CN111801349A - 用于选择性扩增δ3γδT细胞群的方法及其组合物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及结合对δ3γδTCR具有特异性的表位的药剂。此类药剂可以是但不限于抗体或其片段。本文还描述了用于使用所述药剂，例如，扩增或选择性扩增δ3γδT细胞的方法。本文还描述了使用扩增的δ3γδT细胞治疗有需要的受试者的方法。

Description

用于选择性扩增δ3γδT细胞群的方法及其组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月15日提交的美国临时申请号62/586,782的优先权权益，其内容据此整体并入且用于所有目的。
背景技术
T淋巴细胞的抗原识别可通过高度多样化的异二聚体受体，即T细胞受体(TCR)实现。血液和淋巴器官中大约95％的人T细胞表达异二聚体αβTCR受体(αβT细胞谱系)。血液和淋巴器官中大约5％的人T细胞表达异二聚体γδTCR受体(γδT细胞谱系)。这些T细胞亚群可分别称为‘αβ’和‘γδ’T细胞。αβ和γδT细胞的功能不同。在I/II类MHC的背景中，当抗原呈递细胞(APC)呈递抗原时，则发生αβT细胞的活化。与αβT细胞相比，γδT细胞可以不依赖MHC限制而识别抗原。此外，γδT细胞组合了先天性和过继性免疫识别和应答。
γδT细胞利用一组独特的体细胞重排的可变(V)、多样性(D)、连接(J)和恒定(C)基因。γδT细胞含有比αβT细胞更少的V、D和J区段。尽管生殖系Vγ和Vδ基因的数量比Vα和VβTCR基因库更有限，但是TCRγ和δ链重排期间更广泛的连接多样化过程产生比αβTCR潜在更大的γδTCR库(Carding和Egan，Nat Rev Immunol(2002)2：336)。
人γδT细胞使用3个主要Vδ(Vδ1、Vδ2、Vδ3)和最多六个Vγ区域基因来构成其TCR(Hayday AC.，Annu Rev Immunol.2000；18，975-1026)。两个主要Vδ亚群是Vδ1和Vδ2γδT细胞。具有不同Vγ的Vδ1T细胞在粘膜γδT细胞的上皮内亚群中占优势，其中TCR似乎识别上皮细胞上的应激分子(Beagley KW，Husband AJ.Crit Rev Immunol.1998；18(3)：237-254)。通常共表达Vγ9的Vδ2T细胞在外周血和淋巴系统中是丰富的。
γδT细胞直接识别患病细胞上的抗原并表现出杀伤肿瘤细胞的固有能力的能力使得γδT细胞成为具有吸引力的治疗工具。Vγ9Vδ2T细胞的过继性转移已经对癌症的研究性治疗产生了有限的客观临床响应(Kondo等人，Cytotherapy，10：842-856，2008；Lang等人，Cancer Immunology，Immunotherapy：CII，60：1447-1460，2011；Nagamine等人，2009；Nicol等人，British Journal of Cancer，105：778-786，2011；Wilhelm等人，Blood.2003Jul 1；102(1)：200-6)，表明需要分离和临床测试新的γδT细胞群。
选择性扩增具有有效抗肿瘤活性以及改善的纯度和临床相关水平的γδT细胞亚群的能力是非常期望的。虽然抗体和细胞因子混合物已用于繁殖更多不同的γδT细胞集合，但是将特定γδT细胞亚群活化至足够的纯度和临床相关水平仍未实现(Dokouhaki等人，2010；Kang等人，2009；Lopez等人，2000；Kress，2006)。因此，迫切需要离体扩增特定γδT细胞亚群的临床相关方法，以及由此产生的细胞。
发明内容
在一个方面，本发明提供了用于产生富集的γδT细胞群的离体方法。富集的γδT细胞群可以通过一种方法由分离的混合细胞群产生，所述方法包括使混合细胞群或其纯化级分与一种或多种药剂接触，所述一种或多种药剂通过结合对δ3 TCR具有特异性的表位而选择性地扩增δ3 T细胞。扩增的T细胞群可以，例如，单独地或与其他T细胞群组合地用于治疗方法中，这通过向有需要的受试者施用来实现。在一些情况下，药剂是抗体或其片段。
在第一方面，本发明提供了一种选择性地结合对δ3γδTCR具有特异性的表位的药剂。在一些实施方案中，药剂是抗体或其片段。在一些实施方案中，药剂是选择性地结合对δ3γδTCR具有特异性的活化表位的活化剂。
在一些实施方案中，药剂(例如，抗体或其片段)与选自由δ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58组成的组的抗体结合(或竞争)相同的表位，或基本上相同的表位。在一些实施方案中，药剂(例如，抗体或其片段)与选自由δ3-08、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58组成的组的抗体结合(或竞争)相同的表位，或基本上相同的表位。在一些实施方案中，药剂(例如，抗体或其片段)包含选自由δ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58组成的组的抗体的互补决定区。在一些实施方案中，药剂(例如，抗体或其片段)包含选自由δ3-08、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58组成的组的抗体的互补决定区。
在一些实施方案中，药剂(例如，抗体或其片段)与抗体δ3-23、δ3-42和/或δ3-58竞争结合δ3 TCR(例如，γ2δ3 TCR)。在一些实施方案中，药剂(例如，抗体或其片段)与抗体δ3-08竞争结合δ3 TCR(例如，γ2δ3 TCR)。在一些实施方案中，药剂(例如，抗体或其片段)与抗体δ3-08、δ3-23、δ3-42和/或δ3-58竞争结合δ3 TCR(例如，γ2δ3 TCR)。在一些实施方案中，药剂(例如，抗体或其片段)与抗体δ3-31竞争结合δ3 TCR(例如，γ2δ3 TCR)。
在一些实施方案中，与包含γδT细胞和αβT细胞的混合细胞群中的αβT细胞相比，药剂(例如，抗体或其片段)选择性地扩增δ3γδT细胞。在一些实施方案中，药剂(例如，抗体或其片段)结合至δ3γδTCR。在一些实施方案中，δ3γδTCR在工程改造的δ3γδT细胞的表面上表达。在一些实施方案中，δ3γδTCR在非工程改造的δ3γδT细胞，诸如选择性扩增的非工程改造的δ3γδT细胞的表面上表达。在一些实施方案中，药剂(例如，抗体或其片段)结合至在δ3γδT细胞的表面上表达的δ3γδTCR。在一些情况下，结合至在δ3γδT细胞的表面上表达的δ3γδTCR的药剂(例如，抗体或其片段)与δ3γδT细胞形成分离的复合物，处于受试者中，处于离体或体外培养物中，或处于容器中。在一些实施方案中，药剂(例如，抗体或其片段)结合至在离体扩增培养物中的δ3γδT细胞的表面上表达的δ3γδTCR。
在一些实施方案中，药剂(例如，抗体或其片段)结合至抗原呈递细胞(APC)的细胞外表面。在一些实施方案中，药剂(例如，抗体或其片段)锚定在APC的膜中。在一些实施方案中，药剂(例如，抗体或其片段)结合至由APC表达的Fc受体。在一些情况下，APC是人工APC(artificial APC，aAPC)。在一些情况下，APC处于受试者中、是分离的、处于离体或体外培养物中，或处于容器中。
在一些情况下，药剂(例如，抗体或其片段)结合Vδ3的γ链结合界面的远端区域。在一些情况下，根据IMGT命名法，药剂(例如，抗体或其片段)结合γδTCR的Vδ3的β链D和E。在一些情况下，根据IMGT命名法，药剂(例如，抗体或其片段)结合γδTCR的Vδ3的β链C”和D以及β链E和F之间的环。在一些情况下，根据IMGT命名法，药剂(例如抗体或其片段)结合γδTCR的Vδ3的β链A、B、D和E。
在一些情况下，药剂(例如，抗体或其片段)结合Vδ3的氨基酸K79和H88(IMGT命名法)。在一些情况下，药剂(例如，抗体或其片段)结合Vδ3的氨基酸R75和R95(IMGT命名法)。在一些情况下，药剂(例如，抗体或其片段)结合Vδ3的氨基酸K79、E18和H88(IMGT命名法)。在一些情况下，药剂(例如，抗体或其片段)结合Vδ3的氨基酸E67、D70、R75、R95和E97(IMGT命名法)。在一些情况下，药剂(例如，抗体或其片段)结合Vδ3的氨基酸K3、K79和H88(IMGT命名法)。在一些情况下，药剂(例如，抗体或其片段)结合Vδ3的氨基酸K79、L82和H88(IMGT命名法)。通常，在Vδ3γδTCR，诸如在Vδ3γδT细胞的表面上表达的Vδ3γδTCR的背景下，药剂结合特定氨基酸或其组。
在第二方面，本发明提供了一种编码前述药剂(例如，抗体或其片段)中的任一种的核酸。在一些情况下，核酸可操作地连接至异源性启动子。在第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含前述药剂中的任一种和前述核酸中的任一种。在一些情况下，宿主细胞是人工抗原呈递细胞(aAPC)。
在第四方面，本发明提供了一种制备结合对δ3γδTCR具有特异性的表位的药剂(例如，抗体或其片段)的方法，所述方法包括在足以产生抗体或其片段的条件下培养前述宿主细胞中的任一种。
在第五方面，本发明提供了一种用于产生富集的γδT细胞群的离体方法，所述方法包括使包含γδT细胞的第一细胞群与一种或多种前述药剂(例如，抗体或其片段)接触。在一些实施方案中，第一细胞群是分离的混合细胞群，其包括αβT细胞和γδT细胞(例如，δ3γδT细胞)。在一些实施方案中，第一细胞群选自外周血样品、白细胞去除术样品、脐带血样品、肿瘤样品或组织样品。在一些情况下，第一细胞群是从单个供体分离的样品。在一些情况下，第一细胞群是从多个供体分离的样品。在一些情况下，第一细胞群是PBMC样品。在一些情况下，第一细胞群是从单个供体分离的PBMC的样品。在一些情况下，第一细胞群是从多个供体分离的PBMC的样品。
在一些实施方案中，所述方法包括使分离的混合细胞群与一种或多种前述药剂(例如，抗体或其片段)直接接触。在一些实施方案中，第一细胞群是包含一种或多种工程改造的γδT细胞的群体。在一些实施方案中，第一细胞群是扩增的γδT细胞的第一群体。在一些实施方案中，所述方法包括第一γδT细胞扩增和第二γδT细胞扩增。在一些实施方案中，所述方法包括产生包含至少108个δ3γδT细胞的富集的γδT细胞群。在一些实施方案中，包含至少108个δ3γδT细胞的富集的γδT细胞群在12至21天内产生。在一些实施方案中，所述方法包括使第一细胞群中的γδT细胞扩增至少1,000倍。在一些实施方案中，至少1,000倍扩增在12至21天内实现。
在第六方面，本发明提供了一种用于产生富集的γδT细胞群的离体方法，所述方法包括：a)使包含γδT细胞的第一细胞群与活化和扩增γδT细胞的一种或多种第一活化剂接触，从而产生扩增的第-γδT细胞群；以及b)使扩增的第一γδT细胞群与活化和扩增γδT细胞的一种或多种第二活化剂接触，从而产生富集的γδT细胞群，其中一种或多种第一活化剂中的至少一种或一种或多种第二活化剂中的至少一种是如第一方面所述的药剂(例如，抗体或其片段)。在一些实施方案中，所述方法包括在a)之后且在b)之前分离扩增的第一γδT细胞群。在一些实施方案中，a)包括在抗原呈递细胞(APC)和一种或多种第一活化剂的存在下培养第一细胞群。在一些实施方案中，b)包括在抗原呈递细胞(APC)和一种或多种第二活化剂的存在下培养活化的γδT细胞群。
在一些实施方案中，第一细胞群是包含αβT细胞和γδT细胞的分离的混合细胞群。在一些实施方案中，第一细胞群选自外周血样品、白细胞去除术样品、脐带血样品、肿瘤样品或组织样品。在一些实施方案中，第一细胞群是工程改造的γδT细胞的群体。在一些实施方案中，所述方法包括基因修饰扩增的第一γδT细胞群或基因修饰富集的γδT细胞群。在一些实施方案中，所述方法包括产生包含至少108个δ3γδT细胞的富集的γδT细胞群。在一些实施方案中，包含至少108个δ3γδT细胞的富集的γδT细胞群在12至21天内产生。
在一些实施方案中，所述方法包括使第一细胞群中的γδT细胞扩增至少1,000倍。在一些实施方案中，至少1,000倍扩增在12至21天内实现。
在一些实施方案中，一种或多种第一活化剂中的至少一种与一种或多种第二活化剂中的至少一种在结构上相同。在一些实施方案中，一种或多种第一活化剂中的至少一种与一种或多种第二活化剂中的至少一种在结构上不同。在一些实施方案中，一种或多种第一活化剂中的至少一种或一种或多种第二活化剂中的至少一种是固定化的。在一些实施方案中，固定化的活化剂固定在培养容器的表面上。在一些实施方案中，固定化的活化剂固定在抗原呈递细胞(APC)的表面上。在一些实施方案中，固定化的活化剂是结合对δ3γδTCR具有特异性的表位的药剂(例如，抗体或其片段)。
在第七方面，本发明提供了一种扩增的γδT细胞群(例如，在对δ3γδT细胞进行正向或负向选择之前)，其中大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％或80％的扩增的γδT细胞是δ3γδT细胞。在一些实施方案中，10％至80％的扩增的γδT细胞是δ3γδT细胞(例如，在对δ3γδT细胞进行正向或负向选择之前)。在一些实施方案中，10％至60％的扩增的γδT细胞是δ3γδT细胞(例如，在对δ3γδT细胞进行正向或负向选择之前)。在一些实施方案中，10％至40％的扩增的γδT细胞是δ3γδT细胞(例如，在对δ3γδT细胞进行正向或负向选择之前)。在一些实施方案中，20％至80％的扩增的γδT细胞是δ3γδT细胞(例如，在对δ3γδT细胞进行正向或负向选择之前)。在一些实施方案中，20％至60％的扩增的γδT细胞是δ3γδT细胞(例如，在对δ3γδT细胞进行正向或负向选择之前)。在一些实施方案中，20％至50％的扩增的γδT细胞是δ3γδT细胞(例如，在对δ3γδT细胞进行正向或负向选择之前)。在一些实施方案中，20％至40％的扩增的γδT细胞是δ3γδT细胞(例如，在对δ3γδT细胞进行正向或负向选择之前)。
在一些实施方案中，扩增的γδT细胞群包含多克隆TCR多样性。在一些实施方案中，扩增的γδT细胞群中大于30％、40％、50％、60％或70％的δ3γδT细胞表达表型CD45RA+/CD27+和/或CD45RA-/CD27+。在一些实施方案中，扩增的γδT细胞群中20％至70％的δ3γδT细胞表达表型CD45RA+/CD27+和/或CD45RA-/CD27+。在一些实施方案中，扩增的γδT细胞群中大于30％、40％、50％、60％或70％的δ1-/δ2-γδT细胞表达表型CD45RA+/CD27+和/或CD45R A-/CD27+。在一些实施方案中，扩增的γδT细胞群中20％至70％的δ1-/δ2-γδT细胞表达表型CD45RA+/CD27+和/或CD45RA-/CD27+。
在一些实施方案中，扩增的γδT细胞群来源于诸如皮肤的组织。在一些实施方案中，扩增的γδT细胞群来源于肿瘤浸润性淋巴细胞。在一些实施方案中，扩增的γδT细胞群包含表达内源性或异源性肿瘤识别部分的γδT细胞。在一些实施方案中，所述群包含治疗有效量的(例如，＞108个)γδT细胞。在一些实施方案中，γδT细胞群包含不依赖NKp30活性、NKp44活性和/或NKp46活性的抗肿瘤细胞毒性。在一些实施方案中，γδT细胞群不包含NKp30活性依赖性抗肿瘤细胞毒性、NKp44活性依赖性抗肿瘤细胞毒性，和/或NKp46活性依赖性抗肿瘤细胞毒性。在一些实施方案中，少于40％的γδT细胞表达(例如，以蛋白质或mRNA的形式)可检测水平的NKp30、NKp44和/或NKp46。
在第八方面，本发明提供了一种扩增的γδT细胞群，其通过前述方法中的任一种产生。在第九方面，本发明提供了一种治疗有需要的受试者的癌症、炎性疾病或自身免疫疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的δ3γδT细胞，向受试者施用治疗有效量的富集δ3γδT细胞的γδT细胞群，或向受试者施用治疗有效量的通过本文所述的方法获得的γδT细胞群。
在第十方面，本发明提供了一种治疗有需要的受试者的癌症、炎性疾病或自身免疫疾病的方法，所述方法包括：a)提供治疗有效量的从任何一个或多个前述扩增的γδT细胞群中分离的δ3γδT细胞；以及向受试者施用治疗有效量的δ3γδT细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括将扩增的γδT细胞群与不同的扩增的γδT细胞群掺和以形成掺和群，并将掺和群施用给受试者。
在一些实施方案中，不同的扩增的γδT细胞群包含一定量的扩增的δ1γδT细胞，和/或一定量的扩增的δ2γδT细胞。在一些实施方案中，不同的扩增的γδT细胞群包含＞5％的δ1(例如，＞10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的δ1)或＞5％的δ2(例如，＞10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的δ2)γδT细胞。在一些实施方案中，不同的扩增的γδT细胞群包含约或至少约60％至约90％的δ1γδT细胞，或约或至少约60％至约80％的δ1γδT细胞。在一些实施方案中，不同的扩增的γδT细胞群包含约或至少约60％至约90％的δ2γδT细胞，约或至少约70％至约80％的δ2γδT细胞，或约或至少约80％至约90％的δ2γδT细胞。
在一些实施方案中，掺和的γδT细胞群包含一定量的δ1γδT细胞，和/或一定量的δ2γδT细胞，以及一定量的δ3γδT细胞。在一些实施方案中，掺和的γδT细胞群包含＞5％的δ1(例如，＞10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的δ1)或＞5％的δ2(例如，＞10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的δ2)γδT细胞。在一些实施方案中，掺和的γδT细胞群包含＞5％的δ3(例如，＞10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的δ3)γδT细胞。在一些实施方案中，掺和的γδT细胞群包含约或至少约5％至约90％的δ3γδT细胞、约或至少约10％至约90％的δ3γδT细胞、约或至少约20％至约90％的δ3γδT细胞、约或至少约30％至约90％的δ3γδT细胞、约或至少约40％至约90％的δ3γδT细胞、约或至少约50％至约90％的δ3γδT细胞、约或至少约60％至约90％的δ3γδT细胞、约或至少约70％至约90％的δ3γδT细胞，或约或至少约80％至约90％的δ3γδT细胞。
在一些实施方案中，掺和的γδT细胞群包含约或至少约5％至约90％的δ1γδT细胞、约或至少约10％至约90％的δ1γδT细胞、约或至少约20％至约90％的δ1γδT细胞、约或至少约30％至约90％的δ1γδT细胞、约或至少约40％至约90％的δ1γδT细胞、约或至少约50％至约90％的δ1γδT细胞、约或至少约60％至约90％的δ1γδT细胞、约或至少约70％至约90％的δ1γδT细胞，或约或至少约80％至约90％的δ1γδT细胞。在一些实施方案中，掺和的γδT细胞群包含约或至少约5％至约90％的δ2γδT细胞、约或至少约10％至约90％的δ2γδT细胞、约或至少约20％至约90％的δ2γδT细胞、约或至少约30％至约90％的δ2γδT细胞、约或至少约40％至约90％的δ2γδT细胞、约或至少约50％至约90％的δ2γδT细胞、约或至少约60％至约90％的δ2γδT细胞、约或至少约70％至约90％的δ2γδT细胞，或约或至少约80％至约90％的δ2γδT细胞。
以引用方式并入
在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均以引用方式并入本文，其程度就如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体和单独地指出以引用方式并入一般。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考对其中利用了本发明原理的例示性实施方案作出阐述的以下详细描述以及附图(在本文中还有“图(figure和Fig.)”)将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在附图中：
图1示出δ3特异性抗γδTCR抗体的可变区序列。顶部重链可变区的序列。底部轻链可变区的序列。
图2示意性地例示了用于治疗受试者的方法。
图3示意性地例示了用于将工程改造的γδT细胞群施用给受试者的方法。
图4A-B例示了使用21天扩增培养方案进行的Vδ3γδT细胞的选择性扩增。倍数扩增在第21天测量。A)从供体1分离PBMC，并使用所指示的抗体直接活化和扩增。B)从供体2分离PBMC，并使用所指示的抗体直接活化和扩增。
图5A-B例示了图4A-B所示的扩增细胞群中Vδ1-/Vδ2-γδT细胞的比例。
图6A-B例示了图4A-B所示的扩增细胞群中的γδT细胞的表型。扩增培养21天后，用所指示的抗体活化和扩增的Vδ3T细胞的表型主要是(＞50％)CD27+CD45RA+(初始)和CD27+CD45RA-(中央记忆)。
图7例示了针对所指示的δ3γδTCR特异性抗体与γ2δ3 TCR-hFc重组蛋白的结合的竞争测定的结果。
图8A-C例示了Vδ3γδT细胞的选择性扩增。A.未转导的和抗CD20 CAR Vδ3γδT细胞扩增了大约10,000倍。使用分别对δ1、δ2和δ3亚型具有特异性的抗体，作为δ1-、δ2-和δ3+检测Vδ3γδT细胞。B.在αβT细胞耗尽之前，Vδ3γδT细胞代表了扩增的细胞培养物的主要部分。C.抗CD20 CAR构建体在扩增且转导的Vδ3γδT细胞的表面表达。
图9例示了从活化的扩增的Vδ3γδT细胞的培养物中成功耗尽αβT细胞(左侧细胞用抗CD20 CAR构建体转导；右侧细胞未转导)。
图10例示了对活化的、扩增的且耗尽αβT细胞的γδT细胞群进行染色以检测V61和Vδ2(左图)或Vδ3(右图)的表面表达的结果。
图11例示了活化且扩增的Vδ3γδT细胞对CD20+Raji细胞的细胞毒性。未转导的Vδ3γδT细胞在效应子：靶标(E/T)比＞1时对CD20+Raji细胞表现出轻微的细胞毒性，并且在E/T比＞5时表现出中等细胞毒性活性。抗CD20 CAR转导的Vδ3γδT细胞在0.5的E/T比下表现出中等细胞毒性活性，并且在E/T比＞0.75时表现出强烈的细胞毒性活性。
图12例示了根据IMGT命名法编号的Vδ3的氨基酸序列。
图13例示了如实施例7所述，经由诱变，通过精细表位作图鉴定的抗原结合热点的3D模型的3个不同投影。
图14A-C例示了IMGT Collier de Perles，其中通过精细表位作图示出为有助于抗原结合的残基通过黑色双圆圈突出显示。A.K79和H88有助于δ3-23、δ3-42和δ3-58的抗原结合。B.E67和D70有助于δ3-31的抗原结合；R75和R95也有助于δ3-31的抗原结合；E67、D70、R75、R95和E97的组合有助于δ3-31和δ3-42的抗原结合。C.E18有助于δ3-58的抗原结合；并且K3有助于δ3-08的抗原结合。
具体实施方式
虽然本文已经示出并描述了本发明的各种实施方案，但是本领域技术人员将显而易知此类实施方案仅以举例的方式提供。许多改变、变化和取代可由本领域技术人员想到而不背离本发明。应理解，可使用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。
定义
除非另外定义，否则本文中使用的所有科技术语具有与本文所述发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在任何适当的时候，以单数形式使用的术语也将包括复数形式且反之亦然。在所阐述的任何定义与通过引用并入本文的任何文档相矛盾时，应以下文阐述的定义为准。
如本文所用，术语“γδT细胞(gamma delta T cell)”是指在其表面上表达由一条γ链和一条δ链构成的独特T细胞受体(TCR)，即γδTCR的T细胞亚群。术语“γδT细胞”具体地包括γδT细胞的所有亚群及其组合，包括但不限于Vδ3γδT细胞，以及初始、效应记忆、中央记忆和终末分化的γδT细胞。作为另一个实例，术语“γδT细胞”包括Vδ1、Vδ2、Vδ3、Vδ4、Vδ5、Vδ7和Vδ8γδT细胞，以及Vγ2、Vγ3、Vγ5、Vγ8、Vγ9、Vγ10和Vγ11γδT细胞。作为另一个实例，术语“γδT细胞”包括Vδ3γ2 T细胞，并且任选地可以包括或指代Vδ3γ8 T细胞。
如本文所用，术语“T淋巴细胞”或“T细胞”是指表达CD3(CD3+)和T细胞受体(TCR+)的免疫细胞。T细胞在细胞介导的免疫中起核心作用。
如本文所用，术语“TCR”或“T细胞受体”是指形成α-β或γ-δ受体的二聚异源性细胞表面信号传导蛋白。αβTCR识别由MHC分子呈递的抗原，而γδTCR识别与MHC呈递无关的抗原。
术语“MHC”(主要组织相容性复合物)是指编码细胞表面抗原呈递蛋白的基因的子集。在人中，这些基因称为人白细胞抗原(HLA)基因。在本文中，缩写MHC或HLA可互换使用。
如本文所用，术语“外周血淋巴细胞”或“PBL”以最广义使用并且是指包括分化和功能阶段范围的T细胞和B细胞的白细胞、浆细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞(basocyte)、嗜酸性粒细胞等。外周血中T淋巴细胞的范围为约20-80％。
如本文所用，术语“细胞群”是指通过直接从合适的来源，通常从哺乳动物中分离获得的多个细胞。分离的细胞群可随后在体外培养。本领域的普通技术人员将会知道，用于分离和培养细胞群的各种方法适于与本发明一起使用，并且细胞群中的各种数量的细胞适于在本发明使用。可通过各种培养技术和/或针对特定细胞类型的正向或负向选择，将细胞群纯化至同质、基本同质或耗尽一种或多种细胞类型(例如，αβT细胞)。细胞群可以是，例如，来源于(例如，直接分离自)外周血样品、脐带血样品、肿瘤、干细胞前体、肿瘤活检物、组织、淋巴、皮肤、肿瘤浸润性淋巴细胞的样品或含有肿瘤浸润性淋巴细胞的样品，或来自直接接触外部环境的受试者的上皮部位，或来源于前体干细胞的混合异质细胞群。可替代地，混合细胞群可来源于由外周血样品、脐带血样品、肿瘤、干细胞前体、肿瘤活检物、组织、淋巴、皮肤、肿瘤浸润性淋巴细胞的样品或含有肿瘤浸润性淋巴细胞的样品建立的哺乳动物细胞的体外培养物，或来自直接接触外部环境的受试者的上皮部位，或来源于前体干细胞。
“富集的”细胞群或制剂是指来源于起始混合细胞群的细胞群，其所含有的特定细胞类型的百分比大于起始群体中所述细胞类型的百分比。例如，起始混合细胞群可以是针对特定γδT细胞群富集的。在一个实施方案中，富集的γδT细胞群所含有的δ3细胞的百分比大于起始群体中所述细胞类型的百分比。作为另一个实例，富集的γδT细胞群可以含有的δ1细胞和δ3细胞的百分比均大于起始群体中所述细胞类型的百分比。作为另一个实例，富集的γδT细胞群可以含有的δ3细胞和δ4细胞的百分比均大于起始群体中所述细胞类型的百分比。作为另一个实例，富集的γδT细胞群可以含有的δ1 T细胞、δ3 T细胞、δ4 T细胞和δ5 T细胞的百分比均大于起始群体中所述细胞类型的百分比。在另一个实施方案中，富集的γδT细胞群所含有的δ2 T细胞和δ3 T细胞的百分比均大于起始群体中所述细胞类型的百分比。在另一个实施方案中，富集的γδT细胞群所含有的δ1 T细胞、δ2 T细胞和δ3 T细胞的百分比均大于起始群体中所述细胞类型的百分比。在所有实施方案中，富集的γδT细胞群所含有的αβT细胞的百分比低于起始群体中αβT细胞的百分比。
