JP2021516210A - フムルス植物の変種およびその抽出物 - Google Patents

Abstract

本発明は、その葉および花房に高いカンナビノイドレベルを有するフムルス植物に関する。本発明はまた、このフムルス植物の抽出物、フムルス植物抽出物を含む組成物、およびこれらの組成物を用いる処置方法に関する。

Description

本願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2018年3月12日に出願された米国仮特許出願番号62/641,778の恩典を主張する。

発明の分野
本発明は、その葉および花房に高いカンナビノイドレベルを有するフムルス植物に関する。本発明はまた、このフムルス植物の抽出物、フムルス植物抽出物を含む組成物、およびこれらの組成物を用いる処置方法に関する。

発明の背景
カンナビジオール（CBD）は、大麻において同定される多くの活性カンナビノイドの1つである。それは、主要な植物性カンナビノイドであり、この植物の抽出物の最大40％を占める。当初、不活性なカンナビノイドとみなされていたが、現在では、CBDが、テトラヒドロカンナビノール（THC）よりも広範囲の薬理学的特性を有し、かつ向精神作用を有さないことが広く理解されている。例えば、CBDは、炎症および神経性疼痛を抑制し（Xiong et al., "Cannabinoids Suppress Inflammatory and Neuropathic Pain by Targeting alpha3 Glycine Receptors," J. Exp. Med. 209(6): 1121-1134(2012)（非特許文献1））、不安およびストレスを軽減し（Crippa et al., "Neural Basis of Anxiolytic Effects of Cannabidiol (CBD) in Generalized Social Anxiety Disorder: A Preliminary Report," J. Psychopharmacol. 25(1): 121-130(2011)（非特許文献2）; Hill et al., "Endogenous Cannabinoid Signaling is Essential for Stress Adaption," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 107(20): 9406-11(2010)（非特許文献3））、鎮吐特性（Sharkey et al., "Regulation of Nausea and Vomiting by Cannabinoids and the Endocannabinoid System," Eur. J. Pharmacol. 722: 134-46(2014)（非特許文献4））、抗けいれん特性（Karler and Turkanis, "The Cannabinoids as Potential Antiepileptics," J. Clin. Pharmacol. 21(8-9 Suppl): 437S-448S(1981)（非特許文献5））、抗精神病特性（Schubart et al., "Cannabidiol as a Potential Treatment for Psychosis," Eur. Neuropsychopharmacol. 24(1): 51-64(2014)（非特許文献6））、抗炎症特性（Burstein and Zurier, "Cannabinoids, Endocannabinoids, and Related Analogs in Inflammation," AAPS J. 11(1): 109-19(2009)（非特許文献7））、抗腫瘍特性（Massi et al., "Cannabidiol as Potential Anticancer Drug," Br. J. Clin. Pharmacol. 75(2): 303-12(2013)（非特許文献8））、抗不安特性（Schier et al., "Cannabidiol, a Cannabis sativa Constituent, as an Anxiolytic Drug," Rev. Bras Psiquiatr. 34(Suppl 1): S104-10(2012)（非特許文献9））および抗うつ特性（Zanelati et al., "Antidepressant-like Effects of Cannabidiol in Mice: Possible Involvement of 5-HT1A Receptors," Br. J. Pharmacol. 159(1): 122-28(2010)（非特許文献10））を有する。CBDはまた、強力な抗菌活性を示す（Klingeren and Ten Ham, "Antibacterial Activity of Delta9-tetrahydrocannabinol and Cannabidiol," Antonie Van Leeuwenhoek 42(1-2): 9-12(1976)（非特許文献11）およびAppendino et al., "Antibacterial Cannabinoids from Cannabis sativa: A Structure-Activity Study," J. Nat. Prod. 71(8): 1427-30(2008)（非特許文献12））。

CBDの薬理学的能力を広く調査するためには、高純度のカンナビジオール調製物を、簡単で、比較的安価で、かつ大規模化が可能な方法を用いて入手できることが必須である。しかし、CBDの主要な供給源は、大麻植物であり、抽出方法は、CBDに選択的でなく、得られる抽出物はしばしば、有意なおよび限定的な量の向精神性カンナビノイド、例えばTHCを含んでいる。

合成形態のカンナビジオールも入手可能であるが、これらの形態は高価であり、かつ天然植物由来形態のCBDの生物活性を欠いている。したがって、THCのような向精神性カンナビノイドを含まない、生物活性を有するCBD、すなわち天然CBDの供給源を提供することが、当技術分野で求められている。

本発明は、この課題および当技術分野の他の課題を克服するものである。

Xiong et al., "Cannabinoids Suppress Inflammatory and Neuropathic Pain by Targeting alpha3 Glycine Receptors," J. Exp. Med. 209(6): 1121-1134(2012) Crippa et al., "Neural Basis of Anxiolytic Effects of Cannabidiol (CBD) in Generalized Social Anxiety Disorder: A Preliminary Report," J. Psychopharmacol. 25(1): 121-130(2011) Hill et al., "Endogenous Cannabinoid Signaling is Essential for Stress Adaption," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 107(20): 9406-11(2010) Sharkey et al., "Regulation of Nausea and Vomiting by Cannabinoids and the Endocannabinoid System," Eur. J. Pharmacol. 722: 134-46(2014) Karler and Turkanis, "The Cannabinoids as Potential Antiepileptics," J. Clin. Pharmacol. 21(8-9 Suppl): 437S-448S(1981) Schubart et al., "Cannabidiol as a Potential Treatment for Psychosis," Eur. Neuropsychopharmacol. 24(1): 51-64(2014) Burstein and Zurier, "Cannabinoids, Endocannabinoids, and Related Analogs in Inflammation," AAPS J. 11(1): 109-19(2009) Massi et al., "Cannabidiol as Potential Anticancer Drug," Br. J. Clin. Pharmacol. 75(2): 303-12(2013) Schier et al., "Cannabidiol, a Cannabis sativa Constituent, as an Anxiolytic Drug," Rev. Bras Psiquiatr. 34(Suppl 1): S104-10(2012) Zanelati et al., "Antidepressant-like Effects of Cannabidiol in Mice: Possible Involvement of 5-HT1A Receptors," Br. J. Pharmacol. 159(1): 122-28(2010) Klingeren and Ten Ham, "Antibacterial Activity of Delta9-tetrahydrocannabinol and Cannabidiol," Antonie Van Leeuwenhoek 42(1-2): 9-12(1976) Appendino et al., "Antibacterial Cannabinoids from Cannabis sativa: A Structure-Activity Study," J. Nat. Prod. 71(8): 1427-30(2008)

本発明の1つの局面は、その花房において少なくとも75 mg/g（乾燥重量）のカンナビノイド濃度を有するフムルス植物に関する。

本発明の別の局面は、本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物に関する。

本発明の別の局面は、濃縮されたレベルのフムレン、β-カリオフィレンおよびカンナビジオールを含むフムルス植物抽出物に関する。

本発明の別の局面は、フムルス植物抽出物を含む組成物に関する。この組成物は、フムレン、β-カリオフィレンおよびカンナビジオールを含む。

本発明の別の局面は、対象においてエンドカンナビノイド系の活性を調整する方法に関する。この方法は、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象を選択する工程、および選択された対象に、該対象においてエンドカンナビノイド系の活性を調整するのに有効な量の、本明細書に記載されるフムルス植物抽出物またはフムルス植物抽出物を含む組成物を投与する工程を含む。

2017年7月にインドのウーティにおいて温室内で成長させたフムルス・クリヤ（Humulus Kriya）植物の写真である。 フムルス・ユンナネンシス・バー・クリヤ（Humulus yunnanensis var kriya）の葉を示す。 図3A〜3Bは、異なる段階のフムルス・ユンナネンシス・バー・クリヤの花房の写真である。図3Aは、中期栄養成長段階の「クリヤ」花房の画像である。 図3A〜3Bは、異なる段階のフムルス・ユンナネンシス・バー・クリヤの花房の写真である。図3Bは、後期生殖成長段階の「クリヤ」花房の画像である。 VIC細胞の石灰化の減少を示している。5つすべてのmg濃度で、より高い生物活性のカンナビジオール（CBD）に曝露されたときに石灰化の減少がより大きかった。分散は、減少率が.5に近づくほど増加した。 VIC細胞の石灰化の減少を示している。生物活性が非常に低いとき、濃度は無視できる程度の一貫のない差を生じた（上グラフ参照）。生物活性が非常に高いとき、より高い濃度で石灰化の減少がより大きかった（下グラフ参照）。 CBD、β-カリオフィレンおよびフムレンを含む組成物であるImmunAGを用いたVIC細胞の処置が、すべての用量で、CBD単独処置よりも有意に大きく石灰化を減少させることを示している。 図7A〜7Bは、シスプラチン単独処置後の腫瘍サイズの変化を示している。図7Aは、シスプラチン単独処置における初期腫瘍サイズを示している。サンプルサイズ、n：172、平均：4.85116、中央値：4.83、ミッドレンジ：4.74、RMS：4.872、分散、s^2：0.2038、標準偏差、s：0.45145、平均絶対偏差：0.37177、レンジ：2.4200000000000004、変動係数：9.30593％、最小：3.53、第一四分位：4.53、第二四分位：4.83、第三四分位：5.175、最大：5.95、和：834.4、二乗和：4082.6606、平均の95％CI：4.78322＜平均＜4.91911、標準偏差の95％CI：0.40825＜SD＜0.50495、分散の95％CI：0.16667＜VAR＜0.25497。図7Bは、シスプラチン単独処置における最終腫瘍サイズを示している。サンプルサイズ、n：172、平均：5.65946、中央値：5.596、ミッドレンジ：5.567、RMS：5.86443、分散、s^2：2.37592、標準偏差、s：1.5414、平均絶対偏差：1.32113、レンジ：6.408000000000001、変動係数：27.23585％、最小：2.363、第一四分位：4.38、第二四分位：5.596、第三四分位：6.9065、最大：8.771、和：973.427、二乗和：5915.35269、平均の95％CI：5.42746＜平均＜5.89146、標準偏差の95％CI：1.39391＜SD＜1.72407、分散の95％CI：1.94299＜VAR＜2.97242。 図8A〜8Bは、シスプラチンおよびアジュバント処置としてのImmunAGの併用処置後の腫瘍サイズの変化を示している。図8Aは、シスプラチンとアジュバント処置としてのImmunAGにおける初期腫瘍サイズを示している。サンプルサイズ、n：138、平均：4.88587、中央値：4.855、ミッドレンジ：5.06、RMS：4.90409、分散、s^2：0.17971、標準偏差、s：0.42393、平均絶対偏差：0.33102、レンジ：2.18、変動係数：8.67658％、最小：3.97、第一四分位：4.62、第二四分位：4.855、第三四分位：5.11、最大：6.15、和：674.25、二乗和：3318.9183、平均の95％CI：4.81451＜平均＜4.95723、標準偏差の95％CI：0.37912＜SD＜0.48083、分散の95％CI：0.14373＜VAR＜0.2312。図8Bは、シスプラチンとアジュバント処置としてのImmunAGにおける最終腫瘍サイズを示している。サンプルサイズ、n：138、平均：4.64362、中央値：4.615、ミッドレンジ：4.745、RMS：4.69632、分散、s^2：0.49575、標準偏差、s：0.70409、平均絶対偏差：0.57823、レンジ：3.09、変動係数：15.16258％、最小：3.2、第一四分位：4.09、第二四分位：4.615、第三四分位：5.14、最大：6.29、和：640.82、二乗和：3043.644、平均の95％CI：4.5251＜平均＜4.76214、標準偏差の95％CI：0.62968＜SD＜0.79861、分散の95％CI：0.3965＜VAR＜0.63778。 図9A〜9Bは、ImmunAGの投与前および投与後の癌患者のPET走査の画像である。図9Aは、ImmunAG投与前の、2016年3月2日の患者のPET走査を示している。明るい白色の領域は、転移癌である。 図9A〜9Bは、ImmunAGの投与前および投与後の癌患者のPET走査の画像である。図9Bは、2016年4月11日の患者のPET走査を示しており、転移癌の95％がImmunAG投与後39日以内に消失したことを示している。

発明の詳細な説明
本発明は、その花房、葉および他の組織に高濃度のカンナビノイドを有するよう交配されたフムルス植物に関する。本発明のこの局面にしたがい、本明細書に記載されるフムルス植物の組織のカンナビノイドレベル、特にカンナビジオールレベルは、自然界で見い出されるいかなる対応するフムルス植物のカンナビノイドレベルよりも有意に高い。

フムルスは、アサ科の顕花植物の属である。最も一般的なフムルスは、「ビールホップ」の香りの植物であるフムルス・ルプルス（Humulus lupulus）である。フムルスの2つの他の種は、日本固有の、フムルス・ジャポニカス（Humulus japonicus）としても公知の、フムルス・スカデンス（Humulus scadens）、およびネパール、インドおよび中国国境のヒマラヤ山脈路に固有の、フムルス・ユンナネンシス（Humulus yunnanensis）である。本明細書に記載されるように、カンナビジオールは、主としてアサ科の別のメンバーである大麻において見い出される多様なクラスの化合物群である。しかし、フムルス・ルプルスまたはフムルス・ジャポニカスにおけるカンナビノイドの存在は、報告されていなかった。インドのマイソールにあるCentral Food Technology Research Institute of Indiaからの1つの報告のみが、インド、ウーティのハダムンド・ショラ（Hadamund Shola）のフムルス植物においてカンナビジオールおよびカンナビジバリンを含む微量のカンナビノイドが見い出されたことを示唆している。実施例1により詳細に記載されるように、インド近辺由来のフムルス・ユンナネンシス植物の調査は、H.ユンナネンシス集団のわずかな割合（約5％）において低レベルのカンナビノイド（約2.0 mg/g乾燥重量）を見い出した。したがって、その花房において1グラム乾燥重量あたり＞50ミリグラムのカンナビノイドおよびその葉において1グラム乾燥重量あたり＞15ミリグラムのカンナビノイドであるカンナビノイドレベルを有するよう選択的に交配された本発明者らのフムルス植物は、いかなる公知の天然に存在するフムルス植物とも明確に相違する。

