＿１、１８１３＿１、１８１２＿１、１８０９＿２、および１６０７＿１からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド、薬学的に許容されるその塩を提供する。

本発明は、式ＡＣＣｃａｔａｔｔｔｔａｃｔＣＴＴ（化合物番号１８５６＿１）のアンチセンスオリゴヌクレオチド（大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）、または薬学的に許容されるその塩を提供する。

本発明は、式ＣＴＧｔａｃａｃｔｔｔｔａｃａＴＴ（化合物番号１８１３＿１）のアンチセンスオリゴヌクレオチド（大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）、または薬学的に許容されるその塩を提供する。

本発明は、式ＴＧｔａｃａｃｔｔｔｔａｃａｔＴＣＣ（化合物番号１８１２＿１）のアンチセンスオリゴヌクレオチド（大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）、または薬学的に許容されるその塩を提供する。

本発明は、式ＧｔａｃａｃｔｔｔｔａｃａｔｔＣＣＣ（化合物番号１８０９＿２）のアンチセンスオリゴヌクレオチド（大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）、または薬学的に許容されるその塩を提供する。

本発明は、式ＴＴＣｔｔｃａｔｔａｔａｃｃａｔＣＡＡ（化合物番号１６０７＿１）のアンチセンスオリゴヌクレオチド（大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）、または薬学的に許容されるその塩を提供する。

本発明は、式ＡａｔＣｔＴａｔｔｔａｃａｔｃＴｔＣＣ（化合物番号１１２２＿６２）のアンチセンスオリゴヌクレオチド（大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）、または薬学的に許容されるその塩を提供する。

本発明は、式ＡＡＴＣｔｔａｔｔｔａｃａｔｃＴｔＣＣ（化合物番号１１２２＿６７）のアンチセンスオリゴヌクレオチド（大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）、または薬学的に許容されるその塩を提供する。

本発明は、式ＡａｔＣｔＴａｔｔｔａｃａｔｃｔＴＣＣ（化合物番号１１２２＿３３）のアンチセンスオリゴヌクレオチド（大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）、または薬学的に許容されるその塩を提供する。

本明細書にて、または本明細書の特許請求の範囲にて言及されている、本発明のオリゴヌクレオチドは、カリウム塩のナトリウムなどの、薬学的に許容される塩の形態であることができる。

本発明は、本発明に従ったオリゴヌクレオチド、および、上記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの抱合体部分、を含む抱合体を提供する。

本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドまたは抱合体、ならびに、薬学として許容される希釈剤、溶媒、担体、塩、および／またはアジュバントを含む、医薬組成物を提供する。

本発明は、ＡＴＸＮ３を発現する標的細胞におけるＡＴＸＮ３発現を調節するためのインビボまたはインビトロ法であって、上記方法が、有効量の、本発明のオリゴヌクレオチド、または抱合体、または医薬組成物を、上記細胞に投与することを含む、方法を提供する。

本発明は、治療的、または予防的有効量の、本発明のオリゴヌクレオチド、抱合体、または医薬組成物を、当該病気を患う、またはこれに感染しやすい対象に投与することを含む、病気の治療または予防方法を提供する。

いくつかの実施形態では、病気は、マカド・ジョゼフ病（ＭＪＤ）といった脊髄小脳失調症３などの、脊髄小脳失調症である。

本発明は、薬剤で使用するための、本発明のオリゴヌクレオチド、抱合体、または医薬組成物を提供する。

本発明は、マカド・ジョゼフ病（ＭＪＤ）といった脊髄小脳失調症３などの、脊髄小脳失調症の治療または予防に使用するための、本発明のオリゴヌクレオチド、抱合体、または医薬組成物を提供する。

本発明は、マカド・ジョゼフ病（ＭＪＤ）といった脊髄小脳失調症３などの、脊髄小脳失調症の治療または予防のための薬剤を調製するための、本発明のオリゴヌクレオチド、抱合体、または医薬組成物の使用を提供する。

化合物１１２２＿６７（配列番号１１２２）の図。 化合物１８１３＿１（配列番号１８１３）の図。 化合物１８５６＿１（配列番号１８５６）の図。 化合物１８１２＿１（配列番号１８１２）の図。 化合物１８０９＿２（配列番号１８０９）の図。 化合物１６０７＿１（配列番号１６０７）の図。 化合物１１２２＿６２（配列番号１１２２）の図。 化合物１１２２＿３３（配列番号１１２２）の図。 ２４時間のＳＶＰＤアッセイにおける、化合物１１２２＿６７および１８１３＿１、ならびに５種類の参照化合物の安定性。 Ａ）野生型Ａｔａｘｉｎ３（５５ｋＤａ）およびポリＱ延長Ａｔａｘｉｎ３（７７ｋＤａ）の減少を得るための、異なるＡＳＯで処理したＧＭ０６１５３細胞のＷＥＳ分析。Ｂ）ＨＰＲＴに対して正規化したバンド強度の分析。野生型Ａｔａｘｉｎ３は５５ｋＤａにおけるバンドにより表され、ポリＱ延長Ａｔａｘｉｎ３は７７ｋＤａにおけるバンドにより表される。細胞を、タンパク質分析の前に４日間、１０μＭのＡＳＯで処理した。データは、平均±ＳＤ、ＳＣ、スクランブル対照オリゴの３通りで、ＡＳＯで処理した細胞を示す。

化学図は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのプロトン化形態のものであり、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合内の硫黄原子上にある各水素は、独立して存在する、または不存在であることができると理解されよう。塩形態において、１つ以上の水素は例えば、カチオン、例えば金属カチオン（例えばナトリウムカチオンまたはカリウムカチオン）で置き換えることができる。

定義
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、当業者により一般的に理解されるように、２つ以上の共有結合ヌクレオシドを含む分子として定義される。そのような共有結合したヌクレオシドは、核酸分子またはオリゴマーと呼ばれることもあり得る。オリゴヌクレオチドは一般的に、固相化学合成、続いて精製により、実験室で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはその修飾が参照される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、典型的には精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むことができる。

アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは単鎖である。本発明の単鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部（ｉｎｔｒａ）または相互（ｉｎｔｅｒ）の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二重鎖）を形成できることが理解される。

連続ヌクレオチド配列
用語「連続ヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は本明細書で、用語「連続ヌクレオ塩基配列」、および、「モチーフ配列」ともまた呼ばれる、用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と同じ意味で用いられる。「モチーフ配列」は、「オリゴヌクレオチド塩基配列」と呼ばれることもまた可能である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｆ−Ｇ−Ｆ’ギャップマー領域などの、連続ヌクレオチド配列を含み、任意に更なるヌクレオチド、例えば、官能基を連続ヌクレオチド配列に結合するために使用され得る、ヌクレオチドリンカー領域を含むことができる。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。有利には、連続ヌクレオチド配列は、標的核酸に１００％相補性である。

ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチドおよび天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む。本来、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分および１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドに存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、「単位」または「モノマー」と互換的に称されてもよい。

修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される用語「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は、等価なＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと比較して、糖部分または（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。用語修飾ヌクレオシドはまた、用語「ヌクレオシド類似体」または修飾「単位」または修飾「モノマー」と互換的に使用されてもよい。非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの塩基領域における修飾を有するヌクレオシドは、それらがＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対合が可能であれば、依然として一般にＤＮＡまたはＲＮＡと称される。

修飾ヌクレオシド間結合
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者により理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシド間のホスホジエステル結合を形成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボ使用のためのオリゴヌクレオチドの安定化に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの領域、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、ならびに領域ＦおよびＦ’などの修飾ヌクレオシドの領域におけるヌクレアーゼ切断から保護する役割を果たし得る。

一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、ヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性のある、天然ホスホジエステルから改変した、１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることにより、またはヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えばヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を用いることにより決定することができ、これらの両方は当技術分野で周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を向上させることができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と称される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合が修飾され、例えばオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０または例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基、例えばコンジュゲートに結合するヌクレオシドは、ホスホジエステルであり得ることが認識されるであろう。

好ましい修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートである。

ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、そのヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態および製造の容易さのために特に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、例えばオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％または例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部がホスホロチオエートである。

ホスホロチオエート結合などのヌクレアーゼ耐性結合は、標的核酸と二重鎖を形成するときにヌクレアーゼを動員することができるオリゴヌクレオチド領域、例えばギャップマーの領域Ｇにおいて特に有用である。しかしながら、ホスホロチオエート結合は、非ヌクレアーゼ動員領域および／または親和性増強領域、例えばギャップマーの領域ＦおよびＦ’においても有用であり得る。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’、または領域ＦおよびＦ’の両方に１つ以上のホスホジエステル結合を含んでもよく、領域Ｇのヌクレオシド間結合は、完全にホスホロチオエートであり得る。

有利には、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列のすべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

欧州特許第２７４２１３５号に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステルおよびホスホロチオエート以外の）、例えばアルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間結合を含んでもよいことが認識され、これは欧州特許第２７４２１３５号によれば、例えば別のＤＮＡホスホロチオエートのギャップ領域内で耐性であり得る。

核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニンおよびグアニン）ならびにピリミジン（例えばウラシル、チミンおよびシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能性である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンと、天然に存在しない多様体との両方を指す。そのような変異体は、例えばＨｉｒａｏら（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１に記載されている。

いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを修飾プリンまたはピリミジン、例えば置換プリンまたは置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５−メチルシトシン、５−チアゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−ブロモウラシル５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、２’チオ−チミン、イノシン、ジアミノプリン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンから選択される核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅｄ）に変えることにより修飾される。

核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基の文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵにより示され、各文字は、等価な機能の修飾核酸塩基を場合により含み得る。例えば、例示のオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃおよび５−メチルシトシンから選択される。場合により、ＬＮＡギャップマーについて、５−メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。

修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つ以上の糖−修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを記述する。キメラオリゴヌクレオチドという用語は、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。

相補性
用語「相補性」は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの塩基対合の能力を記述する。Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対は、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）およびアデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば５−メチルシトシンは度々シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾および修飾核酸塩基の間のＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対合を包含することが理解されるであろう（例えばＨｉｒａｏら（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１を参照されたい）。

本明細書で使用する場合、用語「相補性割合」とは、個別の核酸分子（例えば、標的核酸または標的配列）の所与の位置における、ヌクレオチドの連続配列に相補性である（例えば、Ｗａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する）、所与の位置における、核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列の割合における、ヌクレオチドの数を意味する。百分率は、２つの配列間で対を形成する（標的配列５’−３’とオリゴヌクレオチド配列３’−５’を整列させたとき）、整列された塩基の数を数え、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。好ましくは、挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。

「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。

同一性
本明細書で使用される用語「同一性」は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば配列モチーフ）に同一である、核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性の百分率は、２つの配列（例えば、本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列および参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性の百分率＝（一致×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５−メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。

ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される用語「ハイブリダイズしている」または「ハイブリダイズする」は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸）が対向する鎖上の塩基対の間で水素結合を形成することにより二重鎖を形成するとして理解するべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、度々、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔ_ｍ）によって記述される。生理学的条件では、Ｔ_ｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：５１５−５３７）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝−ＲＴｌｎ（Ｋ_ｄ）によって反応の解離定数（Ｋ_ｄ）に関連付けられ、ここでＲは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映する。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃の反応に関連したエネルギーである。オリゴヌクレオチドの、標的核酸へのハイブリダイゼーションは自然反応であり、自然反応に対するΔＧ°は０未満である。ΔＧ°は例えば、Ｈａｎｓｅｎら，１９６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６−３８ ａｎｄ Ｈｏｌｄｇａｔｅら，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されているような、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法を使用して、実験により測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°は、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０−１４６５に記載されているように、Ｓｕｇｉｍｏｔｏら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１−１１２１６およびＭｃＴｉｇｕｅら，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８−５４０５に記載されている適切に誘導した熱力学パラメータを使用して、最近接モデル（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｏｄｅｌ）を用いることにより数値的に推定することもできる。ハイブリダイゼーションによってその意図された核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて−１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて−１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば−１５ｋｃａｌ未満、例えば−２０ｋｃａｌ未満、および例えば−２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、−１０〜−６０ｋｃａｌ、例えば−１２〜−４０、例えば−１５〜−３０ｋｃａｌまたは−１６〜−２７ｋｃａｌ、例えば−１８〜−２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。

標的核酸
本発明に従うと、標的核酸は、哺乳動物ＡＴＸＮ３タンパク質をコードする核酸であり、例えば遺伝子、ＡＴＸＮ３ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ配列であることができる。したがって、標的は、ＡＴＸＮ３標的核酸と称され得る。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１として本明細書において提供する、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列をコードするヒトＡＴＸＮ３遺伝子などの、ヒトＡＴＸＮ３タンパク質をコードする。したがって、標的核酸は配列番号１であることができる。

いくつかの実施形態では、標的核酸はマウスＡＴＸＮ３タンパク質をコードする。好適には、マウスＡＴＸＮ３タンパク質をコードする標的核酸は、配列番号３に示す配列を含む。

いくつかの実施形態では、標的核酸はカニクイザルＡＴＸＮ３タンパク質をコードする。好適には、カニクイザルＡＴＸＮ３タンパク質をコードする標的核酸は、配列番号２に示す配列を含む。

本発明のオリゴヌクレオチドを研究または診断に使用する場合、標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡに由来するｃＤＮＡまたは合成核酸であり得る。

インビボまたはインビトロ用途に関して、本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的には、ＡＴＸＮ３標的核酸を発現する細胞における、ＡＴＸＮ３標的核酸の発現を阻害することが可能である。本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、典型的には、オリゴヌクレオチドの長さにわたって測定して、場合により１つまたは２つのミスマッチを除いて、また場合により、オリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの任意の官能基に結合し得るヌクレオチドベースのリンカー領域、または他の非相補的末端ヌクレオチドを除いて、ＡＴＸＮ３標的核酸に相補的である。標的核酸は、メッセンジャーＲＮＡ、例えば、哺乳動物ＡＴＸＮ３タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡもしくはｐｒｅ−ｍＲＮＡ、例えば、ヒトＡＴＸＮ３ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列などのヒトＡＴＸＮ３、例えば、配列番号１として開示したもの、またはＡＴＸＮ３成熟ｍＲＮＡである。更に、標的核酸は、カニクイザルＡＴＸＮ３ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列、例えば配列番号１として開示したもの、または、カニクイザルＡＴＸＮ３成熟ｍＲＮＡであることができる。更に、標的核酸は、マウスＡＴＸＮ３ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列、例えば配列番号３として開示したもの、または、マウスＡＴＸＮ３成熟ｍＲＮＡであることができる。配列番号１〜３はＤＮＡ配列である。標的ＲＮＡ配列は、チミジン塩基（Ｔ）の代わりに、ウラシル（Ｕ）塩基を有することが理解されよう。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号１を標的とする。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号２を標的とする。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号３を標的とする。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号１および配列番号２を標的とする。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号１および配列番号３を標的とする。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号１、配列番号２、および配列番号３を標的とする。

