JP2021528537A - 高性能、低コストかつ適用が容易な抗菌コーティングのためのｎ−ハラミン−ドーパミン共重合体のシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

本出願は、N-ハラミン（HA）およびドーパミン（DMA）の共重合体およびそれらの生成方法に関する。HAおよびDMAは、共重合体中に0.4：9.6〜9.6：0.4（HA：DMA）の比で存在する。共重合体は、金属、プラスチック、ガラス、または塗料表面などの表面にコーティングされて共有結合することができる、新規抗菌組成物において使用することができる。コーティングは、ハロゲンの処理によってリチャージ可能な抗菌表面を提供する。コーティング厚さおよびハロゲン含有量は、配合を調節しコーティングを架橋することによって調整することができる。

Description

本出願は、2018年6月18日提出の米国特許仮出願第62/686,318号の恩典を主張し、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

本発明は、米国農務省によって授与されたHatch 2017-18-107の下での政府支援により行った。政府は本発明において一定の権利を有する。

分野
本出願は、N-ハラミン-ドーパミン共重合体および抗菌コーティングのためのこれらの共重合体の使用に関する。

背景
食物媒介病は、米国の公衆衛生および食品産業の収益性の両方にとって大きな負担である。米国疾病管理予防センター（CDC）は、米国では毎年、食物媒介疾患は約4,800万例の病気、128,000件の入院、3,000例の死亡をもたらすと推定している（Scallan et al., ''Foodborne Illness Acquired in the United States - Major Pathogens,'' Emerging Infectious Diseases 17(1):7-15 (2011)）。経済損失総額は、米国農務省（USDA）によって156億ドルと推定された（USDA Economic Analyses of Economic Issues That Affect the Safety of the U.S. Food Supply, 2017）。現在の食物媒介病の大多数（＞91％）は、真菌、細菌、ウイルスなどの有害微生物で汚染された食物を消費することによって引き起こされる（Scallan et al., ''Foodborne Illness Acquired in the United States - Major Pathogens,'' Emerging Infectious Diseases 17(1):7-15 (2011)）。食物媒介病原体は食品産業における食品回収の増加にも大きく寄与し：これらの回収のほぼ半分は微生物汚染による。平均して、直接費用のうちの約1,000万ドルは、ブランドの損害や売上損失を含まない、食品の単独回収に関連する（Tyco Integrated Security, ''Recall: The Food Industry's Biggest Threat To Profitability,'' Food Safety Magazine, (2012)）。したがって、食品の微生物汚染を低減する新規戦略が必要とされている。

微生物汚染は、生産自体、加工、流通、および調製を含む食品生産プロセスの複数段階で発生し得る（Larsen et al., ''Persistence of Foodborne Pathogens and Their Control in Primary and Secondary Food Production Chains,'' Food Control 44:92-109 (2014)；Muhterem-Uyar et al., ''Environmental Sampling for Listeria Monocytogenes Control in Food Processing Facilities Reveals Three Contamination Scenarios,'' Food Control 51:94-107 (2015)；Gorman et al., ''A Study of Cross-Contamination of Food-Borne Pathogens in the Domestic Kitchen in the Republic of Ireland,'' International Journal of Food Microbiology 76(1-2):143-150 (2002)；Kaneko et al., ''Bacterial Contamination in the Environment of Food Factories Processing Ready-to-Eat Fresh Vegetables,'' Journal of Food Protection 62(7):800-804 (1999)；Carrasco et al., ''Cross-Contamination and Recontamination by Salmonella in Foods: A Review,'' Food Research International 45(2):545-556 (2012)）。細菌（例えば、シュードモナス（Pseudomonas）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、サルモネラ（Salmonella）など）は固体表面に付着してコロニー形成するため、適時に排除しなければ、急速に増殖してバイオフィルムを形成し得る（Ryu et al., ''Biofilm Formation by Escherichia Coli O157:H7 on Stainless Steel: Effect of Exopolysaccharide and Curli Production on its Resistance to Chlorine,'' Applied and Environmental Microbiology 71(1):247-254 (2005)）。成熟したバイオフィルムは、強力な消毒/洗浄剤を含む一般的衛生処理に抵抗性で、したがって除去が難しいことは有名である（Corcoran et al., ''Commonly Used Disinfectants Fail to Eradicate Salmonella Enterica Biofilms from Food Contact Surface Materials,'' Applied and Environmental Microbiology 80(4):1507-1514 (2014)）。バイオフィルムに埋め込まれた細菌は、加工中に汚染された表面に接触する任意の食品の交差汚染の原因の可能性がある（Faille et al., ''Sporulation of Bacillus spp. Within Biofilms: A Potential Source of Contamination in Food Processing Environments,'' Food Microbiology 40:64-74 (2014)；Kumar et al., ''Significance of Microbial Biofilms in Food Industry: A Review,'' International Journal of Food Microbiology 42(1):9-27 (1998)；Brooks et al., ''Biofilms in the Food Industry: Problems and Potential Solutions,'' International Journal of Food Science & Technology 43(12):2163-2176 (2008)）。加えて、機械部品、床、天井、壁、および下水道を含む、食品と直接接触しない表面も、間接的な経路を介して食品に汚染を導入する可能性がある（Muhterem-Uyar et al., ''Environmental Sampling for Listeria Monocytogenes Control in Food Processing Facilities Reveals Three Contamination Scenarios,'' Food Control 51:94-107 (2015)）。そのような汚染を避けるために、衛生手順の間に単に殺菌するのではなく、細菌の付着および成長を持続的に防止することが重要である。

近年、電解水などの新規表面消毒技術（Zhang et al., ''Development of a Portable Electrolytic Sanitizing Unit for the Production of Neutral Electrolysed Water,'' LWT - Food Science and Technology, 82:207-215 (2017)）、または超音波などの物理的処理との組み合わせ（Zhao et al., ''Efficacy of Low Concentration Neutralised Electrolysed Water and Ultrasound Combination for Inactivating Escherichia Coli ATCC 25922, Pichia Pastoris GS115 and Aureobasidium Pullulans 2012 on Stainless Steel Coupons,'' Food Control 73:889-899 (2017)）を開発するためのいくつかの取り組みがなされている。しかし、これらの方法は、バイオフィルムを除去し、硬質表面上の微生物の交差汚染を防止するための前向きな方法ではなく、反応的な方法を提供する。抗菌コーティングは、表面の細菌汚染に持続的に抵抗する1つの手段を提供し、したがって、予防的制御法として使用することができる。食品機器用抗菌コーティングは、Bastarrachea et al., ''Antimicrobial Food Equipment Coatings: Applications and Challenges,'' Annual Review of Food Science and Technology 6(1):97-118 (2015)において広く検討されている。しかし、高コストの材料、食品関連環境における殺生物機能の損傷、またはスケールアップの過程での課題により、これまでに開発された技術の中で、近い将来、実験室から食品産業に容易に翻訳し得るものはほとんどない。例えば、銀系抗菌コーティングが市販されているが、高コストならびに有機負荷からの汚れおよび抗菌剤耐性による食品製造環境での無効性によって制限されている（Belluco et al., ''Silver as Antibacterial Toward Listeria Monocytogenes,'' Frontiers in Microbiology 7:307 (2016)；Chaitiemwong et al., ''Survival of Listeria Monocytogenes on a Conveyor Belt Material With or Without Antimicrobial Additives,'' International Journal of Food Microbiology 142(1):260-263 (2010)）。

近年、N-ハラミン抗菌化学は、その強力で広範な殺生物機能、低コスト、および低毒性のために、大きな関心を引きつけている（Dong et al., ''Chemical Insights into Antibacterial N-Halamines,'' Chemical Reviews 117(6):4806-4862 (2017)）。N-ハラミンは、窒素-水素結合のハロゲン化を介して形成された窒素-ハロゲン結合を含む化合物群であり、塩素系N-ハラミンが最も広く研究されている。N-ハラミンの抗菌メカニズムは次亜塩素酸塩などの他の塩素系化合物と同様であるが、違いは、塩素が共有結合を介して分子内に固定されていることである（Zhao et al., ''Efficacy of Low Concentration Neutralised Electrolysed Water and Ultrasound Combination for Inactivating Escherichia Coli ATCC 25922, Pichia Pastoris GS115 and Aureobasidium Pullulans 2012 on Stainless Steel Coupons,'' Food Control 73:889-899 (2017)）。以前、N-ハラミンは水処理、織物、生物医学装置などを含む広範な用途について集中的に研究されてきた（Bastarrachea et al., ''Antimicrobial Food Equipment Coatings: Applications and Challenges,'' Annual Review of Food Science and Technology 6(1):97-118 (2015)；Dong et al., ''Chemical Insights into Antibacterial N-Halamines,'' Chemical Reviews 117(6):4806-4862 (2017)；Hui et al., ''Antimicrobial N-Halamine Polymers and Coatings: A Review of Their Synthesis, Characterization, and Applications,'' Biomacromolecules 14(3):585-601 (2013)）。ステンレス鋼（Demir et al., ''Polymeric Antimicrobial N-Halamine-Surface Modification of Stainless Steel,'' Industrial & Engineering Chemistry Research 56(41):11773-11781 (2017)；Bastarrachea et al., ''Development of Antimicrobial Stainless Steel via Surface Modification With N-Halamines: Characterization of Surface Chemistry and N-Halamine Chlorination,'' Journal of Applied Polymer Science 127(1):821-831 (2013)）、プラスチック（Bastarrachea et al., ''Antimicrobial Coatings with Dual Cationic and N-Halamine Character: Characterization and Biocidal Efficacy,'' Journal of Agricultural and Food Chemistry 63(16):4243-4251 (2015)；Qiao et al., ''N-Halamine Modified Thermoplastic Polyurethane with Rechargeable Antimicrobial Function for Food Contact Surface,'' RSC Advances 7(3):1233-1240 (2017)）、塗料（Kocer et al., ''N-Halamine Copolymers for Use in Antimicrobial Paints,'' ACS Applied Materials & Interfaces 3(8):3189-3194 (2011)）などの食品製造において一般的に使用される材料へのN-ハラミンコーティングについて、以前にいくつかの報告がなされている。しかし、これらの以前の研究で使用された作製法は、高コストであるか、または複雑な表面前処理、冗長で高価なコーティング手順、もしくはN-ハラミン重合体のコストがかかりすぎる量を必要とする。

本開示は、当技術分野におけるこれらおよび他の欠陥を克服することを目的とする。

概要
本出願の1つの局面は、N-ハラミン（HA）およびドーパミン（DMA）の共重合体に関し、ここでHAおよびDMAは共重合体中に0.4：9.6〜9.6：0.4（HA：DMA）の比で存在する。

本出願の第2の局面は、モノマー（A）、（B）、（C）、および（D）を含む共重合体に関し、ここで、
Aは（LR¹）であるか、または存在せず；
Bは（CR²R⁷）であり；
Cは（LR³）であるか、または存在せず；
Dは（CR⁴R⁸）であり；
LはCH、N、C(O)およびOであり、LがC(O)またはOである場合にはR¹またはR³は存在せず；
R¹は独立にH、CH₃、PEG、四級アンモニウムまたは双性イオンであり；
R²は独立に、

またはその誘導体であり；
R³は独立にH、PEG、四級アンモニウムまたは双性イオンであり；
R⁴は独立に、

またはその誘導体であり；
R⁵は独立にH、Cl、Br、またはIであり；
R⁶は独立にH、Cl、Br、またはIであり；
R⁷は独立にHまたはCH₃であり；
R⁸は独立にHまたはCH₃であり；
Qは独立にH、Cl、Br、またはIであり；
zは独立に2〜6であり；

は分子への可能な結合点を示し；
B：Dの比は0.4：9.6〜9.6：0.4であり；かつ
共重合体は10〜100,000モノマーを含む。

本出願の第3の局面は、本明細書に開示する共重合体を調製するための方法に関する。本方法は、ラジカル重合可能なN-ハラミン系モノマーを提供する段階、ラジカル重合可能なドーパミン系モノマーを提供する段階、ならびにN-ハラミン系モノマーおよびドーパミン系モノマーを適切な溶媒に溶解して、N-ハラミン系モノマーおよびドーパミン系モノマーの溶液を生成する段階を含む。溶液を、次いで、フリーラジカル開始剤存在下でラジカル重合反応にかけて、N-ハラミン系モノマーおよびドーパミン系モノマーの共重合体を生成する。

本出願のさらなる局面は、本明細書に記載の共重合体を含む抗菌組成物に関する。

本出願のもう1つの局面は、抗菌コーティングした材料を生成する方法に関する。この方法は、本明細書に記載の1つまたは複数の共重合体を溶媒に溶解して、共重合体溶液を生成する段階を含む。この方法はさらに、共重合体溶液の共重合体が材料に結合するのに十分な期間、重合体溶液中に材料を浸漬し、それによりコーティングした材料を生成する段階を含む。コーティングした材料を共重合体溶液から取り出し、塩素、臭素またはヨウ素を含む第2の溶液で処理する。

環境表面は、食品加工施設における微生物汚染および伝染の一般的な道である。硬質表面のコーティングを開発する際の最も直接的な課題は、十分な接着性を確保することである。N-ハラミンコーティングに関する以前の研究は、典型的には、表面への安定した接着を達成するために、複雑な表面処理、腐食性/毒性作用物質、または過酷で長時間の加熱を必要とする、グラフティングなどの方法を用いた（Demir et al., ''Polymeric Antimicrobial N-Halamine-Surface Modification of Stainless Steel,'' Industrial & Engineering Chemistry Research 56(41):11773-11781 (2017)；Bastarrachea et al., ''Development of Antimicrobial Stainless Steel via Surface Modification With N-Halamines: Characterization of Surface Chemistry and N-Halamine Chlorination,'' Journal of Applied Polymer Science 127(1):821-831 (2013)；Bastarrachea et al., ''Antimicrobial Coatings with Dual Cationic and N-Halamine Character: Characterization and Biocidal Efficacy,'' Journal of Agricultural and Food Chemistry 63(16):4243-4251 (2015)、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。本出願において、本発明者らはムール貝に触発されたドーパミン化学を利用した（Lee et al., ''Mussel-Inspired Surface Chemistry for Multifunctional Coatings,'' Science 318(5849):426-430 (2007)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。ドーパミンは、湿潤環境下でも多様な表面に強い接着性を提供し（Lee et al., ''A Reversible Wet/Dry Adhesive Inspired by Mussels and Geckos,'' Nature 448:338 (2007)；Glass et al., ''Enhanced Reversible Adhesion of Dopamine Methacrylamide-Coated Elastomer Microfibrillar Structures Under Wet Conditions,'' Langmuir 25(12):6607-6612 (2009)、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）、生物学的適用に対して比較的安全である（Ryu et al., ''High-Strength Carbon Nanotube Fibers Fabricated by Infiltration and Curing of Mussel-Inspired Catecholamine Polymer,'' Advanced Materials 23(17):1971-1975 (2011)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。加えて、ドーパミン官能基を有する重合体は、アミンまたはチオール末端分子と架橋して、厚くて安定なネットワークを形成する、二重の機能も有する（Ryu et al., ''High-Strength Carbon Nanotube Fibers Fabricated by Infiltration and Curing of Mussel-Inspired Catecholamine Polymer,'' Advanced Materials 23(17):1971-1975 (2011)；Tian et al., ''Realizing Ultrahigh Modulus and High Strength of Macroscopic Graphene Oxide Papers Through Crosslinking of Mussel-Inspired Polymers,'' Advanced Materials 25(21):2980-2983 (2013)；Ryu et al., ''Catechol-Functionalized Chitosan/Pluronic Hydrogels for Tissue Adhesives and Hemostatic Materials,'' Biomacromolecules 12(7):2653-2659 (2011)、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。本出願において、本発明者らは、N-ハラミン抗菌機能およびドーパミン接着機能の両方を組み合わせた重合体構造を設計した。N-ハラミン-ドーパミン共重合体でコーティングしたステンレス鋼表面は、接触時間10分以内にグラム陽性菌およびグラム陰性菌両方の6 log₁₀ CFU以上を完全に不活性化した。さらに、3回の「ディスチャージ-リチャージ」サイクル後でも、塩素含有量は同様の細菌殺滅効果を維持するのに十分高いままであり、10回の「ディスチャージ-リチャージ」サイクルの後、表面塩素の60％が残存していた。コーティング厚さおよび塩素含有量は、コーティングの配合を調節することによって調整することができた。最後に、実際の食品機器部品にコーティングを適用するための、スケーラブルで簡便なスプレーコーティング法を開発した。この新しい抗菌材料は、特に食品関連の環境表面のための、高性能、低コスト、および適用しやすいコーティングとして広く適用可能である。