本明細書に記載されるフムルス植物は、任意のフムルス種、例えばフムルス・ユンナネンシス、フムルス・ジャポニカスまたはフムルス・ルプルスの変種、およびそれらの任意の変異種（例えば、フムルス・ルプルス・バー・ルプルス；H.ルプルス・バー・コーディフォリウス（H. lupulus var. cordifolius）、H.ルプルス・バー・ルプロイデス（H. lupulus var. lupuloides）、H.ルプルス・バー・ネオメキシカヌス（H. lupulus var. neomexicanus）、H.ルプルス・バー・プべセンス（H. lupulus var. pubescens））であり得る。1つの態様において、本明細書に記載されるフムルス植物は、フムルス・ユンナネンシスの変異種である。本発明の例示的なフムルス植物は、本明細書の実施例1に記載されるフムルス・ユンナネンシス・バー・クリヤである。

「カンナビノイド」という用語は、当業者によって理解されているように、細胞のカンナビノイド受容体に対する活性を示し、多様な範囲の他の薬理学的特性も有する、多様な化合物およびそれらの誘導体のクラスを包含する。少なくとも113の異なるカンナビノイドが、大麻植物から単離されている。大麻におけるカンナビノイドおよびカンナビノイド産物の非限定的な例は、カンナビジオール（CBD）、カンナビゲロール（CBG）、カンナビクロメン（CBC）、カンナビエルソイン（CBE）、カンナビシクロール（CBL）、カンナビノール（CBN）、カンナビシトラン（CBT）、テトラヒドロカンナビバリン（THCV）、カンナビバリン（CBV）、カンナビジバリン（CBDV）、カンナビクロメバリン（CBCV）、カンナビゲロバリン（CBGV）、カンナビゲロールモノメチルエーテル（CBGM）、テトラヒドロカンナビジオールまたはΔ⁹-テトラヒドロカンナビジオール（THC）、イソ-テトラヒドロカンナビノール（iso-THC）、11-ヒドロキシ-Δ⁹-テトラヒドロカンナビノール（11-OH-Δ⁹-THCまたは11-OH-THC）、ナビロンおよび他のカンナビノイドアナログを含む。

本発明の目的上、本明細書に記載されるフムルス植物およびそれ由来の抽出物に関する「カンナビノイド」、「カンナビノイド群」および「カンナビノイドレベル」という言及は、THC、iso-THC、11-OH-Δ⁹-THC、11-OH-THCまたは向精神特性を有するそれらの任意の異性体、誘導体もしくはアナログを明示的に除外する。特に、本明細書に記載されるフムルス植物およびその抽出物は、THC、iso-THC、11-OH-Δ⁹-THC、11-OH-THCまたは向精神特性を有するそれらの任意の異性体、誘導体もしくはアナログを含まない。

1つの態様において、本明細書に記載されるフムルス植物およびその抽出物の「カンナビノイドレベル」は、カンナビジオール（CBD）、カンナビゲロール（CBG）、カンナビクロメン（CBC）、カンナビエルソイン（CBE）およびカンナビジバリン（CBDV）からなる群より選択される1つまたは複数のカンナビノイドから構成される。1つの態様において、本明細書に記載されるフムルス植物に存在する主要なカンナビノイドは、CBDである。

カンナビジオールまたはCBDは、様々な細胞受容体との相互作用を通じて多様な薬理学的活性を示す。カンナビジオールは、主としてカンナビノイド2型（CB₂）受容体の逆アゴニストまたは部分アゴニストとして作用する。CBDはまた、推定カンナビノイド受容体である、Gタンパク質共役受容体55（GPR55）のアンタゴニストである。CBDはまた、5-HT1A受容体アンタゴニストとして、およびμおよびδオピオイド受容体部位におけるアロステリック調節因子として作用することが示されている。

CBDには様々な異性体および立体異性体が存在するが、本発明のフムルス植物ならびにその抽出物および組成物において見い出される、CBDの、排他的ではないが主要な形態は、2-(6-イソプロペニル-3-メチル-2-シクロヘキセン-1-イル)-5-ペンチル-1,3-ベンゼンジオールである。この形態のCBDは、天然にのみ存在するCBDの形態であり、そのため、最高レベルの生物活性を有するCBDの形態である。CBDは、非限定的に、炎症および神経性疼痛の抑制ならびに不安、ストレス、うつの軽減を含む、多様な作用を示すことが知られている。CBDはまた、鎮吐、抗けいれん、抗精神病、抗炎症、抗腫瘍および抗菌剤として知られている。

カンナビゲロールは、高い親和性のα2アドレナリン受容体アゴニスト、中程度の親和性の5-HT1A受容体アンタゴニスト、および低い親和性のCB₁受容体アンタゴニストとして作用することが見い出されている。カンナビゲロールは、CB₂受容体にも結合する。カンナビゲロールは、眼圧を軽減することが示されており、これは緑内障の処置において有益であり得る（Craig et al., "Intraocular Pressure, Ocular Toxicity and Neurotoxicity After Administration of Cannabinol or Cannabigerol" Exp. Eye Research 39(3): 251-259（1984、その全体が参照により本明細書に組み入れられる））。カンナビゲロールはまた、うつを軽減し、気分障害の処置に有用であることが示されている（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、MustyおよびDeyoの米国特許第8,481,085号）。

カンナビクロメンは、特にテトラヒドロカンナビノール、テトラヒドロカンナビバリン、カンナビジオールおよびカンナビノールを含む他の天然カンナビノイドに対する構造類似性を有している。CBCは、抗炎症および抗ウイルス特性を有し、鎮痛作用を示すと考えられている。

カンナビジバリン（CBDV）は、その側鎖が2つのメチレン架橋（CH₂単位）により短くなった、CBDの非向精神性ホモログである。CBDVは、てんかんの動物モデルにおいて発作の数および重篤度を減少させることが見い出されている（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Whalleyらの米国特許第9,125,859号）。

CBEは、CBDの代謝産物である（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Yamamoto et al., "Cannabielsoin as a New Metabolite of Cannabidiol in Mammals," Pharmacol. Biochem. Behav. 40(3): 541-6 (1991)）。CBEの薬理学的活性についてはほとんど知られていない。

本明細書に記載されるフムルス植物は、その花房および葉に高いカンナビノイドレベルを含む。1つの態様において、本明細書に記載されるフムルス植物は、凍結乾燥された花房1グラムあたり少なくとも50ミリグラム（mg/g乾燥重量）のカンナビノイドを含む。別の態様において、本明細書に記載されるフムルス植物は、少なくとも55 mg/g、少なくとも60 mg/g、少なくとも65 mg/g、少なくとも70 mg/g、少なくとも75 mg/g、少なくとも80 mg/g、少なくとも85 mg/g、少なくとも90 mg/g、少なくとも95 mg/g、少なくとも100 mg/g、少なくとも105 mg/g、少なくとも110 mg/g、および少なくとも115 mg/g、少なくとも120 mg/g、少なくとも125 mg/g、少なくとも130 mg/g、少なくとも135 mg/g、少なくとも140 mg/g、少なくとも145 mg/g花房乾燥重量のカンナビノイドレベルを有する。別の態様において、本明細書に記載されるフムルス植物の花房は、凍結乾燥組織1グラムあたり＞145 mgのカンナビノイドを含む。上記のように、カンナビノイド成分は、主にCBD、CBE、CBDV、CBGおよびCBCから構成され、CBDが主要なカンナビノイドである。

1つの態様において、本明細書に記載されるフムルス植物はさらに、その葉に高いカンナビノイドレベルを含む。1つの態様において、本明細書に記載されるフムルス植物は、凍結乾燥された葉物質1グラムあたり少なくとも15ミリグラム（mg/g乾燥重量）のカンナビノイドを含む。別の態様において、本明細書に記載されるフムルス植物は、少なくとも20 mg/g、少なくとも25 mg/g、少なくとも30 mg/g、少なくとも35 mg/g、少なくとも40 mg/g、少なくとも45 mg/g、少なくとも50 mg/g、少なくとも55 mg/g、少なくとも60 mg/g、少なくとも65 mg/g、少なくとも70 mg/g、少なくとも75 mg/g、少なくとも80 mg/g、少なくとも85 mg/g葉乾燥重量のカンナビノイドレベルを有する。別の態様において、本明細書に記載されるフムルス植物の葉は、凍結乾燥組織1グラムあたり＞85 mgのカンナビノイドを含む。

本明細書に記載されるフムルス植物はまた、その花房および葉に高いβ-カリオフィレンレベルを含む。1つの態様において、本明細書に記載されるフムルス植物は、凍結乾燥された花房1グラムあたり少なくとも20ミリグラム（mg/g乾燥重量）のβ-カリオフィレンを含む。別の態様において、本明細書に記載されるフムルス植物は、少なくとも25 mg/g、少なくとも30 mg/g、少なくとも35 mg/g、少なくとも40 mg/g、少なくとも45 mg/g、少なくとも50 mg/g、少なくとも55 mg/g、少なくとも60 mg/g、少なくとも65 mg/g、少なくとも70 mg/g、少なくとも75 mg/g、少なくとも80 mg/g、少なくとも85 mg/g、少なくとも90 mg/g、少なくとも95 mg/g、少なくとも100 mg/g、少なくとも105 mg/g、少なくとも110 mg/g、少なくとも120 mg/g花房乾燥重量のβ-カリオフィレンレベルを有する。別の態様において、本明細書に記載されるフムルス植物の花房は、凍結乾燥組織1グラムあたり＞120 mgのβ-カリオフィレンを含む。

1つの態様において、本明細書に記載されるフムルス植物はさらに、その葉に高いβ-カリオフィレンレベルを含む。1つの態様において、本明細書に記載されるフムルス植物は、凍結乾燥された葉物質1グラムあたり少なくとも5ミリグラム（mg/g乾燥重量）のβ-カリオフィレンを含む。別の態様において、本明細書に記載されるフムルス植物は、少なくとも10 mg/g、少なくとも15 mg/g、少なくとも20 mg/g、少なくとも25 mg/g、少なくとも30 mg/g、少なくとも35 mg/g、少なくとも40 mg/g葉物質乾燥重量のβ-カリオフィレンレベルを有する。別の態様において、本明細書に記載されるフムルス植物の葉は、凍結乾燥組織1グラムあたり＞40ミリグラムのβ-カリオフィレンを含む。

本発明はまた、単離されたフムルス植物成分、フムルス植物抽出物ならびにこれらのフムルス成分および抽出物を含む組成物を包含する。したがって、本発明の別の局面は、本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物に関する。この局面にしたがい、抽出物は、フムルス植物の1つまたは複数の組織由来、例えば、非限定的に、花房、葉、茎、樹皮、根、茎頂またはそれらの任意の組み合わせの1つまたは複数由来の抽出物である。1つの態様において、抽出物は、本明細書に記載されるフムルス植物の花房由来の抽出物である。そのような抽出物は好ましくは後期栄養または初期開花段階で植物の花房から取得されるが、本明細書に記載される抽出物は、その成長サイクルの任意の期間の花房および任意の他の植物組織から取得され得る。

植物物質から関心対象のカンナビノイドおよび他の化合物を抽出する方法は、当技術分野で周知であり、本発明のフムルス植物からの関心対象のカンナビノイドおよび他の化合物の抽出に適用することができる、例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられるMartinezらのWO2016153347、Muellerの米国特許第8,895,078号、Whittlebandの米国特許第7,344,736号およびFlockhartの米国特許第7,700,368号を参照のこと。フムルス植物物質からカンナビノイドおよび他の化合物を抽出するこれらの方法を、本明細書に記載されるフムルス植物抽出物を得るために利用することができる。

1つの態様において、本明細書に記載されるフムルス植物抽出物は、カンナビジオール（CBD）を含む。上記のように、CBDは、非限定的に、炎症および神経性疼痛の抑制ならびに不安、ストレス、うつの軽減を含む多様な作用を示す。CBDはまた、鎮吐、抗けいれん、抗精神病、抗炎症、抗腫瘍および抗菌剤であることが知られている。

別の態様において、本明細書に記載されるフムルス植物抽出物は、β-カリオフィレンを含む。β-カリオフィレンは、多くの植物のエッセンシャルオイルにおいて見い出される天然二環式セスキテルペンである。それは、カンナビノイド受容体2型の選択的アゴニストであることおよび生物学的活性、例えば抗炎症、抗生、抗酸化、抗発癌および局所麻酔活性を示すことが知られている。

別の態様において、本明細書に記載されるフムルス植物抽出物は、フムレンを含む。α-フムレンまたはα-カリオフィレンとしても公知のフムレンは、天然に存在する単環式セスキテルペンである。フムレンは、フムルス・ルプルスを含む、多くの芳香植物において見い出され、その「ホップ」様の芳香について知られている。しかし、フムレンはまた、生物学的活性、例えば抗炎症、抗菌および抗癌活性を有することも知られている。

