JP2021502816A - δ３γδＴ細胞集団の選択的増殖方法及びその組成物 - Google Patents

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Abstract

本願は、δ３γδＴＣＲに特有のエピトープに結合する薬剤を対象とする。かかる薬剤は、抗体またはその断片であり得るが、これらに限定されない。本明細書ではまた、例えば、δ３γδＴ細胞を増殖させるかまたは選択的に増殖させるための、該薬剤の使用方法も記載される。本明細書ではまた、処置を必要とする対象の処置のための、増殖させたδ３γδＴ細胞の使用方法も記載される。【選択図】図１１

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１１月１５日に出願された米国仮出願第６２／５８６，７８２号の優先権の利益を主張するものであり、この出願の内容はその全体が全目的でこれをもって援用される。
Ｔリンパ球による抗原認識は、多様性に富むヘテロ二量体受容体であるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって達成され得る。血液及びリンパ器官中のヒトＴ細胞のおよそ９５％が、ヘテロ二量体αβＴＣＲ受容体（αβＴ細胞系列）を発現する。血液及びリンパ器官中のヒトＴ細胞のおよそ５％が、ヘテロ二量体γδＴＣＲ受容体（γδＴ細胞系列）を発現する。これらのＴ細胞サブセットは、それぞれ「αβ」及び「γδ」Ｔ細胞と称されることがある。αβ及びγδＴ細胞は、機能が異なる。αβＴ細胞の活性化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）がＭＨＣクラスＩ／ＩＩの関連で抗原を提示するときに次いで起こる。αβＴ細胞とは対照的に、γδＴ細胞は、ＭＨＣ拘束性から独立して抗原を認識することができる。加えて、γδＴ細胞は、自然免疫及び養子（ａｄｏｐｔｉｖｅ）免疫による認識及び応答の両方を併せ持つ。
γδＴ細胞は、体細胞で再構成された別個の可変（Ｖ）遺伝子、多様性（Ｄ）遺伝子、結合（Ｊ）遺伝子、及び定常（Ｃ）遺伝子の組を利用する。γδＴ細胞は、αβＴ細胞よりも少ないＶ、Ｄ、及びＪセグメントを含有する。生殖細胞系のＶγ及びＶδ遺伝子の数は、Ｖα及びＶβＴＣＲ遺伝子のレパートリーよりも限定されるが、ＴＣＲのγ及びδ鎖の再構成中の接合部の多様化プロセスがより大規模であることから、可能性のあるγδＴＣＲのレパートリーはαβＴＣＲのそれよりも広くなる（Ｃａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｅｇａｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００２）２：３３６）。
ヒトγδＴ細胞は、３つの主要なＶδ（Ｖδ１、Ｖδ２、Ｖδ３）領域遺伝子及び多くて６つのＶγ領域遺伝子を使用して、それらのＴＣＲを作る（Ｈａｙｄａｙ ＡＣ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１８，９７５−１０２６）。２つの主要なＶδサブセットは、Ｖδ１γδＴ細胞及びＶδ２γδＴ細胞である。様々なＶγを有するＶδ１Ｔ細胞は、粘膜γδＴ細胞の上皮内サブセットの多数を占め、そこにおいてＴＣＲは、上皮細胞上のストレス分子を認識するようである（Ｂｅａｇｌｅｙ ＫＷ，Ｈｕｓｂａｎｄ ＡＪ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１８（３）：２３７−２５４）。一般にＶγ９を共発現するＶδ２Ｔ細胞は、末梢血及びリンパ系に豊富に存在する。
病的細胞上の抗原を直接認識し、腫瘍細胞を殺傷する本来備わっている能力を示すγδＴ細胞の能力のため、γδＴ細胞は魅力的な治療ツールとなっている。Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の養子移入は、がんの研究的処置において限定された臨床的奏効（ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）をもたらしており（Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，１０：８４２− ８５６，２００８、Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ，６０：１４４７−１４６０，２０１１、Ｎａｇａｍｉｎｅ ｅｔ ａｌ ，２００９、Ｎｉｃｏｌ ｅｔ ａｌ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，１０５：７７８−７８６，２０１１、Ｗｉｌｈｅｌｍ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．２００３ Ｊｕｌ １；１０２（１）：２００−６）、新たなγδＴ細胞集団を単離し、臨床的に試験する必要性が示唆される。
強力な抗腫瘍活性を有するγδＴ細胞サブセット集団を、改善された純度かつ臨床的に意義のあるレベルで選択的に増殖させる能力が、非常に望ましい。より多様なγδＴ細胞の組を増やすために抗体及びサイトカインのカクテルが使用されてきたが、特定のγδＴ細胞サブセットを十分な純度及び臨床的に意義のあるレベルにまで活性化させることは、達成されなかった（Ｄｏｋｏｕｈａｋｉ ｅｔ ａｌ，２０１０、Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ，２００９、Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ，２０００、Ｋｒｅｓｓ，２００６）。したがって、特定のγδＴ細胞サブセットをエクスビボで増殖させる臨床的に意義のある方法、及びそれによって生産された細胞が大いに必要とされている。
本発明は、一態様では、濃縮γδＴ細胞集団を生産するためのエクスビボ方法を提供する。濃縮γδＴ細胞集団は、混合細胞集団またはその精製画分を、δ３ＴＣＲに特有のエピトープに結合することによってδ３Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つまたは複数の薬剤と接触させることを含む方法によって、単離された混合細胞集団から生産することができる。増殖させたＴ細胞集団は、処置方法において、例えば、個々にまたは他のＴ細胞集団と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することによって使用することができる。一部の実例では、該薬剤は、抗体またはその断片である。
第１の態様では、本発明は、δ３γδＴＣＲに特有のエピトープに選択的に結合する薬剤を提供する。一部の実施形態では、該薬剤は、抗体またはその断片である。一部の実施形態では、該薬剤は、δ３γδＴＣＲに特有の活性化エピトープに選択的に結合する活性化剤である。
一部の実施形態では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、δ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体と同じエピトープ、または本質的に同じエピトープに結合する（または該抗体と競合する）。一部の実施形態では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、δ３−０８、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体と同じエピトープ、または本質的に同じエピトープに結合する（または該抗体と競合する）。一部の実施形態では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、δ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体の相補性決定領域を含む。一部の実施形態では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、δ３−０８、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体の相補性決定領域を含む。
一部の実施形態では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、抗体δ３−２３、δ３−４２、及び／またはδ３−５８の、δ３ＴＣＲ（例えば、γ２δ３ＴＣＲ）への結合と競合する。一部の実施形態では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、抗体δ３−０８の、δ３ＴＣＲ（例えば、γ２δ３ＴＣＲ）への結合と競合する。一部の実施形態では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、抗体δ３−０８、δ３−２３、δ３−４２、及び／またはδ３−５８の、δ３ＴＣＲ（例えば、γ２δ３ＴＣＲ）への結合と競合する。一部の実施形態では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、抗体δ３−３１の、δ３ＴＣＲ（例えば、γ２δ３ＴＣＲ）への結合と競合する。
一部の実施形態では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、γδＴ細胞及びαβＴ細胞を含む混合細胞集団中で、αβＴ細胞と比較してδ３γδＴ細胞を選択的に増殖させる。一部の実施形態では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、δ３γδＴＣＲに結合するものである。一部の実施形態では、δ３γδＴＣＲは、操作型δ３γδＴ細胞の表面上で発現される。一部の実施形態では、δ３γδＴＣＲは、選択的に増殖させた非操作型δ３γδＴ細胞等の、非操作型δ３γδＴ細胞の表面上で発現される。一部の実施形態では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、δ３γδＴ細胞の表面上で発現されるδ３γδＴＣＲに結合するものである。一部の実例では、δ３γδＴ細胞の表面上で発現されるδ３γδＴＣＲに結合した該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、δ３γδＴ細胞と単離された複合体を形成するか、対象内にあるか、エクスビボもしくはインビトロ培養物中にあるか、または容器中にある。一部の実施形態では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、エクスビボ増殖培養物中で、δ３γδＴ細胞の表面上で発現されるδ３γδＴＣＲに結合するものである。
一部の実施形態では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞外表面に結合するものである。一部の実施形態では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、ＡＰＣの膜において係留される。一部の実施形態では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）のＦｃ領域が、ＡＰＣにより発現されるＦｃ受容体に結合するものである。一部の実例では、ＡＰＣは、人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である。一部の実例では、ＡＰＣは、対象内にあるか、単離されているか、エクスビボもしくはインビトロ培養物中にあるか、または容器中にある。
一部の実例では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、Ｖδ３のγ鎖結合境界面から遠位の領域に結合する。一部の実例では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、ＩＭＧＴ命名法によるγδＴＣＲのＶδ３のβストランドＤ及びＥに結合する。一部の実例では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、ＩＭＧＴ命名法によるγδＴＣＲのＶδ３のβストランドＣ’’及びＤならびにβストランドＥとＦとの間のループに結合する。一部の実例では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、ＩＭＧＴ命名法によるγδＴＣＲのＶδ３のβストランドＡ、Ｂ、Ｄ、及びＥに結合する。
一部の実例では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、Ｖδ３のアミノ酸Ｋ７９及びＨ８８（ＩＭＧＴ命名法）に結合する。一部の実例では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、Ｖδ３のアミノ酸Ｒ７５及びＲ９５（ＩＭＧＴ命名法）に結合する。一部の実例では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、Ｖδ３のアミノ酸Ｋ７９、Ｅ１８、及びＨ８８（ＩＭＧＴ命名法）に結合する。一部の実例では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、Ｖδ３のアミノ酸Ｅ６７、Ｄ７０、Ｒ７５、Ｒ９５、及びＥ９７（ＩＭＧＴ命名法）に結合する。一部の実例では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、Ｖδ３のアミノ酸Ｋ３、Ｋ７９、及びＨ８８（ＩＭＧＴ命名法）に結合する。一部の実例では、該薬剤（例えば、抗体またはその断片）は、Ｖδ３のアミノ酸Ｋ７９、Ｌ８２、及びＨ８８（ＩＭＧＴ命名法）に結合する。典型的には、該薬剤は、Ｖδ３γδＴ細胞の表面上で発現されるＶδ３γδＴＣＲ等のＶδ３γδＴＣＲの関連において、指定のアミノ酸またはそれらの基に結合する。
第２の態様では、本発明は、上述の薬剤（例えば、抗体またはその断片）のうちのいずれか１つをコードする核酸を提供する。一部の実例では、核酸は、異種プロモーターに作動可能に連結されている。第３の態様では、本発明は、上述の薬剤のうちのいずれか１つまたは上述の核酸のうちのいずれか１つを含む、宿主細胞を提供する。一部の実例では、宿主細胞は、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）である。
第４の態様では、本発明は、δ３γδＴＣＲに特有のエピトープに結合する薬剤（例えば、抗体またはその断片）の作製方法を提供し、該方法は、抗体またはその断片を産生させるのに十分な条件下で上述の宿主細胞のうちのいずれか１つを培養することを含む。
第５の態様では、本発明は、γδＴ細胞を含む第１の細胞集団を、上述の薬剤（例えば、抗体またはその断片）のうちの１つまたは複数と接触させることを含む、濃縮γδＴ細胞集団を生産するためのエクスビボ方法を提供する。一部の実施形態では、第１の細胞集団は、αβＴ細胞及びγδＴ細胞（例えば、δ３γδＴ細胞）を含む単離された混合細胞集団である。一部の実施形態では、第１の細胞集団は、末梢血試料、白血球アフェレーシス試料、臍帯血試料、腫瘍試料、または組織試料から選択される。一部の実例では、第１の細胞集団は、単一ドナーから単離された試料である。一部の実例では、第１の細胞集団は、複数ドナーから単離された試料である。一部の実例では、第１の細胞集団は、ＰＢＭＣ試料である。一部の実例では、第１の細胞集団は、単一ドナーから単離されたＰＢＭＣの試料である。一部の実例では、第１の細胞集団は、複数ドナーから単離されたＰＢＭＣの試料である。
一部の実施形態では、該方法は、単離された混合細胞集団を、上述の薬剤（例えば、抗体またはその断片）のうちの１つまたは複数と直接接触させることを含む。一部の実施形態では、第１の細胞集団は、１つまたは複数の操作型γδＴ細胞を含む集団である。一部の実施形態では、第１の細胞集団は、増殖させたγδＴ細胞の第１の集団である。一部の実施形態では、該方法は、第１のγδＴ細胞増殖及び第２のγδＴ細胞増殖を含む。一部の実施形態では、該方法は、少なくとも１０８個のδ３γδＴ細胞を含む濃縮γδＴ細胞集団を生産することを含む。一部の実施形態では、少なくとも１０８個のδ３γδＴ細胞を含む濃縮γδＴ細胞集団は、１２〜２１日以内に生産される。一部の実施形態では、該方法は、第１の細胞集団中でγδＴ細胞を少なくとも１，０００倍増殖させることを含む。一部の実施形態では、少なくとも１，０００倍の増殖は、１２〜２１日以内に達成される。
第６の態様では、本発明は、ａ）γδＴ細胞を含む第１の細胞集団を、γδＴ細胞を活性化させ、増殖させる１つまたは複数の第１の活性化剤と接触させて、それによって、増殖させた第１のγδＴ細胞集団を生産することと、ｂ）増殖させた第１のγδＴ細胞集団を、γδＴ細胞を活性化させ、増殖させる１つまたは複数の第２の活性化剤と接触させて、それによって、濃縮γδＴ細胞集団を生産することと、を含み、１つもしくは複数の第１の活性化剤のうちの少なくとも１つまたは１つもしくは複数の第２の活性化剤のうちの少なくとも１つが、第１の態様による薬剤（例えば、抗体またはその断片）である、濃縮γδＴ細胞集団を生産するためのエクスビボ方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は、ａ）の後かつｂ）の前に、増殖させた第１のγδＴ細胞集団を単離することを含む。一部の実施形態では、ａ）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び１つまたは複数の第１の活性化剤の存在下で第１の細胞集団を培養することを含む。一部の実施形態では、ｂ）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び１つまたは複数の第２の活性化剤の存在下で、活性化させたγδＴ細胞集団を培養することを含む。
一部の実施形態では、第１の細胞集団は、αβＴ細胞及びγδＴ細胞を含む単離された混合細胞集団である。一部の実施形態では、第１の細胞集団は、末梢血試料、白血球アフェレーシス試料、臍帯血試料、腫瘍試料、または組織試料から選択される。一部の実施形態では、第１の細胞集団は、操作型γδＴ細胞の集団である。一部の実施形態では、該方法は、増殖させた第１のγδＴ細胞集団を遺伝子改変すること、または濃縮γδＴ細胞集団を遺伝子改変することを含む。一部の実施形態では、該方法は、少なくとも１０８個のδ３γδＴ細胞を含む濃縮γδＴ細胞集団を生産することを含む。一部の実施形態では、少なくとも１０８個のδ３γδＴ細胞を含む濃縮γδＴ細胞集団は、１２〜２１日以内に生産される。
一部の実施形態では、該方法は、第１の細胞集団中でγδＴ細胞を少なくとも１，０００倍増殖させることを含む。一部の実施形態では、少なくとも１，０００倍の増殖は、１２〜２１日以内に達成される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の第１の活性化剤のうちの少なくとも１つは、１つまたは複数の第２の活性化剤のうちの少なくとも１つと構造的に同一である。一部の実施形態では、１つまたは複数の第１の活性化剤のうちの少なくとも１つは、１つまたは複数の第２の活性化剤のうちの少なくとも１つとは構造的に異なる。一部の実施形態では、１つもしくは複数の第１の活性化剤のうちの少なくとも１つまたは１つもしくは複数の第２の活性化剤のうちの少なくとも１つは、固定化されている。一部の実施形態では、固定化された活性化剤は、培養容器の表面上に固定化されている。一部の実施形態では、固定化された活性化剤は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に固定化されている。一部の実施形態では、固定化された活性化剤は、δ３γδＴＣＲに特有のエピトープに結合する薬剤（例えば、抗体またはその断片）である。
第７の態様では、本発明は、増殖させたγδＴ細胞集団（例えば、δ３γδＴ細胞に関する正または負の選択の前）を提供し、ここで、増殖させたγδＴ細胞の１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、７５％超、または８０％超が、δ３γδＴ細胞である。一部の実施形態では、増殖させたγδＴ細胞の１０％〜８０％が、δ３γδＴ細胞である（例えば、δ３γδＴ細胞に関する正または負の選択の前）。一部の実施形態では、増殖させたγδＴ細胞の１０％〜６０％が、δ３γδＴ細胞である（例えば、δ３γδＴ細胞に関する正または負の選択の前）。一部の実施形態では、増殖させたγδＴ細胞の１０％〜４０％が、δ３γδＴ細胞である（例えば、δ３γδＴ細胞に関する正または負の選択の前）。一部の実施形態では、増殖させたγδＴ細胞の２０％〜８０％が、δ３γδＴ細胞である（例えば、δ３γδＴ細胞に関する正または負の選択の前）。一部の実施形態では、増殖させたγδＴ細胞の２０％〜６０％が、δ３γδＴ細胞である（例えば、δ３γδＴ細胞に関する正または負の選択の前）。一部の実施形態では、増殖させたγδＴ細胞の２０％〜５０％が、δ３γδＴ細胞である（例えば、δ３γδＴ細胞に関する正または負の選択の前）。一部の実施形態では、増殖させたγδＴ細胞の２０％〜４０％が、δ３γδＴ細胞である（例えば、δ３γδＴ細胞に関する正または負の選択の前）。
一部の実施形態では、増殖させたγδＴ細胞集団は、ポリクローン性のＴＣＲ多様性を含む。一部の実施形態では、増殖させたγδＴ細胞集団中のδ３γδＴ細胞の３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、または７０％超が、表現型ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ２７＋及び／またはＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ２７＋を発現する。一部の実施形態では、増殖させたγδＴ細胞集団中のδ３γδＴ細胞の２０％〜７０％が、表現型ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ２７＋及び／またはＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ２７＋を発現する。一部の実施形態では、増殖させたγδＴ細胞集団中のδ１−／δ２−γδＴ細胞の３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、または７０％超が、表現型ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ２７＋及び／またはＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ２７＋を発現する。一部の実施形態では、増殖させたγδＴ細胞集団中のδ１−／δ２−γδＴ細胞の２０％〜７０％が、表現型ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ２７＋及び／またはＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ２７＋を発現する。
一部の実施形態では、増殖させたγδＴ細胞集団は、皮膚等の組織に由来する。一部の実施形態では、増殖させたγδＴ細胞集団は、腫瘍浸潤リンパ球に由来する。一部の実施形態では、増殖させたγδＴ細胞集団は、内因性または異種腫瘍認識部分を発現するγδＴ細胞を含む。一部の実施形態では、該集団は、治療上有効量（例えば、＞１０８）のγδＴ細胞を含む。一部の実施形態では、γδＴ細胞集団は、ＮＫｐ３０活性、ＮＫｐ４４活性、及び／またはＮＫｐ４６活性から独立した抗腫瘍細胞傷害性を含む。一部の実施形態では、γδＴ細胞集団は、ＮＫｐ３０活性依存性の抗腫瘍細胞傷害性、ＮＫｐ４４活性依存性の抗腫瘍細胞傷害性、及び／またはＮＫｐ４６活性依存性の抗腫瘍細胞傷害性を含まない。一部の実施形態では、γδＴ細胞の４０％未満が、検出可能なレベルのＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、及び／またはＮＫｐ４６を（例えば、タンパク質またはｍＲＮＡとして）発現する。
第８の態様では、本発明は、上述の方法のうちのいずれか１つによって生産される、増殖させたγδＴ細胞集団を提供する。第９の態様では、本発明は、がん、炎症性疾患、または自己免疫疾患の処置を必要とする対象における、がん、炎症性疾患、または自己免疫疾患の処置方法を提供し、該方法は、治療上有効量のδ３γδＴ細胞を対象に投与すること、治療上有効量の、δ３γδＴ細胞が濃縮されたγδＴ細胞集団を対象に投与すること、または治療上有効量の、本明細書に記載される方法によって得られたγδＴ細胞集団を対象に投与することを含む。
第１０の態様では、本発明は、がん、炎症性疾患、または自己免疫疾患の処置を必要とする対象における、がん、炎症性疾患、または自己免疫疾患の処置方法を提供し、該方法は、ａ）上述の増殖させたγδＴ細胞集団のうちのいずれか１つまたは複数から単離された、治療上有効量のδ３γδＴ細胞を用意することと、治療上有効量のδ３γδＴ細胞を対象に投与することと、を含む。一部の実施形態では、該方法は、増殖させたγδＴ細胞集団を増殖させた異なるγδＴ細胞集団と混和して、混和集団を形成することと、混和集団を対象に投与することと、をさらに含む。
一部の実施形態では、増殖させた異なるγδＴ細胞集団は、ある量の増殖させたδ１γδＴ細胞、及び／またはある量の増殖させたδ２γδＴ細胞を含む。一部の実施形態では、増殖させた異なるγδＴ細胞集団は、＞５％のδ１（例えば、＞１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のδ１）γδＴ細胞、または＞５％のδ２（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のδ２）γδＴ細胞を含む。一部の実施形態では、増殖させた異なるγδＴ細胞集団は、約（または少なくとも約）６０％〜約９０％のδ１γδＴ細胞、または約（または少なくとも約）６０％〜約８０％のδ１γδＴ細胞を含む。一部の実施形態では、増殖させた異なるγδＴ細胞集団は、約（または少なくとも約）６０％〜約９０％のδ２γδＴ細胞、約（または少なくとも約）７０％〜約８０％のδ２γδＴ細胞、または約（または少なくとも約）８０％〜約９０％のδ２γδＴ細胞を含む。
一部の実施形態では、混和γδＴ細胞集団は、ある量のδ１γδＴ細胞、及び／またはある量のδ２γδＴ細胞、ならびにある量のδ３γδＴ細胞を含む。一部の実施形態では、混和γδＴ細胞集団は、＞５％のδ１（例えば、＞１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のδ１）γδＴ細胞、または＞５％のδ２（例えば、＞１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のδ２）γδＴ細胞を含む。一部の実施形態では、混和γδＴ細胞集団は、＞５％のδ３（例えば、＞１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のδ３）γδＴ細胞を含む。一部の実施形態では、混和γδＴ細胞集団は、約（または少なくとも約）５％〜約９０％のδ３γδＴ細胞、約（または少なくとも約）１０％〜約９０％のδ３γδＴ細胞、約（または少なくとも約）２０％〜約９０％のδ３γδＴ細胞、約（または少なくとも約）３０％〜約９０％のδ３γδＴ細胞、約（または少なくとも約）４０％〜約９０％のδ３γδＴ細胞、約（または少なくとも約）５０％〜約９０％のδ３γδＴ細胞、約（または少なくとも約）６０％〜約９０％のδ３γδＴ細胞、約（または少なくとも約）７０％〜約９０％のδ３γδＴ細胞、または約（または少なくとも約）８０％〜約９０％のδ３γδＴ細胞を含む。
一部の実施形態では、混和γδＴ細胞集団は、約（または少なくとも約）５％〜約９０％のδ１γδＴ細胞、約（または少なくとも約）１０％〜約９０％のδ１γδＴ細胞、約（または少なくとも約）２０％〜約９０％のδ１γδＴ細胞、約（または少なくとも約）３０％〜約９０％のδ１γδＴ細胞、約（または少なくとも約）４０％〜約９０％のδ１γδＴ細胞、約（または少なくとも約）５０％〜約９０％のδ１γδＴ細胞、約（または少なくとも約）６０％〜約９０％のδ１γδＴ細胞、約（または少なくとも約）７０％〜約９０％のδ１γδＴ細胞、または約（または少なくとも約）８０％〜約９０％のδ１γδＴ細胞を含む。一部の実施形態では、混和γδＴ細胞集団は、約（または少なくとも約）５％〜約９０％のδ２γδＴ細胞、約（または少なくとも約）１０％〜約９０％のδ２γδＴ細胞、約（または少なくとも約）２０％〜約９０％のδ２γδＴ細胞、約（または少なくとも約）３０％〜約９０％のδ２γδＴ細胞、約（または少なくとも約）４０％〜約９０％のδ２γδＴ細胞、約（または少なくとも約）５０％〜約９０％のδ２γδＴ細胞、約（または少なくとも約）６０％〜約９０％のδ２γδＴ細胞、約（または少なくとも約）７０％〜約９０％のδ２γδＴ細胞、または約（または少なくとも約）８０％〜約９０％のδ２γδＴ細胞を含む。
参照による援用
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各個別の刊行物、特許、または特許出願が、明確かつ個別に参照により援用されることが示されているかのように同程度に、参照により本明細書に援用される。
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に特殊性と共に記載される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理を利用した例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、及び添付図面（また、本明細書における「図（ｆｉｇｕｒｅ）」及び「図（Ｆｉｇ．）」）を参照することによって得られる。
δ３特異的抗γδＴＣＲ抗体の可変領域配列を示す。上の配列は重鎖可変領域。下の配列は軽鎖可変領域。 対象の処置方法を概略的に示す。 対象への操作型γδＴ細胞の集団の投与方法を概略的に示す。 ２１日間の増殖培養プロトコルを用いたＶδ３γδＴ細胞の選択的増殖を例示する。増殖倍率は、２１日目に測定される。ＰＢＭＣをドナー１から単離し、示される抗体を用いて直接活性化させ、増殖させる。 ２１日間の増殖培養プロトコルを用いたＶδ３γδＴ細胞の選択的増殖を例示する。増殖倍率は、２１日目に測定される。ＰＢＭＣをドナー２から単離し、示される抗体を用いて直接活性化させ、増殖させる。 図４Ａ〜図４Ｂに例示される増殖させた細胞集団中のＶδ１−／Ｖδ２−γδＴ細胞の割合を例示する。 図４Ａ〜図４Ｂに例示される増殖させた細胞集団中のＶδ１−／Ｖδ２−γδＴ細胞の割合を例示する。 図４Ａ〜図４Ｂに例示される増殖させた細胞集団中のγδＴ細胞の表現型を例示する。示される抗体で活性化させ、増殖させた、２１日間の増殖培養後のＶδ３Ｔ細胞の表現型は、主として（＞５０％）ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ＋（ナイーブ）及びＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ−（セントラルメモリー）である。 図４Ａ〜図４Ｂに例示される増殖させた細胞集団中のγδＴ細胞の表現型を例示する。示される抗体で活性化させ、増殖させた、２１日間の増殖培養後のＶδ３Ｔ細胞の表現型は、主として（＞５０％）ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ＋（ナイーブ）及びＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ−（セントラルメモリー）である。 示されるδ３γδＴＣＲ特異的抗体の、γ２δ３ＴＣＲ−ｈＦｃ組換えタンパク質への結合に関する競合アッセイの結果を例示する。 Ｖδ３γδＴ細胞の選択的増殖を例示する。非形質導入及び抗ＣＤ２０ ＣＡＲ Ｖδ３γδＴ細胞を、およそ１０，０００倍増殖させる。Ｖδ３γδＴ細胞は、それぞれδ１、δ２、及びδ３サブタイプに特異的な抗体を用いて、δ１−、δ２−、及びδ３＋として検出される。 Ｖδ３γδＴ細胞の選択的増殖を例示する。αβＴ細胞除去の前に、Ｖδ３γδＴ細胞は、増殖させた細胞培養物の主要部分に相当する。 Ｖδ３γδＴ細胞の選択的増殖を例示する。抗ＣＤ２０ ＣＡＲ構築物が、増殖させ、形質導入されたＶδ３γδＴ細胞の表面上で発現される。 活性化させ、増殖させたＶδ３γδＴ細胞の培養物からのαβＴ細胞の除去の成功を例示する（左の細胞は抗ＣＤ２０ ＣＡＲ構築物で形質導入されており、右の細胞は形質導入されていない）。 Ｖδ１及びＶδ２（左パネル）またはＶδ３（右パネル）の表面発現を検出するために、活性化させ、増殖させ、αβＴ細胞が除去されたγδＴ細胞の集団を染色した結果を例示する。 活性化させ、増殖させたＶδ３γδＴ細胞の、ＣＤ２０＋ Ｒａｊｉ細胞に対する細胞傷害性を例示する。非形質導入Ｖδ３γδＴ細胞は、エフェクター：標的（Ｅ／Ｔ）比＞１でＣＤ２０＋ Ｒａｊｉ細胞に対してわずかな細胞傷害性、Ｅ／Ｔ比＞５で中程度の細胞傷害性を示した。抗ＣＤ２０ ＣＡＲ形質導入Ｖδ３γδＴ細胞は、０．５のＥ／Ｔ比で中程度の細胞傷害活性、Ｅ／Ｔ比＞０．７５で強力な細胞傷害活性を示した。 ＩＭＧＴ命名法により番号付けされる、Ｖδ３のアミノ酸配列を例示する。 実施例７に記載されるような変異誘発を介した微細エピトープマッピングによって同定される、抗原結合ホットスポットの３Ｄモデルの３つの異なる投影図を例示する。 図１４Ａ〜図１４Ｃは、ＩＭＧＴ Ｃｏｌｌｉｅｒ ｄｅ Ｐｅｒｌｅｓを例示し、微細エピトープマッピングによって抗原結合に寄与することが示される残基が、濃い二重丸で強調表示されている。Ａにおいて、Ｋ７９及びＨ８８は、δ３−２３、δ３−４２、及びδ３−５８の抗原結合に寄与する。Ｂにおいて、Ｅ６７及びＤ７０は、δ３−３１の抗原結合に寄与し、Ｒ７５及びＲ９５もまた、δ３−３１の抗原結合に寄与し、Ｅ６７、Ｄ７０、Ｒ７５、Ｒ９５、及びＥ９７の組み合わせは、δ３−３１及びδ３−４２の抗原結合に寄与する。Ｃにおいて、Ｅ１８は、δ３−５８の抗原結合に寄与し、Ｋ３は、δ３−０８の抗原結合に寄与する。
本発明の種々の実施形態が本明細書に示され、説明されているが、かかる実施形態が例として提供されるにすぎないことは、当業者には明白であろう。当業者には、本発明から逸脱することなく多数の変化形、変更、及び置換が想到され得る。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替例が採用されてもよいことを理解されたい。
定義
別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本明細書に記載される本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的において、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形もまた含み、その逆も同様である。記載されるいずれかの定義が、参照により本明細書に援用されるいずれかの文献と矛盾する場合には、以下に記載される定義が優先する。
本明細書で使用される「γδＴ細胞（ガンマデルタＴ細胞）」という用語は、１本のγ鎖及び１本のδ鎖で構成される別個のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であるγδＴＣＲをそれらの表面上に発現する、Ｔ細胞のサブセットを指す。「γδＴ細胞」という用語は、具体的には、限定されないが、Ｖδ３γδＴ細胞、ならびにナイーブ、エフェクターメモリー、セントラルメモリー、及び最終分化γδＴ細胞を含めた、γδＴ細胞の全てのサブセット及びそれらの組み合わせを含む。さらなる例として、「γδＴ細胞」という用語は、Ｖδ１、Ｖδ２、Ｖδ３、Ｖδ４、Ｖδ５、Ｖδ７、及びＶδ８γδＴ細胞、ならびにＶγ２、Ｖγ３、Ｖγ５、Ｖγ８、Ｖγ９、Ｖγ１０、及びＶγ１１γδＴ細胞を含む。さらなる例として、「γδＴ細胞」という用語は、Ｖδ３γ２Ｔ細胞を含み、任意選択で、Ｖδ３γ８Ｔ細胞を含み得るか、またはＶδ３γ８Ｔ細胞を指し得る。
本明細書で使用されるとき、「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ３（ＣＤ３＋）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ＋）を発現する免疫細胞を指す。Ｔ細胞は、細胞性免疫において中心的な役割を果たす。
本明細書で使用されるとき、「ＴＣＲ」または「Ｔ細胞受容体」という用語は、アルファ−ベータまたはガンマ−デルタ受容体を形成している異種二量体の細胞表面シグナル伝達タンパク質を指す。αβＴＣＲは、ＭＨＣ分子によって提示される抗原を認識するが、一方で、γδＴＣＲは、ＭＨＣ提示から独立して抗原を認識する。
「ＭＨＣ」（主要組織適合複合体）という用語は、細胞表面抗原提示タンパク質をコードする遺伝子のサブセットを指す。ヒトにおいて、これらの遺伝子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子と称される。本明細書において、略号ＭＨＣまたはＨＬＡは、互換的に使用される。
本明細書で使用されるとき、「末梢血リンパ球（複数可）」または「ＰＢＬ（複数可）」という用語は、最も広い意味で使用され、様々な分化段階及び機能的段階のＴ細胞及びＢ細胞、形質細胞、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、好塩基球、好酸球等を含めた、白血球細胞（複数可）を指す。末梢血中のＴリンパ球の範囲は、約２０〜８０％である。
本明細書で使用されるとき、「細胞集団」という用語は、好適な供給源、通常は哺乳動物からの直接の単離によって得られた多数の細胞を指す。単離された細胞集団はその後、インビトロで培養されてもよい。当業者であれば、細胞集団を単離及び培養するための種々の方法が本発明での使用に好適であり、細胞集団中の種々の数の細胞が本発明における使用に好適であることを理解しよう。細胞集団は、種々の培養技法及び／または指定の細胞型に関する負もしくは正の選択によって、均質になるまで、実質的に均質になるまで、または１つもしくは複数の細胞型（例えば、αβＴ細胞）を除去するように、精製されてもよい。細胞集団は、例えば、末梢血試料、臍帯血試料、腫瘍、幹細胞前駆体、腫瘍生検材料、組織、リンパ、皮膚、腫瘍浸潤リンパ球の試料もしくは腫瘍浸潤リンパ球を含有する試料に由来する（例えば、そこから直接単離された）、または外部環境に直接接触している対象の上皮部位からの、または幹前駆細胞に由来する、混合異種細胞集団であり得る。代替として、混合細胞集団は、末梢血試料、臍帯血試料、腫瘍、幹細胞前駆体、腫瘍生検試料、組織、リンパ、皮膚、腫瘍浸潤リンパ球の試料もしくは腫瘍浸潤リンパ球を含有する試料から樹立された、または外部環境に直接接触している対象の上皮部位からの、または幹前駆細胞に由来する、哺乳類細胞のインビトロ培養物に由来してもよい。