本出願の例示的N-ハラミン-ドーパミン共重合体の合成の図を示す。 本明細書に記載の共重合体を用いての浸漬コーティングと、続く塩素化を示す図である。 本明細書に開示する共重合体およびこれらの共重合体のコーティングの特徴づけを示す。図3Aは、合成したp(HA-co-DMA)の¹H NMRスペクトルである。HA：DMA比は7：3と算出された。 本明細書に開示する共重合体およびこれらの共重合体のコーティングの特徴づけを示す。図3Bは、HA、DMA、およびp(HA-co-DMA)のFT-IRスペクトルである。 本明細書に開示する共重合体およびこれらの共重合体のコーティングの特徴づけを示す。図3Cは、未コーティングのステンレス鋼（SS-Ctrl）および重合体コーティングした塩素化ステンレス鋼（SS-Poly1-Cl）の外観および接触角を示す写真パネルである。 本明細書に開示する共重合体およびこれらの共重合体のコーティングの特徴づけを示す。図3Dは、未コーティングのステンレス鋼（SS-Ctrl）、poly1コーティングした非塩素化ステンレス鋼（SS-Poly1）、およびpoly1コーティングした塩素化ステンレス鋼（SS-Poly1-Cl）中のC、N、ClのXPSスペクトルである。Poly1：p(HA-co-DMA)。 ステンレス鋼およびコーティングのSEM顕微鏡写真である。図4Aおよび図4Cは未コーティングのステンレス鋼であり、図4Bおよび図4Dはpoly1コーティングしたステンレス鋼である。Poly1：p(HA-co-DMA)。 複数の基体上の重合体コーティングの酸化塩素含有量のグラフである。図5Aは、異なる材料：SS（ステンレス鋼）、PP（ポリプロピレン）、HDPE（高密度ポリエチレン）、PVC（ポリ塩化ビニル）、およびガラス上の酸化塩素含有量の比較である。図5Bは、異なる「リチャージ-ディスチャージ」サイクル後の共重合体コーティングしたステンレス鋼の塩素含有量を示すグラフである。全ての実験でN＝3であった。「R」はリチャージサイクルを示す。R0：コーティングおよび塩素化。R1：1回の「ディスチャージ-リチャージ」サイクル後。R10：10回の「ディスチャージ-リチャージ」サイクル後。 表面上の抗菌効果試験のグラフである。図6Aは、異なる細菌を示し、接種菌：黄色ブドウ球菌（S. aureus）（6.40 log₁₀CFU/試料）、および大腸菌（E. coli）O157：H7（6.32 log₁₀CFU/試料）。図6Bは、異なるリチャージサイクルを示し、接種菌：黄色ブドウ球菌（R0、6.40 log₁₀CFU/試料；R1、6.32 log₁₀CFU/試料；R2、5.88 log₁₀CFU/試料）、検出限界：1.87 log₁₀CFU/試料。SS-Ctrl：未コーティング、塩素化ステンレス鋼；SS-Poly1：ハラミン-ドーパミン前駆重合体コーティング、非塩素化ステンレス鋼；SS-Poly1-Cl：ハラミン-ドーパミン重合体コーティング、塩素化ステンレス鋼。 LB培地中の未コーティングのステンレス鋼（SS-Ctrl）、N-ハラミン-ドーパミン前駆重合体コーティングしたステンレス鋼（SS-Poly1）、およびN-ハラミン-ドーパミン重合体コーティングしたステンレス鋼（SS-Poly1-Cl）の抗菌制御試験を示す蛍光顕微鏡写真パネルである。直径1〜5μmの明るい点は接着した生存菌（黄色ブドウ球菌）を示す。 架橋によるコーティング厚さおよび塩素含有量の調整を示す図である。図8Aは、PEIによる架橋のメカニズムの図である。 架橋によるコーティング厚さおよび塩素含有量の調整を示す図である。図8Bは、未コーティングのステンレス鋼（SS-Ctrl）、非架橋（SS-Poly1-Cl）、およびPEI架橋コーティング（SS-Poly1+PEI-Cl）上のC、N、ClのXPS分析およびそれらの原子パーセンテージ（at.％）を示す。 架橋によるコーティング厚さおよび塩素含有量の調整を示す図である。図8Cは、PEI、p(HA-co-DMA)、およびPEI架橋p(HA-co-DMA)+PEIコーティングのFT-IRスペクトルを示す。 架橋によるコーティング厚さおよび塩素含有量の調整を示す図である。図8Dは、浸漬コーティング法によるPEI架橋コーティング（SS-Poly1+PEI）の外観および接触角を示す画像である。 架橋によるコーティング厚さおよび塩素含有量の調整を示す図である。図8Eは、浸漬コーティング（DC）およびスプレーコーティング（SP）法によるp(HA-co-DMA)（poly1）およびpoly1+PEIコーティングした表面の酸化塩素含有量のグラフである。 ステンレス鋼（SS）304パイプ上の共重合体コーティングの外観および有効性を示す画像である。図9Aは、未コーティングのSS 304パイプである。 ステンレス鋼（SS）304パイプ上の共重合体コーティングの外観および有効性を示す画像である。図9Bは、乾燥後および0.5％漂白剤によるスプレー塩素化中のスプレーコーティングしたSSパイプの画像である。 ステンレス鋼（SS）304パイプ上の共重合体コーティングの外観および有効性を示す画像である。図9Cは、コーティングしたSSパイプ上の接種菌を示す。 ステンレス鋼（SS）304パイプ上の共重合体コーティングの外観および有効性を示す画像である。図9Dは、SS表面上の固定酸化塩素の色に基づく指標を示す。 ステンレス鋼（SS）304パイプ上の共重合体コーティングの外観および有効性を示す画像である。図9Eは、SSパイプ表面上のN-ハラミンコーティングの抗菌制御効果のグラフであり、接種菌：黄色ブドウ球菌；実験1、8.83 log₁₀CFU/mL；実験2、8.07 log₁₀CFU/mL；実験3、8.14 log₁₀CFU/mL。3つの実験全てで、試料サイズN＝3。SSP：ステンレス鋼パイプ；SS-C-Cl：N-ハラミン-ドーパミン重合体でコーティングし、0.5％漂白剤（利用可能な塩素約200ppm）で塩素化したステンレス鋼。

詳細な説明
本開示は、N-ハラミン（HA）およびドーパミン（DMA）の共重合体、ならびにその製造法に関する。本明細書に開示する共重合体は、本明細書に記載の抗菌組成物およびコーティングにおいて有用である。

上記および本明細書における記載の全体を通して用いられる以下の用語は、特に記載がないかぎり、以下の意味を有することが理解されるべきである。本明細書において別に定義されなければ、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本技術が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書の用語に対して複数の定義がある場合、特に記載がない限り、本項の定義が優先される。

「アルキル」なる用語は、直鎖または分岐であり得る脂肪族炭化水素基を意味する。別に制限されない場合、この用語は、20以下の炭素のアルキルを指す。分岐とは、メチル、エチル、またはプロピルなどの1つまたは複数の低級アルキル基が、線形アルキル鎖に連結していることを意味する。例示的アルキル基には、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、3-ペンチルなどが含まれる。

本明細書で使用される「単環式」なる用語は、1つの環を有する分子構造を示す。

本明細書で使用される「多環式（polycyclic）」または「多環式（multi-cyclic）」なる用語は、縮合、架橋、またはスピロ環を含むが、それらに限定されない、複数の環を有する分子構造を示す。

「炭素環」なる用語は、シクロペンチル、シクロヘキシルなどの、約5〜約8の環炭素を有する環状炭化水素鎖を意味する。これらの基は、1つまたは複数の官能基で置換されていてもよい。

「アリール」なる用語は、6〜約19の炭素原子、または6〜約10の炭素原子の芳香族単環式または多環式環系を意味し、アリールアルキル基を含む。アリール基の環系は置換されていてもよい。代表的なアリール基には、フェニル、ナフチル、アズレニル、フェナントレニル、アントラセニル、フルオレニル、ピレニル、トリフェニレニル、クリセニル、およびナフタセニルなどの基が含まれるが、それらに限定されない。

「ヘテロアリール」なる用語は、環系内の1つまたは複数の原子が炭素以外の元素、例えば、窒素、酸素、または硫黄である、約5〜約19の環原子、または約5〜約10の環原子の芳香族単環式または多環式環系を意味する。多環式環系の場合、環系を「ヘテロアリール」と定義するために、芳香族である必要があるのは1つの環だけである。特定のヘテロアリールは約5〜6の環原子を含む。ヘテロアリールの前の接頭辞アザ、オキサ、チア、またはチオは、それぞれ少なくとも1つの窒素、酸素、または硫黄原子が環原子として存在することを意味する。ヘテロアリール環内の窒素、炭素、または硫黄原子は、任意に酸化されていてもよく；窒素は任意に四級化されていてもよい。代表的なヘテロアリールには、ピリジル、2-オキソ-ピリジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、フラニル、ピロリル、チオフェニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、インドリル、イソインドリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インドリニル、2-オキソインドリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソキサゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ[1,3]ジオキソリル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プタラジニル、キノキサリニル、2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシニル、ベンゾ[1,2,3]トリアジニル、ベンゾ[1,2,4]トリアジニル、4H-クロメニル、インドリジニル、キノリジニル、6aH-チエノ[2,3-d]イミダゾリル、1H-ピロロ[2,3-b]ピリジニル、イミダゾ[1,2-a]ピリジニル、ピラゾロ[1,5-a]ピリジニル、[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジニル、[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジニル、チエノ[2,3-b]フラニル、チエノ[2,3-b]ピリジニル、チエノ[3,2-b]ピリジニル、フロ[2,3-b]ピリジニル、フロ[3,2-b]ピリジニル、チエノ[3,2-d]ピリミジニル、フロ[3,2-d]ピリミジニル、チエノ[2,3-b]ピラジニル、イミダゾ[1,2-a]ピラジニル、5,6,7,8-テトラヒドロイミダゾ[1,2-a]ピラジニル、6,7-ジヒドロ-4H-ピラゾロ[5,1-c][1,4]オキサジニル、2-オキソ-2,3-ジヒドロベンゾ[d]オキサゾリル、3,3-ジメチル-2-オキソインドリニル、2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジニル、ベンゾ[c][1,2,5]オキサジアゾリル、ベンゾ[c][1,2,5]チアジアゾリル、3,4-ジヒドロ-2H-ベンゾ[b][1,4]オキサジニル、5,6,7,8テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジニル、[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジニル、3-オキソ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン-2(3H)-イルなどが含まれる。

「無置換」原子は、その原子価によって規定されるすべての水素原子を有する。

「置換されていてもよい」なる用語は、基が基の各置換可能な原子に置換基（単一原子上の複数の置換基を含む）を有してもよく、ただし指定の原子の通常の原子価を超えることはなく、かつ各置換基の同一性は他とは無関係であることを示すために使用される。各残基内の最大3つのH原子は、アルキル、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、カルボアルコキシ（アルコキシカルボニルとも呼ばれる）、カルボキサミド（アルキルアミノカルボニルとも呼ばれる）、シアノ、カルボニル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、メルカプト、アルキルチオ、スルホキシド、スルホン、アシルアミノ、アミジノ、フェニル、ベンジル、ヘテロアリール、フェノキシ、ベンジルオキシ、またはヘテロアリールオキシで置き換えられる。置換基がケト（すなわち、=0）の場合、原子上の2つの水素が置き換えられる。置換基および/または変数の組み合わせは、そのような組み合わせが安定な化合物をもたらす場合にのみ許容され；「安定な化合物」または「安定な構造」とは、反応混合物から有用な程度の純度までの単離、および有効な治療剤への製剤後に残存するのに十分強固である化合物を意味する。

「ハロゲン」なる用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを意味する。

「共重合体」なる用語は、複数の種のモノマーに由来する重合体を指す。

「交互共重合体」または「交互重合体」なる用語は、1つおきの構築単位が異なる交互配列に配置された複数の種のモノマー単位からなる共重合体(-M₁M₂-)_nを指す。

「ランダム共重合体」または「ランダム重合体」なる用語は、異なるモノマー構築ブロックの配列に対して明確な順序がない共重合体、例えば、(-M₁M₂M₁M₁M₂M₁M₂M₂-)を指す。

「統計共重合体」または「統計重合体」なる用語は、モノマー単位の順序分布が公知の統計法則に従う共重合体を指す。

「ブロック共重合体」または「ブロック重合体」なる用語は、異なる反復単位の長い配列からなる高分子を指す。例示的ブロック重合体には、A_nB_m、A_nB_mA_m、A_nB_mC_k、またはA_nB_mC_kA_nが含まれるが、それらに限定されない。

「その誘導体」なる用語は、その塩、そのエステル、その遊離酸形態、その遊離塩基形態、その溶媒和物、その重水素化誘導体、その水和物、そのN-オキシド、その多形、その立体異性体、その幾何異性体、その互変異性体、その互変異性体の混合物、その鏡像異性体、そのジアステレオマー、そのラセミ体、その立体異性体の混合物、その同位体（例えば、トリチウム、重水素）、またはその組み合わせを指す。