別の態様において、本明細書に記載されるフムルス植物抽出物は、CBD、β-カリオフィレンおよび／またはフムレンの組み合わせを含む。別の態様において、フムルス植物抽出物は、6-プレニルナリンゲニン、8-プレニルナリンゲニン、アドフムロン、アドルプロン、カンナビクロメン、カンナビジバリン、カンナビゲロール、ファルネセン、フムロン、イソキサントフモール、ルプロン、キサントフモールまたはそれらの任意の組み合わせを含む本明細書に記載されるフムルス植物の1つまたは複数の他の化合物と組み合わせて、CBD、β-カリオフィレンおよび／またはフムレンの1つまたは複数を含む。1つの態様において、フムルス植物抽出物は、フムレン、CBD、β-カリオフィレン、6-プレニルナリンゲニン、8-プレニルナリンゲニン、アドフムロン、アドルプロン、カンナビクロメン、カンナビジバリン、カンナビゲロール、ファルネセン、フムロン、イソキサントフモール、ルプロンおよびキサントフモールを含む。本明細書の実施例2は、本発明のフムルス植物抽出物から構成される例示的な組成物を提供する。

本発明の別の態様は、CBD、β-カリオフィレンおよび／またはフムレン、ならびに以下の化合物：6-プレニルナリンゲニン、8-プレニルナリンゲニン、アドフムロン、アドルプロン、カンナビクロメン、カンナビジバリン、カンナビゲロール、ファルネセン、フムロン、イソキサントフモール、ルプロンおよびキサントフモールの1つまたは複数を含む組成物に関する。別の態様において、本発明の組成物は、フムレン、CBD、β-カリオフィレン、6-プレニルナリンゲニン、8-プレニルナリンゲニン、アドフムロン、アドルプロン、カンナビクロメン、カンナビジバリン、カンナビゲロール、ファルネセン、フムロン、イソキサントフモール、ルプロンおよびキサントフモールを含む。1つの態様において、組成物は、約9％のフムレン、約12％のCBD、約14％のβ-カリオフィレン、約6％の6-プレニルナリンゲニン、約4％の8-プレニルナリンゲニン、約5％のアドフムロン、約6％のアドルプロン、約5％のカンナビクロメン、約2％のカンナビジバリン、約2％のカンナビゲロール、約5％のファルネセン、約9％のフムロン、約6％のイソキサントフモール、約8％のルプロンおよび約7％のキサントフモールを含むまたはから本質的になる。この組成物は、本発明のすべての他の組成物と同様、テトラヒドロカンナビノール酸（THCA）、テトラヒドロカンナビノール（THC）または向精神特性を有するそれらの任意の異性体もしくは誘導体を含まない。

本発明の別の態様において、フムルス植物抽出物のフムレン、β-カリオフィレンおよびカンナビジオール成分は、これら3つの成分を含む実質的に純粋な調製物を提供するよう単離または精製される。任意の特定のフムルス植物物質および／または抽出物の正確な含量および純度は、当業者に周知の分析技術、例えば薄層クロマトグラフィー（TLC）または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて定性的および定量的に決定され得る。

本明細書で参照される場合、「実質的に純粋」な調製物は、本明細書において、そのHPLCプロフィールによって定義される場合、90％を超える、好ましくは95％を超える、好ましくは96％を超える、より好ましくは97％を超える、より好ましくは98％を超える、より好ましくは99％を超える、最も好ましくは99.5％を超えるクロマトグラフィー純度を有するカンナビジオール、フムレンおよびβ-カリオフィレンの調製物と定義される。

本発明のこの局面にしたがい、精製されたフムルス植物抽出物は、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％または＞90％のカンナビジオール含量、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％または＞90％のβ-カリオフィレン含量、および0.5％、1％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％、10.0％、11.0％、12.0％、13.0％、14.0％、15.0％、16.0％、17.0％、18.0％、19.0％、20.0％、21.0％、22.0％、23.0％、24.0％、25.0％または＞25％フムレンのフムレン含量を含む。

本発明のこの局面にしたがい、精製されたフムルス抽出物は、5％〜90％のカンナビジオール、5％〜90％のβ-カリオフィレンおよび1％〜10％のフムレンを含む。別の態様において、精製されたフムルス抽出物は、20％〜70％のカンナビジオール、30％〜80％のβ-カリオフィレンおよび1％〜8％のフムレンを含む。別の態様において、精製されたフムルス抽出物は、25％〜55％のカンナビジオール、45％〜75％のβ-カリオフィレンおよび1％〜5％のフムレンを含む。別の態様において、精製されたフムルス抽出物は、30％〜45％のカンナビジオール、50％〜70％のβ-カリオフィレンおよび1％〜5％のフムレンを含む。別の態様において、精製されたフムルス抽出物は、38.5％のカンナビジオール、60％のβ-カリオフィレンおよび1.5％のフムレンを含む。別の態様において、精製されたフムルス抽出物は、38.5％のカンナビジオール、60％のβ-カリオフィレンおよび1.5％のフムレンから本質的になる。

本発明のさらに別の局面は、上記のようなフムレン、β-カリオフィレンおよびカンナビジオールを含む組成物に関する。この組成物は、THCA、THCまたは向精神特性を有するそれらのいかなる異性体も誘導体も含まない。

本発明の別の局面は、上記の任意のフムルス植物抽出物を含む薬学的組成物、栄養補助組成物および化粧品組成物に関する。これらの組成物の製剤およびそれらの使用方法は、以下に記載されている。

本明細書に記載される組成物は、それを必要とするヒトおよび／または動物対象への投与用に製剤化され得る。そのような製剤は、薬学的製剤、栄養補助製剤および化粧品製剤を含む。当業者に理解されているように、「薬学的製剤」という用語は、治療目的でヒトまたは動物に投与するために設計された組成物、典型的には、ある状態またはその状態の症状の処置および／または予防のためにヒトまたは動物に投与するために設計された組成物を表す。「栄養補助製剤」は、栄養、食事または健康目的でヒトおよび／または動物対象に投与するために設計された組成物である。「化粧品製剤」という用語は、身体表面を洗浄する、整えるまたはその完全性および外見を保護する目的で、外部から、例えばヒトまたは動物の身体の皮膚、爪または毛髪に適用される組成物を表す。

本発明の様々な製剤は、本明細書に記載されるフムルス植物抽出物を重量で10％(wt)、20％、25％、35％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％または＞90％含み得る。

一般に、本発明のフムルス植物抽出物および組成物は、1つまたは複数の生理学的に許容される賦形剤を含む製剤として投与される。「賦形剤」という用語は、本明細書で使用される場合、フムルス植物抽出物またはその組成物以外の任意の成分を表す。特に、賦形剤は、必ずそうということではないが、通常、有効成分、例えばCBD、β-カリオフィレンおよびフムレンの投与をさらに容易にするために製剤に添加される不活性物質である。賦形剤は、当技術分野で周知であり、様々な製剤において使用されている。一般的な賦形剤は、希釈剤、例えばラクトース、デキストリン、グルコース、スクロース、ソルビトール、シリケート、カルシウムおよびマグネシウム塩、塩化ナトリウムまたはカリウム；結合剤、圧縮補助剤（compression aids）および造粒剤、例えば天然または合成ポリマー（例えば、デンプン、糖、糖アルコールおよびセルロース誘導体）；崩壊剤、例えばデンプン、セルロース誘導体およびアルギネート；流動促進剤、例えばコロイド無水ケイ素および他のシリカ化合物；滑沢剤、例えばステアリン酸およびその塩；錠剤コーティングおよびフィルム、例えば糖およびポリマー；着色剤および色素を含む。賦形剤の選択は、大部分が、個々の投与様式、溶解性および安定性に対する賦形剤の影響、ならびに剤形の性質に依存する。

1つの態様において、製剤は、生理学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせてフムルス植物抽出物を含む。適当な薬学的に許容される担体は、油、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、白灰、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、植物ステアリン酸（vegetable stearate）、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、水和塩（hydration salt）、グリセロール、プロピレングリコール等を含む。1つの態様において、担体は油である。1つの態様において、油担体は、ココナツ油である。

本明細書に記載されるフムルス抽出物および組成物の送達に適した製剤ならびにそれらの調製方法は、当業者に直ちに明らかとなるであろう。そのような組成物およびそれらの調製方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 22nd ed. (Pharmaceutical Press, 2013)において見い出され得る。製剤は、個々の投与経路に最適化される。適当な投与経路は、非限定的に、経口投与；局所投与；経皮投与；眼内投与；経粘膜投与、特に経鼻、気管支、肺、口腔、舌下、直腸および膣；筋内、皮下および髄内注射ならびにくも膜下、直接心室内、静脈内および腹腔内注射を含む非経口投与を含む。

1つの態様において、本明細書に記載される製剤は、経皮投与に適したものである。経皮投与可能な製剤は、腹、背、胸、脚、腕、手、足、関節、頭皮、耳裏、首、顎または他の適当な皮膚表面へのおよび／またはそれらの周囲への投与に適合され得、フムルス抽出物およびそれを含む組成物がパッチ、軟膏、クリーム、懸濁物、ローション、ペースト、ジェル、スプレー、フォームまたはオイルで投与される製剤を含み得る。

1つの態様において、本明細書に記載される製剤は、局所投与に適したものである。局所投与可能な製剤は、腹、背、胸、脚、腕、手、足、関節、頭皮、耳裏、首、顎または他の適当な皮膚表面へのおよび／またはそれらの周囲への投与に適合され得、フムルス抽出物およびそれを含む組成物がパッチ、軟膏、クリーム、懸濁物、ローション、ペースト、ジェル、スプレー、フォームまたはオイルで投与される製剤を含み得る。1つの態様において、製剤は、水中油乳濁物である。別の態様において、製剤は、油中油ブレンドである。別の態様において、製剤は、油中水乳濁物である。

1つの態様において、本明細書に記載される局所製剤は、化粧品への適用が意図されている。そのような化粧品製剤は、シャンプー、ローション、クリーム、保湿液、ジェル、日焼け止め、化粧品、洗浄液、石鹸、フォーム、オイル、ペースト、スプレーおよびパッチを含み得る。

別の態様において、本明細書に記載される製剤は、経口投与に適したものである。経口投与可能な本明細書に記載される組成物は、フムルス抽出物およびその組成物が錠剤、カプセル、懸濁物、シロップもしくは液体、粉末、顆粒またはオイルで投与される製剤を含む。別の態様において、製剤は、長期放出、持続放出、長期間作用性錠剤もしくはカプセルとして製剤化され得る。持続放出錠剤の製造方法は、当技術分野で公知である；例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み入られる、Rastogiの米国特許公報第2006/0051416号およびDedhiyaの米国特許公報第2007/0065512号を参照のこと。段階放出錠剤もまた、当技術分野で公知であり、そのような錠剤の例は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Hotkoの米国特許第3,456,049号に示されている。緩慢または持続放出形態は、組成物またはその1つもしくは複数の成分の崩壊または吸収を遅らせ得る。

経口投与に適した組成物、例えば錠剤、カプセル等は、1 mg、1.5 mg、2 mg、2.5 mg、3 mg、3.5 mg、4 mg、4.5 mg、5 mg、5.5 mg、6 mg、6.5 mg、7 mg、7.5 mg、8 mg、8.5 mg、9 mg、9.5 mg、10 mg、11 mg、12 mg、13 mg、14 mg、15 mg、16 mg、17 mg、18 mg、19 mg、20 mg、21 mg、22 mg、23 mg、24 mg、25 mg、26 mg、27 mg、28 mg、29 mg、30 mg、31 mg、32 mg、33 mg、34 mg、35 mg、36 mg、37 mg、38 mg、39 mg、40 mg、41 mg、42 mg、43 mg、44 mg、45 mg、46 mg、47 mg、48 mg、49 mg、50 mg、51 mg、52 mg、53 mg、54 mg、55 mg、56 mg、57 mg、58 mg、59 mg、60 mg、61 mg、62 mg、63 mg、64 mg、65 mg、66 mg、67 mg、68 mg、69 mg、70 mg、71 mg、72 mg、73 mg、74 mg、75 mg、76 mg、77 mg、78 mg、79 mg、80 mg、81 mg、82 mg、83 mg、84 mg、85 mg、86 mg、87 mg、88 mg、89 mg、90 mg、91 mg、92 mg、93 mg、94 mg、95 mg、96 mg、97 mg、98 mg、99 mg、100 mg、または＞100 mgから独立して選択される濃度のカンナビジオール、β-カリオフィレンおよびフムレンを含む。1つの態様において、経口製剤は、0.5〜3.0 mgのフムレン、1.0〜5.0 mgのβ-カリオフィレンおよび7.5〜100 mgのカンナビジオールを含む。1つの態様において、経口製剤は、1.5 mgのフムレン、3 mgのβ-カリオフィレンおよび7.5 mgのカンナビジオールを含む。別の態様において、経口製剤は、1.5 mgのフムレン、3 mgのβ-カリオフィレンおよび40 mgのカンナビジオールを含む。別の態様において、経口製剤は、1.5 mgのフムレン、3 mgのβ-カリオフィレンおよび100 mgのカンナビジオールを含む。