「濃縮」細胞集団または調製物は、出発混合細胞集団に由来する、含有する特定の細胞型のパーセンテージが出発集団中のその細胞型のパーセンテージよりも高い、細胞集団を指す。例えば、出発混合細胞集団は、特定のγδＴ細胞集団が濃縮され得る。一実施形態では、濃縮γδＴ細胞集団は、含有するδ３細胞のパーセンテージが、出発集団中のその細胞型のパーセンテージよりも高いものである。別の例として、濃縮γδＴ細胞集団は、含有するδ１細胞のパーセンテージ及びδ３細胞のパーセンテージが両方とも、出発集団中のそれらの細胞型のパーセンテージよりも高いものであり得る。なおも別の例として、濃縮γδＴ細胞集団は、含有するδ３細胞のパーセンテージ及びδ４細胞のパーセンテージが両方とも、出発集団中のそれらの細胞型のパーセンテージよりも高いものであり得る。なおも別の例として、濃縮γδＴ細胞集団は、含有するδ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞、及びδ５Ｔ細胞のパーセンテージが、出発集団中のそれらの細胞型のパーセンテージよりも高いものであり得る。別の実施形態では、濃縮γδＴ細胞集団は、含有するδ２Ｔ細胞及びδ３Ｔ細胞のパーセンテージが、出発集団中のそれらの細胞型のパーセンテージよりも高いものである。なおも別の実施形態では、濃縮γδＴ細胞集団は、含有するδ１Ｔ細胞、δ２Ｔ細胞、及びδ３Ｔ細胞のパーセンテージが、出発集団中のそれらの細胞型のパーセンテージよりも高いものである。全ての実施形態で、濃縮γδＴ細胞集団は、含有するαβＴ細胞のパーセンテージが、出発集団中のαβＴ細胞のパーセンテージよりも低いものである。
本明細書で使用される「増殖させた」とは、濃縮調製物中の所望の細胞型または標的細胞型（例えば、δ３Ｔ細胞）の数が、初期または出発細胞集団中での数よりも大きいことを意味する。「選択的に増殖させる」とは、標的細胞型（例えば、δ３Ｔ細胞）を、選択的増殖において使用される選択的活性化剤によって増殖させられない１つまたは複数の他の非標的細胞型、例えば、αβＴ細胞、ＮＫ細胞、及び／または１つもしくは複数のγδＴ細胞亜集団よりも優先的に増殖させることを意味する。ある特定の実施形態では、本発明の活性化剤は、例えば操作型または非操作型のδ３Ｔ細胞を、αβＴ細胞の増殖を伴わずに、または顕著に伴わずに選択的に増殖させる。ある特定の実施形態では、本発明の活性化剤は、例えば操作型または非操作型のδ３Ｔ細胞を、δ１Ｔ細胞の増殖を伴わずに、または顕著に伴わずに選択的に増殖させる。他の実施形態では、本発明の活性化剤は、例えば操作型または非操作型のδ３Ｔ細胞を、δ２Ｔ細胞の増殖を伴わずに、または顕著に伴わずに選択的に増殖させる。ある特定の実施形態では、本発明の活性化剤は、例えば操作型または非操作型のδ３Ｔ細胞を、δ１Ｔ細胞及びδ２Ｔ細胞の増殖を伴わずに、または顕著に伴わずに選択的に増殖させる。ある特定の実施形態では、本発明の活性化剤は、例えば操作型または非操作型のδ１及びδ３Ｔ細胞を、δ２Ｔ細胞の増殖を伴わずに、または顕著に伴わずに選択的に増殖させる。この文脈で、「〜の顕著な増殖を伴わずに」という用語は、優先的に増殖させた細胞集団が、参照細胞集団よりも少なくとも１０倍、好ましくは１００倍、より好ましくは１，０００倍多く増殖させられていることを意味する。
本明細書で使用される「混和物」という用語は、混合異種細胞集団に由来する２つ以上の単離された濃縮細胞集団の組み合わせを指す。ある特定の実施形態によれば、本発明の細胞集団は、単離されたγδＴ細胞集団である。
細胞集団に適用される「単離された」という用語は、ヒトまたは動物の身体から単離された細胞集団であり、インビボまたはインビトロで当該細胞集団に関連付けられる１つまたは複数の細胞集団を実質的に含まないものを指す。
細胞集団の関連における「接触させること」という用語は、本明細書で使用されるとき、単離された細胞集団の、例えば、ビーズまたは細胞のいずれかに連結され得る抗体、サイトカイン、リガンド、マイトジェン、または共刺激分子等の試薬とのインキュベーションを指す。抗体またはサイトカインは、可溶性形態であり得るか、またはそれは固定化され得る。一実施形態では、固定化された抗体またはサイトカインは、ビーズまたはプレートに緊密に結合されるか、または共有結合性で連結される。一実施形態では、抗体は、Ｆｃ塗布済みウェル上に固定化されている。一実施形態では、抗体は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）または人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）等の細胞の表面上に固定化されている。望ましい実施形態では、接触は、エクスビボ（例えば、インビトロ）またはインビボで起こる。
本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分、すなわち、抗原に特異的に結合する（それと免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。「〜に特異的に結合する」または「〜と免疫反応する」または「〜に対して向けられた」とは、抗体が、所望の抗原の１つまたは複数の抗原決定基と反応し、かつ他のポリペプチドとは反応しないか、またははるかにより低い親和性（ＫＤ＞１０−６モル）で結合することを意味する。抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｓｄＡｂ（重鎖または軽鎖単一ドメイン抗体）、１本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖｓ、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが含まれるが、これらに限定されない。
基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対で構成され、各対が１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主として担う約１００〜１１０またはそれよりも多くのアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主として担う定常領域を画定する。一般に、ヒトから得られた抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤのうちのいずれかに関係し、これらは分子中に存在する重鎖の性質により互いに異なる。ある特定のクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２等といったサブクラスもまた有する。さらに、ヒトにおいては、軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖であり得る。
「Ｆａｂ」という用語は、Ｌ鎖全体（ＶＬ及びＣＬ）に加えて、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）、及び１本の重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる抗体断片を指す。無傷の抗体のパパイン消化を用いて、２つのＦａｂ断片を生み出すことができ、これらの各々は、単一の抗原結合部位を含有する。典型的には、パパイン消化によって生み出されたＦａｂのＬ鎖及びＨ鎖断片は、鎖間ジスルフィド結合によって連結されている。
「Ｆｃ」という用語は、ジスルフィド結合によって一緒に結び付けられた、両Ｈ鎖のカルボキシ末端部分（ＣＨ２及びＣＨ３）及びヒンジ領域の一部分を含む抗体断片を指す。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域における配列によって決定される。この領域はまた、ある特定の種類の細胞上で見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。１つのＦｃ断片は、無傷の抗体のパパイン消化によって得ることができる。
「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、無傷の抗体のペプシン消化によって生み出される抗体断片を指す。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ジスルフィド結合によって一緒に結び付けられた、２つのＦａｂ断片及びヒンジ領域の一部分を含有する。Ｆ（ａｂ’）２断片は、二価の抗原結合活性を有し、抗原に架橋結合することが可能である。
Ｆａｂ’という用語は、Ｆ（ａｂ’）２断片の還元の産物である抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において抗体のヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む少数の追加の残基を有することにより、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基をもつＦａｂ’に対する、本明細書における呼称である。
「Ｆｖ」という用語は、非共有結合性で緊密に会合している１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインとの二量体からなる抗体断片を指す。これらの２つのドメインの折り畳みにより、抗体に抗原結合のためのアミノ酸残基を与え、抗原結合特異性を付与する、６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つのみ含むＦｖの半分）であっても、完全な結合部位よりもしばしば親和性が低いものの、抗原を認識して、それに結合する能力を有する。
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略称される「１本鎖Ｆｖ」という用語は、１本のポリペプチド鎖へとつなげられたＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片を指す。典型的には、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）、及びＭａｌｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３：７−１３，１９９５を参照されたい。
「直鎖状抗体」という表現は、一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＶＨ−ＣＨ１セグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含むポリペプチドを指して使用される。直鎖状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得、例えば、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）により記載される。
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分が配列に関して抗体間で大幅に異なり、各々特定の抗体の、その特定の抗原に対する結合及び特異性においてこれらが使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布してはいない。それは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方において、超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主としてベータシート構造をとる４つのＦＲを含み、これらのＦＲは、ベータシート構造をつなげている、また一部の実例ではその一部を形成しているループを形成する、３つの超可変領域によってつながっている。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって近接して一緒に結び付けられており、他方の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関わらないが、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）への抗体の関与等の、種々のエフェクター機能を示す。
「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖及び軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と称される、重鎖及び軽鎖のＶ領域内の高度に異なる３つの区間は、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られる両脇のより保存された区間の間に介在する。故に、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンにおける超可変領域の間に天然で見出され、かつそれらに隣接するアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、３次元空間で互いに対して配置されて、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合した抗原の３次元表面に対して相補的であり、重鎖及び軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７及び１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７），Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従ったものである。
「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、配列が超可変である及び／または構造的に画定されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の、６つのＨＶＲを含む。天然抗体において、Ｈ３及びＬ３は、６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を呈し、特にＨ３は、抗体に細かい特異性を付与する上で固有の役割を果たすと考えられる。例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３７−４５（２０００）、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｗｕ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１−２５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）を参照されたい。実際、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ抗体は、軽鎖の不在下で機能的かつ安定である。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６−４４８（１９９３）、Ｓｈｅｒｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３−７３６（１９９６）を参照されたい。
「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基のことである。各可変ドメインは典型的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４として同定される４つのＦＲを有する。ＣＤＲがＫａｂａｔにより定義される場合、軽鎖ＦＲ残基は、残基約１〜２３（ＬＣＦＲ１）、３５〜４９（ＬＣＦＲ２）、５７〜８８（ＬＣＦＲ３）、及び９８〜１０７（ＬＣＦＲ４）に位置付けられ、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基における残基約１〜３０（ＨＣＦＲ１）、３６〜４９（ＨＣＦＲ２）、６６〜９４（ＨＣＦＲ３）、及び１０３〜１１３（ＨＣＦＲ４）に位置付けられる。ＣＤＲが超可変ループからのアミノ酸残基を含む場合、軽鎖ＦＲ残基は、軽鎖における残基約１〜２５（ＬＣＦＲ１）、３３〜４９（ＬＣＦＲ２）、５３〜９０（ＬＣＦＲ３）、及び９７〜１０７（ＬＣＦＲ４）に位置付けられ、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基における残基約１〜２５（ＨＣＦＲ１）、３３〜５２（ＨＣＦＲ２）、５６〜９５（ＨＣＦＲ３）、及び１０２〜１１３（ＨＣＦＲ４）に位置付けられる。一部の事例では、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔによる定義に従うＣＤＲと、超可変ループからのそれとの両方からのアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基はそれに応じて調整されることになる。例えば、ＣＤＲＨ１がアミノ酸Ｈ２６〜Ｈ３５を含む場合、重鎖ＦＲ１残基は、位置１〜２５にあり、ＦＲ２残基は、位置３６〜４９にある。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンのＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンのＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列の下位群からのものである。一般に、配列の下位群は、Ｋａｂａｔにあるような下位群である。ある特定の事例では、ＶＬに関して、下位群は、Ｋａｂａｔにあるような下位群カッパＩである。ある特定の事例では、ＶＨに関して、下位群は、Ｋａｂａｔにあるような下位群ＩＩＩである。
本明細書に記載される抗体は、ヒト化され得る。非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト抗体に由来する配列を最小限に含有するキメラ抗体である。大概、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の抗体特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の事例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体性能をさらに改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。ヒト化抗体はまた、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分も含むことになる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。また、以下の総説論文及び同文献中で引用される参考文献も参照されたい：Ｖａｓｗａｎｉ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１：１０５−１１５（１９９８）、Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，２３：１０３５−１０３８（１９９５）、Ｈｕｒｌｅ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５：４２８−４３３（１９９４）。
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される、及び／または本明細書に開示されるようなヒト抗体を作製するための技法のうちのいずれかを用いて作製された抗体のアミノ酸配列に対応する、アミノ酸配列をもつものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含めた、当該技術分野で既知の種々の技法を用いて生産することができる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。また、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載される方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である。また、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：３６８−７４（２００１）も参照されたい。ヒト抗体は、抗原刺激に応答してかかる抗体を産生するように改変されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物、例えば、免疫化異種マウス（ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｘｅｎｏｍｉｃｅ）に抗原を投与することによって、調製することができる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関して、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照されたい）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体に関して、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）も参照されたい。
本明細書で使用されるとき、「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、表面プラズモン共鳴アッセイを用いることによって、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いて、約１０応答単位（ＲＵ）の抗原または抗体が固定化されたＣＭ５チップにより２５℃で測定される、解離定数を指す。二価または他の多価抗体の場合には、結合活性により誘導される解離定数の測定値への干渉を回避するために、典型的に抗体が固定化される。さらなる詳細については、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。
本明細書で結合親和性を指して使用されるときの「またはそれよりも良好」とは、分子とその結合パートナーとの間のより強力な結合を指す。本明細書で使用されるときの「またはそれよりも良好」とは、より小さいＫＤ数値によって表される、より強力な結合を指す。例えば、抗原に対する親和性が「０．６ｎＭまたはそれよりも良好な」抗体の場合、抗原に対する抗体の親和性は、≦０．６ｎＭ、すなわち０．５９ｎＭ、０．５８ｎＭ、０．５７ｎＭ等、つまり０．６ｎＭ以下の任意の値である。
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる、任意のタンパク質決定基、脂質または炭水化物決定基を含む。エピトープ決定基は通常、アミノ酸、脂質、または糖側鎖等の分子の活性な表面群からなり、通常は、特定の３次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する。抗体は、平衡解離定数（ＫＤ）が１０−６〜１０−１２Ｍの範囲内にあるか、またはそれよりも良好である場合、抗原に特異的に結合すると言われる。特異的結合は、標的エピトープへの結合が、他の非標的エピトープへの結合についての解離定数と比較して、少なくとも１０倍、好ましくは１００倍、またはより好ましくは１，０００倍緊密な解離定数（より低いＫＤ）であることを指すことができる。一部の実例では、標的エピトープは、デルタ３ＴＣＲのデルタ３鎖のエピトープである。一部の実例では、非標的エピトープは、αβＴＣＲである。一部の実例では、非標的エピトープは、デルタ３ではないδ−ＴＣＲのデルタ鎖である。例えば、一部の実例では、非標的エピトープは、δ−ＴＣＲのデルタ１、デルタ２、デルタ４、デルタ５、またはデルタ８鎖であり得る。結合の特異性は、γδ−ＴＣＲ及び／またはαβ−ＴＣＲの細胞外領域への結合の関連において決定することができる（例えば、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化したＦｃ融合体としてまたは細胞上で発現させたものとして）。
「活性化エピトープ」は、結合に際してその特定のγδＴ細胞集団を活性化させることができる。Ｔ細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）は、Ｔ細胞の活性化及び増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を示す。
抗体が参照抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合するというのは、これら２つの抗体が同一または立体的に重複するエピトープを認識する場合である。２つのエピトープが同一または立体的に重複するエピトープに結合するかどうかを決定するための最も幅広く使用されかつ迅速な方法は、競合アッセイであり、これは標識抗原または標識抗体のいずれかを用いて、いくつかの異なる形式で構成され得る。一部の実施形態では、抗原は、９６ウェルプレート上に固定化されており、放射性標識または酵素標識を用いて、未標識抗体が標識抗体の結合を遮断する能力が測定される。代替として、標識抗体及び未標識抗体を用いた競合研究は、抗原発現細胞に対するフローサイトメトリーを用いて行われる。
「エピトープマッピング」は、抗体の標的抗原上の、抗体の結合部位またはエピトープを同定するプロセスである。抗体のエピトープは、直鎖状エピトープであっても、または立体構造エピトープであってもよい。直鎖状エピトープは、タンパク質におけるアミノ酸の連続配列によって形成される。立体構造エピトープは、タンパク質配列においては不連続であるが、タンパク質がその３次元構造へと折り畳まれると一緒にまとめられるアミノ酸で形成される。
本明細書で定義されるところの「エピトープビニング」は、抗体が認識するエピトープに基づいて抗体を分類するプロセスである。より詳細には、エピトープビニングは、抗体のエピトープ認識特性に基づいて抗体をクラスター化するため及び別個の結合特異性を有する抗体を同定するための計算プロセスと組み合わせた、様々な抗体のエピトープ認識特性を識別するための方法及びシステムを含む。
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、例えば、人工Ｔ細胞受容体、Ｔボディ（Ｔ−ｂｏｄｉｅｓ）、１本鎖免疫受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体を指す場合があり、特定の免疫エフェクター細胞に人工的な特異性をグラフトする操作型受容体を包含する場合がある。ＣＡＲは、Ｔ細胞にモノクローナル抗体の特異性を付与し、それによって、例えば養子細胞療法において使用するための、多数の特異的Ｔ細胞の生成を可能にするために採用され得る。特定の実施形態では、ＣＡＲは、例えば、細胞の特異性を腫瘍関連抗原に差し向ける。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞内活性化ドメイン（標的腫瘍細胞等の標的細胞との標的化部分の結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）に際してＴ細胞の活性化を可能にする）、膜貫通ドメイン、及び、長さが様々であり得、疾患または障害関連抗原結合領域、例えば腫瘍抗原結合領域を含む、細胞外ドメインを含む。具体的な態様では、ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインに融合させた、モノクローナル抗体に由来する１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合体を含む。他のＣＡＲ設計の特異性は、受容体（例えば、ペプチド）のリガンド、またはデクチン等のパターン認識受容体に由来し得る。ある特定の実例では、抗原認識ドメインの間隔を変更して、活性化誘導細胞死を低減することができる。ある特定の実例では、ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０／１２、及び／またはＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＴＬＲ等といった追加の共刺激シグナル伝達のためのドメインを含む。一部の実例では、共刺激分子、造影用（例えば、陽電子放射断層撮影用）のレポーター遺伝子、プロドラッグの添加に際してＴ細胞を条件的に取り除く遺伝子産物、帰巣受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、及びサイトカイン受容体を含めた分子を、ＣＡＲと共発現させることができる。
本発明による「薬剤」または「化合物」は、小分子、ポリペプチド、タンパク質、抗体または抗体断片を含む。本発明の関連において、小分子は、一実施形態で、１０００ダルトンよりも小さい、詳細には８００ダルトンよりも小さい、より詳細には５００ダルトンよりも小さい分子量を有する化学物質を意味する。「治療剤」という用語は、生物学的活性を有する薬剤を指す。「抗がん剤」という用語は、がん細胞に対する生物学的活性を有する薬剤を指す。
本明細書で使用されるとき、「細胞培養物」という用語は、細胞の任意のインビトロ培養物を指す。この用語には、連続細胞株（例えば、不死化表現型を有する）、初代細胞培養物、有限細胞株（例えば、非形質転換細胞）、及び、幹細胞、血液細胞、胚性臍帯血細胞、腫瘍細胞、形質導入細胞等を含めたインビトロで維持される任意の他の細胞集団が含まれる。
「処置する」または「処置」という用語は、望まれない生理学的変化または障害を防止するかまたは減速（減少）させることを目的とする、治療的処置及び予防的または防止的措置の両方を指す。有益なまたは所望の臨床結果には、例えば、検出可能であるか検出不能であるかにかかわらず、症状の緩和、疾患度合いの減弱（例えば、腫瘍のサイズ、腫瘍負荷、または腫瘍分布の減少）、安定化された（すなわち、悪化していない）疾患状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または一次的緩和、及び寛解（部分的であるか完全であるかにかかわらない）が含まれるが、これらに限定されない。「処置」はまた、生存期間を、処置を受けていない場合に予想される生存期間と比較して長くすることも意味し得る。処置を必要とする者には、病態または障害を既に有する者、ならびに病態もしくは障害を有する傾向にある者または病態もしくは障害が防止されるべき者が含まれる。
１つまたは複数のさらなる治療剤「と組み合わせた」投与は、同時（同時発生的）投与及び任意の順序での連続投与を含む。
本明細書で使用される「同一」という用語は、同じである２つ以上の配列または部分配列を指す。加えて、本明細書で使用される「実質的に同一」という用語は、比較アルゴリズムを使用するかまたは手動でのアライメント及び目視検査によって測定される、比較窓または指定領域にわたって最大の一致が得られるように比較及びアライメントされたときに同じである、あるパーセンテージの配列単位を有する、２つ以上の配列を指す。例にすぎないが、２つ以上の配列は、配列単位が指定の領域にわたって約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、または約９５％同一である場合、「実質的に同一」であり得る。かかるパーセンテージは、２つ以上の配列の「同一性パーセント」を説明するものである。配列の同一性は、長さが少なくとも約７５〜１００配列単位である領域にわたって、長さが約５０配列単位である領域にわたって、または、指定されない場合には配列全体にわたって、存在し得る。この定義はまた、試験配列の相補配列も指す。加えて、例にすぎないが、２つ以上のポリヌクレオチド配列は、核酸残基が同じである場合には同一である一方で、２つ以上のポリヌクレオチド配列は、核酸残基が、指定の領域にわたって約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、または約９５％同一である場合には、「実質的に同一」である。同一性は、長さが少なくとも約７５〜約１００核酸の領域にわたって、長さが約５０核酸の領域にわたって、または、指定されない場合にはポリヌクレオチド配列の配列全体にわたって、存在し得る。
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、化合物の生物学的活性または特性を抑止せず、かつ比較的無毒である、塩、担体または希釈剤を含むが、これらに限定されない材料を指し、すなわち、当該材料は、望ましくない生物学的作用を引き起こすことも、組成物中に含有される組成物の成分のいずれとも有害な様態で相互作用することもなく、個体に投与され得る。
本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、脊椎動物を指す。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、哺乳動物である。哺乳動物には、ヒト、非ヒト霊長類、家畜動物（例えば、ウシ）、競技用動物、及びペット（例えば、ネコ、イヌ、及びウマ）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
本明細書で使用される「治療上有効量」という用語は、疾患、病態、または障害を既に患っている対象、例えば、ヒト患者に投与される、本発明の増殖させた細胞集団及び／または混和物を含有する組成物の、処置されている疾患、障害、または病態の症状のうちの１つまたは複数を治癒させるか、または少なくとも部分的に停止させるか、またはある程度軽減させるのに十分な量を指す。かかる組成物の有効性は、疾患、障害、または病態の重症度及び経過、以前の療法、患者の健康状態及び薬物への応答、ならびに処置する医師の判断を含むが、これらに限定されない条件に依存する。例にすぎないが、治療上有効量は、用量漸増臨床試験を含むが、これらに限定されない、通例の実験によって決定されてもよい。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）という用語は、野生型ＡＰＣ、または操作型もしくは人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を指す。ＡＰＣは、ＡＰＣの照射済み集団として提供され得る。ＡＰＣは、不死化細胞株（例えば、不死化細胞株に由来するＫ５６２または操作型ａＡＰＣ）から、またはドナーからの細胞の画分（例えば、ＰＢＭＣ）として提供され得る。
本明細書で使用されるとき、抗体またはエピトープ等のタンパク質またはそのポリペプチド断片を参照しての「構造的に異なる」及び「構造的に別個の」という用語は、少なくとも２つの異なるタンパク質、そのポリペプチド断片、またはエピトープ間の共有結合的な（すなわち、構造的な）差異を指す。例えば、２つの構造的に異なるタンパク質（例えば、抗体）は、異なる一次アミノ酸配列を有する２つのタンパク質を指し得る。一部の実例では、構造的に異なる活性化剤は、異なる一次アミノ酸配列を有するエピトープ等の、構造的に異なるエピトープに結合する。
本明細書で使用されるとき、指定の受容体活性（例えば、ＮＫｐ３０活性、ＮＫｐ４４活性、及び／またはＮＫｐ４６活性）「から独立」した「抗腫瘍細胞傷害性」という用語は、指定の受容体または受容体の指定の組み合わせが細胞により発現されるか、または細胞溶解を媒介するのに機能的であるか否かにかかわらず示される、抗腫瘍細胞傷害性を指す。このように、ＮＫｐ３０活性、ＮＫｐ４４活性、及び／またはＮＫｐ４６活性から独立した抗腫瘍細胞傷害性を示すγδＴ細胞はまた、ＮＫｐ３０活性依存性の抗腫瘍細胞傷害性、ＮＫｐ４４活性依存性の抗腫瘍細胞傷害性、及び／またはＮＫｐ４６活性依存性の抗腫瘍細胞傷害性を示すこともできる。
本明細書で使用されるとき、「ＮＫｐ３０活性依存性の抗腫瘍細胞傷害性」、「ＮＫｐ４４活性依存性の抗腫瘍細胞傷害性」、及び「ＮＫｐ４６活性依存性の抗腫瘍細胞傷害性」という用語は、指定の受容体の機能的発現を必要とする抗腫瘍細胞傷害性を指す。かかる受容体依存性の抗腫瘍細胞傷害性の存否は、指定の受容体に対するアンタゴニストの存在または不在下で標準的なインビトロ細胞傷害性アッセイを行うことによって決定することができる。例えば、ＮＫｐ３０活性依存性の抗腫瘍細胞傷害性の存否は、抗ＮＫｐ３０アンタゴニストの存在下でのインビトロ細胞傷害性アッセイの結果を、抗ＮＫｐ３０アンタゴニストの不在下で得られた結果と比較することによって決定することができる。
本明細書で使用されるとき、抗腫瘍細胞傷害性の少なくとも指定の「％」が指定の受容体活性（例えば、ＮＫｐ３０活性、ＮＫｐ４４活性、及び／またはＮＫｐ４６活性）「から独立」している、抗腫瘍細胞傷害性を含むγδＴ細胞集団は、指定の受容体を遮断することにより、測定される抗腫瘍細胞傷害性がその％数値以下だけ低減される細胞を指す。故に、抗腫瘍細胞傷害性の少なくとも５０％がＮＫｐ３０活性から独立している、抗腫瘍細胞傷害性を含むγδＴ細胞集団は、ＮＫｐ３０アンタゴニストの存在下で、ＮＫｐ３０アンタゴニストの不在下と比較してインビトロ抗腫瘍細胞傷害性の５０％以下の低減を示すであろう。
概説
ヒトにおいて、γδＴ細胞（複数可）は、自然免疫応答と適応免疫応答との間の連係を提供するＴ細胞のサブセットである。これらの細胞は、Ｖ−（Ｄ）−Ｊセグメント再構成を経て、抗原特異的なγδＴ細胞受容体（γδＴＣＲ）、及びγδＴ細胞（複数可）を生成し、γδＴＣＲ、またはγδＴ細胞エフェクター機能を活性化させるように独立してもしくは一緒に作用する他の非ＴＣＲタンパク質のいずれかによる抗原の認識を介して、直接活性化され得る。γδＴ細胞は、哺乳動物において、末梢血及びリンパ器官中のＴ細胞のおよそ１〜５％と、全体的なＴ細胞集団のごく一部に相当し、それらは、皮膚、肝臓、消化管、気道、及び生殖管のような上皮細胞に富む区画に主として常在するようである。主要組織適合複合体分子（ＭＨＣ）に結合した抗原を認識する、αβＴＣＲとは異なり、γδＴＣＲは、細菌抗原、ウイルス抗原、病的細胞により発現されるストレス抗原、及び無傷のタンパク質または非ペプチド化合物の形態の腫瘍抗原を直接認識することができる。
δ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８は、γδＴ細胞を活性化させ、増殖させることができ、一部の実施形態では、δ３γδＴ細胞を、例えば臨床的に意義のあるレベルにまで、優先的に活性化させ、増殖させるために使用することができる。理論に拘束されることなく、異なるドナーを起源とする培養物の異なる活性化及び増殖レベルは、ドナーのγδ可変ＴＣＲレパートリー及び抗体結合エピトープの特異性に起因するものであり得る。特定のγδＴ細胞サブセットに結合するいずれの薬剤も全て、その特定のγδＴ細胞を活性化させること、特に、濃縮培養物中でその特定のγδＴ細胞集団を、臨床的に意義のあるレベル、すなわち＞１０８個の標的γδＴ細胞にまで活性化させ、増殖させることが可能なわけではないことが発見されている。同様に、γδＴ細胞集団のいずれの結合エピトープも全て、活性化エピトープである、すなわち、結合に際してその特定のγδＴ細胞集団を活性化させることが可能なわけではない。
本発明の発明者らは、δ３γδＴ細胞サブタイプの強力な活性化及び増殖に関連する特定のγδＴＣＲ結合領域を同定した。一部の実例では、当該結合領域は、δ３可変領域内にあるか、またはそれと重複する。故に、これらの活性化領域に結合する薬剤を開発し、δ３γδＴ細胞サブタイプを選択的に活性化させ、増殖させるために使用することができる。例となる活性化剤が本明細書に記載される。故に、本発明は、患者に投与することができる、純度の増加した臨床的に意義のあるレベルの高濃縮δ３γδＴ細胞集団及びそれらの混和物を生産する、δ３γδＴ細胞サブタイプの特異的活性化及び増殖を可能にする。かかる混和物は、δ１及び／またはδ２γδＴ細胞等の他の増殖させたγδＴ細胞亜集団の混和物を含み得る。δ３γδＴ細胞サブタイプの強化された活性化及び増殖を誘導することができる活性化エピトープに特異的に結合する、抗体を含めた新規の活性化リガンドもまた企図され、本明細書にさらに記載される。本明細書に記載される活性化リガンド、方法、及び組成物を、参照によりその全体が本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ１７／３２５３０に記載される活性化リガンド、方法、及び組成物と組み合わせて用いて、エクスビボ増殖及び／または増殖後単離によって、本質的に任意の所望の割合の操作型または非操作型δ１、δ２、δ３、δ４、及び／またはδ８（例えば、δ１、δ２、及びδ３）γδＴ細胞を含む、増殖させたγδＴ細胞集団、及び混和物、及び／またはその精製画分を得、それらを使用することができる。例えば、エクスビボ増殖のために、本明細書に記載されるδ３特異的γδＴ細胞活性化リガンドのうちの１つまたは複数を培養基中で、ＰＣＴ／ＵＳ１７／３２５３０に記載されるδ１特異的及び／またはδ２特異的γδＴ細胞活性化リガンドのうちの１つまたは複数と組み合わせて使用することができる。別の例として、第１または第２のエクスビボγδＴ細胞増殖ステップにおいて、本明細書に記載される活性化リガンド、方法、または組成物を使用することができ、後続または先のエクスビボγδＴ細胞増殖ステップにおいて、ＰＣＴ／ＵＳ１７／３２５３０に記載される活性化リガンド、方法、または組成物を使用することができる。活性化リガンドはまた、正または負の選択による指定のγδＴ細胞集団の精製に使用することもできる。
