JP2021512590A - ゲノム編集のためのシステム及び方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明者らは、哺乳動物細胞におけるゲノム編集のための新規なCRISPR-C2c1システムを同定した。本発明者らによって同定されたC2c1ヌクレアーゼは、in vitro実験で高温耐性並びに酸及びアルカリ耐性を示す。さらに、本発明者らは、同定されたCRISPR-C2c1システムのsgRNAを最適化して、その標的化効率に影響を与えることなく、その長さを大幅に短縮する。最後に、本発明者らはまた、C2c1タンパク質自体を操作して、それをエンドヌクレアーゼから不活性(dead)C2c1(dC2c1)に変換させ、その使用を拡張した。
i) C2c1タンパク質若しくはそのバリアント、及びガイドRNA;
ii) C2c1タンパク質若しくはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNA;
iii) C2c1タンパク質若しくはそのバリアント、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物;
iv) C2c1タンパク質若しくはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物;
v) C2c1タンパク質若しくはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物
のうちの少なくとも1つを含む、細胞のゲノム中の標的配列の部位特異的改変のためのゲノム編集システムであって、
ガイドRNAは、C2c1タンパク質又はそのバリアントと複合体を形成し、C2c1タンパク質又はそのバリアントを細胞のゲノム中の標的配列に標的化させ、標的配列中の1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び/又は付加をもたらすことができる、システムを提供する。いくつかの実施形態では、C2c1タンパク質は、アリサイクロバチルス・アシディフィラス(Alicyclobacillus acidiphilus)又はアリサイクロバチルス・カケガウェンシス(Alicyclobacillus kakegawensis)に由来するC2c1タンパク質である。
本発明において、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、他に明記しない限り、当業者によって一般に理解される意味を有する。また、本明細書で使用されるタンパク質及び核酸化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学、免疫学関連用語、及び実験室手順は、対応する分野で広く使用されている用語及び日常的処置である。例えば、本発明で使用される標準的な組換えDNA及び分子クローニング技術は当業者に周知であり、以下の文書により完全に記載されている: Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989(本明細書において以降、「Sambrook」と呼ばれる)。
i) C2c1タンパク質若しくはそのバリアント、及びガイドRNA;
ii) C2c1タンパク質若しくはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNA;
iii) C2c1タンパク質若しくはそのバリアント、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物;
iv) C2c1タンパク質若しくはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物;
v) C2c1タンパク質若しくはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物
のうちの少なくとも1つを含む、細胞のゲノム中の標的配列の部位特異的改変のためのゲノム編集システムであって、
そのガイドRNAは、C2c1タンパク質又はそのバリアントと複合体を形成し、C2c1タンパク質又はそのバリアントを細胞のゲノム中の標的配列に標的化させ、標的配列中の1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び/又は付加をもたらすことができる、システムを提供する。
5'-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGAACGCTCGCTCAGTGTTCTGACGTCGGATCACTGAGCGAGCGATCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3';
5'-AACTGTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGAACGCTCGCTCAGTGTTCTGACGTCGGATCACTGAGCGAGCGATCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3';
5'-CTGTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGAACGCTCGCTCAGTGTTCTGACGTCGGATCACTGAGCGAGCGATCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3';
5'-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGAACGCTCGCTCAGTGTTATCACTGAGCGAGCGATCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3';
