JP2021530248A - Pd−l1結合ポリペプチドおよびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
配列番号5に記載のアミノ酸配列または配列番号5と比較して1以上のアミノ酸残基置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号6に記載のアミノ酸配列または配列番号6と比較して1以上のアミノ酸残基置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含み、例えば配列番号13に記載のアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号7に記載のアミノ酸配列または配列番号7と比較して1以上のアミノ酸残基置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むCDR3
を含む。
配列番号5に記載のアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号13に記載のアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号7に記載のアミノ酸配列を含むCDR3
を含む。
a)PD−L1結合ポリペプチドの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養すること;
b)工程a)から得られた培養物から宿主細胞によって発現されたPD−L1結合ポリペプチドを回収すること;および
c)工程b)から得られたPD−L1結合ポリペプチドを任意にさらに精製および/または改変すること
を含む本発明のPD−L1結合ポリペプチドを製造するための方法を提供する。
いくつかの実施形態において、検出可能なマーカーは、放射性核種、蛍光剤、化学発光剤、生物発光剤、常磁性イオン、および酵素からなる群より選択される。
a) 本発明のPD−L1結合ポリペプチドおよび/または本発明のPD−L1結合ポリペプチドおよび/または本発明の結合分子がPD−L1と複合体を形成し得るという条件下で、生体試料および対照試料を本発明のPD−L1結合ポリペプチドおよび/または本発明の結合分子と接触させること;
b) 複合体形成を検出すること
を含み、生体試料と対照試料との間の複合体形成の相違は、試料中のPD−L1および/またはPD−L1の発現レベルの存在を示す、方法を提供する。
指示されているか、明確に規定されていない限り、全ての用語は当該技術分野においてそれらの通常の意味を用いており、当業者には明らかであろう。例えば、Sambrook et al, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2nd.Ed.), Vols. 1−3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, ”Genes IV”, Oxford University Press, New York, (1990); および Roitt et al., ”Immunology” (2nd edition), Gower Medical Publishing, London, New York (1989), および 本明細書に引用する一般的な先行技術文献などの標準的なハンドブックが参照される。また、特に断りのない限り、具体的に詳述されていない方法、工程、技術、手術はすべて、それ自体既知の方法で行うことができ、当業者には明らかである。例えば、標準マニュアル、上述の一般的な先行技術および本明細書に引用される他の参考文献にも記載されている。
一態様において、本発明は、プログラムデスリガンド1(PD−L1)と特異的に結合することが可能であり、少なくとも1つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むことを特徴とする、PD−L1結合ポリペプチドを提供し、少なくとも1つの免疫グロブリン単一可変ドメインは、
配列番号5に記載のアミノ酸配列または配列番号5と比較して1以上のアミノ酸残基置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号6に記載のアミノ酸配列または配列番号6と比較して1以上のアミノ酸残基置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含み、例えば配列番号13に記載のアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号7に記載のアミノ酸配列または配列番号7と比較して1以上のアミノ酸残基置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むCDR3を含む。
