JP2021523719A - Ccctc結合因子バリアント - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年5月17日に出願された米国仮特許出願第62/672,682号明細書、および2019年4月2日に出願された米国仮特許出願第62/828,277号明細書の利益を主張する。前述の米国仮特許出願の全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって授与された助成金第GM118158号の下で政府援助により行われた。政府は、本発明におけるある一定の権利を有する。
(i)ZF4の位置+2〜+6にアミノ酸配列AKLKK、AKLRK、AHLRV、AKLRV、またはSKLRL;
(ii)ZF5の位置+2〜+6にアミノ酸配列ERLRV、NRLKV、SRLKE、またはNRLKV;
(iii)ZF6の位置−1〜+3にアミノ酸配列RPDT、RTET、またはRADV;および
(iv)ZF7の位置+2〜+6にアミノ酸配列DNLLA、SNLLV、DNLMA、またはDNLRV
を含む。
(i)ZF4の位置+2〜+6にアミノ酸配列GHLKK、AHLRK、またはGKLRI;
(ii)ZF5の位置+2〜+6にアミノ酸配列SRLKE、DALRR、DGLKR、またはTRLRE;
(iii)ZF6の位置−1〜+36にアミノ酸配列RPDTMKRまたはRTENMKM;および
(iv)ZF7の位置+2〜+6にアミノ酸配列EHLKV、DHLLA、またはHHLDV
を含む。
(i)ZF4の位置+2〜+6にアミノ酸配列SNLRR、GNLVR、GNLRR、GNLKR、ANLRR、NNLRR、またはTNLRR;
(ii)ZF6の位置+2〜+6にアミノ酸配列EHMKR、EHMRR、THMKR、EHMNR、またはEHMAR;および
(iii)ZF7の位置+2〜+6にアミノ酸配列DNLLT、DNLLV、DNLQT、DNLLA、DNLAT、DNLQA、DNLMA、またはDNLMT
を含む。
(i)ZF4の位置+2〜+6にアミノ酸配列GNLVR、GNLRR、GNLAR、GNLMR、ANLRR、SNLRR、またはNNLRR;
(ii)ZF6の位置+2〜+6にアミノ酸配列EHMNR、EHMKR、EHMRR、SHMNR、SHMRR、THMKR、またはDHMNR;および
(iii)ZF7の位置+2〜+6にアミノ酸配列EHLKV、EHLAE、STLNE、DHLQV、EHLNV、DHLNT、EHLQA、またはHHLMH
を含む。
(i)ZF4の位置+2〜+6にアミノ酸配列GHLKK、AHLKK、TKLRL、TKLKL、GHLRK、THLKK、またはAHLRK;
(ii)ZF5の位置+2〜+6にアミノ酸配列TRLKEまたはSRLKE;および
(iii)ZF6の位置−1〜+3にアミノ酸配列RADN、RHDT、RRDT、RPDT、RTSS、またはRNDT
を含む。
これまで、野生型CTCFよりも高いアフィニティーで変異体CBSに結合するように設計される利用可能な操作されたCTCFバリアントはない。それゆえ、野生型CTCFよりも高いアフィニティーで変異体CBSに結合し得る操作されたCTCFバリアントの必要性がある。
CCCTC結合因子(CTCF)は、高次クロマチン構造を維持することによって必須のゲノムオーガナイザーとして作用し、一方で細胞分化におけるおよび遺伝子発現の促進または抑制における役割も有するマルチドメインタンパク質である。CTCFは、ゲノムのメガベースにまたがるトポロジカル関連ドメイン(TAD)、ならびに遺伝子クラスター内の微調整された遺伝子断絶または遺伝子活性化につながるより小型のサブTADを維持する。加えて、CTCFは、転写の速度に影響を与えることによってmRNAスプライシングを調節することが見出されており、より最近では、二本鎖断裂における相同組み換え修復を促進することに関わっている。野生型CTCFは、標準的CTCF結合部位(CBS)を認識する11フィンガージンクフィンガーアレイを介してゲノムのあらゆる場所で結合する。
ZF3の位置−1〜+6:TSGELVR(配列番号1)
ZF4の位置−1〜+6:EVSKLKR(配列番号2)
ZF5の位置−1〜+6:DTYKLKR(配列番号3)
ZF6の位置−1〜+6:QSGTMKM(配列番号4)
ZF7の位置−1〜+6:RKSDLGV(配列番号5)
を含む。
CBSは、典型的に、高度に保存された15bpのコア配列(またはコアモチーフ)を有して、長さが40bpである。コア配列に隣接する配列は著しくあまり保存されていないが、それでもやはりゲノムのあらゆる部位におけるCTCF結合に重要である(図1)。
野生型CTCFよりも高いアフィニティーで変異体CBSに結合し得る操作されたCTCFバリアントが本明細書において記載される。操作されたCTCFバリアントは、変異体CBS(コンセンサスCBSの核酸配列と配列が異なる少なくとも1つの核酸を有するCBS)の制御下にある遺伝子を調節することにおいて使用され得る。CTCFバリアントは、野生型CTCFのアミノ酸配列と配列が異なる、少なくとも1つのジンクフィンガーにおける少なくとも1つのアミノ酸残基を有する。
(1)ZF7の位置+2〜+6にアミノ酸配列DHLQT(配列番号8)、EHLNV(配列番号9)、AHLQV(配列番号10)、EHLRE(配列番号11)、DHLQV(配列番号12)、EHLKV(配列番号13)、DHLQV(配列番号14)、EHLVV(配列番号15)、DHLRT(配列番号16)、DHLAT(配列番号17)、もしくはDHLQT(配列番号18);
(2)ZF7の位置+2〜+6にアミノ酸配列DHLQT(配列番号19)、EHLNV(配列番号20)、AHLQV(配列番号21)、EHLRE(配列番号22)、DHLQV(配列番号23)、EHLKV(配列番号24)、DHLQV(配列番号25)、EHLVV(配列番号26)、DHLRT(配列番号27)、DHLAT(配列番号28)、もしくはDHLQT(配列番号29);
(3)ZF6の位置+2〜+6にアミノ酸配列NAMKR(配列番号30)、EHMGR(配列番号31)、DHMNR(配列番号32)、THMKR(配列番号33)、EHMRR(配列番号34)、もしくはTHMNR(配列番号35);
(4)ZF6の位置−1〜+3にアミノ酸配列MNES(配列番号36)、HRES(配列番号37)、RPDT(配列番号38)、RTDI(配列番号39)、もしくはRHDT(配列番号40);
