JP2021518439A - 微生物組成物の新たな使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】微生物組成物の新たな使用に関する。【解決手段】本発明は、ストレス若しくは不安により引き起こされるか若しくは悪化する行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する状態の発症からの対象の保護に有用な、並びに／或いはストレス若しくは不安により引き起こされるか若しくは悪化する行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する既存の状態の治療において有用な、ラクトバチルス属（Lactobacillus）株の死滅細胞を含む医薬組成物を提供する。具体的な状態の例としては、ストレス、不安、鬱病、気分障害、社会性障害、過敏性腸症候群、自閉症、自閉スペクトラム症、心的外傷後ストレス障害、慢性ストレス及び一連の他のストレス関連疾患が挙げられる。【選択図】図１
Description
本発明の背景
[0001] 本発明は、ストレス若しくは不安により引き起こされるか若しくは悪化する行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する状態の発症から健常対象を保護し、並びに／或いはストレス若しくは不安により引き起こされるか若しくは悪化する行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する既存の状態に良い影響を与えるために使用することができる、精神安定（鎮静）及び精神刺激（刺激）効果を有する微生物組成物に関する。
[0001] 本発明は、ストレス若しくは不安により引き起こされるか若しくは悪化する行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する状態の発症から健常対象を保護し、並びに／或いはストレス若しくは不安により引き起こされるか若しくは悪化する行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する既存の状態に良い影響を与えるために使用することができる、精神安定（鎮静）及び精神刺激（刺激）効果を有する微生物組成物に関する。
[0002] 腸内微生物叢は、中枢神経系（ＣＮＳ）の主なモジュレーターとして認識されつつあり、科学的研究の重要な分野を確立しており、それは、神経連絡、内分泌及び免疫シグナリングを含む双方向性コミュニケーション系「微生物叢−腸−脳軸」と称される。キーストレスホルモンのコルチゾール（ヒトにおいて）及びコルチコステロン（マウスにおいて）と他の種における類似のホルモンアナログの調節における腸内微生物叢組成の役割についての確かな証拠が存在する。腸内微生物叢介入、例として、プロバイオティック及びプレバイオティック使用は、動物、例として、ヒトにおける一部の認識状態及び行動状態において良好な効果をもたらしている。
[0003] 腸内微生物叢は、主に、プロバイオティクスを介して脳の健康に対して良好な結果を産生するために利用されており、種々のビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）及びラクトバチルス属（Lactobacillus）株は、げっ歯類及びヒトの両方において抗不安及び認識促進効果を有することが示されている。さらなる報告、例えば、国際公開特許出願の国際公開第２０１６／０６９７９５号及び国際公開第２０１４／０３６１８２号において、プロバイオティクス、例えば、バクテロイデス属（Bacteroides）細菌は、自閉スペクトラム症に対する良好な効果を実証している。しかしながら、単一又は多株プロバイオティクスは認識機能及び／又は行動を修正する潜在性を有するが、微生物叢に対する比較的狭いスペクトル効果を提供するそれらの傾向は限定的である。生きた生物学的製剤は、治療剤として使用される場合、重要な欠点も有する。胃酸、消化プロセス及び結腸中の嫌気性条件は、遠位腸中の生きた生物製剤の生存に対して大変な障害である。さらに、生きた生物学的製剤は、一般に、数十億のコロニー形成単位として投与され、免疫機能低下対象、超低年齢の小児及び超高齢者において生きた生物学的製剤は感染危険に至り得る。生きた生物学的製剤は、薬物耐性又は細菌病原性遺伝子カセットを移す潜在性も有する。さらに、生きた生物学的製剤は、安定化させ、標準化することが困難な生成物であり、「化学、製造及び管理」が極めて困難である。今日まで、生きた生物学的製剤は、現代の十分に整備された市場において医薬製品として承認されていない。
[0004] ラクトバチルス属（Lactobacillus）は、グラム陽性の通性嫌気性又は微好気性の桿状の非胞子形成細菌の属である。これらは、乳酸菌群の大部分である（すなわち、これらは糖を乳酸に変換する）。ヒトにおいて、これらは多数の身体部位における微生物叢の重要な構成成分を構成する。ラクトバチルス属（Lactobacillus）は、現在、１８０を超える種を含有し、広範な生物体を包含する。
[0005] 目下驚くべきことに、本発明者らは、ラクトバチルス属（Lactobacillus）の特定の株の加熱死細胞を含有する組成物が、（特にそのような細胞を培養培地と組み合わせる場合、）精神安定及び精神刺激効果を有することを見出した。これらの組成物は、ストレス若しくは不安の治療、並びに／或いはストレス若しくは不安により引き起こされるか若しくは悪化する行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する状態、例として、例えば、鬱病、気分障害、社会性が機能不全である状態、自閉症、自閉スペクトラム症、心的外傷後ストレス障害、慢性ストレス及び一連の他のストレス関連疾患、並びに過敏性腸症候群からの保護に特に有用である。これらの組成物は、線維筋痛症、強迫性行動、依存又は嗜癖行動の効果からの対象の保護及びその治療にも有用であり得る。ラクトバチルス属（Lactobacillus）の特定の株の加熱死細胞を含有する組成物は、（特にそのような細胞を培養培地と組み合わせる場合、）ストレス及び／又は不安レベルの上昇により引き起こされるか又は悪化する状態からの健常対象の保護において特に有効である。
[0006] 任意の１つの機序論により拘束されるものではないが、本発明の熱不活化細菌は、腸内微生物叢に対する強度の効果も有し、組成及び多様性の両方の変化を伴う。したがって、この細菌はサイコバイオティクスであること、すなわち、それらは、脳に対する細菌媒介影響を示していると仮定される。
[0007] 本発明の１つの特定の生成物は、Lacteol（登録商標）である。Lacteol（登録商標）は、補液する及び／又は食事措置を補助する、成人及び幼児における下痢の対症療法として販売されている。しかしながら、今日まで、精神安定又は精神刺激効果を示すことも、微生物叢−腸−脳軸に対するいかなる影響を有することも報告されていない。
[0008] Lacteol（登録商標）中の活性構成成分は、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）株（ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の組合せ)の加熱死細胞及び発酵培養培地を含有する培養液に由来する。Lacteol（登録商標）は、死滅ラクトバチルス属（Lactobacillus）細胞を含む本発明の他の活性生成物とともに、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する状態を予防し、又はそれに良好な影響を与えるために使用される場合、生きた生物体を含有する生成物、例えば、プロバイオティクスと比べて多数の潜在的利点を有する。死滅生物体を使用する特定の利点としては、組成及び効果の一貫性、貯蔵容易性、脆弱な患者において感染のリスクがないこと、細菌病原性又は抗生物質耐性の転移がないこと、及び抗生物質又は抗真菌剤とともに使用される場合に生成物が活性を保持することが挙げられる。
発明の概要
[0009] 本文献全体にわたり、用語「治療」及び「治療すること」は、記述される状態又は障害からの本開示の組成物の予防的及び保護的使用もカバーするものとする。
[0009] 本文献全体にわたり、用語「治療」及び「治療すること」は、記述される状態又は障害からの本開示の組成物の予防的及び保護的使用もカバーするものとする。
[0010] 本開示の一態様は、ヒト又は非ヒト動物対象においてサイコバイオティック効果を産生するための使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞を含む組成物を提供する。
[0011] 別の態様は、ヒト又は非ヒト動物対象においてサイコバイオティック効果を産生するための使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞を含む組成物であって、前記サイコバイオティック効果は、ヒト又は非ヒト動物の腸内微生物叢の組成及び／又は多様性を変化させることにより達成される組成物を提供する。
[0012] さらなる態様は、ヒト又は非ヒト動物対象においてサイコバイオティック効果を産生するための使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞を含む組成物であって、前記サイコバイオティック効果が、前記ヒト又は非ヒト動物の腸中に存在するアリスティペス属（Alistipes）及び／又はオドリバクター属（Odoribacter）種の量を改変する（例えば、低減させる）ことにより達成される組成物を提供する。
[0013] 別の態様は、動物（例として、ヒト）患者において、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する、行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する状態を治療する方法であって、前記患者に、精神安定及び／又は精神刺激に有効な量の、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を投与することを含む方法を提供する。
[0014] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する気分障害を有する動物（例として、ヒト）患者を治療する方法であって、前記患者に、有効量の、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を投与することを含む方法を提供する。
[0015] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされる自閉症又は自閉スペクトラム症（ＡＳＤ）を有する動物（例として、ヒト）患者を治療する方法であって、前記患者に、有効量の、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を投与することを含む方法を提供する。
[0016] さらなる態様は、ストレス又は不安を有する動物（例として、ヒト）患者を治療する方法であって、前記患者に、有効量の、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を投与することを含む方法を提供する。
[0017] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する社会性障害を有する動物（例として、ヒト）患者を治療する方法であって、前記患者に、有効量の、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を投与することを含む方法を提供する。
[0018] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する鬱病を有する動物（例として、ヒト）患者を治療する方法であって、前記患者に、有効量の、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を投与することを含む方法を提供する。
[0019] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する心的外傷後ストレス障害を有する動物（例として、ヒト）患者を治療する方法であって、前記患者に、有効量の、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を投与することを含む方法を提供する。
[0020] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する過敏性腸症候群を有する動物（例として、ヒト）患者を治療する方法であって、前記患者に、有効量の、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を投与することを含む方法を提供する。
[0021] 別の態様は、動物（例として、ヒト）患者において、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する、行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する状態の治療における使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を提供する。
[0022] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する気分障害を有する動物（例として、ヒト）患者の治療における使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を提供する。
[0023] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされる自閉症又は自閉スペクトラム症（ＡＳＤ）の治療における使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を提供する。
[0024] さらなる態様は、ストレス又は不安を有する動物（例として、ヒト）患者の治療のための医薬組成物における使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を提供する。