1つの態様において、経口製剤は、カプセルである。カプセルは、担体油中に本明細書に記載される植物抽出物を含む。担体は、任意の食品等級の油であり得る。1つの態様において、担体油は、ココナツ油である。この態様にしたがい、カプセルは、7.5 mgのカンナビジオール（12.5 mg/カプセルの総カンナビノイド）、40 mgのカンナビジオール（67 mg/カプセルの総カンナビノイド）、または100 mgのカンナビジオール（167 mg/カプセルの総カンナビノイド）を含む。カプセルはさらに、1.5 mgのフムレンおよび／または3 mgのβ-カリオフィレンを含み得る。1つの態様において、カプセルは、1.5 mgのフムレンおよび3 mgのβ-カリオフィレンと共にカンナビジオール（7.5 mg、40 mgまたは100 mg）を含む。

別の態様において、経口製剤は、錠剤である。1つの態様において、錠剤は、徐放性錠剤製剤である。この態様にしたがい、錠剤は、7.5 mgのカンナビジオール（12.5 mg/錠剤の総カンナビノイド）、40 mgのカンナビジオール（67 mg/錠剤の総カンナビノイド）、または100 mgのカンナビジオール（167 mg/錠剤の総カンナビノイド）を含む。錠剤はさらに、1.5 mgのフムレンおよび／または3 mgのβ-カリオフィレンを含み得る。1つの態様において、錠剤は、1.5 mgのフムレンおよび3 mgのβ-カリオフィレンと共にカンナビジオール（7.5 mg、40 mgまたは100 mg）を含む。

1つの態様において、本明細書に記載される製剤は、口腔投与に適したものである。口腔投与可能な本明細書に記載される製剤は、フムルス抽出物および組成物がロゼンジ、スプレー、ジェル、ペースト、溶解性錠剤または溶解性ストリップで投与される製剤を含み得る。別の態様において、本明細書に記載される製剤は、舌下投与に適したものである。本明細書に記載される舌下製剤は、フムルス抽出物および組成物がロゼンジ、スプレー、ジェル、ペースト、溶解性錠剤または溶解性ストリップで投与される製剤を含み得る。

1つの態様において、本明細書に記載される製剤は、注射投与に適したものである。注射投与に適した本明細書に記載される製剤は、フムルス抽出物および組成物が静脈内、くも膜下、皮下または蓄積注射として投与される製剤を含み得る。

1つの態様において、本明細書に記載される製剤は、気管支および肺投与に適したものである。肺投与に適した本明細書に記載される製剤は、フムルス抽出物および組成物がエアゾール、加圧噴霧、乾燥粉末の吸引または揮発性液体への溶解として投与される製剤を含み得る。

1つの態様において、本明細書に記載される製剤は、直腸投与に適したものである。直腸投与可能な本明細書に記載される製剤は、フムルス抽出物および組成物が坐剤、軟膏、クリーム、懸濁物、溶液、ローション、ペースト、ジェル、スプレー、フォームまたはオイルで適用される製剤を含み得る。

1つの態様において、本明細書に記載される製剤は、膣投与に適したものである。膣投与可能な本明細書に記載される製剤は、フムルス抽出物および組成物が坐剤、軟膏、クリーム、懸濁物、溶液、ローション、ペースト、ジェル、スプレー、フォームまたはオイルで適用される製剤を含み得る。

1つの態様において、本明細書に記載される製剤は、眼内投与に適したものである。眼内投与可能な本明細書に記載される製剤は、フムルス抽出物および組成物が軟膏、懸濁物、溶液、ジェルまたはスプレーで適用される製剤を含み得る。

1つの態様において、本明細書に記載される製剤は、経鼻投与に適したものである。経鼻投与可能な本明細書に記載される製剤は、フムルス抽出物および組成物が軟膏、懸濁物、溶液、ローション、ペースト、ジェル、スプレーまたはミストで適用される製剤を含み得る。

それを必要とする対象への投与に適した製剤、例えば経皮、局所、粘膜、眼内、経鼻製剤は、1 mg、1.5 mg、2 mg、2.5 mg、3 mg、3.5 mg、4 mg、4.5 mg、5 mg、5.5 mg、6 mg、6.5 mg、7 mg、7.5 mg、8 mg、8.5 mg、9 mg、9.5 mg、10 mg、11 mg、12 mg、13 mg、14 mg、15 mg、16 mg、17 mg、18 mg、19 mg、20 mg、21 mg、22 mg、23 mg、24 mg、25 mg、26 mg、27 mg、28 mg、29 mg、30 mg、31 mg、32 mg、33 mg、34 mg、35 mg、36 mg、37 mg、38 mg、39 mg、40 mg、41 mg、42 mg、43 mg、44 mg、45 mg、46 mg、47 mg、48 mg、49 mg、50 mg、51 mg、52 mg、53 mg、54 mg、55 mg、56 mg、57 mg、58 mg、59 mg、60 mg、61 mg、62 mg、63 mg、64 mg、65 mg、66 mg、67 mg、68 mg、69 mg、70 mg、71 mg、72 mg、73 mg、74 mg、75 mg、76 mg、77 mg、78 mg、79 mg、80 mg、81 mg、82 mg、83 mg、84 mg、85 mg、86 mg、87 mg、88 mg、89 mg、90 mg、91 mg、92 mg、93 mg、94 mg、95 mg、96 mg、97 mg、98 mg、99 mg、100 mg、または＞100 mgから独立して選択される濃度のカンナビジオール、β-カリオフィレンおよびフムレンを含む。

本発明のさらなる局面は、それを必要とするヒトまたは動物対象に、本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物を投与する工程を含む、それを必要とするヒトまたは動物対象の治療的および／または非治療的処置方法に関する。

1つの態様において、フムルス植物抽出物およびそれを含む組成物は、対象の免疫系機能、心血管の健康、腎臓系の健康、神経系の健康、内分泌系の健康、消化系の健康、血管の健康等を促進または増強する目的で、食事および／または健康サプリメントとして対象によって利用される。1つの態様において、フムルス植物抽出物およびそれを含む組成物は、身体のホメオスタシスを全体的に促進するために利用される。

別の態様において、本発明は、対象においてGタンパク質共役受容体活性を調整する方法に関する。この方法は、Gタンパク質共役受容体活性の調整を必要とする対象を選択する工程、および選択された対象に、対象においてGタンパク質共役受容体（GPCR）活性を調整するのに有効な量で、本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物を投与する工程を含む。

CBDは、GPCR活性を直接的に、およびGPCRのリガンドおよび酵素の調整を通じて間接的に、調整することが知られている。したがって、本明細書に記載されるフムルス植物抽出物またはそれを含む組成物の投与は、脂肪酸アミドヒドロラーゼの活性を阻害または阻止するため、アナンダミド再取込阻害因子をアンタゴナイズするため、GPR55をアンタゴナイズするため、TRPM8をアンタゴナイズするため、アデノシン再取り込みをアンタゴナイズするために投与され得る。フムルス植物抽出物またはそれを含む組成物はまた、Mオピオイド受容体（逆アゴニスト）、α1およびα1βグリセリン受容体（アゴニスト）、CB2（アゴニストまたは逆アゴニスト）、TRPA1（アゴニスト）、TRPV1（アゴニスト）、TRPV2（アゴニスト）、PPAR-ガンマ（アゴニスト）、5HT1A（アゴニスト）、T型Ca⁺²チャネル（阻害因子）、5-リポキシゲナーゼ（阻害因子）、15-リポキシゲナーぜ（阻害因子）、ホスホリパーゼA2、CXCL8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11、CXCL10、アンギオテンシンII受容体（アゴニスト）、ソマトスタチン受容体1〜5（逆アゴニスト）、ガラニン受容体（部分アゴニスト）、システニルロイコトリエン受容体1および2（アゴニスト）、ロイコトリエンB4受容体1および2（部分アンタゴニスト）、リラクシン／インスリン様ファミリーペプチド受容体1、2、3、4（アゴニスト）、KiSS1由来ペプチド受容体（GPR54）（逆アゴニスト）、メラニン濃縮ホルモン受容体1（逆アゴニスト）、ウロテンシンII受容体（アゴニスト）、ACTH受容体（再取込阻害因子）、リゾホスファチジン酸受容体1、2、3（阻害因子）、スフィンゴシン1-リン酸受容体1、2、3、4、5（再取込阻害因子）、メラノコルチン/ACTH受容体1、2、3、4、5（部分アゴニスト）、アドレナリン受容体（アゴニスト）ならびにヒスタミンH1受容体（HRH1、HRH3、HRH4）（逆アゴニスト）の活性を調整するためにも投与され得る。

別の態様において、本発明は、対象においてエンドカンナビノイド系の活性を調整する方法に関する。この方法は、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象を選択する工程、および選択された対象に、対象においてエンドカンナビノイド系の活性を調整するのに有効な量で、本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物を投与する工程を含む。

本発明のこの局面にしたがい、本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、対象においてエンドカンナビノイド系の活性を増加させる。1つの態様において、本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物は、カンナビノイド2型受容体（CB₂受容体）の活性を調整する。1つの態様において、本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物は、CB₂受容体の活性を増加させる。

1つの態様において、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象は、ストレス、不安、睡眠障害、気分障害、てんかんもしくは他の発作性障害、統合失調症、自閉症および／またはうつに罹患している対象である。本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、上記状態の1つもしくは複数の症状を軽減もしくは緩和する、該状態の重篤度を低下させる、および／または該状態を全体的に緩和する。

1つの態様において、てんかんまたは他の発作性障害を有する患者への本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、てんかん現象の頻度を減少させ、いくつかの例においては、てんかん現象を完全に停止させる。

別の態様において、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象は、慢性疼痛、偏頭痛または神経症に罹患している対象である。本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、慢性疼痛、偏頭痛もしくは神経症の1つもしくは複数の症状を軽減もしくは緩和する、該状態の重篤度を低下させる、および／または該状態を全体的に緩和する。

別の態様において、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象は、開口障害または顎関節疾患に罹患している対象であり、本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、該状態の1つもしくは複数の症状を軽減もしくは緩和する、該状態の重篤度を低下させる、および／または該状態を全体的に緩和する。

別の態様において、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象は、嗜癖または拒食症に罹患している対象である。本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、上記状態の1つもしくは複数の症状を軽減もしくは緩和する、該状態の重篤度を低下させる、および／または該状態を全体的に緩和する。

別の態様において、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象は、炎症状態に罹患している対象である。本発明の抽出物または組成物を用いた処置に適した炎症状態は、慢性および急性炎症状態を含む。処置される例示的な炎症状態は、非限定的に、過敏性腸症候群、関節炎（関節リウマチおよび乾癬性関節炎を含む）、喘息、クローン病、大腸炎、痔（痔核）、虚血／再灌流損傷を含む。本明細書に記載される抽出物および組成物を用いて処置され得る他の炎症状態は、アテローム性動脈硬化症、乾癬、多発性硬化症、紅斑性狼瘡、I型糖尿病、原発性胆汁性肝硬変症、炎症性腸疾患、結核、皮膚創傷および感染、組織膿瘍、毛嚢炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、敗血症性関節炎、心筋炎、心内膜炎、毒素性ショック症候群、アレルギー性接触皮膚炎、急性過敏症、急性神経学的炎症性傷害、結膜炎、虹彩炎、ブドウ膜炎、中心性網膜炎、外耳炎、急性化膿性中耳炎、乳様突起炎、内耳炎、慢性鼻炎、急性鼻炎、静脈洞炎、咽頭炎、扁桃炎、接触性皮膚炎、皮膚壊死、糖尿病性多発神経炎、多発筋炎、骨化性筋炎、関節周囲炎および変形性骨炎を含む。本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、上記炎症状態の1つもしくは複数の症状を軽減もしくは緩和する、該状態の重篤度を低下させる、および／または該状態を全体的に緩和する。

1つの態様において、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象は、喘息に罹患している対象である。喘息を有する患者への本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、喘息の症状を好転させ、呼吸を改善する。

別の態様において、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象は、糖尿病に罹患している対象であり、本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、糖尿病の1つもしくは複数の症状を軽減もしくは緩和し、該状態の重篤度を低下させ、および／または該状態を全体的に緩和する。

別の態様において、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象は、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病またはハンチントン病に罹患している対象である。本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、上記神経変性疾患の1つもしくは複数の症状を軽減もしくは緩和し、該疾患の重篤度を低下させ、および／または該疾患を全体的に緩和する。1つの態様において、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病を有する患者への本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、変性を好転させ、認識力テストのスコアを改善する。

別の態様において、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象は、癌に罹患している対象である。本明細書に記載される抽出物およびそれを含む組成物を用いて処置され得る癌は、非限定的に、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、AIDS関連肉腫、AIDS関連リンパ腫および癌、虫垂癌、星状細胞腫（小児小脳または大脳）、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨腫瘍、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳癌、脳腫瘍、上皮腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視路・視床下部神経膠腫、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（小児）、カルチノイド腫瘍（胃腸）、原発不明癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、小児癌、軟骨肉腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、類上皮血管内皮腫（EHE）、食道癌、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（GIST）、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、脳幹の神経膠腫、胃カルチノイド、有毛細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、島細胞癌（膵臓内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓癌（腎細胞癌）、喉頭癌、口唇・口腔癌、脂肪肉腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫、AIDS関連リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、男性乳癌、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、口腔癌、多発性内分泌腺腫症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖疾患、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖障害、粘液腫、鼻腔・副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、乏突起神経膠腫、口腔癌、口腔咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体ジャーミノーマ、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腺腫、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、中枢神経系原発リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚癌（非黒色腫）、小腸癌、扁平上皮癌、原発不明扁平上皮性頸部癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉腫瘍（小児）、T細胞リンパ腫（皮膚）、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、腎盂・尿管の移行上皮癌、栄養膜腫瘍、尿道癌、子宮癌（子宮内膜）、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍（腎臓癌）、上記癌の組み合わせ、ならびに上記癌の転移病巣を含む。本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、上記癌の1つもしくは複数の症状を軽減もしくは緩和し、該癌の重篤度を低下させ、該癌の転移を減少もしくは予防し、および／または該癌を全体的に緩和する。1つの態様において、本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、化学療法の副作用を最小化する。

