JP2021193922A - 唾液サンプリングキット - Google Patents

Abstract

【課題】唾液検体中のウイルスを十分に不活性化し、かつ、ＲＮＡの検出精度のすぐれた検査を可能とする唾液サンプリングキット及び該唾液サンプリングキットを用いた方法を提供すること。【解決手段】唾液を収集するための漏斗を有する有底チューブと、前記有底チューブ内に封入された保存液と、を有し、該保存液が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート ０．１０〜０．２０ｍｏｌ／Ｌと、グアニジンチオシアネート ０．８６〜０．９５ｍｏｌ／Ｌと、エチレンジアミン四酢酸 ０．２５〜０．３０ｍｏｌ／Ｌと、を含む、唾液サンプリングキット。【選択図】なし

Description

本発明は、唾液サンプリングキット及び該唾液サンプリングキットを用いた方法に関する。

従来より、スワブと呼ばれる綿棒を使って鼻腔粘膜などの検体を採取し、その検体から、ウイルスのＤＮＡ或いはＲＮＡを検出することで、ウイルス感染症の検査が行われている（例えば、特許文献１参照。）。しかしながら、スワブを使用するこの方法では検体の採取にある程度のテクニックが要求されるため医療従事者が採取しなければならず、医療従事者の負担が高いうえ、採取時の医療従事者への二次感染リスクや、医療用ガウンなどの確保も必要となる。

また、ウイルス感染症の疑いのある検体の採取後の検査施設までの輸送と保存の安全な輸送性を確保することも必要である。

国際公開第2018/168986号

このような問題を回避するため、より容易に採取可能な検体である唾液を用いたウイルス感染症の検査方法の検討が行われている。しかしながら、唾液を用いたウイルス感染症の検査方法においても、検体中のウイルスが不活性化されていなければ検査担当者の二次感染リスクが抑えられているとはいえない。特に、本発明者らが検討したところ、唾液検体の方が鼻腔粘膜検体と比較して液体の体積が多く、鼻腔粘膜検体に対して行ってきたウイルス不活性化手法は十分でないことが分かってきた。また、唾液検体中のウイルスを不活性化する方法によっては、かえってウイルスのＲＮＡの検出精度が著しく低下し、偽陰性率を向上させるという問題が生じることが分かってきた。

本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、唾液検体中のウイルスを十分に不活性化し、かつ、ＲＮＡの検出精度のすぐれた検査を可能とする唾液サンプリングキット及び該唾液サンプリングキットを用いた方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記問題点を解決するために鋭意検討した。その結果、所定量のグアニジンチオシアネート及びポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを用いることにより、上記課題を解決しうることを見出し、本願発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕
唾液を収集するための漏斗付き有底チューブと、
前記有底チューブ内に封入された保存液と、を有し、
該保存液が、
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート ０．１０〜０．２０ｍｏｌ／Ｌと、
グアニジンチオシアネート ０．８６〜０．９５ｍｏｌ／Ｌと、
エチレンジアミン四酢酸 ０．２３〜０．３３ｍｏｌ／Ｌと、を含む、
唾液サンプリングキット。
〔２〕
前記保存液が、クエン酸塩 ０．０１〜０．０６ｍｏｌ／Ｌを、さらに含む、
〔１〕に記載の唾液サンプリングキット。
〔３〕
前記保存液が、還元剤 ０．０１〜０．０６ｍｏｌ／Ｌを、さらに含む、
〔１〕又は〔２〕に記載の唾液サンプリングキット。
〔４〕
前記還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノールからなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、
〔３〕に記載の唾液サンプリングキット。
〔５〕
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート ０．１０〜０．２０ｍｏｌ／Ｌと、
グアニジンチオシアネート ０．８６〜０．９５ｍｏｌ／Ｌと、
エチレンジアミン四酢酸 ０．２５〜０．３０ｍｏｌ／Ｌと、を含む、
唾液サンプリングキット用の保存液。
〔６〕
〔１〕〜〔４〕に記載の唾液サンプリングキットを用い、漏斗を介して有底チューブ内に唾液を収集し、該唾液と保存液が混合されたサンプルを得るステップと、
前記サンプルからＲＮＡを抽出し精製するステップと、
精製した前記ＲＮＡを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によりｃＤＮＡを生成し、得られた前記ｃＤＮＡに対してポリメラーゼ連鎖反応を行うステップと、
前記ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡを検出するステップと、を有する、
方法。