[0025] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する心的外傷後ストレス障害を有する動物（例として、ヒト）患者の治療のための医薬組成物における使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を提供する。
[0026] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する社会性障害を有する動物（例として、ヒト）患者の治療のための医薬組成物における使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を提供する。
[0027] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する鬱病を有する動物（例として、ヒト）患者の治療のための医薬組成物における使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を提供する。
[0028] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する過敏性腸症候群を有する動物（例として、ヒト）患者の治療のための医薬組成物における使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を提供する。
[0029] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する、行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する状態の動物（例として、ヒト）患者の治療における使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を含む医薬組成物を提供する。
[0030] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する気分障害を有する動物（例として、ヒト）患者の治療における使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を含む医薬組成物を提供する。
[0031] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する自閉症又は自閉スペクトラム症（ＡＳＤ）を有する動物（例として、ヒト）患者の治療における使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を含む医薬組成物を提供する。
[0032] さらなる態様は、ストレス又は不安を有する動物（例として、ヒト）患者の治療における使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を含む医薬組成物を提供する。
[0033] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する社会性障害を有する動物（例として、ヒト）患者の治療における使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を含む医薬組成物を提供する。
[0034] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する鬱病を有する動物（例として、ヒト）患者を治療することにおける使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を含む医薬組成物を提供する。
[0035] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する心的外傷後ストレス障害を有する動物（例として、ヒト）患者を治療することにおける使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞）を含む医薬組成物を提供する。
[0036] さらなる態様は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する過敏性腸症候群を有する動物（例として、ヒト）患者を治療することにおける使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞、例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞を含む医薬組成物を提供する。
[0037] さらなる態様は、ヒト又は非ヒト動物対象においてコルチコステロイドレベルを低減することにおける使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞、例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞を含む医薬組成物を提供する。したがって、例えば、このような死滅細胞は、ヒト対象におけるコルチゾールレベル及びげっ歯類、例えば、マウスにおけるコルチコステロンレベルを低減させ得る。
[0038] 第１の特定の実施形態において、上記の態様１〜２５のいずれかの上記のラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞、例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞は、培養培地と一緒に投与される。
[0039] 第２の特定の実施形態において、上記の態様１〜２５のいずれかの上記のラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞、例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞は、場合により、培養培地も含有する培養液の一部として投与される。
[0040] 第３の特定の実施形態において、上記の特定の実施形態２の培養液は、投与前に乾燥されており、例えば、凍結乾燥されている。
[0041] 第４の特定の実施形態において、上記の特定の実施形態３の乾燥培養液は、投与前にラクトースと混合される。
[0042] 第５の特定の実施形態において、上記の態様１〜２５のいずれかにより投与される生成物は、Lacteol（登録商標）である。
[0043] さらなる実施形態は、ヒト又は非ヒト動物の腸内微生物叢の組成及び／又は多様性を変化させることにより、（例えば、腸中で存在するアリスティペス属（Alistipes）又はオドリバクター属（Odoribacter）種の量を低減させることにより）改善することができる状態を治療することにおける使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞、例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞を含む医薬組成物である。
[0044] 別の実施形態は、ヒト又は非ヒト動物の腸内微生物叢の組成及び／又は多様性を変化させることによる、（例えば、腸中に存在するアリスティペス属（Alistipes）又はオドリバクター属（Odoribacter）種の量を低減させることによる、）動物（例として、ヒト）患者におけるストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する状態を治療することにおける使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞、例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞を含む医薬組成物である。
図面の説明
[0045]行動動物実験を実施するためのタイムラインの模式的表示である。
[0046]オープンフィールド（ＯＦ）及び新奇物体認識（ＮＯＲ）試験の模式的表示と、ＮＯＲ試験に使用された物体である。
[0047]ガラス玉覆い隠し(marble burying)（ＭＢ）実験の間の探索前及び探索３０分後の試験ケージを示す。
[0048]３チャンバー社会性試験（３ＣＴ）の模式的表示である。
[0049]高架式十字迷路（ＥＰＭ）試験に使用された器具を示す。
[0050]尾懸垂試験（ＴＳＴ）に使用された器具を示す。
[0051]ＯＦ試験の間の対照（青色）又はADR-159（橙色）食の動物についての平均移動距離（左側グラフ）、中央区域における平均消費時間（中央グラフ）及び移動速度（右側グラフ）を示す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１
[0052]ＯＦ試験の間の対照（左側トレース）及びADR-159（右側トレース）食の代表的な動物のトレース運動を示す。
[0053]ＮＯＲ試験の間の対照（青色）又はADR-159（橙色）食の動物における新奇物体に対する平均選好を示す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
[0054]ＭＢ試験における対照（青色）又はADR-159（橙色）食の動物による、覆い隠されたガラス玉の数を示す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
[0055]３ＣＴの慣らし（左側トレース）、社会性（中央トレース）及び社会的新奇性（右側トレース）段階の間の対照（上段トレース）又はADR-159（下段トレース）食の代表的な動物のトレース運動を示す。
[0056]３ＣＴの間の対照（青色）又はADR-159（橙色）食の動物による慣らし（Ａ、Ｂ、Ｃ）、社会性（Ｄ、Ｅ、Ｆ）及び社会的新奇性（Ｇ、Ｈ、Ｉ）段階の間の個々のチャンバーにおける平均消費時間を示す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
[0057]３ＣＴの間の対照（青色）又はADR-159（橙色）食の動物についての平均速度（右側グラフ）及び移動距離（左側グラフ）を示す。エラーバーは、SEMを表す。
[0058]３ＣＴの間の対照（青色）又はADR-159（橙色）食の動物による慣らし（Ａ、Ｂ）、社会性（Ｄ、Ｅ）及び社会的新奇性（Ｇ、Ｈ）段階の間の物体のいずれか（総相互作用時間）（Ａ、Ｄ、Ｇ）又は個々の物体（Ｂ、Ｅ、Ｈ）との相互作用に対する平均消費時間を示す。慣らし、社会性及び社会的新奇性段階の間の識別比をそれぞれ、グラフ（Ｃ）、（Ｆ）及び（Ｉ）のそれぞれにおいて提示する。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
[0059]ＥＰＭ試験の間の対照（青色）又はADR-159（橙色）食の動物によるクローズド（Ａ）又はオープン（Ｄ）アーム中の平均消費時間、クローズド（Ｂ）又はオープン（Ｅ）アームに進入する頻度及びクローズド（Ｃ）又はオープン（Ｆ）アームに進入するまでの潜伏時間を示す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
[0060]ＥＰＭ試験の間の対照（青色）又はADR-159（橙色）食の動物についての平均速度（左側グラフ）及び移動距離（右側グラフ）を示す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
[0061]カルミンレッド試験の間の対照（青色）又はADR-159（橙色）食のマウスにおける平均腸通過時間を示す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
[0062]ＴＳＴの間の対照（青色）又はADR-159（橙色）食の動物における平均無動(immobility)時間を示す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。＊＊＊ｐ≦０．００１
[0063]ＦＳＴの間の対照（青色）又はADR-159（橙色）食の動物についての受動的水泳の平均時間を示す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
[0064]対照（青色）又はADR-159（橙色）食の動物における平均ベースライン（Ｔ０）コルチコステロンレベル（左側グラフ）並びにＦＳＴ前（Ｔ０）及びＦＳＴの３０、６０、９０及び１２０分後のコルチコステロンレベルの変化（右側グラフ）を示す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５。
[0065]対照及びADR-159食の動物における時点にわたる１６Ｓ ｒＲＮＡ配列に基づく主な属の相対豊富度中央値を示す。色凡例を下段に提示した。簡易性のため、１％未満の豊富度の全ての属を一緒にグループ化した。
[0066]対照（桃色）及びADR-159（青色）食による食餌介入前（第０週）及びその間の微生物叢組成のＰＣｏＡプロットを示す。それぞれのドットは、それぞれの所与の時点における個々の動物を表す。楕円は、７５％における全ての群の信頼区間を表す。
[0067]対照及びADR-159食の動物内の選択された示差的に豊富なＯＴＵを示す。ＯＴＵは、最後の３つの時点（第５、６及び８週）の少なくとも２つにおける示差的豊富度の基準に基づき選択した。
[0068]対照食の動物の微生物叢と比較した任意の時点におけるADR-159食の動物における有意に異なる全てのＯＴＵの補足リストを示す。
詳細な説明
[0069] 本開示は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する状態の発症からの健常対象の保護において有用であり、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する既存の状態に良好に影響を与え得る精神安定（鎮静）及び精神刺激（刺激）効果を有する微生物組成物に関する。
[0069] 本開示は、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する状態の発症からの健常対象の保護において有用であり、ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する既存の状態に良好に影響を与え得る精神安定（鎮静）及び精神刺激（刺激）効果を有する微生物組成物に関する。