標的配列
本明細書で使用される用語「標的配列」は、標的核酸に存在するヌクレオチドの配列を指し、これは本発明のオリコヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な標的核酸上の領域からなる。

本発明のオリゴヌクレオチドにより標的とされ得る、ヒトＡＴＸＮ３ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ（参照として配列番号１を使用する）の領域により定義される、様々な標的配列が、本明細書にて提供される。

いくつかの実施形態では、標的配列は、単一オリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドの好ましい領域を表し得る。

本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書で記載される標的配列などの、標的核酸のサブ配列といった、標的核酸に相補的な、またはハイブリダイズする、連続ヌクレオチド配列を含む。

オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に存在する標的配列に相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。連続ヌクレオチド配列（およびそれ故、標的配列）は、少なくとも１０個の連続ヌクレオチド、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個、例えば１２〜２５個、例えば１４〜１８個の連続ヌクレオチドを含む。

標的配列領域
一態様において、本発明は、１０〜３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の領域に少なくとも９０％相補性である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが相補性である配列番号１の領域を、標的配列領域と呼ぶ。

いくつかの実施形態では、標的配列領域はＡＡＧＡＧＴＡＡＡＡＴＡＴＧＧＧＴ（配列番号１０９３）である。

いくつかの実施形態では、標的配列領域はＧＡＡＴＧＴＡＡＡＡＧＴＧＴＡＣＡＧ（配列番号１０９４）である。

いくつかの実施形態では、標的配列領域はＧＧＡＡＴＧＴＡＡＡＡＧＴＧＴＡＣＡ（配列番号１０９５）である。

いくつかの実施形態では、標的配列領域はＧＧＧＡＡＴＧＴＡＡＡＡＧＴＧＴＡＣ（配列番号１０９６）である。

いくつかの実施形態では、標的配列領域はＴＴＧＡＴＧＧＴＡＴＡＡＴＧＡＡＧＡＡ（配列番号１０９７）である。

いくつかの実施形態では、標的配列領域はＧＧＡＡＧＡＴＧＴＡＡＡＴＡＡＧＡＴＴ（配列番号１０９８）である。

標的細胞
本明細書で使用される用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞は、インビボまたはインビトロであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞もしくはラット細胞、または霊長類細胞、例えばサル細胞（例えばカニクイザル細胞）もしくはヒト細胞である。

好ましい実施形態では、標的細胞は、ヒトＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ、例えばＡＴＸＮ３ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、例えば配列番号１、またはＡＴＸＮ３成熟ｍＲＮＡを発現する。いくつかの実施形態では、標的細胞はサルＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ、例えばＡＴＸＮ３ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、例えば配列番号２、またはＡＴＸＮ３成熟ｍＲＮＡを発現する。いくつかの実施形態では、標的細胞はマウスＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ、例えばＡＴＸＮ３ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、例えば配列番号３、またはＡＴＸＮ３成熟ｍＲＮＡを発現する。ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡのポリＡテールは、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化では無視される。

天然に存在する多様体
用語「天然に存在する多様体」は、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、例えば、同じアミノ酸をコードする多数のコドンを引き起こす遺伝コードの縮重のために、またはｐｒｅ−ｍＲＮＡの選択的スプライシング、または多型、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在に起因して異なり得るＡＴＸＮ３遺伝子または転写産物の多様体、および対立遺伝子多様体を指す。オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的な配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、したがって、標的核酸およびその天然に存在する変異体を標的とし得る。

ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＡＴＸＮ３遺伝子は、染色体組１４、９２０５８５５２．．９２１０６６２１（ＮＣ＿００００１４．９、遺伝子番号４２８７）に位置する。

いくつかの実施形態では、天然に存在する多様体は、哺乳動物ＡＴＸＮ３標的核酸、例えば配列番号１、２、および３からなる群から選択される標的核酸に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％または少なくとも９９％相同性を有する。いくつかの実施形態では、天然に存在する変異体は、配列番号１のヒトＡＴＸＮ３標的核酸に対して少なくとも９９％相同性を有する。

発現の調節
本明細書で使用する場合、用語「発現の調節」とは、オリゴヌクレオチドの投与前のＡＴＸＮ３またはＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの量と比較したときに、ＡＴＸＮ３タンパク質またはＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの量を変化させる、オリゴヌクレオチドの能力に関する全体的な用語と理解されるべきである。あるいは、発現の調節は、対照実験を参照することによって決定され得る。対照は、生理食塩水組成物で処理された個体もしくは標的細胞、または非標的化オリゴヌクレオチド（モック）で処理された個体もしくは標的細胞であると一般的に理解されている。

調節の１つのタイプは、例えばＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの分解または転写の遮断による、ＡＴＸＮ３の発現を阻害、ダウンレギュレート、低減、抑制、除去、停止、遮断、防止、減少、低下、回避または終了するオリゴヌクレオチドの能力である。

高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾されたヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、例えば、融解温度（Ｔ^ｍ）によって測定されるように、その相補的標的と対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５〜＋１２℃、より好ましくは＋１．５〜＋１０℃、最も好ましくは＋３〜＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野にて既知であり、例えば、多くの２’置換ヌクレオシドおよびロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９−４４４３ ａｎｄ Ｕｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３−２１３を参照されたい）。

糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、即ち、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。

リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが、親和性および／またはヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善することを主な目的として作製されている。

そのような修飾には、例えばヘキソース環（ＨＮＡ）または二環式環（典型的には、リボース環（ＬＮＡ）のＣ２とＣ４炭素の間にビラジカル架橋を有する）、または典型的にはＣ２とＣ３炭素の間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）または三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドには、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）の場合には、糖部分が非糖部分で置き換えられているヌクレオシド、またはモルホリノ核酸も含まれる。

糖修飾には、リボース環上の置換基を水素以外の基、またはＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシドに天然に存在する２’−ＯＨ基に変更することによる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’または５’位で導入され得る。

２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨまたは−ＯＨ以外の置換基を有し（２’置換ヌクレオシド）、または２’炭素とリボース環の第２の炭素との間に架橋を形成できる２’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’−４’バイラジカル架橋）である。

実際、２’置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、向上された結合親和性、および／または増大されたヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドに提供することができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡおよび２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドである。更なる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９−４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３−２１３、およびＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１９，９３７を参照。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの説明である。

本発明に関連して、２’置換は、ＬＮＡのような２’架橋分子を含まない。

ロックド核酸（ＬＮＡ）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、上記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’を結合するビラジカル（「２’−４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限または固定する。これらのヌクレオシドは、文献にて架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースのコンフォメーションの固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖安定化）に関連している。これはオリゴヌクレオチド／補完二重鎖の融解温度を測定することにより日常的に決定され得る。

非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９、Ｍｏｒｉｔａら．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３−７６，Ｓｅｔｈら．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ ７５（５）ｐｐ．１５６９−８１，ａｎｄ Ｍｉｔｓｕｏｋａら．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５−１２３８，ａｎｄ Ｗａｎ ａｎｄ Ｓｅｔｈ，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，５９，９６４５−９６６７に開示されている。

更なる非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、スキーム１に開示されている。
スキーム１：

特定のＬＮＡヌクレオシドは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、６’−メチル−β−Ｄ−オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）−６’−メチル−β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）およびＥＮＡである。

特定の有利なＬＮＡは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。

ＲＮａｓｅＨ活性および動員
アンチセンスアンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅＨ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二重鎖を形成するときにＲＮａｓｅ Ｈを動員するその能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するインビトロ方法を提供し、これはＲＮａｓｅＨを動員する能力の決定に使用され得る。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸が提供された場合、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定して、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーのみを含み、オリゴヌクレオチドの全モノマー間にホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドを使用し、また国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１〜９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期率の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％超を有する場合に、ＲＮａｓｅＨを動員することができると見なされる。ＲＨａｓｅ Ｈ活性の測定に使用するために、組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１がＬｕｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ，Ｌｕｃｅｒｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能である。

ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、ギャップマーであってもよい。アンチセンスギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅ媒介分解を介して標的核酸を阻害するのに使用される。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの区別される構造領域、５’−フランク、ギャップおよび３’−フランク、Ｆ−Ｇ−Ｆ’を５’−＞３’配向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨを動員するのを可能にする、連続ＤＮＡヌクレオチドの伸張を含む。ギャップ領域には、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’隣接領域（Ｆ）、および、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’隣接領域（Ｆ’）が隣接している。領域ＦおよびＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する（即ち、これは親和性増強糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、２’糖修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡおよび２’−ＭＯＥから独立して選択される、例えば高親和性２’糖修飾である。

ギャップマー設計において、ギャップ領域の最も５’および３’のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、各々、５’（Ｆ）または３’（Ｆ’）の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置されている。フランクはさらに、ギャップ領域から最も遠い端、即ち５’フランクの５’末端および３’フランクの３’末端に少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義されてもよい。

領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’は、連続ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、式Ｆ−Ｇ−Ｆ’のギャップマー領域を含んでもよい。

ギャップマー設計Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長は、例えば１２〜３２ヌクレオシド、例えば１３〜２４、例えば１４〜２２ヌクレオシド、例えば１４〜１７、例えば１６〜１８ヌクレオシドであってもよい。

例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ_１〜８−Ｇ_５〜１６−Ｆ’_１〜８、例えば
Ｆ_１〜８−Ｇ_７〜１６−Ｆ’_２〜８

ただし、ギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

領域Ｆ、ＧおよびＦ’は、さらに以下に定義され、Ｆ−Ｇ−Ｆ’式に組み込まれることができる。

ギャップマー−領域Ｇ
ギャップマーの領域Ｇ（ギャップ領域）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨ、例えばヒトＲＮａｓｅＨ１を動員することを可能にするヌクレオシド、典型的にはＤＮＡヌクレオシドの領域である。ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡとＲＮＡの間の二重鎖を認識し、ＲＮＡ分子を酵素的に切断する細胞酵素である。好適には、ギャップマーは、少なくとも５または６連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば５〜１６連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば６〜１５連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば７〜１４連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば８〜１２連続ＤＮＡヌクレオチド、例えば８〜１２連続ＤＮＡヌクレオチド長のギャップ領域（Ｇ）を有してもよい。ギャップ領域Ｇは、いくつかの実施形態では、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６連続ＤＮＡヌクレオシドからなっていてもよい。ギャップ領域内の１つ以上のシトシン（Ｃ）ＤＮＡは、いくつかの場合、メチル化（例えば、ＤＮＡ ｃにＤＮＡ ｇが続く場合）されてもよく、そのような残基は、５−メチル−シトシン（^ｍｅＣ）と注釈が付けられる。いくつかの実施形態では、ギャップ領域Ｇは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６連続ホスホロチオエート結合ＤＮＡヌクレオシドからなっていてもよい。いくつかの実施形態では、ギャップ内の全ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

従来のギャップマーはＤＮＡギャップ領域を有するが、ギャップ領域内で使用される場合にＲＮａｓｅＨ動員を可能にする修飾ヌクレオシドの多数の例が存在する。ギャップ領域に含まれるときにＲＮａｓｅＨを動員することが可能であると報告されている修飾ヌクレオシドとしては、例えば、α−Ｌ−ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ（ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３４９およびＶｅｓｔｅｒら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１８（２００８）２２９６−２３００（両方が参照により本明細書に組み込まれている）に記載されているもの）、ＡＮＡおよび２’ＦＡＮＡ（Ｍａｎｇｏｓら．２００３Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．１２５，６５４−６６１）などの、アラビノース由来のヌクレオシド、ＵＮＡ（非固定核酸）（Ｆｌｕｉｔｅｒら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９（参照により本明細書に組み込まれている）に記載されているもの）が挙げられる。ＵＮＡは、典型的には、リボースのＣ２とＣ３の間の結合が除去され、アンロックド「糖」残基を形成しているアンロックド核酸である。そのようなギャップマーに使用されている修飾ヌクレオシドは、ギャップ領域内に導入された際に２’エンド（ｅｎｄｏ）（ＤＮＡ様）構造を採択する（即ち、ＲＮａｓｅＨ動員を可能にする修飾）ヌクレオシドであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡギャップ領域（Ｇ）は、場合により、ギャップ領域内に導入された際に２’エンド（ｅｎｄｏ）（ＤＮＡ様）構造を採択する１〜３糖修飾ヌクレオシドを含んでもよい。

領域Ｇ−「ギャップブレーカー」
あるいは、いくつかのＲＮａｓｅＨ活性を保持しながら、ギャップマーのギャップ領域に３’エンドコンフォメーションを付与する修飾ヌクレオシドの挿入についての多くの報告が存在する。１つ以上の３’エンド修飾ヌクレオシドを含むギャップ領域を有するそのようなギャップマーは、「ギャップブレーカー」または「ギャップ破壊」ギャップマーと称される。例えば、国際公開第２０１３／０２２９８４号を参照されたい。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨ動員を可能にするために、ギャップ領域内にＤＮＡヌクレオシドの十分な領域を保持する。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチド設計がＲＮａｓｅＨを動員する能力は、典型的には、配列または化合物固有である−Ｒｕｋｏｖら．２０１５ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．４３ ｐｐ．８４７６−８４８７を参照されたい。これは、いくつかの場合、標的ＲＮＡのより特異的な切断を提供するＲＮａｓｅＨを動員する「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドを開示している。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で使用される修飾ヌクレオシドは、例えば、３’エンドコンフォメーションを付与する修飾ヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−メチル（ＯＭｅ）または２’−Ｏ−ＭＯＥ（ＭＯＥ）ヌクレオシド、またはβ−Ｄ ＬＮＡヌクレオシド（ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’の間の架橋が、βコンフォメーションである）、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドであってもよい。

上述した領域Ｇを含むギャップマーと同様に、ギャップブレーカーまたはギャップ破壊ギャップマーは、ギャップの５’末端に（領域Ｆの３’ヌクレオシドに隣接して）ＤＮＡヌクレオシドを有し、ギャップの３’末端に（領域Ｆの５’ヌクレオシドに隣接して）ＤＮＡヌクレオシドを有する。破壊ギャップを含むギャップマーは、典型的には、ギャップ領域の５’末端または３’末端のいずれかに少なくとも３または４連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を保持する。
ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドの例示的な設計は、
Ｆ_１〜８−［Ｄ_３〜４−Ｅ_１−Ｄ_３〜４］₋Ｆ’_１〜８
Ｆ_１〜８−［Ｄ_１〜４−Ｅ_１−Ｄ_３〜４］−Ｆ’_１〜８
Ｆ_１〜８−［Ｄ_３〜４−Ｅ_１−Ｄ_１〜４］−Ｆ’_１〜８

