JP2021169539A - Insolubilization-free silk fibroin material - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、不溶化処理を行なうことなく水に対して不溶性のフィブロイン成形体を形成する方法に関する。 The present invention relates to a method for forming a fibroin molded article that is insoluble in water without performing an insolubilization treatment.
昆虫が作る繭は繊維状タンパク質を豊富に含んでおり、その特有の性質から、衣料用、医療用、化粧品用等の分野で研究が行われている。例えば、蚕の繭は、衣料用の天然繊維として一般的に利用されている。また、繭に含まれている絹タンパク質は、医療用の生体材料として研究されている。例えば、特許文献1には、再生医療用の細胞足場材料の原料として、蚕の絹タンパク質を利用したことが記載されている。
Cocoons made by insects are rich in fibrous proteins, and due to their unique properties, research is being conducted in fields such as clothing, medicine, and cosmetics. For example, silk moth cocoons are commonly used as natural fibers for clothing. In addition, silk proteins contained in cocoons are being studied as biomaterials for medical use. For example,
蚕から絹タンパク質である絹フィブロインを抽出する方法として、例えば、特許文献２に記載の方法が挙げられる。特許文献２は、生繭、乾繭もしくは煮繭した繭の繭層もしくは繭糸を、あるいは生糸、絹織物又はそれらの残糸を中性塩水溶液に溶解後、分別沈澱処理に付し、絹タンパク質である絹セリシンと分けることを特徴とする未分解絹フィブロインの製造法を開示している。また、特許文献３は、蚕体内の絹糸腺を水中に浸漬して水中に絹フィブロインを溶かしてから絹フィブロインを抽出し、フィルム状の絹タンパク質を形成する方法が開示されている。 Examples of the method for extracting silk fibroin, which is a silk protein, from silk moth include the method described in Patent Document 2. Patent Document 2 is a silk protein obtained by dissolving a cocoon layer or a cocoon thread of a raw cocoon, a dry cocoon or a boiled cocoon, or a raw silk, a silk fabric or a residual thread thereof in a neutral salt aqueous solution, and then subjecting it to a fractional precipitation treatment. It discloses a method for producing undecomposed silk fibroin, which is characterized by being separated from silk sericin. Further, Patent Document 3 discloses a method of immersing a silk gland in a silk moth in water to dissolve silk fibroin in water and then extracting silk fibroin to form a film-shaped silk protein.
しかしながら、特許文献２又は３に示す方法により得られた絹フィブロインから製造される従来型フィブロイン成形体(例えば、フィルム)は、高い水溶性を示し、水との接触によって溶解もしくは強度の脆弱化を示す不都合が存在していた。 However, the conventional fibroin molded product (for example, film) produced from silk fibroin obtained by the method shown in Patent Documents 2 or 3 exhibits high water solubility and dissolves or weakens in strength by contact with water. There was an inconvenience shown.
この不都合を克服するために、不溶化を目的とした処理(例えば、アルコールによる結晶化の誘起、あるいは熱処理による結晶化の誘起)が知られている。しかしながら、こうした不溶化処理は、製造工程を煩雑にするだけでなく、フィブロイン分子にダメージを与える原因となり得た。アルコールによる結晶化の誘起では、アルコール処理後に乾燥工程が必要となる。熱処理による結晶化の誘起では、200℃前後の高温処理が必要であり、その結果、タンパクの変性による褐色化が進行する。いずれの処理もフィブロインの高次構造に影響を与え、力学物性の低下（脆さの誘因）を招く。 In order to overcome this inconvenience, a treatment for the purpose of insolubilization (for example, induction of crystallization by alcohol or induction of crystallization by heat treatment) is known. However, such insolubilization treatment not only complicates the manufacturing process, but can also cause damage to fibroin molecules. Induction of crystallization with alcohol requires a drying step after the alcohol treatment. Induction of crystallization by heat treatment requires high-temperature treatment at around 200 ° C., and as a result, browning due to protein denaturation progresses. Both treatments affect the higher-order structure of fibroin, leading to a decrease in mechanical properties (inducing brittleness).
また、特許文献２の方法は、セリシンを除去するために繭にアルカリ処理や熱水処理が必要であるため、フィブロインタンパク質が損傷する問題が存在していた。また、特許文献２の方法は、脱塩処理が要求されるため作業時間が長期化する問題が存在していた。また、蚕の生体外に吐出した繭は、脱塩処理のための透析作業等において使用する水に起因してエンドトキシン等の有害物質が混入して汚染されている可能性があり、その除去が高コスト(例えば、エンドトキシンフリー水の費用)となる問題が存在していた。 Further, the method of Patent Document 2 has a problem that the fibroin protein is damaged because the cocoon needs to be treated with alkali or hot water in order to remove sericin. Further, the method of Patent Document 2 has a problem that the working time becomes long because desalination treatment is required. In addition, the cocoons discharged from the silk moth outside the living body may be contaminated with harmful substances such as endotoxin due to the water used in the dialysis work for desalination, and the removal of the cocoons can be done. There was a problem of high cost (for example, the cost of endotoxin-free water).