如本文所用，所谓“扩增的”是指富集制剂中期望或靶细胞类型(例如，δ3 T细胞)的数量高于初始或起始细胞群中的数量。所谓“选择性扩增”是指靶细胞类型(例如，δ3 T细胞)相比一种或多种其他非靶细胞类型(例如，αβT细胞、NK细胞和/或一种或多种不被选择性扩增中使用的选择性活化剂扩增的γδT细胞子群)被优先扩增。在某些实施方案中，本发明的活化剂选择性地扩增，例如，工程改造的或非工程改造的δ3 T细胞，而不扩增或不显著扩增αβT细胞。在某些实施方案中，本发明的活化剂选择性地扩增，例如，工程改造的或非工程改造的δ3 T细胞，而不扩增或不显著扩增δ1 T细胞。在其他实施方案中，本发明的活化剂选择性地扩增，例如，工程改造的或非工程改造的δ3 T细胞，而不扩增或不显著扩增δ2 T细胞。在某些实施方案中，本发明的活化剂选择性地扩增，例如，工程改造的或非工程改造的δ3 T细胞，而不扩增或不显著扩增δ1 T细胞和δ2 T细胞。在某些实施方案中，本发明的活化剂选择性地扩增，例如，工程改造的或非工程改造的δ1和δ3 T细胞，而不扩增或不显著扩增δ2 T细胞。在此上下文中，术语“不显著扩增”是指优先扩增的细胞群比参考细胞群多扩增了至少10倍，优选100倍，更优选1,000倍。
如本文所用，术语“掺和物”是指衍生自混合的异质细胞群的两个或更多个分离的富集细胞群的组合。根据某些实施方案，本发明的细胞群是分离的γδT细胞群。
应用于细胞群的术语“分离的”是指分离自人或动物身体的细胞群，其基本上不含在体内或体外与所述细胞群相关的一个或多个细胞群。
如此处所用，在细胞群的上下文中，术语“接触”是指将分离的细胞群与试剂(诸如可以与珠粒或细胞相连的抗体、细胞因子、配体、丝裂原或共刺激分子)一起孵育。抗体或细胞因子可以是可溶性形式，或可以是固定化的。在一个实施方案中，固定化的抗体或细胞因子与珠粒或板紧密结合或共价连接。在一个实施方案中，抗体固定在Fc包被的孔上。在一个实施方案中，抗体固定在诸如抗原呈递细胞(APC)或人工抗原呈递细胞(aAPC)的细胞的表面上。在期望的实施方案中，接触离体(例如，在体外)或在体内发生。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，含有特异性结合抗原(与其发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。所谓“特异性结合”或“与...发生免疫反应”或“针对”是指抗体与期望抗原的一个或多个抗原决定簇反应并且不与其他多肽反应或以低得多的亲和力(KD＞10-6摩尔)结合。抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、sdAb(重或轻单结构域抗体)、单链、Fab、Fab’和F(ab’)2片段、scFv、双抗体、迷你抗体、纳米抗体和Fab表达文库。
已知基本的抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每一对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分限定主要负责效应功能的恒定区。通常，从人获得的抗体分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD类中的任一种，它们分子中存在的重链的性质彼此不同。某些类别还具有亚类，诸如IgG1、IgG2等。此外，在人中，轻链可以是κ链或λ链。
术语“Fab”是指由整条L链(VL和CL)连同H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成的抗体片段。完整抗体的木瓜蛋白酶消化可用于产生两个Fab片段，其中的每一个含有单个抗原结合位点。通常，通过木瓜蛋白酶消化产生的Fab的L链和H链片段通过链间二硫键连接。
术语“Fc”是指包含通过二硫键保持在一起的两条H链(CH2和CH3)的羧基末端部分和铰链区的一部分的抗体片段。抗体的效应功能由Fc区中的序列决定，此区域也是通过存在于某些类型的细胞上的Fc受体(FcR)识别的部分。可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化获得一个Fc片段。
术语“F(ab’)2”是指通过完整抗体的胃蛋白酶消化产生的抗体片段。F(ab’)2片段含有通过二硫键保持在一起的两个Fab片段和铰链区的一部分。F(ab’)2片段具有二价抗原结合活性，并能够交联抗原。
术语Fab’是指为F(ab’)2片段的还原产物的抗体片段。Fab′片段因在CH1结构域的羧基末端处具有少量另外的残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而不同于Fab片段。Fab’-SH是其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab’本文中的名称。
术语“Fv”是指由处于紧密、非共价缔合的一个重链可变区和一个轻链可变区结构域的二聚体组成的抗体片段。从这两个结构域的折叠产生六个高变环(从H链和L链各自产生3个环)，所述高变环促成用于抗原结合的氨基酸残基并且向抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力通常低于完整结合位点。
术语“单链Fv”(还缩写为“sFv”或“scFv”)是指包含连接到单个多肽链中的VH和VL抗体结构域的抗体片段。通常，scFv多肽还包含VH与VL结构域之间的多肽接头，所述接头能够使scFv形成用于抗原结合的期望结构。关于scFv的综述，参见，例如，Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315(1994)页；和Malmborg等人，J.Immunol.Methods 183：7-13，1995。
表述“线性抗体”用于指包含形成一对抗原结合区的一对串联VH-CH1区段(VH-CH1-VH-CH1)的多肽。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的，并且由例如Zapata等人，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)描述。
术语“可变”是指这样的事实：可变结构域的某些部分的序列在抗体间广泛不同，并且用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性在抗体的整个可变结构域中并非均匀分布。它集中在轻链和重链可变结构域中的三个称为高变区的区段中。可变结构域的更加高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR，主要采用由形成环连接的三个高变区连接的β-折叠构型，并且在一些情况下，形成β-折叠结构的一部分。各链的高变区由FR紧密靠近地保持在一起，并且与来自其他链的高变区一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.)。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子参与抗原结合的部分。抗原结合位点是由重链(“H”)和轻链(“L”)的N末端可变区(“V”)的氨基酸残基形成的。重链和轻链的V区内的三个高度差异链段(highly divergent stretches)(称为“高变区”)插置在被称为“框架区”或“FR”的更为保守的侧翼链段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间且与其邻近的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此设置以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合的抗原的三维表面互补，并且重链和轻链中的每一个的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。每个结构域的氨基酸分配是根据Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))，或Chothia&Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987)，Chothia等人Nature 342：878-883(1989)进行的。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域的序列高变和/或形成结构限定的环的区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3显示出六个HVR的最多的多样性，并且据信H3在将良好的特异性赋予抗体方面尤其发挥独特的作用。参见，例如，Xu等人，Immunity 13：37-45(2000)；Johnson和Wu，在Methods in Molecular Biology 248：1-25(Lo编，Human Press，Totowa，N.J.，2003)中。实际上，由重链组成的天然存在的骆驼抗体仅在不存在轻链的情况下是功能性且稳定的。参见，例如，Hamers-Casterman等人，Nature 363：446-448(1993)；Sheriff等人，Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。
“框架区”(FR)是除CDR残基以外的那些可变结构域残基。每个可变结构域通常具有四个FR，标识为FR1、FR2、FR3和FR4。如果CDR是根据Kabat定义的，那么轻链FR残基位于约残基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)和98-107(LCFR4)处，并且重链FR残基在重链残基中位于约残基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)和103-113(HCFR4)处。如果CDR包含来自高变环的氨基酸残基，那么轻链FR残基在轻链中位于约残基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)和97-107(LCFR4)处，并且重链FR残基在重链残基中位于约残基1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)和102-113(HCFR4)处。在一些情况下，当CDR包含来自通过Kabat定义的CDR和高变环的那些的氨基酸时，FR残基将相应地调节。例如，当CDRH1包括氨基酸H26-H35时，重链FR1残基处于1-25位，并且FR2残基处于36-49位。
“人共有框架”是在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中代表最常见氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的子组。通常，序列的子组是如Kabat中的子组。在某些情况下，对于VL，子组是如Kabat中的子组κI。在某些情况下，对于VH，子组是如Kabat中的子组III。
本文所述的抗体可以是人源化的。“人源化”形式的非人(例如，啮齿动物)抗体是含有来源于非人抗体的最小序列的嵌合抗体。在很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基被来自具有期望抗体特异性、亲和力和能力的诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的非人物种(供体抗体)的高变区的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被对应的非人残基替代。另外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步完善抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些并且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的)的至少一部分。更多细节参见Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。另外参见以下综述论文和其中引用的参考文献：Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy，Asthma and Immunol.，1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions，23：1035-1038(1995)；Hurle和Gross，Curr.Op.Biotech.，5：428-433(1994)。
“人抗体”是所具有的氨基酸序列与由人产生和/或使用如本文所公开的用于制备人抗体的技术中的任一种制备的抗体的氨基酸序列相对应的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可以使用本领域已知的各种技术产生，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581(1991)。也可用于制备人单克隆抗体的是在Cole等人，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等人，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)中描述的方法。另外参见van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5：368-74(2001)。人抗体可以通过将抗原施用给已经过修饰以响应于抗原激发而产生此类抗体但是其内源性基因座被禁用的转基因动物来制备，所述转基因动物例如免疫的异种小鼠(参见，例如，关于XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于通过人B细胞淋巴瘤技术产生的人抗体，另外参见，例如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)。
如本文所用，“Kd”或“Kd值”是指通过例如使用BIAcore.TM.-2000或BIAcore.TM.-3000(BIAcore公司，Piscataway，N.J.)，在25℃下，使用用抗原或抗体固定化的CM5芯片，在约10反应单位(RU)下，使用表面等离子体共振测定测量的解离常数。对于二价或其他多价抗体，通常将抗体固定化以避免亲合力引起的对解离常数测量的干扰。对于更多细节，参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。
当本文提及结合亲和力时使用的“或更好”是指在分子与其结合配偶体之间更强的结合。当本文使用时，“或更好”是指由更小的数值KD值表示的更强结合。例如，对抗原具有“0.6nM或更好”的亲和力的抗体，所述抗体对所述抗原的亲和力是≤0.6nM，即0.59nM、0.58nM、0.57nM等等，或小于或等于0.6nM的任何值。
术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何蛋白决定簇、脂质或碳水化合物决定簇。表位决定簇通常由分子(诸如氨基酸、脂质或糖侧链)的活性表面基团组成并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。当平衡解离常数(KD)在10-6-10-12M或更好的范围内时，抗体被称为特异性结合抗原。特异性结合可以指与结合其他非靶表位的解离常数相比，以更紧密至少10倍、优选100倍，或更优选1,000倍的解离常数(更低的KD)结合靶表位。在一些情况下，靶表位是δ3 TCR的δ3链的表位。在一些情况下，非靶表位是αβTCR。在一些情况下，非靶表位是δ-TCR的不是δ3的δ链。例如，在一些情况下，非靶表位可以是δ-TCR的δ1、δ2、δ4、δ5或δ8链。结合的特异性可以在与γδ-TCR和/或αβ-TCR(例如，如固定在ELISA板上或在细胞上表达的Fc融合体)的细胞外区域结合的背景下确定。
“活化表位”能够在结合时活化特定的γδT细胞群。T细胞增殖表明T细胞活化和扩增。
当两种抗体识别相同或空间上重叠的表位时，抗体与参考抗体结合“基本上相同的表位”。用于确定两个表位是否结合相同或空间上重叠的表位的最广泛使用且快速的方法是竞争测定，其可以使用标记的抗原或标记的抗体以许多不同的形式配置。在一些实施方案中，抗原固定在96孔板上，并且使用放射性或酶标记测量未标记抗体阻断标记抗体的结合的能力。可替代地，使用流式细胞术对表达抗原的细胞进行竞争研究，所述竞争研究使用标记和未标记的抗体进行。
“表位作图”是鉴定抗体在其靶抗原上的结合位点或表位的过程。抗体表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中的氨基酸的连续序列形成。构象表位由蛋白质序列中不连续但在蛋白质折叠成其三维结构时被放在一起的氨基酸形成。
如本文所定义，“表位分仓”是基于抗体识别的表位将所述抗体分组的过程。更具体地，表位分仓包括用于区分不同抗体的表位识别特性的方法和系统，其与基于抗体的表位识别特性将所述抗体聚类并识别具有不同结合特异性的抗体的计算过程相组合。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体(CAR)”可指例如人工T细胞受体、T小体(T-bodies)、单链免疫受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体，并且涵盖将人工特异性移植到特定免疫效应细胞上的工程改造的受体。可使用CAR赋予T细胞单克隆抗体特异性，从而允许产生大量特异性T细胞，例如用于过继性细胞疗法。在具体的实施方案中，例如，CAR指导细胞对肿瘤相关抗原的特异性。在一些实施方案中，CAR包含细胞内活化结构域(允许T细胞在靶向部分与靶细胞(诸如靶肿瘤细胞)接合时活化)、跨膜结构域以及长度可变并且包含与疾病或病症相关的例如肿瘤-抗原结合区的细胞外结构域。在特定方面，CAR包含衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)融合至CD3-ζ跨膜结构域和胞内结构域的融合体。其他CAR设计的特异性可源自受体(例如，肽)的配体或源自模式识别受体，诸如Dectin。在某些情况下，可以改变抗原识别结构域的间距以减少活化引起的细胞死亡。在某些情况下，CAR包含用于另外的共刺激信号传导的结构域，诸如CD3-ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP 10/12和/或OX40、ICOS、TLR等。在一些情况下，分子可以与CAR共表达，包括共刺激分子、用于成像(例如，用于正电子发射断层扫描)的报告基因、在添加前药时有条件地消融T细胞的基因产物、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体。
根据本发明的“药剂”或“化合物”包括小分子、多肽、蛋白质、抗体或抗体片段。在本发明的上下文中，小分子在一个实施方案中是指分子量小于1000道尔顿，特别是小于800道尔顿，更特别是小于500道尔顿的化学品。术语“治疗剂”是指具有生物活性的药剂。术语“抗癌剂”是指对癌细胞具有生物活性的药剂。
如本文所用，术语“细胞培养物”是指细胞的任何体外培养物。包括在此术语内的是连续细胞系(例如，具有永生表型)、原代细胞培养物、有限细胞系(例如，非转化细胞)，以及在体外维持的任何其他细胞群，包括干细胞、血细胞、胚胎脐带血细胞、肿瘤细胞、转导细胞等。
术语“治疗(treat或treatment)”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施，其中目标是为了防止或减缓(减轻)不期望的生理学变化或病症。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的减小(例如，肿瘤大小、肿瘤负荷或肿瘤分布的减小)、疾病状态的稳定(即，不恶化)、疾病进展的延缓或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分缓解还是全部缓解)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可意指使存活与未接受治疗时预期的存活相比有所延长。需要治疗的对象包括已经患有病状或病症的对象，以及易患病状或病症的对象或要预防病状或病症的对象。
“与一种或多种另外的治疗剂组合”施用包括同时(并行)施用和以任何顺序连续施用。
如本文所用，术语“相同的”是指相同的两个或更多个序列或子序列。此外，如本文所用，术语“基本上相同”是指两个或更多个序列当在比较窗口或指定区域上进行最大对应性比较和比对时，具有一定百分比的相同序列单元(sequential unit)，如使用比较算法或通过手动比对和视觉检查所测量的。仅以举例的方式，如果序列单元在指定区域上约60％相同、约65％相同、约70％相同、约75％相同、约80％相同、约85％相同、约90％相同或约95％相同，那么两个或更多个序列可以是“基本上相同的”。此类百分比用于描述两个或更多个序列的“百分比同一性”。序列的同一性可以存在于长至少约75-100个序列单元的区域上，长约50个序列单元的区域上，或在未指定时，存在于整个序列上。此定义也指测试序列的互补序列。此外，仅以举例的方式，当核酸残基相同时，两个或更多个核苷酸序列是相同的，而如果核酸残基在指定区域上约60％相同、约65％相同、约70％相同、约75％相同、约80％相同、约85％相同、约90％相同或约95％相同，那么两个或更多个核苷酸序列是“基本上相同的”。同一性可以存在于长至少约75至约100个核酸的区域上，长约50个核酸的区域上，或在未指定时，存在于多核苷酸序列的整个序列上。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指材料(包括但不限于盐、载体或稀释剂)不消除化合物的生物活性或特性，并且是相对无毒的，即材料可施用给个体而不引起非期望的生物效应或不以有害方式与组合物中含有的任何组分相互作用。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人、非人灵长类动物、农场动物(诸如牛)、运动型动物和宠物(诸如猫、狗和马)。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指向已经患有疾病、病状或病症的受试者(例如，人患者)施用的含有本发明的扩增细胞群和/或掺和物的组合物的量，所述量足以治愈或至少部分地阻止，或在一定程度上减轻所治疗疾病、病症或病状的一种或多种症状。此类组合物的有效性取决于多个条件，包括但不限于疾病、病症或病状的严重程度和病程、先前的疗法、患者的健康状态和对药物的反应，以及治疗医师的判断。仅以举例的方式，治疗有效量可通过常规实验确定，包括但不限于剂量递增临床试验。
术语抗原呈递细胞(APC)是指野生型APC或者工程改造的或人工抗原呈递细胞(aAPC)。APC可以经过辐照的APC群提供。APC可以由永生化细胞系(例如，K562或衍生自永生化细胞系的工程改造的aAPC)提供，或作为来自供体的细胞(例如，PBMC)的一部分提供。
如本文所用，关于蛋白质或其多肽片段(诸如抗体或表位)的术语“结构上不同的”和“结构上各异的”是指至少两种不同的蛋白质、其多肽片段或表位之间的共价(即，结构)差异。例如，两种结构上不同的蛋白质(例如，抗体)可以指具有不同的一级氨基酸序列的两种蛋白质。在一些情况下，结构上不同的活化剂结合结构上不同的表位，诸如具有不同的一级氨基酸序列的表位。
如本文所用，术语“不依赖”指定受体活性(例如，NKp30活性、NKp44活性和/或NKp46活性)的“抗肿瘤细胞毒性”是指无论指定受体或指定受体组合是否由所述细胞表达或是否具有介导细胞溶解的功能而均表现出的抗肿瘤细胞毒性。因此，γδ表现出不依赖NKp30活性、NKp44活性和/或NKp46活性的抗肿瘤细胞毒性的T细胞也可以表现出NKp30活性依赖性抗肿瘤细胞毒性、NKp44活性依赖性抗肿瘤细胞毒性，和/或NKp46活性依赖性抗肿瘤细胞毒性。
如本文所用，术语“NKp30活性依赖性抗肿瘤细胞毒性”、“NKp44活性依赖性抗肿瘤细胞毒性”和“NKp46活性依赖性抗肿瘤细胞毒性”是指需要指定受体的功能性表达的抗肿瘤细胞毒性。这种受体依赖性抗肿瘤细胞毒性的存在与否可以通过在存在或不存在指定受体的拮抗剂的情况下进行标准的体外细胞毒性测定来确定。例如，可以通过将存在抗NKp30拮抗剂的情况下体外细胞毒性测定的结果与不存在抗NKp30拮抗剂的情况下获得的结果相比较来确定NKp30活性依赖性抗肿瘤细胞毒性的存在或不存在。
如本文所用，γδ包含抗肿瘤细胞毒性的T细胞群(其中至少指定“％”的抗肿瘤细胞毒性“不依赖”指定的受体活性(例如，NKp30活性、NKp44活性和/或NKp46活性))是指在其中阻断指定受体使所测得的抗肿瘤细胞毒性降低不超过该数值％值的细胞。因此，γδ包含抗肿瘤细胞毒性的T细胞群(其中至少50％的抗肿瘤细胞毒性不依赖NKp30活性)在存在NKp30拮抗剂的情况下，与不存在NKp30拮抗剂的情况相比，将表现出50％或更少的体外抗肿瘤细胞毒性降低。
概述
在人中，γδT细胞是提供先天性免疫反应与适应性免疫反应之间联系的T细胞亚群。这些细胞发生V-(D)-J区段重排以产生抗原特异性γδT细胞受体(γδTCR)，并且γδT细胞可以通过由γδTCR或其他单独或共同发挥作用的非TCR蛋白进行的抗原识别直接活化，以激活γδT细胞效应功能。γδT细胞仅占哺乳动物总T细胞群的一小部分，大约为外周血和淋巴器官中T细胞的1-5％，并且它们似乎主要存在于富含上皮细胞的区室，如皮肤、肝脏、消化道、呼吸道和生殖道中。不同于识别结合主要组织相容性复合物分子(MHC)的抗原的αβTCR，γδTCR可以直接识别完整蛋白或非肽化合物形式的细菌抗原、病毒抗原、患病细胞表达的应激抗原，以及肿瘤抗原。
δ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58可以活化和扩增γδT细胞，并且在一些实施方案中可以用于优先活化和扩增δ3γδT细胞，例如至临床相关水平。不受理论的束缚，来源于不同供体的培养物的不同水平的活化和扩增可以是由于供体γδ可变的TCR库和抗体结合表位的特异性。已经发现并非所有结合特定γδT细胞亚群的药剂都能活化特定γδT细胞，特别是将特定γδT细胞群活化并扩增至临床相关水平，即，在富集培养基中＞108个靶标γδT细胞。类似地，并非γδT细胞群的每个结合表位都是活化表位，即，能够在结合时活化特定γδT细胞群。
本发明的发明人已经鉴定了与δ3γδT细胞亚型的有效活化和扩增相关的特异性γδTCR结合区。在一些情况下，结合区在δ3可变区之内或与其重叠。因此，可以开发结合这些活化区的药剂，并用于选择性活化和扩增δ3γδT细胞亚型。本文描述了示例性活化剂。因此，本发明能够实现δ3γδT细胞亚型的特异性活化和扩增，这产生可以施用给患者的纯度增大的临床相关水平的高度富集的δ3γδT细胞群及其掺和物。此类掺和物可以包括其他扩增的γδT细胞子群(诸如δ1和/或δ2γδT细胞)的掺和物。本文还设想并进一步描述了特异性结合能够诱导δ3γδT细胞亚型的增强活化和扩增的活化表位的新型活化配体，包括抗体。本文所述的活化配体、方法和组合物可以与PCT/US17/32530(以引用方式整体并入本文)中所述的活化配体、方法和组合物组合使用，以获得和使用通过离体扩增和/或扩增后分离获得的基本上包含任何期望比例的δ1、δ2、δ3、δ4和/或δ8(例如，δ1、δ2和δ3)工程改造的或非工程改造的γδT细胞的扩增的γδT细胞群，以及其掺和物和/或纯化级分。例如，本文所述的一种或多种δ3特异性γδT细胞活化配体可以与PCT/US17/32530中所述的一种或多种δ1特异性和/或δ2特异性γδT细胞活化配体组合地用于培养基中，以用于离体扩增。又如，本文所述的活化配体、方法或组合物可以在第一或第二离体γδT细胞扩增步骤中使用，并且PCT/US17/32530中所述的活化配体、方法或组合物可以在随后的或先前的离体γδT细胞扩增步骤中使用。活化配体还可以用于通过正向或负向选择纯化指定的γδT细胞群。