を含み、領域Ｇは、［Ｄ_ｎ−Ｅ_ｒ−Ｄ_ｍ］内であり、Ｄは、ＤＮＡヌクレオシドの連続配列であり、Ｅは、修飾ヌクレオシド（ギャップブレーカーまたはギャップ破壊ヌクレオシド）であり、ＦおよびＦ’は、本明細書に定義した隣接領域であるが、ただし、ギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

いくつかの実施形態では、ギャップ破壊ギャップマーの領域Ｇは、少なくとも６ＤＮＡヌクレオシド、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６ＤＮＡヌクレオシドを含む。上述したように、ＤＮＡヌクレオシドは連続であってもよく、場合により１つ以上の修飾ヌクレオシドが散在してもよいが、ただしギャップ領域Ｇは、ＲＮａｓｅＨ動員を媒介できることを条件とする。

ギャップマー−隣接領域、ＦおよびＦ’
領域Ｆは、領域Ｇの５’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆの最も３’のヌクレオシドは、高親和性糖修飾ヌクレオシドなどの糖修飾ヌクレオシド、例えば、ＭＯＥヌクレオシド、またはＬＮＡヌクレオシドなどの、２’置換ヌクレオシドである。

領域Ｆ’は、領域Ｇの３’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆ’の最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、またはＬＮＡヌクレオシドである。

領域Ｆは、１〜８連続ヌクレオチド長、例えば２〜６、例えば３〜４連続ヌクレオチド長である。有利には、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば２つの３’ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。

領域Ｆ’は、２〜８連続ヌクレオチド長、例えば３〜６、例えば４〜５連続ヌクレオチド長である。有利には、領域Ｆの最も３’の実施形態は、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば２つの３’ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。

領域ＦまたはＦ’の長さが１である場合、それはＬＮＡヌクレオシドであることに留意するべきである。

いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’は、独立して、糖修飾ヌクレオシドの連続配列からなる、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、領域Ｆの糖修飾ヌクレオシドは、独立して、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位および２’−フルオロ−ＡＮＡ単位から選択されてもよい。

いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’は、独立して、ＬＮＡおよび２’置換修飾ヌクレオシドの両方を含む（混合ウイング設計）。

いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’は、１種類のみの糖修飾ヌクレオシド、例えばＭＯＥのみ、またはβ−Ｄ−オキシＬＮＡのみ、またはＳｃＥＴのみからなる。このような設計は、均一フランクまたは均一ギャップマー設計とも称される。

いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’の全ヌクレオシド、またはＦおよびＦ’は、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡ、ＥＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択される、ＬＮＡヌクレオシドである。

いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’の全ヌクレシド、またはＦおよびＦ’は、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆは、１、２、３、４、５、６、７または８連続ＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態では、隣接領域の１つのみが、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドからなり得る。いくつかの実施形態では、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドからなるのは５’（Ｆ）隣接領域であり、一方、３’（Ｆ’）隣接領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドまたはｃＥＴヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドからなるのは３’（Ｆ’）隣接領域であり、一方、５’（Ｆ）隣接領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドまたはｃＥＴヌクレオシドを含む。

いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の全修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡ、ＥＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択される、ＬＮＡヌクレオシドであり、領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’は、場合によりＤＮＡヌクレオシドを含んでもよい（交互フランク、詳細にはこれらの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の全修飾ヌクレオシドがβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドであり、領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’は、場合によりＤＮＡヌクレオシドを含んでもよい（交互フランク、詳細にはこれらの定義を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の最も５’および最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えばβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドまたはＳｃＥＴヌクレオシドである。

いくつかの実施形態では、領域Ｆと領域Ｇの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｇの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、領域ＦまたはＦ’、ＦおよびＦ’の間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方のいずれかが、ＬＮＡヌクレオシドを含み、またはそれからなるギャップマーである。β−Ｄ−オキシギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方のいずれかが、β−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを含み、またはそれからなるギャップマーである。

いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］_１〜５−［領域Ｇ］−［ＬＮＡ］_１〜５のものであり、領域Ｇはギャップマー領域Ｇの定義に定義した通りである。

ＭＯＥギャップマー
ＭＯＥギャップマーは、領域ＦおよびＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施形態では、ＭＯＥギャップマーは、設計［ＭＯＥ］_１〜８−［領域Ｇ］−［ＭＯＥ］_１〜８、例えば［ＭＯＥ］_２〜７−［領域Ｇ］_５〜１６−［ＭＯＥ］_２〜７、例えば［ＭＯＥ］_３〜６−［領域Ｇ］−［ＭＯＥ］_３〜６のものであり領域Ｇはギャップマーの定義に定義した通りである。５−１０−５設計（ＭＯＥ−ＤＮＡ−ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当技術分野で広く使用されている。

混合ウイングギャップマー
混合ウイングギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、２’置換ヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位および２’−フルオロ−ＡＮＡ単位から独立して選択される２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドを含むＬＮＡギャップマーである。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。いくつかの混合ウイング実施形態では、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、１つ以上のＤＮＡヌクレオシドをさらに含んでもよい。

混合ウイングギャップマー設計は、国際公開第２００８／０４９０８５号および国際公開第２０１２／１０９３９５号（これらの両方は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

交互フランクギャップマー
交互フランクを有するオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡギャップマーオリコヌクレオチドであり、フランクの少なくとも一方（ＦまたはＦ’）が、ＬＮＡヌクレオシドに加えてＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’、または両領域ＦおよびＦ’は、ＬＮＡヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施形態では、隣接領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’の両方は、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆおよび／またはＦ’領域の最も５’および３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。

いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’、または両領域ＦおよびＦ’は、ＬＮＡヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施形態では、隣接領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’の両方は、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、ＦまたはＦ’領域の最も５’および３’のヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドであり、領域ＦまたはＦ’（または領域ＦまたはＦ’の両方）の最も５’および３’のヌクレオシド間に位置する少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシドが存在する。

オリゴヌクレオチドにおける領域Ｄ’またはＤ’’
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーＦ−Ｇ−Ｆ’、ならびにさらに５’および／または３’ヌクレオシドを含み、またはそれからなり得る。更なる５’および／または３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であってもよく、または完全に相補的でなくてもよい。このような更なる５’および／または３’ヌクレオシドは、本明細書で領域Ｄ’およびＤ’’と称され得る。

領域Ｄ’またはＤ’’の追加は、連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーを抱合体部分または他の官能基に連結することを目的として用いられ得る。連続ヌクレオチド配列を抱合体部分に連結するのに使用される場合、生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る。あるいは、それはエキソヌクレアーゼ保護を提供するために、または合成もしくは製造を容易にするために使用され得る。

領域Ｄ’およびＤ’’は、各々、領域Ｆの５’末端または領域Ｆ’の３’末端に結合されて、以下の式
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’または
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’の設計を生成することができる。この場合、Ｆ−Ｇ−Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ’またはＤ’’は、オリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。

領域Ｄ’またはＤ’’は、独立して、１、２、３、４または５個の追加のヌクレオチドを含み、またはそれからなり、標的核酸に相補的であっても、または相補的でなくてもよい。ＦまたはＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチドではなく、例えばＤＮＡまたはＲＮＡまたはこれらの塩基修飾バージョンである。Ｄ’およびＤ’’領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る（リンカーの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、追加の５’および／または３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で連結され、ＤＮＡまたはＲＮＡである。領域Ｄ’およびＤ’’としての使用に好適なヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これは例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを含む。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能なリンカーの使用は、国際公開第２０１５／１１３９２２号に開示されており、それらは複数のアンチセンス構築物（例えば、ギャップマー領域）を単一のオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。

一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’および／またはＤ’’を含む。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ−Ｇ−Ｆ’；特にＦ_１〜８−Ｇ_５〜１６−Ｆ’_２〜８
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、特にＤ’_１−３−Ｆ_１〜８−Ｇ_５〜１６−Ｆ’_２〜８
Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’、特にＦ_１〜８−Ｇ_５〜１６−Ｆ’_２〜８−Ｄ’’_１〜３
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’、特にＤ’_１〜３−Ｆ_１〜８−Ｇ_５〜１６−Ｆ’_２〜８−Ｄ’’_１〜３

いくつかの実施形態では、領域Ｄ’と領域Ｆの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｄ’’の間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。

抱合体
本明細書で使用される抱合体という用語は、非ヌクレオチド部分に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す（抱合体部分または領域Ｃまたは第３の領域）。

１つ以上の非ヌクレオチド部分に対する本発明のオリゴヌクレオチドの抱合体化は、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取り込み、または安定性に影響を及ぼすことにより、オリゴヌクレオチドの薬理学を改善することができる。いくつかの実施形態では、抱合体部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、浸透性、および／または細胞取り込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を調節または向上させる。特に、抱合体は、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織または細胞型に標的化し、それにより、その器官、組織または細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性を増強し得る。同時に、コンジュゲートは、非標的細胞型、組織または器官内のオリゴヌクレオチドの活性を低下させるのに役立ち得る（例えば、非標的細胞型、組織または器官内のオフ標的活性または活性）。

一実施形態では、非ヌクレオチド部分（抱合体部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、キャプシド）またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。

リンカー
リンケージまたはリンカーは、１つ以上の共有結合を介して、対象の化学基またはセグメントを別の化学基またはセグメントに連結する２つの原子間の接続である。抱合体部分は、直接または連結部分（例えば、リンカーまたはテザー）を介してオリゴヌクレオチドに付着させることができる。リンカーは、第３の領域、例えば抱合体部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えばオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列またはギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’（領域Ａ）に共有結合する役割を果たす。

本発明のいくつかの実施形態では、本発明の抱合体またはオリゴヌクレオチド抱合体は、場合により、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列（領域Ａまたは第１の領域）の間に位置するリンカー領域（第２の領域または領域Ｂおよび／または領域Ｙ）と、抱合体部分（領域Ｃまたは第３の領域）とを含み得る。

領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常遭遇するまたは遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含み、またはそれからなる生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化のしくは還元条件または薬剤などの化学条件、および哺乳動物細胞で見られるまたは遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素または加水分解酵素またはヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。ＤＮＡホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号（参照により本明細書に組み込まれる）により詳細に記載されている−本明細書の領域Ｄ’またはＤ’’も参照されたい。

領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主に抱合体部分（領域Ｃまたは第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａまたは第１の領域）に共有結合させるのに役立つリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位またはアミノアルキル基などの反復単位の鎖構造またはオリゴマーを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチド抱合体は、以下の局所要素Ａ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｙ−Ｃ、Ａ−Ｙ−Ｂ−ＣまたはＡ−Ｙ−Ｃから構築することができる。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６〜Ｃ１２アミノアルキル基を含むＣ２〜Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。好ましい実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。

治療
本明細書で使用される用語「治療」は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患または障害）の治療、または疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、即ち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される治療は、いくつかの実施形態では、予防的であり得ることが認識されるであろう。

発明の詳細な説明
本発明は、ＡＴＸＮ３発現を標的とする、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドに関する。

ＡＴＸＮ３を標的とする本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３標的核酸を発現する細胞内で、ＡＴＸＮ３標的核酸にハイブリダイズし、ＡＴＸＮ３標的核酸の発現を阻害することができる。

ＡＴＸＮ３標的核酸は、ヒト、マウス、またはサルＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍＲＮＡなどの、哺乳動物ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍＲＮＡであることができる。いくつかの実施形態では、ＡＴＸＮ３標的核酸は、ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍＲＮＡ、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００４９９３．５（配列番号１）により例示される、染色体１４におけるＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ａｔａｘｉｎ３（ＡＴＸＮ３）、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅに由来するｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡである。

ヒトＡＴＸＮ３ ｐｒｅ−ｍＲＮＡは、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ染色体１４のＮＣ＿００００１４．９（９２０５８５５２．．９２１０６６２１、補体）にてコードされる。遺伝子ＩＤ＝４２８７（ＡＴＸＮ３）。

本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸を発現する細胞における、ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ、例えばＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ（例えばヒト、サル、またはマウス細胞）といった、ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ標的核酸の発現を阻害することができる。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸を発現する細胞におけるＡＴＸＮ３標的核酸の発現を阻害し、細胞内でのＡＴＸＮ３標的核酸（例えばｍＲＮＡ）の発現レベルと比較して、ＡＴＸＮ３標的核酸（例えばｍＲＮＡ）の量を、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％阻害で低減することができる。好適には、細胞は、ヒト細胞、サル細胞、およびマウス細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞はＳＫ−Ｎ−ＡＳ、Ａ４３１、ＮＣＩ−Ｈ２３、またはＡＲＰＥ１９細胞である（これらの細胞についての更なる上方については、実施例を参照のこと）。実施例１は、標的核酸の発現を阻害する、本発明のオリゴヌクレオチドの能力を評価するための好適なアッセイを提供する。好適には、標的核酸の発現を阻害する化合物の能力の評価は、例えば、実施例１に従うように、剥脱インビトロアッセイなど、インビトロで実施される。

本発明の一態様は、配列番号１、２、または３に完全に相補的といった、少なくとも９０％の相補性を有する、１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドギャップマーなどの、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜３０ヌクレオチドの連続配列を含み、これは標的核酸または標的配列の領域と少なくとも９０％相補的、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または１００％相補的である。好適な標的核酸の配列は、本明細書の上で記載されている。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１２〜２４、例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３連続ヌクレオチド長の、連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列は、上の「標的配列領域」セクションで提供されている配列を有する標的核酸に完全に相補性である。

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２〜１５、例えば、１３、または１４、１５連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列は、上の「標的配列領域」セクションで提供されている配列を有する標的核酸に完全に相補性である。

典型的には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡギャップマー、混合ウイングギャップマー、または代替の隣接ギャップマーなどのギャップマーである。

いくつかの実施形態では、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１６〜配列番号１２８１からなる群から選択される配列を有する標的核酸に完全に相補性である、少なくとも１０個の連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１２個の連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１３個の連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１４個の連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１５個の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、２０未満のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、１２〜２４ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、１２〜２２ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、１２〜２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、１２〜１８ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、１２〜１６ヌクレオチド長である。