配列番号5に記載のアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号13に記載のアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号7に記載のアミノ酸配列を含むCDR3
を含む。
別の態様において、本発明は、本発明のPD−L1結合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。本発明の核酸分子は、RNA、DNAまたはcDNAであり得る。当業者は、必要性または慣用手段に従って、PD−L1結合ポリペプチドをコードする核酸分子を選択し得る。
− 本発明のPD−L1結合ポリペプチドの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養すること;および
− 宿主細胞によって発現されたPD−L1結合ポリペプチドを培養物から回収すること;および
− 任意に、本発明のPD−L1結合ポリペプチドをさらに精製および/または改変すること。
別の態様において、本発明は、本発明のPD−L1結合ポリペプチド、および本発明のpD−L1結合ポリペプチドに結合した少なくとも1つの検出可能なマーカーを含む複合分子を提供する。検出可能なマーカーは、放射性核種、蛍光剤、化学発光剤、生物発光剤、常磁性イオン、および酵素を含むが、これらに限定されない。
別の態様では、本発明は、
a)本発明のPD−L1結合ポリペプチドおよび/または本発明の複合分子がPD−L1と複合体を形成し得るという条件下で、生体試料および対照試料を本発明のPD−L1結合ポリペプチドおよび/または本発明の複合分子と接触させること;および
b)生体試料と対照試料との間の複合体形成の相違が、試料中のPD−L1および/またはPD−L1の発現レベルの存在を示す複合体形成を検出すること
を含む、生体試料中のPD−L1の存在および/またはPD−L1の発現レベルを検出するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、生体試料はex vivo試料である。
したがって、いくつかの実施形態において、造影剤は、SPECT造影剤またはPET造影剤のようなECT造影剤である。
1.1 ライブラリー構築
免疫化のためのPDL1‐Fc融合タンパク質をCHO細胞で発現させ、タンパク質A親和性クロマトグラフィーにより精製した。新彊フタコブラクダが免疫のために選ばれた。4回の免疫化の後、100mlのラクダ末梢血リンパ球を抜き取り、QIAGENによって提供されたRNA抽出キットを用いて全RNAを抽出した。抽出したRNAを指示書に従ってSuper−Script III FIRST STRANDSUPERMIXキット(Thermo Fisher Scientific社製)を用いてcDNAに逆転写した。重鎖抗体の可変領域をコードする核酸断片をネスト化PCRにより増幅した:
PCRの第1ラウンド:
上流プライマー: GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC(配列番号14);
下流プライマー: GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC (配列番号15)。
PCRの第2ラウンド:
鋳型としての第1ラウンドのPCR生成物、
上流プライマー: GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG (配列番号16);
下流プライマー: GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT(配列番号17)
プレートを10μg/ウェル中のPDL1−Fc融合タンパク質でコーティングし、4℃で一晩置いた。翌日、室温で1%脱脂乳を2時間ブロッキングに用い、100μlのファージ(8×10 11 tfu、1.1で構築したラクダ重鎖単一ドメイン抗体のファージディスプレイライブラリー由来のファージ)を加え、室温で1時間インキュベートした後、PBST(PBS中0.05% Tween 20)で5回洗浄し、非結合ファージをウォッシュオフした。最後に、PD−L1に特異的に結合するファージをトリエチルアミン(100mM)を用いて解離させ、対数増殖期に大腸菌TG1に感染させて、スクリーニングの次のラウンドためのファージを産生し、精製した。同じスクリーニングプロセスを3〜4ラウンド繰り返した。その結果、陽性クローンが濃縮されたことにより、ファージディスプレイ技術を用いた抗体ライブラリーにおけるPD−L1特異的抗体のスクリーニングの目的が達成された。