5'-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGAACGATCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3';
5'-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3';
5'-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAGCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3';
5'-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAACTGAGAAGTGGCAC-Nx-3';
5'-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAGCGAGAAGTGGCAC-Nx-3';
5'-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTAAGCAGAAGTGGCAC-Nx-3'; 及び
5'-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCAAGCGAAGTGGCAC-Nx-3'
(Nxは、x個の連続するヌクレオチドからなるヌクレオチド配列(スペーサー配列)を表し、Nは、独立して、A、G、C及びTから選択され; xは、18≦x≦35の整数であり、好ましくは、x=20である)からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、配列Nx(スペーサー配列)は、標的配列の相補体に特異的にハイブリダイズすることができる。Nxを除くsgRNA中の配列は、sgRNAの足場配列である。
i) ヌクレアーゼ不活性C2c1タンパク質、若しくはヌクレアーゼ不活性C2c1タンパク質と転写リプレッサータンパク質の融合タンパク質、及びガイドRNA;
ii) ヌクレアーゼ不活性C2c1タンパク質若しくはヌクレアーゼ不活性C2c1タンパク質と転写リプレッサータンパク質の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNA;
iii) ヌクレアーゼ不活性C2c1タンパク質若しくはヌクレアーゼ不活性C2c1タンパク質と転写リプレッサータンパク質の融合タンパク質、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物;
iv) ヌクレアーゼ不活性C2c1タンパク質若しくはヌクレアーゼ不活性C2c1タンパク質と転写リプレッサータンパク質の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物; 又は
v) ヌクレアーゼ不活性C2c1タンパク質若しくはヌクレアーゼ不活性C2c1タンパク質と転写リプレッサータンパク質の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物
のうちの1つを含む、遺伝子抑制又はサイレンシングシステムである。
i) ヌクレアーゼ不活性C2c1タンパク質と転写アクチベータータンパク質の融合タンパク質、及びガイドRNA;
ii) ヌクレアーゼ不活性C2c1タンパク質と転写アクチベータータンパク質の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNA;
iii) ヌクレアーゼ不活性C2c1タンパク質と転写アクチベータータンパク質の融合タンパク質、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物;
iv) ヌクレアーゼ不活性C2c1タンパク質と転写アクチベータータンパク質の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物; 又は
v) ヌクレアーゼ不活性C2c1タンパク質と転写アクチベータータンパク質の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物
のうちの1つを含んでもよい。
DNA操作
DNAの調製、消化、ライゲーション、増幅、精製、アガロースゲル電気泳動などを含むDNA操作は、Molecular Cloning: A Laboratory Manualに従って(いくつかの改変を加えて)実施した。
PSI-BLASTプログラムによって同定された新しいV-B型CRISPR-C2c1タンパク質コード配列を、ヒト化(コドン最適化)し、全長を合成した。pCAG-2AeGFPベクター及びBPK2014-ccdBベクターを、それぞれC2c1哺乳動物細胞発現及び大腸菌(E. coli)発現に適用した。ガイドRNAを、哺乳動物細胞発現用のpUC19-U6ベクター中に構築した。