有利には、いくつかの実施形態において、連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は全て、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は標的核酸に、完全に相補性である。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ−３’の連続ヌクレオチド配列を含むギャップマーオリゴヌクレオチドであり、領域ＦおよびＦ’は独立して、１〜８個の糖修飾ヌクレオシドを含み、Ｇは、ＲＮａｓｅＨを動員することができる、５〜１６ヌクレオシドの領域である。

いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の糖修飾ヌクレオシドは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡ、およびＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される。

いくつかの実施形態では、領域Ｇは５〜１６個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含む。

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドなどのギャップマーオリゴヌクレオチドである。

いくつかの実施形態では、ＬＮＡヌクレオシドはβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドである。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列間のヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

本発明の好ましい配列モチーフおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを表２、および実施例に示す。

オリゴヌクレオチド化合物は、モチーフ配列の特定の設計を表す。典型的には、大文字は、β−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、ＬＮＡのＣは全て５−メチルシトシンであり、５−メチルＤＮＡのシトシンは全て、「ｅ」または^ｍｃで表され、ヌクレオシド間結合は全て、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

設計とは、ギャップマー設計の「Ｆ−Ｇ−Ｆ’」を意味し、各数字は、連続した修飾ヌクレオシド、例えば２’修飾ヌクレオシドの数を表し（最初の数＝５’隣接）、それにＤＮＡヌクレオシドの数が続き（２つ目の数＝ギャップ領域）、それに修飾ヌクレオシド、例えば２’修飾ヌクレオシドの数が続き（３つ目の数＝３’隣接）、任意に、ＤＮＡおよびＬＮＡの更なる繰り返し領域が先行する、または後に続き、これらは必ずしも、標的核酸に相補的な連続ヌクレオチド配列の一部ではない。

モチーフ配列は、オリゴヌクレオチド塩基配列とも呼ばれる、オリゴヌクレオチドに存在する、ヌクレオ塩基の連続配列を表す。

本発明は、長さが１２〜２４、例えば１２〜１８ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４〜配列番号１０８９；配列番号１０９９〜１１２７；および配列番号１１３７〜１９８８から選択される配列に存在する、少なくとも１２個、例えば少なくとも１４個、例えば少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む、連続ヌクレオチド配列を含む。

本明細書において提供するアンチセンスオリゴヌクレオチドは典型的には、配列番号４〜１０８９から選択される連続ヌクレオチド配列を含む、またはこれからなる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４〜１０８９から選択される連続ヌクレオチド配列を含む、またはこれからなるＬＮＡギャップマーである。

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４〜１０８９から選択されるヌクレオチド配列を含む、またはこれからなる。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４〜１０８９から選択される連続ヌクレオチド配列を含む、またはこれからなるＬＮＡギャップマーである。好ましい化合物は上記表２に掲載している。コラム「オリゴヌクレオチド化合物」を参照のこと。

本発明は、長さが１２〜２４、例えば１２〜１８ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１１９０〜配列番号１１３６から選択される配列に存在する、少なくとも１２個、例えば少なくとも１４個、例えば少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む、連続ヌクレオチド配列を含む。

本発明は、長さが１２〜２４、例えば１２〜１８ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１１９０〜配列番号１１３６から選択される配列に存在する、少なくとも１２個、例えば少なくとも１４個、例えば少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む、連続ヌクレオチド配列を含む。

本明細書において提供するアンチセンスオリゴヌクレオチドは典型的には、配列番号１１９０〜１１３６から選択される連続ヌクレオチド配列を含む、またはこれからなる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１１９０〜１１３６から選択される連続ヌクレオチド配列を含む、またはこれからなるＬＮＡギャップマーである。

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１１９０〜１１３６から選択されるヌクレオチド配列を含む、またはこれからなる。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番１１９０〜１１３６から選択される連続ヌクレオチド配列を含む、またはこれからなるＬＮＡギャップマーである。本発明の例示的なオリゴヌクレオチドに関しては、実施例を参照のこと。

本発明は、長さが１２〜２４、例えば１２〜１８ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１１３７〜配列番号１９８８から選択される配列に存在する、少なくとも１２個、例えば少なくとも１４個、例えば少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む、連続ヌクレオチド配列を含む。

本明細書において提供するアンチセンスオリゴヌクレオチドは典型的には、配列番号配列番号１１３７〜配列番号１９８８から選択される連続ヌクレオチド配列を含む、またはこれからなる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１１３７〜１９８８から選択される連続ヌクレオチド配列を含む、またはこれからなるＬＮＡギャップマーである。

いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１１３７〜１９８８から選択されるヌクレオチド配列を含む、またはこれからなる。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番１１３７〜１９８８から選択される連続ヌクレオチド配列を含む、またはこれからなるＬＮＡギャップマーである。本発明の例示的なオリゴヌクレオチドに関しては、実施例を参照のこと。

いくつかの実施形態では、本発明は、Ａｔａｘｉｎ３（例えばヒトＡｔａｘｉｎ３）を発現する細胞において、Ａｔａｘｉｎ３の発現を阻害することができるオリゴマー化合物に関し、オリゴマー化合物は、４〜１９８８からなる群から選択される配列に存在するヌクレオ塩基の連続配列に同一である、少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、Ａｔａｘｉｎ３（例えばヒトＡｔａｘｉｎ３）を発現する細胞において、Ａｔａｘｉｎ３の発現を阻害することができるオリゴマー化合物に関し、オリゴマー化合物は、４〜１９８８からなる群から選択される配列に存在するヌクレオ塩基の連続配列に同一である、少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、Ａｔａｘｉｎ３（例えばヒトＡｔａｘｉｎ３）を発現する細胞において、Ａｔａｘｉｎ３の発現を阻害することができるオリゴマー化合物に関し、オリゴマー化合物は、４〜１９８８からなる群から選択される配列に存在するヌクレオ塩基の連続配列に同一である、少なくとも１４個の連続ヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、Ａｔａｘｉｎ３（例えばヒトＡｔａｘｉｎ３）を発現する細胞において、Ａｔａｘｉｎ３の発現を阻害することができるオリゴマー化合物に関し、オリゴマー化合物は、４〜１９８８からなる群から選択される配列に存在するヌクレオ塩基の連続配列に同一である、少なくとも１６個の連続ヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、Ａｔａｘｉｎ３（例えばヒトＡｔａｘｉｎ３）を発現する細胞において、Ａｔａｘｉｎ３の発現を阻害することができるオリゴマー化合物に関し、オリゴマー化合物は、４〜１９８８からなる群から選択される配列に示すヌクレオ塩基の連続配列に同一である、連続ヌクレオチドを含む。

本発明は、コラム「オリゴヌクレオチド化合物」における表２に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、大文字はＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオシド配列中のヌクレオシド間結合は全て、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。任意に、ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであることができる。任意に、ＤＮＡシトシンは５−メチルシトシンであることができる。任意に、ウラシルを、チミン塩基の代わりに使用することができる。

本発明は、コラム「オリゴヌクレオチド化合物」における表２に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオシド配列中のヌクレオシド間結合は全て、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。任意に、ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであることができる。任意に、ＤＮＡシトシンは５−メチルシトシンであることができる。

本発明は、コラム「オリゴヌクレオチド化合物」における表２に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、大文字はＳｃＥＴ ＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオシド配列中のヌクレオシド間結合は全て、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。任意に、ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであることができる。任意に、ＤＮＡシトシンは５−メチルシトシンであることができる。

本発明は、コラム「オリゴヌクレオチド化合物」における表２に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオシドであり、ＬＮＡシトシンは全て５−メチルシトシンであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、連続ヌクレオシド配列中のヌクレオシド間結合は全て、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、任意に、ＤＮＡシトシンは５−メチルシトシンであることができる。

本発明は、コラム「オリゴヌクレオチド化合物」における表２に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、大文字はＳｃＥＴ ＬＮＡヌクレオシドであり、ＬＮＡシトシンは全て５−メチルシトシンであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、連続ヌクレオシド配列中のヌクレオシド間結合は全て、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、任意に、ＤＮＡシトシンは５−メチルシトシンであることができる。
製造方法

更なる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチドからなる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホラミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１５４，ｐａｇｅｓ ２８７−３１３を参照のこと）。更なる実施形態では、この方法は、連続ヌクレオチド配列を抱合体化部分（リガンド）と反応させて、抱合体部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることを更に含む。更なる態様では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは結合オリゴヌクレオチドを薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩および／またはアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造する方法が提供される。

医薬組成物
更なる態様では、本発明は、前述のオリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその塩のいずれかと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩および／またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。

更なる態様では、本発明は、前述のオリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその塩のいずれかと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。

薬学的に許容される希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５０〜３００μＭ溶液の濃度で薬学的に許容される希釈剤中で使用される。

本発明による化合物は、それらの薬学的に許容される塩の形態で存在し得る。「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生物学的有効性および特性を保持し、適切な非毒性の有機もしくは無機酸または有機もしくは無機塩基から形成される従来の酸付加塩または塩基付加塩を指す。酸付加塩には、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸および硝酸などの無機酸に由来するもの、ならびにｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸などの有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、および第四級アンモニウム水酸化物、例えばテトラメチルアンモニウム水酸化物から誘導されるものが含まれる。医薬化合物の塩への化学修飾は、化合物の物理的および化学的安定性、吸湿性、流動性、および溶解性を向上させるために、薬剤師によく知られている手法である。これは例えば、Ｂａｓｔｉｎ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０００，４，４２７−４３５ ｏｒ ｉｎ Ａｎｓｅｌ，Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，６ｔｈ ｅｄ．（１９９５），ｐｐ．１９６ ａｎｄ １４５６−１４５７に記載されている。例えば、本明細書で提供される化合物の薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩であり得る。

本発明での使用に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５に見られる。薬物送達の方法の簡単なレビューについては、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３，１９９０）を参照のこと。国際公開第２００７／０３１０９１号は、薬学的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントのさらに適切で好ましい例を提供する（参照により本明細書に組み込まれる）。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療薬との組み合わせ、プロドラッグ製剤もまた、国際公開第２００７／０３１０９１号に提供されている。

本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、医薬組成物または製剤の調製のために、薬学的に許容される活性または不活性物質と混合されてもよい。医薬組成物の調製のための組成物および方法は、限定されるものではないが、投与経路、疾患の程度、または投与される用量を含む多くの基準に依存する。

これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装するか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には３〜１１、より好ましくは５〜９または６〜８、最も好ましくは７〜８、例えば７〜７．５であろう。得られた固体形態の組成物は、錠剤またはカプセルの密封パッケージなどのように、各々が上記の薬剤または薬剤群の固定量を含む複数の単回用量単位で包装することができる。固体形態の組成物はまた、局所適用可能なクリームまたは軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブなどの柔軟な量の容器に包装することもできる。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートはプロドラッグである。特にオリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達されると、コンジュゲート部分はオリゴヌクレオチドから切断される。

用途
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療および予防のための研究試薬として利用され得る。

研究では、そのようなオリゴヌクレオチドを使用して、細胞（例えば、インビトロ細胞培養物）および実験動物におけるＡＴＸＮ３タンパク質の合成を特異的に調節し、それによって標的の機能分析または治療的介入の標的としてのその有用性の評価を促進することができる。典型的には、標的調節は、タンパク質を生成するｍＲＮＡを分解または阻害し、それによりタンパク質形成を防止することによって、またはタンパク質を生成する遺伝子もしくはｍＲＮＡのモジュレーターを分解もしくは阻害することによって達成される。

本発明のオリゴヌクレオチドを研究または診断に使用する場合、標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡに由来するｃＤＮＡまたは合成核酸であり得る。

本発明は、ＡＴＸＮ３を発現している標的細胞におけるＡＴＸＮ３発現を調節するためのインビボまたはインビトロ方法を提供し、上記方法は、本発明のオリゴヌクレオチドを上記細胞に有効量で投与することを含む。

いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、哺乳動物の組織の一部を形成するインビトロ細胞培養物またはインビボ細胞であってよい。

診断では、オリゴヌクレオチドを使用して、ノーザンブロッティング、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは同様の技術により、細胞および組織におけるＡＴＸＮ３発現を検出および定量することができる。
治療のための、ＡＴＸＮ３の発現を調節することにより治療可能な、病気または疾患を有することが疑われる動物またはヒト

本発明は、治療的または予防的に有効な量の本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド抱合体、または医薬組成物を、疾患に苦しむまたは罹り易い対象に投与することを含む、疾患の治療または予防方法を提供する。

本発明はまた、医薬として使用するための、本明細書で定義されるオリゴヌクレオチド、組成物または抱合体に関する。

本発明によるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド抱合体または医薬組成物は、典型的には有効量で投与される。

本発明はまた、本明細書で言及される障害の治療のための医薬の製造のため、または本明細書で言及される障害の治療の方法のために記載される本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用を提供する。

本明細書で言及される疾患または障害は、ＡＴＸＮ３の発現に関連している。いくつかの実施形態では、病気または疾患は、ＡＴＸＮ３遺伝子内の変異と関連し得る。したがって、いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＡＴＸＮ３配列の変異形態である。

本発明の方法は、好ましくは、ＡＴＸＮ３の異常な量および／または活性によって引き起こされる疾患の治療または予防のために使用される。

本発明はさらに、ＡＴＸＮ３の異常な量および／または活性を治療するための医薬を製造するための、本明細書で定義されるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物の使用に関する。

一実施形態において、本発明は、脊髄小脳失調症の治療に使用するための、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド抱合体、または医薬組成物に関する。

投与
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、経口投与することができる。更なる実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、局所または経腸または非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、または髄腔内）投与することができる。

好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉注射または注入、髄腔内または頭蓋内、例えば脳内または心室内、硝子体内投与を含む、非経口経路により投与される。一実施形態において、活性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド抱合体は、静脈内投与される。別の実施形態では、活性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド抱合体は、皮下投与される。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド抱合体、または医薬組成物は、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２５〜５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与は、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、または更に月に１回であることができる。

併用療法
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド抱合体または医薬組成物は、別の治療剤との併用治療で使用するためのものである。治療剤は、例えば、上記の病気または疾患の標準的な治療であり得る。

更なる実施形態
以下の更なる実施形態を、明細書または特許請求の範囲の他の箇所で記載した実施形態と組み合わせることができる。

１．１０〜３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列（連続ヌクレオチド配列が、配列番号１に対して完全に相補性であるといった、少なくとも９０％相補性であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＡＴＸＮ３を発現する細胞内でヒトＡＴＸＮ３の発現を阻害することができる）を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。