3〜4ラウンドのスクリーニング後、得られたPD−L1結合陽性ファージを用いて空の大腸菌細胞に感染させ、プレートした。その後、96個の単一コロニーを選択し、別々に培養してファージを作り、精製した。このプレートを一晩4℃のPDL1−Fc融合タンパク質でコーティングし、得られた試料ファージ(対照群:ブランクファージ)を加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、一次抗体、抗体、ヒト抗HAタグ抗体(Beijing Kangwei Century Biotechnology Co., Ltd.から購入)を追加し、常温で1時間インキュベートした。洗浄後、二次抗体であるヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ標識抗体(Amictech Technology Co., Ltd.より購入)を添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、アルカリフォルターゼの展開液を加え、405nmの波長で吸光度値を読み取った。試料ウェルのOD値が対照ウェルのOD値より3倍大きい場合、試料ウェルは陽性クローンウェルとして決定される。プラスミドを抽出し、配列分析を行うために、陽性クローンウェルの細菌を培養用に100μg/mLのアンピシリンを含むLB液体に移した。
2.1 PD−L1単一ドメイン抗体の遺伝子クローンの構築
単一ドメイン抗体のアミノ酸配列は、表1に示されており、ここで、109−chisは、C末端にHisタグを有する組換えタンパク質である。CDR配列は囲みで示してある。
単一ドメイン抗体融合タンパク質の組換え体構築プラスミドをHEK293細胞にトランスフェクトし、抗体発現を行った。組換え発現プラスミドをFreestyle293培地(Thermo Fisher Scientific, Art.No.12338018)で希釈し、形質転換に必要なPEI (ポリエチレンイミン)溶液に添加した。プラスミド/PEI混合物をHEK293細胞懸濁液に加え、37℃および10 % CO2で90rpmで培養した。4時間後にEX293培地(Sigma, Art.No. 14571C)と2mMグルタミンを加え135rpmで培養した。24時間後、培養液に3.8mMのバルプロ酸VPA (Sigma, Art.No.P454)を添加した。5〜6日間の培養後、一過性発現培養からの上清を採取し、109−chis単一ドメイン抗体をNi+レジンゲル親和性クロマトグラフィーにより精製し、SDS−PAGE電気泳動で測定した純度が95%以上の精製抗体を得た、109単一ドメイン抗体をまず親和性クロマトグラフィーによりワン工程で濃縮し、次にイオンクロマトグラフィーカラムにより精製し、SDS−PAGE電気泳動で測定した純度が95%以上の精製された109抗体を得ることができた(図1A−Cに示す)。
PDL1−Fc融合タンパク質はHEK293によって一過性発現され、ニッケルカラム親和性クロマトグラフィーによって精製された。得られたPDL1−Fc融合タンパク質を4℃で一晩0.5μg/well でコーティングした後、得られた連続希釈したPD−L1単一ドメイン抗体に加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、抗his−ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識抗体(Abcam, Art.No. ab1187から購入)を添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後に展開液を加え、405nmの波長で吸光度値を読み取った。ソフトウェアSotfMaxPro v5.4を用いて4パラメータフィッティングによりデータ処理およびマッピング解析を実施した結果、図2に示すような抗体からPD−L1への結合曲線およびEC50値(2.891ng/mL)が得られ、これは109抗体のPD−L1への親和性を反映している。
3.1 PD−1とPD−L1の相互作用に対するPD−L1重鎖単一ドメイン抗体の遮断作用を検討する競合ELISA
PDL1−muFc融合タンパク質(マウスFcを使用)及びPD1−Fc融合タンパク質を、pCDNA4ベクター(Invitrogen, Cat V86220)にクローニングし、HEK293細胞に発現させることにより得た。プレートをPDL1−muFc融合タンパク質0.5μg/wellで4℃で一晩被覆した後、PD1−Fc 10μgを各ウェルに添加し(対照群:抗体又はタンパク質を添加せず、等容量の緩衝液のみを添加)、重鎖単一ドメイン抗体109−chisの初回希釈濃度3μg/L(対照群:緩衝液)、2倍希釈、12勾配で、室温で1時間インキュベートした。その後、anti−his−HRP(Abcam社から購入)を添加し、室温で1時間インキュベートした。次に展開液を加え、405nmの波長で吸光度値を読み取った。PD−1過剰の存在下では、重鎖単一ドメイン抗体109−chis濃度が増加するにつれて結合に対するS曲線結合を示す傾向が認められた場合には、遮断作用はないと考える。