別の態様において、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象は、非限定的に、座瘡、乾癬、皮膚アレルギーまたは掻痒等の皮膚状態に罹患している対象である。本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、上記皮膚状態の1つもしくは複数の症状を軽減もしくは緩和し、状態の重篤度を低下させ、および／または該状態を全体的に緩和する。

別の態様において、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象は、肥満に罹患している対象である。本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、体重減を促進し、および／または対象によるさらなる体重増を予防する。

別の態様において、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象は、運動障害、例えばジスキネジアに罹患している対象である。本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、該運動障害の1つもしくは複数の症状を軽減もしくは緩和し、該障害の重篤度を低下させ、および／または該障害を全体的に緩和する。

別の態様において、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象は、脳損傷または脊髄損傷に罹患している対象である。本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、上記状態の1つもしくは複数の症状を軽減もしくは緩和し、状態の治癒を促進および重篤度を低下させ、ならびに／または該状態を全体的に緩和する。

別の態様において、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象は、緑内障に罹患している対象であり、本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、緑内障の1つもしくは複数の症状を軽減もしくは緩和し、緑内障の重篤度を低下させ、および／または緑内障を全体的に緩和する。1つの態様において、本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、眼圧を有意に低下させる。

別の態様において、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象は、化学療法誘発毒性に苦しんでいる対象である。本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、上記毒性の1つもしくは複数の症状を軽減もしくは緩和し、該毒性の重篤度を低下させ、および／または該毒性を全体的に緩和する。

別の態様において、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象は、心血管疾患、特に心血管不整脈に罹患している対象である。本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、不整脈の1つもしくは複数の症状を軽減もしくは緩和し、不整脈状態の重篤度もしくは頻度を低下させ、および／または不整脈を全体的に緩和する。

別の態様において、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象は、腎臓変性および／または腎臓疾患、例えば腎炎に罹患している対象である。本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、腎臓変性および／もしくは腎臓疾患の1つもしくは複数の症状を軽減もしくは緩和し、該状態の重篤度を低下させ、ならびに／または該状態を全体的に緩和する。1つの態様において、腎炎を有する患者への本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、腎臓ろ過を改善する。

別の態様において、エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象は、ライム病に罹患している対象である。本明細書に記載されるフムルス植物の抽出物または該抽出物を含む組成物の投与は、ライム病の1つもしくは複数の症状を軽減もしくは緩和し、該疾患の重篤度を低下させ、および／または該疾患を全体的に緩和する。

上記状態の処置における本発明のフムルス植物抽出物およびそれを含む組成物の有効用量は、投与様式および頻度、組成物中の有効成分の濃度、標的部位、患者の生理学的状態（性別、身長および体重を含む）、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の医薬、ならびに処置が予防的であるか治療的であるかを含む、多くの異なる要因に依存して変化する。通常、対象はヒトであるが、一部の疾患において、対象は非ヒト哺乳動物であり得る。本発明の方法にしたがう処置に適した非ヒト哺乳動物は、霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット）、ウマ、シカ（deer）、シカ（cervid）、ウシ（cattle）およびウシ（cow）、ヒツジならびにブタを含む。処置用量は、安全性および有効性を最適化するよう滴定される必要がある。共通の手引きは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Publishing Company 1990)において見出すことができる。

本発明の組成物は、単回用量で、または複数回投薬プロトコルにしたがい投与され得る。例えば、本発明の1つの態様において、比較的少ない用量、例えば1つまたは2つの用量の組成物が投与される。本発明の別の態様において、治療組成物は、望まれる治療上の利益が達成されるまで、より高頻度で、例えば毎時間、毎日、毎週、毎月等、投与される。しかし、当業者は、処置される対象および状態に基づき、異なる用量、投薬のタイミングおよび組成物の相対量を選択および調節することができかつするべきである。

実施例1 - フムルス・ユンナネンシス・バー・クリヤの作製および特徴づけ
本明細書に記載される、「クリヤ」と命名された新規かつ独特のフムルス植物は、インドのアルナーチャル・プラデーシュ州ペコン地域で収集された野生のH.ユンナネンシス変異種のクロスハイブリダイゼーションにより作製した。パギング、シンギングおよびペコンならびにモーリング国立公園、ケイングおよびリポ内の森林を含む、インドの様々な地域から様々なH.ユンナネンシスサンプルを分析のために収集した。根を含むH.ユンナネンシスの雄および雌の若木を、雄花および雌花と共に収集した。すべての収集されたサンプルを、当技術分野で公知の標準的方法を用いてカンナビノイドの存在について試験した（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Korte. F. and Sieper. H., J. Chromatoqr. 13:90(1964)を参照のこと）。収集および試験した1,174個のH.ユンナネンシス植物サンプルのうち、61個（5.2％）のサンプルのみが、検出可能なレベルのカンナビノイドを含んでいた。以下の表1を参照のこと。さらに、カンナビノイドを含むH.ユンナネンシス植物の花房における平均カンナビノイドレベルは、2.1 mg/gであった（本願を通じて記載される植物組織内のカンナビノイドレベルは、凍結乾燥された植物物質1グラムあたりのカンナビノイドのミリグラム数で提供される）。

（表１）インドおよびブータンから収集したH.ユンナネンシスのサンプルにおけるカンナビノイド含量の比較

ウーティ¹:南インド、タミル・ナードゥ州のウーティ村
パギング²：インド、アルナーチャル・プラデーシュ州、上シアン県のパギング村
シンギング³：インド、アルナーチャル・プラデーシュ州、上シアン県のシンギング村
ペコン⁴：インド、アルナーチャル・プラデーシュ州、上シアン県のペコン村
モーリング⁵：インド、アルナーチャル・プラデーシュ州のモーリング国立公園
ケイング⁶：インド、アルナーチャル・プラデーシュ州、西シアン県のケイング村
リポ⁷：インド、アルナーチャル・プラデーシュ州、西シアン県のリポ村
ブムデリング⁸：ブータンのブムデリング鳥獣保護区
ナンダデビ⁹：インド、ヒマチャル・プラデーシュ州のナンダデビ国立公園

ペコン株は、通常より高いカンナビジオール含量を有することが同定され、検出可能なレベルのカンナビゲロール（CBG）、カンナビクロメン（CBC）、カンナビジオール（CBD）、カンナビエルソイン（CBE）およびカンナビジバリン（CBDV）が見い出された。カンナビジオール、カンナビクロメンおよびカンナビゲロールの含量が高く、通常、カルボキシル化カンナビノイドの＞85〜90％、非カルボキシル化カンナビノイドの＞65〜70％であった。ペコン株においては、テトラヒドロカンナビノールは全く検出されなかった。

表2（以下）は、ペコン地域から収集された6つのH.ユンナネンシス植物の花房サイズおよびカンナビノイドレベル（凍結乾燥された植物組織1グラムあたりのミリグラムカンナビノイド）をまとめたものである。これらのサンプルから、サンプル3、4および6を、それらの高いカンナビノイド含量に基づき、交配のために選択した。これらのサンプルはすべて、テトラヒドロカンナビノールの存在について陰性であった。

（表２）ペコンH.ユンナネンシスの特徴

「クリヤ」の作製を開始するため。ペコン＃3植物をペコン＃6植物と交配し、128個の雌子孫を作製した。各植物の雌花房におけるカンナビノイドレベルを評価した。128個の子孫の中で、74個の植物が、有意なカンナビノイドレベルを含んでいなかった。23個の子孫は、より長い花房（＞6 cm）を有していたが、その花房におけるカンナビノイドのレベルは、凍結乾燥組織1グラムあたり20ミリグラム未満であった。24個の子孫は、中程度の花房（4〜6 cmの長さ）および中程度の花房カンナビノイドレベル（25〜35 mg/g）を有していた。7個の子孫は、長さが7 cmを超える花房および70 mg/gを超えるカンナビノイドレベルを有していた。この分析から、カンナビノイドの存在はフムルス・ユンナネンシスにおいて劣性形質であると推測された。

ペコン＃3とペコン＃6との交配と並行して、ペコン＃3を別にペコン＃4植物と交配し、128個の子孫を生成した。これらの子孫においても、雌花房におけるカンナビノイドレベルを評価した。66 mg/g〜73 mg/gの花房カンナビノイドレベルを有する8個の植物が同定された。

最も高いカンナビノイドレベルを有する、ペコン＃3とペコン＃6との間の交配およびペコン＃3とペコン＃4との間の交配によって生成された第1世代植物を、第2世代植物の生成のための異種交配のために選択した（ペコン＃3／ペコン＃6交配からの植物n=7；ペコン＃3／ペコン＃4交配からの植物n=8）。これらの交配の子孫を、第3および第4世代子孫を生成するようさらに交配させた。第5劣性世代は、凍結乾燥された花房1グラムあたり128ミリグラムのカンナビノイドおよび凍結乾燥された葉および「刈り取り部（trim）」1グラムあたり16ミリグラムのカンナビノイドの平均カンナビノイド含量を有する雌植物を生成した。これらの雌植物の中で、1つの植物を、無性繁殖のために選択した。この新しい高カンナビノイド含量植物の変異種を、フムルス・ユンナネンシス・バー・クリヤまたは「クリヤ」と命名した。

雌「クリヤ」のさらなる繁殖を、インドのウッタラーカンド州ナイニタールにおいて2017年3月14日に開始したインビトロ培養を用いて行った。雌「クリヤ」植物の胚軸および新胚芽を微細繁殖させた。無菌植物組織を、インタクトな植物から取り出した。植物組織の小さな一部分をB5培地上に置き、そのイオン強度を半減させた（B5/2）。この培地に、成長中に組織片を支持するゲルを生成するよう寒天を加えた。

この第1段階で生成された組織サンプルを増殖させ、全体数を増加させた。この組織を、小さな「植物体（plantlet）」に成長させた。側枝の生成をホルモン処理により誘導した。「クリヤ」のすべての栄養繁殖体は、すべての無性増殖の間に元の植物の花房および球形が維持されていたという点で、典型的であることが観察された。複数の芽の形成後、これらの芽を、高いオーキシン／サイトカイニン比を有する発根培地に移した。

カンナビノイドの存在は、ペコン地域から収集されたH.ユンナネンシスにおいて最も多く検出された。上の表2は、「クリヤ」の元となった親植物を含む、最も高いカンナビノイドレベルを有することが同定された6つのペコン植物におけるカンナビノイドレベルを示している。以下の表3は、交配したペコンサンプルの第1、第2、第3および第4世代（第1世代植物は、ペコン＃3とペコン＃6植物との間の交配の子孫、およびペコン＃3とペコン＃4植物の子孫である。第2世代植物は、ペコン＃3／ペコン＃4子孫と交配させたペコン＃3／ペコン＃6子孫の子孫である。第3世代植物は、第2世代交配体の子孫であり、第4世代植物は、第3世代交配体の子孫である）子孫の花房および葉における平均カンナビノイド含量、ならびに「クリヤ」の花房および葉における平均カンナビノイド含量を示している。「クリヤ」花房における平均カンナビノイドレベルは、133.5 mg/g ± 8.62 mg/gである。このレベルは、元のペコン親変種の花房カンナビノイドレベル（41 mg/g〜56 mg/g）よりも＞2倍高い。このレベルはまた、第1、第2、第3および第4世代植物において見い出された平均花房カンナビノイドレベルと大きく異なっている。

「クリヤ」の平均葉カンナビノイド含量は、19.28 ± 3.75 mg/gである。これはまた、元のペコン親変種の葉カンナビノイド含量（4.8 mg/g〜7.5 mg/g）よりも＞2倍高い。このレベルはまた、第1、第2、第3および第4世代植物において見い出された平均葉カンナビノイドレベルと大きく異なっている。

カンナビジオール（CBD）、カンナビクロメン（CBC）およびカンナビゲロール（CBG）は、「クリヤ」の花房および葉に存在するカンナビノイドの＞98％を占める。微量（＜2％）のカンナビエルソイン（CBE）およびカンナビジバリン（CBDV）も存在する。その親株と同様、「クリヤ」にはテトラヒドロカンナビノールは存在しない。

（表３）「クリヤ」およびその祖先のカンナビノイド含量

以下の表4は、交配ペコンサンプルの第1、第2、第3および第4世代子孫の花房および葉における平均β-カリオフィレン含量、ならびに「クリヤ」の花房および葉における平均β-カリオフィレン含量を示している。「クリヤ」花房における平均β-カリオフィレンレベルは、53.11 mg/g ± 7.73 mg/gである。このレベルは、元のペコン親変種の花房β-カリオフィレンレベル（3 mg/g〜11 mg/g）よりも＞4倍高い。このレベルはまた、第1、第2、第3および第4世代植物において見い出された平均花房β-カリオフィレンレベルと大きく異なっている。

「クリヤ」の平均葉β-カリオフィレン含量は、10.63 ± 1.99 mg/gである。これは、元のペコン親変種の葉β-カリオフィレン含量（0.8 mg/g〜1.6 mg/g）よりもほぼ10倍高い。このレベルはまた、第1、第2、第3および第4世代植物において見い出された平均葉β-カリオフィレンレベルと大きく異なっている。