２．連続ヌクレオチド配列が、７２１〜７６５；７８６〜８２０；１０１２〜１０３８；１０４０〜１０８０；１１８６〜１２１３；２８７０〜２９１５；２９４４〜２９８８；３１６８〜３２０６；３２１０〜３２５７；３４６２〜３４９３；３８８０〜３９０６；３９０８〜３９７７；４０９４〜４１２８；４１７３〜４２０３；５０９８〜５１７７；５５３８〜５５６０；５６９０〜５７４９；６４０７〜６４５０；７４０１〜７４３４；７４３６〜７５２１；８６０９〜８６３７；８６３６〜８６７６；８６９３〜８７１５；９３９１〜９４１４；１０９４３〜１１０３０；１１５４３〜１１５６３；１１９４２〜１１９６７；１２１７５〜１２２０４；１２２０６〜１２２２９；１２２５４〜１２３２４；１２３２７〜１２３６４；１２６８２〜１２７０８；１２７３９〜１２７５８；１３１２７〜１３１９７；１３２８９〜１３４１２；１３９９０〜１４０３１；１４０４１〜１４１１３；１４１１５〜１４１３８；１４２５７〜１４２８８；１４５７０〜１４６１２；１５７７８〜１５８０５；１５８１３〜１５８４８；１５８５０〜１５９００；１６０６９〜１６１１５；１６１８７〜１６２２９；１６４９４〜１６５２７；１６８３４〜１６８５２；１６９１０〜１６９５６；１８０１２〜１８０５１；１８６１５〜１８６５０；１９０８５〜１９１３５；２０２１４〜２０２４１；２０５５４〜２０５９９；２２０７３〜２２０９６；２２２５１〜２２２９２；２２４２２〜２２４４７；２３１９６〜２３２２８；２３６１６〜２３６３７；２４０７１〜２４１３２；２４２１７〜２４３８３；２４４８６〜２４５４１；２４５８６〜２４６１５；２４７３９〜２４７７８；２４８４８〜２４８８８；２４９７５〜２４９９５；２５０２６〜２５１１７；２５４９９〜２５５４０；２７０８１〜２７２３３；２７７７１〜２７８１０；２７９２７〜２７９５３；２９２９７〜２９３２３；２９３３６〜２９４４５；３０７０５〜３０７９２；３１００６〜３１１１１；３２０５７〜３２０９０；３３４２０〜３３４７０；３３７９２〜３３８１７；３３９６３〜３４００２；３４０５０〜３４０７３；３４０７５〜３４１０３；３４５２３〜３４５７０；３５３０２〜３５３７８；３６３２２〜３６３５７；３６４６１〜３６５００；３６７８６〜３６８２０；３６８２２〜３６８６２；３８８４８〜３８８８５；４００５９〜４００９１；４０１４９〜４０２２８；４０３６５〜４０３９９；４１６５５〜４１６８４；４１６９９〜４１７２０；４１７７３〜４１７９９；４２１４５〜４２２１８；４３８２６〜４３８６８；４５４８８〜４５５０８；４７３７１〜４７４１７；４８０６１〜４８１１７；４８８９４〜４８９２４；４８９５９〜４８９９６；５００７６〜５０１１２；５１００８〜５１０３１；５１８２６〜５１８９２；５３２３９〜５３３０１；５３６８８〜５３７１９；５３９３１〜５３９６７；５４５５０〜５４６１０；５５２１８〜５５２５８；５５２６９〜５５２９９；５５４９４〜５５５１４からなる群から選択される、配列番号１の領域に完全に相補性である、実施形態１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。

３．連続ヌクレオチド配列が、４３〜１０１；７２１〜７３６；７８６〜８０８；１６８２〜１６９８；１６８２〜１７００；１６８８〜１７０３；１６８８〜１７０２；１７８７〜１８０１；１８３２〜１８４６；２２５９〜２２７３；４２９６〜４３１０；４３９７〜４４１１；４４０２〜４４１７；４５９３〜４６１１；４５９８〜４６１２；４６０１〜４６１５；５０３１〜５０４６；５２６４〜５２７８；５５６４〜５５７８；６５４７〜６５６７；６６７６〜６６９０；７０５６〜７０７３；９０７８〜９０９２；９０７８〜９０９３；９０７９〜９０９３；９０８０〜９０９４；９７８１〜９８０６；９８３８〜９８５４；９８５７〜９８７２；９８９６〜９９１１；９９４０〜９９５６；９９７７〜９９９２；９９７７〜９９９３；９９８７〜１０００３；１０１１０〜１０１２４；１０４８０〜１０５１０；１２３３０〜１２３４４；１２６６０〜１２６７７；１２６６０〜１２６７６；１２６６１〜１２６７７；１２７８７〜１２８０４；１２８０６〜１２８５２；１２８６９〜１２８８４；１２９１７〜１２９３１；１３３１７〜１３３３３；１３３３５〜１３３６３；１３５７８〜１３５９２；１５６６０〜１５６７６；１７８０３〜１７８２４；１７８４１〜１７８５７；１７８６８〜１７８８４；１８５４１〜１８５５６；２３３５８〜２３３７９；２３４３４〜２３４４８；２３４５０〜２３４６９；２３６１７〜２３６３２；２３８４３〜２３８５９；２３９４６〜２３９６１；２４３３８〜２４３５２；２５２８１〜２５２９６；２５６３４〜２５６７４；２７１４６〜２７１６３；２７１８２〜２７２２２；２７４１５〜２７４３４；２７４１５〜２７４２９；２７５００〜２７５１７；２８２３９〜２８２５３；２８２４４〜２８２５８；３０１５８〜３０１７２；３２７７６〜３２７９０；３４９４６〜３４９６５；３５１１０〜３５１２４；３５３３１〜３５３４５；３５５８８〜３５６０２；３５５９７〜３５６１２；４０００９〜４００２３；４２２３９〜４２２６７；４３５７０〜４３５８５；４３７８９〜４３８０３；４３８７０〜４３８８４；４５３８１〜４５３９７；４７７３６〜４７７５０；４７７５８〜４７７７４；４８０１３〜４８０３５；４８０３７〜４８０５３；４９３３７〜４９３５３；５０６５３〜５０６６８；５０６５６〜５０６７０；５１４２４〜５１４３８；５６０４９〜５６０６３；および６１３３３〜６１３４８からなる群から選択される、配列番号１の領域に完全に相補性である、実施形態１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。

４．連続ヌクレオチド配列が、７４３〜７６０；２９６９〜２９８７；４１７５〜４１９１；５１３１〜５１４８；７４３６〜７４５３；９３９５〜９４１４；１２７４２〜１２７５８；１４５７２〜１４５９０；１６１８８〜１６２０７；１６９２４〜１６９４０；１８６３０〜１８６４７；２２０７４〜２２０９２；２３２０４〜２３２２１；２４５０９〜２４５２８；２７１００〜２７１１９；３０１１５〜３０１３２；３２０５９〜３２０７８；３４０７５〜３４０９３；３５３１０〜３５３２９；３６４７０〜３６４８９；３８８５３〜３８８７１；４０１５８〜４０１７７；４１７７７〜４１７９４；４８９０５〜４８９２３；５１８６６〜５１８８２；および５３９４９〜５３９６５からなる群から選択される、配列番号１の領域に完全に相補性である少なくとも８個または少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの領域を含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。

５．連続ヌクレオチド配列が、７４３〜７６０；２９６９〜２９８７；４１７５〜４１９１；５１３１〜５１４８；７４３６〜７４５３；９３９５〜９４１４；１２７４２〜１２７５８；１４５７２〜１４５９０；１６１８８〜１６２０７；１６９２４〜１６９４０；１８６３０〜１８６４７；２２０７４〜２２０９２；２３２０４〜２３２２１；２４５０９〜２４５２８；２７１００〜２７１１９；３０１１５〜３０１３２；３２０５９〜３２０７８；３４０７５〜３４０９３；３５３１０〜３５３２９；３６４７０〜３６４８９；３８８５３〜３８８７１；４０１５８〜４０１７７；４１７７７〜４１７９４；４８９０５〜４８９２３；５１８６６〜５１８８２；および５３９４９〜５３９６５からなる群から選択される、配列番号１の領域に完全に相補性である少なくとも１２個または少なくとも１４個の連続ヌクレオチドの領域を含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。

６．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’の連続ヌクレオチド配列を含むギャップマーオリゴヌクレオチドであり、領域ＦおよびＦ’が独立して、１〜８個の糖修飾ヌクレオシドを含み、Ｇが、ＲＮａｓｅＨを動員することができる、５〜１６ヌクレオシドの領域である、実施形態１〜５のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。

７．領域ＦおよびＦ’の糖修飾ヌクレオシドが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡ、およびＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される、実施形態６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。

８．領域Ｇが、５〜１６個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含む、実施形態５または６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。

９．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドなどのギャップマーオリゴヌクレオチドである、実施形態１〜８のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。

１０．ＬＮＡヌクレオシドがβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドである、実施形態５〜９のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。

１１．連続ヌクレオチド配列間のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。

１２．オリゴヌクレオチドが、配列番号４〜配列番号１０８９；配列番号１０９９〜１１２７；および配列番号１１３７〜１９８８からなる群から選択される連続ヌクレオチド配列を含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。

１３．オリゴヌクレオチドが、表２に示すオリゴヌクレオチド化合物から選択されるオリゴヌクレオチド化合物であり、大文字はＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表す、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。

１４．オリゴヌクレオチドが、表２に示すオリゴヌクレオチド化合物から選択されるオリゴヌクレオチド化合物であり、大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、または薬剤としてのその塩である、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。

１５．化合物が、化合物１０９９＿１、１１００＿１、１１０１＿１、１１０２＿１、１１０３＿１、１１０４＿１、１１０５＿１、１１０６＿１、１１０７＿１、１１０８＿１、１１０９＿１、１１１０＿１、１１１１＿１、１１１２＿１、１１１３＿１、１１１４＿１、１１１５＿１、１１１６＿１、１１１７＿１、１１１８＿１、１１１９＿１、１１２０＿１、１１２１＿１、１１２２＿１、１１２３＿１、１１２４＿１、１１２５＿１、１１２６＿１、および１１２７＿１、または、実施例２、３、もしくは４における表に示すオリゴヌクレオチド化合物からなる群から選択される、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬剤としてのその塩。

１６．実施形態１〜１５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド、および、上記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの抱合体部分、を含む抱合体、または薬学的に許容されるその塩。

１７．実施形態１〜１５に記載のオリゴヌクレオチド、または、実施形態１６に記載の抱合体、ならびに、薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩、および／もしくはアジュバントを含む、医薬組成物。

１８．ＡＴＸＮ３を発現する標的細胞におけるＡＴＸＮ３発現を調節するためのインビボまたはインビトロ法であって、有効量の、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドもしくは塩、実施形態１６に記載の抱合体、または、実施形態１７に記載の医薬組成物を、上記細胞に投与することを含む、方法。

１９．病気の治療または予防方法であって、治療的、または予防的有効量の、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドもしくは塩、または、実施形態１６に記載の抱合体、または実施形態１７に記載の医薬組成物を、当該病気を患う、またはそれに罹りやすい対象に投与することを含む、方法。

２０．病気が、マカド・ジョゼフ病（ＭＪＤ）といった脊髄小脳失調症３などの、脊髄小脳失調症である、実施形態１９に記載の方法。

２１．薬剤で使用するための、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドもしくは塩、または実施形態１６に記載の抱合体、または実施形態１７に記載の医薬組成物。

２２．マカド・ジョゼフ病（ＭＪＤ）といった脊髄小脳失調症３などの、脊髄小脳失調症の治療または予防に使用するための、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドもしくは塩、または実施形態１６に記載の抱合体、または実施形態１５に記載の医薬組成物。

２３．マカド・ジョゼフ病（ＭＪＤ）といった脊髄小脳失調症３などの、脊髄小脳失調症の治療または予防のための薬剤の調製のための、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドもしくは塩、または実施形態１６に記載の抱合体、または実施形態１７に記載の医薬組成物の使用。

材料および方法
オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド合成は、当技術分野で一般に知られている。以下は、適用できるプロトコルである。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用する装置、支持体および濃度に関してわずかに異なる方法によって生成されている場合がある。

オリゴヌクレオチドは、Ｏｌｉｇｏｍａｋｅｒ ４８のホスホラミダイトアプローチを１μｍｏｌスケールで使用して、ウリジンユニバーサル支持体上で合成される。合成の最後に、水性アンモニアを使用して６０℃で５〜１６時間、オリゴヌクレオチドを固相支持体から切断する。オリゴヌクレオチドは、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により、または固相抽出により精製され、ＵＰＬＣにより特性決定され、分子量がＥＳＩ−ＭＳにより、更に確認される。

オリゴヌクレオチドの伸長：
β−シアノエチル−ホスホルアミダイトのカップリング（ＤＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ−Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｔ、ＬＮＡ−５−メチル−Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ｇ（ｄｍｆ）、またはＬＮＡ−Ｔ）は、アセトニトリル中の０．１Ｍの５’−Ｏ−ＤＭＴ保護アミダイトおよびアセトニトリル（０．２５Ｍ）中のＤＣＩ（４，５−ジシアノイミダゾール）の溶液を使用して行われる。

ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製：
粗化合物は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ １０μ １５０ｘ１０ｍｍカラムでの取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製される。０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ８）およびアセトニトリルを５ｍＬ／分の流速で緩衝液として使用する。収集された画分は凍結乾燥されて、精製された化合物が典型的には白色固体として得られる。

略語：
ＤＣＩ：４，５−ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’−ジメトキシトリチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー

Ｔ_ｍアッセイ
オリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的（リン酸結合、ＰＯ）二重鎖は、５００ｍｌのＲＮａｓｅフリー水で３ｍＭに希釈され、５００ｍｌの２ｘＴ_ｍバッファー（２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭリン酸、ｐＨ７．０）と混合される。この溶液を９５℃で３分間加熱した後、室温で３０分間アニールする。デュプレックス融解温度（Ｔ_ｍ）は、ＰＥ Ｔｅｍｐｌａｂソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、Ｐｅｌｔｉｅｒ温度プログラマーＰＴＰ６を装着した、Ｌａｍｂｄａ ４０ ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計にて測定される。温度を２０℃から９５℃に上昇させ、次いで２５℃に低下させ、２６０ｎｍで吸収を記録する。一次導関数と、融解およびアニーリングの両方の極大値を使用して、二重鎖Ｔ_ｍを評価する。

細胞株

※全ての培地および添加剤は、他に記述がない限り、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入する。