ヒトPD−L1完全長タンパク質の遺伝子を安定にトランスフェクトしたヒトメラノーマA375細胞を構築することにより、膜上にヒトPD−L1タンパク質を安定に発現する375細胞(A375−PDL1細胞)が得られた。PD−L1を発現しない腫瘍形成性細胞株、MCF−7を陰性対照として用いた。MCF−7細胞株は、寄託番号ATCC HTB−22を有するAmerican Type Culture Collection (ATCC)から入手し、推奨通り培養した。細胞は、使用前に90%を超えるコンフルエンスまで培養した。抗PD−L1単一ドメイン抗体109を用いて、これらの細胞株のフローサイトメトリー解析を行い、間接免疫蛍光染色の定量解析を行い、各細胞表面受容体の個数を求めた。
Biacoreの実験温度は25℃、注入流量は50μl/分であった。アナライトをHBS−EP+緩衝液で一定の濃度に希釈し、ブランク参照チャネルおよび活性化チャネルを順に通過させた。ブランク参照チャネル上に発生したシグナル値はチップ上のアナライトの非特異的吸着を反映し、活性化チャネル上に発生したシグナル値はアナライトとリガンドとの特異的結合を反映する。アナライトを300秒間導入した後、HBS−EP+緩衝液を180秒間導入してアナライトをリガンドから解離させた。109抗体を7つの勾配で200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/mlに希釈した。異なる濃度のアナライトを繰り返し導入し、解離させる。
Biacore T200により記録されたデータは、Biacore T200評価ソフトウェアにより分析される。
6〜8週齢の雌ヌードマウスを用いてin vivo試験を実施した。ヌードマウスを特定の病原体を含まない(SPF)環境で飼育し、食品や水を自由に摂取させ、標準的な12時間の昼夜照明サイクルを行う。異種移植のために、100μlの細胞(A375‐PDL1またはMCF‐7)/PBSをマウスの右前肢の皮下に移植した。細胞接種濃度は約5〜6×106細胞/マウスである。移植はイソフルラン麻酔下で行った。これらの条件下で、注射動物の80%以上において、3〜4週後に使用可能な腫瘍(A375−PDL1またはMCF−7)(100−300μg)が得られた。解剖によりマウスから腫瘍を採取し、腫瘍全体をホルマリンで固定し、免疫組織化学的検査まで4℃で保存した。免疫組織化学的切片は、当業者に周知の従来法に準じて作製し、抗his−ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識抗体で染色した。
本発明の単一ドメイン抗体を、図4Aに示されるフローチャートに従って、キレート剤、p−SCN−Bn−NOTAおよび放射性核種68Gaで標識した。
4.1 単一ドメイン抗体とp−SCN−Bn−NOTAとの反応
単一ドメイン抗体、109−chis(3mg)をpH8.7の炭酸ナトリウム緩衝液0.05Mに溶解し、10倍モル比の過剰p−SCN−Bn−NOTA(Macrocyclics, Art.No. B−605)を加えた。混合物を常温で少なくとも18時間暗所で撹拌し、過剰p−SCN−Bn−NOTAを除去するためPD−10カラム(GE)を用いて結合された産物を精製し、限外濾過チューブにより単一ドメイン抗体を約1mg/mLに濃縮した。pH7.0のリン酸緩衝液0.1Mを移動相としてSEC−HPL分析を行った。
GaCl3をHCL0.05Mに溶解し、酢酸ナトリウム溶液0.2Mの1/2体積を加え、pH 5.3で109‐chis‐NOTAを含む酢酸ナトリウム緩衝液0.1Mの1/4体積を加えた。反応系のpHは4.5〜4.7で、室温で10分間反応を行った。未反応のガリウムイオンはPD−10カラムにより除去される。キレート化67Gaの量は、Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL液体クロマトグラフィー質量分析計を用いて測定した。単一ドメイン抗体の濃度は、BCAタンパク質の濃度測定用キットにより測定した。クロマトグラフィー条件は以下のとおりである:Waters ACQUITY UPLC機器、 ACQUITY UPLC(登録商標)BEH C18 1.7μm(2.1×100mm)クロマトカラムを用い、オートサンプラー温度を4℃、カラム温度50℃で流速0.25mL/分、試料4μl、勾配溶出、0.1%ギ酸水溶液(A)−0.1%ギ酸−アセトニトリル(B)の移動相と設定した。得られた69,71Ga−NOTA−109−chisの質量分析結果を図4Cに示した。