合成C2c1コード配列を、ライゲーション依存性クローニングを使用してBPK2014-ccdB発現ベクター中に構築した。得られた融合構築物は、C末端に融合したHis10タグを含有した。CmR+LB培地中で37℃でOD600 約0.4まで増殖させ、その後0.5mM IPTGによって16℃で16時間誘導して、大腸菌株BL21(λDE3)(Transgen Biotech)中でタンパク質を発現させた。300mLの誘導細胞を、タンパク質精製のために回収し、その後の全てのステップは4℃で実施した。細胞ペレットを、1×プロテアーゼ阻害剤(Rocheコンプリート(complete)、EDTAフリー)を補充した30mLの溶解バッファー(NPI-10: 50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mMイミダゾール、5%グリセロール、pH8.0)中で溶解させ、その後、超音波処理により溶解させた。溶解物を、8,000rpmで4℃で10分間の遠心分離により清澄化し、上清をHis60 Ni Superflow Resin(Takara)と共にバッチで4℃で2時間インキュベートした。それぞれ20mLの洗浄バッファー1(NPI-20: 50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mMイミダゾール、5%グリセロール、pH8.0)、洗浄バッファー2(NPI-40: 50mM NaH2PO4、300mM NaCl、40mMイミダゾール、5%グリセロール、pH8.0)及び洗浄バッファー3(NPI-100: 50mM NaH2PO4、300mM NaCl、100mMイミダゾール、5%グリセロール、pH8.0)で樹脂を非常によく洗浄した後、発現したタンパク質を、5mLの溶出バッファー(NPI-300: 50mM NaH2PO4、300mM NaCl、300mMイミダゾール、5%グリセロール、pH8.0)で溶出した。精製されたC2c1タンパク質を、保存バッファー(Tris-HCl、pH8.0、200mM KCl、0.1mM EDTA pH8.0、1mM DTT、20%グリセロール)を用いて100kDa透析器を使用して一晩透析した。画分をプールし、100kDa遠心分離フィルターユニット(Centrifugal Filter Unit)(Millipore)で濃縮した。富化されたタンパク質の純度を、SDS-PAGE及びクマシー染色によって分析し、濃度を、BCAタンパク質アッセイキット(BCA Protein Assay Kit)(Thermo Fisher)を使用して定量した。
RNAは、HiSribe(商標)T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit(NEB)、及びT7プロモーター配列を持つPCR増幅したDNA鋳型を使用して、in vitroで転写した。転写されたRNAは、Oligo Clean & Concentrator(商標)(ZYMO Research)を使用して精製し、NanoDrop(商標)2000(Thermo Fisher)で定量した。
AaC2c1のPAM配列を決定するために、100nM AaC2c1タンパク質、400ngのin vitro転写されたsgRNA、及び様々なPAM配列(表1)を持つPCR生成された二本鎖DNA(dsDNA) 200ngを、開裂バッファー(50mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mM MgCl2、pH8.0)中で37℃で1時間インキュベートした。RNase Aを添加してsgRNAを37℃で20分間消化し、続いてRNase Aを75℃で5分間不活性化することによって反応を停止し、約3%アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色によって分離した。
dsDNA開裂アッセイのため、100nM C2c1タンパク質、400ngのin vitro転写されたsgRNA、及び5'TTTN-PAM配列を含有するPCR生成された二本鎖DNA(dsDNA) 200ngを、開裂バッファー(50mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mM MgCl2、pH8.0)中で37℃で1時間インキュベートした(指定されない場合)。
ヒト胎児腎臓(HEK)細胞株HK293Tを、10%ウシ胎児血清及び1%抗生物質-抗真菌剤(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle's Medium、DMEM)中で37℃で5%CO2インキュベーションで維持した。マウスエピブラスト幹細胞(EpiSC)株を、アクチビンA(20ng/ml、R&D)及びFGF2(12.5ng/ml、R&D)を含むN2B27培地中でフィブロネクチン上で維持した。HK293T又はEpiSC細胞を、トランスフェクションの1日前に24ウェルプレート(Corning)に播種した。リポフェクタミン(Lipofectamine)LTX(Invitrogen)を使用して、製造業者の推奨プロトコールに従って、細胞をトランスフェクトした。24ウェルプレートの各ウェルについて、合計750ngのプラスミドを使用した。次いで、トランスフェクションの48時間後、MoFlo XDP(Beckman Coulter)を使用してGFP陽性細胞を選別した。
プラスミドDNAを48時間トランスフェクションした後、回収又はFACS選別したGFP陽性HK293T又はEpiSC細胞を、ゲノムDNA抽出に供した。簡単に述べると、細胞を、バッファーL(Bimake)で直接溶解し、55℃で3時間、及び95℃で10分間インキュベートした。各遺伝子についてCRISPR-C2c1標的部位を取り囲むゲノム領域をPCR増幅した。200〜400ngのPCR産物を、最終体積10μLまでのddH2Oと混合し、以前の方法に従ってヘテロ二重鎖形成を可能にするために再アニーリングプロセスに供した。再アニーリング後、生成物を1/10容量のNEBuffer(商標)2.1及び0.2μLのT7EI(NEB)で37℃で30分間処理し、3%アガロースゲル上で分析した。インデル(indel)を、相対バンド強度に基づいて定量した。