在一些情况下，可以使用相对少量的培养基实现使用本发明的方法产生临床相关水平(即，＞108)的γδT细胞。例如，在一些实施方案中，临床相关水平的γδT细胞可以在大约25L；20L；10L；5L；3L；2L；1,500mL；1,000mL；500mL；200mL；150mL；100mL或更少(例如，约10mL至约100mL、约100mL至约500mL、约500mL至约5,000mL，或约5L至约25L)的最终培养物体积中由细胞群(例如，分离的混合细胞群)的扩增获得。又如，在一些实施方案中，可以在一定条件下获得临床相关水平的γδT细胞，所述条件使得可以使用少于约50L、25L、20L、10L、5L、1L或750mL(例如，约750mL至少于约50L、约100mL至约750mL、约750mL至约5L、约1L至约10L、约10L至约50L，或约10L至约25L)的培养基总体积实现从获自一个或多个供体的分离的混合细胞群进行扩增。
本文描述了用于直接从分离的混合细胞群中选择性活化和扩增γδT细胞亚型(例如，δ3γδT细胞)的方法，例如，无需预先耗尽非靶细胞类型，即可提供临床相关水平的具有细胞毒性特性的富集的γδT细胞群。还描述了特定γδ细胞群的活化γδ可变TCR表位。本发明还提供了使用包含本发明的富集的γδT细胞群的组合物进行治疗的方法。
本文描述了产生或提供临床相关水平(＞108)的工程改造的或非工程改造的γδT细胞的方法，所述γδT细胞包括γδT细胞的一个或多个特定亚群(例如，δ3γδT细胞)。此类方法可用于从单个供体，包括从单个供体的单个样品产生此类临床相关水平。此外，此类方法可用于产生显著多于108个工程改造的或非工程改造的γδT细胞。例如，在一些实施方案中，约或至少约109、1010、1011或1012个工程改造的或非工程改造的γδT细胞，包括γδT细胞的一个或多个特定亚群(例如，δ3γδT细胞)，可以在本文所述的方法中产生。在一些情况下，可以在短短的14-30天、19-30天或21-30天内，和/或使用少于约1L的培养基总体积实现这样的群体大小。
γδT细胞的分离
在一些方面，本发明提供了用于扩增工程改造的或非工程改造的γδT细胞的离体方法。在一些情况下，所述方法采用一个或多个(例如，第一和/或第二)扩增步骤，所述步骤不包括有利于特定γδT细胞群诸如IL-4、IL-2或IL-15或其组合的扩增的细胞因子。在一些实施方案中，本发明提供了用于由分离的混合细胞群产生富集的γδT细胞群的离体方法，其包括使混合细胞群与通过结合对δ3 TCR(例如，δ3γδTCR)具有特异性的表位而选择性扩增δ3 T细胞的一种或多种药剂接触，以提供富集的γδT细胞群。
在其他方面，本公开提供了用于基因工程改造已从受试者中分离的γδT细胞的方法。富集、活化、扩增或基因工程改造的方法可以任何顺序单独或组合进行。在一个实施方案中，可以将γδT细胞分离、基因工程改造，然后活化和扩增。在一个优选实施方案中，可以将γδT细胞分离，可以将分离的细胞直接活化和扩增，任选地纯化，并且然后任选地基因工程改造。在一些实施方案中，可以将此类活化且扩增且接着基因工程改造的γδT细胞进一步活化和/或扩增和/或纯化。
可以从受试者的复杂样品中扩增例如非工程改造的γδT细胞群。复杂样品可以是外周血样品(例如，PBL或PBMC)、白细胞去除术样品、脐带血样品、肿瘤、干细胞前体、肿瘤活检物、组织、淋巴，或来自直接接触外部环境的受试者的上皮部位，或来源于前体干细胞。在一些情况下，本公开提供了用于选择性扩增Vδ3+细胞的方法。在一些情况下，本公开提供了用于与Vδ1+细胞、Vδ2+细胞、Vδ1+细胞和Vδ3+细胞、Vδ1+细胞和Vδ4+细胞、Vδ1+细胞、Vδ3+细胞、Vδ4+细胞和Vδ5+细胞或其任何群组的扩增相组合地扩增Vδ3+细胞的方法。
外周血单核细胞可以，例如，使用单采机，包括Ficoll-PaqueTM PLUS(GEHealthcare)系统或另一合适装置/系统，从受试者中收集。可以使用例如流式细胞术从收集的样品中纯化γδT细胞或γδT细胞的期望子群。脐带血细胞也可以在受试者出生期间从脐带血获得。参见WO 2016/081518，其出于所有目的以引用方式整体并入本文，包括但不限于用于PBMC分离、γδT细胞活化和扩增，以及制备和使用γδT细胞活化剂的方法和组合物。
可由分离的复杂样品或体外培养的混合细胞群扩增γδT细胞，这通过使混合细胞群与一种或多种药剂接触来实现，所述药剂通过与δ3γδTCR的表位特异性结合来扩增γδT细胞，以提供富集的γδT细胞群，例如在第一富集步骤中。在一些实施方案中，可以活化和扩增没有预先耗尽一种或多种特定细胞群，诸如一种或多种或所有以下非γδT细胞单核细胞：αβT细胞、B细胞和NK细胞的整个PBMC群中包含的γδT细胞，从而产生富集的γδT细胞群。在一些方面，在不存在天然或工程改造的APC的情况下进行γδT细胞的活化和扩增。在一些方面，在存在天然或工程改造的APC的情况下进行γδT细胞的活化和扩增。在一些方面，在第一步骤或第二步骤中在天然或工程改造的APC存在下进行γδT细胞的活化和扩增，并且在没有天然或工程改造的APC的步骤(第一或第二)中也进行活化和扩增。在一些方面，可以使用固定化的γδT细胞丝裂原进行从例如肿瘤样本中分离和扩增γδT细胞，所述丝裂原包括对γδTCR(例如，δ3+ TCR)的活化表位具有特异性的抗体，以及可以例如结合本文提供的γδTCR的活化表位的其他活化剂，包括凝集素。
在某些实施方案中，使分离的混合细胞群与扩增(例如，选择性地扩增)δ3γδT细胞的一种或多种药剂接触约或至少约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约17天、约19天、约21天、约25天、约29天、约30天或其中的任何范围。例如，使分离的混合细胞群与扩增(例如，选择性地扩增)δ3γδT细胞的一种或多种药剂接触约1至约4天、约2至约4天、约2至约5天、约3至约5天、约5至约21天、约5至约19天、约5至约15天、约5至约10天，或约5至约7天，以提供第一富集的γδT细胞群。又如，使分离的混合细胞群与扩增(例如，选择性地扩增)δ3γδT细胞的一种或多种药剂接触约7至约21天、约7至约19天、约7至约23天，或约7至约15天，以提供第一富集的γδT细胞群。
在一些情况下，在第一和第二扩增步骤之间进行纯化或分离步骤。在一些情况下，分离步骤包括除去一种或多种活化剂。在一些情况下，分离步骤包括γδT细胞或其亚型(例如，δ3γδT细胞)的特异性分离。在一些情况下，在第一和第二扩增步骤之间除去一种或多种(例如，所有)活化剂(例如，不是细胞培养基的常见组分诸如血清组分和/或IL-2的所有活化剂)，但γδT细胞并未与其他细胞类型(αβT细胞)特异性分离。在一些情况下，在第一和第二扩增步骤之间除去一种或多种(例如，所有)可溶性活化剂，但γδT细胞并未与其他细胞类型(αβT细胞)特异性分离。
在一些实施方案中，在第一富集步骤和任选的第二富集步骤中使用与γδTCR的活化表位结合的活化剂活化和扩增γδT细胞之后，例如，本发明的第一富集的γδT细胞群可使用本领域已知的技术进一步富集或纯化，以在第二、第三、第四、第五等富集步骤中获得第二或另外的富集的γδT细胞群。例如，例如第一富集的γδT细胞群可耗尽αβT细胞、B细胞和NK细胞。在收集的γδT细胞上表达的细胞表面标志物的正向和/或负向选择可用于直接分离γδT细胞，或表达类似细胞表面标志物的γδT细胞群，例如从第一富集的γδT细胞群中。例如，可以基于标志物诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD44、Kit、TCRα、TCRβ、TCRγ(包括一个或多个TCRγ亚型)、TCRδ(包括一个或多个TCRδ亚型)、NKG2D、CD70、CD27、CD28、CD30、CD16、OX40、CD46、CD161、CCR7、CCR4、NKp30、NKp44、NKp46、DNAM-l、CD242、JAML和其他合适的细胞表面标志物的阳性或阴性表达，从富集的γδT细胞群中分离γδT细胞(例如，在第一和/或第二扩增步骤之后)。
在一些实施方案中，在第一扩增步骤之后(例如，在第一扩增步骤之后执行的分离步骤之后)，任选地稀释扩增的细胞，并在第二扩增步骤中培养。在优选实施方案中，第二扩增步骤是在一定条件下进行的，其中在第二扩增步骤中约每1-2、1-3、1-4、1-5、2-5、2-4或2-3天补充培养基。在一些实施方案中，第二扩增步骤是在一定条件下进行的，其中将细胞稀释或调节至支持1、2、3、4、5、6或更多倍的进一步γδT细胞扩增的密度。在一些情况下，细胞密度调节与培养基的补充同时(即，在同一天或同一时间)进行。例如，在第二扩增步骤中可以每1-2、1-3、1-4、1-5、2-5、2-4或2-3天调节细胞密度。支持进一步γδT细胞扩增的典型细胞密度包括但不限于约1 x 105个、2 x 105个、3 x 105个、4 x 105个、5 x 105个、6 x 105个、7 x 105个、8 x 105个、9 x 105个、1 x 106个、2 x 106个、3 x 106个、4 x 106个、5 x 106个细胞/mL、10 x 106个细胞/mL、15 x 106个细胞/mL、20x 106个细胞/mL，或30 x 106个细胞/mL培养基。
在一些实施方案中，将细胞密度调节至约0.5 x 106至约1 x 106个细胞/mL、约0.5x 106至约1.5 x 106个细胞/mL、约0.5 x 106至约2 x 106个细胞/mL、约0.75 x 106至约1 x106个细胞/mL、约0.75 x 106至约1.5 x 106个细胞/mL、约0.75 x 106至约2 x 106个细胞/mL、约1 x 106至约2 x 106个细胞/mL，或约1 x 106至约1.5 x 106个细胞/mL、约1 x 106至约2 x 106个细胞/mL、约1 x 106至约3 x 106个细胞/mL、约1 x 106至约4 x 106个细胞/mL、约1 x 106至约5 x 106个细胞/mL、约1 x 106至约10 x 106个细胞/mL、约1 x 106至约15 x106个细胞/mL、约1 x 106至约20 x 106个细胞/mL，或约1 x 106至约30 x 106个细胞/mL的密度。
在一些实施方案中，第二扩增步骤是在一定条件下进行的，其中对细胞进行监测并维持在预先确定的细胞密度(或密度区间)下和/或将细胞维持在具有预先确定的葡萄糖含量的培养基中。例如，可以将细胞维持在约0.5 x 106至约1 x 106个细胞/mL、约0.5 x106至约1.5 x 106个细胞/mL、约0.5 x 106至约2 x 106个细胞/mL、约0.75 x 106至约1 x106个细胞/mL、约0.75 x 106至约1.5 x 106个细胞/mL、约0.75x 106至约2 x 106个细胞/mL、约1 x 106至约2 x 106个细胞/mL，或约1 x 106至约1.5 x 106个细胞/mL、约1 x 106至约3 x 106个细胞/mL、约1 x 106至约4 x 106个细胞/mL、约1 x 106至约5 x 106个细胞/mL、约1 x 106至约10 x 106个细胞/mL、约1 x 106至约15 x 106个细胞/mL、约1 x 106至约20 x106个细胞/mL、约1 x 106至约30 x 106个细胞/mL的活细胞密度下。
在一些情况下，对于至少一部分扩增，可以将细胞维持在较高浓度下。例如，对于第一或第二扩增的第一部分，在较高的细胞浓度下可增强细胞活力。又如，对于第一或第二扩增的最后部分，在较高的细胞浓度下，培养体积可得到最有效的利用。因此，在一些实施方案中，对于第一或第二扩增培养的至少一部分，或第一或第二扩增培养的全部，可以将细胞维持在约1 x 106个细胞/mL至约20 x 106个细胞/mL的活细胞密度下。
又如，可以将细胞维持在具有约0.5g/L至约1g/L、约0.5g/L至约1.5g/L、约0.5g/L至约2g/L、约0.75g/L至约1g/L、约0.75g/L至约1.5g/L、约0.75g/L至约2g/L、约1g/L至约1.5g/L、约1g/L至约2g/L、1g/L至3g/L或1g/L至4g/L的葡萄糖含量的培养基中。在一些实施方案中，可以将细胞维持在具有约1.25g/L的葡萄糖含量的培养基中。在诸如其中维持了高细胞密度培养物的一些情况下，可以将细胞维持在具有约1g/L至约5g/L、约1g/L至约4g/L、约2g/L至约5g/L或约2g/L至约4g/L的葡萄糖含量的培养基中。
通常，通过向培养物中添加新鲜的含血清或无血清培养基来维持葡萄糖含量。在一些实施方案中，可以将细胞维持在预先确定的活细胞密度区间和具有预先确定的葡萄糖含量区间的培养基中，例如通过监测每个参数并添加新鲜培养基以将参数维持在预先确定的限度内。在一些实施方案中，通过在培养物中添加新鲜的含血清或无血清培养基，同时在将细胞保留在内部的同时除去灌注生物反应器中的废培养基来维持葡萄糖含量。在一些实施方案中，在本文所述的γδT细胞扩增(例如，选择性γδT细胞扩增)期间或在第一或第二γδT细胞扩增(例如，选择性γδT细胞扩增)步骤期间监测和/或维持另外的参数，包括但不限于以下各项中的一个或多个：pH、O2的分压、O2饱和度、CO2的分压、CO2饱和度、乳酸盐、谷氨酰胺、谷氨酸盐、铵、钠、钾和钙。
可由分离的复杂样品或体外培养的混合细胞群选择性地扩增δ3γδT细胞，这通过使混合细胞群与一种或多种药剂接触来实现，所述药剂通过与δ3 TCR的表位特异性结合而选择性地扩增δ3 T细胞，以提供富集的γδT细胞群，例如在第一富集步骤中。在一些情况下，一种或多种药剂特异性结合δ3J1、δ3J2或δ3J3 TCR、δ3J4 TCR，或其中的两个，或其中的三个，或其中的全部。
在一些实施方案中，可以活化和扩增未预先耗尽诸如单核细胞、αβT细胞、B细胞和NK细胞之类的特定细胞群的整个PBMC群中的δ3γδ细胞，从而产生富集的γδT细胞群(例如，富集的δ3γδT细胞群)。在一些方面，在不存在天然或工程改造的APC的情况下进行δ3γδT细胞的活化和扩增。在一些方面，可以使用固定化的γδT细胞丝裂原进行从肿瘤样本中分离和扩增γδT细胞，所述丝裂原包括对特异于δ3 TCR；δ1 TCR；δ1、δ3、δ4和δ5 TCR，；δ1和δ4 TCR；或δ2 TCR的活化表位具有特异性的抗体；以及例如结合对本文提供的δ3 TCR；δ1TCR；δ1、δ3、δ4和δ5 TCR；δ1和δ4 TCR；或δ2 TCR具有特异性的活化表位的其他活化剂，包括凝集素。
在某些实施方案中，使分离的混合细胞群与选择性地扩增δ3 T细胞的一种或多种药剂接触约5天、6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天或其中的任何范围。例如，使分离的混合细胞群与选择性地扩增δ3 T细胞的一种或多种药剂接触约1至约3天、约1至约4天、约1至约5天、约2至约3天、约2至约4天、约2至约5天、约3至约4天、约3至约5天、约4至约5天、约5至约15天，或约5至约7天，以提供第一富集的γδT细胞群。在一些实施方案中，在如本文所述的第二扩增步骤中进一步扩增选择性扩增的γδT细胞。
在某些实施方案中，起始的分离的混合细胞群，例如，外周血样品，包含在约20-80％范围内的T淋巴细胞。在某些实施方案中，本发明的富集的γδT细胞群中的残余αβT细胞和NK细胞的百分比分别为约或小于约2.5％和1％。在某些实施方案中，本发明的富集的γδT细胞群中的残余αβT细胞或NK细胞的百分比为约或小于约1％、0.5％、0.4％、0.2％、0.1％或0.01％。在某些实施方案中，本发明的富集的γδT细胞群中的残余αβT细胞的百分比为约或小于约0.4％、0.2％、0.1％或0.01％(例如，在γδT细胞或其亚型(诸如δ3γδT细胞)的正向选择步骤之后或在αβT细胞耗尽之后)。在一些实施方案中，在第一和/或第二γδT细胞扩增之前或之后，αβT细胞被耗尽，但NK细胞未耗尽。在某些方面，分离的混合细胞群来源于单个供体。在其他方面，分离的混合细胞群来源于多于一个供体或多个供体(例如，2、3、4、5或2-5、2-10或5-10个供体，或更多)。
因此，在一些实施方案中，本发明的方法可以由仅仅一个供体提供临床相关数量(＞108、＞109、＞1010、＞1011或＞1012，或约108至约1012)的扩增的γδT细胞。在一些情况下，本发明的方法可以在从获得供体样品的时间开始算起的少于19、21或30天内提供临床相关数量(＞108、＞109、＞1010、＞1011或＞1012，或约108至约1012)的扩增的γδT细胞。
在第一富集步骤中使用与对δ3 TCR具有特异性的活化表位结合的活化剂特异性活化和扩增特定的γδT细胞亚群之后，本发明的第一富集的γδT细胞群可在第二、第三、第四、第五等富集步骤中使用本领域已知的技术进一步富集或纯化，以获得第二或另外的富集γδT细胞群。例如，第一富集的γδT细胞群可耗尽αβT细胞、B细胞和/或NK细胞。在收集的γδT细胞上表达的细胞表面标志物的正向和/或负向选择可用于从第一富集的γδT细胞群中直接分离γδT细胞，或表达类似细胞表面标志物的γδT细胞群。例如，可以基于标志物诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD44、Kit、TCRα、TCRβ、TCRγ(或一个或多个其亚型)、TCRδ(或一个或多个其亚型)、NKG2D、CD70、CD27、CD28、CD30、CD16、OX40、CD46、CD161、CCR7、CCR4、DNAM-1、JAML和其他合适的细胞表面标志物的阳性或阴性表达，从第一富集的γδT细胞群中分离γδT细胞。
在一些实施方案中，在本发明的第一γδT细胞扩增、第一富集步骤、第二γδT细胞扩增和/或第二富集步骤之后，富集的γδT细胞群包含＞108个细胞的临床相关水平的γδT细胞亚群，例如，在少于10mL、25mL、50mL、100mL、150mL、200mL、500mL、750mL、1L、2L、3L、4L、5L、10L、20L或25L的培养体积中。例如，本发明的方法可以在一定体积的扩增培养物中提供＞108个细胞的临床相关水平的γδT细胞亚群，所述体积为10-100mL；25-100mL；50-100mL；75-100mL；10-150mL；25-150mL；50-150mL；75-150mL；100-150mL；10-200mL；25-200mL；50-200mL；75-200mL；100-200mL；10-250mL；25-250mL；50-250mL；75-250mL；100-250mL；150-250mL；5-1,000mL；10-1,000mL；或100-1,000mL；150-1,000mL；200-1,000mL；250-1,000mL、400mL至1L、1L至2L、2L至5L、2L至10L、4L至10L、4L至15L、4L至20L或4L至25L。在其他实施方案中，在本发明的第二、第三、第四、第五等富集步骤之后，富集的γδT细胞群包含临床相关水平＞108的一个或多个γδT细胞亚群(例如，＞108个δ3γδT细胞)。
在一些实施方案中，γδT细胞可以响应于与一种或多种抗原的接触而快速扩增。一些γδT细胞，诸如Vγ9Vδ2+γδT细胞，在组织培养过程中响应于与一些抗原(如异戊二烯基焦磷酸酯、烷基胺和代谢物或微生物提取物)的接触而在体外快速扩增。另外，一些野生型γδT细胞，诸如Vγ2Vδ2+γδT细胞，响应于某些类型的疫苗接种而在人体内快速扩增。受刺激的γδT细胞可以表现出多种抗原呈递、共刺激和粘附分子，这可有利于从复杂样品中分离出γδT细胞。可以用至少一种抗原在体外刺激复杂样品内的γδT细胞1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、约5-15天、5-10天或5-7天，或另外的合适时间段，例如，与使用本文所述的选择性γδT细胞扩增剂(诸如抗体或固定化的抗体)进行的扩增相组合、在其之前或在其之后。用合适的抗原刺激γδT细胞可以离体或在体外扩增γδT细胞群。
可用于刺激从复杂样品体外扩增γδT细胞的抗原的非限制性实例包括异戊二烯基焦磷酸酯诸如异戊烯基焦磷酸酯(IPP)、烷基胺、人微生物病原体的代谢物、共生细菌的代谢物、-甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸酯(2M3B1PP)、(e)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯(HMB-PP)、焦磷酸乙酯(EPP)、法呢基焦磷酸酯(FPP)、二甲基烯丙基磷酸酯(DMAP)、二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)、乙基-腺苷三磷酸酯(EPPPA)、香叶基焦磷酸酯(GPP)、香叶基香叶基焦磷酸酯(GGPP)、异戊烯基-腺苷三磷酸酯(IPPPA)、磷酸单乙酯(MEP)、焦磷酸单乙酯(MEPP)、3-甲酰基-1-丁基-焦磷酸酯(TUBAg 1)、X-焦磷酸酯(TUBAg 2)、3-甲酰基-1-丁基-尿苷三磷酸酯(TUBAg 3)、3-甲酰基-1-丁基-脱氧胸苷三磷酸酯(TUBAg 4)、单乙基烷基胺、烯丙基焦磷酸酯、巴豆酰基焦磷酸酯、二甲基烯丙基-γ-尿苷三磷酸酯、巴豆酰基-γ-尿苷三磷酸酯、烯丙基-γ-尿苷三磷酸酯、乙胺、异丁胺、仲丁胺、异戊胺和含氮二膦酸酯。
γδT细胞的活化和扩增可以使用本文所述的活化剂和共刺激剂触发特定的γδT细胞增殖和持续群体来进行。在一些实施方案中，通过使用不同的培养条件诸如不同的活化剂或其混合物，来自不同培养物的γδT细胞的活化和扩增可以实现不同的克隆或混合多克隆群体亚群。在一些情况下，可以纯化和/或掺和不同的群体亚群以产生另外的克隆或混合的多克隆群体亚群。在一些实施方案中，不同的激动剂可以用于鉴定提供特定γδT细胞活化信号的药剂。在一个方面，提供特定γδT细胞活化信号的药剂可以是针对γδTCR的不同单克隆抗体(MAb)。
在一个方面，MAb可以结合至δTCR和/或γTCR的恒定或可变区上的不同表位。在一个方面，MAb可包括泛γδTCR MAb。在一个方面，泛γδTCR MAb可识别由γ或δ链或两者(包括δ3+细胞群)上的不同γ和δTCR共有的结构域。在一个方面，抗体可以是5A6.E9(Thermoscientific)、B1(Biolegend)、IMMU510和/或11F2(11F2)(Beckman Coulter)。在一个方面，MAb可以针对γ链的可变区所独有的特定结构域(7A5 Mab，针对Vγ9 TCR(ThermoScientific#TCR1720))，或Vδ1可变区上的结构域(Mab TS8.2(Thermo scientific#TCR1730；MAb TS-1(ThermoFisher#TCR 1055)、MAb R9.12(Beckman Coulter#IM1761))，或Vδ2链(MAb15D(Thermo Scientific#TCR1732或Life technologies#TCR2732)B6(Biolegend#331402)、PCT/US17/32530中所述的一种或多种δ1-#抗体、PCT/US17/32530中所述的一种或多种δ2-#抗体，或δ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58中的一种或多种。
在一些实施方案中，可以将针对γδTCR的不同结构域的抗体(泛抗体和识别亚群群体上的特定可变区表位的抗体)组合起来，以评估或利用其增强γδT细胞和/或其一个或多个子群的活化和扩增的能力。在一些实施方案中，γδT细胞活化剂可以包括γδTCR结合剂诸如MICA、针对NKG2D的激动剂抗体例如Fc标签、MICA的融合蛋白、ULBP1或ULBP3(R&Dsystems Minneapolis，MN)ULBP2，或ULBP6(Sino Biological Beijing，China)。在一些实施方案中，可以鉴定或在本发明的方法和组合物中使用在不诱导细胞无能和凋亡的情况下协助触发特定γδT细胞增殖的伴侣共刺激剂。这些共刺激剂可以包括在γδ细胞上表达的受体的配体，诸如以下各项中的一个或多个的配体：NKG2D、CD161、CD70、JAML、DNAX、CD81辅助分子1(DNAM-1)ICOS、CD27、CD196、CD137、CD30、HVEM、SLAM、CD122、DAP和CD28。在一些方面，共刺激剂可以是对CD2和CD3分子上的独特表位具有特异性的抗体。当在αβ或γδT细胞上表达时，CD2和CD3可以具有不同的构象结构，并且在一些情况下，针对CD3和CD2的特异性抗体可以导致γδT细胞的选择性活化和扩增。
γδT细胞的群体(例如，包含δ3γδT细胞的群体)可在γδT细胞的工程改造之前离体扩增。可以用于促进γδT细胞群的体外扩增的试剂的非限制性实例包括抗CD3或抗CD2、抗CD27、抗CD30、抗CD70、抗OX40抗体、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-19、IL-21、IL 23、IL-33、IFNγ、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、CD70(CD27配体)、刀豆蛋白A(ConA)、商陆(PWM)、蛋白质花生凝集素(PNA)、大豆凝集素(SBA)、小扁豆(Les Culinaris)凝集素(LCA)、豌豆(Pisum Sativum)凝集素(PSA)、罗马蜗牛(Helix pomatia)凝集素(HPA)、禾本蚕豆(Vicia graminea)凝集素(VGA)、菜豆(Phaseolus Vulgaris)红细胞凝集素(PHA-E)、菜豆白细胞凝集素(PHA-L)、西洋接骨木(Sambucus Nigra)凝集素(SNA、EBL)、朝鲜槐(Maackia Amurensis)凝集素II(MAL II)、龙爪槐(Sophora Japonica)凝集素(SJA)、二花扁豆(Dolichos Biflorus)凝集素(DBA)、小扁豆凝集素(LCA)、多花紫藤(Wisteria Floribunda)凝集素(WFA、WFL)或能够刺激T细胞增殖的另外的合适丝裂原。
γδT细胞的基因工程改造可包括将表达肿瘤识别部分(诸如αβTCR、γδTCR、编码抗体、其抗原结合片段的CAR，和/或淋巴细胞活化结构域)的构建体稳定整合进分离的γδT细胞的基因组、细胞因子(例如，IL-15、IL-12、IL-2、IL-7、IL-21、IL-18、IL-19、IL-33、IL-4、IL-9、IL-23或IL-1β)，以增强T细胞增殖、存活以及离体和体内功能。分离的γδT细胞的基因工程改造还可包括使基因表达从分离的γδT细胞的基因组中的一个或多个内源性基因(诸如一个或多个MHC基因座)缺失或破坏。
γδT细胞的离体扩增
在其他方面，本公开提供了用于离体扩增用于过继性转移疗法的非工程改造的和工程改造的γδT细胞群的方法。本公开的非工程改造的或工程改造的γδT细胞可以离体扩增。本公开的非工程改造的或工程改造的γδT细胞可以体外扩增，而不通过APC活化，或不与APC和/或氨基膦酸盐共培养。另外或可替代地，本公开的非工程改造的或工程改造的γδT细胞可以通过至少一个扩增步骤体外扩增，所述扩增步骤包括通过APC和/或一种或多种氨基膦酸盐或与其一起共培养来活化。
在一些实施方案中，本公开的非工程改造的或工程改造的γδT细胞可以在第一γδT细胞扩增中不通过APC活化来体外扩增，然后在第二γδT细胞扩增中通过APC活化来体外扩增。在一些情况下，第一γδT细胞扩增包括使γδT细胞与一种或多种药剂接触，所述一种或多种药剂(a)扩增γδT细胞，或(b)通过结合至对δ3 TCR具有特异性的活化表位来选择性扩增δ3 T细胞。
在一些情况下，第二γδT细胞扩增在不含第一γδT细胞扩增所用的一种或多种药剂，或不含第一γδT细胞扩增所用的一种或多种药剂中的一种的培养基中进行。在一些情况下，第二γδT细胞扩增在含有一种或多种第二药剂的培养基中进行，所述一种或多种第二药剂(a)扩增T细胞，(b)选择性地扩增γδT细胞(例如，与αβT细胞、B细胞或NK细胞相比)，或(c)通过结合至对δ3 TCR具有特异性的活化表位而选择性地扩增δ3 T细胞。