69,71Ga−NOTA−109−chisの質量分析結果から、生成物は1分子と2分子69,71Gaでキレートされたタンパク質の混合物であることがわかった。
PDL1‐Fc融合タンパク質はHEK293によって一過性発現され、ニッケルカラム親和性クロマトグラフィーによって精製された。得られたPDL1−Fc融合タンパク質を0.5μg/wellで4℃で一晩被覆した後、4.2で得られたPD−L1単一ドメイン抗体タンパク質の連続希釈109−chis PD−L1単一ドメイン抗体又はキレート化生成物を添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、抗his−ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗体を加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄後に展開液を付加し、405nmの波長で吸光度値を読み取った。アプリケーションソフトウェアSotfMaxPro v5.4は、データ処理とマッピング解析に使用される。4パラメータフィッティングを通して、PD−L1に対する抗体の結合曲線およびEC50値を図4Dに示すように得て、109−chis抗体またはその標識形成のPD−L1に対する親和性能力を反映させた。
0.05Mの滅菌HCLをEckert & Ziegler GalliaPharmゲルマニウム68/ガリウム68(Ge68/Ga68)ジェネレーターでリンスして68Ga溶離液を調製し、0.2Mの酢酸ナトリウム溶液の1/2体積を加え、pH5.3の109−chis−NOTAを含む酢酸ナトリウム緩衝液0.1Mの1/4体積を加えた。反応系のpHは4.5〜4.7で、反応は室温で10分間行った。PD−10カラムを用いて未反応ガリウムイオンを除去し、生成物緩衝液を同時に生理食塩水で置換した。68Ga‐NOTA‐109‐chis注入の総放射能濃度を線量補正器(dose corrector)により分析した。
109抗体タンパク質は、構造上に遊離アミノ基を有する全部で3つのリジン基を含み、これは、その後の標識のために使用することができる。抗体標識キレートの純度を最適化し、抗体の各molがキレート1molとしか結合できないようにするために、抗体表面のリジンを変異させ、親和性を維持するために、リジンに近接するアミノ酸も変異させて、表3に示すように、109−R73N&K75E−cHis、109−K86R&P87A−cHis、109−RDNSE−cHis、109−K64Q−cHisの計4種の変異体を得た。また、変異抗体のPD−L1に対する結合能に影響を及ぼすか否かについても検討された。
PDL1−Fc融合タンパク質はHEK293によって一過性発現され、ニッケルカラム親和性クロマトグラフィーによって精製された。得られたPDL1−Fc融合タンパク質を0.5μg/well 一晩4°Cでコートした。得られたPD−L1単一ドメイン抗体タンパク質を連続希釈した後加えて室温で1 時間インキュベートした。洗浄後、抗his−ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄後に展開液を付加し、405nmの波長で吸光度値を読み取った。ソフトウェアSotfMaxPro v5.4は、データ処理とマッピング分析に使用される。4パラメータフィッティングを行ったが、PD‐L1に対する抗体の結合曲線とEC50値は、PD‐L1に対する抗体の親和性を反映するものであった。
前述したように、抗体表面のアミノ酸変異は、抗原の抗体への結合能に影響を与えなかった。キレート剤の標識率をさらに解析し、変異抗体をNOTAと結合させ、4.1に記載した方法を用いた質量分析法により同定した。
6.1 薄層クロマトグラフィー(ITLC)分析
ITLC SAはあらかじめ1cmx12cmの細片に切断し、細片の末端を互いに1cm離して鉛筆でマークした。酢酸アンモニウム1M:メタノール(1:1 V/V)溶液を3〜4mmの深さに現像槽に投入し、槽を覆い平衡化した。68Ga‐109注射液の液滴をITLC細片の下端から1cmの鉛筆線に滴下した。ITLC細片を現像タンク内に配置し、試料を負荷点(すなわち頂部鉛筆線マークまで)から10cm離して現像した。ITLCスキャンニングはラジオメトリックITLCスキャナーで行い、放射化学純度(RCP)はクロマトグラム上のピークを統合して計算した。解析結果を図6Aに示し、単一ドメイン抗体109がポジトロン核種68Gaで首尾よく標識されたことを示した。