また、特許文献３の方法では、抽出の過程で水中に溶解したフィブロインは回収が困難であり、相当量のフィブロインが損失するという問題がある。さらに、カイコ体内から絹糸腺を取り出しての液状絹の抽出は、絹タンパク質のみで構成されている繭糸からの抽出とは異なり、カイコ体内の各種細胞や腸内細菌、およびタンパク質分解酵素などが存在するため、これら夾雑物の混在や、分解酵素によるフィブロインの分解が問題になる。特許文献３には、カイコ体内の細胞や腸内細菌の混入を防ぐ技術が開示されているが、細菌を滅菌する工程はなく、また、タンパク質分解酵素を失活化する工程も含まれていない。このため、水中に抽出したままの状態ではフィブロインの腐敗や分解が進行しやすい。特許文献３では、水抽出後に速やかに乾燥させてフィルム化することで上記の課題を解決することが述べられているが、カイコ体内からの絹糸腺取出しからフィルム化までを短期間で行わなければならい当該方法は、産業利用上の困難を伴う。 Further, the method of Patent Document 3 has a problem that fibroin dissolved in water in the extraction process is difficult to recover and a considerable amount of fibroin is lost. Furthermore, unlike the extraction from cocoon threads, which are composed only of silk proteins, the extraction of liquid silk by extracting silk glands from the silk moth contains various cells, intestinal bacteria, and proteolytic enzymes in the silk moth. Therefore, the mixture of these impurities and the decomposition of fibroin by degrading enzymes become problems. Patent Document 3 discloses a technique for preventing contamination of cells and intestinal bacteria in the silk moth, but does not include a step of sterilizing the bacteria and a step of inactivating a proteolytic enzyme. .. For this reason, fibroin is prone to putrefaction and decomposition in the state of being extracted into water. Patent Document 3 states that the above-mentioned problems can be solved by quickly drying the silk moth after water extraction to form a film. This method involves difficulties in industrial use.
本発明は、以上の事情に鑑みてなされたものであり、不溶化処理を行なうことなく水に対して不溶性のフィブロイン成形体を形成する方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a method for forming a fibroin molded product insoluble in water without performing an insolubilization treatment.
本発明者らは、上記問題点を回避するフィブロイン成形体の製造方法を検討した。図１には、従来の製造方法と本発明の製造方法を概略的に示している。本発明者らは、まず、絹糸腺をアルコール水溶液で固定化して、得られたフィブロインタンパク質を湿潤状態のまま含ハロゲン溶媒に溶かした。得られたフィブロイン溶液をキャストしてフィブロインフィルムを作成したところ、驚くべきことに、このフィブロインフィルムは、水に対して不溶性であった。図１に示す通り、従来の方法で製造したフィブロインフィルムは、水に対して水溶性である。更に、従来の方法で製造したフィルムを含ハロゲン溶媒に溶かして得られたフィブロイン溶液からフィルムを作成しても、得られるフィルムは、水に対して水溶性であった。 The present inventors have studied a method for producing a fibroin molded product that avoids the above problems. FIG. 1 schematically shows a conventional manufacturing method and a manufacturing method of the present invention. First, the present inventors fixed the silk glands with an aqueous alcohol solution, and dissolved the obtained fibroin protein in a halogen-containing solvent in a wet state. When the resulting fibroin solution was cast to make a fibroin film, surprisingly, the fibroin film was insoluble in water. As shown in FIG. 1, the fibroin film produced by the conventional method is water-soluble in water. Further, even if a film was prepared from a fibroin solution obtained by dissolving a film produced by a conventional method in a halogen-containing solvent, the obtained film was water-soluble in water.
本発明者らは、この驚くべき発見に基づいて鋭意研究し、不溶化処理を行なうことなく水に対して不溶性のフィブロイン成形体を形成する方法を完成させるに至った。 Based on this surprising finding, the inventors have worked diligently to complete a method for forming a water-insoluble fibroin molded article without insolubilization.
本願発明によれば、
蚕から取り出された中部絹糸腺を10から100%アルコール水溶液に浸漬して固定化する工程と、
上記固定化した中部絹糸腺から夾雑物を取り除きフィブロインタンパク質を取得する工程と、
含ハロゲン溶媒を用いて、湿潤状態にある上記フィブロインタンパク質を溶解してフィブロイン溶液を調製する工程と、
上記フィブロイン溶液を乾燥させてフィブロイン成形体を形成する工程と、を含む、
水に対して不溶性のフィブロイン成形体を形成する方法が提供される。
後述する実施例において実証されている通り、上記方法は、フィブロイン成形体を形成した後に不溶化処理を行なうことなく、不溶性のフィブロイン成形体を得ることができる。
According to the invention of the present application
The process of immersing the central silk gland taken out from the silk moth in a 10 to 100% alcohol aqueous solution to immobilize it, and
The process of removing impurities from the immobilized central silk gland to obtain fibroin protein, and
A step of dissolving the above-mentioned fibroin protein in a wet state to prepare a fibroin solution using a halogen-containing solvent, and
A step of drying the fibroin solution to form a fibroin molded product, and the like.
A method of forming a fibroin molded article that is insoluble in water is provided.
As demonstrated in the examples described later, the above method can obtain an insoluble fibroin molded product without performing an insolubilization treatment after forming the fibroin molded product.
また、本発明によれば、
蚕から取り出された中部絹糸腺を10から100%アルコール水溶液に浸漬して固定化する工程と、
上記固定化した中部絹糸腺から夾雑物を取り除きフィブロインタンパク質を取得する工程と、を含む、
フィブロインタンパク質を取得する方法が提供される。
後述する実施例において実証されている通り、上記方法によればフィブロインタンパク質を取得することができる。
Further, according to the present invention.
The process of immersing the central silk gland taken out from the silk moth in a 10 to 100% alcohol aqueous solution to immobilize it, and
Including the step of removing impurities from the immobilized central silk gland to obtain fibroin protein, and the like.
A method for obtaining fibroin protein is provided.
As demonstrated in the examples described below, the fibroin protein can be obtained by the above method.
また、本発明によれば、水の接触角が、その測定開始時間から５分間において、85°から100°の範囲内である、水に対して不溶性のフィブロイン成形体が提供される。
後述する実施例において実証されている通り、上記成形体は、水に対して不溶性のフィブロイン成形体である。
Further, according to the present invention, there is provided a fibroin molded product insoluble in water, in which the contact angle of water is in the range of 85 ° to 100 ° in 5 minutes from the measurement start time.