(5)ZF5の位置+2〜+6にアミノ酸配列HGLKV(配列番号41)、HRLKE(配列番号42)、HALKV(配列番号43)、SRLKE(配列番号44)、DGLRV(配列番号45)、HTLKV(配列番号46)、もしくはNRLKE(配列番号47);
(6)ZF5の位置+2〜+6にアミノ酸配列ATLKR(配列番号48)、QALRR(配列番号49)、GGLVR(配列番号50)、HGLIR(配列番号51)、ANLSR(配列番号52)、TGLTR(配列番号53)、HGLVR(配列番号54)、GGLTR(配列番号55)、HTLRR(配列番号56)、TVLKR(配列番号57)、ADLKR(配列番号58)、もしくはHGLRR(配列番号59);
(7)ZF4の位置+2〜+6にアミノ酸配列AHLRK(配列番号60)、AKLRV(配列番号61)、GGLGL(配列番号62)、AKLRI(配列番号63)、TKLKV(配列番号64)、もしくはSKLRV(配列番号65);
(8)ZF4の位置+2〜+6にアミノ酸配列ATLRR(配列番号66)、RRLDR(配列番号67)、TNLRR(配列番号68)、ANLRR(配列番号69)、GNLTR(配列番号70)、AMLKR(配列番号71)、HMLTR(配列番号72)、AMLRR(配列番号73)、もしくはTMLRR(配列番号74);
(9)ZF3の位置+2〜+6にアミノ酸配列QQLIV(配列番号75)、SQLIV(配列番号76)、QQLLV(配列番号77)、GELVV(配列番号78)、QQLLI(配列番号79)、GQLIV(配列番号80)、GQLTV(配列番号81)、TELII(配列番号82)、QGLLV(配列番号83)、QQLLT(配列番号84)、GQLLT(配列番号85)、GELLT(配列番号86)、もしくはQQLLI(配列番号87);
(10)ZF4の位置+2〜+6にアミノ酸配列AKLKK(配列番号88)、AKLRK(配列番号89)、AHLRV(配列番号90)、AKLRV(配列番号91)、もしくはSKLRL(配列番号92);ZF5の位置+2〜+6にアミノ酸配列ERLRV(配列番号93)、NRLKV(配列番号94)、SRLKE(配列番号95)、もしくはNRLKV(配列番号96);ZF6の位置−1〜+3にアミノ酸配列RPDT(配列番号97)、RTET(配列番号98)、もしくはRADV(配列番号99);およびZF7の位置+2〜+6にアミノ酸配列DNLLA(配列番号100)、SNLLV(配列番号101)、DNLMA(配列番号102)、もしくはDNLRV(配列番号103);
(11)ZF4の位置+2〜+6にアミノ酸配列GHLKK(配列番号104)、AHLRK(配列番号105)、もしくはGKLRI(配列番号106);ZF5の位置+2〜+6にアミノ酸配列SRLKE(配列番号107)、DALRR(配列番号108)、DGLKR(配列番号109)、もしくはTRLRE(配列番号110);ZF6の位置−1〜+3にアミノ酸配列RPDT(配列番号111)もしくはRTEN(配列番号112);およびZF7の位置+2〜+6にアミノ酸配列EHLKV(配列番号113)、DHLLA(配列番号114)、もしくはHHLDV(配列番号115);
(12)ZF4の位置+2〜+6にアミノ酸配列SNLRR(配列番号116)、GNLVR(配列番号117)、GNLRR(配列番号118)、GNLKR(配列番号119)、ANLRR(配列番号120)、NNLRR(配列番号121)、もしくはTNLRR(配列番号122);ZF6の位置+2〜+6にアミノ酸配列EHMKR(配列番号123)、EHMRR(配列番号124)、THMKR(配列番号125)、EHMNR(配列番号126)、もしくはEHMAR(配列番号127);およびZF7の位置+2〜+6にアミノ酸配列DNLLT(配列番号128)、DNLLV(配列番号129)、DNLQT(配列番号130)、DNLLA(配列番号131)、DNLAT(配列番号132)、DNLQA(配列番号133)、DNLMA(配列番号134)、もしくはDNLMT(配列番号135);
(13)ZF4の位置+2〜+6にアミノ酸配列GNLVR(配列番号136)、GNLRR(配列番号137)、GNLAR(配列番号138)、GNLMR(配列番号139)、ANLRR(配列番号140)、SNLRR(配列番号141)、もしくはNNLRR(配列番号142);ZF6の位置+2〜+6にアミノ酸配列EHMNR(配列番号143)、EHMKR(配列番号144)、EHMRR(配列番号145)、SHMNR(配列番号146)、SHMRR(配列番号147)、THMKR(配列番号148)、もしくはDHMNR(配列番号149);およびZF7の位置+2〜+6にアミノ酸配列EHLKV(配列番号150)、EHLAE(配列番号151)、STLNE(配列番号152)、DHLQV(配列番号153)、EHLNV(配列番号154)、DHLNT(配列番号155)、EHLQA(配列番号156)、もしくはHHLMH(配列番号157);または
(14)ZF4の位置+2〜+6にアミノ酸配列GHLKK(配列番号158)、AHLKK(配列番号159)、TKLRL(配列番号160)、TKLKL(配列番号161)、GHLRK(配列番号162)、THLKK(配列番号163)、もしくはAHLRK(配列番号164);ZF5の位置+2〜+6にアミノ酸配列TRLKE(配列番号165)もしくはSRLKE(配列番号166);およびZF6の位置−1〜+3にアミノ酸配列RADN(配列番号167)、RHDT(配列番号168)、RRDT(配列番号169)、RPDT(配列番号170)、RTSS(配列番号171)、もしくはRNDT(配列番号172)
を含有するものが含まれる。
