JP2021524286A - 細胞およびその他の生物学的材料の急速な冷却および加温のためのシステム - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、小さな生物学的サンプルの急速な冷却および加温のためのシステムの設計に関する。これには、ヒトおよび他の動物の生殖補助医療における卵(または卵子)、胚、胚盤胞、および精子の急速な冷却および加温が含まれる。
生殖補助医療におけるサンプルの冷却および解凍
卵、胚、胚盤胞、および精子は日常的に凍結され、極低温で保存された後、生殖補助医療で使用するために解凍される。約10年前まで、これらのサンプルは凍結保護剤/ガラス化溶液に浸され、中間温度(たとえば、−40℃)までゆっくりと(20分から2時間かけて)冷却され、その後に長期保存のために液体窒素に入れられた。ゆっくりとした冷却ステップの間に、氷が細胞の外側で核形成し、この氷の成長が細胞から水を引き出し、細胞内のタンパク質や他の溶質の濃度を高める。冷却と水の除去が続くと、最終的に細胞内の溶媒がガラス化した。サンプルを温めるために、サンプルは温かい水溶液中に置かれた。多くの細胞を含む胚および胚盤胞は高い生存率で凍結およびその後に解凍することができたが、個々の卵はできなかった。
冷却中、サンプルはいくつかのメカニズムによって損傷を受ける可能性がある。第一に、氷は細胞内で核形成して成長する可能性がある。この氷は細胞膜に穴を開け、細胞の内部組織を破壊する可能性がある。第二に、すべての溶質は成長する氷の結晶から排除されるため、残りの溶液中に濃縮される。これはタンパク質凝集をもたらす可能性がある。第三に、細胞内の溶液は他の細胞成分よりも膨張または収縮し、機械的応力により細胞損傷を引き起こす可能性がある。第四に、タンパク質は、折りたたみ(フォールディング)を駆動する疎水性相互作用ならびにpH、pKa、および他の物理化学的特性の温度依存性のせいで、冷却されるとその立体構造を変化させ、また折りたたまれていない(アンフォールディング)状態になることがよくある(低温変性と呼ばれるプロセス)。それらの溶解度も温度依存性である。その結果、タンパク質が凝集し、冷却中に不可逆的な他の生体分子の変化が生じる可能性がある。
生殖補助医療で使用されている現在の凍結保存ツールおよび方法は、冷却速度と加温速度を最大化すること、および氷の形成やその他の形態の損傷を防ぐことがうまくできていない。現在のツールの一例はRapid−Iシステムである。最初に、凍結保護剤の濃度を高い値に上げるために一連の溶液にサンプルを浸す。次に、0.5〜1mmの厚さのプラスチック片の上に、またはこの厚さのプラスチック片の穴に、通常は卵または胚の体積の何倍もの量の液体とともに、サンプルを堆積させる。卵および胚と一緒に冷却されるべき液体およびサンプルホルダの総質量は大きい。次に、サンプルを予冷したストローに突っ込み、わずか20K/s(1200K/分)の冷却速度を与える。次に、ストローの上端部をシールし、ストローを液体窒素で保管するために保存用ケーンに移す。
4 フィルムまたは薄膜
7 磁性鋼または磁石
8 フィン
10 サンプルホルダ
12 ストロー
13 角度付きカット
20 カップ
20−A カップホルダ
22 ニップル
30 ストローホルダ
32 ジョー
34 アクチュエータ
36 磁石
100 冷却装置
102 (液体窒素)主貯蔵チャンバ
104 カップデュワー
106 サンプルワンドホルダ
108 サンプル垂直並進ステージ
110 超音波シーラー
112 カップLN2供給管
114 カップカッター
116 ストローホルダマウント
118 ストロー垂直並進ステージ
120 デュワーLN2供給管
Claims (21)
- 生物学的サンプルを極低温冷却するためのシステムにおいて、
第1の量の極低温液体を保持するように構成された第1のチャンバ;
前記第1のチャンバと熱接触して配置された容器ホルダであって、その中に配置される少なくとも1つの取り外し可能な容器を保持するように構成され、前記容器は第2の量の極低温液体を保持するように構成されて第2のチャンバを形成する、容器ホルダ;