As demonstrated in the examples described below, the molded product is a fibroin molded product that is insoluble in water.
＜概要＞
以下、本発明の実施の形態について、詳しく説明する。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑をさけるために、適宜説明を省略する。
<Overview>
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. The same contents will be omitted as appropriate in order to avoid repetitive complications.
本実施形態によれば、
蚕から取り出された中部絹糸腺を10から100%アルコール水溶液に浸漬して固定化する工程と、
上記固定化した中部絹糸腺から夾雑物を取り除きフィブロインタンパク質を取得する工程と、
含ハロゲン溶媒を用いて、湿潤状態にある上記フィブロインタンパク質を溶解してフィブロイン溶液を調製する工程と、
上記フィブロイン溶液を乾燥させてフィブロイン成形体を形成する工程と、を含む、
水に対して不溶性のフィブロイン成形体を形成する方法が提供される。
上記方法は、フィブロイン成形体を形成した後に不溶化処理を行なうことなく、水に対して不溶性のフィブロイン成形体を得ることができる。
According to this embodiment
The process of immersing the central silk gland taken out from the silk moth in a 10 to 100% alcohol aqueous solution to immobilize it, and
The process of removing impurities from the immobilized central silk gland to obtain fibroin protein, and
A step of dissolving the above-mentioned fibroin protein in a wet state to prepare a fibroin solution using a halogen-containing solvent, and
A step of drying the fibroin solution to form a fibroin molded product, and the like.
A method of forming a fibroin molded article that is insoluble in water is provided.
In the above method, a fibroin molded product that is insoluble in water can be obtained without performing an insolubilization treatment after forming the fibroin molded product.
＜蚕から取り出された中部絹糸腺を10から100%アルコール水溶液に浸漬して固定化する工程＞
本工程において、蚕(学名Bombyx mori)から取り出された中部絹糸腺を10から100%アルコール水溶液に浸漬する。中部絹糸腺は、メス又はハサミを用いて蚕の腹部を開いて取り出してもよい。また、中部絹糸腺は、ローラーやヘラを用いて蚕から中部絹糸腺を押し出してもよい。絹糸線は、前部絹糸線、中部絹糸線及び後部絹糸線に分けることができる。中部絹糸腺は、絹糸腺から前部絹糸線及び後部絹糸線を除去することで取得することができる。中部絹糸腺は、上記アルコールによって固定化される。上記水溶液中のアルコール濃度は、上記中部絹糸腺が固定化される濃度であればよく、例えば、10から100%であり、10、20、30、40、50、60、70、80、90、98、99及び100%からなる群より選択される2点間の範囲内であってもよい。上記水溶液中のアルコール濃度は、後述する夾雑物の除去を容易にするために、好ましくは、10から40%である。上記アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール及びそれらの混合物から選択することができ、好ましくは、エタノールである。また、上記アルコールは、蚕中に含まれる酵素による分解を避けるために、冷アルコール(例えば、4℃)であることが好ましい。本実施形態において、上記方法は、更に、10から100%アルコール水溶液を用いて上記中部絹糸腺を洗浄する工程を含んでいてもよい。洗浄工程におけるアルコール水溶液は、固定化工程におけるアルコール水溶液と同一であってもよく、異なるものであってもよい。
<Step of immersing the central silk gland taken out from the silk moth in a 10 to 100% alcohol aqueous solution to immobilize it>
In this step, the central silk glands taken from the silk moth (scientific name: Bombyx mori) are immersed in a 10 to 100% alcohol aqueous solution. The central silk gland may be removed by opening the abdomen of the silk moth with a scalpel or scissors. Further, the central silk gland may be extruded from the silk moth using a roller or a spatula. The silk thread wire can be divided into a front silk thread wire, a middle silk thread wire and a rear silk thread wire. The central silk gland can be obtained by removing the anterior and posterior silk glands from the silk gland. The central silk gland is immobilized by the alcohol. The alcohol concentration in the aqueous solution may be any concentration as long as the central silk gland is immobilized, for example, 10 to 100%, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, It may be within the range between two points selected from the group consisting of 98, 99 and 100%. The alcohol concentration in the aqueous solution is preferably 10 to 40% in order to facilitate the removal of impurities described later. The alcohol can be selected from methanol, ethanol, propanol and mixtures thereof, preferably ethanol. Further, the alcohol is preferably cold alcohol (for example, 4 ° C.) in order to avoid decomposition by enzymes contained in silk moth. In the present embodiment, the method may further include a step of washing the central silk gland with a 10 to 100% alcohol aqueous solution. The alcohol aqueous solution in the washing step may be the same as or different from the alcohol aqueous solution in the immobilization step.
本工程において、中部絹糸腺に対するアルコール水溶液の体積比(浴比)は、上記中部絹糸腺が固定化される体積比であればよく、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9又は10以上である。アルコール水溶液への中部絹糸腺の浸漬時間は、中部絹糸腺が固定化される時間であれば特に限定しないが、例えば、１時間以上であればよく、アルコール水溶液中のアルコール濃度、中部絹糸腺に対するアルコール水溶液の体積比及び/又は下流の工程を開始するタイミングによって変更してもよい。本工程によって、中部絹糸腺中の酵素を失活させることができ、また、中部絹糸腺を殺菌することができるため、中部絹糸腺中のフィブロインタンパク質の低分子化を防ぐことができる。従って、多数の蚕から中部絹糸腺を取り出す場合は、全ての中部絹糸腺を上記アルコール水溶液中に浸漬できるまで、浸漬処理を続けていてもよい。 In this step, the volume ratio (bath ratio) of the alcohol aqueous solution to the central silk gland may be the volume ratio at which the central silk gland is immobilized, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. , 9 or 10 or more. The immersion time of the central silk gland in the alcohol aqueous solution is not particularly limited as long as it is the time for the central silk gland to be immobilized. It may be changed depending on the volume ratio of the aqueous alcohol solution and / or the timing of starting the downstream process. By this step, the enzyme in the central silk gland can be inactivated, and the central silk gland can be sterilized, so that the fibroin protein in the central silk gland can be prevented from being reduced in molecular weight. Therefore, when the central silk glands are taken out from a large number of silk moths, the immersion treatment may be continued until all the central silk glands can be immersed in the alcohol aqueous solution.