[0070] 本開示はまた、ストレス若しくは不安を治療し、又はストレス若しくは不安により引き起こされるか若しくは悪化する行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する状態、例として、例えば、鬱病、気分障害、社会性が機能不全である状態、自閉症、自閉スペクトラム症、心的外傷後ストレス障害、慢性ストレス及び一連の他のストレス関連疾患、並びに過敏性腸症候群を治療し、若しくはそれから保護するための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）又はそれらの混合物、例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞を含有する組成物の使用に関する。このような組成物は、線維筋痛症、強迫性行動、又は常習行動の効果から対象を保護するためにも有用であり得る。
[0071] ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）株はヒトの糞便から簡便に単離することができ、２つの独立種、すなわち、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）からなる。発酵培養培地中のラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）は、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)において参照コードMA 65/4Eで寄託されている。死滅ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）細胞は、発酵培養培地中の生細胞を約１１０℃において約１時間加熱することにより得ることができる。ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）又はそれらの混合物の死滅細胞は、加熱死プロセスを介して同様の形式で得ることができる。
[0072] 混合物として使用される場合、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）とラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）との重量比は、約９９：１〜約１：９９の任意の好適な比、例えば、約９：１〜１：９、例として、９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８、１：９であり得る。ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）とラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）との重量比は、特に、約９：１であり得る。
[0073] Lacteol（登録商標）は、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞を発酵培養培地と一緒に（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥又は流動床乾燥により）乾燥させてから本発明における使用のための好適な組成物に配合することにより調製することができる。特定の態様において、乾燥前にラクトースを湿潤発酵産物に添加することができる。別の態様において、ラクトースは、配合ステップの一部として乾燥後に添加することもできる。
[0074] Lacteol（登録商標）及びADR-159は両方とも、培養培地中の約９：１の比の加熱死ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及びラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の乾燥組合せを含有する。ADR-159は、ADR-159を凍結乾燥ではなく流動床中で乾燥させることを除きLacteol（登録商標）と同様の形式で調製することができる。
[0075] ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）又はそれらの混合物、例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞は、乾燥ステップを省略し、又は乾燥生成物を好適な液体、例えば、水により再構成することによりラクトースを有し又は有さない液体形態で使用することもできる。
[0076] 代表的なネズミ行動試験において、ADR-159をマウス通常食中に取り込んだ。長期間にわたり継続的にADR-159に曝したマウスを、ネズミ行動試験のパネルに供した。同様の行動試験を、ADR-159不含食の対照マウスに対して実施した。
[0077] 以下の行動試験を、文献中で厳密に確立された試験に従って、又はそれと極めて密接に関連する手順を使用して実施した。しかしながら、続いて引用される文献手順からのわずかな変更及び逸脱を一部の試験においてなした。したがって、実施された試験を詳細に記載する後述の実施例セクションに着目されたい。
[0078] ネズミ行動試験：
１．ＮＯＲ：新奇物体認識（ＮＯＲ）試験を使用して認識機能及び記憶を評価した−Bevins R.A.et al.,Nature Protocols,2016 vol.1(3),pages 1306-1311参照。
２．ＯＦ及びＥＰＭ：オープンフィールド（ＯＦ）及び高架式十字迷路（ＥＰＭ）試験を使用して不安様行動を評価した−Sweeney FF,O’Leary OF,Cryan JF, Activation but not blockade of GABAB receptors during early-life alters anxiety in adulthood in BALB/c mice. Neuropharmacology.81:303-10(2014)参照。
３．３ＣＴ：３チャンバー試験（３ＣＴ）において不安様行動及び社会性を評価した−Desbonnet L,Clarke G,Shanahan F,Dinan TG,Cryan JF, Microbiota is essential for social development in the mouse, Mol.Psychiatry.19(2):146-8(2014)参照。
４．MB:ガラス玉覆い隠し（ＭＢ）試験を使用して新奇性恐怖（新たな物品に対する恐怖）に関する行動の定量を評価した−Savignac H.M.et al., Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society,vol.26(11),pages 1615-1627(2014)参照。ＭＢ試験は、不安、強迫性行動及び常同行動の尺度でもある。
５．ＴＳＴ：尾懸垂試験（ＴＳＴ）は、潜在的抗鬱効果について化合物をスクリーニングするために広く使用される−Steru L.et al., Psychopharmacology,vol.85(3),pages 367-370(1985)参照。
６．ＦＳＴ：強制水泳試験（ＦＳＴ）も、鬱行動を計測するために使用される−Porsoit R.D.et al., Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Therapie,vol.229(2),pages 327-336(1977)及びCryan J.F.et al., Molecular Psychiatry,vol.9(4),pages 326-357(2004)参照。これは、ＴＳＴよりもストレスの強い試験であり、したがって、この試験の前、及びこの試験後の規則的な間隔において血液試料を採取してコルチコステロンレベルを計測した。
１．ＮＯＲ：新奇物体認識（ＮＯＲ）試験を使用して認識機能及び記憶を評価した−Bevins R.A.et al.,Nature Protocols,2016 vol.1(3),pages 1306-1311参照。
２．ＯＦ及びＥＰＭ：オープンフィールド（ＯＦ）及び高架式十字迷路（ＥＰＭ）試験を使用して不安様行動を評価した−Sweeney FF,O’Leary OF,Cryan JF, Activation but not blockade of GABAB receptors during early-life alters anxiety in adulthood in BALB/c mice. Neuropharmacology.81:303-10(2014)参照。
３．３ＣＴ：３チャンバー試験（３ＣＴ）において不安様行動及び社会性を評価した−Desbonnet L,Clarke G,Shanahan F,Dinan TG,Cryan JF, Microbiota is essential for social development in the mouse, Mol.Psychiatry.19(2):146-8(2014)参照。
４．MB:ガラス玉覆い隠し（ＭＢ）試験を使用して新奇性恐怖（新たな物品に対する恐怖）に関する行動の定量を評価した−Savignac H.M.et al., Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society,vol.26(11),pages 1615-1627(2014)参照。ＭＢ試験は、不安、強迫性行動及び常同行動の尺度でもある。
５．ＴＳＴ：尾懸垂試験（ＴＳＴ）は、潜在的抗鬱効果について化合物をスクリーニングするために広く使用される−Steru L.et al., Psychopharmacology,vol.85(3),pages 367-370(1985)参照。
６．ＦＳＴ：強制水泳試験（ＦＳＴ）も、鬱行動を計測するために使用される−Porsoit R.D.et al., Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Therapie,vol.229(2),pages 327-336(1977)及びCryan J.F.et al., Molecular Psychiatry,vol.9(4),pages 326-357(2004)参照。これは、ＴＳＴよりもストレスの強い試験であり、したがって、この試験の前、及びこの試験後の規則的な間隔において血液試料を採取してコルチコステロンレベルを計測した。
[0079] 予想外に、ADR-159食のマウスは、いくつかの上記試験においてADR-159不含食のマウスに対して行動の差、例として、社会性相互作用の増加（３ＣＴ）及び無動の増加（ＴＳＴ）を示した。さらに、精神的リードアウトは、対照マウスに対してADR-159食のマウスにおいてストレス関連ホルモンのコルチコステロンの低いベースラインレベルを示した。同時に、ADR-159食のマウスの微生物叢は変化を受け、見られた行動変化についての潜在的機序としての微生物叢組成の変更を示唆した。
[0080] ネズミ試験結果は、ストレス及び不安を有効に管理し、行動パターンを向上させ、さらにストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する状態の発症から保護し、又はそれを治療するための、例えば、配合生成物（例えば、ADR-159又はLacteol（登録商標））内の、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）又はそれらの混合物（例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB））の死滅細胞の、動物（例として、ヒト）患者への投与についての支持を提供する。
[0081] 別の態様において、本開示の組成物は、アルコール及び／又は薬物使用により引き起こされる気分障害又は社会性機能障害の発症からの保護（例として、ストレス緩和剤の使用の改善（例えば、喫煙の改善））において有用であり得る。薬物使用の症例において、障害は薬物の乱用又は治療用量における副作用のいずれかから生じ得る。
[0082] さらなる態様において、本開示の組成物は、薬物依存ヒト対象からの薬物（例えば、ニコチン）の離脱から生じるストレス及びストレス関連状態の治療において有用であり得る。
[0083] ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）又はそれらの混合物、例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の死滅細胞は、所望の効果を達成するために十分な量で本発明の組成物中に存在する。本発明の１つの例示的な実施形態において、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）株の死滅細胞は、本発明の組成物中に約１０億個以上の細胞／ｇ、例えば、約１０〜約１０００億個の細胞／ｇ、例として、約４０〜約８００億個の細胞／ｇ（例えば、約６００億個の細胞／ｇ）の比率で存在する。
[0084] 本開示の組成物は、好適な用量において経口投与することができ、それは、因子、例えば、対象の年齢、体重及び性別、治療すべき状態、並びに投与の継続期間及び投与経路により変動する。通常の技能を有する医師又は獣医師は、それぞれのヒト又は非ヒト動物患者についての本開示の医薬組成物の有効用量を容易に決定し、処方することができる。好適な剤形の本開示の医薬組成物は、患者に簡便に１日１回又は２回投与することができる。乳児又は幼児において、２０〜４０ｋｇの範囲の体重に基づき、成人の投与量のほぼ１／２を投与することができ、２０ｋｇ未満の体重に基づき、成人の投与量のほぼ１／４を投与することができる。
[0085] 例えば、標準的な医薬剤形、例えば、カプセル剤又は錠剤の本開示の組成物の簡便な単位用量は、成人ヒト患者に１日１回又は２回投与される約２０００ｍｇまでの任意の有効な用量であり得る。
[0086] 本開示の組成物は、食料若しくは栄養サプリメントとして、又は食料、例えば、ヨーグルト中で投与することもできる。この場合において、約１００ｇまでの極めて高い用量が摂取され得る。
[0087] 本開示の医薬組成物は、当業者により容易に実行することができる方法に従って薬学的に利用可能な担体及び／又は賦形剤を使用して配合し、単位最大容量で調製し、又は高投与量容器中で含有させることができる。ここで、剤形は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉末を含有するサシェ剤、又は液剤、例えば、水性媒体含有液剤、懸濁液、若しくは乳濁液であり得る。