本明細書において記載される操作されたCTCFバリアントは、変異体CBSに起因した異常な遺伝子調節が根本的要因である疾患を治療するために使用され得る。本明細書において記載される操作されたCTCFバリアントは、例えば、野生型CTCFには結合しない変異体CBSに結合し得、それによって遺伝子調節を変更しまたは回復させ、それが疾患の進行を逆転させ得るまたは減速させ得る。CTCF結合は、MYC等のがん遺伝子の発現を調節することが示されている。CTFC結合部位に蓄積した変異および野生型CTCF結合の喪失は、がん遺伝子の調節異常および発がんの危険性の増加に関連している。MYCの転写調節異常は、侵襲性の強い腫瘍細胞における最も頻度が高い事象の1つであり、調節異常は、エンハンサー−プロモーターループを分断するCTCF結合部位における変異の結果である。操作されたCTCFバリアントは、変異した部位に結合し得、正常な遺伝子発現レベルを回復させ得、癌発生の危険性を低下させる。別の場合には、脆弱X症候群は、繰り返し領域における重複およびFMR1発現の喪失の結果である。X染色体における反復領域の重複は、CTCF結合部位を分断し、FMR1の発現を推進するエンハンサー−プロモーターループの喪失につながる。操作されたCTCFバリアントは、エンハンサー−プロモーターループを回復させ得、FMR1発現の回復につながる。ヒトパピローマウイルス(HPV)および他の組み込み型ウイルス(HIV等)は、近隣エンハンサーからのウイルスゲノムのCTCF媒介性断絶によってしばしばサイレンシングされる。HPV18の場合、ウイルスゲノムのプロモーター領域にCTCF結合部位がある。CTCF結合部位に変異を有するHPV18は、結合部位におけるこれらの配列変異がCTCFによってもはや認識され得ないためサイレンシングされない。操作されたCTCFバリアントは、変異したHPVが組み込まれたゲノムに結合し得、断絶しているループを回復させ得るであろう。
操作されたCTCFバリアントおよび/または本明細書において記載される操作されたCTCFをコードする核酸、ならびに使用のための取扱説明書を含むキットも本明細書において提供される。
本明細書において記載される操作されたCTCFは、いくつかの他の適用において使用され得、その一部は本明細書において開示される。
以下の材料および方法を、下記で示される実施例において使用した。
ジンクフィンガー細菌発現プラスミドは、gal11Pに融合したCTCFジンクフィンガーアレイ(またはバリアント)を含有した。CTCF11フィンガージンクフィンガーアレイのすべてまたは一部のアミノ末端をgal11Pのカルボキシ末端に、それらの間にFlagタグリンカーを用いて融合させた。ジンクフィンガー発現プラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子を含有する。細菌レポータープラスミドとして知られる第2のプラスミドは、BsaI制限消化、それに続くCTCF結合部位を含有するアニールされたオリゴのT4媒介性ライゲーションを介して導入されたCTCF結合部位配列を含有した。レポータープラスミドは、CTCF結合部位が結合された場合にlacZの発現を促進する細菌lacプロモーターを含有した。レポータープラスミドは、クロラムフェニコール耐性遺伝子も有する。
相補的オリゴは、意図的に配列に導入される「VNS」または「NNS」変動を用いて、IDTによって合成された。オリゴをアニールし、T4リガーゼを使用してジンクフィンガー発現プラスミド(XbaIおよびBamHIで事前に消化された)にライゲーションした。ライゲーション反応物をQiagen Mineluteカラムを使用して精製し、精製された基質をエレクトロコンピテントXL1blue大腸菌(E.coli)系統に電気形質転換した。SOC中にて37℃で1時間の回復後、50ug/mLのカナマイシンを有する150mLのLuriaブロス(LB)に形質転換物を植菌した。培養物が0.400〜0.600のOD600に到達した(37℃で約10時間の成長)後、培養物をスピンダウンし、Qiagen Maxiprepキットを使用してライブラリーを回収した。
600ngのgal11P−ジンクフィンガー発現プラスミド、および関心対象のCTCF結合部位を有する600ngのレポータープラスミドを、RNAポリメラーゼのアルファN末端ドメイン(α−NTD)−Gal4融合体とともに、150uLのΔλ大腸菌(E.coli)系統に化学的に形質転換した。プラスミドおよび細胞混合物を氷上で30分間インキュベートし、42℃で1分間熱ショックを与え、氷上で2分間回復させ、その後に500uLのLuriaブロス中での1時間の回復が続いた。回復後、形質転換物を、カナマイシン(50ug/mL)、クロラムフェニコール(12.5ug/uL)選択LB寒天プレートにプレーティングした。37℃での14〜16時間の成長後、コロニーを採取し、1mLの誘導培地(50ug/uLのカナマイシン、12.5ug/mLのクロラムフェニコール、10ug/mLのZnCl、および500ug/mLのIPTGを有するLuriaブロス)中で一晩成長させた。15〜17時間の成長後、25uLの一晩の培養物を1mLの新鮮な誘導培地に継代培養し、37℃で2時間または培養物が分光光度計によって測定されるD595 0.157〜0.268の間になるまで成長させた。次いで、100uLの継代培養物を、リゾチームとPopCultureソープとの11uLの1:10混合物を使用して最低15分間溶解した。次いで、15uLの溶解混合物を、以前に記載された比色分析ONPGアッセイによってLacZの倍活性化について分析した。結合を、LacZの倍活性化によって定量した。陰性対照(gal11Pに融合したジンクフィンガータンパク質なし)のβ−galレベルを上回るサンプルのβ−galレベルの倍増加を算出することによって、倍活性化を判定した。
選択アッセイに関与したプラスミドは、1つの違いのみを有して、以前と同じである。レポータープラスミドは、LacZを、カルベニシリン等のβ−ラクタム環クラスの抗生物質に対する抗生物質耐性遺伝子であるBlaCと入れ替えることによって選択プラスミドであるように作製される。ジンクフィンガー−gal11P発現プラスミドにライゲーションされたオリゴのプールからバリアントのライブラリーを構築することによって、選択を行う。これらを、関心対象のCTCF結合部位を有する選択プラスミドを含有するエレクトロコンピテントΔλ大腸菌(E.coli)系統に電気形質転換する。細胞を1mLのSOC中にて37℃で1時間回復させ、その後に、4mLの誘導培地(以前に記載された)中にて37℃で付加的な3時間の選択プラスミドの誘導が続く。合計4時間後、形質転換物を低ストリンジェンシーなプレート(50ug/mLのカナマイシン、12.5ug/mLのクロラムフェニコール、100ug/mLのカルベニシリン、10ug/mLの塩化亜鉛、および200ug/mLのIPTG、および0.45ug/mLのクラブラン酸を有するLB寒天)にプレーティングする。