＜上記固定化した中部絹糸腺から夾雑物を取り除きフィブロインタンパク質を取得する工程＞
本工程において、固定化した中部絹糸腺中に含まれる夾雑物を取り除く。夾雑物には、中部絹糸腺の表皮細胞、分解酵素、セリシンが含まれる。中部絹視線から夾雑物を取り除くことによって、フィブロインタンパク質が取得できる。夾雑物は、手を用いて及び/又はピンセットによって中部絹糸腺から除去してもよい。中部絹視線は、前部絹糸腺側の前区、後部絹糸腺側の後区と、前区と後区との間の中区に分けることができる。より純度が高いフィブロインタンパク質を取得するために、固定化した中部絹糸腺の後区を切り出して、中部絹視線の後区から夾雑物を除去してもよい。また、夾雑物の除去を容易にするために、中部絹糸腺の後区を用いてもよい。高いフィブロインタンパク質の純度よりもその量を重視する場合は、中部絹視線の全区を用いてもよい。取得されたフィブロインタンパク質は、湿潤状態を維持させるのが好ましい。乾燥を防ぐために、フィブロインタンパク質を4℃の上記アルコール水溶液で保管してもよい。
<Step of removing impurities from the immobilized central silk gland to obtain fibroin protein>
In this step, impurities contained in the immobilized central silk gland are removed. Contaminants include epidermal cells of the central silk gland, degrading enzymes, and sericin. Fibroin protein can be obtained by removing impurities from the central silk line of sight. Contaminants may be removed from the central silk gland by hand and / or by tweezers. The central silk line of sight can be divided into a front section on the anterior silk gland side, a posterior section on the posterior silk gland side, and a middle section between the anterior section and the posterior section. In order to obtain a more pure fibroin protein, the posterior segment of the immobilized central silk gland may be cut out to remove impurities from the posterior segment of the central silk line of sight. In addition, the posterior segment of the central silk gland may be used to facilitate the removal of contaminants. If the amount of fibroin protein is more important than the purity of the high fibroin protein, the entire section of the central silk line of sight may be used. The obtained fibroin protein is preferably kept moist. To prevent drying, the fibroin protein may be stored in the above alcohol aqueous solution at 4 ° C.
＜含ハロゲン溶媒を用いて、湿潤状態にある上記フィブロインタンパク質を溶解してフィブロイン溶液を調製する工程＞
この工程において、湿潤状態にあるフィブロインタンパク質を含ハロゲン溶媒に溶かす。含ハロゲン溶媒に溶かすフィブロインタンパク質は、湿潤状態にある必要がある。理由は、乾燥状態にあるフィブロインタンパク質は、含ハロゲン溶媒に溶かすことができないためである。含ハロゲン溶媒は、1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールである。含ハロゲン溶媒へのフィブロインタンパク質の溶解は、室温で行なうことができる。多数の蚕から中部絹糸腺を取り出す場合は、全てのフィブロインタンパク質を上記含ハロゲン溶媒中に浸漬できるまで、浸漬処理を続けていてもよい。この工程において製造されたフィブロイン溶液は、長期期間の保存（例えば、1日、3日、6日及び30日並びにそれ以上の日数）が可能である。
<Step of preparing a fibroin solution by dissolving the above-mentioned fibroin protein in a wet state using a halogen-containing solvent>
In this step, the wet fibroin protein is dissolved in a halogen-containing solvent. The fibroin protein to be dissolved in a halogen-containing solvent needs to be in a wet state. The reason is that the dried fibroin protein cannot be dissolved in a halogen-containing solvent. The halogen-containing solvent is 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. The fibroin protein can be dissolved in a halogen-containing solvent at room temperature. When the central silk gland is taken out from a large number of silk moths, the immersion treatment may be continued until all the fibroin proteins can be immersed in the halogen-containing solvent. The fibroin solution produced in this step can be stored for a long period of time (eg, 1 day, 3 days, 6 days and 30 days and more).
＜上記フィブロイン溶液を乾燥させてフィブロイン成形体を形成する工程＞
この工程において、フィブロイン溶液を乾燥させる。フィブロイン溶液は、目的の形状の型の中で乾燥させることで、目的の形状(例えば、ブロック)のフィブロイン成形体を形成させることができる。また、フィブロイン溶液を薄く乾燥させることでフィルム状のフィブロイン成形体を形成させることができる。
<Step of drying the above fibroin solution to form a fibroin molded product>
In this step, the fibroin solution is dried. The fibroin solution can be dried in a mold having a desired shape to form a fibroin molded product having a desired shape (for example, a block). Further, a film-like fibroin molded product can be formed by thinly drying the fibroin solution.