本明細書で使用される「殺生物性」なる用語は、微生物および/またはウイルス粒子を不活性化する活性を意味する。

本出願の1つの局面は、N-ハラミン（HA）およびドーパミン（DMA）の共重合体に関する。

本開示のこの局面に従って、共重合体に存在するHAとDMAの比は0.4：9.6〜9.6：0.4（HA：DMA）の範囲である。本明細書に開示する共重合体中のHAとDMAの比は、例えば、9.6：0.4、9.5：0.5、9.4：0.6、9.3：0.7、9.2：0.8、9.1：0.9、9.0：1.0、8.9：1.1、8.8：1.2、8.7：1.3、8.6：1.4、8.5：1.5、8.4：1.6、8.3：1.7、8.2：1.8、8.1：1.9、8.0：2.0、7.9：2.1、7.8：2.2、7.7：2.3、7.6：2.4、7.5：2.5、7.4：2.6、7.3：2.7、7.2：2.8、7.1：2.9、7.0：3.0、6.9：3.1、6.8：3.2、6.7：3.3、6.6：3.4、6.5：3.5、6.4：3.6、6.3：3.7、6.2：3.8、6.1：3.9、6.0：4.0、5.9：4.1、5.8：4.2、5.7：4.3、5.6：4.4、5.5：4.5、5.4：4.6、5.3：4.7、5.2：4.8、5.1：4.9、5.0：5.0、4.9：5.1、4.8：5.2、4.7：5.3、4.6：5.4、4.5：5.5、4.4：5.6、4.3：5.7、4.2：5.8、4.1：5.9、4.0：6.0、3.9：6.1、3.8：6.2、3.7：6.3、3.6：6.4、3.5：6.5、3.4：6.6、3.3：6.7、3.2：6.8、3.1：6.9、3.0：7.0、2.9：7.1、2.8：7.2、2.7：7.3、2.6：7.4、2.5：7.5、2.4：7.6、2.3：7.7、2.2：7.8、2.1：7.9、2.0：8.0、1.9：8.1、1.8：8.2、1.7：8.3、1.6：8.4、1.5：8.5、1.4：8.6、1.3：8.7、1.2：8.8、1.1：8.9、1.0：9.0、0.9：9.1、0.8：9.2、0.7：9.3、0.6：9.4、0.5：9.5、または0.4：9.6（HA：DMA）であり得る。いくつかの態様において、本明細書に開示する共重合体中のHA：DMAの比は約7：3である。

いくつかの態様において、本明細書に開示する共重合体は、1つの種類のN-ハラミンモノマーを含む。他の態様において、本明細書に開示する共重合体は、複数の種類のN-ハラミンモノマー、例えば、2つ以上の異なる種類のN-ハラミンモノマーを含む。適切なN-ハラミンモノマーには、

およびそれらの誘導体が含まれるが、それらに限定されず、式中、
R⁵はH、Cl、Br、またはIであり；
R⁹およびR¹⁰ならびにそれらが結合している炭素は一緒になって炭素環式環を形成するか、または個々にCH₃であり；かつ
Qは独立にH、Cl、Br、またはIである。

本明細書に記載の共重合体において用いるのに適したさらなるN-ハラミンモノマーは、Dong et al., ''Chemical Insights into Antibacterial N-Halamines,'' Chemical Review 117:4806-4962 (2017)に開示されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。特に、本明細書に記載の共重合体中に組み込むことができる、例示的N-ハラミンモノマーには、

およびそれらの誘導体が含まれるが、それらに限定されない。

本明細書に記載の共重合体中に組み込むのに適したさらなるN-ハラミンモノマーには、Worleyらへの米国特許第8,496,920号、Worleyらへの米国特許第6,969,769号、Sunらへの米国特許第6,768,009号、Sunらへの米国特許第5,882,357号、Sunらへの米国特許第7,084,208号、Liらへの米国特許第6,482,756号、Liらへの米国特許第7,858,539号、Caoらへの米国特許出願公開第2015/0315389号、Worleyらへの米国特許出願公開第2016/0106098号、およびSunらへの米国特許出願公開第2015/0166796号に開示されるものが含まれ、これらはすべてその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

本明細書に記載のN-ハラミンモノマーおよびそれらを含む共重合体は、無置換であってもよく、または置換されていてもよい。

本開示のいくつかの態様において、本明細書に開示する共重合体は、1つの種類のドーパミンモノマーを含む。他の態様において、本明細書に開示する共重合体は、複数の種類のドーパミンモノマー、例えば、2つ以上の異なるドーパミンモノマーを含む。適切なドーパミンモノマーには、

およびその誘導体が含まれるが、それらに限定されず、式中、
R⁶はH、Cl、Br、またはIであり；かつ
zは2〜6である。

本明細書に開示する共重合体中に組み込むのに適した例示的ドーパミンモノマーには、エピネフリン、ノルエピネフリン、およびL-ジヒドロキシフェニルアラニンなどのドーパミンの天然類縁体、ならびに合成類縁体およびその誘導体が含まれるが、それらに限定されない。例示的ドーパミンモノマーには、

およびそれらの誘導体が含まれるが、それらに限定されない。

本明細書に開示する共重合体中に組み込むのに適したドーパミンモノマーのさらなる例には、DrumhellerおよびClaudeへの米国特許第9,447,304号、DrumhellerおよびClaudeへの米国特許出願公開第2016/0032145号、およびKizhakkedathuらへの米国特許出願公開第2018/0147326号に開示されるものが含まれ、これらはすべてその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

本明細書に記載のドーパミンモノマーおよびそれらを含む共重合体は、無置換であってもよく、または置換されていてもよい。

本出願の第2の局面は、モノマー（A）、（B）、（C）、および（D）を含む共重合体に関し、ここで、
Aは（LR¹）であるか、または存在せず；
Bは（CR²R⁷）であり；
Cは（LR³）であるか、または存在せず；
Dは（CR⁴R⁸）であり；
LはCH、N、C(O)およびOであり、LがC(O)またはOである場合にはR¹またはR³は存在せず；
R¹は独立にH、CH₃、PEG、四級アンモニウムまたは双性イオンであり；
R²は独立に、それぞれの場合に、

またはその誘導体から選択され；
R³は独立にH、PEG、四級アンモニウムまたは双性イオンであり；
R⁴は独立に、それぞれの場合に、

またはその誘導体から選択され；
R⁵は独立にH、Cl、Br、またはIであり；
R⁶は独立にH、Cl、Br、またはIであり；
R⁷は独立にHまたはCH₃であり；
R⁸は独立にHまたはCH₃であり；
Qは独立にH、Cl、Br、またはIであり；
zは独立に2〜6であり；

は分子への可能な結合点を示し；
B：Dの比は0.4：9.6〜9.6：0.4であり；かつ
共重合体は10〜100,000モノマーを含む。

本開示のこの局面に従って、本明細書に記載の共重合体中のB：Dモノマーの比は0.4：9.6〜9.6：0.4、またはその間の任意の比、例えば、9.6：0.4、9.5：0.5、9.4：0.6、9.3：0.7、9.2：0.8、9.1：0.9、9.0：1.0、8.9：1.1、8.8：1.2、8.7：1.3、8.6：1.4、8.5：1.5、8.4：1.6、8.3：1.7、8.2：1.8、8.1：1.9、8.0：2.0、7.9：2.1、7.8：2.2、7.7：2.3、7.6：2.4、7.5：2.5、7.4：2.6、7.3：2.7、7.2：2.8、7.1：2.9、7.0：3.0、6.9：3.1、6.8：3.2、6.7：3.3、6.6：3.4、6.5：3.5、6.4：3.6、6.3：3.7、6.2：3.8、6.1：3.9、6.0：4.0、5.9：4.1、5.8：4.2、5.7：4.3、5.6：4.4、5.5：4.5、5.4：4.6、5.3：4.7、5.2：4.8、5.1：4.9、5.0：5.0、4.9：5.1、4.8：5.2、4.7：5.3、4.6：5.4、4.5：5.5、4.4：5.6、4.3：5.7、4.2：5.8、4.1：5.9、4.0：6.0、3.9：6.1、3.8：6.2、3.7：6.3、3.6：6.4、3.5：6.5、3.4：6.6、3.3：6.7、3.2：6.8、3.1：6.9、3.0：7.0、2.9：7.1、2.8：7.2、2.7：7.3、2.6：7.4、2.5：7.5、2.4：7.6、2.3：7.7、2.2：7.8、2.1：7.9、2.0：8.0、1.9：8.1、1.8：8.2、1.7：8.3、1.6：8.4、1.5：8.5、1.4：8.6、1.3：8.7、1.2：8.8、1.1：8.9、1.0：9.0、0.9：9.1、0.8：9.2、0.7：9.3、0.6：9.4、0.5：9.5、または0.4：9.6（B：D）である。いくつかの態様において、本明細書に記載の共重合体中のB：Dの比は約7：3である。

本開示のこの、およびすべての態様に従って、本明細書に記載の共重合体のモノマーは、ブロック、反復パターン、またはランダムに配置され得る。例えば、モノマーが共重合体中にブロックで存在する場合、それらはA-A-A-A----B-B-B-B----C-C-C-C----D-D-D-Dなるパターンに従ってもよい。個々のブロックは反復またはランダムに整列したモノマーを含み得る。あるいは、モノマーは共重合体中に特定の反復順序、例えば、A-B-C-D-A-B-C-D-で、またはランダムな配置、例えば、B-D-C-A-C-A-C-Bで存在し得る。

いくつかの態様において、本開示の共重合体は、式（I）の共重合体である：

式中、
Aは（LR¹）であるか、または存在せず；
Bは（CR²R⁷）であり；
Cは（LR³）であるか、または存在せず；
Dは（CR⁴R⁸）であり；
LはCH、N、C(O)およびOであり、LがC(O)またはOである場合にはR¹またはR³は存在せず；
xは独立に1〜10であり；
yは独立に1〜10であり；
mは独立に1〜10であり；
nは独立に1〜10であり；
R¹は独立にH、CH₃、PEG、四級アンモニウムまたは双性イオンであり；
R²は独立に、

またはその誘導体であり；
R³は独立にH、PEG、四級アンモニウムまたは双性イオンであり；
R⁴は独立に、

またはその誘導体であり；
R⁵は独立にH、Cl、Br、またはIであり；
R⁶は独立にH、Cl、Br、またはIであり；
R⁷は独立にHまたはCH₃であり；
R⁸は独立にHまたはCH₃であり；
Qは独立にH、Cl、Br、またはIであり；
zは独立に2〜6であり；
wは1〜10,000であり；

は分子への可能な結合点を示し；かつ
m：nの比は0.4：9.6〜9.6：0.4である。

いくつかの態様において、本開示の共重合体は、式（II）の共重合体である：

式中、
R¹は独立にH、CH₃、PEG、四級アンモニウムまたは双性イオンであり；
R³は独立にH、PEG、四級アンモニウムまたは双性イオンであり；
R⁵は独立にH、Cl、Br、またはIであり；
R⁶は独立にH、Cl、Br、またはIであり；
R⁷は独立にHまたはCH₃であり；
R⁸は独立にHまたはCH₃であり；
Qは独立にH、Cl、Br、またはIであり；
zは独立に2〜6であり；
xは独立に1〜10であり；
yは独立に1〜10であり；
mは独立に1〜10であり；
nは独立に1〜10であり；
wは1〜10,000であり；かつ
m：nの比は0.4：9.6〜9.6：0.4である。

本開示のこれらの態様に従って、本明細書に記載の共重合体中のm：nの比は0.4：9.6〜9.6：0.4、または上記の通りその間の任意の比である。いくつかの態様において、本明細書に開示する共重合体中のm：nの比は約7：3である。

本開示のいくつかの態様において、共重合体の平均分子量は、約1,000〜約20,000Daの範囲である。平均分子量は、例えば、約1,000Da、約2,000Da、約3,000Da、4,000Da、約5,000Da、約6,000Da、7,000Da、約8,000Da、約9,000Da、約10,000Da、約11,000Da、約12,000Da、約13,000Da、約14,000Da、約15,000Da、約16,000Da、約17,000Da、約18,000Da、約19,000Da、または約20,000Daであり得る。

本開示のいくつかの態様において、共重合体は1.01〜2.99の範囲の多分散度を有する。本明細書に開示する共重合体の多分散度は、例えば、約1.01、約1.05、約1.10、約1.15、約1.20、約1.25、約1.30、約1.35、約1.40、約1.45、約1.50、約1.55、約1.60、約1.65、約1.70、約1.75、約1.80、約1.85、約1.90、約1.95、約2.00、約2.05、約2.10、約2.15、約2.20、約2.25、約2.30、約2.35、約2.40、約2.45、約2.50、約2.55、約2.60、約2.65、約2.70、約2.75、約2.80、約2.85、約2.90、約2.95、または約2.99からの範囲である。

本出願は、交互共重合体、ランダム共重合体、統計共重合体、セグメント化重合体、ブロック共重合体、マルチブロック共重合体、グラジエント共重合体、グラフト共重合体、星型共重合体、分岐共重合体、高分岐共重合体およびその組み合わせを含む、N-ハラミン-ドーパミン共重合体を提供する。N-ハラミン-ドーパミン共重合体は、単独で使用することもでき、または組成物中に含める、すなわち、他の材料とブレンド/混合することもできる。

いくつかの態様において、本明細書に開示するN-ハラミン-ドーパミン共重合体を、殺生物活性を想定してハロゲン化する。さらに、大規模な使用により殺生物活性が消失すれば、活性はその後のハロゲン化によって容易にリチャージすることができる。本明細書に記載の共重合体は、混合プロセスによってハロゲン化前または後に材料にブレンドすることができる。ブレンド前または後の化合物のハロゲン化は、遊離ハロゲンの供給源への曝露によって達成することができる。塩素化のために、プロセスを、気体塩素、次亜塩素酸ナトリウム漂白剤、次亜塩素酸カルシウム、クロロイソシアヌレート、および塩素化ヒダントインなどの供給源を用いて水溶液中で行うことができる。同様に、臭素化のために、プロセスを、分子臭素液、酸化剤、例えばペルオキシ一硫酸カリウムまたは次亜塩素酸漂白剤存在下の臭化ナトリウム、および臭素化ヒダントインなどの供給源への水溶液中での暴露によって達成することができる。ハロゲン化は、塩化メチレンなどの有機溶媒中で、またはtert-ブチル次亜塩素酸塩などのフリーラジカルハロゲン化剤を採用することによっても行うことができる。

本出願のもう1つの局面は、本明細書に開示するN-ハラミン-ドーパミン共重合体を調製するための方法に関する。本方法は、ラジカル重合可能なN-ハラミン系モノマーを提供する段階、ラジカル重合可能なドーパミン系モノマーを提供する段階、ならびにN-ハラミン系モノマーおよびドーパミン系モノマーを適切な溶媒に溶解して、N-ハラミン系モノマーおよびドーパミン系モノマーの溶液を生成する段階を含む。溶液を、次いで、フリーラジカル開始剤存在下でラジカル重合反応にかけて、N-ハラミン系モノマーおよびドーパミン系モノマーの共重合体を生成する。

本開示のこの局面に従って、重合プロセスで用いる適切なフリーラジカル開始剤には、2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)、過酸化ベンゾイル、1,1'-アゾビス(シクロヘキサンカルボニトリル)、t-ブチルペルオキシド、ジクミルペルオキシド、過硫酸カリウム、アラルキルハライド、アリールハライド 2,2-ジメトキシ-1,2-ジフェニル-エタン-1-オン、および(2,4,6-トリメチルベンゾイル)-ジフェニルホスフィンオキシドが含まれるが、それらに限定されない。