実施例１ ２５および５μＭにおける、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、Ａ４３１、ＮＣＩ−Ｈ２３、およびＡＲＰＥ１９細胞株での、ＬＮＡオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性の試験
配列番号１を標的とする、表２のＬＮＡオリゴヌクレオチド（ＣＭＰ番号：４＿１〜１０８９＿１、コラム「オリゴヌクレオチド化合物」を参照のこと）を使用して、ヒト細胞株において、オリゴヌクレオチドスクリーンを実施する。ヒト細胞株のＳＫ−Ｎ−ＡＳ、Ａ３４１、ＮＣＩ−Ｈ２３、およびＡＲＰＥ１９は、表３に記載の供給業者から購入し、５％ ＣＯ_２で３７℃にて、加湿したインキュベーター内で、供給元により推奨される方法で維持する。スクリーニングアッセイのために、細胞を、供給元により推奨される培地内で９６マルチウェルプレートに播種する（材料および方法セクションの、表３を参照のこと）。１ウェル当たりの細胞数は、各細胞株に対して最適化される（材料および方法セクションの、表３を参照のこと）。

（ＰＢＳに溶解させた）５または２５μｍの濃度にてオリゴヌクレオチドの添加前に、細胞を０〜２４時間の間でインキュベートする。オリゴヌクレオチドを添加した３〜４日後に、細胞を回収する（各細胞株に対するインキュベーション時間は、材料および方法セクションにおける表３にて、示されている）。

メーカーの指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ９６キット（７４１８２）を使用して、ＲＮＡを抽出する。ｑＳｃｒｉｐｔ ＸＬＴワンステップＲＴ−ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ Ｌｏｗ ＲＯＸ、９５１３４−１００（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲを実施する。ＶＩＣ標識したＧＵＳＢ対照と共に、複数の反応において、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＦＡＭ標識ＴａｑＭａｎアッセイを使用して、標的転写量を定量化する。対象のＡＴＸＮ３（以下を参照）、およびハウスキーピング遺伝子ＧＵＳＢ（４３２６３２０Ｅ ＶＩＣ−ＭＧＢプローブ）の標的転写物に対する、ＴａｑＭａｎプライマーアッセイ。

ＡＴＸＮ３プライマーアッセイ（アッセイ番号：Ｎ／Ａ アイテム名 Ｈｓ．ＰＴ．５８．３９３５５０４９）：
フォワードプライマー：ＧＴＴＴＣＴＡＡＡＧＡＣＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＣ（配列番号１１２８）
リバース：ＣＴＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＣＡＴＣＣ（配列番号１１２９）
プローブ：５６−ＦＡＭ／ＡＡＡＧＧＣＣＡＧ／ＺＥＮ／ＣＣＡＣＣＡＧＴＴＣＡＧＧ／３ＩＡＢｋＦＱ／（配列番号１１３０）

相対的なＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ発現量を、対照（ＰＢＳ処理細胞）の割合として測定する。即ち、値が小さいほど、阻害は大きい。

実施例２：ＡＴＮＸ３を標的とする、更なるＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドを使用する、ＳＫ−Ｎ−ＡＳヒト細胞株における、ＡＴＸＮ３のインビトロ低減。
ヒトＡＴＸＮ３を標的とするＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの、ＥＣＡＣＣカタログ：９４０９２３０２から入手したヒトＳＫ−Ｎ−ＡＳ神経芽細胞腫細胞における、ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ発現の低減能力を試験した。０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）およびウシ胎児血清を補充して、終濃度を１０％にした、ダルベッコ改変イーグル培地にて、供給業者のガイドラインに従い、細胞を培養した。細胞を３７℃、５％ ＣＯ２、および９５％湿度にて、活性蒸発インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｃ１０）内で培養した。１９０μＬのＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞培養培地にて、ウェルあたり９０００ｃｅｌｌｓ（９６ウェルプレート）の密度にて、細胞を播種した。この後、細胞に１０μＬのオリゴ懸濁液またはＰＢＳ（対照）を添加し、予め作製した９６ウェル希釈プレートから、５μＭの終濃度にした。細胞培養皿を、インキュベーター内で７２時間インキュベートした。

インキュベーション後、培地を除去して細胞を回収した後細胞溶解し、メーカーのプロトコルに従って、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ ９６ Ｋｉｔ（ｃａｔ ７４１８１）を使用してＲＮＡ精製を行った。ワンステップｑＰＣＲ反応の前に、ＲＮＡを水で２倍に希釈した。ワンステップｑＰＣＲ反応のために、ｑＰＣＲ−ｍｉｘ（ＱｕａｎｔａＢｉｏ製の、ｑＳｃｒｉｐｔＴＭ ＸＬＴ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）Ｌｏｗ ＲＯＸ、カタログ番号９５１３４−５００）およびＱＰＣＲを、ＡＴＸＮ３（Ｈｓ．ＰＴ．５８．３９３５５０４９）およびＴＢＰ（Ｈｓ．ＰＴ．５８ｖ．３９８５８７７４）用の一体化ＤＮＡ技術からのアッセイを使用して、デュプレックスＱＰＣＲとして実行した。

Ｈｓ．ＰＴ．５８．３９３５５０４９−プライマー配列
プローブ：５’−／５６−ＦＡＭ／ＡＡＡＧＧＣＣＡＧ／ＺＥＮ／ＣＣＡＣＣＡＧＴＴＣＡＧＧ／３ＩＡＢｋＦＱ／−３’（配列番号１１３０）
プライマー１：５’−ＣＴＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＣＡＴＣＣ−３’（配列番号１１２９）
プライマー２：５’−ＧＴＴＴＣＴＡＡＡＧＡＣＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＣ−３’（配列番号１１２８）
Ｈｓ．ＰＴ．５８ｖ．３９８５８７７４−プライマー配列
プローブ：５’−／５ＨＥＸ／ＴＧＡ ＴＣＴ ＴＴＧ／ＺＥＮ／ＣＡＧ ＴＧＡ ＣＣＣ ＡＧＣ ＡＴＣ Ａ／３ＩＡＢｋＦＱ／−３’（配列番号１１３１）
プライマー１：５’−ＧＣＴ ＧＴＴ ＴＡＡ ＣＴＴ ＣＧＣ ＴＴＣ ＣＧ−３’（配列番号１１３２）
プライマー２：５’−ＣＡＧ ＣＡＡ ＣＴＴ ＣＣＴ ＣＡＡ ＴＴＣ ＣＴＴ Ｇ−３’（配列番号１１３３）

次に、反応物をｑＰＣＲプレート（ＭＩＣＲＯＡＭＰ（登録商標）ｏｐｔｉｃａｌ ３８４ウェル、４３０９８４９）内で混合した。播種後、プレートにＲＴで１分間の１０００ｇのクイックスピンを与え、ＶｉｉａＴＭ ７システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ）に移し、以下のＰＣＲ条件を使用した：５０℃で１５分間；９５℃で３分間；以下の４０サイクル：９５℃で５秒、続いて、１．６℃／秒の温度低下、続いて４５秒間６０℃。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ Ｒｅａｌ＿ｔｉｍｅ ＰＣＲソフトウェア、および、ΔΔＣｔ法（量＝２＾（−Ｃｔ）＊１０００００００００）により計算した量を使用して、データを分析した。同じウェルで実行するハウスキーピング遺伝子アッセイ（ＴＢＰ）用に計算した量に対して、量を正規化する。同じプレート上の全てのＰＢＳ処理ウェルの平均で除算することにより、各ウェルに間捨て、相対標的量＝ＱＵＡＮＴＩＴＹ＿ｔａｒｇｅｔ／ＱＵＡＮＴＩＴＹ＿ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ（ＲＮＡ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）を計算した。正規化標的量＝（相対標的量／［平均］相対標的量］＿ｐｂｓ＿ｗｅｌｌｓ）＊１００。

配列番号１の、選択した標的配列領域を標的とする化合物を、上記アッセイで評価した。

標的ノックダウンデータを、以下の化合物およびデータ表に示す。

化合物表において、モチーフ配列は、オリゴヌクレオチドに存在する核酸塩基の連続配列を表す。

オリゴヌクレオチド化合物は、モチーフ配列の特定の設計を表す。大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、すべてのＬＮＡ Ｃは５−メチルシトシンであり、すべてのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

オリゴヌクレオチド化合物コラムにおいて、大文字は、β−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、ヌクレオシド間結合は全て、ホスホロチオエートである。

確認することができるように、列挙された標的配列領域を標的とする上記化合物の大部分は、ヒトＡｔａｘｉｎ３転写物の発現を阻害することができ、配列番号１１２２および１１０９に相補性である標的配列領域を標的とする化合物が特に、ヒトＡｔａｘｉｎ３転写物の阻害に効果的である。ＡＴＸＮ３に対する、他の効果的な標的部位は、上記表から決定することができる。

実施例３
実施例２に記載のスクリーニングアッセイを、ｑｐＣＲ：（ＡＴＸＮ３＿ｅｘｏｎ＿８−９（１）ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ（登録商標）ＸＬ ｑＰＣＲ Ａｓｓａｙ（ＩＤＴ）を使用してヒトＡＴＸＮ３ ｐｒｅ−ｍＲＮＡを標的とする、更なるひと続きのオリゴヌクレオチドを使用して実施した。

ｑＰＣＲプローブおよびプライマーセット２：
プローブ：５’−／５６−ＦＡＭ／ＣＴＣＣＧＣＡＧＧ／ＺＥＮ／ＧＣＴ ＡＴＴＣＡＧＣＴ ＡＡＧＴ／３１ＡＢｋＦＱ／−３’（配列番号１１３４）
プライマー１：５’−ＡＧＴ ＡＡＧＡＴＴＴＧＴ ＡＣＣＴＧＡＴＧＴＣＴＧＴ−３’（配列番号１１３５）
プライマー２：５’−ＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＡＴ−３’（配列番号１１３６）

結果を下表に示す。

オリゴヌクレオチド化合物コラムにおいて、大文字は、β−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、ヌクレオシド間結合は全て、ホスホロチオエートである。^ｍｃは、５−メチルシトシンＤＮＡヌクレオシド（化合物１４９０＿１および１４９１＿１で使用される）を表す。

実施例４
実施例２に記載のスクリーニングアッセイを、ｑｐＣＲ：（ＡＴＸＮ３＿ｅｘｏｎ＿８−９（１）ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ（登録商標）ＸＬ ｑＰＣＲ Ａｓｓａｙ（ＩＤＴ）を使用してヒトＡＴＸＮ３ ｐｒｅ−ｍＲＮＡを標的とする、更なるひと続きのオリゴヌクレオチドを使用して実施した。

ｑＰＣＲプローブおよびプライマーセット２：
プローブ：５’−／５６−ＦＡＭ／ＣＴＣＣＧＣＡＧＧ／ＺＥＮ／ＧＣＴ ＡＴＴＣＡＧＣＴ ＡＡＧＴ／３１ＡＢｋＦＱ／−３’（配列番号１１３４）
プライマー１：５’−ＡＧＴ ＡＡＧＡＴＴＴＧＴ ＡＣＣＴＧＡＴＧＴＣＴＧＴ−３’（配列番号１１３５）
プライマー２：５’−ＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＡＴ−３’（配列番号１１３６）

オリゴヌクレオチド化合物コラムにおいて、大文字は、β−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、ヌクレオシド間結合は全て、ホスホロチオエートである。

実施例５ ２５μＭにおける、ｉＣｅｌｌ ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓでのＬＮＡオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性の試験
以前の実施例から選択したＬＮＡオリゴヌクレオチドを使用して、ヒト細胞株にてオリゴヌクレオチドスクリーンを実施した。

ヒト人工多能性幹細胞由来のｉＣｅｌｌ ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓを、表３に記載する供給業者から購入し、５％ ＣＯ_２で３７℃にて、加湿したインキュベーター内で、供給元により推奨される方法で維持した。スクリーニングアッセイのために、細胞を、供給元により推奨される培地内で９６マルチウェルプレートに播種した（材料および方法セクションの、表３を参照のこと）。１ウェル当たりの細胞数を最適化した（表３）。

細胞を７日間増殖させた後、２５μｍ（培地に溶解）の濃度でオリゴヌクレオチドを添加した。オリゴヌクレオチドを添加した４日後に、細胞を回収した。

ＲＮＡ抽出およびｑＰＣＲを、「実施例１」に記載のとおりに実施した。

ＡＴＸＮ３およびハウスキーピング遺伝子に対するプライマーアッセイは、以下のとおりであった：
ＡＴＸＮ３プライマーアッセイ（アッセイ番号：Ｎ／Ａ アイテム名 Ｈｓ．ＰＴ．５８．３９３５５０４９）：
フォワードプライマー：ＧＴＴＴＣＴＡＡＡＧＡＣＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＣ（配列番号１１２８）
リバース：ＣＴＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＣＡＴＣＣ（配列番号１１２９）
プローブ：５６−ＦＡＭ／ＡＡＡＧＧＣＣＡＧ／ＺＥＮ／ＣＣＡＣＣＡＧＴＴＣＡＧＧ／３ＩＡＢｋＦＱ／（配列番号１０３０）
ＴＢＰプライマーアッセイ（アッセイ番号：Ｎ／Ａ、アイテム名：Ｈｓ．ＰＴ．５８ｖ．３９８５８７７４
プローブ：５’−／５ＨＥＸ／ＴＧＡ ＴＣＴ ＴＴＧ／ＺＥＮ／ＣＡＧ ＴＧＡ ＣＣＣ ＡＧＣ ＡＴＣ Ａ／３ＩＡＢｋＦＱ／−３’（配列番号１１３１）
プライマー１：５’−ＧＣＴ ＧＴＴ ＴＡＡ ＣＴＴ ＣＧＣ ＴＴＣ ＣＧ−３’（配列番号１１３２）
プライマー２：５’−ＣＡＧ ＣＡＡ ＣＴＴ ＣＣＴ ＣＡＡ ＴＴＣ ＣＴＴ Ｇ−３’（配列番号１１３３）

相対的なＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ発現量を、対照（培地処理細胞）の割合として測定した。即ち、値が小さいほど、阻害は大きい。

試験した化合物、および標的ノックダウンデータを表７に示す。

実施例６ ＡＴＸＮ３を標的とするＬＮＡギャップマーのＥＣ５０値の測定
ＥＣ５０の値（標的ノックダウンに半分の影響が観察された濃度）を、細胞株のＳＫ−Ｎ−ＡＳ、Ａ４３１、およびｉＰＳＣ（（ｉＣｅｌｌ ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）に対して測定した。以下のオリゴ濃度を使用した：
− ＳＫ−Ｎ−ＡＳ：５０μＭ−半対数分布（３．１６倍）−ブランク対照を含む８工程
− Ａ４３１：５０μＭ−半対数分布（３．１６倍）−ブランク対照を含む８工程
− ｉＰＣＳ：１０μＭ−１０倍分布−ブランク対照を含む８工程