得られたフィブロイン成形体は、水に対して不溶性である。フィブロイン成形体が水に対して不溶性であるか否かを調べる方法には、約1cm(縦) x 1cm(横) x10μm(厚さ)のサイズのフィルムフィブロイン成形体が水で溶けるか否かを観察する方法が挙げられる。例えば、フィルムフィブロイン成形体を10分間水に浸しても溶解しない場合は、このフィブロイン成形体は、水に対して不溶性であると判断してもよい。また、フィルムフィブロイン成形体の水の接触角を経時的に測定して、水に対して不溶性であるか否かを判断することもできる。例えば、測定直後の水の接触角と5分後の水の接触角との差が20°、19°、18°、17°、16°又は15°以下の場合、フィブロイン成形体は、水に対して不溶性であると判断してもよい。なお、測定条件は、室温25℃、湿度30％、滴下液滴量3.5μlとする。従って、フィブロイン成形体の水の接触角は、その測定開始時間から５分間において、85°から100°の範囲内であってもよい。
The obtained fibroin molded product is insoluble in water. To find out if a fibroin part is insoluble in water, see if a film fibroin part with a size of about 1 cm (length) x 1 cm (width) x 10 μm (thickness) is soluble in water. There is a method of observing. For example, if the film fibroin molded product is not dissolved even after being immersed in water for 10 minutes, it may be determined that the fibroin molded product is insoluble in water. It is also possible to measure the contact angle of water in the film fibroin molded product over time to determine whether or not it is insoluble in water. For example, if the difference between the contact angle of water immediately after measurement and the contact angle of water after 5 minutes is 20 °, 19 °, 18 °, 17 °, 16 ° or 15 ° or less, the fibroin molded article is put into water. On the other hand, it may be determined that it is insoluble. The measurement conditions are room temperature 25 ° C.,
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。例えば、水の接触角が、その測定開始時間から５分間において、85°から100°の範囲内である、水に対して不溶性のフィブロイン成形体も本発明の範囲内である。 Although the embodiments of the present invention have been described above, these are examples of the present invention, and various configurations other than the above can be adopted. For example, a fibroin molded product insoluble in water, in which the contact angle of water is in the range of 85 ° to 100 ° in 5 minutes from the measurement start time, is also within the range of the present invention.
以下、本発明を実施例及び図面によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。機器の操作及びキットの使用は、各メーカーの製造元プロトコールに従った。 Hereinafter, the present invention will be further described with reference to Examples and drawings, but the present invention is not limited thereto. The operation of the equipment and the use of the kit followed the manufacturer's protocol of each manufacturer.
＜実施例１＞
中部絹糸腺の取り出し
家蚕（品種）5齢熟蚕カイコの腹部を生きた状態で開いた（図２）。カイコの体内から、余分な力を与えないよう静かに絹糸腺を取り出した。絹糸腺の前後に存在する前部絹糸腺及び後部絹糸腺は、中部絹糸腺を無傷で全量取り出すために、適切な箇所で切断して体内に残した。カイコの腹部を開く際、カイコの中腸からの内容物の流出による絹糸腺へのコンタミを避けるため、カイコの中腸を一切傷つけることなく絹糸腺のみを取り出した（図３）。
<Example 1>
Removal of the central silk gland The abdomen of the silk moth (variety) 5th instar mature silk moth was opened alive (Fig. 2). The silk gland was gently removed from the body of the silk moth so as not to give extra force. The anterior and posterior silk glands that exist before and after the silk glands were cut at appropriate points and left in the body in order to remove the entire middle silk glands intact. When opening the abdomen of the silk moth, only the silk gland was taken out without damaging the midgut of the silk moth in order to avoid contamination of the silk moth gland due to the outflow of the contents from the midgut of the silk moth (Fig. 3).
＜実施例２＞
絹糸腺のエタノール処理並びに表皮細胞及びセリシンタンパク質の除去
取り出した絹糸腺は冷エタノール水溶液(Nacalai Tesque, Japan)に素早く浸漬した。約10分間浸漬（洗浄）後、同濃度のフレッシュな冷エタノール水溶液に移し、冷蔵庫内(4℃)で密閉浸漬保存を行った。エタノール水溶液の濃度は、0（純水）から99％の間で様々な濃度について検討し、処理濃度の違いによる作業効率や素材の構造・物性への影響を調べた。浸漬中のエタノール濃度の変化を抑えるため、絹糸腺に対するエタノール水溶液の体積比（浴比）は10以上（エタノール水溶液50mlに対して絹糸腺10本以下）と十分大きくした。
<Example 2>
Ethanol treatment of silk glands and removal of epidermal cells and sericin protein The removed silk glands were quickly immersed in a cold ethanol aqueous solution (Nacalai Tesque, Japan). After soaking (washing) for about 10 minutes, the mixture was transferred to a fresh cold ethanol aqueous solution having the same concentration, and stored in a closed refrigerator (4 ° C.). The concentration of the ethanol aqueous solution was examined at various concentrations between 0 (pure water) and 99%, and the effects of different treatment concentrations on work efficiency and the structure and physical properties of the material were investigated. In order to suppress the change in ethanol concentration during immersion, the volume ratio (bath ratio) of the ethanol aqueous solution to the silk thread glands was sufficiently large to be 10 or more (10 silk thread glands or less with respect to 50 ml of the ethanol aqueous solution).
0~99%エタノール水溶液（0、10、20、30、40、50、60、70、80、90及び99%の計11種類）に一定期間浸漬後の中部絹糸腺について、絹糸腺表皮細胞及び絹糸腺の内側に存在するセリシンタンパク質の除去（すなわち、フィブロインタンパク質からの分離）を試みた。 For the middle silk gland after being immersed in 0 to 99% ethanol aqueous solution (0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 and 99% for a total of 11 types), the silk gland epidermal cells and Attempts were made to remove the sericin protein present inside the silk glands (ie, to separate it from the fibroin protein).