一部の実例では、本発明の方法を用いた臨床的に意義のあるレベル（すなわち、＞１０８）のγδＴ細胞の生産は、比較的小さい体積の培養基で得ることができる。例えば、一部の実施形態では、臨床的に意義のあるレベルのγδＴ細胞は、およそ２５Ｌ、２０Ｌ、１０Ｌ、５Ｌ、３Ｌ、２Ｌ、１，５００ｍＬ、１，０００ｍＬ、５００ｍＬ、２００ｍＬ、１５０ｍＬ、１００ｍＬ、またはそれ未満（例えば、約１０ｍＬ〜約１００ｍＬ、約１００ｍＬ〜約５００ｍＬ、約５００ｍＬ〜約５，０００ｍＬ、または約５Ｌ〜約２５Ｌ）の最終培養体積での、細胞集団（例えば、単離された混合細胞集団）の増殖から得ることができる。別の例として、一部の実施形態では、臨床的に意義のあるレベルのγδＴ細胞は、１つのドナーまたは複数ドナーから得られた単離された混合細胞集団からの増殖が、約５０Ｌ未満、２５Ｌ未満、２０Ｌ未満、１０Ｌ未満、５Ｌ未満、１Ｌ未満、または７５０ｍＬ未満（例えば、約７５０ｍＬ〜約５０Ｌ未満、約１００ｍＬ〜約７５０ｍＬ、約７５０ｍＬ〜約５Ｌ、約１Ｌ〜約１０Ｌ、約１０Ｌ〜約５０Ｌ、または約１０Ｌ〜約２５Ｌ）の培養基の総体積を用いて達成され得るような条件下で、得ることができる。
本明細書では、細胞傷害特性を有する臨床的に意義のあるレベルの濃縮γδＴ細胞集団（複数可）を提供する、例えば非標的細胞型の事前の除去を伴わない、単離された混合細胞集団から直接のγδＴ細胞サブタイプ（例えば、δ３γδＴ細胞）の選択的活性化及び増殖のための方法が記載される。特異的γδ細胞集団（複数可）のγδ可変ＴＣＲエピトープの活性化もまた記載される。本発明はまた、本発明の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）を含む組成物による処置方法も提供する。
本明細書では、１つまたは複数の特定のγδＴ細胞サブセット（例えば、δ３γδＴ細胞）を含む、臨床的に意義のあるレベル（＞１０８）の操作型または非操作型γδＴ細胞の生産方法または提供方法が記載される。かかる方法を用いて、単一ドナーの単一試料を含めて、単一ドナーから、かかる臨床的に意義のあるレベルを生産することができる。その上、かかる方法を用いて、１０８個を顕著に上回る操作型または非操作型γδＴ細胞を生産することができる。例えば、一部の実施形態では、１つまたは複数の特定のγδＴ細胞サブセット（例えば、δ３γδＴ細胞）を含む、約（または少なくとも約）１０９、１０１０、１０１１、または１０１２個の操作型または非操作型γδＴ細胞が、本明細書に記載される方法において生産され得る。一部の実例では、かかる集団のサイズは、わずか１４〜３０日間、１９〜３０日間、もしくは２１〜３０日間で、及び／または使用される培養基の総体積が約１Ｌ未満で、達成することができる。
γδＴ細胞の単離
一部の態様では、本発明は、操作型または非操作型γδＴ細胞の増殖のためのエクスビボ方法を提供する。一部の実例では、該方法は、ＩＬ−４、ＩＬ−２、もしくはＩＬ−１５、またはそれらの組み合わせ等の、特定のγδＴ細胞集団の増殖に有利なサイトカインを含まない、１つまたは複数の（例えば、第１及び／または第２の）増殖ステップを採用する。一部の実施形態では、本発明は、混合細胞集団を、δ３ＴＣＲ（例えば、δ３γδＴＣＲ）に特有のエピトープに結合することによってδ３Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つまたは複数の薬剤と接触させて、濃縮γδＴ細胞集団をもたらすことを含む、単離された混合細胞集団から濃縮γδＴ細胞集団を生産するためのエクスビボ方法を提供する。
他の態様では、本開示は、対象から単離されたγδＴ細胞の遺伝子操作のための方法を提供する。濃縮方法、活性化方法、増殖方法、または遺伝子操作方法を、単独でまたは任意の順序で組み合わせて行うことができる。一実施形態では、γδＴ細胞を単離し、遺伝子操作し、次いで活性化させ、増殖させることができる。好ましい実施形態では、γδＴ細胞を単離することができ、単離された細胞を直接活性化させ、増殖させ、任意選択で精製し、次いで任意選択で遺伝子操作することができる。一部の実施形態では、かかる活性化させ、増殖させ、次いで遺伝子操作したγδＴ細胞をさらに活性化させ、及び／または増殖させ、及び／または精製することができる。
例えば非操作型の、γδＴ細胞集団を、対象の複合試料から増殖させることができる。複合試料は、末梢血試料（例えば、ＰＢＬまたはＰＢＭＣ）、白血球アフェレーシス試料、臍帯血試料、腫瘍、幹細胞前駆体、腫瘍生検試料、組織、リンパであるか、または外部環境に直接接触している対象の上皮部位からのもの、または幹前駆細胞に由来するものであり得る。一部の実例では、本開示は、Ｖδ３＋細胞の選択的増殖のための方法を提供する。一部の実例では、本開示は、Ｖδ１＋細胞、Ｖδ２＋細胞、Ｖδ１＋細胞及びＶδ３＋細胞、Ｖδ１＋細胞及びＶδ４＋細胞、Ｖδ１＋細胞、Ｖδ３＋細胞、Ｖδ４＋細胞、ならびにＶδ５＋細胞、またはそれらの任意の分類の増殖と組み合わせた、Ｖδ３＋細胞の増殖のための方法を提供する。
末梢血単核細胞は、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）システム、または別の好適なデバイス／システムを含めたアフェレーシス機械で、対象から採集することができる。γδＴ細胞（複数可）、またはγδＴ細胞（複数可）の所望の亜集団は、例えばフローサイトメトリー技法により採集された試料から、精製することができる。臍帯血細胞もまた、対象の誕生の間に臍帯血から得ることができる。ＷＯ２０１６／０８１５１８を参照されたく、これはＰＢＭＣ単離、γδＴ細胞活性化及び増殖、ならびにγδＴ細胞活性化剤の作製及び使用のための方法及び組成物を含むが、これらに限定されない全目的で、参照によりその全体が本明細書に援用される。
γδＴ細胞は、例えば第１の濃縮ステップにおいて、混合細胞集団を、δ３γδＴＣＲのエピトープに特異的に結合することによってγδＴ細胞を増殖させる１つまたは複数の薬剤と接触させて、濃縮γδＴ細胞集団をもたらすことによって、インビトロで培養される単離された複合試料または混合細胞集団から増殖させてもよい。一部の実施形態では、以下の非γδＴ細胞単球、すなわちαβＴ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞のうちの１つもしくは複数または全て等の１つまたは複数の特定の細胞集団の事前の除去を伴わない、全ＰＢＭＣ集団中に含まれるγδＴ細胞を活性化させ、増殖させて、濃縮γδＴ細胞集団をもたらすことができる。一部の態様では、γδＴ細胞の活性化及び増殖は、天然または操作型ＡＰＣの存在を伴わずに行われる。一部の態様では、γδＴ細胞の活性化及び増殖は、天然または操作型ＡＰＣの存在下で行われる。一部の態様では、γδＴ細胞の活性化及び増殖は、第１または第２のステップにおいて、天然または操作型ＡＰＣの存在下で行われ、活性化及び増殖はまた、ある（第１または第２の）ステップにおいて、天然または操作型ＡＰＣを伴わずに行われる。一部の態様では、例えば腫瘍検体からの、γδＴ細胞の単離及び増殖は、γδＴＣＲ（例えば、δ３＋ＴＣＲ）の活性化エピトープに対して特異的な抗体、及び、例えば本明細書に提供されるγδＴＣＲの活性化エピトープに結合することができる、レクチンを含めた他の活性化剤を含む、固定化されたγδＴ細胞マイトジェンを用いて行うことができる。
ある特定の実施形態では、単離された混合細胞集団は、約（または少なくとも約）２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１７日間、約１９日間、約２１日間、約２５日間、約２９日間、約３０日間、またはそれらの中の任意の範囲にわたって、δ３γδＴ細胞を増殖させる（例えば、選択的に増殖させる）１つまたは複数の薬剤と接触させられる。例えば、単離された混合細胞集団は、約１〜約４日間、約２〜約４日間、約２〜約５日間、約３〜約５日間、約５〜約２１日間、約５〜約１９日間、約５〜約１５日間、約５〜約１０日間、または約５〜約７日間にわたって、δ３γδＴ細胞を増殖させる（例えば、選択的に増殖させる）１つまたは複数の薬剤と接触させられて、第１の濃縮γδＴ細胞集団をもたらす。別の例として、単離された混合細胞集団は、約７〜約２１日間、約７〜約１９日間、約７〜約２３日間、または約７〜約１５日間にわたって、δ３γδＴ細胞を増殖させる（例えば、選択的に増殖させる）１つまたは複数の薬剤と接触させられて、第１の濃縮γδＴ細胞集団をもたらす。
一部の実例では、第１の増殖ステップと第２の増殖ステップとの間に精製または単離ステップが行われる。一部の実例では、単離ステップは、１つまたは複数の活性化剤の除去を含む。一部の実例では、単離ステップは、γδＴ細胞、またはそのサブタイプ（例えば、δ３γδＴ細胞）の特異的な単離を含む。一部の実例では、１つまたは複数（例えば、全て）の活性化剤（例えば、血清成分及び／またはＩＬ−２等の細胞培養基の一般的成分ではない全ての活性化剤））は、第１の増殖ステップと第２の増殖ステップとの間に除去されるが、γδＴ細胞は、他の細胞型（αβＴ細胞）から特異的に単離されない。一部の実例では、１つまたは複数（例えば、全て）の可溶性活性化剤は、第１の増殖ステップと第２の増殖ステップとの間に除去されるが、γδＴ細胞は、他の細胞型（αβＴ細胞）から特異的に単離されない。
一部の実施形態では、第１の濃縮ステップ、及び任意選択で第２の濃縮ステップにおける、γδＴＣＲの活性化エピトープに結合する活性化剤を用いたγδＴ細胞の活性化及び増殖に次いで、第２、第３、第４、第５等の濃縮ステップにおいて、本発明の例えば第１の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）を、当該技術分野で既知の技法を用いてさらに濃縮または精製して、第２のまたはさらなる濃縮γδＴ細胞集団（複数可）を得てもよい。例として、例えば第１の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）から、αβＴ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞を除去してもよい。採集されたγδＴ細胞（複数可）上で発現される細胞表面マーカーの正及び／または負の選択を用いて、同様の細胞表面マーカーを発現するγδＴ細胞、またはγδＴ細胞（複数可）の集団を、例えば第１の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）から直接単離することができる。例えば、γδＴ細胞は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ４４、Ｋｉｔ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ（１つまたは複数のＴＣＲγサブタイプを含む）、ＴＣＲδ（１つまたは複数のＴＣＲδサブタイプを含む）、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ４６、ＣＤ１６１、ＣＣＲ７、ＣＣＲ４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ−１、ＣＤ２４２、ＪＡＭＬ、及び他の好適な細胞表面マーカー等のマーカーの陽性または陰性発現に基づいて、（例えば、第１及び／または第２の増殖ステップ後に）濃縮γδＴ細胞集団から単離することができる。
一部の実施形態では、第１の増殖ステップの後に（例えば、第１の増殖ステップに後続して行われる単離ステップの後に）、増殖させた細胞は、任意選択で希釈されて、第２の増殖ステップにおいて培養される。好ましい実施形態では、第２の増殖ステップは、培養基が第２の増殖ステップにおいて約１〜２日、１〜３日、１〜４日、１〜５日、２〜５日、２〜４日、または２〜３日毎に補給される条件下で行われる。一部の実施形態では、第２の増殖ステップは、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、またはそれよりも多くのさらなるγδＴ細胞増殖を支持する密度に細胞が希釈されるか、または調整される条件下で行われる。一部の実例では、細胞密度の調整は、培養基の補給と同時期に（すなわち、それと同日に、またはそれと同時に）行われる。例えば、細胞密度は、第２の増殖ステップにおいて１〜２日、１〜３日、１〜４日、１〜５日、２〜５日、２〜４日、または２〜３日毎に調整され得る。さらなるγδＴ細胞増殖を支持する典型的な細胞密度には、約１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６細胞／ｍＬ、１０×１０６細胞／ｍＬ、１５×１０６細胞／ｍＬ、２０×１０６細胞／ｍＬ、または３０×１０６細胞／培養物ｍＬが含まれるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、細胞密度は、約０．５×１０６〜約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０６〜約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０６〜約２×１０６細胞／ｍＬ、約０．７５×１０６〜約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．７５×１０６〜約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．７５×１０６〜約２×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約２×１０６細胞／ｍＬ、または約１×１０６〜約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約２×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約３×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約４×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約１０×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約１５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約２０×１０６細胞／ｍＬ、または約１×１０６〜約３０×１０６細胞／ｍＬの密度に調整される。
一部の実施形態では、第２の増殖ステップは、細胞が監視され、既定の細胞密度（または密度区間）に維持される、及び／または既定のグルコース含量を有する培養基中で維持される条件下で行われる。例えば、細胞は、約０．５×１０６〜約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０６〜約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０６〜約２×１０６細胞／ｍＬ、約０．７５×１０６〜約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．７５×１０６〜約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．７５×１０６〜約２×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約２×１０６細胞／ｍＬ、または約１×１０６〜約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約３×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約４×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約１０×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約１５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約２０×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６〜約３０×１０６細胞／ｍＬの生細胞密度に維持することができる。
一部の実例では、細胞は、増殖の少なくとも一部分にわたってより高い濃度に維持することができる。例えば、第１または第２の増殖の第１の部分にわたっては、より高い細胞濃度で細胞の生存能が強化され得る。別の例として、第１または第２の増殖の最終部分にわたっては、より高い細胞濃度で培養体積が最も効率的に利用され得る。故に、一部の実施形態では、細胞は、第１もしくは第２の増殖培養の少なくとも一部分または第１もしくは第２の増殖培養の全てにわたって、約１×１０６細胞／ｍＬ〜約２０×１０６細胞／ｍＬの生細胞密度に維持することができる。
別の例として、細胞は、約０．５ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌ、約０．７５ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約０．７５ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌ、約０．７５ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ〜３ｇ／Ｌ、または１ｇ／Ｌ〜４ｇ／Ｌのグルコース含量を有する培養基中で維持することができる。一部の実施形態では、細胞は、約１．２５ｇ／Ｌのグルコース含量を有する培養基中で維持することができる。高細胞密度の培養物が維持される場合等の、一部の実例では、細胞は、約１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、または約２ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌのグルコース含量を有する培養基中で維持することができる。
典型的には、グルコース含量は、新鮮な血清含有培養基または無血清培養基を培養物に添加することによって維持される。一部の実施形態では、細胞は、例えば、各パラメータを監視し、パラメータを既定の限界内に維持するように新鮮な培地を添加することによって、既定の生細胞密度区間に、かつ既定のグルコース含量区間を有する培養基中で維持することができる。一部の実施形態では、グルコース含量は、灌流バイオリアクタにおいて細胞を内部に保持しつつ使用済み培地を除去しながら、新鮮な血清含有培養基または無血清培養基を培養物中に添加することによって維持される。一部の実施形態では、限定されないが、ｐＨ、Ｏ２の分圧、Ｏ２飽和度、ＣＯ２の分圧、ＣＯ２飽和度、ラクテート、グルタミン、グルタメート、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、及びカルシウムのうちの１つまたは複数を含めた追加のパラメータが、本明細書に記載されるγδＴ細胞増殖（例えば、選択的γδＴ細胞増殖）中またはγδＴ細胞増殖（例えば、選択的γδＴ細胞増殖）の第１もしくは第２のステップ中に、監視され、及び／または維持される。
δ３γδＴ細胞集団は、例えば第１の濃縮ステップにおいて、混合細胞集団を、δ３ＴＣＲのエピトープに特異的に結合することによってδ３Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つまたは複数の薬剤と接触させて、濃縮γδＴ細胞集団をもたらすことによって、インビトロで培養される単離された複合試料または混合細胞集団から選択的に増殖させてもよい。一部の実例では、当該１つまたは複数の薬剤は、δ３Ｊ１、δ３Ｊ２、またはδ３Ｊ３ＴＣＲ、δ３Ｊ４ＴＣＲ、またはそれらのうちの２つ、またはそれらのうちの３つ、またはそれらの全てに特異的に結合する。
一部の実施形態では、単球、αβＴ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞等の特定の細胞集団の事前の除去を伴わない、全ＰＢＭＣ集団中のδ３γδ細胞を活性化させ、増殖させて、濃縮γδＴ細胞集団（例えば、濃縮δ３γδＴ細胞集団）をもたらすことができる。一部の態様では、δ３γδＴ細胞の活性化及び増殖は、天然または操作型ＡＰＣの存在を伴わずに行われる。一部の態様では、例えば腫瘍検体からの、γδＴ細胞の単離及び増殖は、δ３ＴＣＲ；δ１ＴＣＲ；δ１、δ３、δ４、及びδ５ＴＣＲ、δ１及びδ４ＴＣＲ；またはδ２ＴＣＲに特有の活性化エピトープに対して特異的な抗体、ならびに、例えば、本明細書に提供されるδ３ＴＣＲ；δ１ＴＣＲ；δ１、δ３、δ４及びδ５ＴＣＲ；δ１及びδ４ＴＣＲ；またはδ２ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合する、レクチンを含めた他の活性化剤を含む、固定化されたγδＴ細胞マイトジェンを用いて行うことができる。
ある特定の実施形態では、単離された混合細胞集団は、約５日間、６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、またはそれらの中の任意の範囲にわたって、δ３Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つまたは複数の薬剤と接触させられる。例えば、単離された混合細胞集団は、約１〜約３日間、約１〜約４日間、約１〜約５日間、約２〜約３日間、約２〜約４日間、約２〜約５日間、約３〜約４日間、約３〜約５日間、約４〜約５日間、約５〜約１５日間、または約５〜約７日間にわたって、δ３Ｔ細胞を選択的に増殖させる１つまたは複数の薬剤と接触させられて、第１の濃縮γδＴ細胞集団をもたらす。一部の実施形態は、選択的に増殖させたγδＴ細胞を、本明細書に記載されるように第２の増殖ステップにおいてさらに増殖させる。
ある特定の実施形態では、単離された出発混合細胞集団、例えば、末梢血試料は、約２０〜８０％の範囲のＴリンパ球を含む。ある特定の実施形態では、本発明の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）中の残留αβＴ細胞及びＮＫ細胞のパーセントは、それぞれ約２．５％以下及び約１％以下である。ある特定の実施形態では、本発明の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）中の残留αβＴ細胞またはＮＫ細胞のパーセントは、約１％、０．５％、０．４％、０．２％、０．１％、または０．０１％以下である。ある特定の実施形態では、本発明の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）中の残留αβＴ細胞のパーセントは、（例えば、γδＴ細胞もしくはδ３γδＴ細胞等のそのサブタイプに関する正の選択ステップの後、またはαβＴ細胞の除去後に）約０．４％、０．２％、０．１％、または０．０１％以下である。一部の実施形態では、第１及び／または第２のγδＴ細胞増殖の前または後に、αβＴ細胞は除去されるが、ＮＫ細胞は除去されない。ある特定の態様では、単離された混合細胞集団は、単一ドナーに由来する。他の態様では、単離された混合細胞集団は、１つより多くのドナーまたは複数ドナー（例えば、２、３、４、５、または２〜５、２〜１０、もしくは５〜１０のドナー、またはそれよりも多く）に由来する。
このように、一部の実施形態では、本発明の方法は、わずか１つのドナーから、臨床的に意義のある数（＞１０８、＞１０９、＞１０１０、＞１０１１、もしくは＞１０１２、または約１０８〜約１０１２）の増殖させたγδＴ細胞をもたらすことができる。一部の実例では、本発明の方法は、ドナー試料を得た時点から１９、２１、または３０日未満のうちに、臨床的に意義のある数（＞１０８、＞１０９、＞１０１０、＞１０１１、もしくは＞１０１２、または約１０８〜約１０１２）の増殖させたγδＴ細胞をもたらすことができる。
第１の濃縮ステップにおける、δ３ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合する活性化剤を用いた特定のγδＴ細胞サブセットの特異的活性化及び増殖に次いで、第２の、第３の、第４の、第５の等の濃縮ステップにおいて、本発明の第１の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）を、当該技術分野で既知の技法を用いてさらに濃縮または精製して、第２のまたはさらなる濃縮γδＴ細胞集団（複数可）を得てもよい。例えば、第１の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）から、αβＴ細胞、Ｂ細胞、及び／またはＮＫ細胞を除去してもよい。採集されたγδＴ細胞（複数可）上で発現される細胞表面マーカーの正及び／または負の選択を用いて、同様の細胞表面マーカーを発現するγδＴ細胞、またはγδＴ細胞（複数可）の集団を、第１の濃縮γδＴ細胞集団（複数可）から直接単離することができる。例えば、γδＴ細胞は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ４４、Ｋｉｔ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ（またはその１つもしくは複数のサブタイプ）、ＴＣＲδ（またはその１つもしくは複数のサブタイプ）、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ４６、ＣＤ１６１、ＣＣＲ７、ＣＣＲ４、ＤＮＡＭ−１、ＪＡＭＬ、及び他の好適な細胞表面マーカー等のマーカーの陽性または陰性発現に基づいて、第１の濃縮γδＴ細胞集団から単離することができる。
一部の実施形態では、本発明の第１のγδＴ細胞増殖、第１の濃縮ステップ、第２のγδＴ細胞増殖、及び／または第２の濃縮ステップに次いで、濃縮γδＴ細胞集団は、例えば、１０ｍＬ、２５ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、１５０ｍＬ、２００ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、４Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、２０Ｌ、または２５Ｌ未満の培養体積中に、＞１０８細胞という、臨床的に意義のあるレベルのγδＴ細胞サブセットを含む。例えば、本発明の方法は、１０〜１００ｍＬ、２５〜１００ｍＬ、５０〜１００ｍＬ、７５〜１００ｍＬ、１０〜１５０ｍＬ、２５〜１５０ｍＬ、５０〜１５０ｍＬ、７５〜１５０ｍＬ、１００〜１５０ｍＬ、１０〜２００ｍＬ、２５〜２００ｍＬ、５０〜２００ｍＬ、７５〜２００ｍＬ、１００〜２００ｍＬ、１０〜２５０ｍＬ、２５〜２５０ｍＬ、５０〜２５０ｍＬ、７５〜２５０ｍＬ、１００〜２５０ｍＬ、１５０〜２５０ｍＬ、５〜１，０００ｍＬ、１０〜１，０００ｍＬ、または１００〜１，０００ｍＬ、１５０〜１，０００ｍＬ、２００〜１，０００ｍＬ、２５０〜１，０００ｍＬ、４００ｍＬ〜１Ｌ、１Ｌ〜２Ｌ、２Ｌ〜５Ｌ、２Ｌ〜１０Ｌ、４Ｌ〜１０Ｌ、４Ｌ〜１５Ｌ、４Ｌ〜２０Ｌ、または４Ｌ〜２５Ｌの体積を有する増殖培養物中に、＞１０８細胞という、臨床的に意義のあるレベルのγδＴ細胞サブセットをもたらすことができる。他の実施形態では、本発明の第２の、第３の、第４の、第５の等の濃縮ステップに次いで、濃縮γδＴ細胞集団は、臨床的に意義のあるレベルである＞１０８個の、１つまたは複数のγδＴ細胞サブセット（例えば、＞１０８個のδ３γδＴ細胞）を含む。
一部の実施形態では、γδＴ細胞（複数可）は、１つまたは複数の抗原との接触に応答して迅速に増殖することができる。Ｖγ９Ｖδ２＋γδＴ細胞（複数可）等の一部のγδＴ細胞（複数可）は、プレニル−ピロリン酸、アルキルアミン、及び組織培養中の代謝産物または微生物抽出物のような一部の抗原との接触に応答してインビトロで迅速に増殖する。加えて、Ｖγ２Ｖδ２＋γδＴ細胞（複数可）等の一部の野生型γδＴ細胞（複数可）は、ヒトにおいて、ある特定の種類のワクチン接種（複数可）に応答してインビボで迅速に増殖する。刺激されたγδＴ細胞は、多数の抗原提示分子、共刺激分子、及び複合試料からのγδＴ細胞（複数可）の単離を容易にし得る接着分子を呈することができる。複合試料内のγδＴ細胞（複数可）は、例えば、抗体または固定化抗体等の本明細書に記載される選択的γδＴ細胞増殖剤による増殖と組み合わせてか、その前か、または後に、少なくとも１つの抗原により、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、約５〜１５日間、５〜１０日間、もしくは５〜７日間、または別の好適な期間にわたって、インビトロで刺激することができる。好適な抗原によるγδＴ細胞の刺激は、エクスビボまたはインビトロでγδＴ細胞集団を増殖させることができる。
インビトロでの複合試料からのγδＴ細胞（複数可）の増殖を刺激するために使用され得る抗原の非限定的な例としては、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）等のプレニル−ピロリン酸、アルキル−アミン、ヒト微生物病原体の代謝産物、共生細菌の代謝産物、−メチル−３−ブテニル−１−ピロリン酸（２Ｍ３Ｂ１ＰＰ）、（ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブタ−２−エニルピロリン酸（ＨＭＢ−ＰＰ）、エチルピロリン酸（ＥＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、ジメチルアリルリン酸（ＤＭＡＰ）、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）、エチル−アデノシン三リン酸（ＥＰＰＰＡ）、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）、イソペンテニル−アデノシン三リン酸（ＩＰＰＰＡ）、モノエチルリン酸（ＭＥＰ）、モノエチルピロリン酸（ＭＥＰＰ）、３−ホルミル−１−ブチル−ピロリン酸（ＴＵＢＡｇ１）、Ｘ−ピロリン酸（ＴＵＢＡｇ２）、３−ホルミル−１−ブチル−ウリジン三リン酸（ＴＵＢＡｇ３）、３−ホルミル−１−ブチル−デオキシチミジン三リン酸（ＴＵＢＡｇ４）、モノエチルアルキルアミン、アリルピロリン酸、クロトイルピロリン酸、ジメチルアリル−γ−ウリジン三リン酸、クロトイル−γ−ウリジン三リン酸、アリル−γ−ウリジン三リン酸、エチルアミン、イソブチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、イソ−アミルアミン、及び窒素含有ビスホスホネートが挙げられる。
本明細書に記載される活性化剤及び共刺激剤を用いて、特定のγδＴ細胞増殖及び持続性の集団を誘発して、γδＴ細胞の活性化及び増殖を行うことができる。一部の実施形態では、様々な活性化剤またはそれらの混合物等の様々な培養条件を用いて、様々な培養物からγδＴ細胞を活性化させ、増殖させることにより、別個のクローン性または混合ポリクローン性の集団サブセットを達成することができる。一部の実例では、別個の集団サブセットを精製及び／または混和して、追加のクローン性または混合ポリクローン性の集団サブセットを生み出すことができる。一部の実施形態では、異なるアゴニスト薬剤を用いて、特定のγδＴ細胞活性化シグナルをもたらす薬剤を同定することができる。一態様では、特定のγδＴ細胞活性化シグナルをもたらす薬剤は、γδＴＣＲに対して向けられた様々なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）であり得る。
一態様では、ＭＡｂは、δＴＣＲ及び／またはγＴＣＲの定常または可変領域上の異なるエピトープに結合することができる。一態様では、ＭＡｂは、汎γδＴＣＲ ＭＡｂを含み得る。一態様では、汎γδＴＣＲ ＭＡｂは、δ３＋細胞集団を含めた、γ鎖もしくはδ鎖のいずれかまたは両鎖上の様々なγ及びδＴＣＲが共通に有するドメインを認識し得る。一態様では、抗体は、５Ａ６．Ｅ９（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｂ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＭＭＵ５１０及び／または１１Ｆ２（１１Ｆ２）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）であり得る。一態様では、ＭＡｂは、γ鎖の可変領域に固有の特定のドメイン（Ｖγ９ＴＣＲに向けられた７Ａ５ Ｍａｂ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号ＴＣＲ１７２０））、またはＶδ１可変領域上（Ｍａｂ ＴＳ８．２（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号ＴＣＲ１７３０、ＭＡｂ ＴＳ−１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号ＴＣＲ １０５５）、ＭＡｂ Ｒ９．１２（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ番号ＩＭ１７６１））、もしくはＶδ２鎖上のドメイン（ＭＡｂ １５Ｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号ＴＣＲ１７３２またはＬｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ番号ＴＣＲ２７３２）Ｂ６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ番号３３１４０２）、ＰＣＴ／ＵＳ１７／３２５３０に記載されるδ１−（番号）抗体のうちの１つもしくは複数、ＰＣＴ／ＵＳ１７／３２５３０に記載されるδ２−（番号）抗体のうちの１つもしくは複数、またはδ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８のうちの１つもしくは複数）に向けられ得る。
一部の実施形態では、γδＴＣＲの異なるドメインに対する抗体（汎抗体及びサブセット集団上の特定の可変領域エピトープを認識する抗体）を組み合わせて、γδＴ細胞及び／またはその１つもしくは複数の亜集団の活性化及び増殖を強化するそれらの能力を評価するか、またはそれらの能力を利用することができる。一部の実施形態では、γδＴ細胞活性化因子は、ＭＩＣＡ、ＮＫＧ２Ｄに対するアゴニスト抗体、例えばＦｃタグとの、ＭＩＣＡ、ＵＬＢＰ１、またはＵＬＢＰ３（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ＵＬＢＰ２、またはＵＬＢＰ６（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）の融合タンパク質等の、γδＴＣＲ結合剤を含み得る。一部の実施形態では、細胞アネルギー及びアポトーシスを誘導することなく特定のγδＴ細胞増殖を誘発するのを補助するためのコンパニオン共刺激剤が、本発明の方法及び組成物において同定され得るか、または使用され得る。これらの共刺激剤は、以下のうちの１つまたは複数に対するリガンド（複数可）等の、γδ細胞上で発現される受容体に対するリガンドを含み得る：ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６１、ＣＤ７０、ＪＡＭＬ、ＤＮＡＸ、ＣＤ８１補助分子−１（ＤＮＡＭ−１）、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１９６、ＣＤ１３７、ＣＤ３０、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ、ＣＤ１２２、ＤＡＰ、及びＣＤ２８。一部の態様では、共刺激剤は、ＣＤ２及びＣＤ３分子上の固有のエピトープに対して特異的な抗体であり得る。ＣＤ２及びＣＤ３は、αβまたはγδＴ細胞（複数可）上で発現されるとき、異なる立体構造を有し得、一部の実例では、ＣＤ３及びＣＤ２に対する特異的抗体は、γδＴ細胞の選択的活性化及び増殖をもたらし得る。
γδＴ細胞の集団（例えば、δ３γδＴ細胞を含む集団）を、γδＴ細胞の操作の前にエクスビボで増殖させてもよい。インビトロでのγδＴ細胞集団の増殖を容易にするために使用され得る試薬の非限定的な例としては、抗ＣＤ３または抗ＣＤ２、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ７０、抗ＯＸ４０抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２１、ＩＬ２３、ＩＬ−３３、ＩＦＮγ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）、コンカバリンＡ（ＣｏｎＡ）、ヨウシュヤマゴボウ（ＰＷＭ）、タンパク質ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）、ダイズ凝集素（ＳＢＡ）、Ｌｅｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ凝集素（ＬＣＡ）、Ｐｉｓｕｍ Ｓａｔｉｖｕｍ凝集素（ＰＳＡ）、Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ凝集素（ＨＰＡ）、Ｖｉｃｉａ ｇｒａｍｉｎｅａレクチン（ＶＧＡ）、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ Ｖｕｌｇａｒｉｓエリスロアグルチニン（ＰＨＡ−Ｅ）、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ Ｖｕｌｇａｒｉｓロイコアグルチニン（ＰＨＡ−Ｌ）、Ｓａｍｂｕｃｕｓ Ｎｉｇｒａレクチン（ＳＮＡ、ＥＢＬ）、Ｍａａｃｋｉａ ＡｍｕｒｅｎｓｉｓレクチンＩＩ（ＭＡＬ ＩＩ）、Ｓｏｐｈｏｒａ Ｊａｐｏｎｉｃａ凝集素（ＳＪＡ）、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ Ｂｉｆｌｏｒｕｓ凝集素（ＤＢＡ）、Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ凝集素（ＬＣＡ）、Ｗｉｓｔｅｒｉａ Ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａレクチン（ＷＦＡ、ＷＦＬ）、またはＴ細胞増殖を刺激することが可能な別の好適なマイトジェンが挙げられる。