N-ハラミン-ドーパミン共重合体の調製方法において使用するのに適した溶媒は、使用中の重合の種類および重合温度に適合するモノマー溶解度および沸点の要件に基づいて選択される。本明細書に記載の共重合体の生成のために有用な例示的溶媒には、メタノール、エタノール、塩化メチレン、トルエン、ジオキサン、THF、クロロホルム、シクロヘキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトン、アセトニトリル、n-ブタノール、n-ペンタノール、クロロベンゼン、ジエチルエーテル、tertブタノール、1,2-ジクロロエチレン、ジイソプロピルエーテル、エタノール、酢酸エチル、エチルメチルケトン、ヘプタン、ヘキサン、イソプロピルアルコール、イソアミルアルコール、メタノール、ペンタン、n-プロピルアルコール、ペンタクロロエタン、1,1,2,2,-テトラクロロエタン、1,1,1,-トリクロロエタン、テトラクロロエチレン、テトラクロロメタン、トリクロロエチレン、水、キシレン、ベンゼン、ニトロメタン、グリセロール、およびその混合物が含まれるが、それらに限定されない。

溶媒は、安定化剤、界面活性剤、または分散剤をさらに含むことができる。適切な界面活性剤には、イオン性および非イオン性界面活性剤、例えば、ラウリル、オレイル、およびステアリルアルコールのエトキシル化生成物などのアルキルポリグリコールエーテル；オクチル-またはノニルフェノール、ジイソプロピルフェノール、トリイソプロピルフェノールのエトキシル化生成物などのアルキルフェノールポリグリコールエーテル；ラウリル硫酸ナトリウム、オクチルフェノールグリコールエーテル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウリルジグリコール硫酸ナトリウム、ならびにトリtert-ブチルフェノールとペンタおよびオクタグリコールスルホン酸アンモニウム、スルホコハク酸のエトキシル化ノニルフェノール半エステル2ナトリウム、n-オクチルデシルスルホコハク酸2ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウムなどを含む、アルキル、アリールまたはアルキルアリールスルホン酸塩、硫酸塩、リン酸塩などのアルカリ金属アンモニウム塩が含まれる。

本開示のこの局面に従って、ラジカル重合反応は、40℃〜120℃の範囲の温度で行うことができる。いくつかの態様において、ラジカル重合反応を40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、または120℃で行う。

1つの態様において、本明細書に記載のN-ハラミン-ドーパミン共重合体を生成するための重合を、フリーラジカル開始法を用いて行う。例えば、1つの態様において、ドーパミンおよびN-ハラミン前駆体のモノマーをメタノールまたは他の適切な溶媒に溶解し、この溶液を、窒素雰囲気下、溶媒の沸点で、アゾビスイソブチロニトリルと反応させて、非ハロゲン化共重合体を生成する。または、フリーラジカル開始法により、モノマーを他の種類のモノマーと共重合することもできる。この方法は、N,N-ジメチルアセトアミドまたは他の適切な溶媒に所望のすべてのモノマーを溶解する段階、窒素雰囲気下でアゾビスイソブチロニトリルを加える段階、混合物を、窒素雰囲気下、溶媒の沸点温度で反応させてN-ハラミン-ドーパミン共重合体を生成する段階を含む。ドーパミンおよびN-ハラミン前駆体モノマーとの共重合に適した他のモノマーには、アクリロニトリル、スチレン、メタクリルアミド、メチルメタクリレート、エチレン、プロピレン、ブチレン、ブタジエンならびに他のアルケンおよびジエンが含まれるが、それらに限定されない。得られた非ハロゲン化共重合体を、次いで、本明細書に記載のとおり、遊離塩素および臭素供給源などによりハロゲン化することができる。

本開示のこの局面に従って、当技術分野において公知の他の重合技術も、本発明の重合体を生成するために使用することができる。適切な重合反応には、リビングラジカル/制御フリーラジカル重合、乳化重合、懸濁重合などが含まれるが、それらに限定されない。

1つの態様において、重合反応は、活性重合体鎖末端としてのフリーラジカルとのリビング/制御重合を含む、制御フリーラジカル重合である（Moad et al., ''The Chemistry of Radical Polymerization - Second Fully Revised Edition,'' Elsevier Science Ltd. (2006)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。この形態の重合は、成長中の重合体鎖の停止能力が除去された付加重合の形態である。したがって、連鎖開始の速度は連鎖成長の速度よりもはるかに大きい。その結果、重合体鎖は従来の連鎖重合で見られるよりも一定の速度で成長し、その長さは非常に類似しているままである。重合段階は、典型的には、フリーラジカル開始剤、および重合体を生成するための触媒または連鎖移動剤の存在下で起こる。

本明細書に記載のN-ハラミン-ドーパミン共重合体の製造に適した制御フリーラジカル重合の1つの形態は、ラジカル付加開裂連鎖移動（RAFT）である。RAFT重合は、連鎖移動剤（CTA）を用いての、リビング重合または制御重合の一種である。一連の付加断片化平衡からなる、通常のRAFT重合メカニズムは、Moad et al., ''Living Radical Polymerization by the Raft Process- a First Update,'' Australian Journal of Chemistry 59: 669-92 (2006)に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。RAFT重合反応は開始から始まる。開始は、分解してフリーラジカルを生成することができる作用物質の添加によって達成され；開始剤の分解されたフリーラジカル断片はモノマーを攻撃して、成長ラジカル（P^・ _n）を生じ、ここで追加のモノマーを添加して、成長する重合体鎖を産生する。成長段階において、成長ラジカル（P^・ _n）を連鎖移動剤（CTA）に加え、続いて中間ラジカルの断片化が起こって、休止状態の重合体鎖および新しいラジカル（R^・）を生成する。このラジカル（R^・）は新しいモノマー分子と反応して、新しい成長ラジカル（P^・ _m）を生成する。鎖成長段階において、（P^・ _n）および（P^・ _m）が平衡に達し、休止状態の重合体鎖は、全ての重合体鎖が同じ速度で成長する等しい確率を提供して、重合体は狭い多分散性で合成される。RAFTでは停止が制限されており、起こったとしても無視できる。RAFTで特定の分子量を標的とすることは、消費されるモノマーと使用するCTAの濃度との比にモノマーの分子量を乗じて算出することができる。

RAFTを開始するのに適した、「開始剤」と呼ばれる開始作用物質は、モノマーの種類、触媒系の種類、溶媒系、および反応条件を含む、重合に依存する。典型的なラジカル開始剤にはアゾ化合物が含まれ、これは2炭素中心のラジカルを提供する。過酸化ベンゾイル、アゾビスイソブチロニトリル（AIBN）、1,1'アゾビス(シクロヘキサンカルボニトリル)（ABCN）、または4,4'-アゾビス(4-シアノ吉草酸)（ACVA）などのラジカル開始剤；t-ブチルペルオキシドおよびジクミルペルオキシドなどの高温開始剤；過酸化ベンゾイル/N,N-ジメチルアニリンなどの酸化還元開始剤；マイクロ波加熱開始剤；(2,4,6-トリメチルベンゾイル)-ジフェニルホスフィンオキシドなどの光開始剤；ガンマ放射線開始剤；またはスカンジウム（III）トリフレートまたはイットリウム（III）トリフレートなどのルイス酸は、RAFT重合において典型的に使用され、本明細書に記載のN-ハラミン-ドーパミン共重合体を製造する際の使用に適している。

RAFT重合は、様々なCTA剤を使用することができる。適切なCTA剤は、モノマー（ドーパミンおよびN-ハラミン）の重合を開始することができ、その過程で狭い多分散性を達成するべきである。RAFT重合を効率的にするために、初期CTA剤および重合体RAFT剤は反応性C=S二重結合を有するべきであり；中間ラジカルは、副反応なしで急速に断片化すべきであり；中間体は生成物のために分割すべきであり、かつ排出されたラジカル（R^・）は効率的に重合を再開すべきである。適切なCTA剤は、典型的にはチオカルボニルチオ化合物（ZC(=S)SR：

式中、Rはフリーラジカル脱離基であり、かつZはRAFT重合の付加および開裂速度を変更する基である）である。この種の典型的なCTA剤には、重合可能なフリーラジカルと可逆的に結合可能な、ジチオエステル化合物（Z＝アリール、ヘテロアリール、またはアルキル）、トリチオカーボネート化合物（Z＝アルキルチオ、アリールチオ、またはヘテロアリールチオ）、ジチオカルバメート化合物（Z＝アリールアミンまたはヘテロアリールアミンまたはアルキルアミン）、およびキサンテート化合物（Z＝アルコキシ、アリールオキシ、またはヘテロアリールオキシ）が含まれるが、それらに限定されない。Zはまた、スルホニル、ホスホネート、またはホスフィンであり得る。他の適切なCTA剤（またはRAFT剤）には、1-フェニルエチルベンゾジチオエート、1-フェニルエチル2-フェニルプロパンジチオエート、および当技術分野において公知の他のものが含まれる（Moad et al., ''Living Radical Polymerization by the Raft Process- a First Update,'' Australian Journal of Chemistry 59: 669-92 (2006)；Moad et al., ''Living Radical Polymerization by the Raft Process- a Second Update,'' Australian Journal of Chemistry 62(11):1402-72 (2009)；Moad et al., ''Living Radical Polymerization by the Raft Process- a Third Update,'' Australian Journal of Chemistry 65: 985-1076 (2012)；Skey et al., ''Facile one pot synthesis of a range of reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) agents.'' Chemical Communications 35: 4183-85 (2008)を参照されたく、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。CTA剤の有効性は、使用中のモノマーに依存し、フリーラジカル脱離基RおよびZ基の特性によって決定される。これらの基はRAFT剤のチオカルボニル二重結合を活性化および不活性化し、中間ラジカルの安定性を変更する（Moad et al., ''Living Radical Polymerization by the Raft Process- a Second Update,'' Australian Journal of Chemistry 62(11):1402-72 (2009)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。

RAFT反応のための開始剤および反応条件の選択法は、当技術分野において周知で、例えば、Cochranらへの米国特許出願公開第2014/0343192 A1号を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

本明細書に記載のN-ハラミン-ドーパミン共重合体を製造するために使用し得るリビングフリーラジカル重合のもう1つの形態は、原子移動ラジカル重合（ATRP）である。ATRPは、成長中の重合体鎖と触媒との間の不安定なラジカル（例えば、ハライドラジカル）の容易な移動を介して制御重合を達成する、触媒された、可逆的な酸化還元プロセスである（Davis et al., ''Atom Transfer Radical Polymerization of tert-Butyl Acrylate and Preparation of Block Copolymers,'' Macromolecules 33:4039-4047 (2000)；Matyjaszewski et al., ''Atom Transfer Radical Polymerization,'' Chemical Reviews 101:2921-2990 (2001)、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。ATRPでは、連鎖停止および移動反応は、フリーラジカル濃度を小さく保つことによって本質的に排除される。簡単に言うと、ATRPが動作するメカニズムの概要は以下のとおりであり得る：

式（1）において、不安定なラジカルXは、重合体Pの末端に連結したハロゲン（例えば、Br、Cl）であってもよい。触媒であるCu_IBrは、このハロゲンを可逆的に抽出し、重合体フリーラジカル（P^・）を生成する。不活性重合体と活性重合体フリーラジカルとの間で達成される平衡は、左側に強く偏る（K＜＜10^-8）。式（2）は、長さiの重合体とモノマーMとの間の標準的なフリーラジカル成長反応である。式（1）によって確保される低いフリーラジカル濃度は、実質的には停止反応を排除し、ハロゲン官能基は生成した重合体上に保持され、これは通常のフリーラジカル重合に適したほとんどいかなるモノマーからの共重合体生成も可能にする。

ATRP重合反応は開始から始まる。開始は、分解してフリーラジカルを生成することができる作用物質の添加によって達成され；開始剤の分解されたフリーラジカル断片はモノマーを攻撃して、モノマーフリーラジカルを生じ、最終的に重合を成長させ得る中間体を産生する。開始は、典型的には、様々な遷移金属化合物と開始剤との間の酸化還元反応における、成長するラジカルの可逆的生成に基づく。モデルハロゲン原子移動開始剤として、単純な有機ハロゲン化物を典型的に用いる。ATRPの例示的開始剤は、臭化ベンジルまたは塩化ベンジルなどのハロゲン化アラルキルまたはハロゲン化アリールである。

ATRPでは、活性状態（重合体の成長のための活性重合体フリーラジカル）と休止状態（生成した不活性重合体）との間の平衡を確立するために、反応媒体への触媒系の導入が必要である。触媒は、典型的には、開始剤および休止重合体鎖との酸化還元サイクルに関与し得る遷移金属化合物である。本明細書において用いられる遷移金属化合物は、遷移金属ハロゲン化物である。開始剤および休止重合体鎖との酸化還元サイクルに関与し得るが、重合体鎖と直接のC-金属結合を形成しない、任意の遷移金属は、本明細書に記載のN-ハラミン-ドーパミン共重合体を生成する反応において使用するのに適している。例示的な遷移金属には、Cu¹⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Ru²⁺、Ru³⁺、Ru⁴⁺、Ru⁵⁺、Ru⁶⁺、Cr²⁺、Cr³⁺、Mo⁰、Mo⁺、Mo²⁺、Mo³⁺、W²⁺、W³⁺、Mn³⁺、Mn⁴⁺、Rh⁺、Rh²⁺、Rh³⁺、Rh⁴⁺、Re²⁺、Re³⁺、Re⁴⁺、Co⁺、Co²⁺、Co³⁺、V²⁺、V³⁺、V⁴⁺、V⁵⁺、Zn⁺、Zn²⁺、Au⁺、Au²⁺、Au³⁺、Hg⁺、Hg²⁺、Pd⁰、Pd⁺、Pd²⁺、Pt⁰、Pt⁺、Pt²⁺、Pt³⁺、Pt⁴⁺、Ir⁰、Ir⁺、Ir²⁺、Ir³⁺、Ir⁴⁺、Os²⁺、Os³⁺、Os⁴⁺、Nb²⁺、Nb³⁺、Nb⁴⁺、Nb⁵⁺、Ta³⁺、Ta⁴⁺、Ta⁵⁺、Ni⁰、Ni⁺、Ni²⁺、Ni³⁺、Nd⁰、Nd⁺、Nd²⁺、Nd³⁺、Ag⁺、およびAg²⁺が含まれる。典型的な遷移金属触媒系はCuCl/CuCl₂である。

リガンドは、遷移金属と成長する重合体ラジカルとの間に直接結合が形成されないように、遷移金属化合物と配位するようにはたらき、生成した共重合体を単離する。リガンドは、遷移金属と配位してσ結合を形成する、任意のN、O、PもしくはS含有化合物、遷移金属と配位してπ結合を形成する、任意のC含有化合物、または遷移金属と配位してC-遷移金属σ結合を形成するが、重合条件下でモノマーとC-C結合を形成しない、任意のC含有化合物であり得る。ATRPで使用される典型的なリガンドは、ペンタメチルジエチレントリアミン（PMDETA）である。