0%エタノール水溶液（即ち、純水）では、フィブロインが絹糸腺より純水中に溶け出したが、フィブロインの凝固は生じなかった（図４）。10%エタノール水溶液では、絹糸腺からのフィブロインの溶け出しが若干認められた(不図示)。10%を含む全てのエタノール濃度で、１時間以内に絹糸腺内部のフィブロインが凝固した（図５）。凝固が認められた10~99%の絹糸腺について、3日後、6日後、30日後にエタノール水溶液から取り出した。これらの絹糸腺について、絹糸腺の表皮及びセリシン除去の容易さ（作業効率）、除去後のフィブロインの状態、含ハロゲン溶媒である1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)への溶解性、そしてフィルムの水溶性を比較した。その結果を表1に示している。なお、いずれの日数(3日後、6日後及び30日後)であっても、結果に差異が見られなかったため、表１には、3日後のデータを代表して示している。 In the 0% aqueous ethanol solution (that is, pure water), fibroin was dissolved from the silk glands into the pure water, but fibroin did not coagulate (Fig. 4). In the 10% aqueous ethanol solution, some fibroin was found to dissolve from the silk glands (not shown). Fibroin inside the silk glands coagulated within 1 hour at all ethanol concentrations, including 10% (Fig. 5). 10 to 99% of silk glands in which coagulation was observed were removed from the aqueous ethanol solution after 3, 6, and 30 days. Regarding these silk glands, the ease of removing the epidermis and sericin of the silk glands (working efficiency), the state of fibroin after removal, and the halogen-containing solvent 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2- The solubility in propanol (HFIP) and the water solubility of the film were compared. The results are shown in Table 1. Since there was no difference in the results regardless of the number of days (3 days, 6 days, and 30 days), Table 1 shows the data after 3 days as a representative.
10~99%エタノール水溶液の全てにおいて、中部絹糸腺の後区（図６）を除去すると、手作業により絹糸腺の表皮とセリシンをフィブロインから分離することが可能であった（表1、図７）。その分離作業性は、エタノール濃度に依存するものであった。エタノール濃度が増加するにつれ、絹糸腺（フィブロイン、セリシン、表皮の全て）の硬度が増加し、分離作業性の低下が認められた（表1）。10-40%エタノールでは、中部絹糸腺を覆うセリシンと表皮を一続きに、途中破れることなくスムーズに剥がすことが出来（図８）、一連の作業に要する時間は30秒程度であった。一方、50%濃度以上ではスムーズ性は減少し、70%以上では、絹糸腺の硬度化が著しく、表皮とフィブロインとの接着性が高くなり、一続きに剥がすことが困難となった。その結果、上記分離作業には10分程度を要し、分離作業の効率が著しく低下した。 Removal of the posterior segment of the central silk gland (Fig. 6) in all 10-99% aqueous ethanol solutions allowed manual separation of the epidermis and sericin of the silk gland from fibroin (Table 1, Fig. 7). ). The separation workability depended on the ethanol concentration. As the ethanol concentration increased, the hardness of the silk glands (fibroin, sericin, and epidermis) increased, and the separation workability decreased (Table 1). With 10-40% ethanol, the sericin and epidermis covering the central silk gland could be peeled off smoothly without tearing in the middle (Fig. 8), and the time required for the series of operations was about 30 seconds. On the other hand, at a concentration of 50% or more, the smoothness decreased, and at 70% or more, the hardness of the silk glands became remarkable, the adhesiveness between the epidermis and fibroin became high, and it became difficult to peel them off continuously. As a result, the separation work took about 10 minutes, and the efficiency of the separation work was significantly reduced.
絹糸腺の表皮が破れることなく一体として容易に剥がすことのできる低濃度のエタノール条件では、表皮とセリシンが取り除けたことを確認できるのに対し、高濃度のエタノール条件（とくに70%以上）では、表皮が破れるケースが多く、完全に除去できたかどうかの確認が困難となった。一方、全ての処理濃度において、中部絹糸腺の後区（図６）に関しては、表皮が薄く、一体として剥がすことが困難であった。絹糸腺の表皮とセリシンをフィブロインから分離する作業後、光学顕微鏡(NIKON OPTIPHOT2-POL (NIKON, Japan))を用いて無偏光下でフィブロインを観察すると、極僅かではあるが表皮とセリシンの取り残しが見つかるケースがあった（図９）。そのような取り残しは、引き続くHFIPへの溶解過程で溶け残り、最終プロダクトまで残存することが確認された（図１０）。中部絹糸腺の後区におけるフィブロイン以外の不純物の残存は、核磁気共鳴（NMR）分光法測定によっても確認された（図１１：矢印で示されるスペクトルが不純物に帰属する）。このような理由により、極僅かな不純物の混入を嫌う目的においては、引き続くHFIP溶解に先立ち中部絹糸腺の後区のみを予め除外することが望ましい。以上、絹糸腺からフィブロインのみを分離回収する目的において、作業性の観点からは40%以下のエタノール処理が好ましいことが示された。一方、エタノール処理には、絹糸腺表面の滅菌効果を行う重要な役割も兼ねており、作業性と滅菌性の双方を考慮すると濃度が40%のエタノール水溶液が最適な濃度と判断した。 Under low-concentration ethanol conditions, where the epidermis of the silk glands can be easily peeled off as a unit without tearing, it can be confirmed that the epidermis and sericin could be removed, whereas under high-concentration ethanol conditions (especially 70% or more), it can be confirmed. In many cases, the epidermis was torn, making it difficult to confirm whether it could be completely removed. On the other hand, at all treatment concentrations, the epidermis of the posterior section of the central silk gland (Fig. 6) was thin and difficult to peel off as a unit. After the work of separating the epidermis of the silk gland and sericin from fibroin, when observing fibroin under an optical microscope (NIKON OPTIPHOT2-POL (NIKON, Japan)) under unpolarized light, there is a slight amount of leftover epidermis and sericin. There was a case where it was found (Fig. 9). It was confirmed that such leftovers remained undissolved in the subsequent dissolution process in HFIP and remained until the final product (Fig. 10). Residual impurities other than fibroin in the posterior segment of the central silk gland were also confirmed by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy measurements (FIG. 11: spectrum indicated by arrows belong to impurities). For this reason, it is desirable to exclude only the posterior segment of the central silk gland prior to subsequent HFIP dissolution for the purpose of disliking the inclusion of very small impurities. As described above, it has been shown that 40% or less ethanol treatment is preferable from the viewpoint of workability for the purpose of separating and recovering only fibroin from the silk gland. On the other hand, ethanol treatment also plays an important role in sterilizing the surface of the silk gland, and it was judged that an aqueous ethanol solution with a concentration of 40% was the optimum concentration in consideration of both workability and sterilization.