本発明によれば、唾液検体中のウイルスを十分に不活性化し、かつ、ＲＮＡの検出精度のすぐれた検査を可能とする唾液サンプリングキット及び該唾液サンプリングキットを用いた方法を提供することができる。

本実施形態に係る唾液サンプリングキットの一例を表す側面図。 ウイルスの添加量を2×10⁶copies/mLのとしたときのPCRテスト結果 ウイルスの添加量を2×10⁴copies/mLのとしたときのPCRテスト結果 ウイルスの添加量を2×10²copies/mLのとしたときのPCRテスト結果

以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。

〔唾液サンプリングキット〕
本実施形態の唾液サンプリングキットは、唾液を収集するための漏斗付き有底チューブと、有底チューブ内に封入された保存液と、を有し、保存液として、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート ０．１０〜０．２０ｍｏｌ／Ｌと、グアニジンチオシアネート ０．８６〜０．９５ｍｏｌ／Ｌと、エチレンジアミン四酢酸 ０．２５〜０．３０ｍｏｌ／Ｌと、を含むものを用いる。

（有底チューブ）
図１に、唾液サンプリングキットの一例を表す側面図を示す。唾液サンプリングキット１０は、有底チューブ１に唾液を収集するための漏斗２が付されたものであり、有底チューブ１内には保存液３が封入されている。漏斗２内に唾液を垂らすことで、唾液は漏斗２の内面と有底チューブ１の内面をつたって有底チューブ１内の底へと落ち、有底チューブ１の底で唾液と保存液３が接触する。

図１では、漏斗２から有底チューブ１内の底へ延伸した筒の中に保存液３が封入されており、初めに唾液は筒と有底チューブ１内の間の空間に落ちる。そして、その状態で有底チューブ１から漏斗２を外すことで、筒内の保存液３が有底チューブ１内の底へと流出し、有底チューブ１の底で唾液と保存液３が接触する態様となっている。この場合、筒はロート側の端面が閉じており、有底チューブ１の底側の端面が解放されている。これにより、有底チューブ１が転倒しても保存液３が漏れることを回避することができ、また、保存液３の保存安定性がより向上する。

また、上記態様のように筒を用いて間接的に有底チューブ1内に保存液を封入するほか、筒を用いず直接的に有底チューブ１内の底に保存液を封入するようにしてもよい。筒を用いず直接的に有底チューブ１内の底に保存液を封入する場合には、漏斗２の口にキャップなどを設けることが好ましい。

図示しないが、有底チューブ１の底で唾液と保存液３とを接触させた後は、有底チューブ１から漏斗２を引き抜き、別途用意した蓋で有底チューブ１の口を風刺することが好ましい。

（保存液）
次いで、本実施形態の保存液の組成について説明する。本実施形態の保存液は、所定量の、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、グアニジンチオシアネート、及びエチレンジアミン四酢酸を含み、さらにクエン酸塩や還元剤を含んでいてもよい。

ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの濃度は、０．１０〜０．２０ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１２〜０．１９ｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．１４〜０．１８ｍｏｌ／Ｌである。ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの濃度が上記範囲内であることにより、唾液検体中のウイルスを十分に不活性化され、かつ、ＲＮＡの検出精度がより向上する。

グアニジンチオシアネートの濃度は、０．８６〜０．９５ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．８７〜０．９４ｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．８８〜０．９３ｍｏｌ／Ｌである。グアニジンチオシアネートの濃度が０．８６ｍｏｌ／Ｌ以上であることにより、唾液で保存液が薄まった後でもウイルスを不活性化することができる。また、グアニジンチオシアネートの濃度が０．９５ｍｏｌ／Ｌ以下であることにより、過剰のグアニジンチオシアネートに由来するＲＮＡの検出精度の低下を抑制することができる。

ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの濃度に対するグアニジンチオシアネートの濃度の比は、好ましくは４．０〜７．０であり、好ましくは５．０〜６．０であり、好ましくは５．４〜５．７である。ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの濃度に対するグアニジンチオシアネートの濃度の比が上記範囲内であることにより、唾液検体中のウイルスを十分に不活性化され、かつ、ＲＮＡの検出精度がより向上する傾向にある。

エチレンジアミン四酢酸の濃度は、０．２３〜０．３３ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．２４〜０．３１ｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．２５〜０．２９ｍｏｌ／Ｌである。エチレンジアミン四酢酸の濃度が上記範囲内であることにより、金属イオン要求性のヌクレアーゼが不活性化され、ＲＮＡの検出精度がより向上する。