在一些情况下，第二药剂与用于第一γδT细胞扩增的药剂不同(例如，具有不同的一级氨基酸序列和/或结合结构上不同的γδTCR表位)。在一些情况下，第二药剂结合重叠的γδTCR表位、相同的γδTCR表位，或可以与用于第一γδT细胞扩增的一种或多种药剂竞争与γδTCR的结合。在一些情况下，第二药剂在APC的细胞表面上表达。在一些情况下，第二药剂例如通过第二药剂的恒定区与APC表面上的Fc受体之间的结合相互作用结合至APC的表面。在一些情况下，第二药剂是可溶性的。在一些情况下，第二γδT细胞扩增在含有可溶性第二药剂和APC的培养基中进行，任选地其中APC在其细胞表面上表达扩增或选择性扩增γδT细胞群的药剂或结合至其细胞表面。可溶性的第二药剂和在APC表面上表达或结合至所述APC表面的药剂可以是相同或不同的，例如，结合γδTCR上的相同或不同表位。
在一些情况下，第一γδT细胞扩增在不存在APC的情况下进行，并且第二γδT细胞扩增在存在APC的情况下进行。在一些情况下，第二γδT细胞扩增使用APC和一种或多种第二药剂进行，所述一种或多种第二药剂(a)扩增T细胞，(b)选择性地扩增γδT细胞，或(c)通过结合至δ3 TCR的特异性的活化表位而选择性地扩增δ3 T细胞。
本领域的技术人员将理解，在某些实施方案中，本文所述的第二扩增步骤的方法可以如第一扩增步骤那样进行，并且本文所述的第一步骤的方法可以如第二扩增步骤那样进行。例如，但不限于，在一些实施方案中，细胞的混合群体(例如，PBMC)可以在第一步骤中通过接触APC来扩增，然后在不存在APC的情况下，例如，通过使来自第一扩增步骤的扩增群体与固定化的药剂接触来扩增，所述固定化的药剂通过结合至δ3 TCR的特异性的活化表位而选择性地扩增δ3 T细胞。在一些实施方案中，本发明的方法可以扩增各种γδT细胞群，诸如Vγ1+、Vγ2+或Vγ3+γδT细胞群。
在一些情况下，γδT细胞群可以在少于36天、少于35天、少于34天、少于33天、少于32天、少于31天、少于30天、少于29天、少于28天、少于27天、少于26天、少于25天、少于24天、少于23天、少于22天、少于21天、少于20天、少于19天、少于18天、少于17天、少于16天、少于15天、少于14天、少于13天、少于12天、少于11天、少于10天、少于9天、少于8天、少于7天、少于6天、少于5天、少于4天或少于3天内体外扩增。
在一些方面，提供了用于通过使来自混合细胞群的γδT细胞与活化剂接触来选择性地扩增各种γδT细胞(包括工程改造的和非工程改造的γδT细胞)的方法。在一些情况下，活化剂结合至γδT细胞的细胞表面受体上的特定表位。活化剂可以是抗体，诸如单克隆抗体。活化剂或其组合可以特异性地活化一种或多种类型的γδT细胞(诸如δ3、δ2、δ1、δ1和δ4，或δ1和δ3细胞群)的扩增。在一些实施方案中，活化剂特异性地活化δ3细胞群的扩增，以提供富集的δ3 T细胞群。
活化剂可刺激工程改造的和非工程改造的γδT细胞(例如，δ3γδT细胞)以快速生长速率扩增。例如，药剂可以刺激以在小于30小时内1次细胞分裂、在小于29小时内1次细胞分裂、在小于28小时内1次细胞分裂、在小于27小时内1次细胞分裂、在小于26小时内1次细胞分裂、在小于25小时内1次细胞分裂、在小于24小时内1次细胞分裂、在小于23小时内1次细胞分裂、在小于22小时内1次细胞分裂、在小于21小时内1次细胞分裂、在小于20小时内1次细胞分裂、在小于19小时内1次细胞分裂、在小于18小时内1次细胞分裂、在小于17小时内1次细胞分裂、在小于16小时内1次细胞分裂、在小于15小时内1次细胞分裂、在小于14小时内1次细胞分裂、在小于13小时内1次细胞分裂、在小于12小时内1次细胞分裂、在小于11小时内1次细胞分裂、在小于10小时内1次细胞分裂、在小于9小时内1次细胞分裂、在小于8小时内1次细胞分裂、在小于7小时内1次细胞分裂、在小于6小时内1次细胞分裂、在小于5小时内1次细胞分裂、在小于4小时内1次细胞分裂、在小于3小时内1次细胞分裂、在小于2小时内1次细胞分裂的平均速率扩增γδT细胞群。在一些情况下，快速扩增速率可以维持至少约8小时的培养(例如，8至24小时，或1-3、1-4、1-8、2-3、2-4或2-8天，或少于约19、21或30天)。
在一些情况下，活化剂可刺激工程改造的和非工程改造的γδT细胞(例如，δ3γδT细胞)以每约4小时约1次分裂的平均速率、每约5小时约1次分裂的平均速率、每约6小时约1次分裂的平均速率、每约7小时约1次分裂的平均速率、每约8小时约1次分裂的平均速率、每约9小时约1次分裂的平均速率、每约10小时约1次分裂的平均速率、每约11小时约1次分裂的平均速率、每约12小时约1次分裂的平均速率、每约13小时约1次分裂的平均速率、每约14小时约1次分裂的平均速率、每约15小时约1次分裂的平均速率、每约16小时约1次分裂的平均速率、每约17小时约1次分裂的平均速率、每约18小时约1次分裂的平均速率、每约19小时约1次分裂的平均速率、每约20小时约1次分裂的平均速率、每约21小时约1次分裂的平均速率、每约22小时约1次分裂的平均速率、每约23小时约1次分裂的平均速率、每约24小时约1次分裂的平均速率、每约25小时约1次分裂的平均速率、每约26小时约1次分裂的平均速率、每约27小时约1次分裂的平均速率、每约28小时约1次分裂的平均速率、每约29小时约1次分裂的平均速率、每约30小时约1次分裂的平均速率、每约31小时约1次分裂的平均速率、每约32小时约1次分裂的平均速率、每约33小时约1次分裂的平均速率、每约34小时约1次分裂的平均速率、每约35小时约1次分裂的平均速率、每约36小时约1次分裂的平均速率扩增。在一些情况下，快速扩增速率可以维持至少约8小时的培养(例如，8至24小时，或1-3、1-4、1-8、2-3、2-4或2-8天，或少于约19、21或30天)。
在一些情况下，活化剂可刺激γδT细胞扩增培养物(例如，δ3γδT细胞扩增培养物)中的工程改造的和/或非工程改造的γδT细胞(例如，δ3γδT细胞)快速扩增，其中快速扩增以前述细胞分裂平均速率中的任一种进行，并维持约1个连续日与约19个连续日之间、约1个连续日与约14个连续日之间、约1个连续日与约7个连续日之间、约1个连续日与约5个连续日之间、约2个连续日与约19个连续日之间、约2个连续日与约14个连续日之间、约2个连续日与约7个连续日之间、约2个连续日与约5个连续日之间、约4个连续日与约19个连续日之间、约4个连续日与约14个连续日之间、约4个连续日与约7个连续日之间，或约4个连续日与约5个连续日之间。
在一些情况下，活化剂可刺激γδT细胞扩增培养物(例如，δ3γδT细胞扩增培养物)中的工程改造的和/或非工程改造的γδT细胞(例如，δ3γδT细胞)的扩增，所述γδT细胞扩增培养物已经以每约12小时(例如，10-12小时)约1次分裂的平均速率、每约13小时(例如，10-13小时)约1次分裂的平均速率、每约14小时(例如，10-14小时)约1次分裂的平均速率、每约15小时(例如，10-15小时)约1次分裂的平均速率、每约16小时(例如，10-16小时)约1次分裂的平均速率、每约17小时(例如，10-17小时或12-17小时)约1次分裂的平均速率、每约18小时(例如，10-18小时或12-18小时)约1次分裂的平均速率、每约19小时(例如，10-19小时或12-19小时)约1次分裂的平均速率、每约20小时(例如，12-20小时、1 6-20小时或18-20小时)约1次分裂的平均速率、每约21小时(例如，12-21小时、16-21小时或18-21小时)约1次分裂的平均速率、每约22小时(例如，12-22小时、16-22小时或18-22小时)约1次分裂的平均速率、每约23小时或更少(例如，12-23小时、16-23小时或18-23小时)约1次分裂的平均速率、每约24小时(例如，12-24小时、16-24小时或18-24小时)约1次分裂的平均速率维持了约2个连续日与约7个连续日之间，或约2个连续日与约5个连续日之间。
在一些情况下，活化剂可刺激γδT细胞扩增培养物(例如，δ3γδT细胞扩增培养物)中的工程改造的和/或非工程改造的γδT细胞(例如，δ3γδT细胞)的扩增，所述γδT细胞扩增培养物已经以每约25小时(例如，12-25小时、16-25小时、18-25小时或20-25小时)约1次分裂的平均速率、每约26小时(例如，12-26小时、16-26小时、18-26小时或20-26小时)约1次分裂的平均速率、每约27小时(例如，12-27小时、16-27小时、18-27小时或20-27小时)约1次分裂的平均速率、每约28小时(例如，12-28小时、16-28小时、18-28小时、20-28小时或22-28小时)约1次分裂的平均速率、每约29小时(例如，16-29小时、18-29小时、20-29小时或22-29小时)约1次分裂的平均速率、每约30小时(例如，16-30小时、18-30小时、20-30小时或22-30小时)约1次分裂的平均速率、每约31小时(例如，16-31小时、18-31小时、20-31小时、22-31小时或24-31小时)约1次分裂的平均速率、每约32小时(例如，18-32小时、20-32小时、22-32小时或24-32小时)约1次分裂的平均速率、每约33小时(例如，18-33小时、20-33小时、22-33小时或24-33小时)约1次分裂的平均速率、每约34小时(例如，18-34小时、20-34小时、22-34小时或24-34小时)约1次分裂的平均速率、每约35小时(例如，18-35小时、20-35小时、22-35小时或24-35小时)约1次分裂的平均速率、每约36小时(例如，18-36小时、20-36小时、22-36小时或24-36小时)约1次分裂的平均速率维持了约2个连续日与约7个连续日之间，或约2个连续日与约5个连续日之间。
在一些情况下，活化剂可刺激γδT细胞扩增培养物(例如，δ3γδT细胞扩增培养物)中的工程改造的和/或非工程改造的γδT细胞(例如，δ3γδT细胞)的扩增，所述γδT细胞扩增培养物已经以每约12小时(例如，10-12小时)约1次分裂的平均速率、每约13小时(例如，10-13小时)约1次分裂的平均速率、每约14小时(例如，10-14小时)约1次分裂的平均速率、每约15小时(例如，10-15小时)约1次分裂的平均速率、每约16小时(例如，10-16小时)约1次分裂的平均速率、每约17小时(例如，10-17小时或12-17小时)约1次分裂的平均速率、每约18小时(例如，10-18小时或12-18小时)约1次分裂的平均速率、每约19小时(例如，10-19小时或12-19小时)约1次分裂的平均速率、每约20小时(例如，12-20小时、16-20小时或18-20小时)约1次分裂的平均速率、每约21小时(例如，12-21小时、16-21小时或18-21小时)约1次分裂的平均速率、每约22小时(例如，12-22小时、16-22小时或18-22小时)约1次分裂的平均速率、每约23小时或更少(例如，12-23小时、16-23小时或18-23小时)约1次分裂的平均速率、每约24小时(例如，12-24小时、16-24小时或18-24小时)约1次分裂的平均速率维持了至少14个连续日。
在一些情况下，活化剂可刺激γδT细胞扩增培养物中的工程改造的和/或非工程改造的γδT细胞(例如，δ3γδT细胞)的扩增，所述γδT细胞扩增培养物已经以每约25小时(例如，12-25小时、16-25小时、18-25小时或20-25小时)约1次分裂的平均速率、每约26小时(例如，12-26小时、16-26小时、18-26小时或20-26小时)约1次分裂的平均速率、每约27小时(例如，12-27小时、16-27小时、18-27小时或20-27小时)约1次分裂的平均速率、每约28小时(例如，12-28小时、16-28小时、18-28小时、20-28小时或22-28小时)约1次分裂的平均速率、每约29小时(例如，16-29小时、18-29小时、20-29小时或22-29小时)约1次分裂的平均速率、每约30小时(例如，16-30小时、18-30小时、20-30小时或22-30小时)约1次分裂的平均速率、每约31小时(例如，16-31小时、18-31小时、20-31小时、22-31小时或24-31小时)约1次分裂的平均速率、每约32小时(例如，18-32小时、20-32小时、22-32小时或24-32小时)约1次分裂的平均速率、每约33小时(例如，18-33小时、20-33小时、22-33小时或24-33小时)约1次分裂的平均速率、每约34小时(例如，18-34小时、20-34小时、22-34小时或24-34小时)约1次分裂的平均速率、每约35小时(例如，18-35小时、20-35小时、22-35小时或24-35小时)约1次分裂的平均速率、每约36小时(例如，18-36小时、20-36小时、22-36小时或24-36小时)约1次分裂的平均速率维持了至少14个连续日。
在一些情况下，活化剂可刺激γδT细胞扩增培养物中的工程改造的和/或非工程改造的γδT细胞(例如，δ3γδT细胞)的扩增，所述γδT细胞扩增培养物已经以每约12小时(例如，10-12小时)约1次分裂的平均速率、每约13小时(例如，10-13小时)约1次分裂的平均速率、每约19小时(例如，10-14小时)约1次分裂的平均速率、每约15小时(例如，10-15小时)约1次分裂的平均速率、每约16小时(例如，10-16小时)约1次分裂的平均速率、每约17小时(例如，10-17小时或12-17小时)约1次分裂的平均速率、每约18小时(例如，10-18小时或12-18小时)约1次分裂的平均速率、每约19小时(例如，10-19小时或12-19小时)约1次分裂的平均速率、每约20小时(例如，12-20小时、16-20小时或18-20小时)约1次分裂的平均速率、每约21小时(例如，12-21小时、16-21小时或18-21小时)约1次分裂的平均速率、每约22小时(例如，12-22小时、16-22小时或18-22小时)约1次分裂的平均速率、每约23小时或更少(例如，12-23小时、16-23小时或18-23小时)约1次分裂的平均速率、每约24小时(例如，12-24小时、16-24小时或18-24小时)约1次分裂的平均速率维持了至少14个连续日。
在一些情况下，活化剂可刺激γδT细胞扩增培养物(例如，δ3γδT细胞扩增培养物)中的工程改造的和/或非工程改造的γδT细胞(例如，δ3γδT细胞)的扩增，所述γδT细胞扩增培养物已经以每约25小时(例如，12-25小时、16-25小时、18-25小时或20-25小时)约1次分裂的平均速率、每约26小时(例如，12-26小时、16-26小时、18-26小时或20-26小时)约1次分裂的平均速率、每约27小时(例如，12-27小时、16-27小时、18-27小时或20-27小时)约1次分裂的平均速率、每约28小时(例如，12-28小时、16-28小时、18-28小时、20-28小时或22-28小时)约1次分裂的平均速率、每约29小时(例如，16-29小时、18-29小时、20-29小时或22-29小时)约1次分裂的平均速率、每约30小时(例如，16-30小时、18-30小时、20-30小时或22-30小时)约1次分裂的平均速率、每约31小时(例如，16-31小时、18-31小时、20-31小时、22-31小时或24-31小时)约1次分裂的平均速率、每约32小时(例如，18-32小时、20-32小时、22-32小时或24-32小时)约1次分裂的平均速率、每约33小时(例如，18-33小时、20-33小时、22-33小时或24-33小时)约1次分裂的平均速率、每约34小时(例如，18-34小时、20-34小时、22-34小时或24-34小时)约1次分裂的平均速率、每约35小时(例如，18-35小时、20-35小时、22-35小时或24-35小时)约1次分裂的平均速率、每约36小时(例如，18-36小时、20-36小时、22-36小时或24-36小时)约1次分裂的平均速率维持了至少19个连续日。
活化剂可刺激工程改造的或非工程改造的γδT细胞的子群以不同的生长速率扩增。例如，药剂可刺激δ3细胞群以更快的速率生长，使得在1天至90天培养(例如，约1天至约19天、21天或23天培养)时期内，扩增导致比另一γδT细胞群，诸如δ1或δ2群体；比扩增前γδT细胞的起始数量；比扩增前γδ3 T细胞的起始数量；或比培养物中的αβT细胞群大约10倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、10,000倍、20,000倍、30,000倍、50,000倍、70,000倍、100,000倍或1,000,000倍。
在一些方面，本公开提供与药剂接触的工程改造的或非工程改造的γδT细胞群(例如，δ3γδT细胞群)，所述药剂刺激γδT细胞群快速，诸如以每30小时约1次细胞分裂或更快的速率扩增。在一些情况下，药剂选择性地刺激δ3 T细胞的增殖。γδT细胞群可以包含一定量的非工程改造的γδT细胞和一定量的工程改造的γδT细胞。在一些情况下，γδT细胞群包含不同百分比的δ1、δ2、δ3和/或δ4 T细胞。在一些情况下，γδT细胞群包含不同百分比的δ1、δ2、δ3和/或δ4 T细胞，含有比任何其他γδT细胞子群更多的δ3γδT细胞，和/或主要含有(＞50％)δ3γδT细胞。工程改造的或非工程改造的γδT细胞群可以包含，例如，少于90％的δ3 T细胞、少于80％的δ3 T细胞、少于70％的δ3 T细胞、少于60％的δ3 T细胞、少于50％的δ3 T细胞、少于40％的δ3 T细胞、少于30％的δ3 T细胞、少于20％的δ3 T细胞、少于10％的δ3 T细胞，或少于5％的δ3 T细胞。可替代地，工程改造的或非工程改造的γδT细胞群可以包含大于5％的δ3 T细胞、大于10％的δ3 T细胞、大于20％的δ3 T细胞、大于30％的δ3 T细胞、大于40％的δ3 T细胞、大于50％的δ3 T细胞、大于60％的δ3 T细胞、大于70％的δ3T细胞、大于80％的δ3 T细胞，或大于90％的δ3 T细胞。在一些情况下，所述药剂是本文所述的选择性扩增剂中的一种。在一些情况下，药剂被固定在诸如细胞培养物表面或APC表面(例如，在APC的表面上表达或结合至在APC的表面上表达的Fc受体)的表面上。
工程改造的或非工程改造的γδT细胞群可以包含，例如，少于90％的δ2 T细胞、少于80％的δ2 T细胞、少于70％的δ2 T细胞、少于60％的δ2 T细胞、少于50％的δ2 T细胞、少于40％的δ2 T细胞、少于30％的δ2 T细胞、少于20％的δ2 T细胞、少于10％的δ2 T细胞，或少于5％的δ2 T细胞。可替代地，工程改造的或非工程改造的γδT细胞群可以包含大于5％的δ2 T细胞、大于10％的δ2 T细胞、大于20％的δ2 T细胞、大于30％的δ2 T细胞、大于40％的δ2 T细胞、大于50％的δ2 T细胞、大于60％的δ2 T细胞、大于70％的δ2 T细胞、大于80％的δ2 T细胞，或大于90％的δ2 T细胞。
工程改造的或非工程改造的γδT细胞群可以包含，例如，少于90％的δ1和δ4 T细胞、少于80％的δ1和δ4 T细胞、少于70％的δ1和δ4 T细胞、少于60％的δ1和δ4 T细胞、少于50％的δ1和δ4 T细胞、少于40％的δ1和δ4 T细胞、少于30％的δ1和δ4 T细胞、少于20％的δ1和δ4 T细胞、少于10％的δ1和δ4 T细胞，或少于5％的δ1和δ4 T细胞。可替代地，工程改造的或非工程改造的γδT细胞群可以包含大于5％的δ1和δ4 T细胞、大于10％的δ1和δ4 T细胞、大于20％的δ1和δ4 T细胞、大于30％的δ1和δ4 T细胞、大于40％的δ1和δ4 T细胞、大于50％的δ1和δ4 T细胞、大于60％的δ1和δ4 T细胞、大于70％的δ1和δ4 T细胞、大于80％的δ1和δ4T细胞，或大于90％的61和δ4 T细胞。
工程改造的或非工程改造的γδT细胞群可以包含，例如，少于90％的δ4 T细胞、少于80％的δ4 T细胞、少于70％的δ4 T细胞、少于60％的δ4 T细胞、少于50％的δ4 T细胞、少于40％的δ4 T细胞、少于30％的δ4 T细胞、少于20％的δ4 T细胞、少于10％的δ4 T细胞，或少于5％的δ4 T细胞。可替代地，工程改造的或非工程改造的γδT细胞群可以包含大于5％的δ1和δ4 T细胞、大于10％的δ1和δ4 T细胞、大于20％的δ1和64 T细胞、大于30％的δ1和δ4T细胞、大于40％的δ1和δ4 T细胞、大于50％的δ1和δ4 T细胞、大于60％的δ1和δ4 T细胞、大于70％的δ1和δ4 T细胞、大于80％的δ1和δ4 T细胞，或大于90％的δ1和δ4 T细胞。工程改造的或非工程改造的γδT细胞群可以包含，例如，少于90％的δ1和δ4 T细胞、少于80％的δ1和δ4 T细胞、少于70％的δ1和δ4 T细胞、少于60％的δ1和δ4 T细胞、少于50％的δ1和δ4 T细胞、少于40％的δ1和δ4 T细胞、少于30％的δ1和δ4 T细胞、少于20％的δ1和δ4 T细胞、少于10％的δ1和δ4 T细胞，或少于5％的δ1和δ4 T细胞。
在某些实施方案中，本发明提供了包含10-90％的δ3 T细胞和90-10％的δ2 T细胞的扩增的γδT细胞群的掺和物。在某些实施方案中，本发明提供了包含10-90％的δ3 T细胞和90-10％的δ1 T细胞的扩增的γδT细胞群的掺和物。在某些实施方案中，本发明提供了包含10-90％的δ1和δ3 T细胞和90-10％的δ2 T细胞的扩增的γδT细胞群的掺和物。在某些实施方案中，本发明提供了包含10-90％的δ3和δ2 T细胞和90-10％的δ1 T细胞的扩增的γδT细胞群的掺和物。在某些实施方案中，本发明提供了包含10-90％的δ1、δ3、δ4和δ5 T细胞和90-10％的δ2 T细胞的扩增的γδT细胞群的掺和物。
一种或多种活化剂可以接触γδT细胞(例如结合γδT细胞表面上的受体的活化剂)，并且其后共刺激分子可以接触γδT细胞，以提供进一步刺激并扩增γδT细胞。在一些实施方案中，活化剂和/或共刺激剂可以是植物或非植物来源的凝集素、活化γδT细胞的单克隆抗体，以及其他非凝集素/非抗体药剂。在其他情况下，植物凝集素可以是刀豆蛋白A(ConA)，但可使用诸如其他植物凝集素。凝集素的其他实例包括蛋白质花生凝集素(PNA)、大豆凝集素(SBA)、小扁豆凝集素(LCA)、豌豆凝集素(PSA)、罗马蜗牛凝集素(HPA)、禾本蚕豆凝集素(VGA)、菜豆红细胞凝集素(PHA-E)、菜豆白细胞凝集素(PHA-L)、西洋接骨木凝集素(SNA、EBL)、朝鲜槐凝集素II(MAL II)、龙爪槐凝集素(SJA)、二花扁豆凝集素(DBA)、小扁豆凝集素(LCA)以及多花紫藤凝集素(WFA、WFL)。
活化剂和共刺激分子的非限制性实例包括对本文所述的δ链或γ链或其亚型具有选择性的任何一种或多种抗体，诸如5A6.E9、B1、TS8.2、15D、B6、B3、TS-1、γ3.20、7A5、IMMU510、R9.12、11F2或其组合的抗体。活化剂和共刺激分子的其他实例包括唑来膦酸盐、12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸佛波醇酯(TPA)、密执毒素(mezerein)、葡萄球菌肠毒素A(SEA)、链球菌蛋白A或其组合。
在其他情况下，活化剂和/或共刺激剂可以是αTCR、βTCR、γTCR、δTCR、CD277、CD28、CD46、CD81、CTLA4、ICOS、PD-1、CD30、NKG2D、NKG2A、HVEM、4-1 BB(CD137)、OX40(CD134)、CD70、CD80、CD86、DAP、CD122、GITR、FcεRIγ、CD1、CD16、CD161、DNAX、辅助分子-1(DNAM-1)、一种或多种NCR(例如，NKp30、NKp44、NKp46)、SLAM、柯萨奇(Coxsackie)病毒和腺病毒受体或其组合的抗体或配体。
工程改造的γδT细胞
工程改造的γδT细胞(例如，δ3γδT细胞)可使用本领域已知的各种方法生成。工程改造的γδT细胞可设计成稳定表达特定肿瘤识别部分。编码包含肿瘤识别部分或另一类型的识别部分的表达盒的多核苷酸可以通过转座子/转座酶系统或基于病毒的基因转移系统(诸如慢病毒或逆转录病毒系统)，或另一合适方法(诸如转染、电穿孔、转导、脂质转染、磷酸钙(CaPO4))、纳米工程改造物质(诸如有机改性的二氧化硅(Ormosil))、病毒递送方法(包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒)或另一合适的方法稳定地引入γδT细胞。可以通过将包含抗原特异性TCR的遗传密码的多核苷酸稳定插入γδT细胞的基因组来将αβ或γδ抗原特异性TCR引入工程改造的γδT细胞。可通过将多核苷酸稳定插入γδT细胞的基因组来将编码具有肿瘤识别部分的CAR的多核苷酸引入工程改造的γδT细胞。在一些情况下，工程改造的肿瘤识别部分是工程改造的T细胞受体，并且整合进工程改造的γδT细胞的基因组的表达盒包含编码工程改造的TCRα(TCR alpha)基因、工程改造的TCRβ(TCR beta)基因、TCRδ(TCR delta)基因，或工程改造的TCRγ(TCR gamma)基因的多核苷酸。在一些情况下，整合进工程改造的γδT细胞的基因组的表达盒包含编码抗体片段或其抗原结合部分的多核苷酸。在一些情况下，抗体片段或其抗原结合片段是编码完整抗体、抗体片段、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体(sdAb)、Fab、F(ab)2、Fc、抗体上的轻链或重链、抗体的可变区或恒定区或其任何组合的多核苷酸，它们作为嵌合抗原受体(CAR)构建体，或包含CAR和T细胞受体(TCR)或抗体针对不同抗原的CAR的双特异性构建体的一部分结合至细胞表面肿瘤抗原。在一些情况下，多核苷酸来源于人或来源于另外的物种。可以修饰来源于非人物种的抗体片段或抗原结合片段多核苷酸，以提高其与人体中天然产生的抗体变体的相似性，并且抗体片段或抗原结合片段可以是部分或完全人源化的。抗体片段或抗原结合片段多核苷酸也可以是嵌合的，例如小鼠-人抗体嵌合体。表达CAR的工程改造的γδT细胞也可以工程改造成表达由肿瘤识别部分识别的抗原的配体。
本领域已知的各种技术可用于将包含肿瘤识别部分的遗传密码的克隆的或合成工程改造的核酸引入工程改造的γδT细胞的基因组内的特定位置。分别如WO201409370、WO2003087341、WO2014134412和WO2011090804(其中的每一个以引用的方式整体并入本文)所述的来自微生物成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统的RNA引导的Cas9核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)和大范围核酸酶技术可用于在γδT细胞中提供有效的基因组工程改造。本文所述的技术也可用于将表达盒插入同时提供一个基因的敲除和另一个基因的敲入的基因组位置。例如，包含本公开的表达盒的多核苷酸可以插入编码MHC基因的基因组区域。这种工程改造可以同时提供一个或多个基因(例如表达盒中包含的基因)的敲入和另一个基因(例如MHC基因座)的敲除。
在一种情况下，将包含编码肿瘤识别部分的核酸的睡美人(Sleeping Beauty)转座子引入细胞，即工程改造的γδT细胞。与野生型睡美人相比提供增强整合的突变型睡美人转座酶，诸如US 7,985,739(其以引用方式整体并入本文)描述的转座酶，可用于将多核苷酸引入工程改造的γδT细胞。
在一些情况下，使用病毒方法将包含肿瘤识别部分的多核苷酸引入工程改造的γδT细胞的基因组。许多病毒方法已用于人基因疗法，诸如WO 1993020221中描述的方法，所述专利整体并入本文。可用于工程改造γδT细胞的病毒方法的非限制性实例包括逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒或腺病毒相关的病毒方法。
含有肿瘤识别部分的遗传密码的多核苷酸可包含影响工程改造的γδT细胞的生长、增殖、活化状态的突变或其他转基因，或对肿瘤细胞具有特异性的抗原(诸如睾丸特异性癌症抗原)。本公开的γδT细胞可被工程改造成表达包含连接至抗原识别部分(诸如TCR-CD3复合物中的分子或共刺激因子)的活化结构域的多核苷酸。工程改造的γδT细胞可表达作为T淋巴细胞活化结构域的胞内信号传导结构域。γδT细胞可被工程改造成表达胞内活化结构域基因或胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域基因可以是例如CD3ζ、CD28、CD2、ICOS、JAML、CD27、CD30、OX40、NKG2D、CD4、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、IL-2RB/CD 122、IL-2RG/CD132、DAP分子、CD70、细胞因子受体、CD40或其任何组合。在一些情况下，工程改造的γδT细胞还被工程改造成表达细胞因子、抗原、细胞受体或其他免疫调节分子。