プレートを、20〜24時間37℃で一晩成長させ、次いで、コロニーを2mLのLBを有する表面から回収する。50uLの削り取られたコロニーを、50ug/mLのカナマイシンおよび12.5ug/mLのクロラムフェニコールを有する1mLのテリフィックブロス(TB)に継代培養し、37℃で14〜16時間成長させた。翌日、プラスミドを一晩の培養物から回収し、関心対象のCTCF結合部位を有する以前と同じ選択プラスミドを含有する化学的コンピテントΔλ大腸菌(E.coli)系統に化学的に形質転換する。化学的形質転換は、37℃で1時間の回復後に誘導培地中で2時間の成長を加えて、以前に記載されるように実施される。合計3時間の成長後、細胞を高ストリンジェンシーな選択勾配プレートにプレーティングする。高ストリンジェンシーな勾配プレートは、濃度が約1から開始して最高40ug/mLまでのクラブラン酸の勾配を有して、50ug/mLのカナマイシン、12.5ug/mLのクロラムフェニコール、100ug/mLのカルベニシリン、10ug/mLのZnCl、200ug/mLのIPTGを含有する。プレートを37℃で20〜24時間インキュベートした。最も高いレベルのクラブラン酸を有する勾配で成長したコロニーを採取し、50ug/mLのカナマイシンを有する1mLのTB中で成長させ、一晩成長させてプラスミドを回収した。次いで、バリアントプラスミドをサンガーシーケンシングし、ならびにB2H β−galレポーターアッセイにおいて結合活性について分析した。
高ストリンジェンシーな選択勾配プレートは、濃度が約1から開始して40ug/mLまでのクラブラン酸の勾配を有して、50ug/mLのカナマイシン、12.5ug/mLのクロラムフェニコール、100ug/mLのカルベニシリン、10ug/mLのZnCl、200ug/mLのIPTGを含有する。クラブラン酸の勾配を得るために、約25℃の傾斜(くさびの細い先がLB寒天でどうにか覆われるだけのような十分な角度)を有するように、ピペットチップを使用して長方形プレートを持ち上げる。50ug/mLのカナマイシン、12.5ug/mLのクロラムフェニコール、100ug/mLのカルベニシリン、10ug/mLのZnCl、200ug/mLのIPTG、および4ug/mLのクラブラン酸を有する20〜25mLのLB寒天を傾けたプレートに添加し、底のくさびを形成する。固まり次第、プレートを平らに置き、50ug/mLのカナマイシン、12.5ug/mLのクロラムフェニコール、100ug/mLのカルベニシリン、10ug/mLのZnCl、200ug/mLのIPTG(クラブラン酸を有しない)を有する20〜25mLのLB寒天を上部に注ぐ。これにより、約1ug/mLから最高4.0ug/mLに及ぶ範囲のクラブラン酸の勾配を有するプレートが創出される。
3×105個細胞/mLの密度でのトランスフェクションの18〜24時間前に、K562細胞を播種した。バリアントごとに300万個のK562を、提供される最適化プロトコールを使用したLonzaキットVを使用してトランスフェクトし、10cmディッシュにプールした。pCAGプロモーターによって発現されるHAエピトープタグ付けされたCTCF(野生型またはバリアント)を発現する5ugのプラスミドを、各100万個の細胞反応物に対して使用した。トランスフェクションの72時間後、およそ1000万個の細胞を1%ホルムアルデヒドを用いて37℃で10分間架橋した。反応を、1.2mLの2.5Mグリシンを用いて37℃で5分間消光した。細胞を430gで10分間ペレットにし、SFX250 Branson超音波処理器で5.5分間、32%の振幅で、1.3秒間オフ、0.7秒間オンで超音波処理した。次いで、サンプルを半分に分け、一方をCTCFに特異的な抗体とともに4℃で回転させながら一晩沈殿させ、他方をHA特異的抗体とともに一晩沈殿させた。翌日、抗体が結合したクロマチン複合体を、回転させながらG−dynabeadsとともに4℃で2時間インキュベートした。ビーズを、1mLの氷冷RIPA150洗浄バッファー(0.1%SDS、0.1%DOC、1%Triton X−100、1mM EDTA、10mM Tris−HCl pH8、150mM NaCl)中で3回、1mLの氷冷RIPA500洗浄バッファー(0.1%SDS、0.1%DOC、1%Triton X−100、1mM EDTA、10mM Tris−HCl pH8、500mM NaCl)中で3回、1mLの氷冷LiCl洗浄バッファー(10mM Tris−HCl pH8、250mM LiCl、0.5%Triton X−100、0.5%DOC)で3回、および1mLの氷冷10mM Tris−HCl pH8.5中で1回洗浄した。抗体クロマチン複合体を、新しく添加された5mM DTTを有する100uLの溶出バッファー(10mM Tris−HCl pH8、0.1%SDS、150mM NaCl)中にビーズから溶出した。ビーズを、900rpmで振とうしながら、溶出バッファーとともに65℃で1時間インキュベートした。ビーズを磁石によってペレットにし、上清をきれいなチューブに移し、そこで室温に冷ました後、1uLのRNAse(Roche 11119915001)をサンプルに添加し、600rpmにて37℃で30分間インキュベートした。3uLのプロテイナーゼK[20mg/mL]をサンプルに添加し、65℃で一晩インキュベートした(Lifetech #100005393)。翌日、160uLのPEG/NaCl(20%PEG、2.5M NaCl)を有する100uLのSPRIビーズをサンプルに添加し、ボルテックスし、磁石上にビーズをペレットにする前に室温で5分間インキュベートした。ペレットを80%エタノールで2回洗浄し、150uLの10mM Tris−HCl pH8中での最終溶出の前に5分間空気乾燥させた。リアルタイムqPCRによる、抗体によって処理されていない1%インプットを上回るフラグメント富化の定量のために、3uLの回収された上清を、5uLのSYBR qPCRマスターミックスおよび2uLのプライマーミックスと混合した。