クエン酸塩としては、特に制限されないが、例えば、クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸三ナトリウム一水和物、クエン酸三カリウム二水和物、クエン酸三カリウム一水和物などが挙げられる。このなかでも、クエン酸三ナトリウム二水和物が好ましい。このようなクエン酸塩を用いることにより、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートとグアニジンチオシアネートとの相溶性がより向上し、ウイルスの不活性化作用がより向上する傾向にある。クエン酸塩は一種単独で用いても二種以上を併用してもよい。

クエン酸塩の濃度は、好ましくは０．０１〜０．０６ｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌであり、さらに好ましくは０．０２〜０．０４ｍｏｌ／Ｌである。クエン酸塩の濃度が０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上であることにより、ＲＮＡがより安定化され、ＲＮＡの検出精度がより向上する傾向にある。また、クエン酸塩の濃度が０．０６ｍｏｌ／Ｌ以下であることにより、ウイルスの不活性化作用がより向上する傾向にある。

還元剤としては、特に制限されないが、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノールが挙げられる。このなかでも、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンが好ましい。このような還元剤を用いることにより、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートとグアニジンチオシアネートとの相溶性がより向上し、ウイルスの不活性化作用がより向上する傾向にある。還元剤は一種単独で用いても二種以上を併用してもよい。

還元剤の濃度は、好ましくは０．０１〜０．０６ｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌであり、さらに好ましくは０．０１〜０．０３ｍｏｌ／Ｌである。還元剤の濃度が０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上であることにより、ＲＮＡがより安定化され、ＲＮＡの検出精度がより向上する傾向にある。また、還元剤の濃度が０．０６ｍｏｌ／Ｌ以下であることにより、ウイルスの不活性化作用がより向上する傾向にある。

本実施形態の保存液の溶媒としては、水や、エタノール、メタノールなどのアルコール類を用いることができる。このなかでも、溶媒としては水のみが好ましい。水の含有量は、保存液全体に対して、好ましくは４５〜７５質量％であり、より好ましくは５０〜７０質量％であり、さらに好ましくは５５〜６５質量％である。また、水の含有量は、溶媒全体に対して、好ましくは８５〜１００質量％であり、より好ましくは９０〜１００質量％であり、さらに好ましくは９５〜１００質量％である。水の含有量が上記範囲内であることにより、ＲＮＡの沈殿がより抑制される傾向にある。

〔方法〕
本実施形態の方法は、上記唾液サンプリングキットを用い、漏斗を介して有底チューブ内に唾液を収集し、該唾液と保存液が混合されたサンプルを得るステップと、サンプルからＲＮＡを抽出し精製するステップと、精製したＲＮＡを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によりｃＤＮＡを生成し、得られたｃＤＮＡに対してポリメラーゼ連鎖反応を行うステップと、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡを検出するステップと、を有する。

上記方法により、唾液に含まれる任意のＲＮＡをそれに対応するＤＮＡとして増幅することができ、ＲＮＡウイルス感染症に罹患しているか否かを検査することができる。本実施形態において、唾液に含まれるＲＮＡとしては、ＳＡＲＳ−Ｃｏｖ−２（Ｃｏｖｉｄ１９ともいう）などのコロナウイルスやレンチウイルスなどのレトロウイルスといったＲＮＡウイルスに由来するＲＮＡなどが挙げられる。以下、各ステップについて説明する。

まず、上記唾液サンプリングキットを用い、漏斗を介して有底チューブ内に唾液を収集し、唾液と保存液が混合されたサンプルを得る。唾液と保存液の混合方法は特制限されないが、有底チューブ内に唾液を落とし保存液と接触させたら、有底チューブに蓋をして３〜６回ほど上下にひっくり返して混ぜる方法が挙げられる。この際、保存液と唾液が接触することで、唾液中にウイルスが含まれる場合には、サンプル中のウイルス由来のＲＮＡを損なうことなく、ウイルスを不活性化することができる。

このように唾液サンプリングキットを用いることで、被験者の操作によりウイルスを不活性化することが可能となる。そのため、従来、検査担当者が行っていたウイルスの不活性化ステップを省略することが可能となる。またそれにより、検査担当者の二次感染リスクを低減することも可能となる。

このようにして得られたサンプルは次のステップを実施するまでの間、低温から常温の温度範囲、例えば２〜２７℃で保管することができる。保管期間は、特に制限されないが、例えば、７日間以下が好ましい。なお、この保管には、サンプルを被験者の手元から試験設備のある場所へ移動させることも含まれる。本実施形態の保存液を用いることにより、上記環境下の保管においても、サンプル中のウイルス由来のＲＮＡを損なうことなく、かつウイルスを不活性化した状態で、サンプルを安定して保存することが可能となる。