γδＴ細胞（複数可）の遺伝子操作は、腫瘍認識部分、例えば、αβＴＣＲ、γδＴＣＲ、抗体、その抗原結合断片をコードするＣＡＲ、及び／またはリンパ球活性化ドメインを発現する構築物を、単離されたγδＴ細胞のゲノムに安定に組み込むこと、エクスビボ及びインビボでのＴ細胞の増殖、生存、及び機能を強化するためのサイトカイン（例えば、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−３３、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−２３、またはＩＬ−１β）を含んでもよい。単離されたγδＴ細胞の遺伝子操作はまた、単離されたγδＴ細胞のゲノムにおいて、ＭＨＣ遺伝子座（単数）（遺伝子座（複数））等の、１つまたは複数の内因性遺伝子による遺伝子発現を欠失させるかまたは妨害することを含んでもよい。
γδＴ細胞のエクスビボ発現
他の態様では、本開示は、養子移入療法に向けた非操作型及び操作型γδＴ細胞の集団のエクスビボ増殖のための方法を提供する。本開示の非操作型または操作型γδＴ細胞は、エクスビボで増殖させてもよい。本開示の非操作型または操作型γδＴ細胞は、ＡＰＣによる活性化を伴わずに、あるいはＡＰＣ及び／またはアミノホスホネートとの共培養を伴わずに、インビトロで増殖させることができる。追加として、または代替として、本開示の非操作型または操作型γδＴ細胞は、ＡＰＣによる活性化、あるいはＡＰＣ及び／または１つもしくは複数のアミノホスホネートとの共培養を含む、少なくとも１つの増殖ステップを用いて、インビトロで増殖させることができる。
一部の実施形態では、本開示の非操作型または操作型γδＴ細胞は、第１のγδＴ細胞増殖においてＡＰＣによる活性化を伴わずにインビトロで増殖させ、次いで第２のγδＴ細胞増殖においてＡＰＣによる活性化を用いてインビトロで増殖させることができる。一部の実例では、第１のγδＴ細胞増殖は、γδＴ細胞を、（ａ）γδＴ細胞を増殖させる、または（ｂ）δ３ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ３Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つまたは複数の薬剤と接触させることを含む。
一部の実例では、第２のγδＴ細胞増殖は、第１のγδＴ細胞増殖において使用された１つもしくは複数の薬剤を含まない、または第１のγδＴ細胞増殖において使用された１つもしくは複数の薬剤のうちの１つを含まない、培養基中で行われる。一部の実例では、第２のγδＴ細胞増殖は、（ａ）Ｔ細胞を増殖させる、（ｂ）γδＴ細胞を選択的に増殖させる（例えば、αβＴ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞と比較して）、または（ｃ）δ３ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ３Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つまたは複数の第２の薬剤を含有する培養基中で行われる。
一部の実例では、第２の薬剤は、第１のγδＴ細胞増殖において使用された薬剤と比較して異なる（例えば、異なる一次アミノ酸配列を有する、及び／または構造的に異なるγδＴＣＲエピトープに結合する）。一部の実例では、第２の薬剤は、第１のγδＴ細胞増殖において使用された薬剤のうちの１つまたは複数と重複するγδＴＣＲエピトープ、同じγδＴＣＲエピトープに結合するか、または第１のγδＴ細胞増殖において使用された薬剤のうちの１つまたは複数とγδＴＣＲへの結合を競合し得る。一部の実例では、第２の薬剤は、ＡＰＣの細胞表面上で発現される。一部の実例では、第２の薬剤は、例えば、第２の薬剤の定常領域とＡＰＣの表面上のＦｃ受容体との間の結合相互作用によって、ＡＰＣの表面に結合するものである。一部の実例では、第２の薬剤は、可溶性である。一部の実例では、第２のγδＴ細胞増殖は、可溶性の第２の薬剤及びＡＰＣを含有する培養基中で行われ、任意選択で、ここにおいてＡＰＣは、γδＴ細胞集団を増殖させるかまたは選択的に増殖させる薬剤をそれらの細胞表面上に発現するか、またはそれらの細胞表面上に結合させている。可溶性の第２の薬剤及びＡＰＣの表面上で発現されるかまたはその表面に結合した薬剤は、同じであることも、または異なることもでき、例えば、γδＴＣＲ上の同じまたは異なるエピトープに結合し得る。
一部の実例では、第１のγδＴ細胞増殖は、ＡＰＣを伴わずに行われ、第２のγδＴ細胞増殖は、ＡＰＣを伴って行われる。一部の実例では、第２のγδＴ細胞増殖は、ＡＰＣと、（ａ）Ｔ細胞を増殖させる、（ｂ）γδＴ細胞を選択的に増殖させる、または（ｃ）δ３ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ３Ｔ細胞を選択的に増殖させる、１つまたは複数の第２の薬剤とを伴って行われる。
当業者であれば、ある特定の実施形態において、本明細書に記載される第２の増殖ステップの方法が第１の増殖ステップとして行われ得、本明細書に記載される第１のステップの方法が第２の増殖ステップとして行われ得ることを理解しよう。例として、かつ限定されないが、一部の実施形態では、混合細胞集団（例えば、ＰＢＭＣ）を、第１のステップにおいてＡＰＣと接触させることによって増殖させ、次いでＡＰＣの不在下で、例えば、第１の増殖ステップからの増殖させた集団を、δ３ＴＣＲに特有の活性化エピトープに結合することによってδ３Ｔ細胞を選択的に増殖させる固定化された薬剤と接触させることによって、増殖させることができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、Ｖγ１＋、Ｖγ２＋、またはＶγ３＋γδＴ細胞集団等の、種々のγδＴ細胞集団を増殖させることができる。
一部の事例では、γδＴ細胞集団は、インビトロで、３６日未満、３５日未満、３４日未満、３３日未満、３２日未満、３１日未満、３０日未満、２９日未満、２８日未満、２７日未満、２６日未満、２５日未満、２４日未満、２３日未満、２２日未満、２１日未満、２０日未満、１９日未満、１８日未満、１７日未満、１６日未満、１５日未満、１４日未満、１３日未満、１２日未満、１１日未満、１０日未満、９日未満、８日未満、７日未満、６日未満、５日未満、４日未満、または３日未満で増殖させることができる。
一部の態様では、混合細胞集団からのγδＴ細胞を活性化剤と接触させることによって、操作型及び非操作型γδＴ細胞を含めた種々のγδＴ細胞を選択的に増殖させるための方法が提供される。一部の実例では、活性化剤は、γδＴ細胞の細胞表面受容体上にある特定のエピトープに結合する。活性化剤は、モノクローナル抗体等の抗体であり得る。活性化剤またはそれらの組み合わせは、δ３細胞集団、δ２細胞集団、δ１細胞集団、δ１及びδ４細胞集団、またはδ１及びδ３細胞集団等の１つまたは複数の種類のγδＴ細胞の増殖を特異的に活性化させることができる。一部の実施形態活性化剤は、δ３細胞集団の増殖を特異的に活性化させて、濃縮δ３Ｔ細胞集団をもたらす。
活性化剤は、操作型及び非操作型γδＴ細胞（例えば、δ３γδＴ細胞）の増殖を速い成長速度で刺激し得る。例えば、薬剤は、３０時間未満に１回の細胞分裂、２９時間未満に１回の細胞分裂、２８時間未満に１回の細胞分裂、２７時間未満に１回の細胞分裂、２６時間未満に１回の細胞分裂、２５時間未満に１回の細胞分裂、２４時間未満に１回の細胞分裂、２３時間未満に１回の細胞分裂、２２時間未満に１回の細胞分裂、２１時間未満に１回の細胞分裂、２０時間未満に１回の細胞分裂、１９時間未満に１回の細胞分裂、１８時間未満に１回の細胞分裂、１７時間未満に１回の細胞分裂、１６時間未満に１回の細胞分裂、１５時間未満に１回の細胞分裂、１４時間未満に１回の細胞分裂、１３時間未満に１回の細胞分裂、１２時間未満に１回の細胞分裂、１１時間未満に１回の細胞分裂、１０時間未満に１回の細胞分裂、９時間未満に１回の細胞分裂、８時間未満に１回の細胞分裂、７時間未満に１回の細胞分裂、６時間未満に１回の細胞分裂、５時間未満に１回の細胞分裂、４時間未満に１回の細胞分裂、３時間未満に１回の細胞分裂、２時間未満に１回の細胞分裂の平均速度で、γδＴ細胞集団の増殖を刺激することができる。一部の実例では、速い増殖速度は、少なくとも約８時間の培養（例えば、８〜２４時間、または１〜３、１〜４、１〜８、２〜３、２〜４、もしくは２〜８日間、または約１９、２１、もしくは３０日未満）にわたって維持することができる。
一部の実例では、活性化剤は、約４時間毎に約１回の分裂の平均速度、約５時間毎に約１回の分裂の平均速度、約６時間毎に約１回の分裂の平均速度、約７時間毎に約１回の分裂の平均速度、約８時間毎に約１回の分裂の平均速度、約９時間毎に約１回の分裂の平均速度、約１０時間毎に約１回の分裂の平均速度、約１１時間毎に約１回の分裂の平均速度、約１２時間毎に約１回の分裂の平均速度、約１３時間毎に約１回の分裂の平均速度、約１４時間毎に約１回の分裂の平均速度、約１５時間毎に約１回の分裂の平均速度、約１６時間毎に約１回の分裂の平均速度、約１７時間毎に約１回の分裂の平均速度、約１８時間毎に約１回の分裂の平均速度、約１９時間毎に約１回の分裂の平均速度、約２０時間毎に約１回の分裂の平均速度、約２１時間毎に約１回の分裂の平均速度、約２２時間毎に約１回の分裂の速度、約２３時間毎に約１回の分裂の速度、約２４時間毎に約１回の分裂の平均速度、約２５時間毎に約１回の分裂の平均速度、約２６時間毎に約１回の分裂の平均速度、約２７時間毎に約１回の分裂の平均速度、約２８時間毎に約１回の分裂の速度、約２９時間毎に約１回の分裂の速度、約３０時間毎に約１回の分裂の平均速度、約３１時間毎に約１回の分裂の平均速度、約３２時間毎に約１回の分裂の平均速度、約３３時間毎に約１回の分裂の平均速度、約３４時間毎に約１回の分裂の速度、約３５時間毎に約１回の分裂の速度、約３６時間毎に約１回の分裂の平均速度で、操作型及び非操作型γδＴ細胞（例えば、δ３γδＴ細胞）の増殖を刺激し得る。一部の実例では、速い増殖速度は、少なくとも約８時間の培養（例えば、８〜２４時間、または１〜３、１〜４、１〜８、２〜３、２〜４、もしくは２〜８日間、または約１９、２１、もしくは３０日未満）にわたって維持することができる。
一部の実例では、活性化剤は、γδＴ細胞増殖培養物（例えば、δ３γδＴ細胞増殖培養物）中で、操作型及び／または非操作型γδＴ細胞（例えば、δ３γδＴ細胞）の迅速な増殖を刺激し得、ここで、迅速な増殖は、上述の細胞分裂の平均速度のうちのいずれか１つであり、約１連続日〜約１９連続日、約１連続日〜約１４連続日、約１連続日〜約７連続日、約１連続日〜約５連続日、約２連続日〜約１９連続日、約２連続日〜約１４連続日、約２連続日〜約７連続日、約２連続日〜約５連続日、約４連続日〜約１９連続日、約４連続日〜約１４連続日、約４連続日〜約７連続日、または約４連続日〜約５連続日にわたって維持される。
一部の実例では、活性化剤は、約２〜約７連続日、または約２〜約５連続日にわたって維持されているγδＴ細胞増殖培養物（例えば、δ３γδＴ細胞増殖培養物）中で、約１２時間（例えば、１０〜１２時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１３時間（例えば、１０〜１３時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１４時間（例えば、１０〜１４時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１５時間（例えば、１０〜１５時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１６時間（例えば、１０〜１６時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１７時間（例えば、１０〜１７時間または１２〜１７時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１８時間（例えば、１０〜１８時間または１２〜１８時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１９時間（例えば、１０〜１９時間または１２〜１９時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約２０時間（例えば、１２〜２０時間、１６〜２０時間、または１８〜２０時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約２１時間（例えば、１２〜２１時間、１６〜２１時間、または１８〜２１時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約２２時間（例えば、１２〜２２時間、１６〜２２時間、または１８〜２２時間）毎に約１回の分裂の速度、約２３時間以下（例えば、１２〜２３時間、１６〜２３時間、または１８〜２３時間）毎に約１回の分裂の速度、約２４時間（例えば、１２〜２４時間、１６〜２４時間、または１８〜２４時間）毎に約１回の分裂の平均速度で、操作型及び／または非操作型γδＴ細胞（例えば、δ３γδＴ細胞）の増殖を刺激し得る。
一部の実例では、活性化剤は、約２〜約７連続日、または約２〜約５連続日にわたって維持されているγδＴ細胞増殖培養物（例えば、δ３γδＴ細胞増殖培養物）中で、約２５時間（例えば、１２〜２５時間、１６〜２５時間、１８〜２５時間、または２０〜２５時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約２６時間（例えば、１２〜２６時間、１６〜２６時間、１８〜２６時間、または２０〜２６時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約２７時間（例えば、１２〜２７時間、１６〜２７時間、１８〜２７時間、または２０〜２７時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約２８時間（例えば、１２〜２８時間、１６〜２８時間、１８〜２８時間、２０〜２８時間、または２２〜２８時間）毎に約１回の分裂の速度、約２９時間（例えば、１６〜２９時間、１８〜２９時間、２０〜２９時間、または２２〜２９時間）毎に約１回の分裂の速度、約３０時間（例えば、１６〜３０時間、１８〜３０時間、２０〜３０時間、または２２〜３０時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約３１時間（例えば、１６〜３１時間、１８〜３１時間、２０〜３１時間、２２〜３１時間、または２４〜３１時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約３２時間（例えば、１８〜３２時間、２０〜３２時間、２２〜３２時間、または２４〜３２時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約３３時間（例えば、１８〜３３時間、２０〜３３時間、２２〜３３時間、または２４〜３３時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約３４時間（例えば、１８〜３４時間、２０〜３４時間、２２〜３４時間、または２４〜３４時間）毎に約１回の分裂の速度、約３５時間（例えば、１８〜３５時間、２０〜３５時間、２２〜３５時間、または２４〜３５時間）毎に約１回の分裂の速度、約３６時間（例えば、１８〜３６時間、２０〜３６時間、２２〜３６時間、または２４〜３６時間）毎に約１回の分裂の平均速度で、操作型及び／または非操作型γδＴ細胞（例えば、δ３γδＴ細胞）の増殖を刺激し得る。
一部の実例では、活性化剤は、少なくとも１４連続日にわたって維持されているγδＴ細胞増殖培養物（例えば、δ３γδＴ細胞増殖培養物）中で、約１２時間（例えば、１０〜１２時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１３時間（例えば、１０〜１３時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１４時間（例えば、１０〜１４時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１５時間（例えば、１０〜１５時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１６時間（例えば、１０〜１６時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１７時間（例えば、１０〜１７時間または１２〜１７時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１８時間（例えば、１０〜１８時間または１２〜１８時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１９時間（例えば、１０〜１９時間または１２〜１９時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約２０時間（例えば、１２〜２０時間、１６〜２０時間、または１８〜２０時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約２１時間（例えば、１２〜２１時間、１６〜２１時間、または１８〜２１時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約２２時間（例えば、１２〜２２時間、１６〜２２時間、または１８〜２２時間）毎に約１回の分裂の速度、約２３時間以下（例えば、１２〜２３時間、１６〜２３時間、または１８〜２３時間）毎に約１回の分裂の速度、約２４時間（例えば、１２〜２４時間、１６〜２４時間、または１８〜２４時間）毎に約１回の分裂の平均速度で、操作型及び／または非操作型γδＴ細胞（例えば、δ３γδＴ細胞）の増殖を刺激し得る。
一部の実例では、活性化剤は、少なくとも１４連続日にわたって維持されているγδＴ細胞増殖培養物中で、約２５時間（例えば、１２〜２５時間、１６〜２５時間、１８〜２５時間、または２０〜２５時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約２６時間（例えば、１２〜２６時間、１６〜２６時間、１８〜２６時間、または２０〜２６時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約２７時間（例えば、１２〜２７時間、１６〜２７時間、１８〜２７時間、または２０〜２７時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約２８時間（例えば、１２〜２８時間、１６〜２８時間、１８〜２８時間、２０〜２８時間、または２２〜２８時間）毎に約１回の分裂の速度、約２９時間（例えば、１６〜２９時間、１８〜２９時間、２０〜２９時間、または２２〜２９時間）毎に約１回の分裂の速度、約３０時間（例えば、１６〜３０時間、１８〜３０時間、２０〜３０時間、または２２〜３０時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約３１時間（例えば、１６〜３１時間、１８〜３１時間、２０〜３１時間、２２〜３１時間、または２４〜３１時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約３２時間（例えば、１８〜３２時間、２０〜３２時間、２２〜３２時間、または２４〜３２時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約３３時間（例えば、１８〜３３時間、２０〜３３時間、２２〜３３時間、または２４〜３３時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約３４時間（例えば、１８〜３４時間、２０〜３４時間、２２〜３４時間、または２４〜３４時間）毎に約１回の分裂の速度、約３５時間（例えば、１８〜３５時間、２０〜３５時間、２２〜３５時間、または２４〜３５時間）毎に約１回の分裂の速度、約３６時間（例えば、１８〜３６時間、２０〜３６時間、２２〜３６時間、または２４〜３６時間）毎に約１回の分裂の平均速度で、操作型及び／または非操作型γδＴ細胞（例えば、δ３γδＴ細胞）の増殖を刺激し得る。
一部の実例では、活性化剤は、少なくとも１９連続日にわたって維持されているγδＴ細胞増殖培養物中で、約１２時間（例えば、１０〜１２時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１３時間（例えば、１０〜１３時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１４時間（例えば、１０〜１４時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１５時間（例えば、１０〜１５時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１６時間（例えば、１０〜１６時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１７時間（例えば、１０〜１７時間または１２〜１７時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１８時間（例えば、１０〜１８時間または１２〜１８時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約１９時間（例えば、１０〜１９時間または１２〜１９時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約２０時間（例えば、１２〜２０時間、１６〜２０時間、または１８〜２０時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約２１時間（例えば、１２〜２１時間、１６〜２１時間、または１８〜２１時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約２２時間（例えば、１２〜２２時間、１６〜２２時間、または１８〜２２時間）毎に約１回の分裂の速度、約２３時間以下（例えば、１２〜２３時間、１６〜２３時間、または１８〜２３時間）毎に約１回の分裂の速度、約２４時間（例えば、１２〜２４時間、１６〜２４時間、または１８〜２４時間）毎に約１回の分裂の平均速度で、操作型及び／または非操作型γδＴ細胞（例えば、δ３γδＴ細胞）の増殖を刺激し得る。
一部の実例では、活性化剤は、少なくとも１９連続日にわたって維持されているγδＴ細胞増殖培養物（例えば、δ３γδＴ細胞増殖培養物）中で、約２５時間（例えば、１２〜２５時間、１６〜２５時間、１８〜２５時間、または２０〜２５時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約２６時間（例えば、１２〜２６時間、１６〜２６時間、１８〜２６時間、または２０〜２６時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約２７時間（例えば、１２〜２７時間、１６〜２７時間、１８〜２７時間、または２０〜２７時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約２８時間（例えば、１２〜２８時間、１６〜２８時間、１８〜２８時間、２０〜２８時間、または２２〜２８時間）毎に約１回の分裂の速度、約２９時間（例えば、１６〜２９時間、１８〜２９時間、２０〜２９時間、または２２〜２９時間）毎に約１回の分裂の速度、約３０時間（例えば、１６〜３０時間、１８〜３０時間、２０〜３０時間、または２２〜３０時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約３１時間（例えば、１６〜３１時間、１８〜３１時間、２０〜３１時間、２２〜３１時間、または２４〜３１時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約３２時間（例えば、１８〜３２時間、２０〜３２時間、２２〜３２時間、または２４〜３２時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約３３時間（例えば、１８〜３３時間、２０〜３３時間、２２〜３３時間、または２４〜３３時間）毎に約１回の分裂の平均速度、約３４時間（例えば、１８〜３４時間、２０〜３４時間、２２〜３４時間、または２４〜３４時間）毎に約１回の分裂の速度、約３５時間（例えば、１８〜３５時間、２０〜３５時間、２２〜３５時間、または２４〜３５時間）毎に約１回の分裂の速度、約３６時間（例えば、１８〜３６時間、２０〜３６時間、２２〜３６時間、または２４〜３６時間）毎に約１回の分裂の平均速度で、操作型及び／または非操作型γδＴ細胞（例えば、δ３γδＴ細胞）の増殖を刺激し得る。
活性化剤は、操作型または非操作型γδＴ細胞の亜集団の増殖を様々な成長速度で刺激し得る。例えば、薬剤は、δ３細胞集団の成長を、１日〜９０日間の培養（例えば、約１日〜約１９、２１、または２３日間の培養）の期間にわたって、増殖が、培養物中のδ１またはδ２集団等の別のγδＴ細胞集団と比べて、増殖前のγδＴ細胞の出発数と比べて、増殖前のγδ３Ｔ細胞の出発数と比べて、またはαβＴ細胞集団と比べて、約１０倍超、１００倍超、２００倍超、３００倍超、４００倍超、５００倍超、６００倍超、７００倍超、８００倍超、９００倍超、１，０００倍超、１０，０００倍超、２０，０００倍超、３０，０００倍超、５０，０００倍超、７０，０００倍超、１００，０００倍超、または１，０００，０００倍超の増殖をもたらすような、より速い速度で刺激し得る。
一部の態様では、本開示は、３０時間毎に約１回の細胞分裂の速度またはより速い速度等の迅速な速度でγδＴ細胞集団の増殖を刺激する薬剤と接触している、操作型または非操作型γδＴ細胞集団（例えば、δ３γδＴ細胞集団）を提供する。一部の実例では、該薬剤は、δ３Ｔ細胞の増殖を選択的に刺激する。γδＴ細胞集団は、ある量の非操作型γδＴ細胞及びある量の操作型γδＴ細胞を含み得る。一部の実例では、γδＴ細胞集団は、異なるパーセンテージのδ１、δ２、δ３、及び／またはδ４Ｔ細胞を含む。一部の実例では、γδＴ細胞集団は、異なるパーセンテージのδ１、δ２、δ３、及び／またはδ４Ｔ細胞を含み、任意の他のγδＴ細胞亜集団よりも多くのδ３γδＴ細胞を含有する、及び／または主として（＞５０％）δ３γδＴ細胞を含有する。操作型または非操作型γδＴ細胞集団は、例えば、９０％未満のδ３Ｔ細胞、８０％未満のδ３Ｔ細胞、７０％未満のδ３Ｔ細胞、６０％未満のδ３Ｔ細胞、５０％未満のδ３Ｔ細胞、４０％未満のδ３Ｔ細胞、３０％未満のδ３Ｔ細胞、２０％未満のδ３Ｔ細胞、１０％未満のδ３Ｔ細胞、または５％未満のδ３Ｔ細胞を含み得る。代替として、操作型または非操作型γδＴ細胞集団は、５％超のδ３Ｔ細胞、１０％超のδ３Ｔ細胞、２０％超のδ３Ｔ細胞、３０％超のδ３Ｔ細胞、４０％超のδ３Ｔ細胞、５０％超のδ３Ｔ細胞、６０％超のδ３Ｔ細胞、７０％超のδ３Ｔ細胞、８０％超のδ３Ｔ細胞、または９０％超のδ３Ｔ細胞を含み得る。一部の実例では、該薬剤は、本明細書に記載される選択的増殖剤のうちの１つである。一部の実例では、該薬剤は、細胞培養物表面、またはＡＰＣの表面（例えば、ＡＰＣの表面上で発現されるか、またはＡＰＣの表面上で発現されるＦｃ受容体に結合している）等の表面上に固定化されている。
操作型または非操作型γδＴ細胞集団は、例えば、９０％未満のδ２Ｔ細胞、８０％未満のδ２Ｔ細胞、７０％未満のδ２Ｔ細胞、６０％未満のδ２Ｔ細胞、５０％未満のδ２Ｔ細胞、４０％未満のδ２Ｔ細胞、３０％未満のδ２Ｔ細胞、２０％未満のδ２Ｔ細胞、１０％未満のδ２Ｔ細胞、または５％未満のδ２Ｔ細胞を含み得る。代替として、操作型または非操作型γδＴ細胞集団は、５％超のδ２Ｔ細胞、１０％超のδ２Ｔ細胞、２０％超のδ２Ｔ細胞、３０％超のδ２Ｔ細胞、４０％超のδ２Ｔ細胞、５０％超のδ２Ｔ細胞、６０％超のδ２Ｔ細胞、７０％超のδ２Ｔ細胞、８０％超のδ２Ｔ細胞、または９０％超のδ２Ｔ細胞を含み得る。
操作型または非操作型γδＴ細胞集団は、例えば、９０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、８０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、７０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、６０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、５０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、４０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、３０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、２０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、１０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、または５％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞を含み得る。代替として、操作型または非操作型γδＴ細胞集団は、５％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、１０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、２０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、３０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、４０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、５０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、６０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、７０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、８０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、または９０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞を含み得る。
操作型または非操作型γδＴ細胞集団は、例えば、９０％未満のδ４Ｔ細胞、８０％未満のδ４Ｔ細胞、７０％未満のδ４Ｔ細胞、６０％未満のδ４Ｔ細胞、５０％未満のδ４Ｔ細胞、４０％未満のδ４Ｔ細胞、３０％未満のδ４Ｔ細胞、２０％未満のδ４Ｔ細胞、１０％未満のδ４Ｔ細胞、または５％未満のδ４Ｔ細胞を含み得る。代替として、操作型または非操作型γδＴ細胞集団は、５％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、１０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、２０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、３０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、４０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、５０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、６０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、７０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、８０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞、または９０％超のδ１及びδ４Ｔ細胞を含み得る。操作型または非操作型γδＴ細胞集団は、例えば、９０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、８０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、７０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、６０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、５０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、４０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、３０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、２０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、１０％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞、または５％未満のδ１及びδ４Ｔ細胞を含み得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、１０〜９０％のδ３Ｔ細胞及び９０〜１０％のδ２Ｔ細胞を含む、増殖させたγδＴ細胞集団の混和物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、１０〜９０％のδ３Ｔ細胞及び９０〜１０％のδ１Ｔ細胞を含む、増殖させたγδＴ細胞集団の混和物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、１０〜９０％のδ１及びδ３Ｔ細胞ならびに９０〜１０％のδ２Ｔ細胞を含む、増殖させたγδＴ細胞集団の混和物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、１０〜９０％のδ３及びδ２Ｔ細胞ならびに９０〜１０％のδ１Ｔ細胞を含む、増殖させたγδＴ細胞集団の混和物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、１０〜９０％のδ１、δ３、δ４、及びδ５Ｔ細胞ならびに９０〜１０％のδ２Ｔ細胞を含む、増殖させたγδＴ細胞集団の混和物を提供する。
１つまたは複数の活性化剤が、γδＴ細胞に接触することができ（例えば、γδＴＣＲ等の、γδＴ細胞の表面上の受容体に結合する活性化因子）、その後、共刺激分子がγδＴ細胞に接触して、さらなる刺激をもたらすと共にγδＴ細胞を増殖させることができる。一部の実施形態では、活性化剤及び／または共刺激剤は、植物または非植物起源のレクチン、γδＴ細胞を活性化させるモノクローナル抗体、及び他の非レクチン／非抗体薬剤であり得る。他の実例では、植物レクチンは、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）であり得るが、他の植物レクチン等が使用されてもよい。レクチンの他の例としては、タンパク質ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）、ダイズ凝集素（ＳＢＡ）、ｌｅｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ凝集素（ＬＣＡ）、ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ凝集素（ＰＳＡ）、Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ凝集素（ＨＰＡ）、Ｖｉｃｉａ ｇｒａｍｉｎｅａレクチン（ＶＧＡ）、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ Ｖｕｌｇａｒｉｓエリスロアグルチニン（ＰＨＡ−Ｅ）、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ Ｖｕｌｇａｒｉｓロイコアグルチニン（ＰＨＡ−Ｌ）、Ｓａｍｂｕｃｕｓ Ｎｉｇｒａレクチン（ＳＮＡ、ＥＢＬ）、Ｍａａｃｋｉａ ＡｍｕｒｅｎｓｉｓレクチンＩＩ（ＭＡＬ ＩＩ）、Ｓｏｐｈｏｒａ Ｊａｐｏｎｉｃａ凝集素（ＳＪＡ）、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ Ｂｉｆｌｏｒｕｓ凝集素（ＤＢＡ）、Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ凝集素（ＬＣＡ）、及びＷｉｓｔｅｒｉａ Ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａレクチン（ＷＦＡ、ＷＦＬ）が挙げられる。
活性化剤及び共刺激分子の非限定的な例としては、本明細書に記載されるδもしくはγ鎖またはそのサブタイプに選択的ないずれか１つまたは複数の抗体、５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ６、Ｂ３、ＴＳ−１、γ３．２０、７Ａ５、ＩＭＭＵ５１０、Ｒ９．１２、１１Ｆ２等の抗体、またはそれらの組み合わせが挙げられる。活性化剤及び共刺激分子の他の例としては、ゾレドロネート、ホルボール１２−ミリステート−１３−アセテート（ＴＰＡ）、メゼレイン、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、連鎖球菌プロテインＡ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
他の実例では、活性化剤及び／または共刺激剤は、αＴＣＲ、βＴＣＲ、γＴＣＲ、δＴＣＲ、ＣＤ２７７、ＣＤ２８、ＣＤ４６、ＣＤ８１、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、ＣＤ３０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＨＶＥＭ、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＤＡＰ、ＣＤ１２２、ＧＩＴＲ、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１、ＣＤ１６、ＣＤ１６１、ＤＮＡＸ、補助分子−１（ＤＮＡＭ−１）、１つもしくは複数のＮＣＲ（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６）、ＳＬＡＭ、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体、またはそれらの組み合わせに対する抗体またはリガンドであり得る。
操作型γδＴ細胞