[0088] 例えば、医薬組成物をカプセル剤として配合するため、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）又はそれらの混合物、例として、ラクトバチルスＬＢ（Lactobacillus LB）の乾燥（例えば、凍結乾燥）死滅細胞（場合により、発酵培養培地及び／又は凍結乾燥添加剤と一緒）を、１つ以上の好適な非毒性の薬学的に利用可能な不活性担体及び賦形剤と混合することができる。例としては、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、希釈剤、着色剤及び乾燥剤が挙げられる。好適な結合剤は、限定されるものではないが、天然糖、例えば、デンプン、ゼラチン、グルコース、又はベータ−ラクトース、天然又は合成ガム、例えば、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカント、又はオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、又は塩化ナトリウムであり得る。崩壊剤としては、限定されるものではないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、又はキサンタンガムが挙げられる。好適な滑沢剤としては、タルク及びステアリン酸マグネシウムが挙げられる。好適な乾燥剤としては、ケイ酸が挙げられ、好適な希釈剤としては、ラクトース、例えば、無水ラクトースが挙げられる。好適な凍結乾燥添加剤としては、ラクトース一水和物及び金属炭酸塩、例えば、炭酸カルシウムが挙げられる。生成混合物は、任意の標準的なカプセル剤外皮中に、例えば、ゼラチンカプセル中に含有させることができる。
[0089] 別の例において、経口懸濁液のための散剤の形態の本開示の医薬組成物は、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）(場合により、発酵培養培地及び／又は凍結乾燥添加剤と一緒)の乾燥（例えば、凍結乾燥）死滅細胞を、１つ以上の好適な非毒性の薬学的に利用可能な不活性担体及び賦形剤と混合することにより調製することができる。例としては、希釈剤、着香剤、甘味剤及び乾燥剤が挙げられる。好適な乾燥剤としては、ケイ酸が挙げられ、好適な希釈剤としては、ラクトース、例えば、無水ラクトース又はスクロースが挙げられ、後者は、甘味剤としても作用し得る。好適な凍結乾燥添加剤としては、ラクトース一水和物及び金属炭酸塩、例えば、炭酸カルシウムが挙げられる。粉末生成物は、飲用可能な液体と混合準備可能な任意の標準的なサシェ剤中に含有させることができる。
[0090] 経口投与のための組成物は、液体又は固体食料又は栄養製品（例えば、栄養サプリメント）の一部でもあり得る。例としては、牛乳、ヨーグルト又はヨーグルトスタイル製品、チーズ、アイスクリーム、シリアルベース製品、牛乳ベース粉末、栄養補給食、幼児用調製乳(infant formula)、栄養補給食、乾燥経口用細粒若しくは粉末、湿潤経口用ペースト若しくはゼリー、乾燥経管栄養のための細粒若しくは粉末又は湿潤経管栄養のための液状物が挙げられる。
[0091] さらに、任意選択の追加の活性成分も、本開示の組成物についての使用のために存在し得る。任意選択の活性成分としては、例えば、ビタミン、抗生物質、プロバイオティクス、プレバイオティクス、抗不安薬、抗鬱薬及び気分向上剤が挙げられる。本開示の追加の活性成分及び組成物は、同時投与し、又は個々の組成物として別個に（例えば、連続的に）投与することができる。或いは、活性成分は、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞と同一の組成物中に取り込むことができる。
[0092] 本開示の組成物との組合せにおける使用のための好適な薬物製品としては、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）；セロトニン・ノルエピネフリン再取り込み阻害剤；三環系抗鬱薬；四環系抗鬱薬；ベンゾジアゼピン；モノアミンオキシダーゼ阻害剤；オピオイド及びオピオイド様副作用を有する医薬が挙げられる。
[0093] 特定の例示的な実施形態及び具体例を参照して本開示を本明細書に記載してきたが、一方、当業者により、本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく形態及び詳細の改変をなすことができることが理解される。
実施例セクション
Ａ．材料及び方法
１．ADR-159補給マウス通常食の調製
ADR-159という符号が付された、Lacteol（登録商標）の調査用バリアントを、標準マウス通常食[2018S Teklad Global 18% Protein Rodent Diet(Envigo)]中に５％の最終濃度まで取り込んだ。
Ａ．材料及び方法
１．ADR-159補給マウス通常食の調製
ADR-159という符号が付された、Lacteol（登録商標）の調査用バリアントを、標準マウス通常食[2018S Teklad Global 18% Protein Rodent Diet(Envigo)]中に５％の最終濃度まで取り込んだ。
２．動物及び飼育条件
２４匹の８週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用した。それぞれ４匹のマウスを保持する６つのエンリッチメント充填（紙筒及び細断紙）ケージ中に動物を無作為に分割し、それらの環境に６日間にわたり馴化させた。１２匹の動物（３つのケージ）に試験全体にわたりマウス通常食[2018S Teklad Global 18% Protein Rodent Diet(Envigo)]を自由給餌し、他の１２匹の動物（３つのケージ）に試験全体にわたり、５％のADR-159を補給したマウス通常食を自由給餌した。保持部屋は、温度（２１±１℃）及び湿度（５５±１０％）制御し、１２時間の明／暗サイクル下であった。全ての実験をEuropean Directive 86/609/EEC、2007/526/65/ECの推奨に従って実施し、それはAnimal Experimentation Ethics Committee of University College Corkにより承認された。動物を毎週秤量し、１６Ｓメタゲノミクスのために糞便試料を回収した。さらに、給餌器を秤量することにより食餌消費量をモニタリングした。
２４匹の８週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用した。それぞれ４匹のマウスを保持する６つのエンリッチメント充填（紙筒及び細断紙）ケージ中に動物を無作為に分割し、それらの環境に６日間にわたり馴化させた。１２匹の動物（３つのケージ）に試験全体にわたりマウス通常食[2018S Teklad Global 18% Protein Rodent Diet(Envigo)]を自由給餌し、他の１２匹の動物（３つのケージ）に試験全体にわたり、５％のADR-159を補給したマウス通常食を自由給餌した。保持部屋は、温度（２１±１℃）及び湿度（５５±１０％）制御し、１２時間の明／暗サイクル下であった。全ての実験をEuropean Directive 86/609/EEC、2007/526/65/ECの推奨に従って実施し、それはAnimal Experimentation Ethics Committee of University College Corkにより承認された。動物を毎週秤量し、１６Ｓメタゲノミクスのために糞便試料を回収した。さらに、給餌器を秤量することにより食餌消費量をモニタリングした。
マウスに通常食又は５％のADR-159を補給した通常食を３週間給餌した後、動物を図１のプロトコルに従って行動試験のバッテリーに連続的に供した。個々の動物（又は動物のケージ）を試験前に試験部屋に３０〜６０分間馴化させ、無作為に試験してバイアスを防止した。動物への通常食又は５％のADR-159を補給した通常食の初回給餌から合計８週間後、マウスを安楽死させ、それらの体幹血液及び全脳（ドライアイス上で急速冷凍）を回収した。
Ｂ．行動試験
１．オープンフィールド／新奇物体認識（ＯＦ／ＮＯＲ）−図２参照
マウスを灰色プラスチック長方形ボックス（４０×３２×２３ｃｍ、Ｌ×Ｗ×Ｈ）の中央に薄暗がり（アリーナのレベルにおいて６０ルクス）のもと１０分間配置して新奇ストレスフル環境に対するその応答を評価し、それらの自発運動活性を計測した。これを「慣らし段階」と称する。２４時間後、同一マウスを同一ボックスの中央に配置し、このとき、２つの同一の物体（ボトル又は缶）を１０分間用いた。これを「既知段階」と称する。さらに２４時間後、同一のマウスを同一ボックス中に１０分間配置し、２つの同一の物体の１つに代えて新奇物体を用いた（それぞれのボックス中の１つのボトル及び１つの缶をもたらす）。これを「新奇段階」と称する。この実験を同時に４匹の異なるマウスを用いて並行して実施した。それぞれの段階後、マウスをそれらのホームケージに戻した。ボックス及び物体を７０％のエタノールによりクリーニングしてそれぞれの段階間のいかなる手がかりの臭いも回避した。さらなるパラメータ分析のために天井カメラを使用して実験を録画した。物体との相互作用としては、口、鼻又は肢との任意の接触が挙げられ、ストップウォッチを使用してスコアリングし、既知物体と比べた新奇物体に対する選好の割合を計算した。物体の頂部へのよじ登りは、相互作用とみなさなかった。さらに、Ethovision XTソフトウェアv 8.5(Noldus,TrackSys,Nottingham,UK)を使用して慣らし段階の間のボックス内の移動距離及び中央区域（表面の５０％）中の消費時間を計測した。
１．オープンフィールド／新奇物体認識（ＯＦ／ＮＯＲ）−図２参照
マウスを灰色プラスチック長方形ボックス（４０×３２×２３ｃｍ、Ｌ×Ｗ×Ｈ）の中央に薄暗がり（アリーナのレベルにおいて６０ルクス）のもと１０分間配置して新奇ストレスフル環境に対するその応答を評価し、それらの自発運動活性を計測した。これを「慣らし段階」と称する。２４時間後、同一マウスを同一ボックスの中央に配置し、このとき、２つの同一の物体（ボトル又は缶）を１０分間用いた。これを「既知段階」と称する。さらに２４時間後、同一のマウスを同一ボックス中に１０分間配置し、２つの同一の物体の１つに代えて新奇物体を用いた（それぞれのボックス中の１つのボトル及び１つの缶をもたらす）。これを「新奇段階」と称する。この実験を同時に４匹の異なるマウスを用いて並行して実施した。それぞれの段階後、マウスをそれらのホームケージに戻した。ボックス及び物体を７０％のエタノールによりクリーニングしてそれぞれの段階間のいかなる手がかりの臭いも回避した。さらなるパラメータ分析のために天井カメラを使用して実験を録画した。物体との相互作用としては、口、鼻又は肢との任意の接触が挙げられ、ストップウォッチを使用してスコアリングし、既知物体と比べた新奇物体に対する選好の割合を計算した。物体の頂部へのよじ登りは、相互作用とみなさなかった。さらに、Ethovision XTソフトウェアv 8.5(Noldus,TrackSys,Nottingham,UK)を使用して慣らし段階の間のボックス内の移動距離及び中央区域（表面の５０％）中の消費時間を計測した。
２．ガラス玉覆い隠し（ＭＢ）−図３参照
砂屑（５ｃｍ）が充填され、表面上に２０個のガラス玉（壁から２ｃｍ離れ、２ｃｍ離隔した規則的間隔のガラス玉の５つの列）を含有する新たなボックス（３８×２５×１８ｃｍ、Ｌ×Ｗ×Ｈ）中に、マウスを個々に配置した。３０分後、表面の２／３超が覆い隠されたガラス玉の数を記録した。覆い隠されたガラス玉の数が多ければ多いほど、不安のレベルが高いことを表す。ボックス及びガラス玉をそれぞれの実験間で７０％のエタノールによりクリーニングしていかなる手がかりの臭いも回避した。
砂屑（５ｃｍ）が充填され、表面上に２０個のガラス玉（壁から２ｃｍ離れ、２ｃｍ離隔した規則的間隔のガラス玉の５つの列）を含有する新たなボックス（３８×２５×１８ｃｍ、Ｌ×Ｗ×Ｈ）中に、マウスを個々に配置した。３０分後、表面の２／３超が覆い隠されたガラス玉の数を記録した。覆い隠されたガラス玉の数が多ければ多いほど、不安のレベルが高いことを表す。ボックス及びガラス玉をそれぞれの実験間で７０％のエタノールによりクリーニングしていかなる手がかりの臭いも回避した。
３．３チャンバー社会性試験（３ＣＴ）−図４参照
（ａ）器具
器具は、長方形の３チャンバーボックス（３６ｃｍ×１９ｃｍ）である。壁部を半円開口部（３．５ｃｍの高さ、４．５ｃｍの幅）により分割することにより、それぞれのチャンバー中にアクセスさせる。２つの同一のワイヤーカップ様ケージ（底部直径９ｃｍ及び高さ１７ｃｍ並びにバーの間隔を空けて接触させたが格闘を防止した）は、それぞれのサイドチャンバー内部に両側対称位置で存在する。
（ａ）器具
器具は、長方形の３チャンバーボックス（３６ｃｍ×１９ｃｍ）である。壁部を半円開口部（３．５ｃｍの高さ、４．５ｃｍの幅）により分割することにより、それぞれのチャンバー中にアクセスさせる。２つの同一のワイヤーカップ様ケージ（底部直径９ｃｍ及び高さ１７ｃｍ並びにバーの間隔を空けて接触させたが格闘を防止した）は、それぞれのサイドチャンバー内部に両側対称位置で存在する。
（ｂ）試験
試験は、それぞれ１０分間の３つの段階を有する：１）慣らし２）マウス対物体３）新奇マウス対既知マウス。２つのストップウォッチを使用してさらなるパラメータ分析のために天井カメラを使用して実験を録画した。第１の段階のため、試験マウスを中央チャンバー中に配置し、１０分間の慣らしセッションのためにボックス全体（内部に空の小さいワイヤーケージを有する）を探索させた。慣らし段階後、試験マウスを、短い間隔にわたり仕切りの向きを変えることにより中央セクション中に収容した一方、物体（黄色アヒル）を一方のサイドチャンバー中のメッシュケージ中に配置し、見知らぬ同種雄マウス（試験対象との事前の接触なし）を他方のサイドチャンバー中のメッシュケージ中に配置した。段階２の間、仕切りの向きを逆に変え、マウスにボックス全体を１０分間探索させた。第３の段階の間、物体（黄色のプラスチック製アヒル）を、新奇マウスとして機能する見知らぬマウスと置き換え、他方のチャンバーにおいて段階２において使用されたマウスをそのまま保持し、既知マウスとして目下機能させた。全ての試行後、全てのチャンバー及びカップ様ワイヤーケージを７０％のエタノールによりクリーニングし、乾燥させて嗅覚による手がかりのバイアスを防止し、適切な殺菌を確保した。それぞれのチャンバー中の物体又はマウスを探索した消費時間の量を評価した。左サイド対右サイドチャンバー中の見知らぬマウスの位置を、試行間で整然と交互に入れ替えた。アリーナ全体に対する慣らしの最初の１０分間の間に先天的なサイドの選好の欠落が確認された。ワイヤーケージのそれぞれとの相互作用の時間（秒）を計測し、それぞれの段階について個々に分析した。識別比（ＤＲ）をそれぞれの段階について以下のとおり計算した：