ATRP反応のための開始剤および触媒/リガンド系を選択する方法は、当技術分野において公知で、例えば、Matyjaszewskiらへの米国特許第5,763,548号；Matyjaszewskiらへの米国特許第6,538,091号；およびMatyjaszewski (Matyjaszewski et al., ''Atom Transfer Radical Polymerization,'' Chemical Reviews 101:2921-2990 (2001)を参照されたく、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

前述の任意の重合反応で用いるN-ハラミンおよびドーパミンモノマーの濃度は、部分的には、モノマーおよび重合体生成物の溶解度ならびに溶媒の蒸発温度に依存する。溶媒濃度は、重合体のゲル化にも影響を及ぼし得る。不十分な溶媒は、重合体が十分に高い変換に達することなく、より短い期間で架橋する原因となり得る。反応中に溶媒に溶解したモノマーの濃度は、1重量％〜100重量％モノマーの範囲であり得る。典型的には、90重量％未満のモノマー濃度が、得られる重合体の溶解性を確保し、さらに早期のゲル化を防止するのに適している。

本明細書に記載の生成共重合体または本明細書に記載の共重合体を含む材料もしくは表面に殺生物活性を提供するために、共重合体または共重合体を含む材料/表面を、本明細書に記載のとおりにハロゲン化する。1つの態様において、共重合体を、材料への組み込みまたは表面への接着の前にハロゲン化する。もう1つの態様において、非ハロゲン化共重合体を、表面に接着または材料に組み込み、その後ハロゲン化することができる。

本明細書に記載のN-ハラミンおよびドーパミン共重合体殺生物活性は、感染症、ならびに有害臭および不快な着色を引き起こし得る、細菌、真菌、カビ、ウイルスなどの病原微生物を不活性化および/または中和するために使用することができる。コーティングなどの、N-ハラミン-ドーパミン共重合体を含む組成物は、セルロース、合成繊維、織物、フィルター材料、ラテックス塗料、キチン、キトサン、ガラス、セラミックス、プラスチック、ゴム、セメントグラウト、ラテックスコーキング、磁器、アクリルフィルム、ビニール、ポリウレタン、シリコンチューブ、大理石、金属、金属酸化物、およびシリカを含むが、それらに限定されない、多様な多孔性および非多孔性基体に適用する、またはそれらと共に使用することができる。

本出願のもう1つの局面は、本明細書に記載のN-ハラミン-ドーパミン共重合体を含む抗菌組成物に関する。抗菌組成物は、前述の基体表面に殺生物活性を付与するためにその基体の任意の表面にコーティングを形成するために使用し得る、液体、粉末、またはエアロゾル形態であり得る。抗菌組成物の共重合体は、共有結合を介して基体の表面に接着する。さらに、抗菌組成物の共重合体は、例えば、表面上の抗菌組成物のコーティング厚さを増すために互いに架橋することができる。1つの態様において、コーティングの共重合体を、ポリエーテルイミド架橋剤によって相互に架橋する。

本開示のもう1つの局面は、抗菌コーティングなどの、N-ハラミン-ドーパミン共重合体またはN-ハラミン-ドーパミン共重合体を含む組成物でコーティングした基体、材料、装置またはシステムに関する。適切な装置またはシステムには、食品貯蔵装置、食品加工装置、空気ろ過システムのエアフィルター、水システムのパイプおよびフィルター、ならびに病院および他の医療施設における生物医学装置、機器、器具、および家具が含まれるが、それらに限定されない。装置またはシステムは、10nmの厚さの抗菌コーティングを有し得る。

本出願のもう1つの局面は、抗菌コーティングした材料を生成する方法に関する。この方法は、本明細書に記載の1つまたは複数の共重合体を溶媒に溶解して、共重合体溶液を生成する段階を含む。この方法はさらに、共重合体溶液の共重合体が材料に結合するのに十分な期間、共重合体溶液中に材料を浸漬し、それによりコーティングした材料を生成する段階を含む。コーティングした材料を共重合体溶液から取り出し、ハロゲン、例えば、塩素、臭素またはヨウ素を含む第2の溶液で処理する。塩素を含む適切な溶液は漂白剤溶液である。他の適切な溶液には、次亜塩素酸カルシウム、N-クロロスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸ナトリウム、トリクロロイソシアヌル酸、次亜塩素酸tert-ブチル、N-クロロアセトアミド、およびN-クロラミンの溶液が含まれる。

いくつかの態様において、材料を、所望の厚さ、すなわち、1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、または＞10nmの厚さのコーティングを作製するのに有効な条件下で浸漬する。共重合体溶液中での繰り返し浸漬の回数または共重合体溶液中での材料浸漬の持続時間などの、浸漬の条件を変化させることで、コーティング厚さを調節することになる。これは、共重合体溶液中での繰り返し浸漬を含む。

いくつかの態様において、コーティング厚さを、共重合体溶液に材料を浸漬する前に、共重合体溶液に架橋剤を添加することによって変化させることができる。共重合体溶液中の共重合体に対する架橋剤の比は、1：10〜10：1の範囲、またはその間の任意の比、例えば、1：10、2：9、3：8、4：7、5：6、6：5、7：4、8：3、9：2、または10：1であり得る。架橋剤は、共重合体溶液中の共重合体間の架橋を誘導し、所望の材料上のコーティング厚さを増加させることになる。

本開示のこの局面に従ってコーティングすることができる多孔性および非多孔性材料を上に記載し、それらにはセルロース、合成繊維、織物、フィルター材料、ラテックス塗料、キチン、キトサン、ガラス、セラミックス、プラスチック、ゴム、セメントグラウト、ラテックスコーキング、磁器、アクリルフィルム、ビニール、ポリウレタン、シリコンチューブ、大理石、金属、金属酸化物、およびシリカが含まれるが、それらに限定されない。

本明細書に記載のN-ハラミン-ドーパミン共重合体を、公知の技術を用いて基体の表面に沈着させることができる（例えば、米国特許出願第2018/0327627号を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。本明細書に記載のN-ハラミン-ドーパミン共重合体を硬質基体表面に沈着させる1つの例示的方法は、蒸着技術を含む。例えば、物理蒸着（PVD）および化学蒸着（CVD）を含む、蒸着の一般的カテゴリに該当するいくつかの方法がある。PVDは、粒子を気化させ、真空中の基体に沈着させる必要がある。熱分解を伴わずに粒子を気化させるのに必要な温度で熱安定性が要求される。CVDは、溶媒を使用せずにコーティングを沈着させる。このプロセスは、気相モノマーを、より低温の基体上で高度に架橋したネットワークに重合する必要がある。このプロセスは、無機コーティング法において広く利用される。有機コーティングの使用は、主に電子工学および包装用の薄膜適用である。このプロセスは、使用する化学に応じて、低圧または高真空環境で利用することができる。

もう1つの態様において、本明細書に記載のN-ハラミン-ドーパミン共重合体を、液体沈着（例えば、ブラシ、ロールまたはスプレー）を用いて材料の表面に沈着させる。これらの方法は、基体の表面を改変するための最も一般的に使用される工業的方法であり得る。これらの方法は、基体表面上に液体重合体を噴霧、回転およびブラッシングすることからなる。基体への適用後、典型的には、乾燥または乾燥および硬化プロセスを行う。この方法は、その単純さおよび比較的低い資本しか必要とされないため、多くの塗装ならびに市販のコーティング製品を対象とする。

もう1つの態様において、本明細書に記載のN-ハラミン-ドーパミン共重合体を、粉末スプレーコーティング（PSC）を用いて材料の表面に沈着させる。PSCは、小さい粒子をスプレーとして放出し、基体の表面に静電気的に接着させる、一般的な工業的方法である。次いで、粒子を加熱し、粘度がより低い状態で融解または流動させる。次いで、コーティングは、架橋し、硬化して、固体膜を形成することができる。

もう1つの態様において、本明細書に記載のN-ハラミン-ドーパミン共重合体を、浸漬床（DB）および流動床（FB）適用を用いて材料の表面に沈着させる。DB法は十分に特徴付けられており、最も基本的な工業的方法の1つである。DB法は、基体を重合体の浴中に沈下または浸漬することを含み、ここで基体を制御された速度で取り出し、任意の溶媒を蒸発させ、それによって表面上の重合を完了させる。DB法は、UV硬化、オーブン硬化または赤外線硬化と共に使用することができる。DB法の他の形態には、基体を任意の種類の浴または溶液を通過させる、ロールおよびシート系プロセスが含まれる。FB法は、DB法と同様で、粉末コーティングの変形と考えてもよい。このプロセスでは、加熱した物品を流動粉末中に入れ、次いで、粉末が基体上に融解して、潜熱およびコーティングの所望の厚さに基づいて膜が形成される。次いで、基体をタンクから取り出す。このプロセスは静電気的流動床でも使用することができる。

N-ハラミンおよびドーパミン官能基の両方を組み合わせて新規抗菌コーティング材料を形成する重合体を本明細書に記載する。ドーパミン基は、重合体が化学組成（金属、プラスチック、ガラス、塗料）、サイズ、または形状に関係なく、様々な基体表面にしっかりと吸着することを可能にする。N-ハラミン部分は、塩素漂白剤で定期的に処理することにより「リチャージ」し得る、コーティング表面の強力な抗菌機能を提供する。例えば、本明細書の実施例に記載のとおり、N-ハラミン-ドーパミン共重合体コーティングしたステンレス鋼表面は、接触時間10分以内にグラム陽性菌およびグラム陰性菌両方の6 log₁₀ CFU以上を完全に不活性化した。さらに、100回の「ディスチャージ-リチャージ」サイクル後でも、塩素含有量は同様の有効性を維持するのに十分高いままであった。コーティング厚さおよび塩素含有量は、コーティングの配合を調節することによって調整することができた。最後に、コーティングを適用するためのスプレーコーティング法は、実際の食品機器部品を処理するのに合わせて調整し得ることが示された。したがって、本明細書に記載のN-ハラミン-ドーパミン共重合体材料は、安全性および予防的制御適用のための多数の表面上に高性能、低コスト、かつ適用が容易なコーティングを生成する大きな可能性を有する。

本発明の所与の局面、特徴、態様、またはパラメータに対する優先度および選択肢は、文脈が特に示す場合を除き、本発明の他のすべての局面、特徴、態様、およびパラメータに対する任意およびすべての優先度および選択肢との組み合わせで開示されたと見なされるべきである。

以下の実施例は、本出願の様々な局面を例示するために提示するが、特許請求する発明の範囲を限定する意図はない。

材料および方法
N-(1,1-ジメチル-3-オキソブチル)アクリルアミドはTCI Chemical, Japanから購入した。3,4-ジヒドロキシフェネチルアミン塩酸塩、2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)（AIBN）、およびポリ(エチレンイミン)（PEI）はSigma-Aldrich（St. Louis, MO）から購入した。ポリプロピレン、高密度ポリエチレン、およびステンレス鋼316LはMcMaster-Carr（Aurora, OH）から購入した。細菌LIVE/DEADキット（Invitrogen）はLife Technologies Corporation（Eugene, Oregon）から購入した。すべての化学物質および試薬は受領したままで使用した。細菌株黄色ブドウ球菌ATCC 3359（病院から単離）および大腸菌O157:H7 ATCC 43890（ヒト糞便から単離）はFood Microbiology Lab at Cornell University, Ithaca, NYから入手した。

実施例1−ハラミンおよびドーパミンモノマーの合成
ハラミンビニルモノマー（HA）の合成。N-ハラミン前駆体ビニルモノマーであるヒダントインアクリルアミド（HA）［N-(2-メチル-1-(4-メチル-2,5-ジオキソイミダゾリジン-4-イル)プロパン-2-イル)アクリルアミド］を、Bucherer-Bergs反応（Kocer et al., ''N-Halamine Copolymers for Use in Antimicrobial Paints,'' ACS Applied Materials & Interfaces 3(8):3189-3194 (2011)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）に基づき以前に報告された方法に従って合成した。簡単に言うと、水/エタノール（体積比1：1）溶媒混合物中の1：2：6モル比のN-(1,1-ジメチル-3-オキソブチル)アクリルアミド（TCI, Japan）、シアン化カリウム、および炭酸アンモニウムを、丸底フラスコ中、室温で4日間撹拌した。エタノールの蒸発後、粗生成物を希HClに曝露し、続いてろ過することにより単離した。生成物を、178℃の融点を有する白色粉末として、収率89％で得た。その構造をNMR、FT-IR、および質量分析により確認した。

ドーパミンビニルモノマー（DMA）の合成。ドーパミンビニルモノマーであるドーパミンメタクリルアミド（DMA）を、Lee et al. ''Mussel-Inspired Surface Chemistry for Multifunctional Coatings,'' Science 318(5849):426-430 (2007)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載の以前の方法に従って合成した。簡単に言うと、ジヒドロキシベンゼン部分を保護するために、100mlの蒸留水中、10gのホウ酸ナトリウムおよび4gの炭酸水素ナトリウムを加えて、反応媒体を調製した。ホウ酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムはいずれも水中で飽和し、いくらかの不溶性を示した。水溶液を20分間の窒素通気により脱気し、この溶液に5gの3,4-ジヒドロキシフェネチルアミン塩酸塩を加えた。25mlのテトラヒドロフラン（THF）中のメタクリレート無水物溶液（4.7ml）を別に調製し、3,4-ジヒドロキシフェネチルアミン塩酸塩を含む水溶液中に滴加した。調製した溶液のpHをpH指示紙でチェックした。反応混合物を適度に塩基性（pH8以上）に維持するために、1M NaOH溶液を滴加した。反応混合物を室温で窒素通気しながら14時間撹拌した。この時点で、白色のスラリー様溶液が生成し、次いで50mlの酢酸エチルで2回洗浄した。溶液中で生じた固体を減圧ろ過し、得られた水溶液を6MのHCl溶液でpH2まで酸性化した。溶液の有機層を酸性化した水溶液から50mlの酢酸エチルで3回抽出した。抽出した酢酸エチル中の澄明褐色有機層をMgSO4で乾燥した。溶液量をロータリーエバポレーターで25mlまで減量した。得られた溶液を250mlのヘキサンに激しく撹拌しながら加えて、帯褐色固体を沈澱させ、次いで生成した懸濁液を冷却して、結晶形成サイズを最大にした。精製するために、得られた淡褐色固体を20mlの酢酸エチルに溶解し、300mlのヘキサン中で沈澱させた。最終固体粉末を減圧下で終夜乾燥した。

実施例2−N-ハラミン-ドーパミン共重合体の化学合成
フリーラジカル重合法を用いて、N-ハラミン-ドーパミン共重合体を調製した。重合のために、100％MeOH（20mL）を溶媒として用い、HA（7mmol）およびDMA（3mmol）をモノマーとして用い、かつAIBN［2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)］（40mg）を開始剤として用いた。反応混合物に窒素ガスを20分間通気して、酸素を除去した。重合を60℃で3時間行った。室温まで冷却した後、白色の粘稠重合体がフラスコの底に沈澱し、これを回収した。重合体を熱MeOHを用いてさらに洗浄した。湿性重合体生成物を、次いで、80％EtOHに100mg/mLで溶解して保存溶液とし、冷蔵庫に貯蔵した。重合体を¹H NMR、FT-IR（フーリエ変換赤外分光法、Bruker Vertex V80V vacuum FTIR system）、およびGPC（ゲル浸透クロマトグラフィ、Waters Ambient Temperature GPC:DMF）で特徴づけた。図1は、本出願のN-ハラミン-ドーパミン共重合体の合成の図を示す。