操作型γδＴ細胞（例えば、δ３γδＴ細胞）は、当該技術分野で既知の種々の方法により生成されてもよい。操作型γδＴ細胞は、特定の腫瘍認識部分を安定に発現するように設計されてもよい。腫瘍認識部分または別の種類の認識部分を含む発現カセットをコードするポリヌクレオチドは、トランスポゾン／トランスポサーゼ系またはレンチウイルスもしくはレトロウイルス系等のウイルスに基づく遺伝子移入系、または別の好適な方法、例えば、トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、リポフェクション、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）、Ｏｒｍｏｓｉｌ等のナノ操作型物質、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスを含めたウイルス送達法、または別の好適な方法によって、γδＴ細胞に安定に導入することができる。αβまたはγδのいずれかである抗原特異的ＴＣＲは、抗原特異的ＴＣＲの遺伝コードを含むポリヌクレオチドをγδＴ細胞のゲノムに安定に挿入することによって、操作型γδＴ細胞に導入することができる。腫瘍認識部分を有するＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドをγδＴ細胞のゲノムに安定に挿入することによって、操作型γδＴ細胞に導入されてもよい。一部の実例では、操作された腫瘍認識部分は、操作されたＴ細胞受容体であり、操作型γδＴ細胞のゲノムに組み込まれた発現カセットは、操作されたＴＣＲα（ＴＣＲアルファ）遺伝子、操作されたＴＣＲβ（ＴＣＲベータ）遺伝子、ＴＣＲδ（ＴＣＲデルタ）遺伝子、または操作されたＴＣＲγ（ＴＣＲガンマ）遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実例では、操作型γδＴ細胞のゲノムに組み込まれた発現カセットは、抗体断片またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実例では、抗体断片またはその抗原結合断片は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物、またはＣＡＲとＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とを含む、もしくはＣＡＲと異なる抗原に向けられた抗体とを含む二重特異性構築物の一部として細胞表面腫瘍抗原に結合する、全抗体、抗体断片、１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｃ、抗体上の軽鎖もしくは重鎖、抗体の可変もしくは定常領域、またはそれらの任意の組み合わせをコードするポリヌクレオチドである。一部の実例では、ポリヌクレオチドは、ヒトに由来するか、または別の種に由来する。非ヒト種に由来する抗体断片または抗原結合断片ポリヌクレオチドは、ヒトにおいて天然に産生される抗体バリアントへのそれらの類似性を増加させるように改変することができ、抗体断片または抗原結合断片は、部分的または完全にヒト化され得る。抗体断片または抗原結合断片ポリヌクレオチドはまた、キメラ、例えばマウス−ヒト抗体キメラであることもできる。ＣＡＲを発現する操作型γδＴ細胞はまた、腫瘍認識部分によって認識される抗原に対するリガンドを発現するように操作することもできる。
当該技術分野で既知の種々の技法を用いて、腫瘍認識部分の遺伝コードを含む、クローニングされたまたは合成的に操作された核酸を、操作型γδＴ細胞のゲノム内の特定の位置に導入することができる。それぞれＷＯ２０１４０９３７０、ＷＯ２００３０８７３４１、ＷＯ２０１４１３４４１２、及びＷＯ２０１１０９０８０４（これらの各々は参照によりその全体が本明細書に援用される）により記載される、微生物の規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）系からのＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮｓ）、及びメガヌクレアーゼの技術を用いて、γδＴ細胞（複数可）における効率的なゲノム操作をもたらすことができる。本明細書に記載される技術をまた用いて、１つの遺伝子のノックアウトと別の遺伝子のノックインとを同時にもたらすゲノム位置に発現カセットを挿入することもできる。例えば、本開示の発現カセットを含むポリヌクレオチドを、ＭＨＣ遺伝子をコードするゲノム領域に挿入することができる。かかる操作は、１つまたは複数の遺伝子、例えば、発現カセットに含まれる遺伝子のノックインと、別の遺伝子、例えば、ＭＨＣ遺伝子座のノックアウトとを同時にもたらすことができる。
１つの実例では、腫瘍認識部分をコードする核酸を含むＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンが、操作されようとしている細胞γδＴ細胞に導入される。ＵＳ７，９８５，７３９（参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されるトランスポサーゼ等の、野生型Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙと比較して強化された組み込みを可能にする変異体Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポサーゼを用いて、ポリヌクレオチドを操作型γδＴ細胞に導入してもよい。
一部の実例では、腫瘍認識部分を含むポリヌクレオチドを操作型γδＴ細胞のゲノムに導入するために、ウイルスによる方法が使用される。ＷＯ１９９３０２０２２１（参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載される方法等のいくつかのウイルスによる方法が、ヒトの遺伝子療法に使用されてきた。γδＴ細胞を操作するために使用され得るウイルスによる方法の非限定的な例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、またはアデノウイルス随伴ウイルスによる方法が挙げられる。
腫瘍認識部分の遺伝コードを含有するポリヌクレオチドは、操作型γδＴ細胞の成長、増殖、活性化状態に影響を及ぼす変異もしくは他の導入遺伝子、または精巣特異がん抗原等の腫瘍細胞に特異的な抗原を含んでもよい。本開示のγδＴ細胞は、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体における分子または共刺激因子等の、抗原認識部分に連結された活性化ドメインを含むポリヌクレオチドを発現するように操作されてもよい。操作型γδＴ細胞は、Ｔリンパ球活性化ドメインである細胞内シグナル伝達ドメインを発現することができる。γδＴ細胞は、細胞内活性化ドメイン遺伝子または細胞内シグナル伝達ドメインを発現するように操作されてもよい。細胞内シグナル伝達ドメイン遺伝子は、例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＪＡＭＬ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ４、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＬ−２ＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ分子、ＣＤ７０、サイトカイン受容体、ＣＤ４０、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。一部の実例では、操作型γδＴ細胞はまた、サイトカイン、抗原、細胞受容体、または他の免疫調節分子を発現するようにも操作される。
操作型γδＴ細胞に発現させるべき適切な腫瘍認識部分は、処置対象の疾患に基づいて選択することができる。例えば、一部の実例では、腫瘍認識部分は、ＴＣＲである。一部の実例では、腫瘍認識部分は、がん細胞上で発現されるリガンドに対する受容体である。好適な受容体の非限定的な例としては、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＣＤ２６、ＮＫＲＰ１、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＤＮＡＭ−１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、及びＮＫｐ８０が挙げられる。一部の実例では、腫瘍認識部分は、リガンド、例えば、ＩＬ−１３リガンド、または腫瘍抗原に対するリガンド模倣体、例えばＩＬ１３Ｒに対するＩＬ−１３模倣体を含み得る。
γδＴ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＣＤ２６、ＮＫＲＰ１、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＤＮＡＭ−１、または抗Ｈｅｒ２ｎｅｕもしくは抗ＥＧＦＲ等の抗腫瘍抗体に由来するリガンド結合ドメインを含む、キメラ腫瘍認識部分、ならびにＣＤ３−ζ、Ｄａｐ１０、Ｄａｐ１２、ＣＤ２８、４１ＢＢ、及びＣＤ４０Ｌから得られたシグナル伝達ドメインを発現するように操作されてもよい。一部の例では、キメラ受容体は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、メソテリン、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＰＳＡ、ＲＯＮ、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７０、ＣＤ７５、ＣＡ６、ＧＤ２、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＳ１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１６、５Ｔ４、ＮａＰｉ２ｂ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＰＬＩＦ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＭＮＢ、ＬＩＶ−１、糖脂質Ｆ７７、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＳＰＧ４、ＣＤ４４ｖ６、ＰＶＲＬ−４、ＶＥＧＦＲ２、Ｃ４．４ａ、ＰＳＣＡ、葉酸結合タンパク質／受容体、ＳＬＣ４４Ａ４、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＡＸＬ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−３Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＳＬＴＲＫ６、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＮＹＥＳＯ−１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＭＡＧＥＡファミリー遺伝子（例えばＭＡＧＥＡ３．ＭＡＧＥＡ４）、ＫＫＬＣ１、変異型ｒａｓ（Ｈ、Ｎ、Ｋ）、ＢＲａｆ、ｐ５３、βカテニン、ＥＧＦＲＴ７９０、ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ａ（ＭＩＣＡ）、もしくはＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ｂ（ＭＩＣＢ）、またはＨＰＶ、ＣＭＶ、もしくはＥＢＶの１つもしくは複数の抗原に結合する。
一部の実例では、腫瘍認識部分は、腫瘍関連ペプチドと複合体を形成したＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃ）を標的とする。ＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成した腫瘍関連ペプチドを標的とする腫瘍認識部分を生成し、使用するための方法及び組成物には、Ｗｅｉｄａｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：３２８−４０，２０１１、Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．４（５）：６４７−８，２０１３、Ｃｈｅｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５（１７）：５３２３−３７，２００９、Ｄｏｈａｎ ＆ Ｒｅｉｔｅｒ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．１４：ｅ６，２０１２、Ｄａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１３ Ｍａｒ １３；５（１７６）：１７６ｒａ３３、Ｕ．Ｓ．９，５４０，４４８、及びＷＯ２０１７／０１１８０４に記載されるものが含まれる。一部の実施形態では、ペプチドＭＨＣ複合体の標的とする腫瘍関連ペプチドは、ウィルムス腫瘍タンパク質１（ＷＴ１）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、サバイビン、マウス二重微小染色体２相同体（ＭＤＭ２）、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１Ｂ）、ＫＲＡＳ、またはＢＲＡＦのペプチドである。
γδＴ細胞において、操作型γδＴ細胞から安定に発現させた遺伝学的に異なる、実質的に異なる、もしくは実質的に同一のαβＴＣＲポリヌクレオチドから、または操作型γδＴ細胞に安定に組み込まれた遺伝学的に別個のαβＴＣＲポリヌクレオチドから、２つ以上の腫瘍認識部分を発現させてもよい。遺伝学的に別個のαβＴＣＲ（複数可）の場合、同じ病態に関連付けられる異なる抗原を認識するαβＴＣＲ（複数可）が利用されてもよい。好ましい一実施形態では、γδＴ細胞は、異なるＭＨＣハプロタイプの関連において同じ抗原を認識する１つまたは複数の発現カセットから、ヒトまたはマウス起源の、異なるＴＣＲを発現するように操作される。別の好ましい実施形態では、γδＴ細胞は、１つのＴＣＲと、異なるＭＨＣハプロタイプと複合体化された所与の抗原からの同じまたは異なるペプチドに向けられた２つ以上の抗体とを発現するように操作される。一部の実例では、操作型γδＴ細胞による単一のＴＣＲの発現が、適正なＴＣＲ対合を容易にする。異なるＴＣＲを発現する操作型γδＴ細胞は、普遍的な同種異系の操作型γδＴ細胞をもたらすことができる。第２の好ましい実施形態では、γδＴ細胞は、ペプチド−ＭＨＣ複合体に向けられる１つまたは複数の異なる抗体を発現するように操作され、各抗体が、同じまたは異なるＭＨＣハプロタイプと複合体化された同じまたは異なるペプチドに向けられる。一部の実例では、腫瘍認識部分は、ペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体であり得る。
γδＴ細胞は、異なるＭＨＣハプロタイプの関連において同じ抗原を認識する１つまたは複数の発現カセットからＴＣＲを発現するように操作することができる。一部の実例では、操作型γδＴ細胞は、操作型細胞内でのＴＣＲ誤対合の可能性を最小限にするために、単一のＴＣＲ、またはＣＡＲと組み合わせたＴＣＲを発現するように設計される。２つ以上の発現カセットから発現される腫瘍認識部分は、好ましくは、異なるポリヌクレオチド配列を有し、例えば異なるＨＬＡハプロタイプの関連において、同じ標的の異なるエピトープを認識する腫瘍認識部分をコードする。かかる異なるＴＣＲまたはＣＡＲを発現する操作型γδＴ細胞は、普遍的な同種異系の操作型γδＴ細胞をもたらすことができる。
一部の実例では、γδＴ細胞は、１つまたは複数の腫瘍認識部分を発現するように操作される。２つ以上の腫瘍認識部分を、γδＴ細胞において操作された遺伝学的に同一の、または実質的に同一の抗原特異的キメラ（ＣＡＲ）ポリヌクレオチドから発現させてもよい。２つ以上の腫瘍認識部分を、γδＴ細胞において操作された遺伝学的に別個のＣＡＲポリヌクレオチドから発現させてもよい。遺伝学的に別個のＣＡＲ（複数可）は、同じ病態に関連付けられる異なる抗原を認識するように設計されてもよい。
γδＴ細胞は代替として、二重特異性であってもよい。二重特異性操作型γδＴ細胞は、２つ以上の腫瘍認識部分を発現することができる。二重特異性操作型γδＴ細胞は、ＴＣＲ腫瘍認識部分及びＣＡＲ腫瘍認識部分の両方を発現することができる。二重特異性操作型γδＴ細胞は、同じ病態に関連付けられる異なる抗原を認識するように設計することができる。操作型γδＴ細胞は、同一または実質的に同一の抗原を認識する２つ以上のＣＡＲ／ＴＣＲ（複数可）二重特異性ポリヌクレオチドを発現することができる。操作型γδＴ細胞は、別個の抗原を認識する２つ以上のＣＡＲ／ＴＣＲ（複数可）二重特異性構築物を発現することができる。一部の実例では、本開示の二重特異性構築物は、標的細胞の活性化及び不活性化ドメインに結合し、それによって、増加した標的特異性をもたらす。γδＴ細胞は、少なくとも１個の腫瘍認識部分、少なくとも２個の腫瘍認識部分、少なくとも３個の腫瘍認識部分、少なくとも４個の腫瘍認識部分、少なくとも５個の腫瘍認識部分、少なくとも６個の腫瘍認識部分、少なくとも７個の腫瘍認識部分、少なくとも８個の腫瘍認識部分、少なくとも９個の腫瘍認識部分、少なくとも１０個の腫瘍認識部分、少なくとも１１個の腫瘍認識部分、少なくとも１２個の腫瘍認識部分、または別の好適な数の腫瘍認識部分を発現するように操作されてもよい。
適正なＴＣＲ機能は、ＩＴＡＭモチーフを含む２つの機能性ζ（ゼータ）タンパク質によって強化され得る。適正なＴＣＲ機能はまた、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＪＡＭＬ、ＰＤ−１、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４１−ＢＢ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４６、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＩＬ−２ＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ分子、及びＣＤ７０等の、αβまたはγδ活性化ドメインの発現によっても強化され得る。発現されたポリヌクレオチドは、腫瘍認識部分、リンカー部分、及び活性化ドメインの遺伝コードを含んでもよい。操作型γδＴ細胞によるポリヌクレオチドの翻訳は、タンパク質リンカーによって連結された腫瘍認識部分及び活性化ドメインを提供し得る。多くの場合、リンカーは、腫瘍認識部分及び活性化ドメインの折り畳みを妨げないアミノ酸を含む。リンカー分子は、長さが少なくとも約５アミノ酸、約６アミノ酸、約７アミノ酸、約８アミノ酸、約９アミノ酸、約１０アミノ酸、約１１アミノ酸、約１２アミノ酸、約１３アミノ酸、約１４アミノ酸、約１５アミノ酸、約１６アミノ酸、約１７アミノ酸、約１８アミノ酸、約１９アミノ酸、または約２０アミノ酸であり得る。一部の実例では、リンカーにおけるアミノ酸の少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％がセリンまたはグリシンである。
一部の実例では、活性化ドメインは、１つまたは複数の変異を含み得る。好適な変異は、例えば、活性化ドメインを構成的に活性にする変異であり得る。１つまたは複数の核酸の素性を変更することは、翻訳されるアミノ酸のアミノ酸配列を変化させる。コードされるアミノ酸が極性、非極性、塩基性、または酸性アミノ酸に改変されるように、核酸変異を行うことができる。腫瘍認識部分が、腫瘍からのエピトープを認識するよう最適化されるように、核酸変異を行うことができる。γδＴ細胞の操作された腫瘍認識部分、操作された活性化ドメイン、または操作された別の構成要素は、１個よりも多くのアミノ酸変異、２個よりも多くのアミノ酸変異、３個よりも多くのアミノ酸変異、４個よりも多くのアミノ酸変異、５個よりも多くのアミノ酸変異、６個よりも多くのアミノ酸変異、７個よりも多くのアミノ酸変異、８個よりも多くのアミノ酸変異、９個よりも多くのアミノ酸変異、１０個よりも多くのアミノ酸変異、１１個よりも多くのアミノ酸変異、１２個よりも多くのアミノ酸変異、１３個よりも多くのアミノ酸変異、１４個よりも多くのアミノ酸変異、１５個よりも多くのアミノ酸変異、１６個よりも多くのアミノ酸変異、１７個よりも多くのアミノ酸変異、１８個よりも多くのアミノ酸変異、１９個よりも多くのアミノ酸変異、２０個よりも多くのアミノ酸変異、２１個よりも多くのアミノ酸変異、２２個よりも多くのアミノ酸変異、２３個よりも多くのアミノ酸変異、２４個よりも多くのアミノ酸変異、２５個よりも多くのアミノ酸変異、２６個よりも多くのアミノ酸変異、２７個よりも多くのアミノ酸変異、２８個よりも多くのアミノ酸変異、２９個よりも多くのアミノ酸変異、３０個よりも多くのアミノ酸変異、３１個よりも多くのアミノ酸変異、３２個よりも多くのアミノ酸変異、３３個よりも多くのアミノ酸変異、３４個よりも多くのアミノ酸変異、３５個よりも多くのアミノ酸変異、３６個よりも多くのアミノ酸変異、３７個よりも多くのアミノ酸変異、３８個よりも多くのアミノ酸変異、３９個よりも多くのアミノ酸変異、４０個よりも多くのアミノ酸変異、４１個よりも多くのアミノ酸変異、４２個よりも多くのアミノ酸変異、４３個よりも多くのアミノ酸変異、４４個よりも多くのアミノ酸変異、４５個よりも多くのアミノ酸変異、４６個よりも多くのアミノ酸変異、４７個よりも多くのアミノ酸変異、４８個よりも多くのアミノ酸変異、４９個よりも多くのアミノ酸変異、または５０個よりも多くのアミノ酸変異を含んでもよい。
一部の実例では、本開示のγδＴ細胞は、１つまたは複数のＭＨＣ分子を発現しない。操作型γδＴ細胞における１つまたは複数のＭＨＣ遺伝子座の欠失は、操作型γδＴ細胞が宿主免疫系によって認識される可能性を減少させることができる。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系として知られる、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）遺伝子座は、γδＴ細胞を含めた抗原提示細胞において発現される大きな遺伝子ファミリーを構成する。ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃ分子は、細胞内ペプチドを抗原として抗原提示細胞に提示するように機能する。ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＱ、及びＨＬＡ−ＤＲ分子は、細胞外ペプチドを抗原として抗原提示細胞に提示するように機能する。ＨＬＡ遺伝子のいくつかの対立遺伝子は、ＧＶＨＤ、自己免疫障害、及びがんに関連付けられている。本明細書に記載される操作型γδＴ細胞は、１つまたは複数のＨＬＡ遺伝子の遺伝子発現が欠如するか、またはそれを妨害するようにさらに操作することができる。本明細書に記載される操作型γδＴ細胞は、ＭＨＣ遺伝子のうちの１つもしくは複数の完全な欠失、特定のエクソンの欠失、またはβ２マイクログロブリン（Ｂ２ｍ）の欠失等、ＭＨＣ複合体の１つまたは複数の構成要素の遺伝子発現が欠如するか、またはそれを妨害するようにさらに操作することができる。少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子の遺伝子切除または遺伝子妨害は、宿主対移植片病を引き起こすことなく任意のＨＬＡハプロタイプを有する対象に投与され得る、臨床上治療的なγδＴ細胞をもたらすことができる。本明細書に記載されるような操作型γδＴ細胞は、任意のＨＬＡハプロタイプを有するヒト対象のための普遍的ドナーであり得る。
γδＴ細胞は、１つまたは種々のＨＬＡ遺伝子座（単数）（遺伝子座（複数））が欠如するように操作することができる。操作型γδＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子、ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱ対立遺伝子、またはＨＬＡ−ＤＰ対立遺伝子が欠如するように操作することができる。一部の実例では、ＨＬＡ対立遺伝子は、自己免疫病態等のヒトの病態に関連付けられる。例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７対立遺伝子は、関節炎及びブドウ膜炎に関連付けられており、ＨＬＡ−ＤＲ２対立遺伝子は、全身性エリテマトーデス及び多発性硬化症に関連付けられており、ＨＬＡ−ＤＲ３対立遺伝子は、２１−ヒドロキシラーゼ欠損症に関連付けられており、ＨＬＡ−ＤＲ４は、関節リウマチ及び１型糖尿病に関連付けられている。例えばＨＬＡ−Ｂ２７対立遺伝子が欠如した、操作型γδＴ細胞は、対象の免疫系によって容易に認識されることなく、関節炎に罹患した対象に投与され得る。一部の実例では、１つまたは複数のＨＬＡ遺伝子座の欠失は、任意のＨＬＡハプロタイプを有する任意の対象のための普遍的ドナーである操作型γδＴ細胞をもたらす。
一部の実例では、γδＴ細胞の操作は、γδＴ細胞ゲノムの一部分の欠失を必要とする。一部の実例では、ゲノムの欠失部分は、ＭＨＣ遺伝子座（単数）（遺伝子座（複数））の一部分を含む。一部の事例では、操作型γδＴ細胞は、野生型ヒトγδＴ細胞に由来し、ＭＨＣ遺伝子座は、ＨＬＡ遺伝子座である。一部の実例では、ゲノムの欠失部分は、ＭＨＣ複合体におけるタンパク質に対応する遺伝子の一部分を含む。一部の実例では、ゲノムの欠失部分は、β２マイクログロブリン遺伝子を含む。一部の事例では、ゲノムの欠失部分は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、及びＣＥＣＡＭ−１等の免疫チェックポイント遺伝子を含む。一部の実例では、操作型γδＴ細胞は、Ｔ細胞の活性化及び細胞傷害性を強化する活性化ドメインを発現するように設計することができる。操作型γδＴ細胞に発現させることができる活性化ドメインの非限定的な例としては、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＤＡＰ分子、ＣＤ１２２、ＧＩＴＲ、ＦｃεＲＩγが挙げられる。
操作型γδＴ細胞のゲノムの任意の部分を欠失させて、内因性γδＴ細胞遺伝子の発現を妨害することができる。γδＴ細胞のゲノムにおいて欠失または妨害され得るゲノム領域の非限定的な例としては、プロモーター、活性化因子、エンハンサー、エクソン、イントロン、非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、可変数タンデム反復配列（ＶＮＴＲ）、短鎖タンデム反復配列（ＳＴＲ）、ＳＮＰパターン、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復配列、トリヌクレオチド反復配列、テトラヌクレオチド反復配列、または単純配列反復配列が挙げられる。一部の実例では、ゲノムの欠失部分は、１核酸〜約１０核酸、１核酸〜約１００核酸、１核酸〜約１，０００核酸、１核酸〜約１０，０００核酸、１核酸〜約１００，０００核酸、１核酸〜約１，０００，０００核酸の範囲、または他の好適な範囲である。
操作型γδＴ細胞におけるＨＬＡ遺伝子発現はまた、当該技術分野で既知の種々の技法により妨害することもできる。一部の実例では、操作型γδＴ細胞ゲノムから遺伝子を切除するため、または操作型γδＴ細胞における少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子座の遺伝子発現を妨害するために、大きな遺伝子座の遺伝子編集技術が使用される。操作型γδＴ細胞のゲノム上の所望の遺伝子座を編集するために使用され得る遺伝子編集技術の非限定的な例としては、それぞれＷＯ２０１４０９３７０、ＷＯ２００３０８７３４１、ＷＯ２０１４１３４４１２、及びＷＯ２０１１０９０８０４により記載され、これらの各々が、参照によりその全体が本明細書に援用される、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びメガヌクレアーゼの技術が挙げられる。
γδＴ細胞は、腫瘍認識部分を既に発現する単離された非操作型γδＴ細胞から操作されてもよい。操作型γδＴ細胞は、単離された、例えば腫瘍試料の腫瘍浸潤リンパ球から単離された、野生型γδＴ細胞によって内因性で発現される腫瘍細胞認識部分を保持することができる。一部の実例では、操作型γδＴ細胞の腫瘍細胞認識部分は、野生型γδＴＣＲを置き換える。
γδＴ細胞は、リンパ球帰巣分子等の、１つまたは複数の帰巣分子を発現するように操作することができる。帰巣分子は、例えば、リンパ球帰巣受容体または細胞接着分子であり得る。帰巣分子は、操作型γδＴ細胞が対象に投与された際に、操作型γδＴ細胞が遊走して、標的とする固形腫瘍を含めた固形腫瘍に浸潤する一助となり得る。帰巣受容体の非限定的な例としては、ＣＣＲファミリーのメンバー、例えば、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＬＡ、ＣＤ４４、ＣＤ１０３、ＣＤ６２Ｌ、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、ＶＬＡ−４及びＬＦＡ−１等のインテグリンが挙げられる。細胞接着分子の非限定的な例としては、ＩＣＡＭ、Ｎ−ＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＰＥ−ＣＡＭ、Ｌ１−ＣＡＭ、ネクチン（ＰＶＲＬ１、ＰＶＲＬ２、ＰＶＲＬ３）、ＬＦＡ−１、インテグリンアルファＸベータ２、アルファｖベータ７、マクロファージ−１抗原、ＣＬＡ−４、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａが挙げられる。細胞接着分子の追加の例としては、Ｔ−カドヘリン等のカルシウム依存性分子、及びＭＭＰ９またはＭＭＰ２等のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に対する抗体が挙げられる。
Ｔ細胞成熟、活性化、増殖、及び機能に関わるステップは、免疫チェックポイントタンパク質による共刺激性及び阻害性シグナルを通して制御され得る。免疫チェックポイントは、免疫系に本来備わっている共刺激性及び阻害性要素である。免疫チェックポイントは、免疫系が細胞形質転換または感染等の疾患状態に応答するときに、自己寛容を維持すると共に、生理学的免疫応答の持続期間及び大きさを調節するのを補助する。γδ及びαβいずれかのＴ細胞からの免疫応答を制御するために使用される共刺激シグナルと阻害性シグナルとの間の平衡は、免疫チェックポイントタンパク質によって調節され得る。ＰＤ１及びＣＴＬＡ４等の免疫チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞の表面上に存在し、免疫応答を「オン」または「オフ」にするために使用され得る。腫瘍は、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対して、免疫耐性機構としてチェックポイントタンパク質の機能を調節不全にし得る。本開示の操作型γδＴ細胞は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲ、ＣＥＡＣＡＭ１、Ｂ７−Ｈ３、及びＢ７−Ｈ４等の１つまたは複数の免疫チェックポイント遺伝子座（単数）（遺伝子座（複数））が欠如するようにさらに操作することができる。代替として、本開示の操作型γδＴ細胞における内因性免疫チェックポイント遺伝子の発現を、遺伝子編集技術により妨害することができる。
免疫学的チェックポイントは、本開示の操作型γδＴ細胞において、阻害性シグナル伝達経路（ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、及びＬＡＧ３が例として挙げられる）を制御する分子、または刺激性シグナル伝達経路（ＩＣＯＳが例として挙げられる）を制御する分子であり得る。広範な免疫グロブリンスーパーファミリーにおけるいくつかのタンパク質が、免疫学的チェックポイントのためのリガンドであり得る。免疫チェックポイントリガンドタンパク質の非限定的な例としては、Ｂ７−Ｈ４、ＩＣＯＳＬ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＭｅｇａＣＤ４０Ｌ、ＭｅｇａＯＸ４０Ｌ、及びＣＤ１３７Ｌが挙げられる。一部の実例では、免疫チェックポイントリガンドタンパク質は、腫瘍により発現される抗原である。一部の実例では、免疫チェックポイント遺伝子は、ＣＴＬＡ−４遺伝子である。一部の実例では、免疫チェックポイント遺伝子は、ＰＤ−１遺伝子である。
ＰＤ１は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４ファミリーに属する阻害性受容体であり、活性化されたＴリンパ球、Ｂ細胞、単球、ＤＣ、及びＴレグ上で発現される。ＰＤ１のための２つの既知のリガンド、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２が存在し、これらはＴ細胞、ＡＰＣ、及び悪性細胞上で発現され、自己反応性リンパ球を抑制すると共に、ＴＡＡ特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のエフェクター機能を阻害するように機能する。したがって、ＰＤ１が欠如した操作型γδＴ細胞は、腫瘍細胞によるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の発現とは無関係に、その細胞傷害活性を維持することができる。一部の実例では、本開示の操作型γδＴ細胞には、ＰＤ−１遺伝子の遺伝子座が欠如している。一部の実例では、操作型γδＴ細胞におけるＰＤ−１遺伝子の発現は、遺伝子編集技術によって妨害される。
ＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４）は、ＣＤ１５２（分化抗原群１５２）としても知られている。ＣＴＬＡ４は、配列相同性及びリガンド（ＣＤ８０／Ｂ７−１及びＣＤ８６／Ｂ７−２）を共刺激分子ＣＤ２８と共有するが、ＣＴＬＡ４を受容体として発現するＴ細胞に阻害性シグナルを送達する点で異なる。ＣＴＬＡ４は、両リガンドに対する親和性がはるかにより高く、リガンド密度が限定的である場合に結合に関してＣＤ２８を打ち負かすことができる。ＣＴＬＡ４は、多くの場合、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の表面上で発現され、ナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞の両方の初期活性化段階において機能的役割を果たす。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞活性化の早期段階の間、ＣＤ８０及びＣＤ８６に対する増加した親和性を介してＣＤ２８の活性に対抗する。ＣＴＬＡ４の主要な機能には、ヘルパーＴ細胞の下方調節及び制御性Ｔ細胞の免疫抑制活性の強化が含まれる。一部の事例では、本開示の操作型γδＴ細胞には、ＣＴＬＡ４遺伝子が欠如している。一部の実例では、操作型γδＴ細胞におけるＣＴＬＡ４遺伝子の発現は、遺伝子編集技術によって妨害される。
ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３）は、活性化された抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞上で発現され、制御性Ｔ細胞の機能を強化し、かつ独立してＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の活性を阻害することができる。ＬＡＧ３は、いくつかの上皮癌上で上方制御されるＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対する高い結合親和性を有するＣＤ４様の負の制御性タンパク質であり、Ｔ細胞増殖及び恒常性の寛容をもたらす。ＬＡＧ−３−ＩＧ融合タンパク質を用いたＬＡＧ−３／クラスＩＩの相互作用の低減は、抗腫瘍免疫応答を強化し得る。一部の実例では、本開示の操作型γδＴ細胞には、ＬＡＧ３遺伝子の遺伝子座が欠如している。一部の事例では、操作型γδＴ細胞におけるＬＡＧ３遺伝子の発現は、遺伝子編集技術によって妨害される。
非操作型及び操作型γδＴ細胞の表現型
操作型γδＴ細胞は、対象の身体内の特定の物理的位置に帰巣し得る。操作型γδＴ細胞の遊走及び帰巣は、特定のケモカイン及び／または接着分子の発現及び作用の組み合わせに依存し得る。操作型γδＴ細胞の帰巣は、ケモカインとそれらの受容体との間の相互作用によって制御され得る。例えば、ＣＸＣＲ３（そのリガンドは、ＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０及び６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ／ＣＣＬ２１により表される）、ＣＣＲ４＋ ＣＸＣＲ５＋（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βに対する受容体）、ＣＣＲ６＋、及びＣＣＲ７を含むが、これらに限定されないサイトカインが、操作型γδＴ細胞の帰巣に影響を及ぼし得る。一部の実例では、操作型γδＴ細胞は、炎症及び損傷の部位、ならびに病的細胞に帰巣して、修復機能を果たし得る。一部の実例では、操作型γδＴ細胞は、がんに帰巣することができる。一部の実例では、操作型γδＴ細胞は、胸腺、骨髄、皮膚、喉頭、気管、胸膜、肺、食道、腹部、胃、小腸、大腸、肝臓、膵臓、腎臓、尿道、膀胱、精巣、前立腺、精管、卵巣、尿管（ｕｒｅｔｕｓ）、乳腺、副甲状腺、脾臓、または対象の身体内の別の部位に帰巣し得る。操作型γδＴ細胞は、特定のＴＣＲ対立遺伝子及び／またはリンパ球帰巣分子等の、１つまたは複数の帰巣部分を発現することができる。
操作型γδＴ細胞は、特定の表現型を有してもよく、表現型は、細胞表面マーカー発現の観点から説明され得る。種々の種類のγδＴ細胞を本明細書に記載されるように操作することができる。好ましい実施形態では、操作型γδＴ細胞は、ヒトに由来するが、操作型γδＴ細胞はまた、哺乳動物または合成細胞等の異なる供給源に由来してもよい。
増殖させた細胞集団の免疫表現型は、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、及びＣＤ６２Ｌを含むが、これらに限定されないマーカーを用いて決定されてもよい（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２１１：２１４ ２００６）。ＣＤ４５ＲＡは、ナイーブＴリンパ球上で発現され、抗原に遭遇するとＣＤ４５ＲＯで置き換えられるが、後期のエフェクター細胞において再発現される（Ｍｉｃｈｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６０，２６４−２６５（１９９２）。ＣＤ６２Ｌは、帰巣分子として作用して二次リンパ組織に侵入する細胞接着分子であり、Ｔ細胞がエフェクター機能を獲得するときのＴ細胞の活性化後に失われる（Ｓａｌｌｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４０１：７０８（１９９９）。ＣＤ２７は、Ｔ細胞の分化中に失われる共刺激マーカーである（Ａｐｐａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．８：３７９（２００２）、Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２１１：２１４ ２００６）。
抗原
本明細書に開示される本発明は、抗原認識部分を発現する操作型γδＴ細胞を提供し、ここで、抗原認識部分は、疾患特有のエピトープを認識する。抗原は、免疫応答を惹起する分子であり得る。この免疫応答は、抗体産生、特定の免疫担当細胞の活性化のいずれか、または両方を伴い得る。抗原は、例えば、ペプチド、タンパク質、ハプテン、脂質、炭水化物、細菌、病原体、またはウイルスであり得る。抗原は、腫瘍抗原であり得る。腫瘍エピトープは、ＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩ複合体によって腫瘍細胞の表面上で提示され得る。エピトープは、細胞表面上で発現され、腫瘍認識部分によって認識される、抗原の部分であり得る。