V-B型CRISPR-C2c1システムは、哺乳動物ゲノムを編集するために利用されてきていないため、オフターゲットを予測する指針はない。図7の一次データは、シード領域が、スペーサー配列の5'末端の最初の17ヌクレオチド(nt)であり得るといういくらかの参考を提供する。なぜならば、スペーサーが18ntまでトランケート(末端切り詰め)された場合に、最小のオフターゲット開裂活性が検出されたためである。スペーサー配列の5'末端の7番目のミスマッチは、オフターゲットに耐性であるため、ヒトゲノムを、5'TTN-PAM配列を含有する5'末端の14ntシード配列で検索した。14ntシード配列の1つのミスマッチ又は2つの不連続ミスマッチがなお含まれていた。T7EIアッセイを適用して、オフターゲットが存在するかどうかを確認した。
所望の部位特異的変異及び5'末端オーバーラップを含有する2対のプライマーを遺伝子増幅に使用した。2つのアガロースゲル精製遺伝子断片を、NEBuilder(登録商標)HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB)を使用して、製造業者の推奨プロトコールに従って、XmaI及びNheI二重消化哺乳動物発現ベクターに構築した。そして、大腸菌発現ベクターを、消化及びライゲーションに依存した方法を使用して再構築した。
第一に、本発明のA.アシディフィラス(A. acidiphilus)由来のC2c1のPAM配列を、in vitro核酸開裂によって同定した。図1Aは、AaC2c1、及び様々なPAMを持つ座位を標的化するsgRNAを使用した開裂を示す。図の下の記号「+」は、in vitroでの強力な開裂活性を示す。結果は、AaC2c1のPAMが、5'TTTN-、5'ATTN-、5'GTTN-、5'CTTN-、5'TTC-、5'TTG-、5'TTA-、5'TTT-、5'TAN-、5'TGN-、5'TCN-、5'ATC-であり得ることを示す。
この実施例は、哺乳動物細胞におけるAaC2c1のゲノム編集活性を検出する。使用した標的配列を以下の表3に示す。
この実施例は、AaC2c1をゲノム編集に向かわせる単一ガイドRNA(sgRNA)を最適化する。元のsgRNAは、AaC2c1座位中のtracrRNA及びA.アシドテレストリスの推定crRNAに基づいて構築されたsgRNA1である。
図7Aの実験結果は、in vivoでのAaC2c1標的化活性に対するプロトスペーサー長の影響を示す。結果は、18ヌクレオチド未満のプロトスペーサー配列が効率的な開裂を達成できたことを示す。
図9Aは、触媒残基変異を有するAaC2c1ドメイン構造の概略図である。触媒残基は、A.アシドテレストリスC2c1(AacC2c1)(PDB:5WQE)との配列相同性に基づいて同定された。
Claims (15)
- 以下のi)〜v):
i) C2c1タンパク質若しくはそのバリアント、及びガイドRNA;
ii) C2c1タンパク質若しくはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNA;
iii) C2c1タンパク質若しくはそのバリアント、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物;
iv) C2c1タンパク質若しくはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物;
v) C2c1タンパク質若しくはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列及びガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物
のうちの少なくとも1つを含む、細胞のゲノム中の標的配列の部位特異的改変のためのゲノム編集システムであって、
ガイドRNAは、C2c1タンパク質又はそのバリアントと複合体を形成し、C2c1タンパク質又はそのバリアントを細胞のゲノム中の標的配列に標的化させ、標的配列中の1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び/又は付加をもたらすことができ、C2c1タンパク質は、アリサイクロバチルス・アシディフィラス(Alicyclobacillus acidiphilus)に由来するAaC2c1タンパク質である、システム。 - AaC2c1タンパク質が、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むか、又はAaC2c1タンパク質のバリアントが、配列番号1と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ野生型AaC2c1タンパク質のRNA媒介DNA結合活性及び/又はDNA開裂活性を有する、請求項1に記載のシステム。
- AaC2c1タンパク質のバリアントが、ヌクレアーゼ不活性AaC2c1とデアミナーゼの融合タンパク質であり、デアミナーゼは、例えば、基質として一本鎖DNAを受け入れることができるシトシンデアミナーゼ又は基質として一本鎖DNAを受け入れることができるアデニンデアミナーゼである、請求項1に記載のシステム。
- ヌクレアーゼ不活性AaC2c1中の野生型AaC2c1タンパク質の785位に対応するアミノ酸が置換されている、請求項2又は3に記載のシステム。
- ヌクレアーゼ不活性AaC2c1が、野生型AaC2c1タンパク質と比較してアミノ酸置換R785Aを含む、請求項4に記載のシステム。
- ガイドRNAが、sgRNAである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のシステム。
- sgRNAが、以下:
5'-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGAACGCTCGCTCAGTGTTCTGACGTCGGATCACTGAGCGAGCGATCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3';