次に、サンプルからＲＮＡを抽出し精製する。サンプルからのＲＮＡの抽出と精製は公知の方法に従って行うことができる。例えば、サンプルにエタノールを添加し、サンプル中のＲＮＡを沈殿させて上澄液を除去することで、ＲＮＡの抽出と精製を行うことができる。この際、沈殿したＲＮＡを複数回洗浄してもよい。最終的には、沈殿したＲＮＡは、バッファーで再溶解して、次のステップで使用する。

上記のようにして生成したＲＮＡを用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によりｃＤＮＡを生成する。ｃＤＮＡの生成は、公知の方法に従って行うことができる。ｃＤＮＡの生成には、増幅したい配列に対応するプライマーを用いる。次いで、得られたｃＤＮＡに対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う。ＰＣＲは、公知の方法に従って行うことができる。

最後に、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡを検出し、任意の配列のＤＮＡが検出されるか否かを確認する。これにより被験者の唾液検体に、ウイルスに由来するＲＮＡが含まれていたかどうかを確認することができる。

また、本実施形態の方法は、アデノウイルスなどのＤＮＡウイルス感染症に罹患しているか否かについても検査することができる。この場合、上記唾液サンプリングキットを用い、漏斗を介して有底チューブ内に唾液を収集し、該唾液と保存液が混合されたサンプルを得るステップと、サンプルからＤＮＡを抽出し精製するステップと、精製したＤＮＡを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うステップと、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡを検出するステップと、を有する方法が挙げられる。

本実施形態の方法において、検出可能なウイルスとしては、ＲＮＡウイルスが挙げられるが、ＤＮＡウイルスに属するアデノウイルスであってもよい。ＲＮＡウイルスとしては、国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ）によって分類されるＲＮＡウイルスであってよく、一本鎖ＲＮＡウイルスであっても、二本鎖ＲＮＡウイルスであってもよい。ＲＮＡウイルスとしては、特に限定されないが、インフルエンザウイルス、免疫不全ウイルス（ヒト免疫不全ウイルスが好ましい）、コロナウイルス等が挙げられる。検出可能なウイルスとしては、エンベロープウイルスであってよく、エンベロープを有する一本鎖ＲＮＡウイルスであってよい。

以下、本発明を実施例及び比較例を用いてより具体的に説明する。本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。

〔ウイルス不活性化テスト〕
下記表１に記載の濃度となるように、水に各成分を混合して保存液を調製した。

上記のようにして調製した保存液１〜６それぞれに、１０⁶ＴＣＩＤ ５０／ｍＬのレンチウイルスを添加し、振盪した。そして、保存液とレンチウイルスの混合液２μＬを、２９３Ｔ細胞に加えて、３６時間インキュベートし、２９３Ｔ細胞を顕微鏡で観察した。また、レンチウイルスの代わりに１０⁶ＴＣＩＤ ５０／ｍＬのアデノウイルスを用いて同様の操作を行い、２９３Ｔ細胞を顕微鏡で観察した。

なお、レンチウイルス及びアデノウイルスはともにＧＦＰ遺伝子を組み込んだものを用いた。このレンチウイルス及びアデノウイルスが２９３Ｔ細胞に感染すると、ＧＦＰが合成されるため、２９３Ｔ細胞を顕微鏡で観察することで、系中のウイルスが活性状態にあるか不活性状態にあるかを確認することができる。

さらに、２μＬの保存液１又は２を２９３Ｔ細胞に加えて、３６時間インキュベートし、ネガティブコントロール１又は２とした。また、１０⁶ＴＣＩＤ ５０／ｍＬのレンチウイルス又は１０⁶ＴＣＩＤ ５０／ｍＬのアデノウイルスを、２９３Ｔ細胞に加えて、３６時間インキュベートし、ポジティブコントロールとした。上記の結果を、下記表２に示す。

−：緑色蛍光が認められず、ウイルスが不活性状態にある。
＋：緑色蛍光が認められ、ウイルスが活性状態にある。

〔PCRテスト〕
保存液１に、２×１０⁶ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬのレンチウイルスのテスト株を添加し、振盪した。そして、その溶液を２〜８℃又は２５℃で所定期間、保管した。保管後、溶液に対して、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応とポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＯＲＦ１ａ遺伝子とＮ遺伝子を増幅した。そして、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ（Ｃｔ）を算出した。また、同様の試験を、ウイルス量を２×１０⁴ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ、２×１０²ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬにして行った。その結果を図２〜４に示す。