操作型γδＴ細胞によって認識される抗原の非限定的な例としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７０、ＣＤ７５、ＣＡ６、ＧＤ２、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＲＯＮ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１６、５Ｔ４、ＮａＰｉ２ｂ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＰＬＩＦ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＭＮＢ、ＬＩＶ−１、糖脂質Ｆ７７、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２、メソテリン、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＳＰＧ４、ＰＶＲＬ−４、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＣＡ、ＣＬＥＣ１２ａ、Ｌ１ＣＡＭ、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、葉酸結合タンパク質／受容体、ＳＬＣ４４Ａ４、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＡＸＬ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−３Ｒα２、ＳＬＴＲＫ６、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＮＹＥＳＯ−１、ＷＴ−１、ＰＲＡＭＥ、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＭＡＧＥＡファミリー遺伝子（例えばＭＡＧＥＡ３．ＭＡＧＥＡ４）、ＫＫＬＣ１、変異型ｒａｓ、□□ａｆ、ｐ５３、ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ａ（ＭＩＣＡ）、もしくはＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ｂ（ＭＩＣＢ）、またはＨＰＶ、ＣＭＶ、もしくはＥＢＶの１つもしくは複数の抗原が挙げられる。
抗原は、細胞の細胞内または細胞外区画において発現され得、操作型γδＴ細胞は、細胞内または細胞外腫瘍抗原を認識することができる。一部の実例では、操作型γδＴ細胞におけるαβＴＣＲは、細胞内腫瘍抗原または細胞外腫瘍抗原のいずれかに由来するペプチドを認識する。例えば、抗原は、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、またはＨＰＶタンパク質等の、ウイルスに感染した細胞によって細胞内または細胞外に産生されるタンパク質であり得る。抗原はまた、がん細胞により細胞内または細胞外に発現されるタンパク質でもあり得る。
抗原認識部分は、がん細胞、またはウイルスに感染した細胞等のストレス下にある細胞からの抗原を認識し得る。例えば、ヒトＭＨＣクラスＩ鎖関連遺伝子（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）は、６番染色体のＨＬＡクラスＩ領域内に位置する。ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢタンパク質は、ヒト上皮における「ストレス」のマーカーであると考えられ、一般的なナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＧ２Ｄ）を発現する細胞のためのリガンドとして作用する。ストレスマーカーとして、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢは、がん細胞から高発現され得る。操作型γδＴ細胞は、ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢ腫瘍エピトープを認識することができる。
腫瘍認識部分は、ある特定の結合活性をもって抗原を認識するように操作されてもよい。例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ構築物によってコードされる腫瘍認識部分は、少なくとも少なくとも１０ｆＭ、少なくとも１００ｆＭ、少なくとも１ピコモル（ｐＭ）、少なくとも１０ｐＭ、少なくとも２０ｐＭ、少なくとも３０ｐＭ、少なくとも４０ｐＭ、少なくとも５０ｐＭ、少なくとも６０ｐＭ、少なくとも７ｐＭ、少なくとも８０ｐＭ、少なくとも９０ｐＭ、少なくとも１００ｐＭ、少なくとも２００ｐＭ、少なくとも３００ｐＭ、少なくとも４００ｐＭ、少なくとも５００ｐＭ、少なくとも６００ｐＭ、少なくとも７００ｐＭ、少なくとも８００ｐＭ、少なくとも９００ｐＭ、少なくとも１ナノモル（ｎＭ）、少なくとも２ｎＭ、少なくとも３ｎＭ、少なくとも４ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも６ｎＭ、少なくとも７ｎＭ、少なくとも８ｎＭ、少なくとも９ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも２０ｎＭ、少なくとも３０ｎＭ、少なくとも４０ｎＭ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎＭ、少なくとも７０ｎＭ、少なくとも８０ｎＭ、少なくとも９０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも３００ｎＭ、少なくとも４００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも６００ｎＭ、少なくとも７００ｎＭ、少なくとも８００ｎＭ、少なくとも９００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２μＭ、少なくとも３μＭ、少なくとも４μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも６μＭ、少なくとも７μＭ、少なくとも８μＭ、少なくとも９μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも６０μＭ、少なくとも７０μＭ、少なくとも８０μＭ、少なくとも９０μＭ、または少なくとも１００μＭの解離定数で抗原を認識し得る。
一部の事例では、腫瘍認識部分は、最大でも１０ｆＭ、最大でも１００ｆＭ、最大でも１ピコモル（ｐＭ）、最大でも１０ｐＭ、最大でも２０ｐＭ、最大でも３０ｐＭ、最大でも４０ｐＭ、最大でも５０ｐＭ、最大でも６０ｐＭ、最大でも７ｐＭ、最大でも８０ｐＭ、最大でも９０ｐＭ、最大でも１００ｐＭ、最大でも２００ｐＭ、最大でも３００ｐＭ、最大でも４００ｐＭ、最大でも５００ｐＭ、最大でも６００ｐＭ、最大でも７００ｐＭ、最大でも８００ｐＭ、最大でも９００ｐＭ、最大でも１ナノモル（ｎＭ）、最大でも２ｎＭ、最大でも３ｎＭ、最大でも４ｎＭ、最大でも５ｎＭ、最大でも６ｎＭ、最大でも７ｎＭ、最大でも８ｎＭ、最大でも９ｎＭ、最大でも１０ｎＭ、最大でも２０ｎＭ、最大でも３０ｎＭ、最大でも４０ｎＭ、最大でも５０ｎｍ、最大でも６０ｎＭ、最大でも７０ｎＭ、最大でも８０ｎＭ、最大でも９０ｎＭ、最大でも１００ｎＭ、最大でも２００ｎＭ、最大でも３００ｎＭ、最大でも４００ｎＭ、最大でも５００ｎＭ、最大でも６００ｎＭ、最大でも７００ｎＭ、最大でも８００ｎＭ、最大でも９００ｎＭ、最大でも１μＭ、最大でも２μＭ、最大でも３μＭ、最大でも４μＭ、最大でも５μＭ、最大でも６μＭ、最大でも７μＭ、最大でも８μＭ、最大でも９μＭ、最大でも１０μＭ、最大でも２０μＭ、最大でも３０μＭ、最大でも４０μＭ、最大でも５０μＭ、最大でも６０μＭ、最大でも７０μＭ、最大でも８０μＭ、最大でも９０μＭ、または最大でも１００μＭの解離定数で抗原を認識するように操作されてもよい。
新規の活性化剤
本発明の発明者らは、γδＴＣＲの特定のサブタイプに結合し、それによってγδＴ細胞の特定の集団を活性化させ、増殖させる活性化剤を同定した。一態様では、本発明は、本明細書の実施例１及び２、ならびに図１で同定され、記載される、新規の活性化エピトープに結合する新規の活性化剤を提供する。活性化剤には、ＭＡｂであるδ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、活性化剤（例えば、抗体）は、１つまたは複数のγδＴ細胞集団（例えば、δ３Ｔ細胞）を増殖させ、及び／または活性化させる。
これらの活性化剤にはさらに、δ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８からなる群から選択される１つまたは複数のＭＡｂと同じエピトープに結合するか、または該ＭＡｂと競合する活性化剤が含まれるが、これらに限定されない。
これらの活性化剤にはさらに、δ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８からなる群から選択されるＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）及び／または可変領域を含有する活性化剤が含まれるが、これらに限定されない。
本発明はまた、（ｉ）δ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８からなる群から選択されるＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）及び／または可変領域を含有する、（ｉｉ）該ＭＡｂと同じエピトープに結合するか、または該ＭＡｂと競合する、あるいは（ｉｉｉ）該ＭＡｂである、活性化剤をコードする、核酸も提供する。一部の実例では、核酸は、宿主細胞（例えば、異種宿主細胞）内にある。一部の実例では、核酸は、異種プロモーターに作動可能に連結されているか、または異種ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されている。本明細書で使用されるとき、「異種」という用語は、自然界で本来一緒に存在しない２つの構成要素を指す。
本発明はまた、上述の活性化剤のうちの１つまたは複数の生産方法も提供する。例えば、活性化剤をコードする核酸を含有する宿主細胞を培養して、上述の活性化剤のうちの１つまたは複数を生産することができる。
ＡＰＣ
本明細書ではまた、γδＴ細胞の１つまたは複数の亜集団等の操作型または非操作型γδＴ細胞の増殖のためのＡＰＣも記載される。一部の実施形態では、上述の活性化剤のうちの１つまたは複数をコードする異種核酸を含有するＡＰＣが本明細書に記載される。一部の実施形態では、上述の活性化剤のうちの１つまたは複数を細胞表面上に発現するＡＰＣが本明細書に記載される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＦｃ受容体をその細胞表面上に発現するＡＰＣが本明細書に記載され、ここで、Ｆｃ受容体（複数可）は、上述の活性化剤のうちの１つもしくは複数と接触する、及び／またはそれに結合するものである。
一部の実例では、ＡＰＣ（例えば、上述の活性化剤のうちの１つまたは複数を細胞表面上で発現しているか、または細胞表面上で発現されたＦｃ受容体にそれを結合させた、ＡＰＣ）は、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩ、インバリアント鎖、及び／またはＨＬＡ−ＤＭを発現しないか、または低減された発現を示す。一部の実例では、ＡＰＣは、細胞間接着分子−１等の接着分子、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ５４、及び／または白血球機能関連抗原−３を発現する。一部の実例では、ＡＰＣは、Ｆｃ受容体、例えば、本明細書に記載されるγδＴ細胞増殖方法において使用される活性化剤のアイソタイプに特異的なＦｃ受容体を発現する。一部の実例では、ＡＰＣは、ＣＤ６４、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３２Ｃ、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＦｃＲｎ、ＴＲＩＭ２１、もしくはＣＤ３０７、またはより高い親和性もしくは変化した特異性を有するその操作されたバリアントからなる群から選択される、１つもしくは複数のＦｃ受容体を発現する。
本明細書ではまた、上述のＡＰＣのうちの１つまたは複数を含む培養物も記載される。培養物は、増殖させたまたは増殖させていない操作型または非操作型のγδＴ細胞をさらに含有することができる。培養物は、追加としてまたは代替として、本明細書に記載されるγδＴ細胞活性化剤のうちのいずれか１つを含む、選択的または非選択的γδＴ細胞活性化剤を含有することができる。一部の実例では、培養物は、ＩＬ−２１を含有しない。一部の実例では、培養物は、ＩＬ−４、ＩＬ−２、もしくはＩＬ−１５、またはそれらの組み合わせを含有しない。一部の実例では、培養物は、γδＴ細胞の亜集団を選択的に増殖させるサイトカインを含有しない。
エピトープ特定
本発明の発明者らは、γδＴＣＲ活性化ＭＡｂであるδ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８のエピトープ内の結合領域を同定した。例となるエピトープには、γδＴＣＲ活性化ＭＡｂであるδ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８のエピトープが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、エピトープは、γδＴＣＲ活性化ＭＡｂであるδ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８のうちの１つまたは複数が特異的に結合するエピトープである。
一態様では、本開示は、操作型及び非操作型γδＴ細胞の増殖を速い成長速度で刺激する薬剤のエピトープの同定方法を提供する。エピトープは、固有の空間的立体構造にある少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸を含み得る。エピトープは、連続アミノ酸、またはタンパク質の三次折り畳みによって並置された不連続アミノ酸の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されたエピトープは典型的に、変性溶媒への曝露時に保持され得るが、一方で、三次折り畳みによって形成されたエピトープは典型的に、変性溶媒での処置時に失われ得る。
エピトープマッピングを行って、δ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８抗体等の目的とする活性化剤によって（例えば、特異的に）認識される、直鎖状または非直鎖状の不連続アミノ酸配列（複数可）、すなわちエピトープを同定することができる。エピトープマッピングの一般的手法は、一般に異種発現系における、目的とする抗体またはリガンドによって認識される完全長ポリペプチド配列、ならびにポリペプチド配列の種々の断片、すなわち、切詰め形態の発現を必要とし得る。次いで、これらの種々の組換えポリペプチド配列またはそれらの断片（例えば、Ｎ末端タンパク質（例えば、ＧＦＰ）と融合させた）を用いて、目的とする抗体またはリガンドがポリペプチド配列の切詰め形態のうちの１つまたは複数に結合可能であるかどうかを決定することができる。
一部の実施形態では、組換えポリペプチド配列は、２つ以上の相同な親ポリペプチドの接合断片を含有するキメラであり、このうち、少なくとも１つの親ポリペプチドは、目的とする活性化剤に結合し、少なくとも１つの親ポリペプチドは、目的とする活性化剤に結合しない。例えば、ヒトδ３鎖遺伝子のセグメントを、相同なイルカ（または他の非ヒト動物）δ鎖遺伝子のセグメントと接合し、組換え発現系においてキメラＴＣＲを生成する能力に関して試験することができる。別の例として、ヒトδ３鎖遺伝子のセグメントを、異なるδ鎖サブタイプのセグメントと接合することができる。例えば、細胞表面での汎γδ−ＴＣＲ抗体の検出によって示されるような、ＴＣＲを形成するキメラＴＣＲ遺伝子を次いで、目的とする活性化剤への結合に関して試験することができる。
重複するアミノ酸領域を有する組換えポリペプチド配列の反復的な切詰め及び生成を用いることにより、目的とする抗体によって認識されるポリペプチド配列の領域を同定することが可能である（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ（１９９６）を参照されたい）。この方法は、目的とする抗体等の薬剤が、膜支持体上の合成ペプチドアレイ、コンビナトリアル式ファージディスプレイペプチドライブラリーに由来するエピトープライブラリー等のエピトープライブラリーから再作出された配列に結合する能力に依拠する。こうして、エピトープライブラリーは様々な可能性を提供し、それらが抗体に対してスクリーニングされる。追加として、エピトープの１つまたは複数の残基を標的とする部位特異的変異誘発、またはランダムＡｌａ走査を遂行して、エピトープの素性を確認することができる。
エピトープのライブラリーは、γδＴ細胞受容体（γδＴＣＲ）の種々の可能な組換え体をｃＤＮＡ構築物として合成設計し、それらを好適な系において発現させることによって作出することができる。例えば、Ｊδ１、Ｊδ２、及びＪδ３遺伝子セグメントを含めた、それらのＪδ領域が異なる複数のＶδ３遺伝子セグメントを合成設計することができる。かかるＶδ３Ｊセグメントは、例えば、合成遺伝子としてオーダーし、好適なベクターにクローニングすることができる。合成的にクローニングされた複数のδ３ＴＣＲ鎖、例えばＶδ３Ｊ１、Ｖδ３Ｊ２、Ｖδ３Ｊ３、またはＶδ３Ｊ４鎖は、合成的にクローニングされたγＴＣＲ鎖、例えばＶγ２、Ｖγ３、Ｖγ４、Ｖγ５、Ｖγ８、Ｖγ９、及びＶγ１０合成設計遺伝子セグメントと共に、宿主系に共トランスフェクトすることができる。他の実例では、δＴＣＲ鎖は、ヒトＰＢＭＣまたはヒト正常組織及び悪性組織から単離されたγδＴ細胞から抽出された全ＲＮＡから増幅することができる。
宿主系は、２９３細胞、昆虫細胞、または好適なインビトロ翻訳系等の任意の好適な発現系であり得る。宿主系にトランスフェクトされた、合成設計されたγδＴ細胞セグメントの複数の種々の可能な組み合わせは、例えば、２５個よりも多く、３０個よりも多く、３５個よりも多く、４０個よりも多く、４５個よりも多く、５０個よりも多く、５５個よりも多く、６０個よりも多く、６５個よりも多く、７０個よりも多く、７５個よりも多く、８０個よりも多く、８５個よりも多く、または９０個よりも多くの可能なγδＴＣＲの対合の組み合わせをもたらすことができる。前述のライブラリーにおけるエピトープのうちの１つへの薬剤の結合は、標識された抗体、例えば、δ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８を当該ライブラリーのエピトープと接触させ、標識からのシグナルを検出することによって、検出することができる。代替として、薬剤の結合は、抗マウス抗体等の標識された二次抗体を用いて検出することができる。
エピトープマッピングのために、不連続な立体構造エピトープをマッピングすることが示されている計算アルゴリズムもまた開発されてきた。立体構造エピトープは、例えば、Ｘ結晶構造解析及び２次元核磁気共鳴を含めた方法により、アミノ酸の空間的立体構造を決定することによって同定することができる。抗原：抗体複合体の結晶のＸ解析等のいくつかのエピトープマッピング方法は、エピトープの原子的分解能をもたらすことができる。他の実例では、エピトープマッピングのための計算コンビナトリアル方法を採用して、可能性のあるエピトープを、抗体、例えば、δ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、またはδ３−５８抗体の配列に基づいてモデル化することができる。かかる実例では、抗体の抗原結合部分を配列決定し、計算モデルを用いて、抗体の可能性のある結合部位を再構築し、予測する。
一部の実例では、本開示は、（ａ）γδＴ細胞受容体からエピトープのライブラリーを調製することと、（ｂ）エピトープのライブラリーを抗体と接触させることと、（ｂ）エピトープのライブラリーにおいて抗体が結合している少なくとも１つのエピトープのアミノ酸配列を同定することと、を含む、γδＴ細胞受容体のエピトープの決定方法を提供する。一部の実例では、抗体は、δ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８抗体からなる群から選択される。１つの事例では、抗体は、固体支持体に付着している。エピトープのライブラリーは、γＴＣＲまたはδＴＣＲ等のＴ細胞受容体の連続及び不連続エピトープに対応する配列を含み得る。一部の実例では、エピトープのライブラリーは、長さが約１０アミノ酸〜約３０アミノ酸、長さが約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸、または長さが約５アミノ酸〜約１２アミノ酸の範囲の、γδＴ細胞受容体からの断片を含む。一部の実例では、抗体は標識され、標識は、放射性分子、発光分子、蛍光分子、酵素、またはビオチンである。
δ３エピトープビン
一部の実施形態では、目的とする活性化剤は、１つまたは複数のビン１Ａ抗体であるδ３−２３、δ３−４２、及び／またはδ３−５８のγ２δ３ＴＣＲへの結合と競合する。一部の実施形態では、目的とする活性化剤は、ビン１Ｂ抗体であるδ３−０８のγ２δ３ＴＣＲへの結合と競合する。一部の実施形態では、目的とする活性化剤は、１つまたは複数のビン１（ビン１Ａ及びビン１Ｂ）抗体であるδ３−２３、δ３−４２、δ３−５８、及び／またはδ３−０８のγ２δ３ＴＣＲへの結合と競合する。一部の実施形態では、目的とする活性化剤は、ビン２抗体であるδ３−３１のγ２δ３ＴＣＲへの結合と競合する。
一般に、本明細書に記載されるδ３特異的抗体は、γδ−ＴＣＲの関連において立体構造エピトープを認識する。一部の実例では、本明細書に記載されるδ３特異的抗体は、それぞれγδ３−ＴＣＲの１つまたは複数の対に特異的である。例えば、一部の実例では、本明細書に記載されるδ３特異的抗体は、γ２δ３−ＴＣＲに特異的である。
処置方法
本明細書に記載されるような、非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物を含有する薬学的組成物は、予防的及び／または治療的処置のために投与されてもよい。治療用途において、本組成物は、疾患または病態を既に患っている対象に、疾患または病態の症状を治癒させるか、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与され得る。非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物はまた、病態の発症、罹患、または悪化の可能性を減らすために投与することもできる。治療的使用のための非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物の集団の有効量は、疾患または病態の重症度及び経過、以前の療法、対象の健康状態、体重、及び／または薬物への応答、及び／または処置する医師の判断に基づいて様々であり得る。
本開示の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物を用いて、病態に対する処置を必要とする対象を処置することができる。病態の例としては、がん、感染性疾患、自己免疫障害、及び敗血症が挙げられる。対象は、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、チンパンジー、ならびに他の類人猿及びサル種；家畜動物、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；飼育動物、例えば、ウサギ、イヌ、及びネコ；齧歯動物を含めた実験動物、例えば、ラット、マウス、及びモルモット等であり得る。対象は、任意の年齢であり得る。対象は、例えば、高齢成体、成体、思春期児、思春期前児、小児、幼児、乳児であり得る。
本発明の濃縮γδＴ細胞集団による対象における病態（例えば、病気）の処置方法は、治療上有効量の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物を対象に投与することを含んでもよい。本開示の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物は、種々のレジメン（例えば、タイミング、濃度、投薬量、処置間の間隔、及び／または製剤形態）で投与されてもよい。対象はまた、本開示の濃縮γδＴ細胞集団及び／またはそれらの混和物を与える前に、例えば、化学療法、放射線、または両方の組み合わせで前処置することもできる。処置の一部として、非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物が、第１のレジメンで対象に投与されてもよく、第１のレジメンでの処置が所与のレベルの治療有効性を満たすかどうかを決定するために対象が監視され得る。一部の実例では、操作型γδＴ細胞または別の操作型γδＴ細胞が、第２のレジメンで対象に投与されてもよい。図２は、対象の処置方法を概略的に示す。第１の作業２０１において、少なくとも１つの操作型γδＴ細胞が、所与の病態（例えば、がん）を有するか、または有することが疑われる対象に投与される。操作型γδＴ細胞は、第１のレジメンで投与され得る。第２の作業２０２において、対象が、例えば医療提供者（例えば、処置する医師または看護師）によって、監視され得る。一部の例では、対象は、対象の病態を処置する上での操作型γδＴ細胞の有効性を決定または判断するために監視される。一部の状況では、対象はまた、対象におけるγδＴ細胞集団のインビボ増殖を決定するために監視され得る。次に、第３の作業２０３において、少なくとも１つの他の操作型γδＴ細胞が、第２のレジメンで対象に投与される。第２のレジメンは、第１のレジメンと同じであっても、または第１のレジメンとは異なってもよい。一部の状況では、例えば、第１の作業２０１における操作型γδＴ細胞の投与が有効であることが見出される（例えば、病態を処置するために単回の投与で十分であり得る）場合には、第３の作業２０３は行われない。それらの同種異系かつ普遍的なドナー特性に起因して、操作型γδＴ細胞の集団は、異なるＭＨＣハプロタイプを有する種々の対象に投与されてもよい。操作型γδＴ細胞は、対象に投与される前に凍結または冷凍保存され得る。
γδＴ細胞（すなわち、操作型または非操作型）の濃縮集団及び／またはそれらの混和物はまた、対象に投与される前に凍結または冷凍保存され得る。ある特定の実施形態では、操作型の濃縮γδＴ細胞の集団は、同一の腫瘍認識部分、異なる腫瘍認識部分、または同一の腫瘍認識部分及び異なる腫瘍認識部分の組み合わせを発現する２つ以上の細胞を含み得る。例えば、操作型の濃縮γδＴ細胞の集団は、異なる抗原、または同じ抗原の異なるエピトープを認識するように設計されているいくつかの別個の操作型γδＴ細胞を含み得る。例えば、黒色腫に罹患したヒト細胞は、ＮＹ−ＥＳＯ−１発がん遺伝子を発現し得る。ヒト内での感染細胞は、ＮＹ−ＥＳＯ−１腫瘍性タンパク質をより小さな断片へとプロセシングし、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の種々の部分を抗原認識のために提示し得る。操作型の濃縮γδＴ細胞の集団は、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の異なる部分を認識するように設計された、異なる腫瘍認識部分を発現する種々の操作型γδＴ細胞を含み得る。図３は、黒色腫抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１の異なるエピトープを認識する操作型γδＴ細胞の集団による、対象の処置方法を概略的に示す。第１の作業３０１において、同じ抗原の異なるエピトープを認識する操作型γδＴ細胞の集団が選択される。例えば、操作型γδＴ細胞の集団は、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の異なる部分を認識する、異なる腫瘍認識部分を発現している２つ以上の細胞を含んでもよい。第２の作業３０２において、操作型γδＴ細胞の集団が、第１のレジメンで投与され得る。第２の作業３０３において、対象が、例えば医療提供者（例えば、処置する医師または看護師）によって、監視され得る。
本開示の濃縮γδＴ細胞集団（すなわち、非操作型または操作型）及び／またはそれらの混和物を用いて、種々の病態を処置してもよい。一部の実例では、本開示の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物を用いて、固形腫瘍及び血液悪性腫瘍を含めたがんを処置してもよい。がんの非限定的な例としては、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、神経芽細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、例えば、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視路視床下部神経膠腫、乳癌、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、原発不明の癌腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、子宮頸癌、小児がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍、胆嚢癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、神経膠腫、有毛細胞性白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇及び口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ｃａｎｃｅｒ）、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、例えば、非小細胞及び小細胞肺癌、リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽細胞腫、黒色腫、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、口腔癌（ｍｏｕｔｈ ｃａｎｃｅｒ）、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓癌、膵島細胞癌、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚細胞腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、形質細胞新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管移行細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、皮膚メルケル細胞癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、Ｔ細胞リンパ腫、咽喉癌、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、栄養膜腫瘍（妊娠性）、原発部位不明のがん、尿道癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍が挙げられる。
一部の実例では、本開示の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物を用いて、感染性疾患を処置してもよい。感染性疾患は、例えば、病原性細菌またはウイルスによって引き起こされ得る。種々の病原性タンパク質、核酸、脂質、またはそれらの断片が、病的細胞により発現され得る。抗原提示細胞は、例えば、食作用、または受容体媒介性エンドサイトーシスによって、かかる病原性分子を内在化させ、適切なＭＨＣ分子に結合した抗原の断片を提示することができる。例えば、病原性タンパク質の種々の９ｍｅｒ断片がＡＰＣによって提示され得る。本開示の操作型の濃縮γδＴ細胞集団は、病原性細菌またはウイルスの種々の抗原及び抗原断片を認識するように設計されてもよい。病原性細菌の非限定的な例は、ａ）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、例えば、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ種；ｂ）Ｂｏｒｒｅｌｉａ属、例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ種；ｃ）Ｂｒｕｃｅｌｉａ属、例えば、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌａ ｍｅｌｉｔｅｒｉｓｉｓ、及び／またはＢｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ種；ｄ）Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ種；ｅ）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ａｎｄ Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ属、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、及び／またはＣｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ種；ｆ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ種；ｇ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ種；ｈ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、及び／またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ種；ｉ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ種；ｊ）Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ種；ｋ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ種；ｌ）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ種；ｍ）Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、例えば、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ種；ｎ）Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属、例えば、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ種；ｏ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ種；ｐ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、及び／またはｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ種；ｑ）Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ種；ｒ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉａ種；ｓ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ種；ｔ）Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属、例えば、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ種；ｕ）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ及び／またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ種；ｖ）Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ種；ｗ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、及び／またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ種；ｘ）Ｓｔｒｅｐｔｐｃｏｃｃｕｓ属、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、及び／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ種；ｙ）Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、例えば、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ種；ｚ）Ｖｉｂｒｉｏ属、例えば、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ；及び／またはａａ）Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、例えば、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ種に見出すことができる。