少なくとも1つの中空の細長いチューブを前記容器内に保持するように構成された細長いチューブホルダ;および
前記細長いチューブが第2の量の極低温液体を含む前記容器内にある間に、生物学的サンプルを含む少なくとも1つのサンプルホルダを保持して前記細長いチューブ内に移すように構成されたサンプルワンド;
を備えたシステム。 - 前記少なくとも1つのサンプルホルダが、遠位端とその遠位端よりも大きな直径を有する近位端とを有する細長いサンプルホルダである、請求項1に記載のシステム。
- 前記細長いサンプルホルダの近位端が、その上に配置されて前記サンプルワンドによって磁気的に保持されるように構成された磁石または磁気部分を含む、請求項2に記載のシステム。
- 前記細長いサンプルホルダの遠位端が、その上に配置されたマイクロパターンフィルムを含み、該マイクロパターンフィルムは生物学的サンプルを保持するように構成される、請求項2に記載のシステム。
- 前記マイクロパターンフィルムが約5〜25μmの厚さであり、幅、長さおよび/または直径が1〜3mmである、請求項4に記載のシステム。
- 前記細長いサンプルホルダの近位端が、該近位端の外面から半径方向に延びる複数の突起を含み、該突起は、前記細長いサンプルホルダが前記細長いチューブ内に配置されたときに前記細長いチューブの内面に接触するように構成される、請求項2に記載のシステム。
- 前記細長いチューブの遠位端が角度付き遠位面を備える、請求項1に記載のシステム。
- 前記極低温液体が液体窒素である、請求項1に記載のシステム。
- 前記容器ホルダが前記第1のチャンバ内に配置される、請求項1に記載のシステム。
- 前記細長いチューブホルダが、前記細長いチューブを把持しかつその中に配置されるサンプルホルダの実質的な長さに匹敵する長さに延在するように構成された細長い半円筒形のジョーを備える、請求項1に記載のシステム。
- 前記細長い半円筒形のジョーがステンレス鋼で構成される、請求項10に記載のシステム。
- 前記第1のチャンバの上に配置された第3のチャンバをさらに備え、該第3のチャンバは極低温液体を含み、その極低温液体を前記第1のチャンバと少なくとも1つの導管を介して前記容器とに送達するように構成される、請求項1に記載のシステム。
- 前記容器ホルダの底側壁部分と前記第1のチャンバの内底面とによって形成される第4のチャンバをさらに備え、該第4のチャンバは、前記容器から排出される第2の量の極低温液体を受け入れるように構成される、請求項12に記載のシステム。
- 前記容器が、該容器が前記容器ホルダ内に配置されたときにその底面から延びる部材をさらに備える、請求項12に記載のシステム。
- 前記第4のチャンバが、前記第2の量の極低温液体を前記容器から前記第4のチャンバに排出させるために、前記部材を切断するかまたは前記容器の底面に穴を開けるように構成されたカッターをさらに備える、請求項14に記載のシステム。
- 前記細長いチューブホルダが、第1の垂直並進機構を介して第1の垂直面に沿って垂直に移送されるように構成される、請求項1に記載のシステム。
- 前記サンプルワンドが、第2の垂直並進機構を介して前記第1の垂直面に沿って垂直に移送されるように構成される、請求項16に記載のシステム。
- 容器内の極低温液体の上の低温ガス層を除去するように構成されたガス処理マニホールドをさらに備える、請求項1に記載のシステム。
- 前記容器ホルダの上に配置され、前記チューブの近位端と遠位端のうち少なくとも1つをシールするように構成された、格納式ジョーを含む超音波シーラーまたは熱シーラーをさらに備える、請求項1に記載のシステム。
- 前記第1のチャンバが、その上端部に1つまたは複数のドレーンを備え、前記容器からオーバーフローした第2の量の極低温液体がそのドレーンを通って前記第1のチャンバに流入する、請求項1に記載のシステム。
- 前記細長いチューブホルダが、前記細長いチューブを前記容器内に搬入し、かつサンプルホルダを中に含む前記細長いチューブを前記容器から搬出するように構成される、請求項1に記載のシステム。
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