また、保存液４〜６を用いて上記と同様のテストを行ったが、保存液１と比較してＣｔが少なくとも数サイクル分は低い結果となった。

偽ＳＡＲＳ−Ｃｏｖ−２として用いたレンチウイルスでの実験結果から、ＳＡＲＳ−Ｃｏｖ−２などのコロナウイルス（広く、ＲＮＡウイルス）においても、本発明の保存液により唾液検体中のＲＮＡウイルスを十分に不活性化し、かつ、ＲＮＡの検出精度のすぐれた検査を可能とする唾液サンプリングキット及び該唾液サンプリングキットを用いた方法を提供することができると考えられた。

本発明は、唾液検体中にウイルスが含まれているか否かを検査するための唾液サンプリングキットとして、産業上の利用可能性を有する。

１…有底チューブ、２…漏斗、３…保存液、１０…唾液サンプリングキット。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕
唾液を収集するための漏斗付き有底チューブと、
前記有底チューブ内に封入された保存液と、を有し、
該保存液が、
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート ０．１０〜０．２０ｍｏｌ／Ｌと、
グアニジンチオシアネート ０．８６〜０．９５ｍｏｌ／Ｌと、
エチレンジアミン四酢酸 ０．２３〜０．３３ｍｏｌ／Ｌと、を含む、
唾液サンプリングキット。
〔２〕
前記保存液が、クエン酸塩 ０．０１〜０．０６ｍｏｌ／Ｌを、さらに含む、
〔１〕に記載の唾液サンプリングキット。
〔３〕
前記保存液が、還元剤 ０．０１〜０．０６ｍｏｌ／Ｌを、さらに含む、
〔１〕又は〔２〕に記載の唾液サンプリングキット。
〔４〕
前記還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノールからなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、
〔３〕に記載の唾液サンプリングキット。
〔５〕
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート ０．１０〜０．２０ｍｏｌ／Ｌと、
グアニジンチオシアネート ０．８６〜０．９５ｍｏｌ／Ｌと、
エチレンジアミン四酢酸 ０．２５〜０．３０ｍｏｌ／Ｌと、を含む、
唾液サンプリングキット用の保存液。
〔６〕
〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の唾液サンプリングキットを用い、漏斗を介して有底チューブ内に唾液を収集し、該唾液と保存液が混合されたサンプルを得るステップと、
前記サンプルからＲＮＡを抽出し精製するステップと、
精製した前記ＲＮＡを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によりｃＤＮＡを生成し、得られた前記ｃＤＮＡに対してポリメラーゼ連鎖反応を行うステップと、
前記ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡを検出するステップと、を有する、
方法。

Claims (6)

1. 唾液を収集するための漏斗を有する有底チューブと、
   前記有底チューブ内に封入された保存液と、を有し、
   該保存液が、
   ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート ０．１０〜０．２０ｍｏｌ／Ｌと、
   グアニジンチオシアネート ０．８６〜０．９５ｍｏｌ／Ｌと、
   エチレンジアミン四酢酸 ０．２３〜０．３３ｍｏｌ／Ｌと、を含む、
   唾液サンプリングキット。
2. 前記保存液が、クエン酸塩 ０．０１〜０．０６ｍｏｌ／Ｌを、さらに含む、
   請求項１に記載の唾液サンプリングキット。
3. 前記保存液が、還元剤 ０．０１〜０．０６ｍｏｌ／Ｌを、さらに含む、
   請求項１又は２に記載の唾液サンプリングキット。
4. 前記還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノールからなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、
   請求項３に記載の唾液サンプリングキット。
5. ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート ０．１０〜０．２０ｍｏｌ／Ｌと、
   グアニジンチオシアネート ０．８６〜０．９５ｍｏｌ／Ｌと、
   エチレンジアミン四酢酸 ０．２５〜０．３０ｍｏｌ／Ｌと、を含む、
   唾液サンプリングキット用の保存液。
6. 請求項１〜４に記載の唾液サンプリングキットを用い、漏斗を介して有底チューブ内に唾液を収集し、該唾液と保存液が混合されたサンプルを得るステップと、
   前記サンプルからＲＮＡを抽出し精製するステップと、
   精製した前記ＲＮＡを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によりｃＤＮＡを生成し、得られた前記ｃＤＮＡに対してポリメラーゼ連鎖反応を行うステップと、
   前記ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡを検出するステップと、を有する、
   方法。

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