可以根据待治疗的疾病选择由工程改造的γδT细胞表达的适当肿瘤识别部分。例如，在一些情况下，肿瘤识别部分是TCR。在一些情况下，肿瘤识别部分是在癌细胞上表达的配体的受体。合适受体的非限制性实例包括NKG2D、NKG2A、NKG2C、NKG2F、LLT1、AICL、CD26、NKRP1、CD244(2B4)、DNAM-1、NKp30、NKp44、NKp46和NKp80。在一些情况下，肿瘤识别部分可以包括配体，例如IL-13配体，或肿瘤抗原的模拟配体，诸如IL13R的模拟IL-13。
γδT细胞可被工程改造成表达包含来源于NKG2D、NKG2A、NKG2C、NKG2F、LLT1、AICL、CD26、NKRP1、CD244(2B4)、DNAM-1的配体结合结构域，或抗肿瘤抗体(诸如抗Her2neu或抗EGFR)以及得自CD3-ζ、Dap 10、Dap 12、CD28、41BB和CD40L的信号传导结构域的嵌合肿瘤识别部分。在一些实例中，嵌合受体结合MICA、MICB、Her2neu、EGFR、EGFRvIII、间皮素、CD38、CD20、CD19、BCMA、PSA、RON、CD30、CD22、CD37、CD38、CD56、CD33、CD138、CD123、CD79b、CD70、CD75、CA6、GD2、甲胎蛋白(AFP)、CS1、癌胚抗原(CEA)、CEACAM5、CA-125、MUC-16、5 T4、NaPi2b、ROR1、ROR2、PLIF、Her2/Neu、EGFRvIII、GPMNB、LIV-1、糖脂F77、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、PSMA、STEAP-1、STEAP-2、c-Met、CSPG4、CD44v6、PVRL-4、VEGFR2、C4.4a、PSCA、叶酸结合蛋白/受体、SLC44A4、Cripto、CTAG1B、AXL、IL-13Rα2、IL-3R、EPHA3、SLTRK6、gp100、MART1、酪氨酸酶、SSX2、SSX4、NYESO-1、上皮肿瘤抗原(ETA)、MAGEA家族基因(诸如MAGEA3、MAGEA4)、KKLC1、突变ras(H、N、K)、BRaf、p53、β连环蛋白、EGFRT790、MHC I类链相关分子A(MICA)或MHC I类链相关分子B(MICB)，或者HPV、CMV或EBV中的一种或多种抗原。
在一些情况下，肿瘤识别部分靶向与肿瘤相关肽复合的MHC I类分子(HLA-A、HLA-B或HLA-C)。用于产生和使用靶向与MHC I类分子复合的肿瘤相关肽的肿瘤识别部分的方法和组合物包括Weidanz等人，Int.Rev.Immunol.30：328-40，2011；Scheinberg等人，Oncotarget.4(5)：647-8，2013；Cheever等人，Clin.Cancer Res.15(17)：5323-37，2009；Dohan&Reiter Expert Rev Mol Med.14：e6，2012；Dao等人，Sci Transl Med.2013年3月13日；5(176)：176ra33；U.S.9,540,448；以及WO 2017/011804所述的那些。在一些实施方案中，肽MHC复合物的被靶向的肿瘤相关肽是以下肽：威尔姆氏(Wilms’)肿瘤蛋白1(WT1)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、生存素、小鼠双微体2同源物(MDM2)、细胞色素P450(CYP1B)、KRAS或BRAF。
两个或更多个肿瘤识别部分可在γδT细胞中由从工程改造的γδT细胞稳定表达的遗传上不同的、基本上不同的或基本上相同的αβTCR多核苷酸，或由稳定整合进工程改造的γδT细胞的遗传上不同的αβTCR多核苷酸表达。就遗传上不同的αβTCR而言，可利用识别与相同病状相关的不同抗原的αβTCR。在一个优选实施方案中，γδT细胞被工程改造成表达来自一个或多个表达盒的人或小鼠来源的不同TCR，所述表达盒在不同的MHC单体型的背景下识别相同的抗原。在另一个优选实施方案中，γδT细胞被工程改造成表达针对来自与不同的MHC单体型复合的给定抗原的相同或不同肽的一种TCR和两种或更多种抗体。在一些情况下，通过工程改造的γδT细胞表达单一TCR促进了正确的TCR配对。表达不同TCR的工程改造的γδT细胞可以提供通用的同种异体的工程改造的γδT细胞。在第二优选实施方案中，γδT细胞被工程改造成表达针对肽-MHC复合物的一种或多种不同的抗体，每种抗体针对与相同的或不同的MHC单体型复合的相同的或不同的肽。在一些情况下，肿瘤识别部分可以是结合至肽-MHC复合物的抗体。
γδT细胞可以被工程改造成表达来自一个或多个表达盒的TCR，所述表达盒在不同的MHC单体型的背景下识别相同的抗原。在一些情况下，工程改造的γδT细胞被设计成表达单个TCR，或与CAR组合的TCR，以使工程改造的细胞内TCR错配的可能性最小化。由两个或更多个表达盒表达的肿瘤识别部分优选地具有不同的多核苷酸序列，并且编码例如在不同的HLA单体型的背景下识别相同靶标的不同表位的肿瘤识别部分。表达这种不同TCR或CAR的工程改造的γδT细胞可以提供通用的同种异体的工程改造的γδT细胞。
在一些情况下，γδT细胞被工程改造成表达一个或多个肿瘤识别部分。两个或更多个肿瘤识别部分可在γδT细胞中由遗传上相同的或基本上相同的工程改造的抗原特异性嵌合(CAR)多核苷酸表达。两个或更多个肿瘤识别部分可在γδT细胞中由遗传上不同的工程改造的CAR多核苷酸表达。遗传上不同的CAR可被设计成识别与相同病状相关的不同抗原。
γδT细胞可以可替代地是双特异性的。双特异性的工程改造的γδT细胞可以表达两个或更多个肿瘤识别部分。双特异性的工程改造的γδT细胞可以表达TCR和CAR肿瘤识别部分。双特异性的工程改造的γδT细胞可以被设计成识别与相同病状相关的不同抗原。工程改造的γδT细胞可以表达识别相同或基本上相同的抗原的两个或更多个CAR/TCR双特异性多核苷酸。工程改造的γδT细胞可以表达识别不同抗原的两个或更多个CAR/TCR双特异性构建体。在一些情况下，本公开的双特异性构建体结合至靶细胞的活化和失活结构域，从而提供增加的靶标特异性。γδT细胞可被工程改造成表达至少1个肿瘤识别部分、至少2个肿瘤识别部分、至少3个肿瘤识别部分、至少4个肿瘤识别部分、至少5个肿瘤识别部分、至少6个肿瘤识别部分、至少7个肿瘤识别部分、至少8个肿瘤识别部分、至少9个肿瘤识别部分、至少10个肿瘤识别部分、至少11个肿瘤识别部分、至少12个肿瘤识别部分，或另一合适数量的肿瘤识别部分。
可通过包含ITAM基序的两种功能性ζ(zeta)蛋白来增强适当的TCR功能。还可通过αβ或γδ活化结构域(诸如CD3ζ、CD28、CD2、CTLA4、ICOS、JAML、PD-1、CD27、CD30、41-BB、OX40、NKG2D、HVEM、CD46、CD4、FcεRIγ、IL-2RB/CD122、IL-2RG/CD132、DAP分子和CD70)的表达增强适当的TCR功能。表达的多核苷酸可包含肿瘤识别部分、接头部分和活化结构域的遗传密码。通过工程改造的γδT细胞翻译多核苷酸可提供由蛋白质接头连接的肿瘤识别部分和活化结构域。通常，接头包含不阻碍肿瘤识别部分和活化结构域的折叠的氨基酸。接头分子的长度可以为至少约5个氨基酸、约6个氨基酸、约7个氨基酸、约8个氨基酸、约9个氨基酸、约10个氨基酸、约11个氨基酸、约12个氨基酸、约13个氨基酸、约14个氨基酸、约15个氨基酸、约16个氨基酸、约17个氨基酸、约18个氨基酸、约19个氨基酸，或约20个氨基酸。在一些情况下，接头中至少50％、至少70％或至少90％的氨基酸为丝氨酸或甘氨酸。
在一些情况下，活化结构域可以包含一个或多个突变。合适的突变可以是例如赋予活化结构域以组成型活性的突变。改变一种或多种核酸的同一性改变了所翻译氨基酸的氨基酸序列。可以进行核酸突变，使得编码的氨基酸被修饰为极性的、非极性的、碱性或酸性氨基酸。可以进行核酸突变，使得肿瘤识别部分被优化为识别来自肿瘤的表位。γδT细胞的工程改造的肿瘤识别部分、工程改造的活化结构域或另一工程改造的组分可包括多于1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变、7个氨基酸突变、8个氨基酸突变、9个氨基酸突变、10个氨基酸突变、11个氨基酸突变、12个氨基酸突变、13个氨基酸突变、14个氨基酸突变、15个氨基酸突变、16个氨基酸突变、17个氨基酸突变、18个氨基酸突变、19个氨基酸突变、20个氨基酸突变、21个氨基酸突变、22个氨基酸突变、23个氨基酸突变、24个氨基酸突变、25个氨基酸突变、26个氨基酸突变、27个氨基酸突变、28个氨基酸突变、29个氨基酸突变、30个氨基酸突变、31个氨基酸突变、32个氨基酸突变、33个氨基酸突变、34个氨基酸突变、35个氨基酸突变、36个氨基酸突变、37个氨基酸突变、38个氨基酸突变、39个氨基酸突变、40个氨基酸突变、41个氨基酸突变、42个氨基酸突变、43个氨基酸突变、44个氨基酸突变、45个氨基酸突变、46个氨基酸突变、47个氨基酸突变、48个氨基酸突变、49个氨基酸突变或50个氨基酸突变。
在一些情况下，本公开的γδT细胞不表达一种或多种MHC分子。工程改造的γδT细胞中一个或多个MHC基因座的缺失可以降低工程改造的γδT细胞将被宿主免疫系统识别的可能性。人主要组织相容性复合物(MHC)基因座(称为人白细胞抗原(HLA)系统)包含在抗原呈递细胞(包括γδT细胞)中表达的大基因家族。HLA-A、HLA-B和HLA-C分子的作用是提供作为抗原呈递细胞的抗原的胞内肽。HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR分子的作用是提供作为抗原呈递细胞的抗原的胞外肽。HLA基因的一些等位基因与GVHD、自身免疫病症和癌症相关。本文所述的工程改造的γδT细胞可以进一步被工程改造成缺乏或破坏一个或多个HLA基因的基因表达。本文所述的工程改造的γδT细胞可以进一步工程改造成缺乏或破坏MHC复合物的一种或多种组分的基因表达，诸如一个或多个MHC基因的完全缺失、特定外显子的缺失，或β2微球蛋白(B2m)的缺失。至少一个HLA基因的基因切除或基因断裂可以提供临床治疗性γδT细胞，所述γδT细胞可以施用于具有任何HLA单体型的受试者，而不导致宿主对抗移植物疾病。如本文所述的工程改造的γδT细胞可以是具有任何HLA单体型的人受试者的通用供体。
γδT细胞可以被工程改造成缺乏一个或多个HLA基因座(基因座位)。工程改造的γδT细胞可以被工程改造成缺乏HLA-A等位基因、HLA-B等位基因、HLA-C等位基因、HLA-DR等位基因、HLA-DQ等位基因或HLA-DP等位基因。在一些情况下，HLA等位基因与人病状(诸如自身免疫病状)相关。例如，HLA-B27等位基因与关节炎和葡萄膜炎相关，HLA-DR2等位基因与全身性红斑狼疮和多发性硬化相关，HLA-DR3等位基因与21-羟化酶缺乏相关，HLA-DR4与类风湿性关节炎和1型糖尿病相关。缺乏例如HLA-B27等位基因的工程改造的γδT细胞可以施用于患有关节炎的受试者，而不容易被受试者的免疫系统识别。在一些情况下，一个或多个HLA基因座的缺失提供了工程改造的γδT细胞，其为具有任何HLA单体型的任何受试者的通用供体。
在一些情况下，工程改造γδT细胞需要缺失γδT细胞基因组的一部分。在一些情况下，基因组的缺失部分包含MHC基因座(基因座位)的一部分。在一些情况下，工程改造的γδT细胞来源于野生型人γδT细胞，并且MHC基因座是HLA基因座。在一些情况下，基因组的缺失部分包含MHC复合物中的蛋白质对应的基因的一部分。在一些情况下，基因组的缺失部分包含β2微球蛋白基因。在一些情况下，基因组的缺失部分包含免疫检查点基因，诸如PD-1、CTLA-4、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、TIM3、A2aR、B7-H3、B7-H4和CECAM-1。在一些情况下，工程改造的γδT细胞可以被设计成表达增强T细胞活化和细胞毒性的活化结构域。可由工程改造的γδT细胞表达的活化结构域的非限制性实例包括：CD2、ICOS、4-1 BB(CD137)、OX40(CD134)、CD27、CD70、CD80、CD86、DAP分子、CD122、GITR、FcεRIγ。
工程改造的γδT细胞的基因组的任何部分可以被缺失，以破坏内源性γδT细胞基因的表达。γδT细胞的基因组中可以缺失或破坏的基因组区域的非限制性实例包括启动子、活化子、增强子、外显子、内含子、非编码RNA、微RNA、小核RNA、可变数量串联重复序列(VNTR)、短串联重复序列(STR)、SNP图谱、高变区、小卫星序列、二核苷酸重复序列、三核苷酸重复序列、四核苷酸重复序列，或简单重复序列。在一些情况下，基因组的缺失部分的范围在1个核酸至约10个核酸、1个核酸至约100个核酸、1个核酸至约1,000个核酸、1个核酸至约10,000个核酸、1个核酸至约100,000个核酸、1个核酸至约1,000,000个核酸之间，或其他合适的范围。
工程改造的γδT细胞中的HLA基因表达也可以通过本领域已知的各种技术破坏。在一些情况下，大基因座基因编辑技术用于从工程改造的γδT细胞基因组切除基因，或破坏工程改造的γδT细胞中的至少一个HLA基因座的基因表达。可用于编辑工程改造的γδT细胞的基因组上的期望基因座的基因编辑技术的非限制性实例包括分别如WO201409370、WO2003087341、WO2014134412和WO 2011090804(这些专利中的每一个以引用方式整体并入本文)所述的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)以及大范围核酸酶技术。
γδT细胞可由已表达肿瘤识别部分的分离的非工程改造的γδT细胞工程改造。工程改造的γδT细胞可以保持由分离的野生型γδT细胞(例如，从肿瘤样品的肿瘤浸润性淋巴细胞分离)内源性表达的肿瘤细胞识别部分。在一些情况下，工程改造的γδT细胞肿瘤细胞识别部分替代野生型γδTCR。
γδT细胞可以被工程改造成表达一种或多种归巢分子，诸如淋巴细胞归巢分子。归巢分子可以是例如淋巴细胞归巢受体或细胞粘附分子。归巢分子可以在工程改造的γδT细胞施用于受试者时帮助工程改造的γδT细胞迁移和浸润实体肿瘤(包括靶向的实体肿瘤)。归巢受体的非限制性实例包括CCR家族成员，例如：CCR2、CCR4、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CLA、CD44、CD103、CD62L、E-选择素、P-选择素、L-选择素、整联蛋白(诸如VLA-4和LFA-1)。细胞粘附分子的非限制性实例包括ICAM、N-CAM、VCAM、PE-CAM、L1-CAM、粘连蛋白(PVRL1、PVRL2、PVRL3)、LFA-1、整联蛋白αXβ2、αvβ7、巨噬细胞-1抗原、CLA-4、糖蛋白IIb/IIIa。细胞粘附分子的另外实例包括钙依赖性分子(诸如T-钙粘蛋白)，以及基质金属蛋白酶(MMP)(诸如MMP9或MMP2)的抗体。
涉及T细胞成熟、活化、增殖和功能的步骤可通过共刺激和抑制信号经由免疫检查点蛋白调控。免疫检查点是免疫系统固有的共刺激和抑制元件。免疫检查点有助于维持自身耐受性和调节生理免疫应答的持续时间和幅度，以在免疫系统对疾病状况(诸如细胞转化或感染)作出响应时防止组织损伤。用于控制来自γδ和αβT细胞的免疫应答的共刺激和抑制信号之间的平衡可由免疫检查点蛋白调节。免疫检查点蛋白(诸如PD1和CTLA4)存在于T细胞的表面上，并且可用于“开启”或“关闭”免疫应答。肿瘤可以使作为免疫耐受机制的检查点蛋白功能失调，特别是对肿瘤抗原具有特异性的T细胞。本公开的工程改造的γδT细胞可以进一步被工程改造成缺乏一个或多个免疫检查点基因座(基因座位)，诸如PD-1、CTLA4、LAG3、ICOS、BTLA、KIR、TIM3、A2aR、CEACAM1、B7-H3和B7-H4。可替代地，可以通过基因编辑技术破坏内源性免疫检查点基因在本公开的工程改造的γδT细胞中的表达。
免疫检查点可以是本公开的工程改造的γδT细胞中调节抑制信号传导通路的分子(通过CTLA4、PD1和LAG3例示)或调节刺激信号传导通路的分子(通过ICOS例示)。扩展免疫球蛋白超家族中的几种蛋白质可以是免疫检查点的配体。免疫检查点配体蛋白的非限制性实例包括B7-H4、ICOSL、PD-L1、PD-L2、MegaCD40L、MegaOX40L和CD137L。在一些情况下，免疫检查点配体蛋白是由肿瘤表达的抗原。在一些情况下，免疫检查点基因是CTLA-4基因。在一些情况下，免疫检查点基因是PD-1基因。
PD1是属于CD28/CTLA4家族的抑制性受体，并在活化的T淋巴细胞、B细胞、单核细胞、DC和调节T细胞上表达。存在两种已知的PD1配体，即PD-L1和PD-L2，它们在T细胞、APC和恶性细胞上表达，其作用是抑制自体反应性淋巴细胞和抑制TAA特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的效应功能。因此，缺乏PD1的工程改造的γδT细胞可以保持其细胞毒性活性，无论肿瘤细胞是否表达PD-L1和PD-L2。在一些情况下，本公开的工程改造的γδT细胞缺乏PD-1基因的基因座。在一些情况下，通过基因编辑技术破坏PD-1基因在工程改造的γδT细胞中的表达。
CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞抗原4)也称为CD152(分化簇152)。CTLA4与共刺激分子CD28共有序列同源性和配体(CD80/B7-1和CD86/B7-2)，但不同之处在于将抑制信号递送至表达作为受体的CTLA4的T细胞。CTLA4对两种配体的总体亲和力更高，并且当配体密度有限时，可以在与CD28的结合竞争中胜出。CTLA4通常在CD8+效应T细胞的表面上表达，并且在初始和记忆T细胞的初始活化阶段中发挥功能作用。CTLA4在T细胞活化的早期通过增加对CD80和CD86的亲和力来抵消CD28的活性。CTLA4的主要功能包括下调辅助T细胞和增强调节T细胞的免疫抑制活性。在一些情况下，本公开的工程改造的γδT细胞缺乏CTLA4基因。在一些情况下，通过基因编辑技术破坏CTLA4基因在工程改造的γδT细胞中的表达。
LAG3(淋巴细胞活化基因3)在活化的抗原特异性细胞毒性T细胞上表达，并且可增强调节T细胞的功能并独立地抑制CD8+效应T细胞活性。LAG3是对MHC II类蛋白的结合具有高亲和力的CD-4样负调控蛋白，它们在一些上皮癌症中上调，引起T细胞增殖和稳态的耐受性。使用LAG-3-IG融合蛋白减少LAG-3/II类相互作用可增强抗肿瘤免疫应答。在一些情况下，本公开的工程改造的γδT细胞缺乏LAG3基因的基因座。在一些情况下，通过基因编辑技术破坏LAG3基因在工程改造的γδT细胞中的表达。
非工程改造的和工程改造的γδT细胞的表型
工程改造的γδT细胞可归巢至受试者体内的特定物理位置。工程改造的γδT细胞的迁移和归巢可以取决于特定趋化因子和/或粘附分子的组合表达和作用。工程改造的γδT细胞的归巢可以由趋化因子与其受体之间的相互作用控制。例如，细胞因子(包括但不限于CXCR3(其配体以IP-10/CXCL10和6Ckine/SLC/CCL21表示)、CCR4+、CXCR5+(RANTES、MIP-1α、MIP-1β的受体)、CCR6+和CCR7)可影响工程改造的γδT细胞的归巢。在一些情况下，工程改造的γδT细胞可归巢至炎症和损伤部位以及疾病细胞以执行修复功能。在一些情况下，工程改造的γδT细胞可归巢至癌症。在一些情况下，工程改造的γδT细胞可归巢至胸腺、骨髓、皮肤、喉、气管、胸膜、肺、食道、腹部、胃、小肠、大肠、肝、胰腺、肾、尿道、膀胱、睾丸、前列腺、输精管、卵巢、子宫、乳腺、甲状旁腺、脾或受试者身体的另一部位。工程改造的γδT细胞可表达一个或多个归巢部分，诸如特定的TCR等位基因和/或淋巴细胞归巢分子。
工程改造的γδT细胞可具有特定表型，并且表型可以根据细胞表面标志物表达来描述。各种类型的γδT细胞可以如本文所述进行工程改造。在优选实施方案中，工程改造的γδT细胞来源于人，但工程改造的γδT细胞也可来源于不同来源，诸如哺乳动物或合成细胞。
可使用标志物(包括但不限于CD27、CD45RA、CD45RO、CCR7和CD62L)确定扩增细胞群的免疫表型(Klebanoff等人，Immunol Rev.211：2142006)。CD45RA在初始T淋巴细胞上表达，当抗原遇到时被CD45RO替换，但在晚期效应细胞中重新表达(Michie等人，Nature 360，264-265(1992)；CD62L是充当归巢分子进入次级淋巴组织的细胞粘附分子，并且在T细胞活化后丢失，此时T细胞获得效应功能(Sallusto等人，Nature.401：708(1999)；CD27是在T细胞分化期间丢失的共刺激标志物(Appay等人，Nat Med.8：379(2002)；Klebanoff等人，Immunol Rev.211：2142006)。
抗原
本文公开的发明提供一种表达抗原识别部分的工程改造的γδT细胞，其中抗原识别部分识别疾病特异性表位。抗原可以是引发免疫应答的分子。此免疫应答可涉及抗体产生、特定免疫感受态细胞的活化，或两者。抗原可以是例如肽、蛋白质、半抗原、脂质、碳水化合物、细菌、病原体或病毒。抗原可以是肿瘤抗原。肿瘤表位可由肿瘤细胞表面上的MHC I或MHC II复合物呈递。表位可以是在细胞表面上表达并且由肿瘤识别部分识别的抗原的一部分。
工程改造的γδT细胞识别的抗原的非限制性实例包括CD19、CD20、CD30、CD22、CD37、CD38、CD56、CD33、CD138、CD123、CD79b、CD70、CD75、CA6、GD2、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、RON、CEACAM5、CA-125、MUC-16、5T4、NaPi2b、ROR1、ROR2、PLIF、Her2/Neu、EGFRvIII、GPMNB、LIV-1、糖脂F77、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、PSMA、STEAP-1、STEAP-2、间皮素、c-Met、CSPG4、PVRL-4、VEGFR2、PSCA、CLEC12a、L1CAM、GPC2、GPC3、叶酸结合蛋白/受体、SLC44A4、Cripto、CTAG1B、AXL、IL-13R、IL-3Rα2、SLTRK6、gp100、MART1、酪氨酸酶、SSX2、SSX4、NYESO-1、WT-1、PRAME、上皮肿瘤抗原(ETA)、MAGEA家族基因(诸如MAGEA3、MAGEA4)、KKLC1、突变ras、□□af、p53、MHC I类链相关分子A(MICA)或MHC I类链相关分子B(MICB)，或者HPV、CMV或EBV中的一种或多种抗原。
抗原可以在细胞的胞内或胞外区室中表达，并且工程改造的γδT细胞可以识别胞内或胞外肿瘤抗原。在一些情况下，工程改造的γδT细胞中的αβTCR识别来源于胞内或胞外肿瘤抗原的肽。例如，抗原可以是由病毒感染的细胞胞内或胞外产生的蛋白质，诸如HIV、EBV、CMV或HPV蛋白。抗原也可以是由癌细胞胞内或胞外表达的蛋白质。
抗原识别部分可识别来自窘迫期细胞(诸如癌细胞或被病毒感染的细胞)的抗原。例如，人MHC I类链相关基因(MICA和MICB)位于染色体6的HLA I类区域内。MICA和MICB蛋白被视为人上皮细胞中的“应激”标志物，并且充当表达常见自然杀伤细胞受体(NKG2D)的细胞的配体。作为应激标志物，MICA和MICB可以从癌细胞高表达。工程改造的γδT细胞可以识别MICA或MICB肿瘤表位。
肿瘤识别部分可被工程改造成以一定亲合力识别抗原。例如，由TCR或CAR构建体编码的肿瘤识别部分可以至少至少10fM、至少100fM、至少1皮摩尔(pM)、至少10pM、至少20pM、至少30pM、至少40pM、至少50pM、至少60pM、至少7pM、至少80pM、至少90pM、至少100pM、至少200pM、至少300pM、至少400pM、至少500pM、至少600pM、至少700pM、至少800pM、至少900pM、至少1纳摩尔(nM)、至少2nM、至少3nM、至少4nM、至少5nM、至少6nM、至少7nM、至少8nM、至少9nM、至少10nM、至少20nM、至少30nM、至少40nM、至少50nm、至少60nM、至少70nM、至少80nM、至少90nM、至少100nM、至少200nM、至少300nM、至少400nM、至少500nM、至少600nM、至少700nM、至少800nM、至少900nM、至少1μM、至少2μM、至少3μM、至少4μM、至少5μM、至少6μM、至少7μM、至少8μM、至少9μM、至少10μM、至少20μM、至少30μM、至少40μM、至少50μM、至少60μM、至少70μM、至少80μM、至少90μM或至少100μM的解离常数识别抗原。
在一些情况下，肿瘤识别部分可被工程改造成以至多10fM、至多100fM、至多1皮摩尔(pM)、至多10pM、至多20pM、至多30pM、至多40pM、至多50pM、至多60pM、至多7pM、至多80pM、至多90pM、至多100pM、至多200pM、至多300pM、至多400pM、至多500pM、至多600pM、至多700pM、至多800pM、至多900pM、至多1纳摩尔(nM)、至多2nM、至多3nM、至多4nM、至多5nM、至多6nM、至多7nM、至多8nM、至多9nM、至多10nM、至多20nM、至多30nM、至多40nM、至多50nm、至多60nM、至多70nM、至多80nM、至多90nM、至多100nM、至多200nM、至多300nM、至多400nM、至多500nM、至多600nM、至多700nM、至多800nM、至多900nM、至多1μM、至多2μM、至多3μM、至多4μM、至多5μM、至多6μM、至多7μM、至多8μM、至多9μM、至多10μM、至多20μM、至多30μM、至多40μM、至多50μM、至多60μM、至多70μM、至多80μM、至多90μM或至多100μM的解离常数识别抗原。
新型活化剂
本发明的发明人鉴定了结合γδTCR的特定亚型并从而活化和扩增特定γδT细胞群的活化剂。在一个方面，本发明提供了结合本文在实施例1和2以及图1中鉴定和描述的新型活化表位的新型活化剂。活化剂包括但不限于MAbδ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58。在某些实施方案中，活化剂(例如，抗体)扩增和/或活化一个或多个γδT细胞群(例如，δ3 T细胞)。
这些活化剂还包括但不限于与一种或多种MAb结合相同表位或竞争的活化剂，所述MAb选自由以下组成的组：δ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58。
这些活化剂还包括但不限于含有MAb的互补决定区(CDR)和/或可变区的活化剂，所述MAb选自由以下组成的组：δ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58。
本发明还提供了一种编码活化剂的核酸，所述活化剂：(i)含有MAb的互补决定区(CDR)和/或可变区；(ii)与MAb结合相同的表位或与MAb竞争；或(iii)是MAb，所述MAb选自由以下组成的组：δ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58。在一些情况下，核酸在宿主细胞(例如，异源性宿主细胞)中。在一些情况下，核酸可操作地连接至异源性启动子或可操作地连接至编码异源性多肽的核酸。如本文所用，术语“异源性”是指天然不共同存在于自然界中的两种组分。
本发明还提供了产生一种或多种前述活化剂的方法。例如，可以培养含有编码活化剂的核酸的宿主细胞，以产生一种或多种前述活化剂。
APC