識別指数（ＤＩ）を段階のそれぞれについて計算した：
式中、Ｘ及びＹは、以下を意味する：
試験は、それぞれ１０分間の３つの段階を有する：１）慣らし２）マウス対物体３）新奇マウス対既知マウス。２つのストップウォッチを使用してさらなるパラメータ分析のために天井カメラを使用して実験を録画した。第１の段階のため、試験マウスを中央チャンバー中に配置し、１０分間の慣らしセッションのためにボックス全体（内部に空の小さいワイヤーケージを有する）を探索させた。慣らし段階後、試験マウスを、短い間隔にわたり仕切りの向きを変えることにより中央セクション中に収容した一方、物体（黄色アヒル）を一方のサイドチャンバー中のメッシュケージ中に配置し、見知らぬ同種雄マウス（試験対象との事前の接触なし）を他方のサイドチャンバー中のメッシュケージ中に配置した。段階２の間、仕切りの向きを逆に変え、マウスにボックス全体を１０分間探索させた。第３の段階の間、物体（黄色のプラスチック製アヒル）を、新奇マウスとして機能する見知らぬマウスと置き換え、他方のチャンバーにおいて段階２において使用されたマウスをそのまま保持し、既知マウスとして目下機能させた。全ての試行後、全てのチャンバー及びカップ様ワイヤーケージを７０％のエタノールによりクリーニングし、乾燥させて嗅覚による手がかりのバイアスを防止し、適切な殺菌を確保した。それぞれのチャンバー中の物体又はマウスを探索した消費時間の量を評価した。左サイド対右サイドチャンバー中の見知らぬマウスの位置を、試行間で整然と交互に入れ替えた。アリーナ全体に対する慣らしの最初の１０分間の間に先天的なサイドの選好の欠落が確認された。ワイヤーケージのそれぞれとの相互作用の時間（秒）を計測し、それぞれの段階について個々に分析した。識別比（ＤＲ）をそれぞれの段階について以下のとおり計算した：
識別指数（ＤＩ）を段階のそれぞれについて計算した：
式中、Ｘ及びＹは、以下を意味する：
さらに、Ethovision XTソフトウェアv 8.5を使用してチャンバーのそれぞれにおける消費時間並びにそれぞれの段階の間の移動速度及び距離を計測した。
４．高架式十字迷路（ＥＰＭ）−図５参照
２本のオープン（恐怖）及び２本のクローズド（安全）アーム（アーム長さ３０ｃｍ；アーム幅５ｃｍ；壁の高さ２０ｃｍ又は壁なし）を含む灰色プラスチック十字形状迷路を、床から１メートル上昇させた。実験を赤色光（約５ルクス）のもと実施した。オープンアームに面する迷路の中央にマウスを個々に配置し（クローズドアーム中への直接進入を回避するため）、自由に５分間探索させた。迷路を７０％のエタノールによりクリーニングしてそれぞれの試行間のいかなる手がかりの臭いも回避した。Ethovisionソフトウェア（8.5 version,Noldus,TrackSys,Nottingham,UK）を使用するさらなるパラメータ分析のために天井カメラを使用して実験を録画した。アーム中での消費時間、アーム中への進入回数（アーム中の進入は、アーム内部に全ての四肢が存在した場合と定義した）及びそれぞれのアームにおける潜伏時間（進入の遅れ）を、移動速度及び距離とともに計測した。
２本のオープン（恐怖）及び２本のクローズド（安全）アーム（アーム長さ３０ｃｍ；アーム幅５ｃｍ；壁の高さ２０ｃｍ又は壁なし）を含む灰色プラスチック十字形状迷路を、床から１メートル上昇させた。実験を赤色光（約５ルクス）のもと実施した。オープンアームに面する迷路の中央にマウスを個々に配置し（クローズドアーム中への直接進入を回避するため）、自由に５分間探索させた。迷路を７０％のエタノールによりクリーニングしてそれぞれの試行間のいかなる手がかりの臭いも回避した。Ethovisionソフトウェア（8.5 version,Noldus,TrackSys,Nottingham,UK）を使用するさらなるパラメータ分析のために天井カメラを使用して実験を録画した。アーム中での消費時間、アーム中への進入回数（アーム中の進入は、アーム内部に全ての四肢が存在した場合と定義した）及びそれぞれのアームにおける潜伏時間（進入の遅れ）を、移動速度及び距離とともに計測した。
５．カルミンレッド（Ｃ）
マウスを、３時間にわたり食料にも水にもアクセスさせずに個々に飼育し、その後に動物に１００〜２００μｌの非消化性カルミンレッド（０．５％のメチルセルロース中６％溶液）を強制経口投与した。強制経口投与後、マウスのそれぞれについて赤色の糞便ペレットの最初の出現まで、個々の動物を有するケージを２０分間隔においてモニタリングし（最大７時間まで）、その後にマウスをホームケージに戻した。通過時間（分）を以下のとおり計算した：
通過時間＝（最初の赤色ペレットの検出の時間）−（強制経口投与の時間）
マウスを、３時間にわたり食料にも水にもアクセスさせずに個々に飼育し、その後に動物に１００〜２００μｌの非消化性カルミンレッド（０．５％のメチルセルロース中６％溶液）を強制経口投与した。強制経口投与後、マウスのそれぞれについて赤色の糞便ペレットの最初の出現まで、個々の動物を有するケージを２０分間隔においてモニタリングし（最大７時間まで）、その後にマウスをホームケージに戻した。通過時間（分）を以下のとおり計算した：
通過時間＝（最初の赤色ペレットの検出の時間）−（強制経口投与の時間）
６．尾懸垂試験（ＴＳＴ）−図６参照
接着テープ（尾端から２ｃｍ）を使用して床から５０ｃｍ上昇させたグリッドバーにマウスを尾により取り付けた。可視分割器により隔てた２つの動物を、並行して試験に６分間供した。三脚固定数値カメラ（numeric tripod-fixed camera）を使用して実験を記録し、条件に対してブラインドの２人の実験者によってデータをさらに独立してスコアリングした（Video Media Playerソフトウェア）。無動の時間を、試験の最後の４分間の間にスコアリングした。無動は、自発又は逃避方向付け運動の不存在と定義する（毛づくろいは有動とみなした）。
接着テープ（尾端から２ｃｍ）を使用して床から５０ｃｍ上昇させたグリッドバーにマウスを尾により取り付けた。可視分割器により隔てた２つの動物を、並行して試験に６分間供した。三脚固定数値カメラ（numeric tripod-fixed camera）を使用して実験を記録し、条件に対してブラインドの２人の実験者によってデータをさらに独立してスコアリングした（Video Media Playerソフトウェア）。無動の時間を、試験の最後の４分間の間にスコアリングした。無動は、自発又は逃避方向付け運動の不存在と定義する（毛づくろいは有動とみなした）。
７．強制水泳試験（ＦＳＴ）
マウスを、１５ｃｍの深さの水（２３〜２５℃）を含有する透明ガラスシリンダ（２２ｃｍの直径×４５ｃｍの高さ）中に個々に配置した。それぞれの試験間で水を交換して臭気を除去した。試験を６分間続け、天井カメラを使用して実験を記録した。条件に対してブラインドの２人の実験者によってビデオ（Video Media Playerソフトウェア)を使用してデータをさらにスコアリングした。無動の時間及び受動的水泳の時間を、試験の最後の４分間にわたりスコアリングした。無動を運動の完全な不存在と定義する一方、受動的水泳を浮遊及び方向不定の運動（例えば、水面上で頭部を維持する動作）と定義する。
マウスを、１５ｃｍの深さの水（２３〜２５℃）を含有する透明ガラスシリンダ（２２ｃｍの直径×４５ｃｍの高さ）中に個々に配置した。それぞれの試験間で水を交換して臭気を除去した。試験を６分間続け、天井カメラを使用して実験を記録した。条件に対してブラインドの２人の実験者によってビデオ（Video Media Playerソフトウェア)を使用してデータをさらにスコアリングした。無動の時間及び受動的水泳の時間を、試験の最後の４分間にわたりスコアリングした。無動を運動の完全な不存在と定義する一方、受動的水泳を浮遊及び方向不定の運動（例えば、水面上で頭部を維持する動作）と定義する。
コルチコステロンレベルの計測のための血液試料を、それぞれの動物からＦＳＴ直前並びにＦＳＴの３０、６０、９０及び１２０分後に回収した。採血の間、マウスは拘束せず、尾端を２本の指により保持した。片刃剃刀を使用して、尾端において２〜５ｍｍの長さの斜めの切開部を作製した。約７５μｌの血液をヘパリン化ガラスキャピラリー中で回収して切開部上方の尾上への指の圧力を増加させることにより血液凝固を回避した。回収した血液を回収チューブ中に放出させ、４℃の温度において３５００×ｇにおいて１５分間遠心分離した。血漿を慎重に吸引し、−８０℃において貯蔵した。
Ｃ．分析
１．コルチコステロンアッセイ
コルチコステロンＥＬＩＳＡキット（Enzo Life Scientific）を製造業者の推奨に従って使用する単一アッセイにおいて、試料をデュプリケイトで分析した。ステロイド置換試薬（steroid displacement reagent）（ＳＤＲ）を使用してタンパク質へのステロイド結合を阻害した。ベースライン試料（Ｔ０）からの血漿（１５μｌ）を、１５μｌの１：１００のＳＤＲ試薬と混合し、インキュベートし、次いで２７０μｌのアッセイ緩衝液を添加し、１：２０の希釈物をもたらした。残りの試料を、１０μｌの血漿を１０μｌの１：１００のＳＤＲ試薬と混合することにより１：４０の比に希釈し、インキュベートし、次いで３８０μｌのアッセイ緩衝液を添加した。閾値検出は、３２ｐｇ／ｍｌ未満であった（標準曲線３２〜２０，０００ｐｇ／ｍｌ）。吸光度をマルチモードプレートリーダー（Synergy 2,BioTek Instruments,Inc.）により４０５ｎｍにおいて読み取った。結合黄色の強度は、スタンダード又は試料のいずれかのコルチコステロンの濃度に反比例する。濃度をｎｇ／ｍｌで表現する。
１．コルチコステロンアッセイ
コルチコステロンＥＬＩＳＡキット（Enzo Life Scientific）を製造業者の推奨に従って使用する単一アッセイにおいて、試料をデュプリケイトで分析した。ステロイド置換試薬（steroid displacement reagent）（ＳＤＲ）を使用してタンパク質へのステロイド結合を阻害した。ベースライン試料（Ｔ０）からの血漿（１５μｌ）を、１５μｌの１：１００のＳＤＲ試薬と混合し、インキュベートし、次いで２７０μｌのアッセイ緩衝液を添加し、１：２０の希釈物をもたらした。残りの試料を、１０μｌの血漿を１０μｌの１：１００のＳＤＲ試薬と混合することにより１：４０の比に希釈し、インキュベートし、次いで３８０μｌのアッセイ緩衝液を添加した。閾値検出は、３２ｐｇ／ｍｌ未満であった（標準曲線３２〜２０，０００ｐｇ／ｍｌ）。吸光度をマルチモードプレートリーダー（Synergy 2,BioTek Instruments,Inc.）により４０５ｎｍにおいて読み取った。結合黄色の強度は、スタンダード又は試料のいずれかのコルチコステロンの濃度に反比例する。濃度をｎｇ／ｍｌで表現する。
２．行動的及び精神的応答についての統計的分析
SPSSソフトウェア（IBM Corporation ）を使用して統計的分析を実施した。２つの平均からの標準偏差の上又は下の行動データを外れ値として分類し、統計的分析前に除外した。シャピロ・ウィルク検定に従って正規分布に従ったデータは、パラメトリック検定の独立Ｔ検定を使用して分析した。行動ノンパラメトリックデータは、ノンパラメトリックのマン・ホイットニーＵ検定又はウィルコクソンの符号順位検定を使用して分析した。体重、体重の変化及びコルチコステロンデータは、反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して分析した。統計的有意性は、ｐ＜０．０５において設定した。
SPSSソフトウェア（IBM Corporation ）を使用して統計的分析を実施した。２つの平均からの標準偏差の上又は下の行動データを外れ値として分類し、統計的分析前に除外した。シャピロ・ウィルク検定に従って正規分布に従ったデータは、パラメトリック検定の独立Ｔ検定を使用して分析した。行動ノンパラメトリックデータは、ノンパラメトリックのマン・ホイットニーＵ検定又はウィルコクソンの符号順位検定を使用して分析した。体重、体重の変化及びコルチコステロンデータは、反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して分析した。統計的有意性は、ｐ＜０．０５において設定した。
３．１６Ｓメタゲノミクス−微生物叢分析
（ａ）ＤＮＡ単離、増幅、インデックス化、正規化及びシーケンシング
糞便試料を処理まで−８０℃において貯蔵した。QIAamp Fast DNA Stool mini kit(Qiagen)を製造業者の推奨に従って使用してＤＮＡ単離を実施し、次いで品質評価のためにQubit dsDNA HS Assay Kitを使用してＤＮＡ濃度を計測し、５μｌの試料をゲル上でランした。Phusion Polymerase Master Mix及びV3-V4（フォワード5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3’;リバース5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）プライマー（９８℃ ３０秒；９８℃ １０秒、５５℃ １５秒、７２℃ ２０秒の２５サイクル；７２℃ ５分）を使用して１６Ｓ遺伝子のＶ３及びＶ４領域を増幅させた−Klindworth A,Pruesse E,Schweer T,Peplles J,Quast C,et al., Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next‐generation sequencing‐based diversity studies.Nucleic Acids Res 41(1)(2013)参照。アンプリコンを品質及び量についてQubit dsDNA HS Assay Kit及びゲル上でのランにより確認し、Ampure XP 磁気ビーズを使用してクリーニングした。５μｌのクリーニングアンプリコンを、Phusion Polymerase Master Mix及びNextera XT Index Kit（９５℃ ３０秒；９５℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒の８サイクル；７２℃ ５分）を使用するインデックスＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。Ampure XP磁気ビーズを使用してインデックス化アンプリコンをクリーニングし、品質及び量についてQubit dsDNA HS Assay Kit及びゲル上でのランにより確認した。全ての試料を４ｎＭに正規化し、次いで５μｌのそれぞれの試料を一緒にプールし、MiSeqシーケンシングのためにGTAC(Germany)に送付した。