一部の実例では、本開示の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物を用いて、感染性疾患を処置してもよく、感染性疾患は、ウイルスによって引き起こされ得る。ウイルスの非限定的な例は、以下のウイルスの科に見出すことができ、例となる種により例示される：ａ）Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、アデノウイルス種；ｂ）Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バールウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型種；ｃ）Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、ヒトパピローマウイルス種；ｄ）Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス種；ｅ）Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、痘瘡種；ｆ）Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス種；ｇ）Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、ヒトボカウイルス、パルボウイルスＢ１９種；ｈ）Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、ヒトアストロウイルス種；ｉ）Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、ノーウォークウイルス種；ｊ）Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス種；ｋ）Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、風疹ウイルス種；ｌ）Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、Ｅ型肝炎ウイルス種；ｍ）Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）種；ｎ）Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｗ科、例えば、インフルエンザウイルス種；ｏ）Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、及び／またはサビアウイルス種；ｐ）Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス種；ｑ）Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、エボラウイルス及び／またはマールブルグウイルス種；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ヘンドラウイルス及び／またはニパウイルス種；ｒ）Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ属、例えば、狂犬病ウイルス種；ｓ）Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、ロタウイルス、オルビウイルス、コルチウイルス、及び／またはバンナウイルス種。一部の例では、ウイルスは、Ｄ型肝炎等、ウイルス科に割り当てられないものである。
一部の実例では、本開示の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物を用いて、自己免疫疾患等の免疫疾患を処置してもよい。自己免疫疾患を含めた炎症性疾患はまた、Ｂ細胞障害に関連する疾患のクラスでもある。自己免疫病態を含めた免疫疾患または病態の例としては、関節リウマチ、リウマチ熱、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、乾癬、ブドウ膜炎、真性糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、湿疹、強皮症、多発性筋炎／強皮症、多発性筋炎／皮膚筋炎、潰瘍性直腸炎（ｕｎｃｅｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｉｔｉｓ）、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ディジョージ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、季節性アレルギー、通年性アレルギー、食物アレルギー、アナフィラキシー、肥満細胞症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、脾機能亢進症、白血球接着不全症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、選択的免疫グロブリンＡ欠損症、高ＩｇＭ症候群、ＨＩＶ、自己免疫リンパ球増殖性症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、慢性肉芽腫性疾患、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、高免疫グロブリンＥ症候群、橋本甲状腺炎、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、多形性紅斑、ｇＡ腎症、高安動脈炎、アジソン病、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓｕｂｉｔｅｒａｎｓ）、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、慢性活動性肝炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡（ｐａｍｐｈｉｇｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発筋痛症、悪性貧血（ｐｅｒａｉｃｉｏｕｓａｎｅｍｉａ）、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、線維化肺胞炎、及びがんが挙げられる。
本開示のγδＴ細胞集団及び／またはそれらの混和物による処置は、病態の臨床的発症の前、間、及び後に対象に提供されてもよい。処置は、疾患の臨床的発症から１日後、１週間後、６ヶ月後、１２ヶ月後、または２年後に対象に提供されてもよい。処置は、疾患の臨床的発症後、１日超、１週超、１ヶ月超、６ヶ月超、１２ヶ月超、２年超、３年超、４年超、５年超、６年超、７年超、８年超、９年超、１０年超、またはそれよりも長くにわたって対象に提供されてもよい。処置は、疾患の臨床的発症後、１日未満、１週間未満、１ヶ月未満、６ヶ月未満、１２ヶ月未満、または２年未満にわたって対象に提供されてもよい。処置はまた、臨床試験においてヒトを処置することを含んでもよい。処置は、本開示の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物を含む薬学的組成物を対象に投与することを含み得る。
一部の実例では、本開示の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物の対象への投与は、対象の身体における内因性リンパ球の活性を調節する。一部の実例では、非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物の対象への投与は、内因性Ｔ細胞に対する抗原を提供し、免疫応答を高め得る。一部の実例では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の実例では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実例では、非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物の対象への投与は、別の免疫細胞の細胞傷害性を活性化させる。一部の実例では、他方の免疫細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。一部の実例では、他方の免疫細胞は、ナチュラルキラーＴ細胞である。一部の実例では、非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物の対象への投与は、制御性Ｔ細胞を抑制する。一部の実例では、制御性Ｔ細胞は、Ｆｏｘ３＋ Ｔレグ細胞である。一部の実例では、制御性Ｔ細胞は、Ｆｏｘ３− Ｔレグ細胞である。本開示の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物によって活性が調節され得る細胞の非限定的な例としては、造血幹細胞、Ｂ細胞、ＣＤ４、ＣＤ８、赤血球、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）、樹状抗原提示細胞を含めた樹状細胞、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）、マクロファージ、メモリーＢ細胞、メモリーＴ細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好中性顆粒球、ヘルパーＴ細胞、及びキラーＴ細胞が挙げられる。
ほとんどの骨髄移植の間、対象の免疫系による移植片中の造血幹細胞（ＨＳＣ）の拒絶反応を防止するために、シクロホスファミドと全身照射との組み合わせが慣習的に採用される。一部の実例では、ドナー骨髄中のキラーリンパ球の生成を強化するために、エクスビボでインターロイキン−２（ＩＬ−２）とのドナー骨髄のインキュベーションが行われる。インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、野生型リンパ球の成長、増殖、及び分化に必要なサイトカインである。γδＴ細胞のヒトへの養子移入に関する現在の研究は、γδＴ細胞及びインターロイキン−２の共投与を必要とし得る。しかしながら、低投薬量のＩＬ−２及び高投薬量のＩＬ−２は両方とも、毒性の高い副作用を有し得る。ＩＬ−２毒性は、複数の臓器／器官、最も顕著には心臓、肺、腎臓、及び中枢神経系において顕在化し得る。一部の実例では、本開示は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、またはＩＬ−２１等のサイトカインの共投与を伴わない、非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物の対象への投与方法を提供する。一部の実例では、非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物は、ＩＬ−２との共投与を伴わずに対象に投与され得る。一部の実例では、非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物は、骨髄移植等の手技の間に、ＩＬ−２の共投与を伴わずに対象に投与される。
投与方法
本発明の１つまたは複数の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物は、任意の順序でまたは同時に対象に投与され得る。同時の場合、本発明の複数の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物は、静脈内注射等の単一化された単回形態で、または複数回形態で、例えば、複数回の静脈内注入、皮下注射、もしくは丸剤として、提供され得る。本発明の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物は、単一のパッケージ中または複数のパッケージ中で、一緒にまたは別々に包装することができる。本発明の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物のうちの１つまたは全てを複数回用量で与えることができる。同時でない場合、複数回用量の間のタイミングは、約１週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、または約１年間もの長さまで様々であり得る。一部の実例では、本発明の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物は、対象への投与後に、対象の身体内においてインビボで増殖することができる。非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物は凍結させて、同じ細胞調製物による複数回処置のための細胞をもたらすことができる。本開示の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、キットとして包装することができる。キットは、非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物、ならびにそれらを含む薬学的組成物の使用に関する説明書（例えば、文書による説明書）を含んでもよい。
一部の実例では、がんの処置方法は、治療上有効量の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物を対象に投与することを含み、この投与が、がんを処置する。一部の実施形態では、治療上有効量の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物は、少なくとも約１０秒間、３０秒間、１分間、１０分間、３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、または１年間にわたって投与される。一部の実施形態では、治療上有効量の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物は、少なくとも１週間にわたって投与される。一部の実施形態では、治療上有効量の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物は、少なくとも２週間にわたって投与される。
本明細書に記載される非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物は、疾患または病態の発生の前、間、または後に投与することができ、非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物を含有する薬学的組成物を投与するタイミングは、様々であり得る。例えば、非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物は、予防薬として投与することができ、疾患または病態の発生の可能性を減らすために、病態または疾患の傾向を有する対象に継続的に投与することができる。非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物は、症状の発症の間またはその後可能な限り速やかに対象に投与され得る。非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物の投与は、症状が発症しているうちに、症状の発症の最初の３時間以内、症状の発症の最初の６時間以内、症状の発症の最初の２４時間以内、症状の発症の４８時間以内、または症状の発症から任意の期間以内に、直ちに開始することができる。初回投与は、本明細書に記載される任意の製剤形態を用いた本明細書に記載される任意の経路等の、実用的な任意の経路を介することができる。一部の例では、本開示の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物の投与は、静脈内投与である。非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物の１回または複数回の投薬量は、がん、感染性疾患、免疫疾患、敗血症の発症後、実行可能な限り速やかに、または骨髄移植と共に、免疫疾患の処置に必要な時間の長さ、例えば、約２４時間〜約４８時間、約４８時間〜約１週間、約１週間〜約２週間、約２週間〜約１ヶ月間、約１ヶ月〜約３ヶ月等にわたって、投与することができる。がんの処置の場合、非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物の１回または複数回の投薬量は、がんの発症から数年後に、かつ他の処置の前または後に投与することができる。一部の例では、非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物は、少なくとも約１０分間、３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年少なくとも３年間、少なくとも４年間、または少なくとも５年間にわたって投与することができる。処置の長さは、各対象につき様々であり得る。
投薬量
本明細書に開示されるような非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物は、正確な投薬量の単回投与に好適な単位剤形で製剤化されてもよい。一部の実例では、単位剤形は、追加のリンパ球を含む。単位剤形において、製剤は、１つまたは複数の化合物の適切な分量を含有する単位用量に分割される。単位投薬量は、製剤の個別的な分量を含有するパッケージの形態であり得る。非限定的な例は、包装された錠剤またはカプセル剤、及びバイアルまたはアンプル中の粉末である。水性懸濁液組成物は、単回用量の再封不可能容器中に包装することができる。複数回用量の再封可能容器は、例えば、防腐剤と組み合わせてまたは防腐剤なしで、使用することができる。一部の例では、薬学的組成物は、防腐剤を含まない。非経口投与用の製剤は、単位剤形で、例えばアンプル中で、または複数回用量の容器中で防腐剤と共に、提示され得る。
本明細書に記載されるような非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物は、少なくとも５細胞、少なくとも１０細胞、少なくとも２０細胞、少なくとも３０細胞、少なくとも４０細胞、少なくとも５０細胞、少なくとも６０細胞、少なくとも７０細胞、少なくとも８０細胞、少なくとも９０細胞、少なくとも１００細胞、少なくとも２００細胞、少なくとも３００細胞、少なくとも４００細胞、少なくとも５００細胞、少なくとも６００細胞、少なくとも７００細胞、少なくとも８００細胞、少なくとも９００細胞、少なくとも１×１０３細胞、少なくとも２×１０３細胞、少なくとも３×１０３細胞、少なくとも４×１０３細胞、少なくとも５×１０３細胞、少なくとも６×１０３細胞、少なくとも７×１０３細胞、少なくとも８×１０３細胞、少なくとも９×１０３細胞、少なくとも１×１０４細胞、少なくとも２×１０４細胞、少なくとも３×１０４細胞、少なくとも４×１０４細胞、少なくとも５×１０４細胞、少なくとも６×１０４細胞、少なくとも７×１０４細胞、少なくとも８×１０４細胞、少なくとも９×１０４細胞、少なくとも１×１０５細胞、少なくとも２×１０５細胞、少なくとも３×１０５細胞、少なくとも４×１０５細胞、少なくとも５×１０５細胞、少なくとも６×１０５細胞、少なくとも７×１０５細胞、少なくとも８×１０５細胞、少なくとも９×１０５細胞、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも２×１０６細胞、少なくとも３×１０６細胞、少なくとも４×１０６細胞、少なくとも５×１０６細胞、少なくとも６×１０６細胞、少なくとも７×１０６細胞、少なくとも８×１０６細胞、少なくとも９×１０６細胞、少なくとも１×１０７細胞、少なくとも２×１０７細胞、少なくとも３×１０７細胞、少なくとも４×１０７細胞、少なくとも５×１０７細胞、少なくとも６×１０７細胞、少なくとも７×１０７細胞、少なくとも８×１０７細胞、少なくとも９×１０７細胞、少なくとも１×１０８細胞、少なくとも２×１０８細胞、少なくとも３×１０８細胞、少なくとも４×１０８細胞、少なくとも５×１０８細胞、少なくとも６×１０８細胞、少なくとも７×１０８細胞、少なくとも８×１０８細胞、少なくとも９×１０８細胞、少なくとも１×１０９細胞、またはそれよりも多い量で、組成物中に存在してもよい。
本発明の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物の治療上有効用量は、約１細胞〜約１０細胞、約１細胞〜約１００細胞、約１細胞〜約１０細胞、約１細胞〜約２０細胞、約１細胞〜約３０細胞、約１細胞〜約４０細胞、約１細胞〜約５０細胞、約１細胞〜約６０細胞、約１細胞約７０細胞、約１細胞〜約８０細胞、約１細胞〜約９０細胞、約１細胞〜約１００細胞、約１細胞〜約１×１０３細胞、約１細胞〜約２×１０３細胞、約１細胞〜約３×１０３細胞、約１細胞〜約４×１０３細胞、約１細胞〜約５×１０３細胞、約１細胞〜約６×１０３細胞、約１細胞〜約７×１０３細胞、約１細胞〜約８×１０３細胞、約１細胞〜約９×１０３細胞、約１細胞〜約１×１０４細胞、約１細胞〜約２×１０４細胞、約１細胞〜約３×１０４細胞、約１細胞〜約４×１０４細胞、約１細胞〜約５×１０４細胞、約１細胞〜約６×１０４細胞、約１細胞〜約７×１０４細胞、約１細胞〜約８×１０４細胞、約１細胞〜約９×１０４細胞、約１細胞〜約１×１０５細胞、約１細胞〜約２×１０５細胞、約１細胞〜約３×１０５細胞、約１細胞〜約４×１０５細胞、約１細胞〜約５×１０５細胞、約１細胞〜約６×１０５細胞、約１細胞〜約７×１０５細胞、約１細胞〜約８×１０５細胞、約１細胞〜約９×１０５細胞、約１細胞〜約１×１０６細胞、約１細胞〜約２×１０６細胞、約１細胞〜約３×１０６細胞、約１細胞〜約４×１０６細胞、約１細胞〜約５×１０６細胞、約１細胞〜約６×１０６細胞、約１細胞〜約７×１０６細胞、約１細胞〜約８×１０６細胞、約１細胞〜約９×１０６細胞、約１細胞〜約１×１０７細胞、約１細胞〜約２×１０７細胞、約１細胞〜約３×１０７細胞、約１細胞〜約４×１０７細胞、約１細胞〜約５×１０７細胞、約１細胞〜約６×１０７細胞、約１細胞〜約７×１０７細胞、約１細胞〜約８×１０７細胞、約１細胞〜約９×１０７細胞、約１細胞〜約１×１０８細胞、約１細胞〜約２×１０８細胞、約１細胞〜約３×１０８細胞、約１細胞〜約４×１０８細胞、約１細胞〜約５×１０８細胞、約１細胞〜約６×１０８細胞、約１細胞〜約７×１０８細胞、約１細胞〜約８×１０８細胞、約１細胞〜約９×１０８細胞、または約１細胞〜約１×１０９細胞であり得る。
一部の実例では、本発明の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物の治療上有効用量は、約１×１０３細胞〜約２×１０３細胞、約１×１０３細胞〜約３×１０３細胞、約１×１０３細胞〜約４×１０３細胞、約１×１０３細胞〜約５×１０３細胞、約１×１０３細胞〜約６×１０３細胞、約１×１０３細胞〜約７×１０３細胞、約１×１０３細胞〜約８×１０３細胞、約１×１０３細胞〜約９×１０３細胞、約１×１０３細胞〜約１×１０４細胞、約１×１０３細胞〜約２×１０４細胞、約１×１０３細胞〜約３×１０４細胞、約１×１０３細胞〜約４×１０４細胞、約１×１０３細胞〜約５×１０４細胞、約１×１０３細胞〜約６×１０４細胞、約１×１０３細胞〜約７×１０４細胞、約１×１０３細胞〜約８×１０４細胞、約１×１０３細胞〜約９×１０４細胞、約１×１０３細胞〜約１×１０５細胞、約１×１０３細胞〜約２×１０５細胞、約１×１０３細胞〜約３×１０５細胞、約１×１０３細胞〜約４×１０５細胞、約１×１０３細胞〜約５×１０５細胞、約１×１０３細胞〜約６×１０５細胞、約１×１０３細胞〜約７×１０５細胞、約１×１０３細胞〜約８×１０５細胞、約１×１０３細胞〜約９×１０５細胞、約１×１０３細胞〜約１×１０６細胞、約１×１０３細胞〜約２×１０６細胞、約１×１０３細胞〜約３×１０６細胞、約１×１０３細胞〜約４×１０６細胞、約１×１０３細胞〜約５×１０６細胞、約１×１０３細胞〜約６×１０６細胞、約１×１０３細胞〜約７×１０６細胞、約１×１０３細胞〜約８×１０６細胞、約１×１０３細胞〜約９×１０６細胞、約１×１０３細胞〜約１×１０７細胞、約１×１０３細胞〜約２×１０７細胞、約１×１０３細胞〜約３×１０７細胞、約１×１０３細胞〜約４×１０７細胞、約１×１０３細胞〜約５×１０７細胞、約１×１０３細胞〜約６×１０７細胞、約１×１０３細胞〜約７×１０７細胞、約１×１０３細胞〜約８×１０７細胞、約１×１０３細胞〜約９×１０７細胞、約１×１０３細胞〜約１×１０８細胞、約１×１０３細胞〜約２×１０８細胞、約１×１０３細胞〜約３×１０８細胞、約１×１０３細胞〜約４×１０８細胞、約１×１０３細胞〜約５×１０８細胞、約１×１０３細胞〜約６×１０８細胞、約１×１０３細胞〜約７×１０８細胞、約１×１０３細胞〜約８×１０８細胞、約１×１０３細胞〜約９×１０８細胞、または約１×１０３細胞〜約１×１０９細胞であり得る。
一部の実例では、本発明の非操作型の濃縮γδＴ細胞集団、操作型の濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物の治療上有効用量は、約１×１０６細胞〜約２×１０６細胞、約１×１０６細胞〜約３×１０６細胞、約１×１０６細胞〜約４×１０６細胞、約１×１０６細胞〜約５×１０６細胞、約１×１０６細胞〜約６×１０６細胞、約１×１０６細胞〜約７×１０６細胞、約１×１０６細胞〜約８×１０６細胞、約１×１０６細胞〜約９×１０６細胞、約１×１０６細胞〜約１×１０７細胞、約１×１０６細胞〜約２×１０７細胞、約１×１０６細胞〜約３×１０７細胞、約１×１０６細胞〜約４×１０７細胞、約１×１０６細胞〜約５×１０７細胞、約１×１０６細胞〜約６×１０７細胞、約１×１０６細胞〜約７×１０７細胞、約１×１０６細胞〜約８×１０７細胞、約１×１０６細胞〜約９×１０７細胞、約１×１０６細胞〜約１×１０８細胞、約１×１０６細胞〜約２×１０８細胞、約１×１０６細胞〜約３×１０８細胞、約１×１０６細胞〜約４×１０８細胞、約１×１０６細胞〜約５×１０８細胞、約１×１０６細胞〜約６×１０８細胞、約１×１０６細胞〜約７×１０８細胞、約１×１０６細胞〜約８×１０８細胞、約１×１０６細胞〜約９×１０８細胞、約１×１０６細胞〜約１×１０９細胞、約１×１０６細胞〜約２×１０９細胞、約１×１０６細胞〜約３×１０９細胞、約１×１０６細胞〜約４×１０９細胞、約１×１０６細胞〜約５×１０９細胞、約１×１０６細胞〜約６×１０９細胞、約１×１０６細胞〜約７×１０９細胞、約１×１０６細胞〜約８×１０９細胞、約１×１０６細胞〜約９×１０９細胞、約１×１０７細胞〜約１×１０９細胞、約１×１０７細胞〜約２×１０９細胞、約１×１０７細胞〜約３×１０９細胞、約１×１０７細胞〜約４×１０９細胞、約１×１０７細胞〜約５×１０９細胞、約１×１０７細胞〜約６×１０９細胞、約１×１０７細胞〜約７×１０９細胞、約１×１０７細胞〜約８×１０９細胞、約１×１０７細胞〜約９×１０９細胞、約１×１０８細胞〜約１×１０９細胞、約１×１０８細胞〜約２×１０９細胞、約１×１０８細胞〜約３×１０９細胞、約１×１０８細胞〜約４×１０９細胞、約１×１０８細胞〜約５×１０９細胞、約１×１０８細胞〜約６×１０９細胞、約１×１０８細胞〜約７×１０９細胞、約１×１０８細胞〜約８×１０９細胞、約１×１０８細胞〜約９×１０９細胞、または約１×１０９細胞〜約１×１０１０細胞であり得る。
保存
一部の実施形態では、濃縮γδＴ細胞集団、及び／またはそれらの混和物は、少なくとも約１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、１年間、２年間、３年間、または少なくとも５年間の長期貯蔵のために、凍結培地中で製剤化され、液体窒素冷凍庫（−１９５℃）または超低温冷凍庫（−６５℃、−８０℃、または−１２０℃）等の極低温貯蔵ユニット内に置かれてもよい。凍結培地は、ｐＨを約６．０〜約６．５、約６．５〜約７．０、約７．０〜約７．５、約７．５〜約８．０、または約６．５〜約７．５に維持するための生理学的ｐＨ緩衝剤と共に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及び／または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及び／またはデキストロース、及び／または硫酸デキストラン、及び／またはヒドロキシエチル（ｈｙｄｒｏｙｅｔｈｙｌ）デンプン（ＨＥＳ）を含有し得る。冷凍保存されたγδＴ細胞は、解凍され、本明細書に記載されるような抗体、タンパク質、ペプチド、及び／またはサイトカインによる刺激によってさらにプロセスされ得る。冷凍保存されたγδＴ細胞は、解凍され、本明細書に記載されるようなウイルスベクター（レトロウイルス及びレンチウイルスベクターを含む）または非ウイルス手段（ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質を含む）により遺伝子改変され得る。代替として、非操作型γδＴ細胞を、本明細書に記載される方法によって増殖させ、遺伝子改変し、冷凍保存することができる。
故に、遺伝子操作型及び／または非操作型γδＴ細胞をさらに冷凍保存して、凍結培地中１ｍＬ当たり少なくとも約１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または少なくとも約１０１０細胞での、少なくとも約１、５、１０、１００、１５０、２００、５００バイアルの数量で、細胞バンクを生成することができる。冷凍保存された細胞バンクは、それらの機能性を保持し得、解凍し、さらに刺激して、増殖させることができる。一部の態様では、解凍させた細胞を、細胞培養バッグ及び／またはバイオリアクタ等の好適な密閉容器中で刺激し、増殖させて、同種異系の細胞製品として多量の細胞を生成することができる。冷凍保存されたγδＴ細胞は、極低温貯蔵条件下で、少なくとも約６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１５ヶ月間、１８ヶ月間、２０ヶ月間、２４ヶ月間、３０ヶ月間、３６ヶ月間、４０ヶ月間、５０ヶ月間、または少なくとも約６０ヶ月間にわたって、それらの生物学的機能を維持することができる。一部の態様では、防腐剤は、製剤中で何ら使用されない。冷凍保存されたγδＴ細胞は、解凍され、同種異系の既製の細胞製品として複数の患者に注入され得る。
本明細書で言及される全ての刊行物及び特許は、本明細書に記載の本発明に関連して使用され得る、例えば、当該刊行物に記載される構築物及び手法を説明し、開示する目的で、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。本明細書で考察される刊行物は、本願の出願日より前のそれらの開示のために提供されるにすぎない。本明細書中のいかなるものも、本明細書に記載される本発明者らが、先行発明に基づいてまたは他の任意の理由でかかる開示に先行する権利を有しないことを認めるものとして解釈されるべきではない。
本発明は、以下の非限定的な実施例によってより詳細に説明される。
実施例１．δ３ＴＣＲに特異的に結合する抗体の生成
マウス抗体の形態でのγδＴＣＲ活性化因子を、ヒトＩｇＧ１ＦＣに融合させたγδＴＣＲ鎖の成熟ＥＣＤを含む組換えヒト可溶性γ２δ３ＴＣＲ−ＦＣの免疫化によって生産した。マウスの３つの株（Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、及びＦＶＢ）にヒト組換えγδＴＣＲを接種して、高親和性のマウスモノクローナル抗体活性化因子を分泌しているハイブリドーマをもたらした。
γδＴＣＲ−Ｆｃ融合構築物をＰＣＲ増幅によって生成した。γ２δ３ＴＣＲ鎖を、大網への転移癌からの悪性卵巣細胞の新鮮な検体から抽出した腫瘍浸潤γδリンパ球から単離されたＲＮＡから増幅した。可溶性δ３ＴＣＲ−ＦＣを、一過性でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清から精製した。１０μｇの可溶性ＴＣＲを等体積のＴＩＴＥＲＭＡＸ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）またはＩｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で乳化し、各マウスの免疫化に使用した。次いで、結果として生じた乳濁液を、３匹のマウス（各々１匹：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、及びＦＶＢ）に足蹠経路を介して注射した。
固相ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ヒトγδ３ＴＣＲに特異的なマウスＩｇＧ抗体に関してマウス血清をスクリーニングした。簡潔に述べると、９６ウェルプレート（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号６１０７４４）に、ＥＬＩＳＡ塗布用緩衝液中１μｇ／ｍｌの組換えγδ３ＴＣＲを塗布し、一晩置いた。０．０２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、ウェルを、ＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）のＢＳＡにより２００μＬ／ウェルで、室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。マウス血清を滴定し（１：１００、１：２００、１：４００、及び１：８００）、５０ＵＬ／ウェルでγδＴＣＲ塗布済みプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いで、３％のＢＳＡ−ＰＢＳまたはＰＢＳ中２％のＦＣＳ中で１：１０，０００に希釈した５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧと共に、室温で１時間インキュベートする。再びプレートを洗浄し、４０μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ３４０２８）を添加して室温で１５分間置いた。発色後、等体積の２ＮのＨ２ＳＯ４を添加して基質発色を停止させ、プレートを分光光度計によってＯＤ４５０で分析した。
血清陽性の免疫化マウスを屠殺し、（膝窩部及び鼠径部の）流入領域リンパ節を切り出し、抗体産生細胞の供給源として使用した。Ｂ細胞（７６６×１０６細胞）の単一細胞懸濁液を、電気的融合によって非分泌性Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５８０）と１：１の比で融合させた。電気的融合は、製造業者の指示に従ってＢＴＸ Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅ（商標）システム（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて行った。融合後、１５％のＦｅｔａｌ Ｃｌｏｎｅ Ｉ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％のＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵのペニシリン−ストレプトマイシン、及び５０μＭの２−メルカプトエタノールを含有する、ピルビン酸ナトリウム含有高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｃｅｌｌｇｒｏカタログ番号１５−０１７−ＣＭ）、アザセリン（Ｓｉｇｍａ番号Ａ９６６６）を補充したハイブリドーマ選択培地中に細胞を再懸濁させ、次いで３本のＴ１５０フラスコにおいて、フラスコ１本当たり５０ｍＬの選択培地に播種した。次いで、フラスコを、５％のＣＯ２及び９５％の空気を含有する、加湿した３７℃のインキュベーター中に６〜７日間置いた。
６日間成長させた後、Ｔ１５０フラスコにおいてまとまって成長させた細胞からなるライブラリーを、Ａｒｉａ ＩＩ細胞選別機を用いてＦａｌｃｏｎ ３８４ウェル平底プレートに１ウェル当たり１細胞で播種した。次いで、選択のハイブリドーマを、１５％のＦｅｔａｌ Ｃｌｏｎｅ Ｉ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％のＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、４ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵのペニシリン−ストレプトマイシン、５０μＭの２−メルカプトエタノール、及び１００μＭのヒポキサンチンを含有する９０μＬの培養基中で成長させた。残りの未使用のハイブリドーマライブラリー細胞はいずれも今後のライブラリー試験のために凍結させた。１０日間成長させた後、播種した細胞の各ウェルからの上清を、δ３ＴＣＲに反応する抗体に関してＥＬＩＳＡによってアッセイした。
高結合能ＥＬＩＳＡ９６ウェルプレートに、以下のγδＴＣＲ鎖、すなわちγ８δ１、γ２δ１、及びγ２δ３を対合させることによって生成した、可溶性γδＴＣＲタンパク質を塗布した。可溶性ＴＣＲを炭酸ナトリウム緩衝液中１μｇ／ｍｌに希釈し、４℃で一晩使用した。プレートを洗浄し、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中３％のＢＳＡにより３７℃で１時間ブロッキングし、即座に使用したか、または４℃に保った。未希釈のハイブリドーマ上清をプレート上で、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、３％のＢＳＡ−ＰＢＳ中で１：１０，０００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧにより、室温で１時間プロービングした。次いで、プレートを上述の基質溶液と共にインキュベートし、ＯＤ４５０で読み取った。バックグラウンドより高いシグナルによって決定した、ヒトδ３ＴＣＲ鎖に優先的に結合した免疫グロブリンを含有するウェルを移し、増殖させた。
結果として生じたδ３ＴＣＲ特異的クローン性ハイブリドーマをＣＳ−１０凍結培地（Ｂｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中で冷凍保存し、液体窒素中で貯蔵した。
実施例２．δ３ＴＣＲに特異的に結合するマウス抗体の配列決定
ＥＬＩＳＡ結合アッセイに基づいて、δ３可溶性ＴＣＲに特異的に結合するいくつかの例となる別個のモノクローナル抗体を配列決定及びさらなる解析のために選択した。図１に表の様式で示されるように、実施例１で生成された選択のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（図）及び重鎖可変領域（図）の配列解析により、新規の相補性決定領域及び新規のＶＤＪ構成の呈示が確認された。図１に記載される相補性決定領域はＫａｂａｔによる定義に従う。
ＲＮｅａｓｙ単離キット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ Ｑｉａｇｅｎ番号７４１０６）を用いて、全ＲＮＡを選択のハイブリドーマ細胞から抽出した。１０４個のハイブリドーマ細胞を３５０μｌのＲＬＴ緩衝液中で溶解させ、等体積の７０％エタノールを添加し、試料をＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラムに投入した。カラムを２回洗浄し、スピンカラム膜に直接投入した１００μｌのＲＮａｓｅ不含水によりＲＮＡを溶離させた。ＲＮＡ調製物の品質を、１％アガロースゲルに３μＬを分取することによって決定してから、使用時まで−８０℃で貯蔵した。
完全マウスＶＨのレパートリーを標的とするように設計された、３２種のマウス特異的リーダー配列プライマーを含む５’プライマーミックスを、全てのマウスＩｇアイソタイプに特異的な３’マウスＣγプライマーと組み合わせて用いて、各ハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を増幅した。同じＰＣＲプライマーを用いて、ＶＨの４００ｂｐのＰＣＲ断片を両端から配列決定した。同様に、Ｖκマウスファミリーの各々を増幅するように設計された３２個の５’Ｖκリーダー配列プライマーのミックスを、マウスカッパ定常領域に対して特異的な単一の逆方向プライマーと組み合わせて用いて、カッパ軽鎖を増幅し、配列決定した。逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ＶＨ及びＶＬ転写物を１００ｎｇの全ＲＮＡから増幅した。