実施例3−浸漬コーティングおよびN-ハラミン活性化
浸漬コーティング法を用いて、N-ハラミン-ドーパミン共重合体組成物を様々な基体上にコーティングし、塩素化を用いてN-ハラミン部分を活性化した（図2）。N-ハラミン-ドーパミン重合体（poly1、HA-co-DMA、HA：DMA＝7：3）の作業溶液を、溶媒として80％EtOHを用いて、保存溶液から2mg/mLで調製した。コーティング接着を試験するために、316Lステンレス鋼、プラスチック（PP、PVC、HDPE）、およびガラスを含む、5つの異なる材料基体を切断して1平方インチの試験片とし、DI水で洗浄した。次に、試験片をコーティング溶液に3時間浸漬した。その後、試験片を80％EtOHで短時間洗浄して、任意の非結合または緩く接着した重合体分子を除去し、ドラフト内で少なくとも2時間乾燥した。poly1コーティングした試験片を10％漂白剤溶液（8.25％次亜塩素酸塩、HClでpHを7.0に調節、利用可能な塩素含有量は約4000ppm）で30分間処理することにより塩素化し、DI水で十分に洗浄して表面上の任意の遊離塩素を除去し、ドラフト内で終夜乾燥した。コーティングを接触角ゴニオメーター（Rame-Hart）およびXPS（X線光電子分光法）で特徴づけた。

実施例4−表面塩素滴定
N-ハラミン-ドーパミン重合体コーティングした試験片の表面上の固定酸化塩素含有量（N-ハラミン）を、ヨウ素/チオスルフェート滴定法（Qiao et al., ''N-Halamine Modified Thermoplastic Polyurethane with Rechargeable Antimicrobial Function for Food Contact Surface,'' RSC Advances 7(3):1233-1240 (2017)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）を用いて判定した。簡単に言うと、2つの試験片（1 in²）をヨウ化カリウム（KI）、水、およびHClを含むフラスコ中に入れ、試験片を室温で10分間撹拌した。次に、得られた溶液に0.5％デンプン溶液を加え、チオ硫酸ナトリウムで滴定した。酸化塩素含有量を、以下の式を用いて算出した：
[Cl⁺] (μg/cm²)＝(N×V×35.5)/2A
式中、NおよびVは滴定剤チオ硫酸ナトリウムの規定度（当量・L^-1）および体積（L）であり、かつAは規定する試料の全表面積（cm²）である。各材料の試験片に対して3群を繰り返した。

コーティング安定性およびリチャージ可能性を調べるために、ステンレス鋼試料を用いて滴定した。最初の塩素化および滴定（R0）の後、試料を回収し、DI水で十分に洗浄し、前に記載したのと同じ条件で塩素化し、この工程を1回の「ディスチャージ-リチャージ」サイクル（R1）と規定した。この工程をさらに9回繰り返し、得られたSS試験片をR10と命名した。高濃度の漂白剤処理段階が、表面からのコーティングの剥離において最も危険であるため、1サイクルにおける塩素化処理の時間（10％漂白剤、30分）を用いて1回の「ディスチャージ-リチャージ」サイクルを表し、10回のリチャージサイクル後の表面上のコーティング安定性を調査した。

実施例5−表面殺生物効果試験
N-ハラミン-ドーパミンコーティングしたステンレス鋼表面の殺生物効果を、以前に記載された「サンドイッチ」接触致死試験法を用いて判定した（Qiao et al., ''N-Halamine Modified Thermoplastic Polyurethane with Rechargeable Antimicrobial Function for Food Contact Surface,'' RSC Advances 7(3):1233-1240 (2017)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。グラム陰性菌の大腸菌O157:H7およびグラム陽性菌の黄色ブドウ球菌をこの試験で用いた。各細菌の単一のコロニーを15mLの脳心臓浸出物（BHI）ブロス中に移し、37℃で16時間インキュベートした。培養物を遠心分離によってペレット化し、Butterfieldのリン酸緩衝液（BPB）で2回洗浄し、最後にBPB緩衝液に再懸濁した。細菌集団密度をO.D._640nmにより推定し、接種菌を調製した。25μL量の接種菌（約4×10⁷ CFU/mLの細菌）を正方形の試験片の中心に加え、第2の同じ試験片を試料上に置き、サンドイッチを滅菌した重しで圧迫して、確実に接種した菌と完全に接触させる。接触時間10、30、および60分で、試験片を5mLのNa₂S₂O₃溶液（0.05N）中に移し、激しくボルテックス処理して、任意の酸化塩素残渣を失活させ、生存菌を試料から分離した。10倍連続希釈を全ての試料で行い、各希釈液をトリプチケースソイ寒天プレートに加えた。プレートを37℃で48時間インキュベートし、細菌コロニーを数え、殺生物効果試験のために記録した。接種菌の細菌数（CFU/試料）および各接触時間の細菌数を以下に示すとおりに算出した：細菌数（log₁₀CFU/試料）＝log₁₀［（寒天プレート上の細菌数×希釈因子×5mL）/（0.025mL）］。

リチャージ可能な抗菌機能を、同じ「サンドイッチ」法を用いて判定したが、グラム陽性菌黄色ブドウ球菌だけを接種した。最初の抗菌試験サイクル（R0）の後、全ての試料を回収し、70％EtOHで衛生化した。N-ハラミンコーティングしたSS表面上の全ての塩素は抗菌試験手順（チオ硫酸ナトリウム溶液中でのボルテックス処理）中に失活したため、コーティングは完全に「ディスチャージ」され、抗菌活性はまったくなかった。コーティングを同じ塩素化手順を繰り返すことによって「リチャージ」した。これらの「リチャージ」したN-ハラミンコーティングしたSS（R1）を、同じ手順に従っての第2の「サンドイッチ」試験のために用いた。同じ手順をもう1回繰り返し、結果をR2として記録した。

実施例6−細菌生息防止試験
有機負荷下でのコーティング表面の包括的抗菌制御効果を調査するために、細菌生息防止試験を以前に報告された方法に従い、いくつかの変更を加えて実施した（Bastarrachea et al., ''Antimicrobial Food Equipment Coatings: Applications and Challenges,'' Annual Review of Food Science and Technology 6(1):97-118 (2015)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。簡単に言うと、黄色ブドウ球菌の終夜培養物を調製して、LB（Luria-Bertani）培地中の最終細胞密度を10⁶ CFU/mLとした。次に、三つ組試料（1.5×0.5cm²）を細菌溶液に室温で3時間浸漬した。次いで、試料を取り出し、PBS緩衝液で洗浄し、細菌LIVE/DEADキットで染色した。試料を蛍光顕微鏡法（EVOS(商標) FL Cell Imaging System、Thermo Scientific）により観察して、細菌生存度を評価した。Live/dead画像法のための波長は、生細胞に対しては緑色蛍光タンパク質（470/22nm）および死細胞に対しては赤色蛍光タンパク質（531/40nm）である。表面上に接着して生存した細菌だけが、表面上で緑色蛍光（1〜5μmの間の直径を有する明るい点）を発光する。未コーティングのステンレス鋼（SS-Ctrl）、N-ハラミン前駆重合体コーティング（SS-Poly1、非塩素化）およびN-ハラミン重合体コーティング（SS-Poly1-Cl、塩素化）ステンレス鋼の表面上に残っている生菌の密度を比較した。

実施例7−架橋によるコーティング厚さの調整
コーティング厚さをさらに増加させるために、以前に記載されたPEIを架橋剤として用いた（Lee et al., ''Mussel-Inspired Surface Chemistry for Multifunctional Coatings,'' Science 318(5849):426-430 (2007)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。簡単に言うと、2mg/mLの重合体溶液を80％EtOHおよび20％トリス-HCl緩衝液（pH8.5）で調製し、溶液の最終pHは約pH8.0であった。PEI（100mg/mL）溶液をDI水中で調製した。重合体溶液およびPEI溶液をPoly1：PEI＝1：5のモル比で混合した。次いで、浸漬コーティング手順のために溶液を用いた：試料を溶液中に10秒間浸漬し、取り出し、ドラフト内で1時間乾燥/硬化させた。その後、試料を80％EtOHで十分に洗浄して、任意の緩く接着した分子を除去した。次いで、試料を前述と同じ塩素化条件下で塩素化した。試料を水接触角、FT-IR、およびXPSにより特徴づけた。加えて、スプレーコーティング法を、PEIを含む、および含まないpoly1溶液に対し、ミスト噴霧器ボトルを用いて実施した（試料を噴霧中は垂直に向けた）。コーティングした試料を乾燥/硬化し、清浄化し、浸漬コーティングと同じ方法で塩素化した。これら全ての浸漬コーティングおよびスプレーコーティングした試料を塩素含有量について滴定した。

実施例8−スケールアップおよび実際の食品機器への適用
Poly1＋PEIの最適化された配合を、スプレーコーティングによる実際の食品機器部品のコーティングに用いた。ステンレス鋼（304）パイプを食品加工工場から直接取り、石鹸および水で十分に清浄化した。PEI配合poly1溶液（5mg/mL）を、ミスト噴霧器を用いて外表面に噴霧し、これは5分以内に完全に乾燥した。空気中でさらに1時間硬化した後、コーティングしたパイプ表面およびコーティングしていないパイプ表面の両方に0.5％漂白剤を噴霧し、乾燥させた。塩素化工程を3回繰り返して、十分な塩素化を確実にした。その後、パイプ全体をDI水で十分に洗浄して、表面上のいかなる遊離塩素残渣も除去した。N-ハラミンコーティングしたパイプ上の酸化塩素を可視化するために、ヨウ素滴定のメカニズムに基づく単純な方法を用いた。水、酸、ヨードカリウム、およびデンプン溶液を含む指示薬溶液をインサイチューで調製し、この溶液の一滴を表面に滴下した。十分な酸化塩素が表面に固定されていれば、溶液は5秒以内に無色から青色に変化した。固定された酸化塩素が表面になければ、溶液は少なくとも1分間無色のままである。綿棒を指示薬溶液に浸し、表面を簡単に拭き取るスワビング法も開発した。表面がN-ハラミンコーティングでうまくコーティングされれば、綿は5秒以内に無色から青色に変化した。しかし、コーティングがないか、またはN-ハラミンが活性化されなければ、綿は少なくとも1分間無色のままであった。

SSパイプ上のN-ハラミンドーパミンコーティングの抗菌制御効果を、以前に報告された方法に従い、いくつかの変更を加えて実施した（Chaitiemwong et al., ''Survival of Listeria monocytogenes on a Conveyor Belt Material With or Without Antimicrobial Additives,'' International Journal of Food Microbiology 142(1):260-263 (2010)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。簡単に言うと、終夜培養した細菌（黄色ブドウ球菌）を遠心分離し、PBSで洗浄し、PBS（リン酸緩衝化食塩水）中に再懸濁して、細胞密度5×10⁸ CFU/mLの接種菌を調製した。清浄で無菌の綿棒を細菌溶液に浸し、コーティング領域および非コーティング領域の両方に対し1.5 in²の表面積に均等に広げた。1時間の接触後、表面上の生存細菌をBPW（緩衝化ペプトン水）溶液により予め湿らせた綿棒で十分に拭き取って回収し、次いで綿棒を1mLのBPW溶液に入れ、2分間ボルテックスにかけて、全ての細菌を溶液中に脱離させた。その後、溶液を連続希釈し、TSA（トリプチケースソイ寒天）プレートに接種した。プレートを37℃で24時間インキュベートし、細菌コロニー形成単位（CFU）を記録し、抗菌制御効果を評価するために比較した。コーティング表面および非コーティング表面の両方について、各実験で三つ組の面積を試験した。最初の実験（実験1）の後、パイプを70％EtOHで十分に消毒し、水道水を用いて軽作業用スポンジたわし（Scotch-Brite(商標)、3M）で十分に洗浄した。次いで、表面を0.5％塩素漂白剤で処理し、乾燥し、十分に洗浄し、次の実験（実験2）のために終夜保存した。この手順を異なる3日間に合計3回繰り返し、それぞれ実験1、2、および3として記録した。三つ組実験の結果を組み合わせた。コーティング表面および非コーティング表面上の生存黄色ブドウ球菌の数における差の有意性（P＜0.05）を、Windows 7用SPSSを用い、ANOVAおよび一般的な線形モデルで判定した。

実施例1〜7の考察
N-ハラミン-ドーパミン共重合体p(HA-co-DMA)を、NMRおよびFT-IRによって特徴付けた。NMRスペクトル（図3A）において、HA（δ10.7ppm、N-H）およびDMA（δ6.25〜6.75ppm、カテコール）両方の特徴的なピークが重合体鎖で観察されたが、各モノマーの二重結合（δ5.5〜6.0ppm）は消失し、N-ハラミンおよびドーパミン基を含む純粋な重合体が得られたことが確認された。重合体鎖におけるHAおよびDMA比を、NMRスペクトルのピークを積分することにより7：3と算出し、これはHAおよびDMAモノマーの設計した供給比（7：3）と一致していた。以前の報告によると、20〜30％のDMA含有量は、典型的には、接着効果を提供するのに十分であり（Glass et al., ''Enhanced Reversible Adhesion of Dopamine Methacrylamide-Coated Elastomer Microfibrillar Structures Under Wet Conditions,'' Langmuir 25(12):6607-6612 (2009)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）、したがって得られたp(HA-co-DMA)は、分子組成に基づいて十分な接着性を有すると予想された。加えて、GPCの結果は、重合体が分子量M_n＝11,957およびM_w＝18,225を有し、PDI（多分散性）＝1.52であることを示した。FT-IRスペクトル（図3B）は、ヒダントイン（1767および1718cm^-1）およびドーパミン基（1519cm^-1）の特徴的なピークを示した。まとめると、これらのデータは、N-ハラミン-ドーパミン官能基化重合体がうまく合成されたことを示した。最終重合体生成物は、工業用途のために、乾燥が速く、適用が容易で、安全なコーティング溶液を配合するのに便利な溶媒である70〜87％EtOH/H₂O溶液に可溶性であった。

316L等級のステンレス鋼を、浸漬コーティングによりN-ハラミンドーパミン重合体でうまくコーティングした。図3Cに示すとおり、コーティング後、ステンレス鋼の表面接触角は72±8°から59±3°に減少し、表面親水性の増加を示した。コーティング組成を、XPSを用いてさらに調査した（図3D）。SS-Poly1（p(HA-co-DMA)コーティングしたSS上の窒素ピーク（399eV）の出現は、ステンレス鋼試験片が重合体でコーティングされていたことの証拠を提供した。さらに、窒素ピークは、強力な塩素処理（10％漂白剤で30分間）後に残存し、コーティングの接着性が比較的強いことを示唆した。XPSはまた、N-ハラミンの活性化が達成されたことも確認した（図3D）。未コーティングのステンレス鋼（SS-Ctrl）およびN-ハラミン前駆重合体コーティングしたSS（SS-Poly1）上ではCl_2pピーク（200eV）は認められなかったが、塩素漂白剤による処理後にCl_2pピーク（200eV）が観察された。加えて、N_1sピークは塩素化後にシフトして形状が変化し、N-H結合（N-ハラミン前駆体）がN-Cl結合（N-ハラミン）に変換されたことを示唆した。ドーパミン中のN-H基も、N-ハラミン（N-Cl）に変換することができ、これは酸化塩素含有量の一部に寄与し得ることに留意すべきである。コーティング厚さはエリプソメトリーにより、コーティング材料の化学組成に応じて、10nm（シリコンウエハ）から50nm（ステンレス鋼）の間であると推定された。表面のSEM顕微鏡写真も図4A〜4Dに示し、ステンレス鋼表面上の正常なコーティングの追加の証拠を提供した。