SEC‐HPLCクロマトグラフィー条件は、Tokou sv3000SL (4.6×250mm)カラムとRaytest GABI放射能ディテクターを備えたAgilent 1100シリーズHPLCでSEC‐HPLCを行った。pH 7.0の0.1Mリン酸緩衝液を移動相としてSEC分析を行った。
細胞をウェルあたり8×105細胞および培地/ウェル3mLで6−ウェルプレート中にプレートし、37℃および5%CO2で一晩培養した。細胞を取り出し、4℃で30分間インキュベートした。すべての6−ウェルプレートを取り出し、プレート中の培地を10μci(〜50nM)の加熱標識(heat−labeled)タンパク質を含む培地に置き換え、プレートを4℃で1時間インキュベートした;プレートの3ウェル中の培地を非特異的吸着の対照試料として25μMの非標識タンパク質を含む培地に置き換えた。上清中の非結合タンパク質を含む培地を吸い出した。細胞を1%BSAを含むあらかじめ冷却したPBS2mLで2回洗浄し、増殖培地で補い、37℃および5%CO2で1時間および2時間インキュベートした。細胞を異なる期間インキュベートした後、2つの試験の上清を取り出し、細胞にpH 3.0で酢酸ナトリウム20mMを含むPBS2mLを添加し、4℃で15分間インキュベートした後、再びpH 3.0で酢酸ナトリウム20mMを含むPBS2mLを添加した。これら2つの上清は細胞表面に結合した部分のcpm値用であった。残りの細胞ペレットを0.5%SDSを含むPBS中に再懸濁し、これはエンドサイトーシスに関与する部分のcpm値用であった。細胞結合とエンドサイトーシスに関与する部分のcpm値をガンマカウンターで測定し、減衰補正を行った。図6Cに示したように、68Gaはエンドサイトーシス後には基本的に解離せず、放射性標識抗体は構造中で安定であることが示された。
健常マウスを選択し、各々に98%の放射化学純度の68Ga‐NOTA‐1090.1mLを尾静脈から注入した。注射2時間後に採尿し、HPLCで分析し、68Ga‐NOTA‐109 in vivoの安定性を測定した。
68Ga−NOTA−109の免疫学的活性は以下のように決定された。
(1) 細胞を消化してプレートし、37℃および5% CO2で一晩インキュベートした後、4℃で30分間インキュベートする。
(2) 消化された細胞はPBS500μL(pH 7.4)で3×106細胞/チューブの細胞密度に再懸濁され、1000倍過剰の109単一ドメイン抗体、または遮断抗体KN035(PD1とPDL1の結合を阻止できる治療用抗体)をそれぞれ0.5h早く加えた。
(3) 細胞に放射性反応液1μl (5μci/0.2μg)を加え、室温で0.5、1、2及び4時間インキュベートした。
(5) 細胞懸濁液および洗浄上清のcpm値をγカウンターで測定し、減衰補正を行った。
8.1 68Ga−NOTA−109 の研究に使用される動物モデル
in vivo試験には6〜8週齢の雌ヌードマウスを用いた。ヌードマウスをSPF環境で飼育し、食品と水を自由に摂取させ、標準的な12時間の昼夜照明サイクルで飼育した。異種移植のために、100μlの細胞(A375‐PDL1またはMCF‐7)/PBSをマウスの右前肢の皮下に移植した。細胞接種濃度は約5〜6×106細胞/マウスである。移植はイソフルラン麻酔下で行った。これらの条件下で、注射した動物の80%以上で、使用可能な腫瘍(100〜300mm3)(A375‐PDL1またはMCF‐7)が3〜4週後に得られた。
〜10μgの放射標識単一ドメイン抗体(〜100μCi/10μg)を尾静脈経由で、マウスに注入した。マウスは、安楽死させるまでろ紙で裏打ちしたケージに入れた。各時点で、5匹のマウスを安楽死させ、目的の組織を解剖し、ガンマカウンターにより計数した。データは、血液、腎臓、肝臓、脾臓、肺、心臓、腸、胃、筋肉、皮膚、脳、骨および腫瘍から収集した。注射量は総注射量とした。各臓器について、総注射量に基づいて注射量の%を求め、臓器重量を測定して1g当たりの注射量の%(%ID/g)を求めた。
イソフルランを用いてマウスを麻酔し、PETベッドに置き、〜10μgの放射性標識単一ドメイン抗体(〜100μCi/10μg)を尾静脈に注入した。連続PETスキャンを120分で実施し、図7Cの上および中パネルに示すように、複数の時点で腫瘍、筋肉および腎臓の放射性取り込みを分析した。二次元サブセット化による期待値最大化アルゴリズムを画像再構築に使用する。腫瘍、筋肉、肝臓等の臓器における放射能(MBq/mL)は関心領域(ROI)法により算出された。得られた値を注入量で除し、各組織におけるPETトレーサーの取り込み値(%ID/g)を求めた(組織密度を1g/mlと仮定)。計算結果を図7Dに示した。