各ハイブリドーマにつき、Ｖκ軽鎖に対して４つ、Ｖγ重鎖に対して４つの総計８つのＲＴ−ＰＣＲ反応を実行した。Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＯｎｅＳｔｅｐ Ａｈｅａｄ ＲＴ−ＰＣＲキットを増幅に使用した（Ｑｉａｇｅｎ番号２２０２１３）。このキットは、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ及びＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素、ＱｕａｎｔｉＮｏｖａ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰミックス、緩衝液、ならびに任意のＲＮＡテンプレートの効率的な増幅を可能にする新規の添加剤であるＱ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎのブレンドを提供する。５μｌのＲＮＡ、０．５の１００μＭの重鎖プライマーまたはカッパ軽鎖プライマーのいずれか（ＩＤＴによりカスタム合成された）、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰｓを含む１２．５μｌのマスターミックス、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを含有する１μｌの酵素ミックス、ならびに０．４μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（１単位）を含む、反応混合物を調製した。反応混合物は、逆転写及びＰＣＲの両方に必要とされる試薬の全てを含有する。熱サイクラーのプログラム設定は、ＲＴステップが５０℃で１０分間、９５℃で５分間、続いてＰＣＲを３０サイクル（９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間）であった。次いで、最終インキュベーションが７２℃で１０分間であった。
ＤＮＡの直接の配列決定のためのＰＣＲ産物を調製するために、製造業者のプロトコルに従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、それらを精製した。５０μｌの滅菌水を用いてＤＮＡをスピンカラムから溶離させ、次いで両鎖から直接配列決定した。抽出したＰＣＲ産物は、特異的Ｖ領域プライマーを用いて直接配列決定した。ＶＢａｓｅ２を用いてヌクレオチド配列を解析して、配列相同性が最も高い生殖細胞系Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子メンバーを同定した。
注釈付き配列が、図１に記載される。より具体的には、図１（上）は、δ３ＴＣＲ特異的抗体由来の７つの新規のマウス重鎖可変領域の連続アミノ酸配列を図示し、図１（下）は、δ３ＴＣＲ特異的抗体由来の対応する軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列を図示する。
まとめて、図１は、７つのマウス抗δ３ＴＣＲ抗体（δ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８と称される）の注釈付き配列を提供する。
実施例３．δ３特異的抗体によるγδＴ細胞増殖
２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、５μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ抗体３００μｌを塗布し、一晩置いた。翌日、ウェルをＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中５％のＦＢＳにより３７℃で１時間ブロッキングした。Ｖδ３抗体を、２％のＦＢＳを含有するＰＢＳ中１μｇ／ｍＬで調製した。３００μｌの抗体溶液を各ウェルに分注し、室温で２時間インキュベートして、捕捉を行った。
健常な個体由来のヒトＰＢＭＣを、捕捉されたＶδ３抗体を含むウェルに、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を含有し、抗生物質を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中、１×１０６／ｍＬ／ウェルで播種した。培養物中の細胞に対して、２〜３日毎に培地の補給により栄養補給を行った。７日目、細胞を採取し、活性化抗体を含まない新たなプレートに１×１０６／ｍＬで再播種し、２〜３日毎に栄養補給を行うことによってさらに増殖させた。１４日目、細胞を１×１０６／ｍＬの細胞密度になるまで再播種した。２１日目、細胞分析（計数及びフローサイトメトリー）を行って、非Ｖδ１（Ｒ９ Ｖｄ１特異的抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）により決定）細胞及び非Ｖδ２（Ｂ６ Ｖｄ２特異的抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）により決定）細胞の純度及び増殖倍率を決定した。図４Ａ〜Ｂは、２つのドナーのＰＢＭＣ培養物中の非Ｖδ１／非Ｖδ２細胞の増殖倍率を示す。Ｖδ３特異的抗体は、Ｖδ３抗体に依存して最大８５３１倍（ドナー１）及び最大６６２１倍（ドナー２）の増殖を誘導した。
これら２つのドナーについての、２１日目の増殖させた培養物中の非Ｖδ１／非Ｖδ２細胞の純度が、図５Ａ〜Ｂに示される。δ３−２３抗体で増殖させたドナー１のＰＢＭＣについて、２１日目の細胞培養物の最大４１％が非Ｖδ１／非Ｖδ２γδＴ細胞から構成されていた。
２１日目の増殖させたδ１−／δ２−Ｔ細胞の表現型をＣＤ２７及びＣＤ４５表面マーカー発現によって評価した。図６Ａ〜Ｂは、ＭＡｂで活性化された２１日目のδ１−／δ２−Ｔ細胞の表現型が、主として（＞５０％）ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ＋（ナイーブ）及びＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ−（セントラルメモリー）であることを示す。
実施例４．γ２δ３ＴＣＲ−ｈＦｃへの競合結合によるＶδ３抗体のエピトープ分類
ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ機器及び抗ヒトＦｃ ＡＨＣバイオセンサ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を用いて、選択のＶδ３抗体を対合における競合パターンに基づいてエピトープビンに分類した。簡潔に述べると、γ２δ３ＴＣＲ−ｈＦｃ組換えタンパク質及び全てのＶδ３抗体を、２０μｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するＨＢＳ−ＰＢ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）中、５μｇ／ｍＬに希釈した。全ての試料（３００μｌ）を９６ウェルプレート中に配置し、製造業者の推奨に従ってＯｃｔｅｔ ３８４機器を用いて、競合実験を行った。まず、γ２δ３ＴＣＲ−ｈＦｃを抗ヒトＦｃバイオセンサ上に５分間捕捉させた。次いで、Ｖδ３抗体の対を飽和するまで連続してγ２δ３ＴＣＲ−ｈＦｃに結合させて（各々１０分間の会合段階）、抗体の対がγ２δ３ＴＣＲ−ｈＦｃ上の結合部位を競合するかどうかを決定した。第２の抗体が結合しなかった場合、それら２つの抗体は、同じエピトープビンにあり、同じ、非常に類似した、または主として重複するエピトープを認識すると見なされた。ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＨＴ９．０データ解析ツールを適用して、Ｖδ３抗体間の競合を決定した。
５つの抗Ｖδ３抗体の競合パターンが図７に提示される。試験した抗Ｖδ３抗体を３つのエピトープビンに分類した。δ３−２３、δ３−４２、及びδ３−５８は全て、対合における結合アッセイで互いに競合し、１Ａと指定される１つのエピトープビンの構成要素となることが見出された。δ３−３１は、試験した抗体のうちのいずれとも競合しなかったため、別個のビン２に入れられた。δ３−０８抗体は、δ３−３１抗体とは競合しなかったが、δ３−２３、δ３−４２、及びδ３−５８により置き換えられるようであり、δ３−０８抗体は恐らく重複するエピトープを有するものの、δ３−０８の親和性がより低い可能性があることが示唆された。δ３−０８のエピトープは、ビン１Ｂと指定される。
実施例５．Ｖδ３γδＴ細胞の活性化、形質導入、及び選択的増殖
１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標））に、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬの精製δ３−０８またはδ３−２３抗体を６００μＬ／ウェルで直接塗布し、４℃で一晩置いた。翌日、ウェルをＰＢＳで洗浄し、２つのドナー（ドナー３及びドナー４）由来のＰＢＭＣ（２×１０６個の総細胞）を活性化のために、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中１×１０６細胞／ｍＬで添加した。出発ＰＢＭＣをフローサイトメトリーによって、Ｖδ３細胞を含有するＶδ１、Ｖδ２、及び非Ｖδ１／Ｖδ２γδＴ（ＤＮ、二重陰性）画分の含量に関して特性評価した。非Ｖδ１／Ｖδ２γδＴ細胞含量は、総細胞の＜０．５％であった。２日目及び４日目に、細胞培養物に対して、ｒｈＩＬ−２を補充した新鮮な培地で半交換により栄養補給を行った。
５日目、細胞をＨＢＳＳ中で洗浄し、抗ＣＤ２０（リツキサン）キメラ抗原受容体ＡＣＴ２（ｓｃＦｖをＣＤ２８膜貫通共刺激ドメイン及びＣＤ３ζに連結）をコードするレトロウイルス構築物で形質導入した。簡潔に述べると、１２ウェルの非組織培養処理プレートのウェルに、１０μｇ／ｍＬのＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（登録商標）（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）を予め塗布し、２×１０６個の活性化されたＰＢＭＣをウェルに添加し（ドナー毎、活性化抗体毎）、続いてＭＯＩ＝１を達成するように適切な体積のウイルス上清を添加した。培地の総体積を２ｍＬにして、１×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度を達成し、ｒｈＩＬ−２を１００ＩＵ／ｍＬになるように補充した。細胞の一部分には形質導入を行わなかったが、ＣＡＲ形質導入細胞と同じ操作を施した（非形質導入、疑似形質導入）。
翌日、細胞を増殖のために６ウェルプレートに移し、１日おきに培地半交換により栄養補給することによってさらに１１日間維持した。増殖の終わりに、細胞を採取し、洗浄し、フローサイトメトリーによってＶδ３の増殖倍率、純度、及びＣＡＲ発現に関して分析した（図８Ａ〜Ｃ）。簡潔に述べると、細胞をＴＣＲαβ（Ｃｌｏｎｅ ＩＰ２６）、抗ＴＣＲγδ（Ｉｍｍｕｎｏ５１０、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、抗Ｖδ２（Ｂ６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗Ｖδ１（Ｒ９．１２、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ５６（いずれもＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の抗体で染色し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩにおいて分析した。抗ＣＤ２０ ＣＡＲ形質導入効率を決定するために、細胞をラット抗リツキシマブ−ＦＩＴＣコンジュゲートで染色した（ＢｉｏＲａｄ、図８Ｃ）。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてデータを解析した。培養物中のαβＴ細胞を、マニュアル手順を用いて、ＬＳカラムと共にαβＴ細胞除去キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて除去した。αβＴ細胞除去後の純度及びＣＡＲ発現をフローサイトメトリーによって確認し、細胞を細胞傷害性アッセイに使用した。残留αβＴ細胞のパーセンテージは、全ての試料中で＜１％であり、Ｖδ３細胞の純度は、ドナー及びＶδ３細胞増殖に使用した抗体に依存して＞７０％であった（図９）。
δ３−０８ＭＡｂ及びδ３−２３ＭＡｂの両方を用いて増殖させたドナー４由来の非形質導入細胞から、残留αβＴ細胞を除去し、δ３−２３ＭＡｂならびに他のＴ細胞マーカー（ＴＣＲαβ、抗Ｖδ１、抗Ｖδ２）で染色した。図１０に示されるように、αβＴ細胞除去後の細胞の大部分（≧９０％）は、非Ｖδ１／非Ｖδ２細胞であり（左パネル）、このうち≧９５％が、δ３−２３ＭＡｂによりＶδ３に関して陽性染色された（右パネル）。
実施例６．操作型Ｖδ３γδＴ細胞の細胞傷害性アッセイ
実施例５に記載されるようにδ３−０８及びδ３−２３ＭＡｂを用いて、ドナー３由来のヒトＰＢＭＣを活性化させ、ＣＤ２０ ＣＡＲ構築物で形質導入した。実施例５に記載されるように、増殖の終わりに、細胞を純度及び形質導入効率に関して特性評価し、αβＴ細胞を除去した。次いで、αβＴ細胞が除去された培養物をＣＤ２０＋ Ｒａｊｉ−ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ細胞に対する細胞傷害性アッセイにおいて使用した。ＣＤ２０＋ Ｒａｊｉ−ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ細胞は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄレンチウイルス粒子で形質導入されており、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）プラットフォーム上でＲａｊｉ細胞の蛍光検出が可能である。
ＣＤ２０ ＣＡＲ形質導入または非形質導入Ｖδ３細胞を、３８４ウェルプレート中、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で、Ｒａｊｉ−ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ細胞と共に種々のＥ／Ｔ比で６時間、共インキュベートした。Ｒａｊｉ−ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ細胞の生存能を、６時間時点でウェル全体から定量した総蛍光量として評定した。図１１に示されるように、δ３−０８（Ａ）またはδ３−２３（Ｂ）ＭＡｂを用いてドナー３から増殖させた抗ＣＤ２０ ＣＡＲ形質導入Ｖδ３細胞及び非形質導入Ｖδ３細胞の両方が、ＣＤ２０＋ Ｒａｊｉ−ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ細胞に対する細胞傷害性を示した。形質導入Ｖδ３細胞は、増殖させた非形質導入Ｖδ３細胞と比較して、ＣＤ２０＋ Ｒａｊｉ−ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ細胞に対する細胞傷害性を有意に増強した。
実施例７．変異誘発による抗Ｖδ３抗体の微細エピトープマッピング
Ｖδ３抗体の結合に必要不可欠であるヒトγδＴＣＲの可変Ｖδ３領域におけるアミノ酸残基を決定するために、いくつかの点変異、またはそれらの組み合わせをδ３鎖に導入し、Ｌｕｍｉｎｅｘを用いてＭＡｂ結合を評定した。簡潔に述べると、Ｖδ３Ｖγ９二量体分子のコンピュータモデルを、ＰＤＢに寄託されたＶδ２Ｖγ９ＴＣＲの結晶構造（受託番号１ＨＸＭ及び１ＴＶＤ）を用いて作成した。表１に示されるような可能性のある免疫原性に基づいて、Ｖδ３鎖の野生型配列に置換を導入した。Ｖδ３アミノ酸の残基の番号付けは、図１２に示される通りである。表１に示される変異型Ｖδ３鎖を、実施例１に記載されるような２９３Ｅｘｐｉ細胞において、ヒト−Ｆｃヘテロ二量体融合タンパク質としてＶγ２鎖と共発現させ、プロテインＡによる親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。変異体及び野生型δ３γ２−ｈＦｃタンパク質を、ヤギ−抗ヒトＦｃポリクローナル抗体とコンジュゲートしたＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズ上に捕捉させ、種々のＶδ３抗体のＥＣ５０結合を決定した。特定の変異体δ３γ２−ＴＣＲ融合体へのＥＣ５０結合の損失または低下を監視して、この変異型アミノ酸の抗原結合への寄与を決定した。理論に拘束されることを望むものではないが、変異に際して結合の減少を示す残基は、Ｖδ３γδＴＣＲに結合したときのδ３特異的抗体と接触しているとの仮説が立てられる。
Figure 2021502816
本明細書に記載される微細エピトープマッピングによって抗原結合に寄与することが示される選択残基の綿密な分類が、図１３及び図１４Ａ〜Ｃに例示され、これらにおいて、本明細書に記載される抗体によって認識されるδ３特有のエピトープが少なくとも部分的に、または全体的に、立体構造状及び／または非直鎖状であり得ることが示唆される。図１３により示されるように、δ３特異的γδＴＣＲ結合抗体は、Ｖδ３のγ鎖結合境界面から遠位にあるＶδ３のエピトープに結合し得る。
表１及び図１３〜１４Ｃに示されるように、δ３特異的抗体は、２つの主要なエピトープ結合群に分類することができ、ここにおいて、δ３−０８、δ３−２３、δ３−４２、及びδ３−５８が第１の群を形成し、δ３−３１が第２の群を形成する。第１の主要群は、２つの下位群に分離することができ、このうち、δ３−２３、δ３−４２、及びδ３−５８が下位群１Ａを形成し、δ３−０８が下位群１Ｂを形成する。これらの結果は、図７に例示される競合結合データとよく一致している。しかしながら、抗原結合に関わる特定残基を強調表示することに加えて、詳細マッピングは、抗体δ３−３１及びδ３−４２によって形成される第３の群を明らかにし、これらの抗体は両方ともＥ６７Ｑ、Ｄ７０Ｎ、Ｒ７５Ｑ、Ｒ９５Ｑ、Ｅ９７Ｑ変異体Ｖδ３γδＴＣＲへの結合の低減を示す。
図１４Ａ〜Ｃはまた、δ３特異的抗体の抗原結合のためのホットスポットとしてβシートストランドＤ及びＥ（ＩＭＧＴ命名法）も強調表示する。故に、一部の実例では、δ３特異的抗体は、Ｖδ３のβシートストランドＤ及びＥ（ＩＭＧＴ命名法）における残基に結合するもの、追加としてまたは代替として、Ｖδ３のＶδ３のβシートストランドＣ’’及びＤにおける残基、ならびにβストランドＥとＦとの間のループ（ＩＭＧＴ命名法）における残基に結合するもの、及び／またはＶδ３のβシートストランドＡ、Ｂ、Ｄ、及びＥ（ＩＭＧＴ命名法）における残基に結合するものを含み得る。
アミノ酸レベルでは、いくつかのδ３γδＴＣＲ特異的抗体は、Ｖδ３の残基Ｋ７９及びＨ８８（ＩＭＧＴ命名法）に結合するとの仮説が立てられる。追加として、または代替として、いくつかのδ３γδＴＣＲ特異的抗体は、Ｖδ３の残基Ｒ７５及びＲ９５（ＩＭＧＴ命名法）に結合する。追加として、または代替として、いくつかのδ３γδＴＣＲ特異的抗体は、Ｖδ３の残基Ｋ７９、Ｅ１８、及びＨ８８（ＩＭＧＴ命名法）に結合する。追加として、または代替として、いくつかのδ３γδＴＣＲ特異的抗体は、Ｖδ３の残基Ｅ６７、Ｄ７０、Ｒ７５、Ｒ９５、及びＥ９７（ＩＭＧＴ命名法）に結合する。追加として、または代替として、いくつかのδ３γδＴＣＲ特異的抗体は、Ｖδ３の残基Ｋ３、Ｋ７９、及びＨ８８（ＩＭＧＴ命名法）に結合する。追加として、または代替として、いくつかのδ３γδＴＣＲ特異的抗体は、Ｖδ３の残基Ｋ７９、Ｌ８２、及びＨ８８（ＩＭＧＴ命名法）に結合する。

Claims (72)

  1. δ３γδＴＣＲに特有のエピトープに結合する抗体またはその断片。
  2. 前記抗体またはその断片が、
    ａ）δ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体、
    ｂ）δ３−０８、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体、
    ｃ）δ３−０８、δ３−２３、δ３−４２、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体、
    ｄ）δ３−２３、δ３−４２、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体、
    ｅ）δ３−３１及びδ３−４２からなる群から選択される抗体、
    ｆ）抗体δ３−０８、または
    ｇ）抗体δ３−３１、
    と本質的に同じエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体またはその断片。
  3. 前記抗体またはその断片が、
    ａ）δ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体、
    ｂ）δ３−０８、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体、
    ｃ）δ３−０８、δ３−２３、δ３−４２、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体、
    ｄ）δ３−２３、δ３−４２、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体、
    ｅ）δ３−３１及びδ３−４２からなる群から選択される抗体、
    ｆ）抗体δ３−０８、または
    ｇ）抗体δ３−３１、
    と同じエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体またはその断片。
  4. 前記抗体またはその断片が、
    ａ）δ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体、
    ｂ）δ３−０８、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体、
    ｃ）δ３−０８、δ３−２３、δ３−４２、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体、
    ｄ）δ３−２３、δ３−４２、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体、
    ｅ）δ３−３１及びδ３−４２からなる群から選択される抗体、
    ｆ）抗体δ３−０８、または
    ｇ）抗体δ３−３１、
    の相補性決定領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
  5. 前記抗体またはその断片が、γδＴＣＲのＶδ３に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体またはその断片。
  6. 前記抗体が、Ｖδ３のγ鎖結合境界面から遠位の領域に結合する、請求項５に記載の抗体。
  7. 前記抗体が、ＩＭＧＴ命名法による前記γδＴＣＲの前記Ｖδ３のβストランドＤ及びＥに結合する、請求項５に記載の抗体。
  8. 前記抗体が、ＩＭＧＴ命名法による前記γδＴＣＲの前記Ｖδ３のβストランドＣ’’及びＤならびにβストランドＥとＦとの間のループに結合する、請求項５に記載の抗体。
  9. 前記抗体が、ＩＭＧＴ命名法による前記γδＴＣＲの前記Ｖδ３のβストランドＡ、Ｂ、Ｄ、及びＥに結合する、請求項５に記載の抗体。
  10. 前記抗体またはその断片が、γδＴ細胞及びαβＴ細胞を含む混合細胞集団中で、αβＴ細胞と比較してδ３γδＴ細胞を選択的に増殖させる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
  11. 前記抗体またはその断片が、δ３γδＴＣＲに結合するものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
  12. 前記δ３γδＴＣＲが、δ３γδＴ細胞の表面上で発現される、請求項１１に記載の抗体またはその断片。
  13. 前記抗体またはその断片が、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞外表面に結合するものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
  14. 前記抗体またはその断片が、前記ＡＰＣまたはａＡＰＣの膜において係留される、請求項１３に記載の抗体またはその断片。
  15. 前記抗体またはその断片のＦｃ領域が、前記ＡＰＣまたはａＡＰＣにより発現されるＦｃ受容体に結合するものである、請求項１３に記載の抗体またはその断片。
  16. 前記抗体またはその断片が、
    ａ）δ３−０８、δ３−２０、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体、
    ｂ）δ３−０８、δ３−２３、δ３−３１、δ３−４２、δ３−４７、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体、
    ｃ）δ３−０８、δ３−２３、δ３−４２、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体、
    ｄ）δ３−２３、δ３−４２、及びδ３−５８からなる群から選択される抗体、
    ｅ）δ３−３１及びδ３−４２からなる群から選択される抗体、
    ｆ）抗体δ３−０８、または
    ｇ）抗体δ３−３１、
    に対して結合を競合する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
  17. 前記抗体またはその断片が、δ３γδＴ細胞の特異的活性化因子である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
  18. 請求項１〜１７に記載の抗体またはその断片のうちのいずれか１つをコードする核酸であって、前記核酸が、異種プロモーターに作動可能に連結されている、前記核酸。
  19. 請求項１〜１７に記載の抗体もしくはその断片のうちのいずれか１つまたは請求項１８に記載の核酸を含む、宿主細胞。
  20. 前記宿主細胞が人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）である、請求項１９に記載の宿主細胞。
  21. δ３γδＴＣＲに特有のエピトープに結合する抗体またはその断片の作製方法であって、前記抗体またはその断片を産生させるのに十分な条件下で請求項１９に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
  22. 濃縮γδＴ細胞集団を生産するためのエクスビボ方法であって、γδＴ細胞を含む第１の細胞集団を、請求項１〜１７に記載の１つまたは複数の抗体またはその断片と接触させることを含む、前記方法。
  23. 前記第１の細胞集団が、αβＴ細胞及びγδＴ細胞を含む単離された混合細胞集団である、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記第１の細胞集団が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の試料を含むか、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の試料である、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記第１の細胞集団が、末梢血試料、白血球アフェレーシス試料、臍帯血試料、腫瘍試料、または組織試料から選択される、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記第１の細胞集団が、１％未満のδ３γδＴ細胞を含む、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記第１の細胞集団が、培養されていない初代細胞または継代されていない初代細胞を含む、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記方法が、前記単離された混合細胞集団を、前記１つまたは複数の抗体またはその断片と直接接触させることを含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記第１の細胞集団が、１つまたは複数の操作型γδＴ細胞を含む集団である、請求項２２に記載の方法。
  30. 前記第１の細胞集団が、増殖させたγδＴ細胞の第１の集団である、請求項２２または２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記方法が、第１のγδＴ細胞増殖及び第２のγδＴ細胞増殖を含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記方法が、少なくとも１０８個のδ３γδＴ細胞を含む濃縮γδＴ細胞集団を生産することを含む、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 少なくとも１０８個のδ３γδＴ細胞を含む前記濃縮γδＴ細胞集団が、１２〜２１日以内に生産される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記方法が、前記第１の細胞集団中で前記δ３γδＴ細胞を、少なくとも１，０００倍、好ましくは少なくとも５，０００倍、より好ましくは少なくとも１０，０００倍、または約１０，０００倍、または少なくとも約１０，０００倍増殖させることを含む、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記指定の増殖倍率が１２〜２１日以内に達成される、請求項３４に記載の方法。
  36. 濃縮γδＴ細胞集団を生産するためのエクスビボ方法であって、
    ａ）γδＴ細胞を含む第１の細胞集団を、γδＴ細胞を活性化させ、増殖させる１つまたは複数の第１の活性化剤と接触させて、それによって、増殖させた第１のγδＴ細胞集団を生産することと、
    ｂ）前記増殖させた第１のγδＴ細胞集団を、γδＴ細胞を活性化させ、増殖させる１つまたは複数の第２の活性化剤と接触させて、それによって、前記濃縮γδＴ細胞集団を生産することと、
    を含み、前記１つもしくは複数の第１の活性化剤のうちの少なくとも１つまたは前記１つもしくは複数の第２の活性化剤のうちの少なくとも１つが、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体またはその断片である、前記方法。
  37. 前記方法が、ａ）の後かつｂ）の前に、前記増殖させた第１のγδＴ細胞集団を単離することを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. ａ）が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び前記１つまたは複数の第１の活性化剤の存在下で前記第１の細胞集団を培養することを含む、請求項３６または３７に記載の方法。
  39. ｂ）が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び前記１つまたは複数の第２の活性化剤の存在下で前記増殖させた第１のγδＴ細胞集団を培養することを含む、請求項３６または３７に記載の方法。
  40. 前記第１の細胞集団が、αβＴ細胞及びγδＴ細胞を含む単離された混合細胞集団である、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記第１の細胞集団が、末梢血試料、白血球アフェレーシス試料、臍帯血試料、腫瘍試料、または組織試料から選択される、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記第１の細胞集団が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の試料を含むか、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の試料である、請求項４０に記載の方法。
  43. 前記第１の細胞集団が、培養されていない初代細胞、継代されていない初代細胞を含む、請求項３６〜４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記第１の細胞集団が、操作型γδＴ細胞の集団である、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記方法が、前記増殖させた第１のγδＴ細胞集団を遺伝子改変すること、または前記濃縮γδＴ細胞集団を遺伝子改変することを含む、請求項３６〜４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記方法が、少なくとも１０８個のδ３γδＴ細胞を含む濃縮γδＴ細胞集団を生産することを含む、請求項３６〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 少なくとも１０８個のδ３γδＴ細胞を含む前記濃縮γδＴ細胞集団が、１２〜２１日以内に生産される、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記方法が、前記第１の細胞集団中で前記δ３γδＴ細胞を、少なくとも１，０００倍、好ましくは少なくとも５，０００倍、より好ましくは少なくとも１０，０００倍、または約１０，０００倍、または少なくとも約１０，０００倍増殖させることを含む、請求項３６〜４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記指定の増殖倍率が１２〜２１日以内に達成される、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記１つまたは複数の第１の活性化剤のうちの少なくとも１つが、前記１つまたは複数の第２の活性化剤のうちの少なくとも１つと構造的に同一である、請求項３６〜４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記１つまたは複数の第１の活性化剤のうちの少なくとも１つが、前記１つまたは複数の第２の活性化剤のうちの少なくとも１つとは構造的に異なる、請求項３６〜５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記１つもしくは複数の第１の活性化剤のうちの少なくとも１つまたは前記１つもしくは複数の第２の活性化剤のうちの少なくとも１つが固定化されている、請求項３６〜５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記固定化された活性化剤が、培養容器の表面上に固定化されている、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記固定化された活性化剤が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）または人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の表面上に固定化されている、請求項５２に記載の方法。
  55. 固定化された活性化剤が、δ３γδＴＣＲに特有の前記エピトープに結合する前記抗体またはその断片である、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記方法が、αβＴ細胞除去の前、またはαβＴ細胞除去の不在下で、３０％超、好ましくは４０％超のδ３γδＴ細胞を達成する、請求項２２〜３５または３６〜５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 増殖させたγδＴ細胞集団であって、前記増殖させたγδＴ細胞の３０％超、好ましくは４０％超、より好ましくは６０％超、なおもより好ましくは７０％超、さらにより好ましくは８０％超がδ３γδＴ細胞である、前記増殖させたγδＴ細胞集団。
  58. 前記増殖させたγδＴ細胞集団が、ポリクローン性のＴＣＲ多様性を含む、請求項５７に記載の増殖させたγδＴ細胞集団。
  59. 前記δ３Ｔ細胞の６０超％または７０％超が、表現型ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ２７＋及び／またはＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ２７＋を発現する、請求項５８に記載の増殖させたγδＴ細胞集団。
  60. 腫瘍浸潤リンパ球に由来する、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の増殖させたγδＴ細胞集団。
  61. 前記γδＴ細胞が、内因性または異種腫瘍認識部分を発現する、請求項５７〜６０のいずれか１項に記載の増殖させたγδＴ細胞集団。
  62. 前記集団が治療上有効量のγδＴ細胞を含む、請求項５７〜６１のいずれか１項に記載の増殖させたγδＴ細胞集団。
  63. 前記γδＴ細胞集団が、ＮＫｐ３０活性、ＮＫｐ４４活性、及び／またはＮＫｐ４６活性から独立した抗腫瘍細胞傷害性を含む、請求項５７〜６２のいずれか１項に記載の増殖させたγδＴ細胞集団。
  64. 前記γδＴ細胞集団が、ＮＫｐ３０活性依存性の抗腫瘍細胞傷害性、ＮＫｐ４４活性依存性の抗腫瘍細胞傷害性、及び／またはＮＫｐ４６活性依存性の抗腫瘍細胞傷害性を含まない、請求項６３に記載の増殖させたγδＴ細胞集団。
  65. 前記γδＴ細胞の４０％未満が、検出可能なレベルのＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、及び／またはＮＫｐ４６を発現する、請求項５７〜６３のいずれか１項に記載の増殖させたγδＴ細胞集団。
  66. ａ）請求項２２〜３５のいずれか１項に記載の方法、または
    ｂ）請求項３６〜５６のいずれか１項に記載の方法、
    によって生産される、増殖させたγδＴ細胞集団。
  67. がん、炎症性疾患、または自己免疫疾患の処置を必要とする対象における、前記がん、炎症性疾患、または自己免疫疾患の処置方法であって、治療上有効量のδ３γδＴ細胞を前記対象に投与することを含む、前記方法。
  68. がん、炎症性疾患、または自己免疫疾患の処置を必要とする対象における、前記がん、炎症性疾患、または自己免疫疾患の処置方法であって、
    ａ）治療上有効量の、請求項５７〜６６のいずれか１項に記載のδ３γδＴ細胞を用意することと、
    ｂ）前記治療上有効量のδ３γδＴ細胞を前記対象に投与することと、
    を含む、前記方法。
  69. 前記方法が、前記増殖させたγδＴ細胞集団を第２の増殖させたγδＴ細胞集団と混和して、混和集団を形成することと、前記混和集団を前記対象に投与することと、をさらに含む、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記第２の増殖させたγδＴ細胞集団が、＞６０％のδ１γδＴ細胞または＞６０％のδ２γδＴ細胞を含む、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記混和γδＴ細胞集団が、＞６０％のδ１γδＴ細胞または＞６０％のδ２γδＴ細胞を含む、請求項６９に記載の方法。
  72. 前記混和γδＴ細胞集団が、＞６０％のδ３γδＴ細胞を含む、請求項６９に記載の方法。
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