（ａ）ＤＮＡ単離、増幅、インデックス化、正規化及びシーケンシング
糞便試料を処理まで−８０℃において貯蔵した。QIAamp Fast DNA Stool mini kit(Qiagen)を製造業者の推奨に従って使用してＤＮＡ単離を実施し、次いで品質評価のためにQubit dsDNA HS Assay Kitを使用してＤＮＡ濃度を計測し、５μｌの試料をゲル上でランした。Phusion Polymerase Master Mix及びV3-V4（フォワード5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3’;リバース5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）プライマー（９８℃ ３０秒；９８℃ １０秒、５５℃ １５秒、７２℃ ２０秒の２５サイクル；７２℃ ５分）を使用して１６Ｓ遺伝子のＶ３及びＶ４領域を増幅させた−Klindworth A,Pruesse E,Schweer T,Peplles J,Quast C,et al., Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next‐generation sequencing‐based diversity studies.Nucleic Acids Res 41(1)(2013)参照。アンプリコンを品質及び量についてQubit dsDNA HS Assay Kit及びゲル上でのランにより確認し、Ampure XP 磁気ビーズを使用してクリーニングした。５μｌのクリーニングアンプリコンを、Phusion Polymerase Master Mix及びNextera XT Index Kit（９５℃ ３０秒；９５℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒の８サイクル；７２℃ ５分）を使用するインデックスＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。Ampure XP磁気ビーズを使用してインデックス化アンプリコンをクリーニングし、品質及び量についてQubit dsDNA HS Assay Kit及びゲル上でのランにより確認した。全ての試料を４ｎＭに正規化し、次いで５μｌのそれぞれの試料を一緒にプールし、MiSeqシーケンシングのためにGTAC(Germany)に送付した。
（ｂ）バイオインフォマティクス分析
最初に、Cutadapt 1.9.1[Martin M.EMBnetjournal,2011 vol.17,pages 10-22]を使用してNexteraアダプターを除去し、Trimmomatic[Bolger AM et al.,Bioinformatics 2014 vol.30(15),pages 2114-2120]を使用して最初の５ｂｐ及び低品質塩基（２８以下のPHRED品質）をトリミングした。全てのペアFASTQファイルのマージ、予測エラー率による品質フィルタリング、シングルトンの除去、及び操作的分類単位（ＯＴＵ）への配列のクラスタリングは、UPARSE[Edgar RC.Nat Methods.2013 vol.10(10),pages 996-998]を使用して実施した。その後、Ribosomal Database Projectデータベース（RDP v.14; Cole JR et al.Nucleic Acids Res.2014 vol 42(database issue),D633-642）に基づく第２のキメラ除去は、UCHIMEアルゴリズムに従うUSEARCH v8.1[Edgar RC et al. Bioinformatics 2011 vol.27(16),pages 2194-2200を使用して実施した。１６Ｓ配列の分類学的分類は、RDP v 14に対するRDP classifier v.2.12[Wang Q et al. Applied and environmental microbiology 2007 vol.73(16),pages 5261-5267]及び種レベルについてのSPINGO[Allard G et al. BMC bioinformatics 2015 vol.16,page 324]を使用して実施した。
最初に、Cutadapt 1.9.1[Martin M.EMBnetjournal,2011 vol.17,pages 10-22]を使用してNexteraアダプターを除去し、Trimmomatic[Bolger AM et al.,Bioinformatics 2014 vol.30(15),pages 2114-2120]を使用して最初の５ｂｐ及び低品質塩基（２８以下のPHRED品質）をトリミングした。全てのペアFASTQファイルのマージ、予測エラー率による品質フィルタリング、シングルトンの除去、及び操作的分類単位（ＯＴＵ）への配列のクラスタリングは、UPARSE[Edgar RC.Nat Methods.2013 vol.10(10),pages 996-998]を使用して実施した。その後、Ribosomal Database Projectデータベース（RDP v.14; Cole JR et al.Nucleic Acids Res.2014 vol 42(database issue),D633-642）に基づく第２のキメラ除去は、UCHIMEアルゴリズムに従うUSEARCH v8.1[Edgar RC et al. Bioinformatics 2011 vol.27(16),pages 2194-2200を使用して実施した。１６Ｓ配列の分類学的分類は、RDP v 14に対するRDP classifier v.2.12[Wang Q et al. Applied and environmental microbiology 2007 vol.73(16),pages 5261-5267]及び種レベルについてのSPINGO[Allard G et al. BMC bioinformatics 2015 vol.16,page 324]を使用して実施した。
（ｃ）統計的検定
いくつかの統計的検定を実施して１週間当たりの対照及び処理間の微生物組成及び多様性を分析した。第１に、１週間当たりの対照及び処理間の微生物組成の潜在的な差を評価するため、配列の数を考慮してブレイ・カーティス非類似度を使用する主座標分析（ＰＣＯＡ）プロットを構築した。次いで、並べ替え多変量分散分析（ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ;Anderson MJ. Austral.Ecology 2001 vol.26(1),pages 32-46）を実施して１週間当たりの対照及び処理間の微生物組成の差を評価した。最大反復数を全ての分析において１，０００に設定した。ＰＥＲＭＡＮＯＶＡは位置及び分散の帰無仮説を識別しないため[Warton DI et al. Distance-based multivariate analyses confound location and dispersion effects.Methods Ecol Evol 3: 89-101(2012)]、多変量豊富度データについての一般化線形モデル[Wang Y et al.mvabund:an R package for model-based analysis on multivariate data.Methods Ecol Evol 3:471-474(2012)]を、Warton et al.[Warton DI et al.Distance-based multivariate analyses confound location and dispersion effects.Methods Ecol Evol 3:89-101(2012)]により示唆されるとおり実施した。第２に、対照に対して処理において示差的に発現された全ての種を同定するため、２つの検定を実施した：群集分析（Analysis of Communities）（ＡＮＣＯＭ; Mandal S,et al.Microbial ecology in health and disease 2015 vol.26,page 27663）を、より厳格でない補正モード（偽発見率と同等）を使用して実施し、負の二項分布（DESeq2;[Love MI et al.Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.Genome Biol 15:550(2014)]に基づく示差的発現分析をワルド検定を使用して実施した。第３に、１週間当たりの対照及び処理間の微生物多様性の潜在的な差を評価するため、シャノン指数及び逆シンプソン指数を考慮する場合にネストＡＮＯＶＡを実施した。シャノン指数は、十進数の対数を使用して計算した。第４に、経時的な微生物多様性の時間的トレンドを説明するため、マン・ケンドールトレンド検定[Mann HB.Econometrica 1945 vol.13(3),pages 245-259]を実施した。これら全ての統計的アプローチは、０．０１のアルファレベルにおいて実施したDESeq2分析を除き０．０５のアルファレベルにおいて実施し、ancom.R[Mandal S et al.Microbial ecology in health and disease 2015 vol.26,page 27663]、Kendall[Hipel K et al.Time Series Modelling of Water Resources and Environmental Systems,Elsevier 1994],)、DESeq2[Love MI et al.Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.Genome Biol 15: 550(2014)]、labdsv[Roberts D.labdsv: Ordination and Multivariate Analysis for Ecology 2016]、mvabund[Wang Y et al.mvabund: an R package for model-based analysis on multivariate data.Methods Ecol Evol 3: 471-474(2012)]、及びvegan[Oksanen J et al.vegan: community ecology package 2015]パッケージを使用してR v.3.4.1において実施した。
いくつかの統計的検定を実施して１週間当たりの対照及び処理間の微生物組成及び多様性を分析した。第１に、１週間当たりの対照及び処理間の微生物組成の潜在的な差を評価するため、配列の数を考慮してブレイ・カーティス非類似度を使用する主座標分析（ＰＣＯＡ）プロットを構築した。次いで、並べ替え多変量分散分析（ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ;Anderson MJ. Austral.Ecology 2001 vol.26(1),pages 32-46）を実施して１週間当たりの対照及び処理間の微生物組成の差を評価した。最大反復数を全ての分析において１，０００に設定した。ＰＥＲＭＡＮＯＶＡは位置及び分散の帰無仮説を識別しないため[Warton DI et al. Distance-based multivariate analyses confound location and dispersion effects.Methods Ecol Evol 3: 89-101(2012)]、多変量豊富度データについての一般化線形モデル[Wang Y et al.mvabund:an R package for model-based analysis on multivariate data.Methods Ecol Evol 3:471-474(2012)]を、Warton et al.[Warton DI et al.Distance-based multivariate analyses confound location and dispersion effects.Methods Ecol Evol 3:89-101(2012)]により示唆されるとおり実施した。第２に、対照に対して処理において示差的に発現された全ての種を同定するため、２つの検定を実施した：群集分析（Analysis of Communities）（ＡＮＣＯＭ; Mandal S,et al.Microbial ecology in health and disease 2015 vol.26,page 27663）を、より厳格でない補正モード（偽発見率と同等）を使用して実施し、負の二項分布（DESeq2;[Love MI et al.Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.Genome Biol 15:550(2014)]に基づく示差的発現分析をワルド検定を使用して実施した。第３に、１週間当たりの対照及び処理間の微生物多様性の潜在的な差を評価するため、シャノン指数及び逆シンプソン指数を考慮する場合にネストＡＮＯＶＡを実施した。シャノン指数は、十進数の対数を使用して計算した。第４に、経時的な微生物多様性の時間的トレンドを説明するため、マン・ケンドールトレンド検定[Mann HB.Econometrica 1945 vol.13(3),pages 245-259]を実施した。これら全ての統計的アプローチは、０．０１のアルファレベルにおいて実施したDESeq2分析を除き０．０５のアルファレベルにおいて実施し、ancom.R[Mandal S et al.Microbial ecology in health and disease 2015 vol.26,page 27663]、Kendall[Hipel K et al.Time Series Modelling of Water Resources and Environmental Systems,Elsevier 1994],)、DESeq2[Love MI et al.Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.Genome Biol 15: 550(2014)]、labdsv[Roberts D.labdsv: Ordination and Multivariate Analysis for Ecology 2016]、mvabund[Wang Y et al.mvabund: an R package for model-based analysis on multivariate data.Methods Ecol Evol 3: 471-474(2012)]、及びvegan[Oksanen J et al.vegan: community ecology package 2015]パッケージを使用してR v.3.4.1において実施した。