本文还描述了用于扩增工程改造的或非工程改造的γδT细胞(诸如一个或多个γδT细胞子群)的APC。在一些实施方案中，本文描述了含有编码一种或多种前述活化剂的异源性核酸的APC。在一些实施方案中，本文描述了在细胞表面上表达一种或多种前述活化剂的APC。在一些实施方案中，本文描述了在其细胞表面上表达一种或多种Fc受体的APC，其中一种或多种Fc受体接触和/或结合一种或多种前述活化剂。
在一些情况下，APC(例如，在细胞表面上表达一种或多种前述活化剂，处于细胞表面上或结合至在细胞表面上表达的Fc受体的APC)不表达HLA I类、HLA I类、不变链和/或HLA-DM，或表现出HLA I类、HLA I类、不变链和/或HLA-DM的表达减少。在一些情况下，APC表达粘附分子，诸如细胞间粘附分子1、CD11a、CD18、CD54和/或白细胞功能相关抗原3。在一些情况下，APC表达Fc受体，诸如对用于本文所述的γδT细胞扩增方法的活化剂的同种型具有特异性的Fc受体。在一些情况下，APC表达选自由以下组成的组的一种或多种Fc受体：CD64、CD32A、CD32B、CD32C、CD16A、CD16B、FcRn、TRIM21或CD307，或其具有更高亲和力或改变的特异性的工程改造的变体。
本文还描述了包含一种或多种前述APC的培养物。培养物还可以含有扩增的或未扩增的、工程改造的或非工程改造的γδT细胞。培养物可以另外或可替代地含有选择性或非选择性γδT细胞活化剂，包括本文所述的任何一种γδT细胞活化剂。在一些情况下，培养物不含有IL-21。在一些情况下，培养物不含有IL-4、IL-2或IL-15，或其组合。在一些情况下，培养物不含有选择性扩增γδT细胞子群的细胞因子。
表位鉴定
本发明的发明人已鉴定了γδTCR活化MAbδ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58的表位内的结合区。示例性表位包括但不限于γδTCR活化MAbδ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58的表位。在一些实施方案中，表位是由一种或多种γδTCR活化MAbδ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58特异性结合的表位。
在一个方面，本公开提供了一种用于鉴定刺激工程改造的和非工程改造的γδT细胞以快速生长速率扩增的药剂的表位的方法。表位可包括处于独特空间构象的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。表位可由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常可在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常可在用变性溶剂处理时丧失。
可进行表位作图以鉴定线性或非线性、不连续氨基酸序列，即由感兴趣的活化剂(诸如δ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58抗体)(例如，特异性)识别的表位。用于表位作图的一般方法可需要由感兴趣的抗体或配体以及各种片段(即，多肽序列的截短形式，通常在异源性表达系统中)识别的全长多肽序列的表达。然后可使用这些各种重组多肽序列或其片段(例如，与N末端蛋白(例如，GFP)融合)确定感兴趣的抗体或配体是否能够结合多肽序列的一种或多种截短形式。
在一些实施方案中，重组多肽序列是含有两个或更多个同源亲本多肽的连接片段的嵌合体，其中至少一个亲本多肽结合感兴趣的活化剂，并且至少一个亲本多肽不结合感兴趣的活化剂。例如，人δ3链基因的区段可以与同源的海豚(或其他非人动物)δ链基因的区段连接，并测试在重组表达系统中生成嵌合TCR的能力。人δ3链基因的另外片段可以与不同δ链亚型的区段连接。然后可以测试形成TCR(例如，由细胞表面上的泛γδ-TCR抗体的检测来指示)的嵌合TCR基因与感兴趣的活化剂的结合。
通过使用重复截短和具有重叠氨基酸区域的重组多肽序列的产生，可以鉴定由感兴趣的抗体识别的多肽序列的区域(参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methodsin Molecular Biology，第66卷，Glenn E.Morris编(1996))。该方法依赖于药剂(诸如感兴趣的抗体)结合由表位文库(诸如来源于膜支持物上的合成肽阵列、组合噬菌体展示肽文库的表位文库)重新创建的序列的能力。然后，表位文库提供针对抗体进行筛选的一系列可能性。另外，可以进行靶向表位的一个或多个残基的位点特异性诱变或随机Ala扫描，以确认表位的同一性。
通过将γδT细胞受体(γδTCR)的各种可能重组合成设计为cDNA构建体并在合适的系统中表达，可以创建表位文库。例如，可以合成设计在其Jδ区中不同的多个Vδ3基因区段，包括Jδ1、Jδ2和Jδ3基因区段。此类Vδ3J区段可以例如以合成基因的形式排序并克隆到合适载体中。多个合成克隆的δ3 TCR链(诸如Vδ3J1、Vδ3J2、Vδ3J3或Vδ3J4链)可以与合成克隆的γTCR链(诸如Vγ2、Vγ3、Vγ4、Vγ5、Vγ8、Vγ9和Vγ10合成设计的基因区段)一起共转染到宿主系统中。在其他情况下，可以由从人PBMC提取的总RNA或从人正常和恶性组织分离的γδT细胞扩增出δTCR链。
宿主系统可以是任何合适的表达系统(诸如293细胞、昆虫细胞)或合适的体外翻译系统。转染到宿主系统中的合成设计的γδT细胞区段的多种可能的重组可以提供，例如，γδTCR的超过25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90种可能的配对组合。药剂与前述文库中的一个表位的结合可以通过使标记抗体(诸如δ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58)与文库的表位接触，并检测来自标记的信号来检测。可替代地，可以使用标记的二抗(诸如抗小鼠抗体)检测药剂的结合。
对于表位作图，还开发了已显示出标绘构象不连续表位的计算算法。构象表位可以通过使用包括例如x射线晶体学和二维核磁共振的方法确定氨基酸的空间构象来鉴定。一些表位作图方法，诸如抗原：抗体复合物晶体的x射线分析，可以提供表位的原子解析。在其他情况下，可以利用表位作图的计算组合方法，基于抗体(诸如δ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47或δ3-58抗体)的序列对可能的表位建模。在这种情况下，对抗体的抗原结合部分测序，并使用计算模型重建和预测抗体的可能结合位点。
在一些情况下，本公开提供了一种确定γδT细胞受体的表位的方法，包括：(a)由γδT细胞受体制备表位的文库；(b)使表位的文库与抗体接触；以及(b)鉴定表位文库中由抗体结合的至少一个表位的氨基酸序列。在一些情况下，抗体选自由δ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58抗体组成的组。在一个实例中，抗体附接于固体支持物。表位的文库可包含对应于T细胞受体(诸如γTCR或δTCR)的连续和不连续表位的序列。在一些情况下，表位的文库包含长度在约10个氨基酸至约30个氨基酸的范围内、长度在约10个氨基酸至约20个氨基酸的范围内，或长度在约5个氨基酸至约12个氨基酸的范围内的来自γδT细胞受体的片段。在一些情况下，抗体是标记的，并且标记是放射性分子、发光分子、荧光分子、酶或生物素。
δ3表位仓
在一些实施方案中，目标活化剂与一种或多种仓1A抗体δ3-23、δ3-42和/或δ3-58竞争结合γ2δ3TCR。在一些实施方案中，目标活化剂与仓1B抗体δ3-08竞争结合γ2δ3 TCR。在一些实施方案中，目标活化剂与一种或多种仓1(仓1A和仓1B)抗体δ3-23、δ3-42、δ3-58和/或δ3-08竞争结合γ2δ3TCR。在一些实施方案中，目标活化剂与仓2抗体δ3-31竞争结合γ2δ3TCR。
通常，本文所述的δ3特异性抗体在γδ-TCR的背景下识别构象表位。在一些情况下，本文所述的δ3特异性抗体分别对一对或多对γδ3-TCR具有特异性。例如，在一些情况下，本文所述的δ3特异性抗体对γ2δ3-TCR具有特异性。
治疗方法
可施用含有如本文所述的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物的药物组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗应用中，组合物可以足以治愈或至少部分阻止疾病或病状的症状的量施用给已患有疾病或病状的受试者。还可施用非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物，以降低发展、感染或恶化病状的可能性。一群非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物用于治疗用途的有效量可根据疾病或病状的严重程度和病程、先前疗法、受试者的健康状态、体重和/或对药物的反应，和/或主治医生的判断而变化。
本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可用于治疗需要治疗病状的受试者。病状的实例包括癌症、感染性疾病、自身免疫病症和败血症。受试者可以是人、非人灵长类动物，诸如黑猩猩以及其他猿类和猴类物种；农场动物，诸如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，诸如兔、狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，诸如大鼠、小鼠和豚鼠等等。受试者可以是任何年龄的。受试者可以是例如老年人、成人、青少年、青春前期少年、儿童、幼儿或婴儿。
使用本发明的富集的γδT细胞群治疗受试者的病状(例如，病痛)的方法可包括向受试者施用治疗有效量的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物。本公开的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以多种方案(例如，时间安排、浓度、剂量、治疗间间隔和/或制剂)施用。受试者也可以在接受本公开的富集的γδT细胞群和/或其掺和物之前使用例如化学疗法、放射或两者的组合进行预处理。作为治疗的一部分，非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以第一方案施用给受试者，并且可对受试者进行监测以确定第一方案的治疗是否达到给定的治疗功效水平。在一些情况下，工程改造的γδT细胞或另一工程改造的γδT细胞可以第二方案施用给受试者。图2示意性地例示了用于治疗受试者的方法。在第一操作201中，将至少一种工程改造的γδT细胞施用给患有或疑似患有给定病状(例如，癌症)的受试者。工程改造的γδT细胞可以第一方案施用。在第二操作202中，可例如由保健提供者(例如，主治医生或护士)监测受试者。在一些实例中，监测受试者以确定或计量工程改造的γδT细胞在治疗受试者病状中的功效。在一些情况下，还可监测受试者以确定受试者中γδT细胞群的体内扩增。接下来，在第三操作203中，将至少一种其他工程改造的γδT细胞以第二方案施用给受试者。第二方案可与第一方案相同或与第一方案不同。在一些情况下，不进行第三操作203，例如，如果发现第一操作201中工程改造的γδT细胞的施用有效(例如，单轮施用可足以治疗病状)的话。由于其同种异体和通用供体特征，工程改造的γδT细胞群可以不同的MHC单体型施用给多名受试者。工程改造的γδT细胞可以在施用给受试者之前冷冻或超低温保存。
富集的γδT细胞群(即，工程改造的或非工程改造的)和/或其掺和物也可在施用给受试者之前冷冻或超低温保存。在某些实施方案中，工程改造的富集的γδT细胞群可以包含两种或更多种表达相同的肿瘤识别部分、不同的肿瘤识别部分或相同的肿瘤识别部分和不同的肿瘤识别部分的组合的细胞。例如，工程改造的富集的γδT细胞群可以包含被设计成识别不同的抗原或相同抗原的不同表位的几种不同的工程改造的γδT细胞。例如，患有黑素瘤的人细胞可以表达NY-ESO-1癌基因。人体内的感染细胞可以将NY-ESO-1癌蛋白加工成较小的片段，并提供用于抗原识别的NY-ESO-1蛋白的多个部分。工程改造的富集的γδT细胞群可以包含表达不同的肿瘤识别部分的各种工程改造的γδT细胞，所述肿瘤识别部分被设计成识别NY-ESO-1蛋白的不同部分。图3示意性地例示了使用识别黑素瘤抗原NY-ESO-1的不同表位的工程改造的γδT细胞群治疗受试者的方法。在第一操作301中，选择识别相同抗原的不同表位的工程改造的γδT细胞群。例如，工程改造的γδT细胞群可包含两种或更多种表达不同的肿瘤识别部分的细胞，所述肿瘤识别部分识别NY-ESO-1蛋白的不同部分。在第二操作302中，工程改造的γδT细胞群可以第一方案施用。在第二操作303中，可例如由保健提供者(例如，主治医生或护士)监测受试者。
本公开的富集的γδT细胞群(即，非工程改造的或工程改造的)和/或其掺和物可用于治疗各种病状。在一些情况下，本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可用于治疗癌症(包括实体肿瘤和血液恶性肿瘤)。癌症的非限制性实例包括：急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、成神经细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤(诸如小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤)、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视路和下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特(Burkitt)淋巴瘤、原发部位不明癌症、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童期癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏肉瘤、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道基质肿瘤、神经胶质瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、卡波西氏(Kaposi)肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌(诸如非小细胞和小细胞肺癌)、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨恶性纤维性组织细胞瘤/骨肉瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性原发不明颈部鳞状细胞癌、口腔癌、多发性内分泌腺瘤综合征、骨髓增生异常综合征、骨髓性白血病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、上皮性卵巢癌、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、胰腺癌胰岛细胞、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、口咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、皮肤癌默克(merkel)细胞、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养叶肿瘤(妊娠)、原发部位不明的癌症、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症(
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macroglobulinemia)和威廉姆氏(Wilms)肿瘤。
在一些情况下，本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可用于治疗感染性疾病。感染性疾病可例如由病原性细菌或由病毒引起。各种病原性蛋白质、核酸、脂质或其片段可由病变细胞表达。抗原呈递细胞可以例如通过吞噬作用或通过受体介导的胞吞作用内化此类病原性分子，并且展示出结合至适当的MHC分子的抗原片段。例如，APC可展示出病原性蛋白的各种9聚物片段。本公开的工程改造的富集的γδT细胞群可被设计成识别病原性细菌或病毒的各种抗原和抗原片段。病原性细菌的非限制性实例可见于：a)博德特氏菌属(Bordetella)，诸如百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)种；b)疏螺旋体属(Borrelia)，诸如伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)种；c)布鲁氏菌属(Brucelia)，诸如流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、马尔他布鲁氏菌(Brucela meliterisis)和/或猪布鲁氏菌(Brucella suis)种；d)弯曲杆菌属(Campylobacter)，诸如空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)种；e)衣原体属(Chlamydia)和亲衣原体属(Chlamydophila)，诸如肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和/或鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)种；f)梭菌属(Clostridium)，诸如肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)种；g)棒状杆菌属(Corynebacterium)，诸如白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)种；h)肠球菌属(Enterococcus)，诸如粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和/或屎肠球菌(Enterococcus faecium)种；i)埃希氏菌属(Escherichia)，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)种；j)弗朗西斯氏菌属(Francisella)，诸如土拉热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)种；k)嗜血杆菌属(Haemophilus)，诸如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)种；1)螺杆菌属(Helicobacter)，诸如幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)种；m)军团菌属(Legionella)，诸如嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)种；n)钩端螺旋体属(Leptospira)，诸如问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)种；o)李斯特菌属(Listeria)，诸如单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)种；p)分枝杆菌属(Mycobacterium)，诸如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)和/或溃疡分枝杆菌(mycobacterium ulcerans)种；q)支原体属(Mycoplasma)，诸如肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia)种；r)奈瑟氏菌属(Neisseria)，诸如淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)和/或脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidia)种；s)假单胞菌属(Pseudomonas)，诸如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)种；t)立克次氏体属(Rickettsia)，诸如立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)种；u)沙门氏菌属(Salmonella)，诸如伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和/或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)种；v)志贺氏菌属(Shigella)，诸如宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)种；w)葡萄球菌属(Staphylococcus)，诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和/或腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)种；x)链球菌属(Streptpcoccus)，诸如无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)和/或酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)种；y)密螺旋体属(Treponema)，诸如梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)种；z)弧菌属(Vibrio)，诸如霍乱弧菌(Vibrio cholera)；和/或aa)耶尔森氏菌属(Yersinia)，诸如鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)种。
在一些情况下，本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可用于治疗感染性疾病，感染性疾病可由病毒导致。病毒的非限制性实例可见于以下病毒科，并用示例性种例示：a)腺病毒科(Adenoviridae)，诸如腺病毒种；b)疱疹病毒科(Herpesviridae)，诸如单纯疱疹1型、单纯疱疹2型、水痘-带状疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-barr)病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒8型种；c)乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)，诸如人乳头瘤病毒种；d)多瘤病毒科(Polyomaviridae)，诸如BK病毒、JC病毒种；e)痘病毒科(Poxviridae)，诸如天花种；f)肝病毒科(Hepadnaviridae)，诸如乙肝病毒种；g)细小病毒科(Parvoviridae)，诸如人博卡病毒、细小病毒B19种；h)星状病毒科(Astroviridae)，诸如人星状病毒种；i)杯状病毒科(Caliciviridae)，诸如诺沃克病毒种；j)黄病毒科(Flaviviridae)，诸如丙肝病毒(HCV)、黄热病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒种；k)披膜病毒科(Togaviridae)，诸如风疹病毒种；1)肝炎病毒科(Hepeviridae)，诸如戊肝病毒种；m)逆转录病毒科(Retroviridae)，诸如人免疫缺陷病毒(HIV)种；n)正黏液病毒科(Orthomyxoviridaw)，诸如流感病毒种；o)沙状病毒科(Arenaviridae)，诸如瓜纳瑞托(Guanarito)病毒、胡宁(Junin)病毒、拉沙(Lassa)病毒、马秋波(Machupo)病毒和/或萨比亚(Sabiá)病毒种；p)本雅病毒科(Bunyaviridae)，诸如克里米亚-刚果(Crimean-Congo)出血热病毒种；q)丝状病毒科(Filoviridae)，诸如埃博拉(Ebola)病毒和/或马尔堡(Marburg)病毒种；副黏液病毒科(Paramyxoviridae)，诸如麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、亨德拉(Hendra)病毒和/或尼帕(Nipah)病毒种；r)弹状病毒属(Rhabdoviridae)，诸如狂犬病病毒种；s)呼肠孤病毒科(Reoviridae)，诸如轮状病毒、环状病毒、科罗拉多蜱传热病毒和/或版纳(Banna)病毒种。在一些实例中，病毒未分配至病毒科，诸如丁型肝炎。
在一些情况下，本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可用于治疗免疫疾病，诸如自身免疫疾病。炎性疾病(包括自身免疫疾病)也是与B细胞病症相关的一类疾病。免疫疾病或病状(包括自身免疫病状)的实例包括：类风湿性关节炎、风湿热、多发性硬化、实验性自身免疫脑脊髓炎、牛皮癣、葡萄膜炎、糖尿病、全身性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、湿疹、硬皮病、多肌炎/硬皮病、多肌炎/皮肌炎、溃疡性直肠炎、严重联合免疫缺陷症(SCID)、迪乔治(DiGeorge)综合征、共济失调性毛细血管扩张症、季节性过敏、常年性过敏、食物过敏、过敏反应、肥大细胞增生症、过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、帕金森氏症、阿尔茨海默氏症、脾功能亢进、白细胞粘附缺陷、X连锁淋巴细胞增生性疾病、X连锁无丙种球蛋白血症、选择性免疫球蛋白A缺陷、高IgM综合征、HIV、自身免疫淋巴细胞增生性综合征、维斯科特-奥尔德里(Wiskott-Aldrich)综合征、慢性肉芽肿病、常见变异型免疫缺陷病(CVID)、高免疫球蛋白E综合征、桥本氏(Hashimoto’s)甲状腺炎、急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、辛登南氏(Sydenham’a)舞蹈症、重症肌无力、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、多形性红斑、gA肾病、高安氏(Takayasu’s)动脉炎、爱迪生氏(Addison’s)病、结节病、溃疡性结肠炎、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古巴斯捷氏(Goodpasture’s)综合征、闭塞性血栓血管炎、修格连氏(Sjogren’s)综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、慢性活动性肝炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳氏(Wegener’s)肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、骨髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、银屑病、纤维性肺泡炎和癌症。