68Ga‐NOTA‐109のPD‐L1ターゲティング能力をさらに証明し、個体差を排除するために、異なった癌細胞、A375‐HPD‐L1,A375‐HPD‐L1/A375混合物(1/1, v/v)およびA375をそれぞれ同じマウスの左後肢、右後肢および右前肢に同時に皮下接種した。当初、腫瘍の大きさは約250〜350mm3であった。
クロラミンT溶液及びメタ重亜硫酸ナトリウム溶液10mg/mLにPBS 0.05mol/Lを加え、PH=7.5で調製した。2μlのタンパク質を50μlのPB溶液に希釈した。この溶液を50μlとり、Na125I1.5mCi (10μl)に加えて混和した。クロラミンT溶液を混合溶液に加え、速やかに混合し、室温で40秒間反応させた。メタ重亜硫酸ナトリウム溶液50μlを加え、反応を終了した。クロマトグラフィーペーパーの尾部にキャピラリーを滴下して反応液を一滴吸引し、PBSを停止用の現像剤として使用してクロマトグラフィーペーパーの頂部に現像した。標識率はTLCスキャナーによって識別される。未反応125IをPD‐10カラムで除去し、生成物緩衝系を同時に生理食塩水で置換した。
Claims (27)
- プログラムデスリガンド1(PD−L1)に特異的に結合することが可能であり、少なくとも1つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むPD−L1結合ポリペプチドであって、少なくとも1つの免疫グロブリン単一可変ドメインが
配列番号5に記載のアミノ酸配列または配列番号5と比較して1以上のアミノ酸残基置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号6に記載のアミノ酸配列または配列番号6と比較して1以上のアミノ酸残基置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含み、例えば配列番号13に記載のアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号7に記載のアミノ酸配列または配列番号7と比較して1以上のアミノ酸残基置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むCDR3
を含む、PD−L1結合ポリペプチド。 - 少なくとも1つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、
配列番号5に記載のアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号13に記載のアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号7に記載のアミノ酸配列を含むCDR3
を含む、請求項1に記載のPD−L1結合ポリペプチド。 - 免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは95%、さらに好ましくは99%同一のアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載のPD−L1結合ポリペプチド。
- 免疫グロブリン単一可変ドメインが唯一のリジン残基を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のPD−L1結合ポリペプチド。
- 免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号1−2、8−12および18−22からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のPD−L1結合ポリペプチド。
- 免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のPD−L1結合ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドがPD−1のPD−L1への結合を遮断しない、請求項1〜6のいずれか一項に記載のPD−L1結合ポリペプチド。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のPD−L1結合ポリペプチドをコードする核酸分子。
- 発現調節エレメントに作動可能に連結された請求項8に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項8に記載の核酸分子を含むか、または請求項9に記載の発現ベクターで形質転換され、かつPD−L1結合ポリペプチドを発現することができる宿主細胞。
- a)PD−L1結合ポリペプチドの発現を可能にする条件下で請求項10に記載の宿主細胞を培養すること;