細胞をオリゴで処理し、溶解させて、以前の実施例で示すように分析した。

試験した化合物、およびこれらのＥＣ５０値を表７に示す。

実施例７ インビトロ毒性評価
様々な安全アッセイにおいて評価した、オリゴヌクレオチドの選択基準は、入手した信号の大きさおよび周波数に基づく。安全性アッセイは、以下のものを使用した：カスパーゼ活性化、肝毒性、腎毒性、および免疫毒性アッセイ。個別のインビトロ安全性アッセイにて得た信号はスコア（０−安全、０．５・境界の毒性、１−穏やかに毒性、２−中程度の毒性、および３−深刻な毒性）をもたらし、各配列に関して、累計スコアにまとめており（表７を参照）、化合物の客観的なランキングを提供する。提供された参考文献にて報告されているように、信号の強度は、インビボでの関係する参照分子を用いるアッセイの認証に基づく、インビボ毒性に対するリスクの尺度である。
以下の参照文献に記載されているように、インビトロ毒性アッセイを実施した：

カスパーゼ活性化アッセイ：Ｄｉｅｃｋｍａｎｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｖｏｌ．１０ Ｍａｒｃｈ ２０１８，ｐｐ４５−５４。

肝毒性アッセイ：Ｓｅｗｉｎｇら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ＭＩＭＢ，ｖｏｌｕｍｅ ２０３６，ｐｐ ２４９−２５９ ２０１９，Ｓｅｗｉｎｇら，ＰＬＯＳ ＯＮＥ｜ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１５９４３１ Ｊｕｌｙ ２１，２０１６。

腎毒性アッセイ：Ｍｏｉｓａｎら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１７ Ｍａｒ １７；６：８９−１０５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｏｍｔｎ．２０１６．１１．００６．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｄｅｃ １０．

免疫毒性：Ｓｅｗｉｎｇら，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１７ Ｎｏｖ ６；１２（１１）：ｅ０１８７５７４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１８７５７４．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１７．

スクリーニングカスケード１１７０化合物の一部を、化合物の有効性を評価した、細胞株ＳＫ−Ｎ−ＡＳおよびＡ４３１にて評価した（表４〜６）。これらのうち、最も効果的な化合物のうちの５０個の、カスパーゼ活性化を評価し、これらのうち１８個が、３つの他のインビトロ毒性アッセイに記載する、更なる評価を受けた（蓄積スコアを表７に示す）。

結論を言うと、８個の化合物が、高い有効性およびインビトロで潜在性を有し、４つのインビトロアッセイにて低い毒性を有する、または毒性を有しないものとして同定された。３個の化合物をそれ故、ヒトＡＴＮＸ３ ｐｒｅ−ｍＲＮＡを発現するトランスジェニックマウスにて評価するために選択した。化合物番号１８５６＿１、１８１３＿１、１８１２＿１、１８０９＿２、１６０７＿１、１１２２＿６２、１１２２＿６７、および１１２２＿３３。

実施例７：インビボトランスジェニックマウス研究
動物のケア
カゴ１個あたり３〜５匹を入れた、１０〜１３週齢のＢ６；ＣＢＡ−Ｔｇ（ＡＴＸＮ３＊）８４．２Ｃｃｅ／ＩｂｅｚＪオスおよびメスマウス（ＪＡＸ（登録商標）Ｍｉｃｅ，Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）にて、化合物のインビボ活性および忍容性を試験した。マウスは、ヒトにてＭＪＤと関連する対立遺伝子である、８４個のＣＡＧ反復モチーフを有する、ヒトＡＴＸＮ３ ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列を発現するトランスジェニックマウスである。動物を、一定温度（２２±２℃）および湿度（４０＋８０％）、および１日あたり１２時間照明を付けた（６時に照明を付ける）にて維持したコロニー部屋にて維持した。動物は全て、研究を通して、自由に食料と水にアクセスできた。全ての手順を、対応するスイス規則に従い実施し、Ｃａｎｔｏｎａｌ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈにより認可された。

投与経路−大槽内注射。
化合物は、大槽内（ＩＣＭ）注射によりマウスに投与された。ＩＣＭ注射の前に、動物は、麻酔として、０．０５ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンを皮下組織内投与で受けた。ＩＣＭ注射のために、動物をイソフルランに配置した。３６ゲージ針に適合したＦＥＰカテーテルを有する、Ｈａｍｉｌｔｏｎマイクロ注射器を使用して、脳室内注射を実施した。皮膚を切開し、筋肉を収縮させて、後環椎後頭膜を露出させた。３６ゲージ針に適合したカテーテルを有する、Ｈａｍｉｌｔｏｎマイクロ注射器を使用して、脳室内注射を実施した。３０秒間、試験化合物またはビヒクルの４マイクロリットルボーラスを注射した。筋肉を再配置させ、２〜３本の縫合糸で皮膚を閉じた。動物を、処置から回復するまで暖かい環境に配置した。

２つの独立した実験を、表８に示す異なる化合物の群で実施した。

忍容性の結果：
全ての化合物は、４週の時点までに認容されたことが見いだされた。国際公開第２０１６／１２６９９５号に記載されているとおりに動物の挙動を監視することで、急性の毒性を測定した（実施例９を参照のこと）。亜急性毒性を、実験の時間経過中の、各動物の体重を監視することで測定し、５％を超える体重減少は、亜急性毒性を示す。いくつかの群において、１または２匹の動物は、ＩＣｍ投与後にある程度の苦痛を示さず安楽死したが、これは恐らく、化合物のいずれかの有害毒性ではなく、手順に因るものである可能性があった。８個全ての化合物はそれ故、インビボで十分に認容されると考えられた。

投与後４週間で、動物を犠牲にし、毛皮質、中脳、小脳、海馬橋／髄質および線条体の組織を収集して秤量し、サンプリング後に直接、液体Ｎ２にて急速冷凍した。サンプルを、−８０℃にて保存するまで、ドライアイス上で保存した。

インビボサンプルの分析。含有量測定およびｑＰＣＲのための、組織調製の記載。
Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ ＩＩを使用して、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＬＣ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）にて、マウスの組織サンプルを均質化した。ホモジェネートを完全に細胞溶解させるために、３０分間室温でインキュベートした。細胞溶解後、ホモジェネートを３分間、１３０００ｒｐｍにて遠心分離し、上清を分析に使用した。半分を生物学的分析のために取っておき、もう半分に関して、ＲＮＡ抽出を直接継続した。

オリゴ含有量分析
生物学的分析に関して、サンプルを、オリゴ含有量測定のために、ハイブリダイゼーションＥＬＩＳＡ法を用いて、１０〜５０倍に希釈した。ビオチン化ＬＮＡ捕捉プローブ、およびジゴキシゲニン抱合体化ＬＮＡ検出プローブ（５ｘＳＳＣＴにて両方３５ｎＭ、それぞれ、検出されるＬＮＡオリゴヌクレオチドの一端に相補性である）を、希釈したホモジェネート、または関係する規格で希釈し、３０分間室温にてインキュベートし、ストレプトアビジンでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに加えた（Ｎｕｎｃカタログ番号４３６０１４）。

プレートを１時間室温にてインキュベートし、２ｘＳＳＣＴ（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、および０．０５％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．０）で洗浄した。アルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１１０９３２７４９１０）、およびアルカリホスファターゼ基質系（Ｂｌｕｅ Ｐｈｏｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ＫＰＬプロダクトコード：５０−８８−００）と抱合体化した抗ＤＩＧ抗体を使用して、捕捉したＬＮＡデュプレックスを検出した。オリゴ複合体の量を、Ｂｉｏｔｅｋリーダーにて６１５ｎｍにおける吸光度として、測定した。

データを組織重量に対して正規化し、オリゴのｎＭとして表現した。
ｍＲＮＡ分析

キットであるＣｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ Ｌａｒｇｅ Ｖｏｌｕｍｅ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６機器を使用して、３５０μＬの上清からＲＮＡ精製した。ＲＮＡサンプルを、ＲＮａｓｅ非含有水中で２ｎｇ／μＬに正規化し、更なる使用まで、−２０℃にて保存した。

ワンステップｑＰＣＲ（ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲ）のために、各サンプルを、４つのプローブセット（（ＩＤＴ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）をデュプレックス中で実行しながら、２通りに実行した。

各反応物に、４μＬの、以前に希釈したＲＮＡ、０．５μＬの水、および、５．５μＬのＴａｑＭａｎ ＭａｓｔｅｒＭｉｘを添加した。プレートを遠心分離し、９０℃にて４０秒間熱閉鎖させた後、氷上で短いインキュベーションを行い、その後、ｑＰＣＲを使用してサンプルを分析した（５０℃にて１５分間、および９０℃にて３分間、続いて４０サイクル、９５℃にて５秒間、および６０℃にて４５秒間の、インキュベーション）。アッセイプローブを、以下で説明する。

相対検量線法を使用してデータを分析し、それぞれをまず、ハウスキーピング遺伝子（ＲＰＬ４）に対して正規化し、その後、未処理の対照動物の割合として表現した。

インビボ研究のためのｑＰＣＲ分析：
ヒトＡＴＸＮ３、ｑＰＲアッセイ：（ＡＴＸＮ３＿ｅｘｏｎ＿８−９（１）ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ（登録商標）ＸＬ ｑＰＣＲ Ａｓｓａｙ（ＩＤＴ）を使用してヒトＡＴＸＮ３ ｐｒｅ−ｍＲＮＡを標的とする、更なるひと続きのオリゴヌクレオチドを使用して実施した。

ｑＰＣＲプローブおよびプライマー：
プローブ：５’−／５６−ＦＡＭ／ＣＴＣＣＧＣＡＧＧ／ＺＥＮ／ＧＣＴ ＡＴＴＣＡＧＣＴ ＡＡＧＴ／３１ＡＢｋＦＱ／−３’（配列番号１１３４）
プライマー１：５’−ＡＧＴ ＡＡＧＡＴＴＴＧＴ ＡＣＣＴＧＡＴＧＴＣＴＧＴ−３’（配列番号１１３５）
プライマー２：５’−ＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＡＴ−３’（配列番号１１３６）

使用したハウスキーピング遺伝子：
Ｍｏｕｓｅ ＲＰＬ４、ｑＰＣＲアッセイ（Ｍｍ．ＰＴ．５８．１７６０９２１８）ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ（登録商標）ＸＬ ｑＰＣＲ Ａｓｓａｙ（ＩＤＴ）。
ｑＰＣＲプローブおよびプライマー：
プローブ：５’−／５ＨＥＸ／ＣＴＧ ＡＡＣ ＡＧＣ ／ＺＥＮ／ＣＴＣ ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＧＴＡ ／３ＩＡＢｋＦＱ／−３’（配列番号１０９０）
プライマー１：５’−ＣＴＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＣＴ ＣＡＴ ＴＣＴ ＣＴＧ−３’（配列番号１０９１）
プライマー２：５’−ＴＧＧ ＴＧＧ ＴＴＧ ＡＡＧ ＡＴＡ ＡＧＧ ＴＴＧ Ａ−３’（配列番号１０９２）

実施例８：時間経過における、ＬＮＡオリゴヌクレオチドおよび参照化合物のインビトロ有効性の試験、ヒトｉＰＳＣ由来のニューロンにおける用量範囲実験
使用した化合物：１１２２＿６７および１８１３＿１、ならびに、国際公開第２０１９／２１７７０８号で使用した化合物ＩＤ番号により参照される、国際公開第２０１９／２１７７０８号で解される以下の参照化合物：１１００６７３、１１０１６５７、１１０２１３０、１１０３０１４、および１１０２９８７。化合物１１００６７３、１１０１６５７、１１０２１３０は、国際公開第２０１９／２１７７０８号にて、潜在的なインビボ阻害を提供するものとして強調されており、化合物１１０３０１４および１１０２９８７は、国際公開第２０１９／２１７７０８号ではインビボで評価されなかったが、化合物１１２２＿６７（１１０３０１４）および１８１３＿１（１１０２９８７）に対する配列類似性故に、参照化合物として含まれる。

ｉＣｅｌｌ ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ細胞を、実施例５および表３に記載するとおりに調製し維持した。細胞を７日間増殖させた後、０〜１０μｍ（培地に溶解）の濃度でオリゴヌクレオチドを添加した。

オリゴ処理の４、６、９、１２、および２０日後に細胞を回収し、実施例５に記載するＡＴＸＮ３プライマーアッセイを使用して、「実施例１」に記載するとおりに、ＲＮＡ抽出およびｑＰＣＲを実施した。相対的なＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ発現量を、対照（培地処理細胞）の割合として測定した。即ち、値が小さいほど、阻害は大きい。結果を表９に示す。

化合物１１２２＿６７および１８１３＿１は、５つの参照化合物よりも著しく潜在性があり、化合物１１２２＿６７が、全ての時点において最も潜在性のある化合物であり、１１２２＿６７および１８１３＿１が両方、ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの著しく効果的、かつ長持ちする阻害をもたらした。

実施例９：比較のインビボトランスジェニック研究
化合物１１２２＿６７および１８１３＿１、ならびに化合物１１００６７３（国際公開第２０１９／２１７７０８号）を使用して、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｄｅｎ Ｂｏｓｃｈ Ｂ．Ｖ．，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，ＮＬにて、更なるインビボ研究を行った。研究では、槽内（ＩＣＭ）投与により化合物を投与した、オスおよびメスＢ６；ＣＢＡ−Ｔｇ（ＡＴＸＮ３＊）８４．２Ｃｃｅ／ＩｂｅｚＪマウスを使用した。化合物を投与した後の２つの時点（１または４週）にて、動物を安楽死させ、末端血漿サンプルおよび組織を収集した。

動物のケア
６２匹の、７〜１０週齢の６２ Ｂ６；ＣＢＡ−Ｔｇ（ＡＴＸＮ３＊）８４．２Ｃｃｅ／ＩｂｅｚＪオスおよびメスマウス（ＪＡＸ（登録商標）Ｍｉｃｅ，Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）にて、化合物のインビボ活性および忍容性を試験した。到着後、動物を、温度（２２±２℃）および湿度（５５±１５％）に制御した環境で、１２時間の照明サイクル（７時〜１９時）にて、個別に通気したカゴ（ＩＶＣ、４０×２０×１６ｃｍ）に最大５匹の群で、収容した。オスおよびメスを別のカゴで保持した。標準的な食事（ＳＤＳ食、ＲＭ１ ＰＬ）および国内品質の主な水が自由に利用できた。必要に応じて、動物は、手厚いケアの一部として、標準的な食事に加えて、浸した食事、および／またはロイヤルカナンを受けた。実験はＣａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（米国学術研究会議２０１１）向けのガイドに厳格に従い実施し、欧州連合指令２０１０／６３およびオランダ法に従った。記載したインビボ実験を、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に位置するＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｄｅｎ Ｂｏｓｃｈ Ｂ．Ｖ．にて実施した。