Ｄ．結果
１．オープンフィールド−図７及び８参照。
中央区域中の消費時間を、ＯＦ試験の間に対照（ｎ＝１２、平均３４．２３、ＳＤ＝１９．２６３）及びADR-159（ｎ＝１１、平均１１．１１、ＳＤ＝１２．１５５）食の動物について試験した。ADR-159群からのデータは正規分布に従わず、したがって、マン・ホイットニーＵ検定を使用し、食餌間の中央区域中の消費時間の分布が、統計的に異なることが見出された（ｐ＝０．００３）。
１．オープンフィールド−図７及び８参照。
中央区域中の消費時間を、ＯＦ試験の間に対照（ｎ＝１２、平均３４．２３、ＳＤ＝１９．２６３）及びADR-159（ｎ＝１１、平均１１．１１、ＳＤ＝１２．１５５）食の動物について試験した。ADR-159群からのデータは正規分布に従わず、したがって、マン・ホイットニーＵ検定を使用し、食餌間の中央区域中の消費時間の分布が、統計的に異なることが見出された（ｐ＝０．００３）。
移動の速度も、ＯＦ試験の間に対照（ｎ＝１２、平均５．２４、ＳＤ＝０．７８７）及びADR-159（ｎ＝１２、平均４．２７、ＳＤ＝１．５８４）食の動物について試験した。さらに、移動距離を、ＯＦ試験の間に対照（ｎ＝１１、平均１６０６．９２、ＳＤ＝１９２．８６０）及びADR-159（ｎ＝１２、平均１２７２．３４、ＳＤ＝４７３．６５６）食の動物について試験した。独立ｔ検定を、等分散性の条件に違反する正規分布データに使用し、これにより、３３４．５８ｃｍ（対照−ADR-159)の平均の距離の差が統計的に有意である（ｐ＝０．０４０、９５％の差のＣＩ［１７．５１６、６５１．６３８］）一方、０．９８ｃｍ／ｓ（対照−ADR-159）の平均の移動速度の差は統計的に有意でない（ｐ＝０．０７３、９５％の差のＣＩ［−０．１０３、２．０６０］）ことが明らかになった。
２．新奇物体認識−図９参照
新奇物体に対する選好を、対照（ｎ＝１１、平均６１．６６、ＳＤ＝５．１００）及びADR-159（ｎ＝１２、平均５８．９５、ＳＤ＝１４．４５１）食の動物において試験した。両方の群からのデータは正規分布に従い、等分散性の条件は違反された。したがって、独立ｔ検定を使用し、２．７０（対照：ADR-159）の平均の差は統計的に有意でない（ｐ＝０．５５３、９５％の差のＣＩ［−６．８４１、１２．２４３］）ことが明らかになった。
新奇物体に対する選好を、対照（ｎ＝１１、平均６１．６６、ＳＤ＝５．１００）及びADR-159（ｎ＝１２、平均５８．９５、ＳＤ＝１４．４５１）食の動物において試験した。両方の群からのデータは正規分布に従い、等分散性の条件は違反された。したがって、独立ｔ検定を使用し、２．７０（対照：ADR-159）の平均の差は統計的に有意でない（ｐ＝０．５５３、９５％の差のＣＩ［−６．８４１、１２．２４３］）ことが明らかになった。
３．ガラス玉覆い隠し−図１０参照
覆い隠されたガラス玉の数を、対照食の１２匹の動物（平均１７．１７、ＳＤ＝２．４０６）及びADR-159食の１１匹の動物（平均１７．０９、ＳＤ＝３．１１３）について試験した。ADR-159群からのデータは正規分布に従わず、したがって、マン・ホイットニーＵ検定を使用し、食餌間の覆い隠されたガラス玉の数の分布は統計的に有意でない（ｐ＝０．８３３）ことが明らかになった。
覆い隠されたガラス玉の数を、対照食の１２匹の動物（平均１７．１７、ＳＤ＝２．４０６）及びADR-159食の１１匹の動物（平均１７．０９、ＳＤ＝３．１１３）について試験した。ADR-159群からのデータは正規分布に従わず、したがって、マン・ホイットニーＵ検定を使用し、食餌間の覆い隠されたガラス玉の数の分布は統計的に有意でない（ｐ＝０．８３３）ことが明らかになった。
４．３チャンバー試験−図１１〜１４参照
物体（空のバスケット又はアヒル若しくはマウスを含有するバスケット）を有する中央チャンバー中の、又はサイドチャンバー中のそれぞれにおける消費時間に対する食餌の影響を、この試験において試験した。独立Ｔ検定を使用して正規分布データを分析した（等分散性の仮定の違反について補正が必要な場合）一方、ノンパラメトリックデータにマン・ホイットニーＵ検定を使用した。動物運動を実験段階のそれぞれの間にトレースした。
物体（空のバスケット又はアヒル若しくはマウスを含有するバスケット）を有する中央チャンバー中の、又はサイドチャンバー中のそれぞれにおける消費時間に対する食餌の影響を、この試験において試験した。独立Ｔ検定を使用して正規分布データを分析した（等分散性の仮定の違反について補正が必要な場合）一方、ノンパラメトリックデータにマン・ホイットニーＵ検定を使用した。動物運動を実験段階のそれぞれの間にトレースした。
慣らし（図１２；上段行）段階の間、対照（ｎ＝１１、平均２４５．１９、ＳＤ＝２９．５５０）又はADR-159（ｎ＝１２、平均２６３．４３、ＳＤ＝３８．０５１）食の動物についての空のチャンバー１（ｐ＝０．２１６）中の消費時間の、空のチャンバー２（ｐ＝０．２６８）（ｎ＝１２、平均２３５．４１、ＳＤ＝３８．２９７；ｎ＝１２、平均２５５．０６、ＳＤ＝４６．１１１、それぞれ）に対する有意差は存在しなかった。しかしながら、対照（ｎ＝１２、平均１１１．２０、ＳＤ＝３２．３８９）又はADR-159（ｎ＝１１、平均７７．２６、ＳＤ＝１５．１４３）食の動物間の中央区域中の消費時間の３３．９４秒の有意差（ｐ＝０．００３）が存在した。
社会性（図１２；中央行）段階の間、対照（ｎ＝１２、平均２３８．２０、ＳＤ＝１２７．６８１）又はADR-159（ｎ＝１２、平均４０８．２４、ＳＤ＝６０．５１６）食の動物についてのマウスを有するチャンバー中の消費時間の有意差（ｐ＝０．００１；平均差（ADR-159−対照）１６９．２５秒；９５％の差のＣＩ［８２．６５、２５５．８５］）が存在した。対照（ｎ＝１１、平均１３２．６２、ＳＤ＝３９．９７６）又はADR-159（ｎ＝１２、平均７３．７２、ＳＤ＝３８．６６６）食の動物についての中央チャンバー中の消費時間の有意差（ｐ＝０．００２；平均差（対照−ADR-159）５８．９０秒；９５％の差のＣＩ［２４．７９、９３．０１］）も存在した。最後に、対照（ｎ＝１２、平均２１５．０４、ＳＤ＝１０２．６５１）又はADR-159（ｎ＝１２、平均１１８．０７、ＳＤ＝４６．４７２）食の動物についてのプラスチック製アヒルを有するチャンバー中の消費時間の有意差（ｐ＝０．０２０；平均差（対照−ADR-159）９６．９７秒が存在した。
社会的新奇性（図１２；下段行）段階の間、いずれのチャンバー中の消費時間の有意差も存在しなかった。特に、対照（ｎ＝１１、平均２０６．０１、ＳＤ＝４８．４０５）及びADR-159（ｎ＝１２、平均２００．６４、ＳＤ＝７１．５９７）食の動物についての既知マウスを有するチャンバー中の消費時間（ｐ＝０．８３７；平均差（対照−ADR-159）５．３７；９５％の差のＣＩ［−４８．１４、５８．８９］）、又は中央チャンバー中の消費時間（ｐ＝０．０５２）（ｎ＝１２、平均１２３．３６、ＳＤ＝４３．２３；ｎ＝１２、平均８９．７５、ＳＤ＝４３．７０、それぞれ）。最後に、対照（ｎ＝１２、平均２５９．２７、ＳＤ＝４１．０４０）又はADR-159（ｎ＝１２、平均３０９．６５、ＳＤ＝７９．１３５）食の動物間の新奇マウスを有するチャンバー中の消費時間の有意差は存在しなかった（ｐ＝０．０６７）。
移動距離及び速度を、３ＣＴ試験において慣らしの間に対照（ｎ＝１２、平均２９３１．７４、ＳＤ＝２１７．７６０及びｎ＝１１、平均４．９７、ＳＤ＝０．２９８、それぞれ）及びADR-159（ｎ＝１１、平均３１０６．７７、ＳＤ＝２３６．０１３及びｎ＝１１、平均５．２０、ＳＤ＝０．３９６、それぞれ）食の動物について試験した。社会性段階の間、距離及び速度は、対照（ｎ＝１２、平均２４６７．４１、ＳＤ＝３３７．５１５及びｎ＝１２、平均４．１３、ＳＤ＝０．５６５、それぞれ）及びADR-159（ｎ＝１２、平均２５８５．４４、ＳＤ＝４２９．８７４及びｎ＝１２、平均４．３２、ＳＤ＝０．７２０、それぞれ）食の動物について示されるとおりであった。最後に、社会的新奇性段階の間、試験パラメータは、対照食の動物（ｎ＝１１、平均２４３５．９３、ＳＤ＝２５３．７４４及びｎ＝１１、平均４．０７、ＳＤ＝０．４２４、それぞれ）及びADR-159色の動物（ｎ＝１１、平均２５８４．５８、ＳＤ＝３７３．２８９及びｎ＝１１、平均４．３２、ＳＤ＝０．６２７、それぞれ）であった。全てのデータは正規分布に従い、等分散性の条件は違反されなかった。したがって、独立ｔ検定を使用し、対照及びADR-159食の動物間の移動距離及び速度の平均の差が統計的に有意でない（ｐ＞０．０５）ことが明らかになった。
さらに、物体（空のバスケット又はアヒル若しくはマウスを含有するバスケット）との直接相互作用に対する食餌の影響をこの試験において試験した。物体のいずれかとの総相互作用時間を慣らし、社会性及び社会的新奇性段階の間に、対照食の１２匹の対象（平均１２９．３３、ＳＤ＝３９．２４６；平均１７７．８３、ＳＤ＝７１．７３０；及び平均２２３．４２、ＳＤ＝５４．７５５、それぞれ）及びADR-159食の１２匹の対象（平均１５１．５８、ＳＤ＝２９．４３２；平均２３７．５０、ＳＤ＝３４．５０３；及び平均２４１．７５、ＳＤ＝４７．８５８、それぞれ）について試験した（図１４、グラフＡ、Ｄ及びＧ）。全てのデータは正規分布に従い、等分散性の条件は慣らし及び社会的新奇性段階について違反されなかった。したがって、独立ｔ検定を使用し、５９．６７秒の社会性段階の間の相互作用時間の平均の差（ｐ＝０．０２０、９５％の差のＣＩ［１０．９１、１０８．４２］）は、統計的に有意であることが明らかになった。しかしながら、２２．２５秒（ｐ＝０．１３０、９５％の差のＣＩ［−７．１２、５１．６２］）及び１８．３３秒（ｐ＝０．３９２、９５％の差のＣＩ［−２５．２０、６１．８７］）の慣らし及び社会的新奇性段階の間の相互作用時間の平均の差はそれぞれ、統計的に有意でなかった。
２つの物体間の識別比を、慣らし、社会性及び社会的新奇性段階の間に、対照食の動物（ｎ＝１１、平均４９．９３、ＳＤ＝４．５７９；ｎ＝１２、平均７７．７１、ＳＤ＝１２．５２５；及びｎ＝１１、平均５９．８１、ＳＤ＝９．２２４、それぞれ）及びADR-159食の１２匹の対象（平均５３．２９、ＳＤ＝４．３４１；平均８５．１０、ＳＤ＝６．０２８；及び平均５９．８１、ＳＤ＝９．２２４、それぞれ）について分析した（図１４、グラフＣ、Ｆ及びＩ）。慣らし及び社会的新奇性段階についてのデータは正規分布に従い、等分散性の条件は違反されなかった。したがって、独立ｔ検定を使用し、３．３６（ｐ＝０．０８６、９５％の差のＣＩ［−０．５１１、７．２２５］）及び０．２１（ｐ＝０．９６３、９５％の差のＣＩ［−９．１６６、９．５９２］）の慣らし及び社会的新奇性段階の間の識別比の平均の差はそれぞれ、統計的に有意でないことが明らかになった。社会性についてのデータは正規分布に従わず、したがって、マン・ホイットニーＵ検定を使用し、食餌間の識別比の分布は統計的に有意でない（ｐ＝０．１１４）ことが明らかになった。
５．高架式十字迷路−図１５及び１６参照
対照食に対するADR-159食を、１群当たり１２匹までの動物について試験した。等分散性の仮定に違反しない正規分布データを、独立Ｔ検定を使用して分析した一方、ノンパラメトリックデータにマン・ホイットニーＵ検定を使用した。クローズド（ｐ＝０．４１６）又はオープンアーム（ｐ＝０．２３７）のいずれかにおける消費時間、進入の頻度（ｐ＝０．６９５；ｐ＝０．７２４）及び進入までの潜伏時間（ｐ＝０．３１９；ｐ＝０．５１９）の差は、統計的に有意でなかった。
対照食に対するADR-159食を、１群当たり１２匹までの動物について試験した。等分散性の仮定に違反しない正規分布データを、独立Ｔ検定を使用して分析した一方、ノンパラメトリックデータにマン・ホイットニーＵ検定を使用した。クローズド（ｐ＝０．４１６）又はオープンアーム（ｐ＝０．２３７）のいずれかにおける消費時間、進入の頻度（ｐ＝０．６９５；ｐ＝０．７２４）及び進入までの潜伏時間（ｐ＝０．３１９；ｐ＝０．５１９）の差は、統計的に有意でなかった。
移動速度及び距離を、ＥＰＭの間に、対照食の１１匹の動物（平均３．５８、ＳＤ＝０．６９１及び平均１０６９．５７、ＳＤ＝２０８．８２７、それぞれ）及びADR-159食の１１匹の動物（平均３．４２、ＳＤ＝０．６９５及び平均１０２３．６１、ＳＤ＝２１１．１５７、それぞれ）について試験した。全てのデータは正規分布に従い、等分散性の条件は違反されなかった。したがって、独立ｔ検定を使用し、０．１５ｃｍ／ｓ（対照−ADR-159）の平均の速度差は、統計的に有意でない（ｐ＝０．６０７、９５％の差のＣＩ［−０．４６、０．７７］）ことが明らかになった。さらに、４５．９６ｃｍ（対照−ADR-159）の移動距離の平均の差は、統計的に有意でなかった（ｐ＝０．６１３、９５％の差のＣＩ［−１４０．８３、２３２．７４］）。
６．カルミンレッド−図１７参照
腸通過時間に対する食餌の影響を試験した。ADR-159群からのデータは正規分布に従わず、したがって、マン・ホイットニーＵ検定を使用し、対照（ｎ＝１１、平均２８３．００、ＳＤ＝６２．４９５）及びADR-159（ｎ＝１２、平均２７２．１８、ＳＤ＝７４．７３７）食の動物間の通過時間の分布は統計的に同一である（ｐ＝０．７４８）ことが見出された。
腸通過時間に対する食餌の影響を試験した。ADR-159群からのデータは正規分布に従わず、したがって、マン・ホイットニーＵ検定を使用し、対照（ｎ＝１１、平均２８３．００、ＳＤ＝６２．４９５）及びADR-159（ｎ＝１２、平均２７２．１８、ＳＤ＝７４．７３７）食の動物間の通過時間の分布は統計的に同一である（ｐ＝０．７４８）ことが見出された。
７．尾懸垂試験−図１８参照