MYC TSSの約2kb上流にあるCTCF結合部位に導入されたバリアント結合部位を有する細胞株を、exoMYC.K562に、SpCas9−P2A−GFP、CTCF結合部位を標的にするgRNA、および6つの異なるバリアント結合部位を導入するHDR鋳型としての6つの個別のssODNのうちの1つをヌクレオフェクトすることによって作出した。exoMYC.K562は、PGKプロモーターから発現される外因性MYC構築物を形質導入されたK562細胞株である。内因性MYC発現の任意の低下はK562細胞の生存に影響を与え得ることから、これが必要であった。単一細胞クローン増殖のために、GFP+細胞を96ウェルプレートに高希釈で選別した。増殖され次第、gDNAおよびRNAを抽出して、クローン細胞集団を遺伝子型判定および表現型判定した。内因性MYCの低下を有し、また所望のHDR事象のための標的部位でホモ接合性に見えるクローン株を調査において使用した。
MYCの上流にバリアント結合部位を持するように編集された300万個のK562細胞のゲノムに、LonzaキットVプロトコールに従って、バリアントCTCFを発現する5ugのプラスミドをヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションの72時間後、NucleoSpin RNA Plus RNA単離プロトコールに従って、100万個の細胞をRNA抽出のために単離した。Thermo High−Capacity RNA−to−cDNAキットにより、RNAをcDNAに変換した。3uLの1:20希釈のcDNAを5uLのThermo Fast SYBRgreenマスターミックスと混合し、標準PCR増幅プロトコールに従って、RT−qPCR機器でランした。
CTCF結合効率に影響を及ぼす、CBSにおける単一ヌクレオチド置換
本発明者らは、細菌ツーハイブリッド(B2H)システムを使用して、野生型CTCF結合を分断する単一のまたは複数の配列変化を持つ変異したCBSに結合するCTCFのジンクフィンガーアレイを考案し得るであろうと本発明者らは推論した(Wright et al. Nature Protocols (2006);Sander et al., Nature Methods (2010);Maeder et al. Molecular Cell. (2008))。本発明者らは、以前に記載された細菌ツーハイブリッド(B2H)システムを使用して、以前に規定されたコンセンサスCBS部位内の単一ヌクレオチド置換の影響を体系的に規定した(Joung et al., PNAS (2000))。B2Hシステムにおいて、関心対象の標的部位へのDNA結合ジンクフィンガーアレイの結合を、レポーター遺伝子(例えば、ベータ−ガラクトシダーゼまたは抗生物質耐性遺伝子)の転写の増加をもたらすように構成し得る(図2)。これを行うために、2つの融合体を、レポーター構築物を持つ大腸菌(E.coli)細胞において発現させる。第1の融合体は、酵母Gal4融合体のフラグメントと相互作用する酵母Gal11Pタンパク質のフラグメントに融合したジンクフィンガーアレイからなる。第2の融合体は、酵母Gal4フラグメントとの大腸菌(E.coli)RNAポリメラーゼアルファサブユニットのN末端ドメインの融合体(α−Gal4融合体)からなる。レポーター構築物は、プロモーターの上流に位置する、ジンクフィンガーアレイに対する結合部位を有して、関心対象のレポーター遺伝子の発現を推進する弱い大腸菌(E.coli)プロモーターからなる。ジンクフィンガー結合部位へのジンクフィンガー−Gal11P融合体の結合は、アルファ−Gal4融合体を持するRNAポリメラーゼ複合体の導きをもたらし、レポーター遺伝子の転写の増加がもたらされる。レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ(β−gal)をコードするlacZである場合、ベータ−gal発現のレベルは、十分に確立された比色分析ONPGに基づくアッセイを使用して容易に定量され得る(図2)。
次に、本発明者らは、本発明者らがB2Hシステムを使用して、野生型CTCFジンクフィンガーアレイによって認識されない変異したCBSを認識し得るCTCFジンクフィンガーアレイバリアントを選択し得るかどうかを判定しようと努めた。これを行うために、本発明者らはB2Hレポーター構築物を改変し、lacZ遺伝子を、ベータ−ラクタマーゼをコードし、それゆえベータ−ラクタム抗生物質(例えば、カルベニシリン)に対する耐性を付与するblaC遺伝子で置き換えた(図6)。この改変により、本発明者らは、blaC発現を推進する弱いプロモーターの上流に位置する変異体CBSに効率的に結合し得るCTCFジンクフィンガーアレイバリアントを発現する細胞を選択することが可能となる。次第により高くなるレベルのblaC発現は、カルベニシリンを含有する培地および次第により高くなる濃度のベータ−ラクタマーゼ阻害剤クラブラン酸を使用することによって選択され得る。クラブラン酸の勾配は、単一の寒天プレート内で創出され得(図6;材料および方法を参照されたい)、それによって、阻害剤の様々な濃度における細胞のサンプリングが可能となる。
単一の変更したヌクレオチド位置を有するCBSを認識し得るCTCFジンクフィンガーバリアントを同定することに成功したため、本発明者らは、次に、複数の変異したヌクレオチドを持つCBSを認識し得るバリアントを同定しようと努めた。これを行うために、本発明者らは、個々の変異を持つ、CBS内の異なる「サブサイト」に結合するようにそれぞれが選択されたZFバリアントを組み換えようと努めた。しかしながら、マルチフィンガーアレイにおけるZFの間に存在する周知の前後関係依存的効果が理由で、本発明者らは、本発明者らが、任意の所与の変更したサブサイトに対して、選択されたZFバリアントのプール(単一のバリアントではなく)を一緒に組み換えて、複数の変異を持つCBSを認識するように一緒になって最善に働く変異したZFの組み合わせを同定するストラテジーに取り組んだ。様々な変異したCBSサブサイトに対するZFバリアントのプールを単離するために、本発明者らは、単一変異を持つCBS部位に関して本発明者らが実施した高ストリンジェンシーな選択プレートから残りすべてのクローンを回収した(図9〜16に描写される)。これらのプールにおける様々な選択されたクローンのディープシーケンシングは、予想どおりに各選択内にある程度のコンセンサスを有する多様な配列を生み出した(表1)。