使用本公开的γδT细胞群和/或其掺和物的治疗可在病状的临床发作之前、期间和之后提供给受试者。治疗可在疾病的临床发作之后1天、1周、6个月、12个月或2年后提供给受试者。治疗可以在疾病的临床发作之后提供给受试者，持续超过1天、1周、1个月、6个月、12个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更长时间。治疗可在疾病的临床发作之后提供给受试者，持续少于1天、1周、1个月、6个月、12个月或2年。治疗还可包括在临床试验中治疗人。治疗可以包括将包含本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物的药物组合物施用给受试者。
在一些情况下，本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物施用给受试者调节了受试者体内的内源性淋巴细胞的活性。在一些情况下，将非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物施用给受试者提供了内源性T细胞的抗原，并且可加强免疫应答。在一些情况下，记忆T细胞是CD4+T细胞。在一些情况下，记忆T细胞是CD8+T细胞。在一些情况下，将非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物施用给受试者活化了另一免疫细胞的细胞毒性。在一些情况下，其他免疫细胞是CD8+T细胞。在一些情况下，其他免疫细胞是自然杀伤T细胞。在一些情况下，将非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物施用给受试者抑制了调节T细胞。在一些情况下，调节T细胞是Fox3+Treg细胞。在一些情况下，调节T细胞是Fox3-Treg细胞。活性可由本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物调节的细胞的非限制性实例包括：造血干细胞；B细胞；CD4；CD8；红细胞；白细胞；树突状细胞，包括树突状抗原呈递细胞；白血球；巨噬细胞；记忆B细胞；记忆T细胞；单核细胞；自然杀伤细胞；嗜中性粒细胞；辅助T细胞；以及杀伤T细胞。
在大多数骨髓移植期间，环磷酰胺与全身辐射的组合通常用于防止受试者的免疫系统对移植物中的造血干细胞(HSC)产生排斥。在一些情况下，进行供体骨髓与白介素2(IL-2)的离体孵育，以增强供体骨髓中杀伤淋巴细胞的产生。白介素-2(IL-2)是野生型淋巴细胞的生长、增殖和分化必需的细胞因子。目前关于γδT细胞过继性转移到人体中的研究可需要γδT细胞和白介素2的共施用。然而，低剂量和高剂量的IL-2均可具有剧毒副作用。IL-2毒性可在多个器官/系统中表现出来，最显著的是心脏、肺、肾和中枢神经系统。在一些情况下，本公开提供了一种在不与细胞因子(诸如IL-2、IL-15、IL-12或IL-21)共施用的情况下，将非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物施用给受试者的方法。在一些情况下，非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以在不与IL-2共施用的情况下施用给受试者。在一些情况下，非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物在手术(诸如在不与IL-2共施用的情况下的骨髓移植)期间施用给受试者。
施用方法
本发明的一种或多种非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以任何顺序或同时施用给受试者。如果同时施用，则本发明的多种非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以单一、统一形式提供(诸如静脉内注射)，或以多种形式提供(例如作为多种静脉内输注、皮下注射或丸剂提供)。本发明的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以一起或分开包装于单个包装中或多个包装中。本发明的一种或全部非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以多次剂量给予。如果不同时施用，则多次剂量之间的时间安排可变化至多达约一周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或约一年。在一些情况下，在施用给受试者之后，本发明的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以在受试者的身体中体内扩增。可以冷冻非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物，以提供用于使用相同的细胞制剂进行的多次治疗的细胞。本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物，以及包含它们的药物组合物可以包装为试剂盒。试剂盒可包括非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物，以及包含它们的组合物的使用说明书(例如，书面说明书)。
在一些情况下，治疗癌症的方法包括向受试者施用治疗有效量的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物，其中所述施用治疗癌症。在一些实施方案中，施用治疗有效量的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物，持续至少约10秒、30秒、1分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年。在一些实施方案中，施用治疗有效量的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物，持续至少一周。在一些实施方案中，施用治疗有效量的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物，持续至少两周。
本文所述的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以在疾病或病状发生之前、期间或之后施用，并且施用含有非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物的药物组合物的时间安排可以变化。例如，非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以用作预防性用途，并且可以根据病状或疾病偏好连续施用给受试者，以便降低疾病或病状发生的可能性。非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以在症状的发作期间或之后尽快施用给受试者。非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物的施用可以在症状发作时立即、在症状发作的前3小时内、在症状发作的前6小时内、在症状发作的前24小时内、在症状发作的前48小时内或在症状发作的任何时期内开始。初始施用可以通过任何实用途径进行，诸如使用本文所述的任何制剂通过本文所述的任何途径进行。在一些实例中，本公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物的施用是静脉内施用。一次或多次剂量的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以在癌症、感染性疾病、免疫疾病、败血症发作或骨髓移植之后可行地尽快施用，并且持续治疗免疫疾病所需的时间长度，例如约24小时至约48小时、约48小时至约1周、约1周至约2周、约2周至约1个月、约1个月至约3个月。对于癌症的治疗，一次或多次剂量的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以在癌症发作之后以及在其他治疗之前或之后几年施用。在一些实例中，非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以施用至少约10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年或至少5年。每位受试者的治疗长度可以变化。
剂量
如本文所公开的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可配制为适于精确剂量的单次施用的单位剂型。在一些情况下，单位剂型包含另外的淋巴细胞。在单位剂型中，制剂被分成含有适量的一种或多种化合物的单位剂量。单位剂量可以是含有不连续量的制剂的包装的形式。非限制性实例为包装片剂或胶囊剂，以及小瓶或安瓿瓶中的粉剂。水性混悬剂组合物可以包装在单剂量不可重复开启式容器中。多剂量可重复开启式容器可以例如与防腐剂或不与防腐剂组合使用。在一些实例中，药物组合物不包含防腐剂。用于肠胃外注射的制剂可以单位剂型存在于例如安瓿瓶或具有防腐剂的多剂量容器中。
如本文所述的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物可以至少5个细胞、至少10个细胞、至少20个细胞、至少30个细胞、至少40个细胞、至少50个细胞、至少60个细胞、至少70个细胞、至少80个细胞、至少90个细胞、至少100个细胞、至少200个细胞、至少300个细胞、至少400个细胞、至少500个细胞、至少600个细胞、至少700个细胞、至少800个细胞、至少900个细胞、至少1 x 103个细胞、至少2 x 103个细胞、至少3 x 103个细胞、至少4 x 103个细胞、至少5 x 103个细胞、至少6 x 103个细胞、至少7x 103个细胞、至少8 x 103个细胞、至少9 x 103个细胞、至少1 x 104个细胞、至少2 x 104个细胞、至少3 x 104个细胞、至少4 x 104个细胞、至少5 x 104个细胞、至少6 x 104个细胞、至少7 x 104个细胞、至少8 x 104个细胞、至少9 x 104个细胞、至少1 x 105个细胞、至少2x 105个细胞、至少3 x 105个细胞、至少4 x 105个细胞、至少5 x 105个细胞、至少6 x 105个细胞、至少7 x 105个细胞、至少8 x 105个细胞、至少9 x 105个细胞、至少1 x 106个细胞、至少2 x 106个细胞、至少3 x 106个细胞、至少4 x 106个细胞、至少5 x 106个细胞、至少6x 106个细胞、至少7 x 106个细胞、至少8 x 106个细胞、至少9 x 106个细胞、至少1 x 107个细胞、至少2 x 107个细胞、至少3 x 107个细胞、至少4 x 107个细胞、至少5 x 107个细胞、至少6 x 107个细胞、至少7 x 107个细胞、至少8 x 107个细胞、至少9 x 107个细胞、至少1x 108个细胞、至少2 x 108个细胞、至少3 x 108个细胞、至少4 x 108个细胞、至少5 x 108个细胞、至少6 x 108个细胞、至少7 x 108个细胞、至少8 x 108个细胞、至少9 x 108个细胞、至少1 x 109个细胞或更多的量存在于组合物中。
本发明的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物的治疗有效剂量可以是约1个细胞至约10个细胞、约1个细胞至约100个细胞、约1个细胞至约10个细胞、约1个细胞至约20个细胞、约1个细胞至约30个细胞、约1个细胞至约40个细胞、约1个细胞至约50个细胞、约1个细胞至约60个细胞、约1个细胞至约70个细胞、约1个细胞至约80个细胞、约1个细胞至约90个细胞、约1个细胞至约100个细胞、约1个细胞至约1 x 103个细胞、约1个细胞至约2 x 103个细胞、约1个细胞至约3 x 103个细胞、约1个细胞至约4 x 103个细胞、约1个细胞至约5 x 103个细胞、约1个细胞至约6 x 103个细胞、约1个细胞至约7 x 103个细胞、约1个细胞至约8 x 103个细胞、约1个细胞至约9 x 103个细胞、约1个细胞至约1 x 104个细胞、约1个细胞至约2 x 104个细胞、约1个细胞至约3 x 104个细胞、约1个细胞至约4 x 104个细胞、约1个细胞至约5 x 104个细胞、约1个细胞至约6 x 104个细胞、约1个细胞至约7 x 104个细胞、约1个细胞至约8 x 104个细胞、约1个细胞至约9 x104个细胞、约1个细胞至约1 x 105个细胞、约1个细胞至约2 x 105个细胞、约1个细胞至约3x 105个细胞、约1个细胞至约4 x 105个细胞、约1个细胞至约5 x 105个细胞、约1个细胞至约6 x 105个细胞、约1个细胞至约7 x 105个细胞、约1个细胞至约8 x 105个细胞、约1个细胞至约9 x 105个细胞、约1个细胞至约1 x 106个细胞、约1个细胞至约2 x 106个细胞、约1个细胞至约3 x 106个细胞、约1个细胞至约4 x 106个细胞、约1个细胞至约5 x 106个细胞、约1个细胞至约6 x 106个细胞、约1个细胞至约7 x 106个细胞、约1个细胞至约8 x 106个细胞、约1个细胞至约9 x 106个细胞、约1个细胞至约1 x 107个细胞、约1个细胞至约2 x 107个细胞、约1个细胞至约3 x 107个细胞、约1个细胞至约4 x 107个细胞、约1个细胞至约5 x107个细胞、约1个细胞至约6 x 107个细胞、约1个细胞至约7 x 107个细胞、约1个细胞至约8x 107个细胞、约1个细胞至约9 x 107个细胞、约1个细胞至约1 x 108个细胞、约1个细胞至约2 x 108个细胞、约1个细胞至约3 x 108个细胞、约1个细胞至约4 x 108个细胞、约1个细胞至约5 x 108个细胞、约1个细胞至约6 x 108个细胞、约1个细胞至约7 x 108个细胞、约1个细胞至约8 x 108个细胞、约1个细胞至约9 x 108个细胞，或约1个细胞至约1 x 109个细胞。
在一些情况下，本发明的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物的治疗有效剂量可以是约1 x 103个细胞至约2 x 103个细胞、约1 x103个细胞至约3 x 103个细胞、约1 x 103个细胞至约4 x 103个细胞、约1 x 103个细胞至约5 x 103个细胞、约1 x 103个细胞至约6 x 103个细胞、约1 x 103个细胞至约7 x 103个细胞、约1 x 103个细胞至约8 x 103个细胞、约1 x 103个细胞至约9 x 103个细胞、约1 x 103个细胞至约1 x 104个细胞、约1 x 103个细胞至约2 x 104个细胞、约1 x 103个细胞至约3x 104个细胞、约1 x 103个细胞至约4 x 104个细胞、约1 x 103个细胞至约5 x 104个细胞、约1 x 103个细胞至约6 x 104个细胞、约1 x 103个细胞至约7 x 104个细胞、约1 x 103个细胞至约8 x 104个细胞、约1 x 103个细胞至约9 x 104个细胞、约1 x 103个细胞至约1 x 105个细胞、约1 x 103个细胞至约2 x 105个细胞、约1 x 103个细胞至约3 x 105个细胞、约1 x103个细胞至约4 x 105个细胞、约1 x 103个细胞至约5 x 105个细胞、约1 x 103个细胞至约6 x 105个细胞、约1 x 103个细胞至约7 x 105个细胞、约1 x 103个细胞至约8 x 105个细胞、约1 x 103个细胞至约9 x 105个细胞、约1 x 103个细胞至约1 x 106个细胞、约1 x 103个细胞至约2 x 106个细胞、约1 x 103个细胞至约3 x 106个细胞、约1 x 103个细胞至约4x 106个细胞、约1 x 103个细胞至约5 x 106个细胞、约1 x 103个细胞至约6 x 106个细胞、约1 x 103个细胞至约7 x 106个细胞、约1 x 103个细胞至约8 x 106个细胞、约1 x 103个细胞至约9 x 106个细胞、约1 x 103个细胞至约1 x 107个细胞、约1 x 103个细胞至约2 x 107个细胞、约1 x 103个细胞至约3 x 107个细胞、约1 x 103个细胞至约4 x 107个细胞、约1 x103个细胞至约5 x 107个细胞、约1 x 103个细胞至约6 x 107个细胞、约1 x 103个细胞至约7 x 107个细胞、约1 x 103个细胞至约8 x 107个细胞、约1 x 103个细胞至约9 x 107个细胞、约1 x 103个细胞至约1 x 108个细胞、约1 x 103个细胞至约2 x 108个细胞、约1x 103个细胞至约3x 108个细胞、约1x103个细胞至约4x108个细胞、约1x103个细胞至约5x108个细胞、约1x103个细胞至约6x108个细胞、约1x103个细胞至约7x 108个细胞、约1 x 103个细胞至约8x 108个细胞、约1 x 103个细胞至约9x 108个细胞，或约1 x103个细胞至约1x109个细胞。
在一些情况下，本发明的非工程改造的富集的γδT细胞群、工程改造的富集的γδT细胞群和/或其掺和物的治疗有效剂量可以是约1x106个细胞至约2x106个细胞、约1x106个细胞至约3x 106个细胞、约1 x 106个细胞至约4x 106个细胞、约1 x 106个细胞至约5x106个细胞、约1 x 106个细胞至约6x 106个细胞、约1 x 106个细胞至约7x 106个细胞、约1x 106个细胞至约8x 106个细胞、约1x106个细胞至约9x106个细胞、约1x106个细胞至约1x107个细胞、约1x 106个细胞至约2x 107个细胞、约1 x 106个细胞至约3x 107个细胞、约1 x106个细胞至约4x 107个细胞、约1x 106个细胞至约5x 107个细胞、约1x106个细胞至约6x107个细胞、约1x106个细胞至约7x 107个细胞、约1x106个细胞至约8x107个细胞、约1x106个细胞至约9x 107个细胞、约1 x 106个细胞至约1x 108个细胞、约1 x 106个细胞至约2x108个细胞、约1 x 106个细胞至约3x 108个细胞、约1 x 106个细胞至约4x 108个细胞、约1x 106个细胞至约5x 108个细胞、约1x 106个细胞至约6x 108个细胞、约1x 106个细胞至约7x 108个细胞、约1x 106个细胞至约8x 108个细胞、约1x 106个细胞至约9x 108个细胞、约1x106个细胞至约1x 109个细胞、约1x 106个细胞至约2x 109个细胞、约1x 106个细胞至约3x 109个细胞、约1 x 106个细胞至约4x 109个细胞、约1x 106个细胞至约5x109个细胞、约1x106个细胞至约6x 109个细胞、约1 x 106个细胞至约7x 109个细胞、约1 x 106个细胞至约8x109个细胞、约1x106个细胞至约9x109个细胞、约1x107个细胞至约1x109个细胞、约1x107个细胞至约2x109个细胞、约1x107个细胞至约3x109个细胞、约1x107个细胞至约4 x109个细胞、约1 x 107个细胞至约5 x 109个细胞、约1 x 107个细胞至约6 x 109个细胞、约1x 107个细胞至约7 x 109个细胞、约1 x 107个细胞至约8 x 109个细胞、约1 x 107个细胞至约9 x 109个细胞、约1 x 108个细胞至约1 x 109个细胞、约1 x 108个细胞至约2 x 109个细胞、约1 x 108个细胞至约3 x 109个细胞、约1 x 108个细胞至约4 x 109个细胞、约1 x 108个细胞至约5 x 109个细胞、约1 x 108个细胞至约6 x 109个细胞、约1 x 108个细胞至约7x 109个细胞、约1 x 108个细胞至约8 x 109个细胞、约1 x 108个细胞至约9 x 109个细胞，或约1 x 109个细胞至约1 x 1010个细胞。
保存
在一些实施方案中，富集的γδT细胞群和/或其掺和物可在冷冻培养基中配制，并置于低温储存单元(诸如液氮冷冻剂(-195℃)或超低温冷冻剂(-65℃、-80℃或-120℃))中长期储存至少约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、3年或至少5年。冷冻培养基可含有二甲亚砜(DMSO)和/或氯化钠(NaCl)和/或右旋糖和/或硫酸葡聚糖和/或羟乙基淀粉(HES)，以及将pH维持在约6.0至约6.5之间、约6.5至约7.0之间、约7.0至约7.5之间、约7.5至约8.0之间或约6.5至约7.5之间的生理pH缓冲剂。可以使超低温保存的γδT细胞解冻，并如本文所述通过使用抗体、蛋白质、肽和/或细胞因子刺激来进一步加工。可以使超低温保存的γδT细胞解冻，并如本文所述通过病毒载体(包括逆转录病毒和慢病毒载体)或非病毒手段(包括RNA、DNA和蛋白质)进行基因修饰。可替代地，非工程改造的γδT细胞可以通过本文所述的方法扩增、基因修饰和超低温保存。
因此，基因工程改造的和/或非工程改造的γδT细胞可以进一步超低温保存，以产生在冷冻培养基中至少约101、102、103、104、105、106、107、108、109或至少约1010个细胞/mL，数量为至少约1、5、10、100、150、200、500瓶的细胞库。超低温保存的细胞库可保持其功能，并且可以解冻以及进一步刺激和扩增。在一些方面，可以刺激解冻的细胞，并在合适的封闭容器(诸如细胞培养袋和/或生物反应器)中扩增以产生作为同种异体细胞产物的大量细胞。超低温保存的γδT细胞可以在低温储存条件下维持其生物学功能，持续至少约6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、15个月、18个月、20个月、24个月、30个月、36个月、40个月、50个月或至少约60个月。在一些方面，制剂中不使用防腐剂。可以使超低温保存的γδT细胞解冻，并作为同种异体的现成细胞产品给多名患者输注。
本文提及的所有出版物和专利均通过引用整体并入本文，以用于描述和公开例如出版物中描述的构建体和方法的目的，所述构建体和方法可与本文所述的发明结合使用。本文讨论的出版物单独提供，因为它们在本申请的提交日期之前公开。不得将本文的任何条款视为承认本文所述的发明人因现有发明或任何其它原因而无权将此公开提前。
通过以下非限制性实施例更详细地解释本发明。
实施例
实施例1.特异性结合δ3 TCR的抗体的产生
通过包含与人IgG1FC融合的γδTCR链的成熟ECD的重组人可溶性γ2δ3TCR-FC的免疫产生鼠抗体形式的γδTCR活化剂。用人重组γδTCR接种三个小鼠品系(Balb/c、CD-1和FVB)，以提供分泌高亲和力鼠单克隆抗体活化剂的杂交瘤。
通过PCR扩增产生γδTCR-Fc融合构建体。从由肿瘤浸润性γδ淋巴细胞分离的RNA扩增γ2δ3 TCR链，所述淋巴细胞从来自转移至网膜的转移癌的恶性卵巢细胞的新鲜样本中提取。从瞬时转染的HEK 293细胞的上清液纯化可溶性δ3TCR-FC。用等体积的
Figure BDA0002570764440000861
Gold(Sigma Aldrich)或Imject Alum Adjuvant(Thermo Fisher)乳化10μg可溶性TCR，并用于免疫每只小鼠。然后通过足垫途径将所得的乳液注射到三种小鼠中(每种1只：Balb/c、CD-1和FVB)。
使用固相ELISA测定针对对人γδ3 TCR具有特异性的小鼠IgG抗体对小鼠血清进行筛选。简而言之，用1μg/ml在ELISA包被缓冲液中的重组γδ3 TCR包被96孔板(VWRInternational，目录号610744)过夜。在用含有0.02％(体积/体积(v/v))Tween 20的PBS洗涤后，用在PBS中的3％(重量/体积(w/v))BSA封闭孔，200μL/孔，在室温下(RT)放置1小时。对小鼠血清进行滴定(1∶100、1∶200、1∶400和1∶800)，并以50UL/孔添加到γδTCR包被的板中，并在室温下孵育1小时。将板洗涤，然后与50μL/孔的在3％BSA-PBS或PBS中的2％FCS中1∶10,000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG一起在室温下孵育1小时。再次洗涤板，添加40μL/孔的TMB底物溶液(Thermo Scientific 34028)，在室温下15分钟。在显影后，添加等体积的2N H2SO4，以停止底物显影，并且通过分光光度计在OD 450下分析板。
处死血清阳性免疫小鼠，切下引流淋巴结(腘和腹股沟)并用作产生抗体的细胞的来源。使B细胞的单细胞悬浮液(766×106个细胞)与非分泌型P3x63Ag8.653骨髓瘤细胞(ATCC#CRL-1580)通过电融合以1∶1的比率融合。使用BTX HybrimmuneTM系统(BTX HarvardApparatus)，根据制造商的说明进行电融合。融合后，将细胞重悬于补充有重氮丝氨酸(Sigma#A9666)的杂交瘤选择培养基、含有15％胎儿克隆I血清(Hyclone)、10％BMCondimed(Roche Applied Sciences)、4mM L-谷氨酰胺、100IU青霉素-链霉素和50μM 2-巯基乙醇的具有丙酮酸钠(Cellgro目录号15-017-CM)的高葡萄糖DMEM培养基中，然后涂板于三个T150烧瓶中，每个烧瓶50mL选择培养基。然后将烧瓶在含有5％CO2和95％空气的潮湿的37℃培养箱中放置6-7天。
生长六天后，使用Aria II细胞分选仪将由在T150烧瓶中大批生长的细胞组成的文库以1个细胞/孔涂板于Falcon 384孔平底板中。然后使选择的杂交瘤在90μL含有15％胎儿克隆I血清(Hyclone)、10％BM-Condimed(Roche Applied Sciences)、1mM丙酮酸钠、4mML-谷氨酰胺、100IU青霉素-链霉素、50μM 2-巯基乙醇和100μM次黄嘌呤的培养基中生长。将任何其余未使用的杂交瘤文库细胞冷冻以用于将来文库测试。生长十天后，通过ELISA测定每孔涂板细胞的上清液对δ3 TCR的抗体反应性。
使用通过配对以下γδTCR链产生的可溶性γδTCR蛋白包被高结合的ELISA 96孔板：γ8δ1、γ2δ1和γ2δ3。将可溶性TCR稀释并在碳酸钠缓冲液中以1μg/ml在4℃下使用过夜。将板洗涤并使用在PBS/Tween中的3％BSA在37℃下封闭一小时。立即使用或保存在4℃下。将未稀释的杂交瘤上清液在板上在室温下孵育一小时。将板洗涤并使用在3％BSA-PBS中1∶10,000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG在室温下探测一小时。然后如上文所述使用底物溶液孵育板，并在OD 450下读数。转移和扩增含有优先结合人δ3 TCR链(通过背景上信号(signal above background)确定)的免疫球蛋白的孔。
将所得的δ3TCR特异性克隆杂交瘤在CS-10冷冻培养基(Biolife Solutions)中超低温保存并储存在液氮中。
实施例2.特异性结合δ3 TCR的鼠抗体的测序
基于ELISA结合测定，选择特异性结合δ3可溶性TCR的多种示例性的不同单克隆抗体进行测序和进一步分析。如图1中以表格方式所示，实施例1中产生的所选单克隆抗体的轻链可变区(图)和重链可变区(图)的序列分析确认了新的互补决定区，并显示出新的VDJ排列。图1所示的互补决定区由Kabat定义。
使用RNeasy分离试剂盒(RNeasy Mini Kit Qiagen#74106)从选定的杂交瘤细胞中提取总RNA。在350μl RLT缓冲液中裂解104个杂交瘤细胞，添加等体积的70％乙醇，并且将样品上样至RNeasy Mini离心柱。洗涤柱两次，并通过将100μl无RNA酶水直接上样至离心柱膜来洗脱RNA。通过在1％琼脂糖凝胶中分级取出3吐来确定RNA制剂的量，然后储存在-80℃下直到使用。