b)工程a)から得られた培養物から宿主細胞によって発現されたPD−L1結合ポリペプチドを回収すること;および
c)工程b)から得られたPD−L1結合ポリペプチドを任意にさらに精製および/または改変すること
を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のPD−L1結合ポリペプチドを製造する方法。 - 請求項1〜7のいずれか1つのPD−L1結合ポリペプチドおよびPD−L1結合ポリペプチドに結合した少なくとも1つの検出可能なマーカーを含む複合分子。
- 前記検出可能なマーカーが、放射性核種、蛍光剤、化学発光剤、生物発光剤、常磁性イオン、および酵素からなる群より選択される、請求項12に記載の複合分子。
- 検出可能なマーカーが、110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、68Ge、86Y、90Y、89Zr、94mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Srまたは他のγ−、β−、またはポジトロンエミッターからなる群より選択され,例えば、検出可能なマーカーが、68Gaまたは125Iである、請求項13に記載の複合分子。
- PD−L1結合ポリペプチドがキレート剤を介して検出可能マーカーに結合される、請求項12〜14のいずれか一項に記載の複合分子。
- キレート剤が、NOTA、DOTA、TETAまたはNETAからなる群より選択される、請求項15に記載の複合分子。
- 検出可能なマーカーが68Gaであり、キレート剤がNOTAである、請求項16に記載の複合分子。
- PD−L1結合ポリペプチドが、配列番号12に記載のアミノ酸配列を含む、請求項17に記載の複合分子。
- 生体試料中のPD−L1の存在および/またはPD−L1の発現レベルを検出するための方法であって、
a)生体試料および対照試料を、請求項1〜7のいずれか一項に記載のPD−L1結合ポリペプチドおよび/または請求項12〜18のいずれか一項に記載の複合分子に、請求項1〜7のいずれか一項に記載のPD−L1結合ポリペプチドおよび/または請求項12〜18のいずれか一項に記載の複合分子がPD−L1と複合体を形成することを可能にする条件下で接触させること;
b)複合体形成を検出すること
を含み、
生体試料と対照試料との間の複合体形成の相違は、試料中のPD−L1および/またはPD−L1の発現レベルの存在を示す、方法。 - 癌などのPD−L1関連疾患を検出および/または診断するための診断薬であって、請求項1〜7のいずれか一項に記載のPD−L1結合ポリペプチドおよび/または請求項12〜18のいずれか一項に記載の複合分子、および任意に生理学的に許容可能な担体を含む、診断薬。
- 診断薬が、SPECT造影剤またはPET造影剤のようなECT造影剤である、請求項20に記載の診断薬。
- 癌などのPD−L1関連疾患を検出および/または診断するための診断薬の製造における請求項1〜7のいずれか一項に記載のPD−L1結合ポリペプチドおよび/または請求項12〜18のいずれか一項に記載の複合分子の使用。
- 診断薬が、SPECT造影剤またはPET造影剤などのECT造影剤である、請求項22に記載の使用。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のPD−L1結合ポリペプチドおよび/または請求項12〜18のいずれか一項に記載の複合分子および/または請求項20〜21のいずれか一項に記載の診断薬を対象に投与することを含む、癌を検出および/または診断する方法。
- 前記対象にSPECT撮像またはPET撮像などのECT撮像を行う工程をさらに含む、請求項24に記載の方法。
- 癌がPD−L1を高度に発現する、例えば、癌が、肺癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、黒色腫、膀胱癌、乳癌、肝臓癌、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部癌、神経膠腫、胃癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、子宮頸癌、体癌、骨肉腫からなる群から選択される、請求項20〜21のいずれか一項に記載の診断薬、請求項22〜23のいずれか一項に記載の使用、または請求項24〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のPD−L1結合ポリペプチドおよび/または請求項12〜18のいずれか一項に記載の複合分子および/または請求項20〜21のいずれか一項に記載の診断薬を含むキット。
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