ドーパミン官能基によって付与された接着性を評価するために、滴定に基づく間接的であるが、簡単な方法を用いた。滴定は表面上の酸化塩素を定量し、塩素含有量は表面上の重合体含有量と正の相関があるため、一定の範囲では、表面上の塩素含有量を表面に接着したコーティング重合体の量を示すために使用することができる。図5Aに示すとおり、試験した5つの異なる材料、すなわちPP（ポリプロピレン）、HDPE（高密度ポリエチレン）、SS（ステンレス鋼）、PVC（ポリ塩化ビニル）、およびガラスの全てについて、各材料の塩素含有量（[Cl⁺]）は2.0〜5.0×10¹⁵原子/cm²のほぼ同等の範囲内であった。さらに、コーティングし、塩素化したステンレス鋼試験片（R0）を失活（「ディスチャージ」）し、再塩素化（「リチャージ」、R1）し、同じ条件で再び滴定した。各材料は、表面上にほぼ同等の量の塩素を吸着し（図5A）、N-ハラミン-ドーパミン重合体が表面に強く接着したままであることを示した。重合体が接着することが判明した材料の種類の多様性は、重合体が表面化学に関係なく事実上万能コーティングとしてはたらき得ることを示唆した。加えて、浸漬コーティング法は迅速（ステンレス鋼に対しては5分以内に完了）かつ柔軟で、事実上いかなる幾何形状もコーティングすることができた。このコーティング法には特別な表面処理は必要なかったため、層ごとの方法またはグラフティング法に基づく以前に報告された方法（Demir et al., ''Polymeric Antimicrobial N-Halamine-Surface Modification of Stainless Steel,'' Industrial & Engineering Chemistry Research 56(41):11773-11781 (2017)；Bastarrachea et al., ''Antimicrobial Coatings with Dual Cationic and N-Halamine Character: Characterization and Biocidal Efficacy,'' Journal of Agricultural and Food Chemistry 63(16):4243-4251 (2015)、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）と比較して、より低コストで容易にスケーラブルである可能性がある。

N-ハラミンの最も魅力的な特性の1つは、その「リチャージ可能」な抗菌機能である（Hui et al., ''Antimicrobial N-Halamine Polymers and Coatings: A Review of Their Synthesis, Characterization, and Applications,'' Biomacromolecules 14(3):585-601 (2013)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。図5Bに示すとおり、塩素含有量は、SS基体上での10サイクルの「ディスチャージ-リチャージ」後、4.0×10¹⁵原子/cm²から3.0×10¹⁵原子/cm²に減少した。この結果から、10サイクルの強力な漂白処理後に一定量のコーティング重合体がコーティング表面から剥離するが、残りの層は表面に強く接着していることが示された。この強い接着効果は、ドーパミン基内のカテコール構造が固体表面、特に金属上で共有結合を形成し得るとの事実によって説明することができる（Lee et al., ''Mussel-Inspired Surface Chemistry for Multifunctional Coatings,'' Science 318(5849):426-430 (2007)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。これは、コーティングが実際の適用において漂白および衛生洗浄の定期的な処理に耐えるのに十分頑強であることも示している。

以前は、N-ハラミンに関する試験は一般に、抗菌機能を予測するために酸化塩素含有量を用いた。接触致死試験は、塩素含有量がヨウ素-チオスルフェート滴定法で滴定可能（＞10¹⁵原子/cm²）であった場合に、有意な抗菌機能を示した。図6Aに示すとおり、1時間の接触後、黄色ブドウ球菌および大腸菌O157:H7の5.0〜6.0 log₁₀ CFU/cm²が未コーティングのステンレス鋼（SS-Ctrl）ならびにN-ハラミン前駆重合体コーティングしたSS（SS-Poly1）の表面に残っていた。これは、1×10⁶ CFU/試料（1 in²）の設計した接種レベルと矛盾している。しかし、塩素でN-ハラミンを活性化した後、表面は接触10分の短期間内に全ての接種した黄色ブドウ球菌（グラム陽性）および大腸菌O157:H7（グラム陰性）菌（＞6 log₁₀CFU/cm²）を検出限界（1.87log₁₀CFU/試料）未満のレベルまで不活性化した。この強力な抗菌機能が「リチャージ可能」であることを確認するために、表面を「リチャージ」し、さらに2つの抗菌試験を行った。N-Cl基は殺菌の鍵であり、メカニズムは以前に報告されている（Dong et al., ''Chemical Insights into Antibacterial N-Halamines,'' Chemical Reviews 117(6):4806-4862 (2017)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。原理的に、N-Clからの「Cl⁺」の酸化力は、次亜塩素酸イオン（ClO^-）中の酸化塩素と同様に、細胞壁に損傷を与えることになる。「Cl⁺」は、殺菌後に還元され、塩素イオン「Cl^-」として結合から遊離されると考えられる。これが次亜塩素酸イオン（ClO^-）でコーティングをリチャージする主な理由である。N-ハラミンの抗菌機能は非特異的（細菌、真菌、酵母、ウイルス、内生胞子などに対して有効）であると報告されている（Dong et al., ''Chemical Insights into Antibacterial N-Halamines,'' Chemical Reviews 117(6):4806-4862 (2017)；Cao et al., ''Polymeric N-Halamine Latex Emulsions for Use in Antimicrobial Paints,'' ACS Applied Materials & Interfaces 1(2):494-504 (2009)、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）ため、以下の試験に対して黄色ブドウ球菌のみを用いた。図6Bに示すとおり、SS-CtrlおよびSS-Poly1試料の両方に対して同様の傾向が見られ、実験方法の一貫性が確認された。最初の3回の「チャージ」サイクル内で、N-ハラミンコーティングした表面は6 log₁₀ CFU/cm²以上の接種した細菌を検出限界（1.87 log₁₀ CFU/cm²）未満のレベルまで不活性化することができた。これはまた、最初の3サイクル（R0、R1、R2）内で塩素含有量が安定なままであったとの滴定結果と良好に一致していた。これらの結果を全て組み合わせると、N-ハラミン修飾した表面は強力かつ非特異的な抗菌機能を示し、抗菌機能は塩素漂白剤で表面を処理することにより「リチャージ」し得ることが確認された。対照的に、他の以前に開発された材料（例えば、銀合金/複合材料配合ポリウレタンコンベアベルト）は、接触24時間以内に2〜3 logの減少を達成したにすぎなかった（Chaitiemwong et al., ''Survival of Listeria Monocytogenes on a Conveyor Belt Material With or Without Antimicrobial Additives,'' International Journal of Food Microbiology 142(1):260-263 (2010)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。

「サンドイッチ」試験は、表面上に既に存在する細菌を死滅させる表面の能力を測定するのに有効であるにすぎない。これは、溶液からの細菌の接着および増殖に抵抗する表面の能力に関するいかなる情報も提供することはない。したがって、溶液からのコーティング表面上の細菌の接着および生存を評価するための追加の試験も行った。「サンドイッチ」試験データと組み合わせて、これらの結果は「サンドイッチ」試験単独よりも性能の良い予測を提供する可能性がある。図7に示すとおり、LB培地中での3時間のインキュベーションの後、未コーティングのステンレス鋼（SS-Ctrl）およびN-ハラミン前駆体コーティングしたステンレス鋼（SS-Poly1）上で多くの細菌が接着して生存し、表面上に細菌凝集体が観察された（直径1〜5μmの間の明るい蛍光の点は、接着して生存した細菌を表す）。しかし、N-ハラミン活性化コーティング試料については、生菌はほとんど観察できなかった。N-ハラミンは通常非常に迅速に殺菌するため、細菌は表面に接触した直後に死滅すると考えられる。したがって、表面に固定されたコリンが完全に消費されるまで、表面に細菌が接着する可能性はほとんどない（Dong et al., ''Chemical Insights into Antibacterial N-Halamines,'' Chemical Reviews 117(6):4806-4862 (2017)；Cao et al., ''Polymeric N-Halamine Latex Emulsions for Use in Antimicrobial Paints,'' ACS Applied Materials & Interfaces 1(2):494-504 (2009)、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。これは、細菌コロニーまたはバイオフィルムがすでに形成され、死んだ細胞が処理後も表面に接着している状況とは異なる。表面への接着を防止し得る重合体コーティングからのいくらかの相乗効果もあり得るが、N-ハラミンからの抗菌殺菌が大きな役割を果たす。これは、ステンレス鋼に関するN-ハラミンのもう1つの試験で確認された（Demir et al., ''Polymeric Antimicrobial N-Halamine-Surface Modification of Stainless Steel,'' Industrial & Engineering Chemistry Research 56(41):11773-11781 (2017)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。結果から、N-ハラミンが有機負荷（LB培地はペプトンおよび酵母エキスからのタンパク質およびアミノ酸を含む）下で少なくとも3時間の優れた抗菌効果を示すことが判明した。この知見は、N-ハラミン化合物がTSB（トリプチックソイブロス）、肉滲出液、および養鶏廃棄物（chicken litter）を含む高有機負荷下で優れた殺生物機能を示すとの以前の結果と一致している（Tian et al., ''Realizing Ultrahigh Modulus and High Strength of Macroscopic Graphene Oxide Papers Through Crosslinking of Mussel-Inspired Polymers,'' Advanced Materials 25(21):2980-2983 (2013)；Ryu et al., ''Catechol-Functionalized Chitosan/Pluronic Hydrogels for Tissue Adhesives and Hemostatic Materials,'' Biomacromolecules 12(7):2653-2659 (2011)；Cao et al., ''Polymeric N-Halamine Latex Emulsions for Use in Antimicrobial Paints,'' ACS Applied Materials & Interfaces 1(2):494-504 (2009)、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。しかし、3時間の接触期間は、比較的短期間の有機負荷曝露の情報を与え得るにすぎないことが認識されている。コーティングは主に非食品接触表面用途のためであったため、この試験では長い時間（＞3時間）は試験しなかった。これらの表面は、実際の用途では長期間（＞3時間）高有機負荷に持続的に曝露される可能性は低かった。加えて、抗菌機能は、表面が重合体コーティングによって覆われ、これは表面の形状および表面張力も変化させ、これらの因子はすべて表面上の細菌の接着にも影響を与え得るとの事実からも一部寄与し得る。

このコーティング技術は、工業的環境における用途に直接翻訳可能であるように設計されたため、そのスケーラビリティが重要な懸念事項であった。便利なことに、このコーティング材料はスプレーコーティングによって表面に適用することができる。以前の報告と比較して、本出願の重合体コーティングの塩素含有量は依然として比較的低い。これは適用方法（浸漬コーティング）のせいでコーティングが非常に薄いためである。塩素含有量を改善するために、塩素化時間の増加またはコーティング厚さの増大を含む、いくつかの方法がある。浸漬コーティングは、表面に重合体コーティングの単層（10〜100nm）を生成することに限定される。厚さを増大させ、したがって10¹⁶〜10¹⁷原子/cm²のレベルの塩素含有量を達成するために、本発明者らはドーパミン基を架橋し得るという事実を利用した（図8A）。ドーパミン構造におけるカテコール部分は、マイケル付加およびシッフ塩基形成を介してポリエーテルイミド（PEI）と反応して、架橋構造（共有結合）を生成することができる（Tian et al., ''Realizing Ultrahigh Modulus and High Strength of Macroscopic Graphene Oxide Papers Through Crosslinking of Mussel-Inspired Polymers,'' Advanced Materials 25(21):2980-2983 (2013)；Ryu et al., ''Catechol-Functionalized Chitosan/Pluronic Hydrogels for Tissue Adhesives and Hemostatic Materials,'' Biomacromolecules 12(7):2653-2659 (2011)、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。この試験では、ドーパミン-ハラミンコーティングマトリックスへのPEIの取り込み成功がXPS（図8B）およびFT-IR（図8C）によって確認された。XPSは、PEI架橋重合体マトリックス内で窒素含有量が増加し、HA-co-DMAと比較して窒素含有量が高いことを示した。FT-IRスペクトルは、架橋コーティングにおいて3272および1450cm^-1のPEIの特徴的なピークを示した。また、1601および1637cm^-1のピークは、それぞれ-C=C-および-C=N-結合の存在を特定し、架橋のさらなる証拠を示した。興味深いことに、配合中にPEIを添加した後、コーティングは無色から赤褐色に変化し（図8C）、接触角は、おそらくはN-Hおよび-NH₂基の数の増加により、約46±4°にさらに減少した。滴定結果により、架橋コーティングは塩素を結合する能力が高いことが確認された。これは、より多くのN-ハラミン前駆重合体（HA-co-DMA）分子が表面上に接着し、より厚いコーティングをもたらしたことで説明できるであろう。浸漬コーティングの場合、PEI架橋コーティングの塩素含有量は、初期のコーティングに比べてほぼ2倍以上に増加し、10¹⁶原子/cm²に達した。スプレーコーティングの場合、さらに高い値に達した。PEIなしでのスプレーコーティングは2×10¹⁶原子/cm²の塩素含有量を有したが、PEI架橋コーティングは4×10¹⁶原子/cm²の塩素含有量を有した。塩素含有量は、重合体濃度、スプレーコーティング時間、塩素化条件、またはコーティング層数などを含む、他のいくつかのパラメータを調整することによってさらに増加させることができる。

コーティングを、実際の食品加工装置の試料片としての金属パイプ上に適用した。現実的な条件を模擬するために、金属パイプを食品加工工場から直接取り、欠陥があると微生物を保持する傾向が高いため、表面をこすってそのような損傷を与えた（図9A〜9E）。図9Bに示すとおり、コーティングをスプレーコーティング法によって適用し、より暗い色になった。初期実験では、10％漂白剤溶液を使用してN-ハラミンを活性化したが、食品加工工場内では表面を消毒するためにより低い濃度をより一般的に使用する。したがって0.5％漂白剤（約200〜300ppmの遊離塩素）を噴霧して、表面を塩素化した。コーティング層は、未コーティングの金属パイプよりも親水性が高く、漂白剤が表面全体を均一に湿らせることを可能にした。低濃度の漂白剤（200〜300ppmの利用可能な塩素）を使用し、コーティング部分が完全に乾燥するまで10分しかかからなかったため、腐食の影響は最小限にとどまる可能性が高かった。さらにいかなる可能な腐食も減らすために、表面を消毒後に飲料水で洗浄することができた。また、現行のコーティング法に基づいて、表面上のN-ハラミン-ドーパミン重合体は130mg/m²であり、このN-ハラミン-ドーパミン重合体の製造および適用の最終コストは約2米ドル/gであると推定された。したがって、この重合体コーティングを適用するための最終コストは約0.26米ドル/m²になり、これは抗菌コーティングにとって比較的低コストと考えてもよい。