使用包含三十二个被设计成靶向完全小鼠VH库的小鼠特异性前导序列引物的5’引物混合物与对所有小鼠Ig同种型具有特异性的3’小鼠Cγ引物的组合来扩增每个杂交瘤的Ig重链的可变区。使用相同的PCR引物从两个末端对VH的400bp PCR片段测序。类似地，使用三十二个被设计来扩增每个Vκ小鼠家族的5’Vκ前导序列引物的混合物与对小鼠κ恒定区具有特异性的单个反向引物的组合对κ轻链进行扩增和测序。使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)由100ng总RNA扩增VH和VL转录物。
对每种杂交瘤运行总共八个RT-PCR反应：Vκ轻链四个，Vγ重链四个。使用一步法OneStep Ahead RT-PCR试剂盒进行扩增(Qiagen#220213)。该试剂盒提供了Sensiscript和Omniscript逆转录酶、QuantiNova HotStarTaq DNA聚合酶、dNTP混合物、缓冲液和Q-Solution(能够有效扩增任何RNA模板的新型添加剂)的共混物。制备包含5μL的RNA、0.5的100μM重链或κ轻链引物(通过IDT合成定制)、12.5μL的具有DNA聚合酶、缓冲液、dNTP的主混合物、1μL的含有逆转录酶和DNA聚合酶的酶混合物，以及0.4μL的核糖核酸酶抑制剂RNasin(1个单位)的反应混合物。反应混合物含有逆转录和PCR所需的所有试剂。热循环仪程序设置为RT步骤50℃10分钟，95℃5分钟，然后是30个循环PCR(95℃30秒，58℃30秒，72℃一分钟)。然后是在72℃下最终孵育10分钟。
为了制备用于直接DNA测序的PCR产物，使用QIAquickTM PCR纯化试剂盒(Qiagen)根据制造商的方案对其进行纯化。使用50μL无菌水从离心柱洗脱DNA，然后从两条链直接测序。使用特异性V区引物对提取的PCR产物直接测序。使用VBase2分析核苷酸序列，以鉴定具有最高序列同源性的生殖系V、D和J基因成员。
注释序列在图1中示出。更具体地，图1(顶部)描绘了来自δ3 TCR特异性抗体的7个新型鼠重链可变区的连续氨基酸序列，并且图1(底部)描绘了来自δ3 TCR特异性抗体的对应轻链可变区的连续氨基酸序列。
总体而言，图1提供了七种鼠抗δ3 TCR抗体(称为δ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58)的注释序列。
实施例3.使用δ3特异性抗体进行的γδT细胞扩增
将24孔板(Corning)用300μL的5μg/mL山羊抗小鼠IgG抗体包被过夜。第二天，将孔用PBS洗涤一次，并用在PBS中的5％FBS在37℃下封闭1h。在含有2％FBS的PBS中制备1μg/mL的Vδ3抗体。将300μL抗体溶液分配到每个孔中，并在室温下孵育2h以进行捕获。
将来自健康个体的人PBMC以1x106/mL/孔涂板于具有捕获的Vδ3抗体的孔中含有10％FBS、2mM谷氨酰胺、100IU/mL的rhIL-2且补充有抗生素的RPMI-1640培养基中。通过培养基补充每2-3天对培养中的细胞进行喂饲。在第7天收获细胞，并以1x106/mL重新涂板于无活化抗体的新板中并且通过每2-3天进行喂饲来进一步扩增。在第14天将细胞重新涂板至1x106/mL细胞密度。在第21天进行细胞分析(计数和流式细胞术)，以确定非Vδ1(使用R9Vd1特异性抗体确定，Beckman-Coulter)和非Vδ2(使用B6 Vd2特异性抗体确定，BioLegend)细胞的纯度和倍数扩增。图4A-B示出两个供体的PBMC培养物中非Vδ1/非Vδ2细胞的倍数扩增。取决于Vδ3抗体，Vδ3特异性抗体诱导最多至8531倍(供体1)和最多6621倍(供体2)的扩增。
对于两个供体，第21天扩增培养物中非Vδ1/非Vδ2细胞的纯度在图5A-B中示出。在第21天，最多至41％的细胞培养物由用δ3-23抗体扩增的供体1PBMC的非Vδ1/非Vδ2γδT细胞组成。
通过CD27和CD45表面标志物表达评估第21天的扩增δ1-/δ2- T细胞的表型。图6A-B示出，第21天MAb活化的δ1-/δ2- T细胞的表型主要是(＞50％)CD27+CD45RA+(初始)和CD27+CD45RA-(中央记忆)。
实施例4.通过竞争结合γ2δ3TCR-hFc进行的Vδ3抗体的表位分组
使用ForteBio Octet仪器和抗人Fc AHC生物传感器(ForteBio，PallCorporation，Fremont，CA)，基于配对的竞争模式，将选定的Vδ3抗体分组到表位仓中。简而言之，将γ2δ3TCR-hFc重组蛋白和所有Vδ3抗体在含有20μg/mL的BSA的HBS-PB缓冲液(10mMHEPES、150mM NaCl、0.005％Tween-20，pH 7.4)中稀释至5μg/mL。将所有样品(300μl)布置在96孔板中，并使用Octet 384仪器按照制造商的建议进行竞争实验。首先，将γ2δ3TCR-hFc在抗人Fc生物传感器上捕获5分钟。然后，使Vδ3抗体对与γ2δ3TCR-hFc连续结合至饱和(每个缔合阶段10分钟)，以确定抗体对是否竞争γ2δ3TCR-hFc上的结合位点。如果第二抗体不结合，则认为这两种抗体在同一表位仓中，并且识别相同、非常相似或很大程度上重叠的表位。应用ForteBio HT9.0数据分析工具确定Vδ3抗体之间的竞争。
图7呈现了五种抗Vδ3抗体的竞争模式。将所测试的抗Vδ3抗体分组到3个表位仓中。δ3-23、δ3-42和δ3-58均被发现在配对结合测定中彼此竞争，并构成一个命名为1A的表位仓。δ3-31不与任何所测试抗体竞争，将其放入单独的仓2中。δ3-08抗体不与δ3-31抗体竞争，但似乎被δ3-23、δ3-42和δ3-58置换，表明δ3-08抗体可能具有重叠的表位，但δ3-08亲和力可能较低。δ3-08的表位命名为仓1B。
实施例5.Vδ3γδT细胞的活化、转导和选择性扩增
将12孔板(Corning，
Figure BDA0002570764440000911
)以600μL/孔用1μg/mL在PBS中的纯化的δ3-08或δ3-23抗体在4℃下直接包被过夜。第二天，用PBS洗涤孔，并且将来自两个供体(供体3和供体4)的PBMC(2 x 106个总细胞)以1 x 106个细胞/mL添加到补充有10％FBS、2mM谷氨酰胺、100IU/mL的rhIL-2(Peprotech)的RPMI-1640培养基中以进行活化。通过流式细胞术对起始PBMC的Vδ1、Vδ2和含有Vδ3细胞的非Vδ1/Vδ2γδT(DN，双阴性)级分的含量进行表征。非Vδ1/Vδ2γδT细胞含量小于总细胞的0.5％。在第2天和第4天通过半交换(demi-exchange)向细胞培养物喂饲补充有rhIL-2的新鲜培养基。
在第5天，将细胞在HBSS中洗涤，并用编码抗CD20(Rituxan)嵌合抗原受体ACT2(与CD28跨膜共刺激结构域和CD3ζ连接的scFv)的逆转录病毒构建体转导。简而言之，将12孔非组织培养物处理板的孔用10μg/mL的
Figure BDA0002570764440000921
(TaKaRa Bio)预先包被，然后向孔中添加2 x 106个活化的PBMC(每个供体，每种活化抗体)，然后添加适当体积的病毒上清液以实现MOI＝1。使培养基的总体积达到2mL以实现1 x 106个细胞/mL的细胞浓度，并且将rhIL-2补充至100IU/mL。一部分细胞未转导，但进行了与CAR转导细胞相同的操作(未转导，模拟转导)。
第二天，将细胞转移至6孔板中进行扩增，并且每隔一天通过培养基半交换喂饲，再维持11天。在扩增结束时，收获细胞，洗涤并通过流式细胞术分析Vδ3倍数扩增、纯度和CAR表达(图8A-C)。简而言之，将细胞用针对TCRαβ(克隆IP26)、抗TCRγδ(Immuno510，Beckman Coulter)、抗Vδ2(B6，Biolegend)、抗Vδ1(R9.12，Beckman Coulter)、抗CD16和抗CD56(均为BioLegend)的抗体染色，并在BD FACS Canto II上进行分析。为了确定抗CD20CAR转导效率，将细胞用大鼠抗利妥昔单抗(Rituximab)-FITC缀合物(BioRad，图8C)染色。数据使用FlowJo软件分析。使用具有LS柱的手动程序，用αβT细胞耗尽试剂盒(MiltenyiBiotec)耗尽培养物中的αβT细胞。通过流式细胞术确认αβT细胞耗尽后的纯度和CAR表达，并将细胞用于细胞毒性测定。所有样品中的残余αβT细胞的百分比均＜1％；并且Vδ3细胞的纯度＞70％，这取决于供体和用于Vδ3细胞扩增的抗体(图9)。
使用δ3-08和δ3-23 MAb扩增的来自供体4的未转导细胞耗尽残余的αβT细胞，并用δ3-23 MAb以及其他T细胞标志物(TCRαβ、抗Vδ1、抗Vδ2)染色。如图10所示，αβT细胞耗尽后的大多数细胞(≥90％)是非Vδ1/非Vδ2细胞(左图)，其中≥95％的细胞用δ3-23 MAb针对Vδ3阳性染色(右图)。
实施例6.使用工程改造的Vδ3γδT细胞进行的细胞毒性测定
如实施例5中所述，使用δ3-08和δ3-23 MAb活化来自供体3的人PBMC，并用CD20CAR构建体进行转导。如实施例5中所述，在扩增结束时，对细胞的纯度和转导效率进行表征，并耗尽αβT细胞。然后将耗尽αβT细胞的培养物用于针对CD20+Raji-NucLight Red细胞的细胞毒性测定。已使用
Figure BDA0002570764440000931
NucLight Red慢病毒颗粒转导CD20+Raji-NucLightRed细胞，从而允许在
Figure BDA0002570764440000932
平台上进行Raji细胞的荧光检测。
将CD20 CAR转导或未转导的Vδ3细胞与Raji-NucLight Red细胞一起以各种E/T比在384孔板中的补充有10％FBS、2mM谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中共孵育6小时。将Raji-NucLight Red细胞活力评估为在6小时时间点从整个孔中定量的总荧光。如图11所示，使用δ3-08(A)或δ3-23(B)MAb从供体3扩增的抗CD20 CAR转导和未转导的Vδ3细胞均表现出对CD20+Raji-NucLight Red细胞的细胞毒性。与未转导的扩增的Vδ3细胞相比，转导的Vδ3细胞显著增强了对CD20+Raji-NucLight Red细胞的细胞毒性。
实施例7.通过诱变进行的抗Vδ3抗体的精细表位作图
为了确定人γδTCR的可变Vδ3区域中对Vδ3抗体的结合至关重要的氨基酸残基，将几个点突变或其组合引入δ3链，并使用Luminex评估MAb结合。简而言之，使用存放在PDB中的Vδ2Vγ9 TCR的晶体结构(登录号1HXM和1TVD)创建Vδ3Vγ9二聚体分子的计算机模型。如表1所示，基于潜在的免疫原性向Vδ3链的野生型序列中引入取代。Vδ3氨基酸的残基编号如图12所示。将表1所指示的突变Vδ3链如实施例1中所述与Vγ2链一起在293Expi细胞中共表达为人-Fc异二聚体融合蛋白，并使用亲和层析在蛋白A上纯化。将突变型和野生型δ3γ2-hFc蛋白捕获在与山羊抗人Fc多克隆抗体缀合的
Figure BDA0002570764440000942
珠粒上并且确定各种Vδ3抗体的EC50结合。监测对特定突变型δ3γ2-TCR融合体的EC50结合的丧失或下降，以确定突变氨基酸对抗原结合的贡献。不受理论的束缚，假设当结合至Vδ3γδTCR时，在突变时表现出结合降低的残基与δ3特异性抗体接触。
表1：
Figure BDA0002570764440000941
*-外推值；未达到饱和
由本文所述的精细表位作图表明为促进抗原结合的选定残基的紧密分组(closegrouping)在图13和图14A-C中示出，表明本文所述的抗体所识别的δ3特异性表位可以至少部分地或完全地是构象和/或非线性的。如图13所示，δ3特异性γδTCR结合抗体可以结合Vδ3的γ链结合界面远端的Vδ3的表位。
如表1和图13-14C所示，可以将δ3特异性抗体分组为2个大的表位结合组，其中δ3-08、δ3-23、δ3-42和δ3-58形成第一组并且δ3-31形成第二组。第一大组可以分为两个子组，其中δ3-23、δ3-42和δ3-58形成子组1A，并且δ3-08形成子组1B。这些结果与图7所示的竞争结合数据非常吻合。然而，除了突出显示涉及抗原结合的特定残基之外，精细作图还揭示了由抗体δ3-31和δ3-42形成的第三分组，它们均显示出对E67Q、D70N、R75Q、R95Q、E97Q突变型Vδ3γδTCR的结合减少。
图14A-C还突出显示了作为δ3特异性抗体的抗原结合热点的β折叠链D和E(IMGT命名法)。因此，在一些情况下，δ3特异性抗体可以包括与Vδ3的β折叠链D和E中的残基(IMGT命名法)结合的那些；另外或可替代地，与Vδ3的β折叠链C”和D中的残基以及Vδ3的β链E和F之间的环中的残基(IMGT命名法)结合的那些；和/或与Vδ3的β折叠链A、B、D和E中的残基(IMGT命名法)结合的那些。
在氨基酸水平上，假设一些δ3γδTCR特异性抗体结合Vδ3的残基K79和H88(IMGT命名法)。另外或可替代地，一些δ3γδTCR特异性抗体结合Vδ3的残基R75和R95(IMGT命名法)。另外或可替代地，一些δ3γδTCR特异性抗体结合Vδ3的残基K79、E18和H88(IMGT命名法)。另外或可替代地，一些δ3γδTCR特异性抗体结合Vδ3的残基E67、D70、R75、R95和E97(IMGT命名法)。另外或可替代地，一些δ3γδTCR特异性抗体结合Vδ3的残基K3、K79和H88(IMGT命名法)。另外或可替代地，一些δ3γδTCR特异性抗体结合Vδ3的残基K79、L82和H88(IMGT命名法)。

Claims (72)

1.一种结合对δ3γδTCR具有特异性的表位的抗体或其片段。
2.如权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段与以下各项结合基本上相同的表位：
a)选自由δ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58组成的组的抗体；
b)选自由δ3-08、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58组成的组的抗体；
c)选自由δ3-08、δ3-23、δ3-42和δ3-58组成的组的抗体；
d)选自由δ3-23、δ3-42和δ3-58组成的组的抗体；
e)选自由δ3-31和δ3-42组成的组的抗体；
f)抗体δ3-08；或
g)抗体δ3-31。
3.如权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段与以下各项结合相同的表位：
a)选自由δ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58组成的组的抗体；
b)选自由δ3-08、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58组成的组的抗体；
c)选自由δ3-08、δ3-23、δ3-42和δ3-58组成的组的抗体；
d)选自由δ3-23、δ3-42和δ3-58组成的组的抗体；
e)选自由δ3-31和δ3-42组成的组的抗体；
f)抗体δ3-08；或
g)抗体δ3-31。
4.如权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含以下各项的互补决定区：
a)选自由δ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58组成的组的抗体；
b)选自由δ3-08、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58组成的组的抗体；
c)选自由δ3-08、δ3-23、δ3-42和δ3-58组成的组的抗体；
d)选自由δ3-23、δ3-42和δ3-58组成的组的抗体；
e)选自由δ3-31和δ3-42组成的组的抗体；
f)抗体δ3-08；或
g)抗体δ3-31。
5.如权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段与γδTCR的Vδ3特异性结合。
6.如权利要求5所述的抗体，其中所述抗体结合Vδ3的γ链结合界面的远端区域。
7.如权利要求5所述的抗体，其中根据IMGT命名法，所述抗体结合所述γδTCR的所述Vδ3的β链D和E。
8.如权利要求5所述的抗体，其中根据IMGT命名法，所述抗体结合所述γδTCR的所述Vδ3的β链C”和D以及β链E和F之间的环。
9.如权利要求5所述的抗体，其中根据IMGT命名法，所述抗体结合所述γδTCR的所述Vδ3的β链A、B、D和E。
10.如权利要求1-9中任一项所述的抗体或其片段，其中与包含γδT细胞和αβT细胞的混合细胞群中的αβT细胞相比，所述抗体或其片段选择性地扩增δ3γδT细胞。
11.如权利要求1-10中任一项所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段结合至δ3γδTCR。
12.如权利要求11所述的抗体或其片段，其中所述δ3γδTCR在δ3γδT细胞的表面上表达。
13.如权利要求1-12中任一项所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段结合至抗原呈递细胞(APC)，诸如人工抗原呈递细胞(aAPC)的细胞外表面。
14.如权利要求13所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段锚定在所述APC或aAPC的膜中。
15.如权利要求13所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的Fc区结合至由所述APC或aAPC表达的Fc受体。
16.如权利要求1-15中任一项所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段与以下各项竞争结合：
a)选自由δ3-08、δ3-20、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58组成的组的抗体；
b)选自由δ3-08、δ3-23、δ3-31、δ3-42、δ3-47和δ3-58组成的组的抗体；
c)选自由δ3-08、δ3-23、δ3-42和δ3-58组成的组的抗体；
d)选自由δ3-23、δ3-42和δ3-58组成的组的抗体；
e)选自由δ3-31和δ3-42组成的组的抗体；
f)抗体δ3-08；或
g)抗体δ3-31。
17.如权利要求1-16中任一项所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是δ3γδT细胞的特异性活化剂。
18.一种编码如权利要求1-17所述的抗体或其片段中的任一种的核酸，其中所述核酸可操作地连接至异源性启动子。
19.一种宿主细胞，其包含如权利要求1-17所述的抗体或其片段中的任一种或如权利要求18所述的核酸。
20.如权利要求19所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是人工抗原呈递细胞(aAPC)。
21.一种制备结合对δ3γδTCR具有特异性的表位的抗体或其片段的方法，所述方法包括在足以产生所述抗体或其片段的条件下培养如权利要求19所述的宿主细胞。
22.一种用于产生富集的γδT细胞群的离体方法，其包括使包含γδT细胞的第一细胞群与一种或多种如权利要求1-17所述的抗体或其片段接触。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述第一细胞群是包含αβT细胞和γδT细胞的分离的混合细胞群。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述第一细胞群包含，或是外周血单核细胞(PBMC)的样品。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述第一细胞群选自外周血样品、白细胞去除术样品、脐带血样品、肿瘤样品或组织样品。
26.如权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述第一细胞群包含少于1％的δ3γδT细胞。
27.如权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述第一细胞群包含未培养的原代细胞或未传代的原代细胞。
28.如权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述方法包括使所述分离的混合细胞群与所述一种或多种抗体或其片段直接接触。
29.如权利要求22所述的方法，其中所述第一细胞群是包含一种或多种工程改造的γδT细胞的群体。
30.如权利要求22或29中任一项所述的方法，其中所述第一细胞群是扩增的γδT细胞的第一群体。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述方法包括第一γδT细胞扩增和第二γδT细胞扩增。
32.如权利要求22至31中任一项所述的方法，其中所述方法包括产生包含至少108个δ3γδT细胞的富集的γδT细胞群。
33.如权利要求32所述的方法，其中包含至少108个δ3γδT细胞的所述富集的γδT细胞群在12至21天内产生。
34.如权利要求22至33中任一项所述的方法，其中所述方法包括使所述第一细胞群中的所述δ3γδT细胞扩增至少1,000倍，优选地至少5,000倍，更优选地至少或大约或至少约10,000倍。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述指定倍数扩增在12至21天内实现。
36.一种用于产生富集的γδT细胞群的离体方法，包括：
a)使包含γδT细胞的第一细胞群与活化和扩增γδT细胞的一种或多种第一活化剂接触，从而产生扩增的第一γδT细胞群；以及
b)使所述扩增的第一γδT细胞群与活化和扩增γδT细胞的一种或多种第二活化剂接触，从而产生所述富集的γδT细胞群，
其中所述一种或多种第一活化剂中的至少一种或所述一种或多种第二活化剂中的至少一种是如权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述方法包括在a)之后且在b)之前分离所述扩增的第一γδT细胞群。
38.如权利要求36或37所述的方法，其中a)包括在抗原呈递细胞(APC)和所述一种或多种第一活化剂的存在下培养所述第一细胞群。
39.如权利要求36或37所述的方法，其中b)包括在抗原呈递细胞(APC)和所述一种或多种第二活化剂的存在下培养所述扩增的第一γδT细胞群。
40.如权利要求36-39中任一项所述的方法，其中所述第一细胞群是包含αβT细胞和γδT细胞的分离的混合细胞群。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述第一细胞群选自外周血样品、白细胞去除术样品、脐带血样品、肿瘤样品或组织样品。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述第一细胞群包含，或是外周血单核细胞(PBMC)的样品。
43.如权利要求36-42中任一项所述的方法，其中所述第一细胞群包含未培养的原代细胞、未传代的原代细胞。
44.如权利要求36-39中任一项所述的方法，其中所述第一细胞群是工程改造的γδT细胞的群体。
45.如权利要求36-44中任一项所述的方法，其中所述方法包括基因修饰所述扩增的第一γδT细胞群或基因修饰所述富集的γδT细胞群。
46.如权利要求36-45中任一项所述的方法，其中所述方法包括产生包含至少108个δ3γδT细胞的富集的γδT细胞群。
47.如权利要求46所述的方法，其中包含至少108个δ3γδT细胞的所述富集的γδT细胞群在12至21天内产生。
48.如权利要求36-47中任一项所述的方法，其中所述方法包括使所述第一细胞群中的所述δ3γδT细胞扩增至少1,000倍，优选地至少5,000倍，更优选地至少或大约或至少约10,000倍。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述指定倍数扩增在12至21天内实现。
50.如权利要求36-49中任一项所述的方法，其中所述一种或多种第一活化剂中的至少一种与所述一种或多种第二活化剂中的至少一种在结构上相同。
51.如权利要求36-50中任一项所述的方法，其中所述一种或多种第一活化剂中的至少一种与所述一种或多种第二活化剂中的至少一种在结构上不同。
52.如权利要求36-51中任一项所述的方法，其中所述一种或多种第一活化剂中的至少一种或所述一种或多种第二活化剂中的至少一种是固定化的。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述固定化的活化剂固定在培养容器的表面上。
54.如权利要求52所述的方法，其中所述固定化的活化剂固定在抗原呈递细胞(APC)或人工抗原呈递细胞(aAPC)的表面上。
55.如权利要求52-54中任一项所述的方法，其中固定化的活化剂是结合对δ3γδTCR具有特异性的表位的所述抗体或其片段。
56.如权利要求22-35或36-55中任一项所述的方法，其中所述方法在αβT细胞耗尽之前或没有耗尽的情况下，获得大于30％的δ3γδT细胞，优选地大于40％。
57.一种扩增的γδT细胞群，其中大于30％的所述扩增的γδT细胞是δ3γδT细胞，优选地大于40％，更优选地大于60％，还更优选地大于70％，甚至更优选地大于80％。
58.如权利要求57所述的扩增的γδT细胞群，其中所述扩增的γδT细胞群包含多克隆TCR多样性。
59.如权利要求58所述的扩增的γδT细胞群，其中大于60％或70％的所述δ3T细胞表达表型CD45RA+/CD27+和/或CD45RA-/CD27+。
60.如权利要求57-59中任一项所述的扩增的γδT细胞群，其来源于肿瘤浸润性淋巴细胞。
61.如权利要求57-60中任一项所述的扩增的γδT细胞群，其中所述γδT细胞表达内源性或异源性肿瘤识别部分。
62.如权利要求57-61中任一项所述的扩增的γδT细胞群，其中所述群包含治疗有效量的γδT细胞。
63.如权利要求57-62中任一项所述的扩增的γδT细胞群，其中所述γδT细胞群包含不依赖NKp30活性、NKp44活性和/或NKp46活性的抗肿瘤细胞毒性。
64.如权利要求63所述的扩增的γδT细胞群，其中所述γδT细胞群不包含NKp30活性依赖性抗肿瘤细胞毒性、NKp44活性依赖性抗肿瘤细胞毒性和/或NKp46活性依赖性抗肿瘤细胞毒性。
65.如权利要求57-63中任一项所述的扩增的γδT细胞群，其中少于40％的所述γδT细胞表达可检测水平的NKp30、NKp44和/或NKp46。
66.一种扩增的γδT细胞群，其通过以下各项产生：
a)如权利要求22-35中任一项所述的方法；或
b)如权利要求36-56中任一项所述的方法。
67.一种治疗有需要的受试者的癌症、炎性疾病或自身免疫疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的δ3γδT细胞。
68.一种治疗有需要的受试者的癌症、炎性疾病或自身免疫疾病的方法，所述方法包括：
a)提供治疗有效量的如权利要求57-66中任一项所述的δ3γδT细胞；以及
b)向所述受试者施用所述治疗有效量的δ3γδT细胞。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述方法还包括将所述扩增的γδT细胞群与第二扩增的γδT细胞群掺和以形成掺和群，并将所述掺和群施用给所述受试者。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述第二扩增的γδT细胞群包含＞60％的δ1或＞60％的δ2γδT细胞。
71.如权利要求69所述的方法，其中所述掺和的γδT细胞群包含＞60％的δ1或＞60％的δ2γδT细胞。
72.如权利要求69所述的方法，其中所述掺和的γδT细胞群包含＞60％的δ3γδT细胞。
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