＜実施例３＞
表皮及びセリシン除去後の絹糸腺フィブロインの保管
10~99%エタノール水溶液により凝固した中部絹糸腺から表皮とセリシンを取り除いて得られる絹糸腺フィブロインは、その後、再び同濃度のエタノール水溶液に浸漬、密閉し、4℃環境下で保管した。いずれの濃度においても、少なくとも30日間の保管期間において、目視や触手において目立った変化は認められなかった(不図示)。フィブロインの回収方法として最適であると提案した40%エタノール処理試料については240日間浸漬後も目視、触手による目立った変化がないことを確認した(不図示)。さらに、40%エタノール処理試料について、浸漬期間6日と240日の試料について広角X線回折（WAXD）測定を行い、構造的にも目立った変化が認められないことを確認した（実施例6参照）。
<Example 3>
Storage of silk gland fibroin after removal of epidermis and sericin
The silk gland fibroin obtained by removing the epidermis and sericin from the central silk gland coagulated with a 10 to 99% ethanol aqueous solution was then immersed in the same concentration of ethanol aqueous solution again, sealed, and stored in an environment of 4 ° C. No noticeable changes were observed visually or with tentacles at any of the concentrations during the storage period of at least 30 days (not shown). Regarding the 40% ethanol-treated sample, which was proposed to be the most suitable method for recovering fibroin, it was confirmed that there was no noticeable change by tentacles even after immersion for 240 days (not shown). Furthermore, wide-angle X-ray diffraction (WAXD) measurements were performed on the 40% ethanol-treated samples with immersion periods of 6 days and 240 days, and it was confirmed that no noticeable structural changes were observed (see Example 6). ).
＜実施例４＞
含ハロゲン溶媒による絹糸腺フィブロインの溶解
エタノール水溶液により凝固した中部絹糸腺から表皮とセリシンを取り除いて得られる絹糸腺フィブロインを含ハロゲン溶媒であるHFIP(Tokyo Chemical Industry Co. Ltd., Japan)へ溶解させた。10-99%エタノール水溶液で処理し、その後、中部絹糸腺の表皮とセリシンを除去して得られた絹糸腺フィブロインをHFIPに室温で浸漬し、振とうした。溶解条件は、表皮とセリシンを除去直後のフィブロインについて25mg/mlとした。フィブロインはHFIPに浸漬する段階で水およびエタノールで濡れた状態であるため、上記重量には水およびエタノールの重量も含まれている。10-99%エタノール水溶液で処理したいずれのフィブロインも2時間程度で溶解し、各試料間での溶解性に目立った差異は認められなかった。
<Example 4>
Dissolution of silk gland fibroin with a halogen-containing solvent The silk gland fibroin obtained by removing the epidermis and sericin from the central silk gland coagulated with an aqueous ethanol solution is dissolved in the halogen-containing solvent HFIP (Tokyo Chemical Industry Co. Ltd., Japan). rice field. After treatment with a 10-99% aqueous ethanol solution, the silk gland fibroin obtained by removing the epidermis and sericin of the central silk gland was immersed in HFIP at room temperature and shaken. The dissolution condition was 25 mg / ml for fibroin immediately after removing the epidermis and sericin. Since fibroin is wet with water and ethanol when immersed in HFIP, the above weight also includes the weight of water and ethanol. All fibroins treated with a 10-99% ethanol aqueous solution dissolved in about 2 hours, and no noticeable difference in solubility was observed between the samples.
＜実施例４＞
絹糸腺フィブロイン-HFIP溶液から得られたキャストフィルムの水溶性試験
上述した通り、10-99%エタノールで処理した絹糸腺フィブロインを含むHFIP溶液(フィブロイン-HFIP溶液)を調製した。フィブロイン-HFIP溶液からキャストフィルムを作製して、このフィルムを縦横約1cm x 1cmのサイズにカットした。フィルムの厚みは、エタノールの濃度に関係なく、約10μmとした。カットしたフィルムを水面上に浮かべ、水溶性の有無を調べた。
<Example 4>
Water solubility test of cast film obtained from silk gland fibroin-HFIP solution As described above, an HFIP solution (fibroin-HFIP solution) containing silk gland fibroin treated with 10-99% ethanol was prepared. A cast film was prepared from the fibroin-HFIP solution, and the film was cut to a size of about 1 cm x 1 cm in length and width. The thickness of the film was about 10 μm regardless of the concentration of ethanol. The cut film was floated on the surface of the water and examined for water solubility.