工業的環境において、コーティングの有効性が経時的に低下しないよう確実にすることが重要である。したがって、塩素の「リチャージ」工程が滴定に基づいて正しく行われたことを検証するために、簡単かつ迅速な方法を設計した。指示薬溶液は、塩素が存在する場合、表面上に広がると5秒以内に青色に変わるよう設計した（図9D）。便宜上、指示薬溶液を綿棒に適用することができる。表面をぬぐうと、綿は青く変わる。将来的には、比色指示薬スケールは塩素濃度に関する半定量的情報を提供することができよう。

実際の装置部品に対するコーティングの抗菌効果を、3つの別々の逐次実験で表面に細菌を接種し、生きている微生物の数を測定することによって確認した（図9C）。図9Eに示すとおり、SSパイプの未コーティング部品（SSP）上で、接触1時間後に約3.0〜4.0 log₁₀CFU/cm²細菌（黄色ブドウ球菌）を表面から回収することができた。しかし、N-ハラミンコーティングした表面では、1.0 log₁₀CFU/cm²未満を回収することができた。実験2および実験3において、追加の塩素化により抗菌機能が改善された。実験3において、N-ハラミンコーティングした表面からは、培養可能な細菌は回収されなかった。実験1では、コーティングは0.5％漂白剤で十分にチャージされていなかったため、チャージサイクルが多くなるほど塩素負荷が高くなり、抗菌機能が向上した。この結果は、パイプ表面上のコーティングを塩素漂白剤で少なくとも9回処理しており、実験手順中にDI水で約15回十分に洗浄した事実を考慮すると、コーティングが、抗菌機能を失うことなく、数サイクルの消毒および洗浄に耐えられることを確認するものである。

N-ハラミンは、高い有機負荷の条件下で妥当にうまくはたらくことが示されているが、コーティングが食品と直接接触していた用途では、ここで報告しているものと比較して抗菌効果が低下する可能性がある。発明者らは、実際の食品存在下でコーティングの抗菌効果を試験するために、将来的に追加の研究を行う予定である。しかし、食品製造の一部の分野（ゾーン1食品設備などの）では、非食品接触食品設備の表面は有機負荷によってひどく汚損または不潔になることはなく、したがって、これらの分野での適用に対する懸念はないであろう。食品安全性を高めるためのいかなる改善戦略も、現行の戦略に代わるものではなく、補完すべきであるとの一般的な食品工場衛生の理念に従って、現行の衛生法に加えてコーティングを実施することになる。

すぐ次の段階は、パイロットスケールの食品加工工場でコーティングを試験することである。したがって、単にコーティングの有効性ではなく、それ自体の安全性が重要である。N-ハラミンおよびドーパミンが安全な構造であることは広く受け入れられている（Zhao et al., ''Efficacy of Low Concentration Neutralised Electrolysed Water and Ultrasound Combination for Inactivating Escherichia Coli ATCC 25922, Pichia Pastoris GS115 and Aureobasidium Pullulans 2012 on Stainless Steel Coupons,'' Food Control 73:889-899 (2017)；Kocer et al., ''N-Halamine Copolymers for Use in Antimicrobial Paints,'' ACS Applied Materials & Interfaces 3(8):3189-3194 (2011)、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。歴史的に、直接食品接触表面へのコーティングの適用を妨げる最大の障害は、コーティングが時間と共にはがれて、食品不純物となり、別の食品安全性の問題となる傾向があるため、コーティングは所望の機能を達成するために非常に厚くなければならないということである。本出願のコーティングの場合、所望の機能を達成するために数百ナノメートルの厚さしか必要とされなかった。データは、このようなコーティングが比較的安定であり、表面が剥がれる可能性が低いことを示唆している。しかし、熱水洗浄および高圧水洗浄、強酸またはアルカン剤、脱脂剤、消毒剤（QAC）などの商業用食品工場衛生下でのコーティングに挑戦する、より多くの試験を行うべきである。本出願において、発明者らは非食品接触環境表面に焦点を合わせた。このコーティングは食品接触表面にも使用できるが、さらなる毒性試験および規制当局からの承認（例えば、USFDA食品接触通知プログラム）が正当とされる。食品接触表面用途では、コーティングから食品への有毒生成物の浸出を考慮する必要がある。唯一可能性のある浸出生成物は塩素または塩化物であるが；湿潤条件下でも量は非常に少ない（Dong et al., ''Chemical Insights into Antibacterial N-Halamines,'' Chemical Reviews 117(6):4806-4862 (2017)、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。加えて、塩素漂白剤が食品接触表面消毒用途に承認されていることが公知で；これらは、食品接触のために安全であることが公知である。

本研究において、食品産業用途を念頭に置いて重合体を開発、設計した。この重合体コーティングは、食品接触表面（作業台、切断ナイフ、容器、コンベアベルトなど）および環境表面（非食品接触機器部品、壁、天井、排水）の両方に適用できる。コーティングは、化学組成、大きさ、または形状に関係なく、様々な基体に接着することが示された。用途に応じて、異なるコーティング法（浸漬コーティングおよびスプレーコーティング）を選択することができ、いずれの方法でも5〜10分以内に全コーティング手順が達成された。さらに、塩素「チャージ」工程を現行の消毒手順に組み込むことができ、したがってコーティングシステムを実装するために食品加工プロトコルの変更はほとんど必要とされないであろう。本発明者らは、実際の食品機器部品に対するコーティングの有効性も示し、また、コーティングおよび塩素化工程の成功を検証するための単純かつ低コストの手順も開発した。結論として、本試験において開発した汎用性およびリチャージ可能コーティング材料は、食品産業における食品安全予防制御用途のために大きな可能性を有している。

本明細書において好ましい態様を詳細に示し、記載してきたが、当業者には、本出願の精神から逸脱することなく種々の改変、追加、置換などを行うことができ、これらはしたがって添付の特許請求の範囲において定義する本出願の範囲内であると考えられることが明らかであろう。

Claims (30)

1. N-ハラミン（HA）およびドーパミン（DMA）の共重合体であって、HAおよびDMAは共重合体中に0.4：9.6〜9.6：0.4（HA：DMA）の比で存在する、共重合体。
2. HA：DMAの比が約7：3である、請求項1記載の共重合体。
3. N-ハラミンが、
   

   

   およびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項1または2記載の共重合体：
   式中、
   R⁵はH、Cl、Br、またはIであり；
   R⁹およびR¹⁰ならびにそれらが結合している炭素は一緒になって炭素環式環を形成するか、または個々にCH₃であり；かつ
   Qは独立にH、Cl、Br、またはIである。
4. ドーパミンが、
   

   

   またはその誘導体である、請求項1〜3のいずれか一項記載の共重合体：
   式中、
   R⁶はH、Cl、Br、またはIであり；かつ
   zは2〜6である。
5. モノマー（A）、（B）、（C）、および（D）を含む、請求項1記載の共重合体：
   ここで、
   Aは（LR¹）であるか、または存在せず；
   Bは（CR²R⁷）であり；
   Cは（LR³）であるか、または存在せず；
   Dは（CR⁴R⁸）であり；
   LはCH、N、C(O)およびOであり、LがC(O)またはOである場合にはR¹またはR³は存在せず；
   R¹は独立にH、CH₃、PEG、四級アンモニウムまたは双性イオンであり；
   R²は独立に、
   

   

   またはその誘導体であり；
   R³は独立にH、PEG、四級アンモニウムまたは双性イオンであり；
   R⁴は独立に、
   

   

   またはその誘導体であり；
   R⁵は独立にH、Cl、Br、またはIであり；
   R⁶は独立にH、Cl、Br、またはIであり；
   R⁷は独立にHまたはCH₃であり；
   R⁸は独立にHまたはCH₃であり；
   Qは独立にH、Cl、Br、またはIであり；
   zは独立に2〜6であり；
   

   

   は共重合体への可能な結合点を示し；
   B：Dの比は0.4：9.6〜9.6：0.4であり；かつ
   共重合体は10〜100,000モノマーを含む。
6. B：Dの比が約7：3である、請求項5記載の共重合体。
7. 共重合体のモノマーが、ブロック、反復パターン、またはランダムに配置される、請求項5記載の共重合体。
8. 式（I）を有する、請求項1記載の共重合体：
   

   

   式中、
   Aは（LR¹）であるか、または存在せず；
   Bは（CR²R⁷）であり；
   Cは（LR³）であるか、または存在せず；
   Dは（CR⁴R⁸）であり；
   LはCH、N、C(O)およびOであり、LがC(O)またはOである場合にはR¹またはR³は存在せず；
   xは独立に1〜10であり；
   yは独立に1〜10であり；
   mは独立に1〜10であり；
   nは独立に1〜10であり；
   R¹は独立にH、CH₃、PEG、四級アンモニウムまたは双性イオンであり；
   R²は独立に、
   

   

   またはその誘導体であり；
   R³は独立にH、PEG、四級アンモニウムまたは双性イオンであり；
   R⁴は独立に、
   

   

   またはその誘導体であり；
   R⁵は独立にH、Cl、Br、またはIであり；
   R⁶は独立にH、Cl、Br、またはIであり；
   R⁷は独立にHまたはCH₃であり；
   R⁸は独立にHまたはCH₃であり；
   Qは独立にH、Cl、Br、またはIであり；
   zは独立に2〜6であり；
   wは1〜10,000であり；
   

   

   は共重合体への可能な結合点を示し；かつ
   m：nの比は0.4：9.6〜9.6：0.4である。
9. 式（II）の共重合体：
   

   

   式中、
   R¹は独立にH、CH₃、PEG、四級アンモニウムまたは双性イオンであり；
   R³は独立にH、PEG、四級アンモニウムまたは双性イオンであり；
   R⁵は独立にH、Cl、Br、またはIであり；
   R⁶は独立にH、Cl、Br、またはIであり；
   R⁷は独立にHまたはCH₃であり；
   R⁸は独立にHまたはCH₃であり；
   Qは独立にH、Cl、Br、またはIであり；
   zは独立に2〜6であり；
   xは独立に1〜10であり；
   yは独立に1〜10であり；
   mは独立に1〜10であり；
   nは独立に1〜10であり；
   wは1〜10,000であり；かつ
   m：nの比は0.4：9.6〜9.6：0.4である。
10. m：nの比が約7：3である、請求項8または9記載の共重合体。
11. 1,000〜20,000Daの範囲の平均分子量を有する、請求項1〜10のいずれか一項記載の共重合体。
12. 1.01〜2.99の範囲の多分散度を有する、請求項1〜11のいずれか一項記載の共重合体。
13. 請求項1〜12のいずれか一項記載の共重合体を含む、抗菌組成物。
14. コーティングである、請求項13記載の抗菌組成物。
15. 液体、粉末、またはエアロゾル形態である、請求項14記載の抗菌コーティング。
16. コーティングの共重合体が金属、プラスチック、ガラス、または塗料に共有結合している、請求項14記載の抗菌コーティング。
17. コーティングの共重合体が互いに架橋している、請求項14記載の抗菌コーティング。
18. 共重合体がポリエーテルイミド架橋剤によって互いに架橋している、請求項17記載の抗菌コーティング。
19. 請求項1〜12のいずれか一項記載の共重合体、請求項13記載の組成物、または請求項14〜18のいずれか一項記載の抗菌コーティングでコーティングされている、装置またはシステム。
20. 食品貯蔵装置、食品加工装置、または生物医学装置である、請求項19記載の装置またはシステム。
21. 抗菌コーティングにより少なくとも10nmの厚さでコーティングされている、請求項19記載の装置またはシステム。
22. 請求項1〜12のいずれか一項記載の共重合体を調製するための方法であって、
    ラジカル重合可能なN-ハラミン系モノマーを提供する段階；
    ラジカル重合可能なドーパミン系モノマーを提供する段階；
    N-ハラミン系モノマーおよびドーパミン系モノマーを適切な溶媒に溶解して、N-ハラミン系モノマーおよびドーパミン系モノマーの溶液を生成する段階；ならびに
    該溶液を、フリーラジカル開始剤存在下でラジカル重合反応にかけて、N-ハラミン系モノマーおよびドーパミン系モノマーの共重合体を生成する段階
    を含む、前記方法。
23. 溶媒が、メタノール、エタノール、塩化メチレン、トルエン、ジオキサン、THF、クロロホルム、シクロヘキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトン、アセトニトリル、n-ブタノール、n-ペンタノール、クロロベンゼン、ジエチルエーテル、tertブタノール、1,2-ジクロロエチレン、ジイソプロピルエーテル、エタノール、酢酸エチル、エチルメチルケトン、ヘプタン、ヘキサン、イソプロピルアルコール、イソアミルアルコール、メタノール、ペンタン、n-プロピルアルコール、ペンタクロロエタン、1,1,2,2,-テトラクロロエタン、1,1,1,-トリクロロエタン、テトラクロロエチレン、テトラクロロメタン、トリクロロエチレン、水、キシレン、ベンゼン、ニトロメタン、グリセロール、およびその混合物からなる群より選択される、請求項22記載の方法。
24. フリーラジカル開始剤が、2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)、過酸化ベンゾイル、1,1'-アゾビス(シクロヘキサンカルボニトリル)、t-ブチルペルオキシド、ジクミルペルオキシド、過硫酸カリウム、アラルキルハライド、アリールハライド 2,2-ジメトキシ-1,2-ジフェニル-エタン-1-オン、および(2,4,6-トリメチルベンゾイル)-ジフェニルホスフィンオキシドからなる群より選択される、請求項22記載の方法。
25. ラジカル重合反応が40℃〜120℃の範囲の温度で起こる、請求項22記載の方法。
26. 抗菌コーティングした材料を生成する方法であって、
    請求項1〜12のいずれか一項記載の1つまたは複数の共重合体を溶媒に溶解して、共重合体溶液を生成する段階；
    共重合体溶液の共重合体が材料に結合するのに十分な期間、重合体溶液中に材料を浸漬し、それによりコーティングした材料を生成する段階；
    コーティングした材料を共重合体溶液から取り出す段階；および
    コーティングした材料をハロゲンを含む第2の溶液で処理する段階
    を含む、前記方法。
27. 第2の溶液のハロゲンが塩素、臭素またはヨウ素から選択される、請求項26記載の方法。
28. 塩素を含む溶液が漂白剤溶液、次亜塩素酸カルシウム溶液、N-クロロスクシンイミド溶液、ジクロロイソシアヌル酸ナトリウム溶液、トリクロロイソシアヌル酸溶液、次亜塩素酸tert-ブチル溶液、N-クロロアセトアミド溶液、またはN-クロラミンの溶液である、請求項26記載の方法。
29. 前記浸漬の前に、共重合体溶液に架橋剤を添加する段階をさらに含む、請求項26記載の方法。
30. 共重合体溶液中の共重合体に対する架橋剤の比が、1：10〜10：1の範囲である、請求項28記載の方法。

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