（表４）「クリヤ」およびその祖先のβ-カリオフィレン含量

実施例2 - フムルス・ユンナネンシス・クリヤ抽出物
H.ユンナネンシス・クリヤ（後期栄養状態）由来のさやの生抽出物を、Food and Safety Standards Authority of Indiaが分析した。この抽出物の組成を、以下の表5に提供する。

（表５）フムルス植物抽出物

実施例3 - より高い生物活性のカンナビジオールは、より高濃度で、弁間質細胞の石灰化をより大きく減少させる
実施例3の材料および方法
すべての化合物および溶液は、Sigma - Aldrich (St. Louis, MO)から入手した。すべての細胞培養物は、Creative Bioarray, Shirley, NYから入手した。CBDの生物活性は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるCushing et al., "Measuring the Bioactivity of Phytocannabinoid Cannabidiol from Cannabis Sources, and a Novel Non-Cannabis Source," Journal of Medical Phyto. Research 10 (2018)に記載される手法を用いて測定した。

VICの単離および培養。VICは、コラゲナーゼ消化によりブタ大動脈弁葉（Hormel, Austin, MN）から単離し、その後に成長培地（培地199中、15％ FBS、2 mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリンおよび100 g/mlストレプトマイシン）中、37℃、5％CO₂の下で2〜4継代培養した。すべての実験で使用したVICを、50,000細胞/cm²の密度で24ウェルまたは96ウェルプレートに播種した。実験の間、VICを低血清培地（培地199中1％ FBS、100 U/mlペニシリン、100 g/mlストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン）中で培養し、第5日まで培地を毎日交換した。

培養基材のコーティング。組織培養用ポリスチレン（TCPS）プレート（24ウェルまたは96ウェル）を、I型コラーゲン（Coll）（Inamed Biomaterials, Fremont, CA; 2 g/cm²）、フィブロネクチン（FN、5 g/cm²）、フィブリン（FB、1.5 g/cm²）でコーティングするか、または未処置のままにした（TCPS）。FBコーティングのために、プレートをまず4℃で一晩、フィブリノゲン（1 mg/mL）中でインキュベートし、その後にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中0.05％ Tween 20で3回洗浄し、トロンビン（0.6 mg/ml）と共に37℃で1時間インキュベートした（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Gu et al., "Role of the MAPK/ERK Pathway in Valvular Interstitial Cell Calcification," American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology 296(6): H1748-H1757 (2009)）。すべてのコーティングを、50 mM重炭酸コーティング緩衝液、pH 8.5中で行い、細胞播種前にPBSで3回リンスした。タンパク質コーティングの吸着を検証するため、吸着したタンパク質の量を、別プレート上でビシンコニン酸タンパク質アッセイ（Pierce, Rockford, IL）を用いて測定した。

MEK-1/2の阻害。様々な濃度および生物活性のCBDに曝露されたVICを、U-0126［1,4-ジアミノ-2,3-ジシアノ-1,4-ビス(2-アミノフェニルチオ)ブタジエン；Calbiochem, San Diego, CA］、PD-98059（2-アミノ-3 メトキシフラボン；5M；Calbiochem）で処置するか、またはこれらの阻害実験のMAPK特異性を確認するための対照として未処置のままにした。U-0126は、MEK-1/2を特異的に阻害し、したがってERK-1/2の活性化を阻害する（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Favata et al., "Identification of a Novel Inhibitor of Mitogen - Activated Protein Kinase Kinase," Journal of Biological Chemistry 273(29): 18623-18632(1998)）。PD-98059は、別のMEK阻害剤である。各処置グループに9つの組織サンプルとした。これらは、その後の分析において使用した組織サンプルであった。

細胞数の定量。1、3および5日の時点で、VICを放射免疫沈降アッセイ緩衝液［1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％ SDS、1％ Triton X-100、1 mMヨードアセトアミド、140 mM NaCl、10 mM Tris HCl、（pH 8.0）］を用いて溶解させた。サンプル溶解産物中のDNAの量を、製造元の指示にしたがいQuanti-iT PicoGreenアッセイ（Invitrogen, Carlsbad, CA）を通じて測定した。

遊走アッセイ。遊走を、改定フェンス法（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Mann et al., "Cell Adhesion Peptides Alter Smooth Muscle Cell Adhesion, Proliferation, Migration, and Matrix Protein Synthesis on Modified Surfaces and in Polymer Scaffolds," Journal of Biomedical Materials Research 60(1): 86-93 (2002)）を通じてアッセイし、その中で、VICを2 mm²リムーバブルシリコーンウェル内に播種し、コンフルエンスになるまで成長させ、ついでシリコーンアイソレータの取り外し（第0日と定義した）後に遊走させた。VIC培養物を含むプレートの下に格子パターンの透明フィルムを取り付け、細胞の移動を経時的に追跡した。5日間、24時間ごとに、40倍（Olympus IX51）で細胞遊走の先頭端部の写真を撮影した。タイムコース画像を重ね合わせ、単一の格子空間内で第0日に記録された遊走エリアを差し引いた先頭細胞端部の前進を測定することによって遊走距離を定量する（NIH ImageJ）ことで、正味の細胞端部の移動を測定した。

アポトーシスアッセイ。石灰化実験で使用される細胞サンプルの健康を確認するため、DNAの断片化を検出するELISAベースのHT TiterTACS Assay Kit（Trevigen, Gaithersburg, MD）を用いてアポトーシスを測定した。第1および5日に、細胞を、3.7％緩衝化ホルムアルデヒド溶液中で7分間固定し、PBSで洗浄し、そして100％メタノール中で20分間、後固定した。製造元の指示にしたがい、細胞をプロテイナーゼKで透過処理し、これをメタノール中2.5％ H₂O₂で停止し、その後に標識反応混合物（TdT、ビオチン-dNTP、非標識dNTP）と共にインキュベートしてDNA中の断裂部を標識した。アポトーシス細胞を検出するために、ストレプトアビジン-HRP、ついでTACS-Sapphireをウェルに添加し；この反応を、2N HClで停止させ、吸収を450 nmで読み取った。

RNAの単離。総RNAは、TRI Reagent（Molecular Research Center, Cincinnati, OH）を製造元の指示にしたがって用いて単離した。ウェルあたり200L TRI Reagentを、50プロテアーゼインヒビターカクテル（BD Biosciences, San Jose, CA）と共に用いて4℃でVICを溶解させた。核タンパク質複合体の溶解を完遂するためにホモジネートを室温で5分間保管し、この時点で600 L TRI Reagentあたり0.15 mLクロロホルムをホモジネートに添加し、その後に13,000 gで15分間遠心分離した。遠心分離後、600 L TRI Reagentあたり0.3 mLイソプロパノールを試験管に添加することによって上側水相からRNAを沈降させ、その後に13,000 gで8分間遠心分離した。この遠心分離工程の後、RNAペレットを75％エタノールで洗浄し、8,000 gで5分間遠心分離した。このRNAペレットを風乾させ、60℃で15分間、75 L H₂Oに溶解させた。その後の使用まで、RNAサンプルを20℃で保管した。

定量リアルタイムPCR分析。細胞の収縮性および骨形成活性の様々なマーカーに対する特注プライマーをInvitrogen（Carlsbad, CA）から入手し、これを表6に列挙する。

（表６）CBDのmg濃度および生物活性による石灰化の減少。石灰化の減少はすべて百分率で表されている

cDNAの構築のために、サンプルから単離された元となるRNA 250 ngを、iScript（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）を製造元の指示にしたがって用いて逆転写した。製造元のプロトコルに示されているように、このcDNA構築物 0.5 L、プライマー 5 M、およびSYBR Green SuperMix（Bio-Rad）を15-L反応物中で組み合わせることによって、サンプルをリアルタイムPCR分析用に処理した。熱サイクルは、標準的なプロトコルを使用し：PCR反応を、95℃で15秒間の変性および60℃で1分間のアニールの40サイクルで行い；その後に、各条件を3連で行う、55℃ 0.5℃/サイクル、1サイクルあたり10秒間の80サイクルで融解曲線分析を行い、最終PCR産物の純度をさらに確認した（iCycler iQ Real-Time PCR Instrument, Bio-Rad）。標準的なサイクル数比較（comparative threshold cycle）（またはCT）法を用いてPCRデータを分析した。すべてのサンプルのCTを、最初に、内部対照としてのアクチンに対して正規化し、その後に実験サンプルのCT値を、陰性対照（非CBD条件を表すVIC on Coll）に対してさらに正規化した。

小結節数およびサイズの定量。U-0126またはPD-98059の存在下または非存在下での5日間の培養後、VIC培養物を、石灰化した小結節の定量を容易にするために、石灰化した沈着物を赤色に染色するAlizarin Red S（ARS）で染色した。培養物を、10％中性緩衝化ホルマリンで固定し、4℃で一晩保管し、PBS中2％ARS溶液で染色した。陽性染色された小結節を、顕微鏡（Hamamatsu 285デジタルカメラを搭載したOlympus IX51およびSimple PCIデジタルイメージングソフトウェア；Compix, Imaging Systems, Cranberry Township, PA）下で手作業で計数した。小結節のサイズは、ImageJソフトウェア（National Institutes of Health）を用いて測定し、顕微鏡写真を40倍および100倍で撮影した。

CBDサンプルおよび生物活性試験。生物活性.20、.30、.50、.60および.70を有するCBDサンプルは、Natural Hemp SolutionsのRandy Kindred氏から入手した。生物活性.80、.90および.95を有するCBDサンプルは、ImmunAG LLPのフムルス製品であるImmunAGから単離した。単離後、生物活性を、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Cushing et al., "Measuring the Bioactivity of Phytocannabinoid Cannabidiol from Cannabis Sources, and a Novel Non-Cannabis Source," Journal of Medical Phyto. Research 10 (2018)に概説されている手順を用いて測定した。

結果
27の異なる組織サンプル由来の石灰化VICを含む複数のウェルを、8つの異なる生物活性および5つの異なるmg濃度のCBDで処置するかまたは未処置のままにした。平均石灰化を、ウェルあたりの小結節数および小結節あたりの平均面積を用いて計算した。未処置ウェルの平均総小結節面積は、ウェルあたり3.27 mm²（SD=0.32、最小=0.5、最大=4.0）であった。すべての報告されている石灰化減少率は、処置されたウェルの平均小結節面積を3.27 mm²で割ることによって計算した。CBDサンプルを、それらの生物活性レベルにしたがい、.20、.30、.50、.60、.70、.80、.90および.95の値付近で分類した。5、10、25、40および100のmg用量を試験した。

予備的データ分析。各々の試験されたmg濃度での各々の試験された生物活性レベルにおける平均、標準偏差ならびに最小および最大値を、上記表6に提供する。すべてのデータを表7に提供する。

（表７）全VIC石灰化減少データ

より高い生物活性およびより高い濃度の各々が、石灰化の減少に結びついた。5つすべての濃度で、生物活性の増加と共に、石灰化は指数関数的に減少したようであった（図4を参照のこと）。各サンプルの石灰化の減少の間の分散もまた、生物活性の増加にともない増加した。例えば、最も高い減少値（100 mg、.95の生物活性）のグループは、40％〜67％の減少（M=55％）を示した。このグループはまた、最も高い標準偏差を示した（SD=6.66％）。より高い減少スコアで分散が増加しているものの、生物活性レベルの間に有意差が存在したようであった。例えば、各mg濃度で、.95の生物活性のCBDによって誘導された最小の石灰化減少は、それでもなお、.70の生物活性のCBDによって誘導された最大石灰化減少よりも大きかった。

mg濃度間での低生物活性CBDの比較。.20の生物活性のCBDにより処置されたVICサンプルにおいて様々なmg濃度（5、10、25、40、100）間で差が存在したかどうかを試験するため、1x5反復測定ANOVAを行った（図5を参照のこと）。モークリー試験では、サンプル間の球面性の仮定からの逸脱が見い出されなかった：W=.759、p=.667。RM ANOVAでは、.20生物活性試験グループ内で、VIC石灰化の減少に関する用量間の有意差が見出された：F(4,104)=18.90、p<.001、η²G=.354。ボンフェローニ補正を用いた事後比較は、25 mgおよび100 mgの用量に曝露された試験サンプルが、5、10および40 mgの用量よりもVIC石灰化の大きな減少を現したことを示した。すべての有意な事後比較において、p<.001。これらの平均間の差は小さかった（すべてのM_diff<1.15％）。

mg濃度間での高生物活性CBDの比較。.95の生物活性のCBDにより処置されたVICサンプルにおいて様々なmg濃度間で差が存在したかどうかを試験するため、1x5反復測定ANOVAを行った（図5を参照のこと）。モークリー試験では、球面性の仮定からの逸脱の可能性が見い出された：W=.331、p=.0014。グリーンハウス・ゲイザー補正を用いた反復測定ANOVAでは、.95生物活性試験グループ内で、VIC石灰化に関する用量間の有意差が見出された：F(4,104)=260.13、p<.001、η²G=.894。ボンフェローニ調整を用いた事後比較は、各グループ間で有意差を示した。すべての有意な事後比較において、p<.0000001。これらの平均間の差はかなり大きかった（最大のM_diff=35.58％）。

生物活性と濃度との間の相互作用の試験。より高い生物活性およびより高い濃度の各々がより大きな石灰化減少をもたらすことを示す明白な傾向がデータ間でみられるため、生物活性と用量とが相互作用する程度をより理解するために2x2混合ANOVAを試みた。石灰化減少の増加は、すべてのmg濃度にわたって同じ様に起こるので、最小および最大の生物活性および濃度のみを試験することによって統計学的アプローチを単純化した。