モチーフにわたる複数の配列変化を有するCBSを認識し得る操作されたバリアントに成功したため、本発明者らは、次に、バリアントが、ヒト細胞背景においてこれらの同じ変異体結合部位に結合し得、一方で野生型CBSに結合しないかどうかを調べることを望んだ。まず、本発明者らが、結合するようにCTCFバリアントを選択していた5つの変異した結合部位のそれぞれに対する15bpコア配列と合致する、ヒトゲノムにおける部位の集合体を本発明者らは見出した(図17〜21に記載される)。本発明者らは、次いで、5つの変異した結合部位のうちの1つ(図20に描写される配列)と合致する配列を有する2つのバリアント結合部位ならびに公知のCBSに注目して、B2Hレポーターアッセイが示唆するであろうように、内因性CTCFが野生型CBSに結合し得、バリアント結合部位には結合しないかどうかを判定した(図20)。赤白血病細胞株であるヒトK562を回収し、CTCF特異的抗体を使用したChIP−qPCRによって分析してCTCF−DNA結合を検出した。野生型CTCFは、変異したCBSと合致する2つの異なる標的部位への検出可能な結合を示さなかったが、野生型CTCF結合部位の大幅な富化を示し、B2Hレポーターアッセイの結果を支持した(図22)。次に、本発明者らは、K562におけるプラスミドトランスフェクションによって送達された、過剰発現した外因性の3×HAタグ付けされた野生型CTCFが、内因性CTCFに関して観察されたものと同じ結合プロファイルを有するかどうかを確かめることを望んだ。野生型K562に3×HA−CTCFをトランスフェクトし、72時間後に回収し、HA特異的抗体を用いたChIP−qPCR分析のために処理した。外因性の野生型3×HA−CTCFは、内因性の野生型CTCFと同じく、野生型CBSに結合し得、バリアント結合部位には結合し得ず、プラスミド送達によるCTCFの過剰発現が、生物学的に関連した挙動を反映することを示唆した(図23A)。これらの結果に基づき、本発明者らは、次に、バリアントCTCFが、ヒトゲノム原産のバリアント結合部位に結合する能力を検討した。選定されたバリアントは、B2Hアッセイにおける選択から取り出されたものであり、B2Hレポーターアッセイによって、図22〜23Bにおいて使用されたバリアント部位1および2と同じ配列を有するバリアント部位に結合することが示された。K562に3×HAタグ付けされたCTCFバリアントをトランスフェクトし、以前と同じ部位をChIP−qPCRによって結合活性について検討した。バリアント特異的HA富化は、バリアント結合部位に存在しかつ野生型部位に欠如しており、本発明者らが、天然CBSに結合することなく、たった3つのヌクレオチド変化を有する変異体CBSに特異的に結合し得るバリアントを考案することに成功したことを示唆した(図23B)。
CTCFは、ゲノムのCTCF−コヒーシン媒介性ループ形成により遺伝子発現を変更する能力を有する。本発明者らは、バリアントCTCFが、内因性バリアント結合部位に結合した場合に、野生型CTCFの遺伝子調節能を再生し得るかどうかを確かめることに好奇心を持った。遺伝子発現変化を調べるために、本発明者らは、バリアント結合部位の1Mb領域内の遺伝子に重点を置いた。バリアント部位1.1および1.2に対して1Mb領域内に11個の遺伝子が同定され、バリアント部位2.1および2.2に対して別の10個の遺伝子が同定された。バリアント部位1およびバリアント部位2に結合する能力を有する、GFPに融合したバリアントCTCFをK562にヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションの72時間後、RNAをGFP+細胞から単離し、遺伝子発現レベルを、野生型CTCF対照をヌクレオフェクトされたK562から抽出されたRNAと比較した。バリアント部位1.1および1.2に対する11個の遺伝子のうち、6個の遺伝子が、野生型CTCF対照をヌクレオフェクトされた細胞(JJ388)と比べて遺伝子発現の変化を示した(図24A)。バリアント部位2.1および2.2に対して同定された10個の遺伝子のうちの2個が、野生型対照と比べて変更した遺伝子発現レベルを有した(図24B)。このデータは、バリアントCTCFタンパク質がヒト細胞においてそれらの標的配列に結合するだけでなく、それが、おそらくループまたはサブTADの形成により遺伝子発現を調節する天然CTCFの生物学的役割を再生もすることを示唆する。
種々のCTCF結合部位に関して選択されたバリアントのアミノ酸配列。すべてのアミノ酸配列は、NからC末に挙げられている。選択の最も高いストリンジェンシーで成長するコロニーを削り取り、プールし、ジンクフィンガーをコードするプラスミドを単離し、ディープシーケンシングした。読み取りの数は、三つ組で実施された選択からプールされた集団において、バリアントがどのくらい顕著であったかを反映する。
本発明は、その詳細な説明と併せて記載されているが、前述の説明は例示することを意図されるものであり、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内にある。
Claims (26)
- 野生型CTCFのアミノ酸配列と配列が異なる、少なくとも1つのジンクフィンガーにおける少なくとも1つのアミノ酸残基を含む操作されたCCCTC結合因子(CTCF)バリアントであって、前記操作されたCTCFバリアントは、野生型CTCFよりも高いアフィニティーで変異体CTCF結合配列(CBS)に結合し、前記変異体CBSは、コンセンサスCBSのヌクレオチド配列と配列が異なる少なくとも1つのヌクレオチド塩基を含み、前記野生型CTCFのアミノ酸配列と配列が異なる前記少なくとも1つのアミノ酸残基は、前記操作されたCTCFバリアントのZF7、ZF6、ZF5、ZF4、およびZF3のいずれかの位置−1、+1、+2、+3、+5、および+6におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、操作されたCTCFバリアント。
- 前記変異体CBSは、前記コンセンサスCBSモチーフの位置2にチミン(T)、アデニン(A)、またはグアニン(G)残基を有し、前記操作されたCTCFは、ZF7の位置+3にアミノ酸残基トレオニン、アスパラギン、またはヒスチジンを含む、請求項1に記載の操作されたCTCFバリアント。