投与経路−大槽内注射。
化合物は、大槽内（ＩＣＭ）注射によりマウスに投与された。マウスを、イソフルラン（２．５〜３％、および５００ｍＬ／分のＯ２）を使用して安楽死させた。手術前に、術中および術後回復期間の麻酔のために、Ｆｉｎａｄｙｎｅ（１ｍｇ、皮下組織内）を投与した。切開部位、および局部麻酔のための頭蓋骨膜に、ブピバカインとエピネフィリンの混合物を適用した。

動物を定位固定フレーム（Ｋｏｐｆ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＳＡ）に配置し、後頭部から首に向かって切開を行った。次に、皮膚を広げ、後頭蓋骨に穴を開ける前に座標を記録し、ここにカニューレを配置した。次に、化合物を大槽内（ＩＣＭ）に注射した。４μＬの体積の割り当てた試験アイテムを、３０秒にわたり注射した。注射後、針およびカニューレを３０秒間所定位置で保持し、逆流が起きないようにした。次にカニューレを後退させ、穴を皮膚で覆い、切開を縫合糸で閉じた。

動物を、処置から回復するまで暖かい環境に配置した。

化合物１１２２＿６７を、９０、１５０、または２５０μｇの単回投与で投与し、化合物１８１３＿１を、１５０μｇまたは２５０μｇの単回投与で投与した。参照化合物１１００６７３を、２５０μｇのみの単回投与で投与した。

ＩＣＭ注射の３日前から、最大で投与の１週間後まで、動物の体重を毎日登録した。実験の残りの間、少なくとも１週間に２回、動物の体重を監視して登録した。

実験の終わりに、８日目または２９日目（１または４週）、動物にＥｕｔｈａｓｏｌ（登録商標）を過剰投与して安楽死させた。末端血漿をＬｉ−Ｈｅｐ管で収集した。末端組織を動物から回収して、冷却した表面にて切開した。組織サンプルの半分を、２．０ｍＬのＳａｆｅ−Ｌｏｃｋ管にて保管し、ＰＣＲクリーンし、予め秤量して予冷却した。収集直後に、サンプルを秤量して液体Ｎ２中で急速冷凍した後、−８０℃で保管した。もう半分を４％ ＰＦＡ内で７２時間固定した後、出荷を待つ７０％エタノールに移した。組織切開および収集を行い、広範な組織から組織を収集した：中脳、毛皮質、線条体、海馬、小脳、脳幹、および中脳（Ｃｅｒｖｉｃａｌ，Ｔｈｏｒａｃｉｃ＆Ｌｕｍｂａｒ）。

忍容性の結果：
国際公開第２０１６／１２６９９５号に記載されているとおりに動物の挙動を監視することで、急性の毒性を測定した（実施例９を参照のこと）。慢性毒性を、実験の時間経過中の、各動物の体重を監視することで測定し、５％を超える体重減少は、慢性毒性を示す。いくつかの群において、１または２匹の動物は、ＩＣｍ投与後にある程度の苦痛を示さず安楽死したが、これは恐らく、化合物のいずれかの有害毒性ではなく、外科手術の性質に因るものである可能性があった。

２５０μｇ用量の１８１３＿１において、急性毒性の兆候があったのが３匹のマウスであったため、この群の動物を早く安楽死させた。別の場合において、全ての化合物は、４週の時点までに認容されたことが見いだされた。

４週間後、動物を安楽死させて、脳およびＣＮＳ組織を収集した。脊髄、毛皮質、線条体、海馬、中脳、脳幹、および小脳、加えて肝臓および腎臓を、投与の１または４週間後における、薬剤濃度分析、およびＡＴＡＸＮ３ ｍＲＮＡ分析のために、液体窒素中で収集した。

インビボサンプルの分析：含有量測定およびｑＰＣＲのための、組織調製の記載を、実施例７に従い実施した。ＥＣ５０を計算し、達成した最大ＫＤを記録した−このデータを表１０に提供する。

化合物１１２２＿６７が、試験した全ての脳組織中で最も効果的な化合物であり、試験した全ての脳組織中で、素晴らしく効果的なノックダウンを与えた。このことは、鍵となる全ての組織に対して良好な生物学的分布を示している（脊髄、脳幹、および中脳においては、１８１３＿１も、１１２２＿６７同様に効果的であった）。特に、化合物１１２２＿６７は、参照化合物１１００６７３が特に、効果が弱かった組織である、小脳にて非常に効果的なノックダウンを与えた。治療の４週間後における、鍵となる更なる観察は、全ての脳組織において、１週間の時点と比較して、１１２２＿６７の有効性が更に改善されたことである。特に、参照化合物である１１００６７３の有効性は、特に、鍵となる小脳および毛皮質組織において、４週間の段階ｖｓ１週間の時点にて、特に低かった。この化合物は、治療用設定において、さほど頻繁でない投与が必要とされるべきであることを、１１２２＿６７の、長期間の作用および高い潜在性は示す。

実施例１０ ＳＶＰＤに対する化合物の安定性
方法論：３’−エキソヌクレアーゼ蛇毒ホスホジエステラーゼＩ（ＳＶＰ）（技術番号ＬＳ００３９２６、ロット番号５８Ｈ１８３６７）を、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．（Ｌａｋｅｗｏｏｄ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）より購入した。３’−エキソヌクレアーゼ蛇毒ホスホジエステラーゼＩ（ＳＶＰ）アッセイ用の反応混合物は、５０ｍＭ ＴＲＩＳ／ＨＣｌ ｐＨ８緩衝液、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０Ｕ ＣＩＰ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ），０．０２Ｕ ＳＶＰ、およびオリゴヌクレオチド化合物で構成された。ＳＶＰＤに対するＡＳＯの安定性は、１日の時間経過にわたりヌクレアーゼアッセイを実施することで測定した。各反応混合物において、全体積１５０μＬ中で、約０．２ｍｇ／ｍＬ ＡＳＯを使用した。

２４時間３７℃のインキュベーション期間をオートサンプラーで実施し、ダイオードアレイ検出器を装着し、エレクトロスプレーイオン化飛行時間形質量分析計（ＥＳＩ−ＴｏＦ−ＭＳ）を連結したＵＨＰＬＣシステムにより、時間間隔にて、ＳＶＰＤおよび反応、ならびにＡＳＯ安定性を監視した。ｔ＝０時間の時点を生成するため、酵素を、第１の注射の直前に反応混合物に添加した。更なる注射を、２４時間にわたって定期的な間隔で行った。

試験化合物の１１２２＿６７、１８１３＿１、ならびに、参照化合物の１１００６７３、１１０１６５７、１１０２１３０、１１０３０１４、および１１０２９８７。

データを図９に示す。国際公開第２０１９／２１７７０８号からの、３つの強調された参照化合物、ならびに１１２２＿６７および１８１３＿１化合物は、ＳＶＰＤアッセイにて良好な安定性を有した一方で、１１２２＿６７および１８１３＿１に最も近い配列を有する、国際公開第２０１９／２１７７０８号の２つの参照化合物である、化合物１１０３０１４および１１０２９８７は、１１２２＿６７および１８１３＿１と比較して、ＳＶＰＤ分解に対して特に、より不安定であった。

実施例１１ 選択したオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）で処理した、ヒトＳＣＡ３患者由来の線維芽細胞における、ＷＴおよびポリＱ Ａｔａｘｉｎ３タンパク質濃度
この実験は、先行技術の化合物である、ＳＣＡ３患者由来の線維芽細胞における１１００６７３および１１０２１３０と比較して、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの１１２２＿６７および１１２２＿３３のノックダウンの有効性を調査するために実施し、病気を引き起こすａｔａｘｉｎ３対立遺伝子、およびａｔａｘｉｎ３ ＷＴ対立遺伝子における有効性の評価を可能にする。

ＡＳＯ処理のために使用する細胞株、ヒトＳＣＡ３患者由来の線維芽細胞（ＧＭ０６１５３−Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）。１０万個の細胞を、ウェルあたり総体積１ｍＬで、２４ウェルプレート内に播種した。ＡＳＯを直後に添加し、１０μＭの終濃度にした（ジムノシス取り込み）。４日間のインキュベーションの後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２００μＬのＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｅｒｃｅ）中で回収した。

ＷＥＳ １２−２３０ ｋＤａ Ｗｅｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅを使用して、キャピラリベースのイムノアッセイプラットフォーム（ＷＥＳ，ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）上でウェスタンブロットを実施した。細胞可溶化物を、カートリッジに載せる前にサンプルロード緩衝液（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）中で１０倍に希釈した。Ａｔａｘｉｎ３（ウサギモノクローナル抗体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、製品番号７０２７８８）、およびＨＰＲＴ（ウサギモノクローナル抗体、Ａｂｃａｍ製、カタログ番号Ａｂ１０９０２１）用の一次抗体。両方の抗体を１／１００希釈溶液中で使用した。ヤギ抗ウサギＨＲＰ抱合体（Ｐａｒｔ．＃ＤＭ−００１，ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を二次抗体として使用した。

Ｃｏｍｐａｓｓソフトウェア（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を、タンパク質バンドの定量化のために使用した。

結果
野生型およびポリＱ延長Ａｔａｘｉｎ３タンパク質の両方の効果的なＫＤを示すために、ＧＭ０６１５３細胞を、ＷＥＳでのタンパク質分析前に４日間、１０μｍのＡＳＯで処理した。Ａｔａｘｉｎ３抗体は両方のアイソフォームを認識し、ＨＰＲＴ由来のシグナルに基づき、タンパク質入力に対して強度（ピーク下面積）を正規化した。図１０ＡおよびＢから確認されるように、１１２２＿６７および１１２２＿３３での処理の際に、野生型Ａｔａｘｉｎ３と比較して、ポリＱ延長Ａｔａｘｉｎ３が大きく減少することが観察される。野生型Ａｔａｘｉｎ３と比較して多量のポリＱ延長Ａｔａｘｉｎ３が確認される、他のＡＳＯ（スクランブル対照、１１００６７３または１１０２１３０）に関しては、この傾向は観察されない。対立遺伝子を引き起こす病気の選択的低減を可能にするために、ＷＴ Ａｔａｘｉｎ３よりも病気を引き起こすポリＱ延長Ａｔａｘｉｎ３における高い活性が好ましい。

試験化合物は全て、試験組織にて有効な標的阻害をもたらし、試験用量にて耐性があった。試験化合物に対して化合物１１２２＿３３は、全ての組織において、１１２２＿６２および１１２２＿６７に続いて、最も高い、または２番目に高い特異的活性（低いＥＣ５０）のいずれかを有した。

化合物１１２２＿６７、１６０７＿１、１８１３＿１、および１１２２＿３３は、全ての試験組織において、高いインビボ有効性をもたらし、このことは、試験した脳組織に対して、ＡＴＸＮ３発現の、著しい一貫した阻害を示す。累積ランクスコアに基づくと、化合物１１２２＿６７は一貫して、試験組織におけるＡＴＸＮ３ノックダウンの有効性の観点から、最もランクの高い、または２番目にランクの高い化合物のいずれかであった。

Claims (17)

1. 化合物番号１１２２＿６２、１１２２＿６７、１８５６＿１、１８１３＿１、１８１２＿１、１８０９＿２、１６０７＿１、および１１２２＿３３からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。
2. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがＡＣＣｃａｔａｔｔｔｔａｃｔＣＴＴ（化合物番号１８５６＿１）である（大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、前記ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。
3. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがＣＴＧｔａｃａｃｔｔｔｔａｃａＴＴ（化合物番号１８１３＿１）である（大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、前記ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。
4. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがＴＧｔａｃａｃｔｔｔｔａｃａｔＴＣＣ（化合物番号１８１２＿１）である（大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、前記ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。
5. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがＧｔａｃａｃｔｔｔｔａｃａｔｔＣＣＣ（化合物番号１８０９＿１）である（大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、前記ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。
6. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがＴＴＣｔｔｃａｔｔａｔａｃｃａｔＣＡＡ（化合物番号１６０７＿１）である（大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、前記ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。
7. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがＡａｔＣｔＴａｔｔｔａｃａｔｃＴｔＣＣ（化合物番号１１２２＿６２）である（大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、前記ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。
8. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがＡＡＴＣｔｔａｔｔｔａｃａｔｃＴｔＣＣ（化合物番号１１２２＿６７）である（大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、前記ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。
9. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがＡａｔＣｔＴａｔｔｔａｃａｔｃｔＴＣＣ（化合物番号１１２２＿３３）である（大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、前記ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩。
10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、および、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの抱合体部分を含む抱合体、または薬学的に許容されるその塩。
11. 請求項１〜９に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項１０に記載の抱合体、ならびに、薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩、および／またはアジュバントを含む医薬組成物。
12. ＡＴＸＮ３を発現する標的細胞におけるＡＴＸＮ３発現を調節するためのインビボまたはインビトロ法であって、有効量の、請求項１〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドもしくは塩、請求項１０に記載の抱合体、または、請求項１１に記載の医薬組成物を、前記細胞に投与することを含む、方法。
13. 病気の治療または予防方法であって、治療的、または予防的有効量の、請求項１〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドもしくは塩、または、請求項１０に記載の抱合体、または請求項１１に記載の医薬組成物を、前記病気を患う、またはそれに罹りやすい対象に投与することを含む、方法。
14. 前記病気が、マカド・ジョゼフ病といった脊髄小脳失調症３などの、脊髄小脳失調症である、請求項１３に記載の方法。
15. 薬剤で使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドもしくは塩、または請求項１０に記載の抱合体、または請求項１１に記載の医薬組成物。
16. マカド・ジョゼフ病（ＭＪＤ）といった脊髄小脳失調症３などの、脊髄小脳失調症の治療または予防に使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドもしくは塩、または請求項１０に記載の抱合体、または請求項１１に記載の医薬組成物。
17. マカド・ジョゼフ病といった脊髄小脳失調症３などの、脊髄小脳失調症の治療または予防のための薬剤の調製のための、請求項１〜９に記載のオリゴヌクレオチドもしくは塩、請求項１０に記載の抱合体、または請求項１１に記載の医薬組成物の使用。

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