ルビーン検定は、非一様な分散を示した：W=23.42、p<.001。逆正弦変換は、分散を一様にすることができなかった：W=16.04、p<.001。したがって、元の値に対して、中央値推定量を用いるロバスト2x2 ANOVAを行った。これにより、主効果としての生物活性の（psihat=64.7、p<0.001）、主効果としての濃度の（psihat=-37.5、p<.001）、ならびに生物活性および濃度間の相互作用（psihat=-36.5、p<.001）の、有意な効果が見出された。

結論
高い生物活性および高い濃度において、石灰化は大きく減少した。低い生物活性において、mg濃度は、石灰化減少に関して一貫性のない役割を果たした。高い生物活性において、石灰化減少は、より高い濃度で有意に増加した。ロバスト推定技術を通じて生物活性と濃度との間で有意な相互作用の効果が見い出された。まとめると、これらの結果は、VIC石灰化処置としてのCBDの効果を考慮したとき、CBDの生物活性が中心的重要性を持つことを示唆している。

考察
この研究において、CBDは、インビトロでブタVICの石灰化を減少させるのに有効であることが示され、最も高い濃度における最も高い生物活性のCBDが、最も大きな減少を示した（M=55%）。

この実験において、CBDが主にVIC石灰化を減少させるメカニズムは、おそらくERK阻害であることが見い出された（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Gu et al., "Role of the MAPK/ERK Pathway in Valvular Interstitial Cell Calcification," American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology 296(6): H1748-H1757 (2009)を参照のこと）。この判断が正しいとすると、生物活性レベルによって引き起こされる異なる石灰化減少は、ERK活性の異なる阻害を暗示している。これの暗示するところは広範囲である。

ERK経路は、増殖、分化、生存および血管新生に対する様々な細胞外刺激に関連している（それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる、Roy et al., "Phenotypic Modulation of Arterial Smooth Muscle Cells is Associated with Prolonged Activation of ERK 1/2," Differentiation 67(1-2): 50-58(2001); Salasznyk et al., "ERK Signaling Pathways Regulate the Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells on Collagen I and Vitronectin," Cell Communication & Adhesion 11(5-6):137-153(2004); Lewis et al., "Signal Transduction through MAP Kinase Cascades," In Advances in Cancer Research 74:49-139(1998). Academic Press.; Depeille, "MKK-signaling and vascularization," Oncogene 26(9): 1290-6(2007)）。癌を含む多数の疾患が、その調整を通じて影響を受け得る（例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる、Wagner et al., "Signal Integration by JNK and p38 MAPK Pathways in Cancer Development, " Nature Reviews Cancer 9(8): 537(2009); Huang et al., "Inhibition of MAPK Kinase Signaling Pathways Suppressed Renal Cell Carcinoma Growth and Angiogenesis in Vivo," Cancer Research 68(1): 81-88 (2008); Herrera et al., "MAPK is Involved in CB2 Receptor-Induced Apoptosis of Human Leukaemia Cells," FEBS Letters 579(22); 5084-5088 (2005); Milella et al., "Therapeutic Targeting of the MEK/MAPK Signal Transduction Module in Acute Myeloid Leukemia," The Journal of Clinical Investigation 108(6): 851-859 (2001)を参照のこと）。例えば、放射線照射と共に、MAPK p38経路は、膠芽腫におけるCBD誘導細胞死の主要な誘導因子のひとつであった（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ivanov et al., "Regulation of Human Glioblastoma Cell Death by Combined Treatment of Cannabidiol, γ-Radiation and Small Molecule Inhibitors of Cell Signaling Pathways," Oncotarget 8(43): 74068 (2017)）。さらに、ERKおよびROS経路によるCBDの調整は、Id-1発現の下方調節およびId-2の上方調節をもたらし、それによって乳癌細胞の増殖および浸潤を阻害する（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、McAllister et al., Pathways Mediating the Effects of Cannabidiol on the Reduction of Breast Cancer Cell Proliferation, Invasion, and Metastasis," Breast Cancer Res. Treat. 129(1): 37-47 (2011) ）。CBDがこれらの抗癌効果を誘導する程度もまた、CBDの生物活性に依存する。

その全体が参照により本明細書に組み入れられるCushing et al., "Measuring the Bioactivity of Phytocannabinoid Cannabidiol from Cannabis Sources, and a Novel Non-Cannabis Source," Journal of Medical Phyto. Research 10 (2018)に記載される、この実験において使用された生物活性試験手順は、その有効性がCBDサンプルのCB2親和性に依存するモノクローナル抗体試験からなるものであった。CBD生物活性試験が非CB2標的、例えばGPR55の石灰化減少効果を推測するものであるかどうかは、未だ不透明である（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Lauckner et al., "GPR55 is a Cannabinoid Receptor that Increases Intracellular Calcium and Inhibits M Current," Proceedings of the National Academy of Sciences 105(7): 2699-2704 (2008)）。生物活性は、非CB2経路を通じて伝達される効果に一般化されると考えられる。そうであるならば、低い生物活性のCBDを利用して、GPR55等の経路に対するその石灰化促進効果を調査する研究は、誤った結果をもたらしていた可能性がある。臨床研究前に生物活性についてCBDサンプルを試験することが必須である。

実施例4 - 生物活性を有するカンナビジオールはβ-カリオフィレンおよびα-フムレンと組み合わせたとき弁間質細胞の石灰化をより大きく減少させる
実施例4の材料および方法
この研究は、上記研究と同時に行った。すべての化合物および溶液は、Sigma - Aldrich (St. Louis, MO)から入手した。すべての細胞培養物は、Creative Bioarray, Shirley, NYから入手した。CBDの生物活性は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Cushing et al., "Measuring the Bioactivity of Phytocannabinoid Cannabidiol from Cannabis Sources, and a Novel Non-Cannabis Source," Journal of Medical Phyto. Research 10 (2018)に記載される手法を用いて測定した。

VICの単離および培養。VICは、コラゲナーゼ消化によりブタ大動脈弁葉（Hormel, Austin, MN）から単離し、その後に成長培地（培地199中15％ FBS、2 mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリンおよび100 g/mlストレプトマイシン）中、37℃、5％CO₂の下で2〜4継代培養した。すべての実験で使用したVICを、50,000細胞/cm²の密度で24ウェルまたは96ウェルプレートに播種した。実験の間、VICを低血清培地（培地199中1％ FBS、100 U/mlペニシリン、100 g/mlストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン）中で培養し、第5日まで培地を毎日交換した。

培養基材のコーティング。組織培養用ポリスチレン（TCPS）プレート（24ウェルまたは96ウェル）を、I型コラーゲン（Coll）（Inamed Biomaterials, Fremont, CA; 2 g/cm²）、フィブロネクチン（FN、5 g/cm²）、フィブリン（FB、1.5 g/cm²）でコーティングするか、または未処置のままにした（TCPS）。FBコーティングのために、プレートをまず4℃で一晩、フィブリノゲン（1 mg/mL）中でインキュベートし、その後にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中0.05％ Tween 20で3回洗浄し、トロンビン（0.6 mg/ml）と共に37℃で1時間インキュベートした。すべてのコーティングを、50 mM重炭酸コーティング緩衝液、pH 8.5中で調製し、細胞播種前にPBSで3回リンスした。タンパク質コーティングの吸着を検証するため、吸着したタンパク質の量を、別プレート上でビシンコニン酸タンパク質アッセイ（Pierce, Rockford, IL）を用いて測定した。

MEK-1/2の阻害。様々な濃度および生物活性のCBDに曝露されたVICを、U-0126［1,4-ジアミノ-2,3-ジシアノ-1,4-ビス(2-アミノフェニルチオ)ブタジエン；Calbiochem, San Diego, CA］、PD-98059（2-アミノ-3-メトキシフラボン；5M；Calbiochem）で処置するか、またはこれらの阻害実験のMAPK特異性を確認するための対照として未処置のままにした。U-0126は、MEK-1/2を特異的に阻害し、したがってERK-1/2の活性化を阻害する（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Favata et al., "Identification of a Novel Inhibitor of Mitogen - Activated Protein Kinase Kinase," Journal of Biological Chemistry 273(29): 18623-18632(1998)）。PD-98059は、別のMEK阻害剤である。各処置グループに9つの組織サンプルとした。これらは、その後の分析において使用した組織サンプルであった。

細胞数の定量。1、3および5日の時点で、VICを放射免疫沈降アッセイ緩衝液［1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％ SDS、1％ Triton X-100、1 mMヨードアセトアミド、140 mM NaCl、10 mM Tris HCl、（pH 8.0）］を用いて溶解させた。サンプル溶解産物中のDNAの量を、製造元の指示にしたがいQuanti-iT PicoGreenアッセイ（Invitrogen, Carlsbad, CA）を通じて測定した。

遊走アッセイ。遊走を、改定フェンス法（Mann & West, 2002）を通じてアッセイし、その中で、VICを2 mm²リムーバブルシリコーンウェル内に播種し、コンフルエンスになるまで成長させ、ついでシリコーンアイソレータの取り外し（第0日と定義した）後に遊走させた。VICを培養物を含むプレートの下に格子パターンの透明フィルムを取り付け、細胞の移動を経時的に追跡した。5日間、24時間ごとに、40倍（Olympus IX51）で細胞遊走の先頭端部の写真を撮影した。タイムコース画像を重ね合わせ、単一の格子スペース内で第0日に記録された遊走エリアを差し引いた先頭細胞端部の前進を測定することによって遊走距離を定量する（NIH ImageJ）ことによって、正味の細胞端部の移動を測定した。

アポトーシスアッセイ。石灰化実験で使用される細胞サンプルの健康を確認するため、DNAの断片化を検出するELISAベースのHT TiterTACS Assay Kit（Trevigen, Gaithersburg, MD）を用いてアポトーシスを測定した。第1および5日に、細胞を、3.7％緩衝化ホルムアルデヒド溶液中で7分間固定し、PBSで洗浄し、そして100％メタノール中で20分間、後固定した。製造元の指示にしたがい、細胞をプロテイナーゼKで透過処理し、これをメタノール中2.5％ H₂O₂で停止し、その後に標識反応混合物（TdT、ビオチン-dNTP、非標識dNTP）と共にインキュベートしてDNA中の断裂部を標識した。アポトーシス細胞を検出するために、ストレプトアビジン-HRP、ついでTACS-Sapphireをウェルに添加し；この反応を、2N HClで停止させ、吸収を450 nmで読み取った。

RNAの単離。総RNAは、TRI Reagent（Molecular Research Center, Cincinnati, OH）を製造元の指示にしたがって用いて単離した。ウェルあたり200 L TRI Reagentを、50プロテアーゼインヒビターカクテル（BD Biosciences, San Jose, CA）と共に用いて4℃でVICを溶解させた。核タンパク質複合体の溶解を完遂するためにホモジネートを室温で5分間保管し、その時点で600 L TRI Reagentあたり0.15 mLクロロホルムをホモジネートに添加し、その後に13,000 gで15分間遠心分離した。遠心分離後、600 l TRI Reagentあたり0.3 mLイソプロパノールを試験管に添加することによって上側水相からRNAを沈降させ、その後に13,000 gで8分間遠心分離した。この遠心分離工程の後、RNAペレットを75％エタノールで洗浄し、8,000 gで5分間遠心分離した。このRNAペレットを風乾させ、60℃で15分間、75 l H₂Oに溶解させた。その後の使用まで、RNAサンプルを20℃で保管した。

定量リアルタイムPCR分析。細胞の収縮性および骨形成活性の様々なマーカーに対する特注プライマーをInvitrogen（Carlsbad, CA）から入手した。cDNAの構築のために、サンプルから単離された元のRNA 250 ngを、iScript（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）を製造元の指示にしたがって用いて逆転写した。製造元のプロトコルに示されているように、このcDNA構築物 0.5 l、プライマー 5 M、およびSYBR Green SuperMix（Bio-Rad）を15-l反応物中で組み合わせることによって、サンプルをリアルタイムPCR分析用に処理した。熱サイクルは、標準的なプロトコルを使用し：PCR反応を、95℃で15秒間の変性および60℃で1分間のアニールの40サイクルで行い；その後に、各条件を3連で行う、55℃ 0.5℃/サイクル、サイクルあたり10秒間の80サイクルで融解曲線分析を行い、最終PCR産物の純度をさらに確認した（iCycler iQ Real-Time PCR Instrument, Bio-Rad）。標準的なサイクル数比較（またはCT）法を用いてPCRデータを分析した。すべてのサンプルのCTを、最初に、内部対照としてのアクチンに対して正規化し、その後に実験サンプルのCT値を、陰性対照（非CBD条件を表すVIC on Coll）に対してさらに正規化した。

小結節数およびサイズの定量。U-0126またはPD-98059の存在下または非存在下での5日間の培養後、VIC培養物を、石灰化した小結節の定量を容易にするために、石灰化した沈着物を赤色に染色するAlizarin Red S（ARS）で染色した。培養物を、10％中性緩衝化ホルマリンで固定し、4℃で一晩保管し、PBS中2％ARS溶液で染色した、陽性染色された小結節を、顕微鏡（Hamamatsu 285デジタルカメラを搭載したOlympus IX51およびSimple PCIデジタルイメージングソフトウェア；Compix, Imaging System, Cranberry Township, PA）下で手作業で計数した。小結節のサイズは、ImageJソフトウェア（National Institutes of Health）を用いて測定し、顕微鏡写真を40倍および100倍で撮影した。