ＴＳＴの間の無動の時間に対する食餌の影響を、対照食の１１匹の動物（平均３７．６３、ＳＤ＝２８．６０８）及びADR-159食の１１匹の動物（平均８９．１８、ＳＤ＝３３．８２８）について試験した（図１８）。両方の群からデータは正規分布に従い、等分散性の条件は違反されなかった。したがって、独立ｔ検定を使用し、５１．５５（ADR-159−対照）の平均の差は統計的に有意である（ｐ＝０．００１、９５％の差のＣＩ［２３．６８２、７９．４１０］）ことが明らかになった。
ＴＳＴの間の無動の時間に対する食餌の影響を、対照食の１１匹の動物（平均３７．６３、ＳＤ＝２８．６０８）及びADR-159食の１１匹の動物（平均８９．１８、ＳＤ＝３３．８２８）について試験した（図１８）。両方の群からデータは正規分布に従い、等分散性の条件は違反されなかった。したがって、独立ｔ検定を使用し、５１．５５（ADR-159−対照）の平均の差は統計的に有意である（ｐ＝０．００１、９５％の差のＣＩ［２３．６８２、７９．４１０］）ことが明らかになった。
８．強制水泳試験−図１９参照
ＦＳＴの間の受動的水泳の時間に対する食餌の影響を、対照（ｎ＝１１、平均１１８．８６、ＳＤ＝４５．９９４）及びADR-159（ｎ＝１１、平均１３６．５７、ＳＤ＝４７．６０７）食の動物について試験した。両方の群からデータは正規分布に従い、等分散性の条件は違反されなかった。したがって、独立ｔ検定を使用し、17.71（ADR-159−対照）の平均の差は、統計的に有意でなかった（ｐ＝０．３６４、９５％の差のＣＩ［−２１．９２、５７．３４］）。
ＦＳＴの間の受動的水泳の時間に対する食餌の影響を、対照（ｎ＝１１、平均１１８．８６、ＳＤ＝４５．９９４）及びADR-159（ｎ＝１１、平均１３６．５７、ＳＤ＝４７．６０７）食の動物について試験した。両方の群からデータは正規分布に従い、等分散性の条件は違反されなかった。したがって、独立ｔ検定を使用し、17.71（ADR-159−対照）の平均の差は、統計的に有意でなかった（ｐ＝０．３６４、９５％の差のＣＩ［−２１．９２、５７．３４］）。
９．コルチコステロンレベル−図２０参照
ベースラインコルチコステロンレベルを、ＦＳＴ前に対照（ｎ＝１１、平均１６．１０、ＳＤ＝１３．８５５）及びADR-159（ｎ＝１０、平均４．３３、ＳＤ＝４．４６９）食の動物において試験した。両方の群からのデータは正規分布に従い、等分散性の条件は違反された。したがって、独立ｔ検定を使用し、１１．７７（対照−ADR-159）の平均の差は、統計的に有意であることが示された（ｐ＝０．０２０、９５％の差のＣＩ［２．１８、２１．３６］）。
ベースラインコルチコステロンレベルを、ＦＳＴ前に対照（ｎ＝１１、平均１６．１０、ＳＤ＝１３．８５５）及びADR-159（ｎ＝１０、平均４．３３、ＳＤ＝４．４６９）食の動物において試験した。両方の群からのデータは正規分布に従い、等分散性の条件は違反された。したがって、独立ｔ検定を使用し、１１．７７（対照−ADR-159）の平均の差は、統計的に有意であることが示された（ｐ＝０．０２０、９５％の差のＣＩ［２．１８、２１．３６］）。
ＦＳＴ後、経時的なコルチコステロンレベルの変化に対する食餌の影響を試験した。対照食の１１匹の対象及びADR-159食の１０匹の対象についての反復測定ＡＮＯＶＡは、統計的に有意な差を明らかにせず、処理間でｐ＝０．２３０ Ｆ＝１．５３７であった。
１０．微生物叢分析−図２１〜２４参照
ネズミ微生物叢に対する食餌の影響を、対照及びADR-159食の動物について試験した。フィルミテクス門（Firmicutes）、バクテロイデス門（Bacteroidetes）及びウェルコミクロビウム門（Verrucomicrobia）が、対照及びADR-159食の両方の動物の糞便中の３つの最も豊富に表される門であった。属レベルにおいて、全ての動物の微生物叢は、未分類ポルフィロモナス科（Porphyromonadaceae）及び未分類ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）により支配された（図２１）。まとめると、属レベルの微生物組成は、対照及びADR-159食の動物間で同等であった。アリスティペス属（Alistipes）及びオドリバクター属（Odoribacter）の相対豊富度中央値は対照食の動物と比較してADR-159の動物において一貫して低減した一方、プレボテラ属（Prevotella）は増加した。
ネズミ微生物叢に対する食餌の影響を、対照及びADR-159食の動物について試験した。フィルミテクス門（Firmicutes）、バクテロイデス門（Bacteroidetes）及びウェルコミクロビウム門（Verrucomicrobia）が、対照及びADR-159食の両方の動物の糞便中の３つの最も豊富に表される門であった。属レベルにおいて、全ての動物の微生物叢は、未分類ポルフィロモナス科（Porphyromonadaceae）及び未分類ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）により支配された（図２１）。まとめると、属レベルの微生物組成は、対照及びADR-159食の動物間で同等であった。アリスティペス属（Alistipes）及びオドリバクター属（Odoribacter）の相対豊富度中央値は対照食の動物と比較してADR-159の動物において一貫して低減した一方、プレボテラ属（Prevotella）は増加した。
個体間の微生物叢多様性を主座標分析（ＰＣｏＡ）プロットにより可視化し、ＰＥＲＭＡＮＯＶＡにより分析した。ＰＣｏＡプロットにより、対照及びADR-159食の動物の微生物叢の明確な時間関連分離が明らかになった（図２２）。食餌区別の前、全ての動物の微生物叢は同等であり、密接にクラスター形成した一方、食餌の８週間後、ADR-159食の動物の微生物叢は、対照微生物叢から明確に分離された。
次に、対照及びADR-159食の動物間の相対豊富度の変化をＯＴＵレベルにおいて分析し（図２３、２４）、２２９個のＯＴＵが少なくとも１つの時点において示差的に豊富であった（図２４。食餌介入の長期効果に重点を置くため、本発明者らは、実験の５〜８週間の期間の豊富度変化を示す４１個のＯＴＵを特に調査した（最後の３つの時点の少なくとも２つにおいて変化を示したそれらのＯＵＴのみを含む）（図２３）。興味深いことに、未分類ポルフィロモナス科（Porphyromonadaceae）及び未分類ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）に属するＯＴＵの一部は、ADR-159動物における増加した豊富度を示した一方、同一の分類群からの他のＯＴＵは、低減した豊富度を示した。
Ｅ．考察
組成１６Ｓシーケンシングにより、マウス食餌におけるADR-159の包含が、微生物叢の組成及び動物行動の態様の両方に対する有意な効果を有することが裏付けられる。本発明者らは、これが、このような同時効果を実証する最初の研究であると考える。結果は、腸−脳軸に対する熱不活化細菌及びその代謝産物の影響に関する潜在的に新規の機序的洞察を提供する。
組成１６Ｓシーケンシングにより、マウス食餌におけるADR-159の包含が、微生物叢の組成及び動物行動の態様の両方に対する有意な効果を有することが裏付けられる。本発明者らは、これが、このような同時効果を実証する最初の研究であると考える。結果は、腸−脳軸に対する熱不活化細菌及びその代謝産物の影響に関する潜在的に新規の機序的洞察を提供する。
Claims (28)
- ヒト又は非ヒト動物対象においてサイコバイオティック効果を産生するための使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞を含む組成物。
- 前記サイコバイオティック効果が、前記ヒト又は非ヒト動物の腸内微生物叢の組成及び／又は多様性を変化させることにより達成される、請求項１に記載の組成物。
- 前記サイコバイオティック効果が、前記ヒト又は非ヒト動物の腸中に存在するアリスティペス属（Alistipes）及び／又はオドリバクター属（Odoribacter）種の量を改変する（例えば、低減させる）ことにより達成される、請求項１又は２に記載の組成物。
- 前記サイコバイオティック効果が、行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する状態の発症からヒト又は非ヒト動物対象を保護する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
- ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する状態の発症からヒト又は非ヒト動物対象を保護することにおける使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞を含む組成物。
- 不安、鬱病、気分障害、社会性が機能不全である状態、自閉症、自閉スペクトラム症、過敏性腸症候群、心的外傷後ストレス障害、慢性ストレス及び一連の他のストレス関連疾患から選択される状態の発症からヒト又は非ヒト動物対象を保護することにおける使用のための、請求項５に記載の組成物。
- 前記対象が、健常ヒト又は健常非ヒト動物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- ヒト又は非ヒト動物対象において不安、ストレス又はストレス関連状態を治療することにおける使用のための、有効量のラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞を含む組成物。
- 前記ストレス又はストレス関連状態が、薬物依存ヒト対象からの薬物（例えば、ニコチン）の離脱の結果である、請求項８に記載の使用のための組成物。
- 非ヒト動物対象においてコルチコステロイドレベルを低減することにおける使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞を含む組成物。
- ヒト動物対象においてコルチコステロイドレベルを低減することにおける使用のための、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞を含む組成物。
- ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞、ラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞及び培養培地の混合物を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及びラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞が、前記混合物中に約９：１の重量比で存在する、請求項１２に記載の使用のための組成物。
- 前記混合物は、乾燥（例えば、凍結乾燥）されている、請求項１２又は１３に記載の使用のための組成物。
- 有効量のLacteol（登録商標）を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 医薬組成物、食料サプリメント、又は栄養サプリメントの形態である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記食料サプリメント又は栄養サプリメントが、牛乳、ヨーグルト又はヨーグルトスタイル製品、チーズ、アイスクリーム、シリアルベース製品、牛乳ベース粉末、幼児用調製乳、栄養補給食、乾燥経口用細粒若しくは粉末、湿潤経口用ペースト若しくはゼリー、乾燥経管栄養のための細粒若しくは粉末又は湿潤経管栄養のための液状物から選択される食料品内に含まれる、請求項１６に記載の使用のための組成物。
- １つ以上の賦形剤（例えば、ラクトース）を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
- ストレス又は不安により引き起こされるか又は悪化する行動的、精神的及び／又は身体的構成要素を有する状態の発症からヒト又は非ヒト動物対象を保護する方法であって、前記対象に、有効量のラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞を投与することを含む方法。
- 前記ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞を、精神安定又は精神刺激効果を産生するために十分な量で投与する、請求項１９に記載の方法。
- 前記状態が、不安、鬱病、気分障害、社会性が機能不全である状態、自閉症、自閉スペクトラム症、過敏性腸症候群、心的外傷後ストレス障害、慢性ストレス及び一連の他のストレス関連疾患から選択される、請求項１９又は２０に記載の方法。
- 前記対象が、健常ヒト又は健常非ヒト動物である、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト又は非ヒト動物対象において不安、ストレス又はストレス関連状態を治療する方法であって、前記対象に、有効量のラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及び／又はラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞を投与することを含む方法。
- 前記ストレス又はストレス関連状態が、薬物依存ヒト対象からの薬物（例えば、ニコチン）の離脱の結果である、請求項２３に記載の方法。
- ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞、ラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞、及び培養培地の混合物を投与することを含む、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の死滅細胞及びラクトバチルス・デルブリッキイ（Lactobacillus delbrueckii）の死滅細胞が、前記混合物中に約９：１の重量比で存在する、請求項２５に記載の方法。
- 前記混合物は、乾燥（例えば、凍結乾燥）されいる、請求項２５又は２６に記載の方法。
- 有効量のLacteol（登録商標）を投与することを含む、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の方法。
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