5'-AACTGTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGAACGCTCGCTCAGTGTTCTGACGTCGGATCACTGAGCGAGCGATCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3';
5'-CTGTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGAACGCTCGCTCAGTGTTCTGACGTCGGATCACTGAGCGAGCGATCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3';
5'-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGAACGCTCGCTCAGTGTTATCACTGAGCGAGCGATCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3';
5'-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGAACGATCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3';
5'-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAAAGCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3';
5'-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAGCTGAGAAGTGGCAC-Nx-3';
5'-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAAACTGAGAAGTGGCAC-Nx-3';
5'-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTCAAGCGAGAAGTGGCAC-Nx-3';
5'-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCTAAGCAGAAGTGGCAC-Nx-3'; 及び
5'-GTCTAAAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCACTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAACTTCAAGCGAAGTGGCAC-Nx-3'
(Nxは、標的配列の相補体に特異的にハイブリダイズすることができる、x個の連続するヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表し、Nは、独立して、A、G、C及びTから選択され; xは、18≦x≦35の整数であり、好ましくは、x=20である)からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項6に記載のシステム。 - 細胞のゲノム中の標的配列を部位特異的に改変する方法であって、請求項1〜7のいずれか一項に記載のシステムを細胞に導入するステップを含む、方法。
- 細胞が、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ネコ; 家禽、例えばニワトリ、アヒル、ガチョウ; 単子葉植物及び双子葉植物を含む植物、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、オオムギ、ダイズ、ピーナッツ及びシロイヌナズナ(Arabidopsis)などに由来する、請求項8に記載の方法。
- 前記システムが、リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、ウイルス感染(例えば、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス及び他のウイルス)、遺伝子銃法、PEG媒介プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウム媒介形質転換から選択される方法によって細胞に導入される、請求項8又は9に記載の方法。
- 疾患の治療を必要とする対象においてその疾患を治療する方法であって、対象に、有効量の、請求項1〜7のいずれか一項に記載のゲノム編集システムを送達して、対象において疾患に関連する遺伝子を改変するステップを含む、方法。
- 疾患の治療を必要とする対象においてその疾患を治療するための医薬組成物の製造のための、請求項1〜7のいずれか一項に記載のゲノム編集システムの使用であって、ゲノム編集システムは、対象において疾患に関連する遺伝子を改変するためのものである、使用。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のゲノム編集システム及び薬学的に許容される担体を含む、疾患の治療を必要とする対象においてその疾患を治療するための医薬組成物であって、ゲノム編集システムは、対象において疾患に関連する遺伝子を改変するためのものである、医薬組成物。
- 対象が、哺乳動物、例えばヒトである、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法、使用又は医薬組成物。
- 疾患が、腫瘍、炎症、パーキンソン病、心血管疾患、アルツハイマー病、自閉症、薬物中毒、加齢黄斑変性、統合失調症、及び遺伝性疾患から選択される、請求項14に記載の方法、使用又は医薬組成物。
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