- 前記変異体CBSは、前記コンセンサスCBSモチーフの位置2にG残基を有し、前記操作されたCTCFは、ZF7の位置+2〜+6にアミノ酸配列DHLQT、EHLNV、AHLQV、EHLRE、DHLQV、EHLKV、EHLVV、DHLRT、またはDHLATを含む、請求項1に記載の操作されたCTCFバリアント。
- 前記変異体CBSは、前記コンセンサスCBSモチーフの位置3にT、G、またはC残基を有し、前記操作されたCTCFは、ZF7の位置−1〜+3に:
アミノ酸配列RKHDもしくはRRSDを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置3にT残基を有する;
アミノ酸配列RKAD、IPRI、RKHD、もしくはRKDDを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置3にG残基を有する;または、
アミノ酸配列GIVN、ELLN、QALL、もしくはPHRMを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置3にC残基を有する、
請求項1に記載の操作されたCTCFバリアント。 - 前記変異体CBSは、前記コンセンサスCBSモチーフの位置5にT、G、またはA残基を有し、前記操作されたCTCFは、ZF6の位置+2〜+6に:
アミノ酸配列NAMKR、GNMAR、EGMTR、SNMVR、もしくはNAMRGを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置5にT残基を有する;または、
アミノ酸配列EHMGR、DHMNR、THMKR、EHMRR、もしくはTHMNRを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置5にG残基を有する、
請求項1に記載の操作されたCTCFバリアント。 - 前記変異体CBSは、前記コンセンサスCBSモチーフの位置6にT、G、またはC残基を有し、前記操作されたCTCFは、ZF6の位置−1〜+3に:
アミノ酸配列MNESもしくはHRESを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置6にT残基を有する;または、
アミノ酸配列RPDT、RTDI、もしくはRHDTを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置6にG残基を有する、
請求項1に記載の操作されたCTCFバリアント。 - 前記変異体CBSは、前記コンセンサスCBSモチーフの位置7にC、A、またはT残基を有し、前記操作されたCTCFは、ZF5の位置+2〜+6に:
アミノ酸配列HGLKV、HRLKE、HALKV、SRLKE、もしくはDGLRVを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置7にT残基を有する;
アミノ酸配列HTLKVもしくはHGLKVを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置7にA残基を有する;または、
アミノ酸配列SRLKE、HRLKE、もしくはNRLKEを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置7にC残基を有する、
請求項1に記載の操作されたCTCFバリアント。 - 前記変異体CBSは、前記コンセンサスCBSモチーフの位置8にC、A、またはT残基を有し、前記操作されたCTCFは、ZF5の位置+2〜+6に:
アミノ酸配列ATLKR、QALRR、GGLVR、またはHGLIRを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置8にT残基を有する;
アミノ酸配列ANLSR、TGLTR、HGLVR、またはGGLTRを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置8にA残基を有する;
アミノ酸配列HTLRR、TVLKR、ADLKR、またはHGLRRを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置8にC残基を有する、
請求項1に記載の操作されたCTCFバリアント。 - 前記変異体CBSは、前記コンセンサスCBSモチーフの位置10にT、A、またはC残基を有し、前記操作されたCTCFは、ZF4の位置+2〜+6に:
アミノ酸配列AHLRKを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置10にT残基を有する;
アミノ酸配列AKLRV、EKLRI、もしくはAKLRIを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置10にA残基を有する;または、
アミノ酸配列TKLKVを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置10にC残基を有する、
請求項1に記載の操作されたCTCFバリアント。 - 前記変異体CBSは、前記コンセンサスCBSモチーフの位置11にT、A、またはC残基を有し、前記操作されたCTCFは、ZF4の位置+2〜+6に:
アミノ酸配列ATLRRもしくはRRLDRを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置11にT残基を有する;
アミノ酸配列TNLRR、ANLRR、もしくはGNLTRを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置11にA残基を有する;または、
アミノ酸配列AMLKR、HMLTR、AMLRR、もしくはTMLRRを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置11にC残基を有する、
請求項1に記載の操作されたCTCFバリアント。 - 前記変異体CBSは、前記コンセンサスCBSモチーフの位置13にT、A、またはC残基を有し、前記操作されたCTCFは、ZF3の位置+2〜+6に:
アミノ酸配列QQLIV、SQLIV、QQLLV、GELVV、もしくはQQLLIを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置13にT残基を有する;