CBDおよびImmunAGサンプル。.95の生物活性のCBDを、ImmunAG LLPのフムルス製品であるImmunAGからHPLCによって単離した。ImmunAGは、CBD（39.5％）、BCP（59.5％）およびHMU（1％）の独自の組み合わせである。BCPおよびHMUの生物活性は直接的に試験しなかった。それらは、CBDの生物活性とおおよそ等しいとみなされた。

結果
27の異なる組織サンプル由来の石灰化VICを含む複数のウェルを、5、10、25、40または100 mgのCBDまたはImmunAGのいずれかで処置した。平均石灰化を、ウェルあたりの小結節数および小結節あたりの平均面積を用いて計算した。未処置ウェルの平均小結節面積は、ウェルあたり3.27 mm²（SD=0.32、最小=0.5、最大=4.0）であった。報告されているすべての石灰化減少率は、処置されたウェルの平均小結節面積を3.27 mm²で割ることによって計算した。

各々の試験されたmg濃度でのCBDおよびImmunAGにおける平均、標準偏差ならびに最小および最大値を、表8に提供する。

（表８）mg濃度によるCBDおよびImmunAGの石灰化減少データの記述統計学

全データを表9に示す。

（表９）

対応のあるサンプルのt検定は、各mg濃度でImmunAGがCBD単独よりも有意に大きく石灰化を減少させたことを決定した。5 mgで、t(26)=9.87、p＜.001、d=1.90；10 mgで、t(26)=4.20、p＜.001、d=0.81；25 mgで、t(26)=5.23、p＜.001、d=1.00；40 mgで、t(26)=7.76、p＜.001、d=1.49；および100 mgで、t(26)=4.05、p＜.001、d=0.78。観察された差の棒グラフを図6に示す。

結論
本研究は、高い生物活性のCBD、BCPおよびHMUの組み合わせが、高い生物活性のCBD単独よりもVICの石灰化を減少させることを示した。この化合物の組み合わせによりもたらされる生じ得る相乗効果がVICの石灰化以外にも及ぶかどうかは引き続き検証されるべきである。CBDは、抗不安、抗うつ、抗精神病、抗けいれん、鎮吐、抗酸化、抗炎症、抗関節炎および抗腫瘍特性を有することが示されている（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ligresti et al., "From Phytocannabinoids to Cannabinoid Receptors and Endocannabinoids: Pleiotropic Physiological and Pathological Roles through Complex Pharmacology," Physiological Reviews 96(4): 1593-1659 (2016)）。BCPは、抗風土病、抗腫瘍、抗酸化、抗微生物および抗炎症特性についての可能性が示されている（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Dahham et al., "The Anticancer, Antioxidant and Antimicrobial Properties of the Sesquiterpene β-Caryophyllene from the Essential Oil of Aquilaria crassna," Molecules 20(7): 11808-29 (2015)）。創薬への植物学的アプローチは勢いを増しており、これらの特性の各々が相互作用する方法の解明は、刺激的で新しい未解明の科学分野であろう。

実施例5 - ImmunAGを用いた肝臓癌研究
実施例5の材料および方法
患者の特徴。この試験には99名の男性および18名の女性が参加した。その平均年齢は53歳であり、最年少は31歳、最年長は78歳であった。86名の患者（73.5％）が術前TACE陰性であり、31名の患者（26.49％）が術前TACE陽性であった。17名の患者（14.52％）がHBsAg陰性であり、100名の患者（85.47％）がHBsAg陽性であった。106名の患者（95.49％）が抗HCV陰性であり、11名の患者（4.5％）が抗HCV陽性であった。18名の患者（16.1％）が肝硬変に関して陰性であり、99名の患者（83.9％）が肝硬変に関して陽性であった。術前アルファ-フェトプロテイン（μg/L）は平均18.3であり、最小値は1.7、最大値は1089であった。累積腫瘍サイズは平均4.89 cmであり、最小は2.37 cm、最大値は19.62 cmであった。53名は肝臓に2つの腫瘍を有しており、52名は3つの肝臓腫瘍を有しており、12名は4つの腫瘍を有していた。平均腫瘍数は3Nである。高壊死分化型が7例（5.98％）、中壊死分化型が106例（90.59％）、低壊死分化型が4例（3.41％）であった。18名の患者（15％）のみが、肝被膜浸潤を有さなかった。残りの99名の患者（84.6％）は、いくつかの形態の肝被膜浸潤を有していた。

これらの患者はすべて、標準リスク（SR）肝芽腫に罹患しており、肝細胞癌または胆管癌に罹患していなかった。これらの患者の中で、57名の男性および7名の女性が、一定程度の外科的切除を行っていた。しかし、この処置時点で、切除は有効な選択肢であるとみなされなかった。

シスプラチン単独処置グループには、54名の男性および10名の女性が参加した。シスプラチン＋ImmunAG処置グループには、45名の男性および8名の女性が参加した。シスプラチン単独処置グループは、研究期間の間、4週ごとに50〜70 mg/m²の用量を投与された。シスプラチン＋ImmunAG処置グループは、80 mg〜600 mg/日用量のImmunAG（CBD、フムレンおよびβ-カリオフィレンを含む組成物）と共に上記と同じ用量のシスプラチンを投与された。ImmunAGの正確な用量は、患者の性別および身長に基づき決定し、1日の間に3回に分けて投与した。

「シスプラチン＋ImmunAGアジュバント処置」では、平均腫瘍が1から0.952に（-5％）減少し（図8A〜8Bを参照のこと）、シスプラチン単独処置では、平均で1から1.17に（17％）増加した（図7A〜7Bを参照のこと）。90％信頼区間で、ImmunAGを伴うシスプラチンは、シスプラチン単独よりも22％多く肝臓癌腫瘍を減少させたと予想することができる。

実施例6 - ImmunAGを用いたケーススタディ
実施例6の材料および方法
患者の情報。Jane Doeは、カリフォルニア州サンノゼ出身の62歳の閉経後の白人女性である。2013年、右乳房のしこりに気づき、浸潤性導管腺癌と診断され、右乳房の下四半部の6.1 cmの病巣が腺癌に関してFNA+であった。この腫瘍は、HER2陰性/ER+/PR+腫瘍であると決定された。骨の走査および胸部の診断CTでは、転移を認めなかった。患者は、高用量AC：ドキソルビシン60 mg/m² IV q2週とそれに続く毎週のパクリタキセル80 mg/m² x 12のネオアジュバント療法による処置を受けた。患者は、乳房温存療法（7つの腋窩リンパ節に悪性細胞）を受け、手術の後に、胸壁および所属リンパ節の放射線療法（5x/週を6週間）が行われた。患者は、非ステロイドアロマターゼ阻害剤を開始した。

アジュバント化学療法から5ヶ月後、患者は、骨の痛みを訴えた。骨の走査およびCT走査により、いくつかの転移：2〜3 cmと測定された左上腕骨の2つの病巣および2〜3 cmと測定された肝臓の2つの病巣；2〜3 cmと測定された肺の1つの病巣、が明らかになった。患者は、タキサン耐性の可能性あり（最後のアジュバント療法から12ヶ月以内に進行した）と診断された。肝臓の生検および病理学は、転移物が元の乳癌と同系統であることを示した。患者は、ステージIVの癌と診断された。組織学により、HER2陰性/ER+/PR+の疾患と確認された。患者は、骨転移物に対してデノスマブを用いる治療を開始した。患者はまた、第1〜14日にXeloda 1000 mg/m² PO BIDを投与された。患者は、化学療法を中止することを決定された。

患者の息子は、ImmunAGを入手した。患者は、1日あたり500 mgのImmunAGを投与された：午前8時に200 mg、午後2時に100 mgおよび午後8時に200 mg。

結果
2016年4月11日のPETチャート（図9Aと比較した図9B）で確認できるように、転移癌の95％が、39日で消失した。ImmunAGは、「チェックポイントタンパク質」阻害剤として作用する。チェックポイントタンパク質は、癌細胞が、免疫系から隠れることを可能にする。ImmunAGによるチェックポイントタンパク質の妨害により、免疫系は、癌細胞を認識し、それらを攻撃することができる。免疫系は、偏在しており、この例では、転移癌細胞を攻撃することができる。

本明細書では好ましい態様が示され詳述されているが、関連技術分野の当業者には、本発明の精神から逸脱することなく様々な改変、付加、置換等を行うことができ、したがってそれらも添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲に包含されるとみなされることが明らかであろう。

Claims (40)

1. その花房において少なくとも75 mg/g（乾燥重量）のカンナビノイド濃度を有する、フムルス植物。
2. その葉において少なくとも15 mg/g（乾燥重量）のカンナビノイド濃度を有する、請求項1記載のフムルス植物。
3. 花房におけるカンナビノイド濃度が、少なくとも100 mg/g（乾燥重量）である、請求項1記載のフムルス植物。
4. 葉におけるカンナビノイド濃度が、少なくとも20 mg/g（乾燥重量）である、請求項2記載のフムルス植物。
5. フムルス・ユンナネンシス（Humulus yunnanensis）植物である、請求項1記載のフムルス植物。
6. カンナビゲロール（CBG）、カンナビクロメン（CBC）、カンナビジオール（CBD）、カンナビエルソイン（CBE）およびカンナビジバリン（CBDV）からなる群より選択される1つまたは複数のカンナビノイドを含む、請求項1記載のフムルス植物。
7. テトラヒドロカンナビノール酸（THCA）またはテトラヒドロカンナビノール（THC）を含まない、請求項1記載のフムルス植物。
8. 請求項1記載の植物の抽出物。
9. 濃縮されたレベルのフムレン、β-カリオフィレンおよびカンナビジオールを含む、請求項8記載の抽出物。
10. 1.5％のフムレン、60％のβ-カリオフィレンおよび38.5％のカンナビジオールを含む、請求項9記載の抽出物。
11. 請求項8記載の抽出物を含む、組成物。
12. 1％〜10％のフムレン、
    5％〜90％のβ-カリオフィレン、および
    5％〜90％のカンナビジオール
    を含む、組成物。
13. 1.5％のフムレン、
    60％のβ-カリオフィレン、および
    38.5％のカンナビジオール
    を含む、請求項12記載の組成物。
14. 1.5％のフムレン、
    60％のβ-カリオフィレン、および
    38.5％のカンナビジオール
    から本質的になる、請求項13記載の組成物。
15. テトラヒドロカンナビノール酸（THCA）またはテトラヒドロカンナビノール（THC）を含まない、請求項11〜14のいずれか一項記載の組成物。
16. 経口投与用に製剤化されている、請求項11〜15のいずれか一項記載の組成物。
17. カプセル、錠剤、液体、粉末、顆粒、懸濁物またはオイルとして製剤化されている、請求項16記載の組成物。
18. 徐放性錠剤として製剤化されている。請求項16記載の組成物。
19. 局所投与用に製剤化されている、請求項11〜15のいずれか一項記載の組成物。
20. クリーム、ローション、乳濁物、粉末、ペースト、ジェル、スプレー、軟膏、溶液、フォームおよびオイルとして製剤化されている、請求項19記載の組成物。
21. 対象においてエンドカンナビノイド系の活性を調整する方法であって、
    エンドカンナビノイド系の調整を必要とする対象を選択する工程、および
    選択された対象に、該対象においてエンドカンナビノイド系の活性を調整するのに有効な量の請求項8〜10のいずれか一項記載の抽出物または請求項11〜15のいずれか一項記載の組成物を投与する工程
    を含む、方法。
22. 前記投与が、対象においてエンドカンナビノイド系の活性を増加させる、請求項21記載の方法。
23. 選択された対象が、ストレス、不安、睡眠障害、気分障害、てんかん、統合失調症、自閉症および／またはうつに罹患している、請求項21記載の方法。
24. 選択された対象が、慢性疼痛、偏頭痛または神経症を有する、請求項21記載の方法。
25. 選択された対象が、嗜癖または拒食症に罹患している、請求項21記載の方法。
26. 選択された対象が、炎症に関連する状態を有している、請求項21記載の方法。
27. 炎症に関連する状態が、過敏性腸症候群、関節炎、喘息、クローン病、大腸炎、痔、虚血／再灌流損傷からなる群より選択される、請求項26記載の方法。
28. 選択された対象が、糖尿病を有する、請求項21記載の方法。
29. 選択された対象が、神経変性疾患を有する、請求項21記載の方法。
30. 神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病およびハンチントン病からなる群より選択される、請求項29記載の方法。
31. 選択された対象が、癌を有する、請求項21記載の方法。
32. 選択された対象が、座瘡、乾癬、皮膚アレルギーおよび掻痒からなる群より選択される皮膚状態に罹患している、請求項21記載の方法。
33. 選択された対象が、肥満である、請求項21記載の方法。
34. 選択された対象が、運動障害を有する、請求項21記載の方法。
35. 選択された対象が、脳損傷または脊髄損傷を有する、請求項21記載の方法。
36. 選択された対象が、緑内障を有する、請求項21記載の方法。
37. 選択された対象が、化学療法誘発毒性に苦しんでいる、請求項21記載の方法。
38. 選択された対象が、心血管不整脈を有する、請求項21記載の方法。
39. 選択された対象が、腎臓変性に罹患している、請求項21記載の方法。
40. 選択された対象が、開口障害または顎関節疾患に罹患している、請求項21記載の方法。

Images