アミノ酸配列GQLIV、GQLTV、GKLVT、TELII、もしくはQGLLVを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置13にA残基を有する;または、
アミノ酸配列QQLLT、GQLLT、GELLT、もしくはQQLLIを含み、前記変異体CBSは前記コンセンサスCBSモチーフの位置13にC残基を有する、
請求項1に記載の操作されたCTCFバリアント。 - 前記変異体CBSは、前記コンセンサスCBSモチーフの位置2、6、7、および10にそれぞれA、G、T、およびT残基を有し、前記操作されたCTCFは、
(i)前記操作されたCTCFのZF4の位置+2〜+6にアミノ酸配列AKLKK、AKLRK、AHLRV、AKLRV、またはSKLRL;
(ii)前記操作されたCTCFのZF5の位置+2〜+6にアミノ酸配列ERLRV、NRLKV、SRLKE、またはNRLKV;
(iii)前記操作されたCTCFのZF6の位置−1〜+3にアミノ酸配列RPDT、RTET、またはRADV;および
(iv)前記操作されたCTCFのZF7の位置+2〜+6にアミノ酸配列DNLLA、SNLLV、DNLMA、またはDNLRV
を含む、請求項1に記載の操作されたCTCFバリアント。 - 前記変異体CBSは、前記コンセンサスCBSモチーフの位置2、6、7、および10にそれぞれG、G、T、およびT残基を有し、前記操作されたCTCFは、
(i)前記操作されたCTCFのZF4の位置+2〜+6にアミノ酸配列GHLKK、AHLRK、またはGKLRI;
(ii)前記操作されたCTCFのZF5の位置+2〜+6にアミノ酸配列SRLKE、DALRR、DGLKR、またはTRLRE;
(iii)前記操作されたCTCFのZF6の位置−1〜+6にアミノ酸配列RPDTMKRまたはRTENMKM;および
(iv)前記操作されたCTCFのZF7の位置+2〜+6にアミノ酸配列EHLKV、DHLLA、またはHHLDV
を含む、請求項1に記載の操作されたCTCFバリアント。 - 前記変異体CBSは、前記コンセンサスCBSモチーフの位置2、5、および11にそれぞれA、G、およびA残基を有し、前記操作されたCTCFは、
(i)前記操作されたCTCFのZF4の位置+2〜+6にアミノ酸配列SNLRR、GNLVR、GNLRR、GNLKR、ANLRR、NNLRR、またはTNLRR;
(ii)前記操作されたCTCFのZF6の位置+2〜+6にアミノ酸配列EHMKR、EHMRR、THMKR、EHMNR、またはEHMAR;および
(iii)前記操作されたCTCFのZF7の位置+2〜+6にアミノ酸配列DNLLT、DNLLV、DNLQT、DNLLA、DNLAT、DNLQA、DNLMA、またはDNLMT
を含む、請求項1に記載の操作されたCTCFバリアント。 - 前記変異体CBSは、前記コンセンサスCBSモチーフの位置2、5、および11にそれぞれG、G、およびA残基を有し、前記操作されたCTCFは、
(i)前記操作されたCTCFのZF4の位置+2〜+6にアミノ酸配列GNLVR、GNLRR、GNLAR、GNLMR、ANLRR、SNLRR、またはNNLRR;
(ii)前記操作されたCTCFのZF6の位置+2〜+6にアミノ酸配列EHMNR、EHMKR、EHMRR、SHMNR、SHMRR、THMKR、またはDHMNR;および
(iii)前記操作されたCTCFのZF7の位置+2〜+6にアミノ酸配列EHLKV、EHLAE、STLNE、DHLQV、EHLNV、DHLNT、EHLQA、またはHHLMH
を含む、請求項1に記載の操作されたCTCFバリアント。 - 前記変異体CBSは、前記コンセンサスCBSモチーフの位置6、7、および10にそれぞれG、T、およびT残基を有し、前記操作されたCTCFは、
(i)前記操作されたCTCFのZF4の位置+2〜+6にアミノ酸配列GHLKK、AHLKK、TKLRL、TKLKL、GHLRK、THLKK、またはAHLRK;
(ii)前記操作されたCTCFのZF5の位置+2〜+6にアミノ酸配列TRLKEまたはSRLKE;および
(iii)前記操作されたCTCFのZF6の位置−1〜+3にアミノ酸配列RADN、RHDT、RRDT、RPDT、RTSS、またはRNDT
を含む、請求項1に記載の操作されたCTCFバリアント。 - コヒーシン(cohesion)と相互作用してエンハンサー−プロモーターループの形成を媒介して遺伝子発現をモジュレートする、請求項1から16のいずれか一項に記載の操作されたCTCFバリアント。
- 請求項1から17のいずれか一項に記載の操作されたCTCFバリアントの治療上有効量を対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象を治療する方法。
- 前記対象は癌を有する、請求項18に記載の方法。
- 請求項1から17のいずれか一項に規定の変異体CBSの制御下にある遺伝子の発現を活性化するまたは抑制する方法であって、前記遺伝子は、前記変異体CBSの制御下で異常に発現しており、前記変異体CBSと請求項1から17のいずれか一項に記載の操作されたCTCFとを接触させ、それによって前記遺伝子の発現を調節するステップを含む、方法。
- 前記操作されたCTCFは、コヒーシンと相互作用してエンハンサー−プロモーターループの形成を媒介することによって前記遺伝子の発現を活性化するまたは抑制する、請求項20に記載の方法。
- 請求項1から17のいずれか一項に記載の操作されたCTCFバリアントを含む、薬学的組成物。
- 請求項1から17のいずれか一項に記載の操作されたCTCFバリアントをコードする核酸を含む、遺伝子の調節のための遺伝子発現システム。
- 請求項1から17のいずれか一項に記載の操作されたCTCFバリアントと変異体CBSとを接触させて結合複合体を形成し、それによりクロマチンの構造が変更されるステップを含む、クロマチンの構造を変更する方法。
- 1つまたは複数の変異を持つCBSと請求項1から17のいずれか一項に記載の操作されたCTCFバリアントとを接触させるステップを含む、1つまたは複数の変異を持つCBSの制御下にある遺伝子の発現をモジュレートする方法。
- 請求項1から17のいずれか一項に記載の操作されたCTCFバリアントおよび本明細書において記載される方法における使用のための取扱説明書を含む、キット。
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