フィルムの水溶性に対するフィルムの厚さ依存性を調べるため、40%エタノール処理試料を使い、2~200μmの範囲で異なる膜厚のフィルムについての水溶性を調べた。10~99%エタノールで固化させた試料を含むHFIPキャストフィルムは、全て、水に対し不溶性を示した（表1）。また、とくに40%エタノール処理フィルムは、約10μmの厚みで水に不溶性であることが確認された(図１２a)。2~200μmの様々な厚さのフィルムであっても、同様に、水に対して不溶性であった(不図示)。比較のため、再生フィブロインより作製した2種類のフィルムの溶解試験を実施した。ここで用いた2種類の再生フィブロインフィルムは、絹糸を9M濃度のLiBr濃厚水溶液を用いて溶解し、純水で透析後、（i）水溶液をポリスチレンシャーレ上にキャストし得られたフィルム（再生フィルム(i)）、および（ii）水溶液を凍結乾燥し、スポンジ状乾燥物を得た後、これをHFIPに溶解させキャストしたフィルム（再生フィルム(ii)）の2種類を指す。従来報告されてきたとおり、いずれの再生フィブロインも容易に水に溶けることが確認された（図１２b及びc）。 In order to investigate the thickness dependence of the film on the water solubility, 40% ethanol-treated samples were used, and the water solubility of films having different film thicknesses in the range of 2 to 200 μm was examined. All HFIP cast films containing samples solidified with 10-99% ethanol were insoluble in water (Table 1). In particular, it was confirmed that the 40% ethanol-treated film had a thickness of about 10 μm and was insoluble in water (Fig. 12a). Films of various thicknesses from 2 to 200 μm were also insoluble in water (not shown). For comparison, a dissolution test was performed on two types of films made from regenerated fibroin. The two types of regenerated fibroin films used here are films obtained by dissolving silk thread using a concentrated LiBr aqueous solution having a concentration of 9 M, dialyzing with pure water, and then casting (i) the aqueous solution onto a polystyrene chalet (recycled film). (I)) and (ii) Aqueous solution is freeze-dried to obtain a sponge-like dried product, which is then dissolved in HFIP and cast (recycled film (ii)). As previously reported, it was confirmed that all regenerated fibroins are easily soluble in water (FIGS. 12b and c).
＜実施例５＞
絹糸腺フィブロイン-HFIP溶液から得られたキャストフィルム表面の濡れ性試験
40%エタノール処理絹糸腺フィブロインを用いて作製したHFIPキャストフィルム(未分解絹糸腺フィブロインフィルム)表面の濡れ性及びにその時間経過（5分間）による変化を、接触角(contact angle)測定により評価した。接触角は、動的接触角測定装置 FTA188 (JASCO INTERNATIONAL Co. Ltd., Japan)を使用して、スライドガラス上にキャストした各フィルム上に、約3.5μlの水滴を滴下し、接触角の時間変化を5分間追跡することで決定した。比較として、上述した再生フィブロインフィルム(i)及び(ii)並びにスライドガラス表面の濡れ性と比較した。結果を図１３に示している。再生フィブロインフィルム(i)及び(ii)は、約60°の接触角を示した。これに対し、未分解絹糸腺フィブロインフィルムでは約100°の接触角を示し、高い撥水性を示した。さらに、液滴滴下後の接触角の経時変化を見ると、再生フィブロインフィルム(i)及び(ii)と共に、滴下の30秒後に接触角は約50°まで低下し、水の浸透が急激に生じていることが示された。このことから、濡れ直後より表面の溶解が生じていると考えられる。再生フィブロインフィルム(i)及び(ii)の接触角は、その後も大きく低下を続けた。一方、絹糸腺フィブロインフィルムでは、このような急激な接触角の変化は認められず、スライドガラス上に滴下した液滴の接触角の変化との比較から判断すると、ほぼ、蒸発に伴う接触角の変化のみが生じていると考えられる。このことは、水溶性試験の結果とも矛盾がない。従って、この方法により作製したフィルムは、高い撥水性を有していることが裏付けられた。
<Example 5>
Wetting test of cast film surface obtained from silk gland fibroin-HFIP solution
The wettability of the surface of the HFIP cast film (undigraded silk gland fibroin film) prepared using 40% ethanol-treated silk gland fibroin and the change over time (5 minutes) were evaluated by contact angle measurement. .. For the contact angle, use the dynamic contact angle measuring device FTA188 (JASCO INTERNATIONAL Co. Ltd., Japan) to drop about 3.5 μl of water droplets on each film cast on a slide glass, and the contact angle time. The change was determined by tracking for 5 minutes. For comparison, the wettability of the above-mentioned regenerated fibroin films (i) and (ii) and the surface of the slide glass was compared. The results are shown in FIG. The regenerated fibroin films (i) and (ii) showed a contact angle of about 60 °. On the other hand, the undecomposed silk gland fibroin film showed a contact angle of about 100 ° and showed high water repellency. Furthermore, looking at the change over time in the contact angle after dropping the droplet, the contact angle decreased to about 50 ° 30 seconds after the dropping, together with the regenerated fibroin films (i) and (ii), and water permeation occurred rapidly. Was shown to be. From this, it is considered that the surface is dissolved immediately after wetting. The contact angles of the regenerated fibroin films (i) and (ii) continued to decrease significantly thereafter. On the other hand, in the silk gland fibroin film, such a sudden change in the contact angle was not observed, and judging from the comparison with the change in the contact angle of the droplets dropped on the slide glass, the contact angle was almost the same as that due to evaporation. It is believed that only changes are occurring. This is consistent with the results of the water solubility test. Therefore, it was confirmed that the film produced by this method has high water repellency.
＜実施例６＞
エタノール処理絹糸腺フィブロイン及びそのHFIPキャストフィルムの構造評価
（１）広角X線回折（WAXD）測定による構造評価
上述の通り、本フィブロインフィルムは、不溶化処理なしで強い撥水性を示し、水に対して不溶性を示した。不溶性を与える構造的要因を調べるため、エタノール水溶液処理により凝固した中部絹糸腺フィブロインの構造と処理に用いたエタノール濃度依存性をWAXD測定により調べた。WAXD測定には、湾曲型イメージングプレート搭載X線回折装置 R-Axis Rapid II (Rigaku Co., Japan)を使用し、測定条件は、50kV、100mA (MoKα線)とした。
<Example 6>
Structural evaluation of ethanol-treated silk gland fibroin and its HFIP cast film (1) Structural evaluation by wide-angle X-ray diffraction (WAXD) measurement As described above, this fibroin film shows strong water repellency without insolubilization treatment and is resistant to water. It was insoluble. In order to investigate the structural factors that give insolubility, the structure of the central silk gland fibroin coagulated by the ethanol aqueous solution treatment and the dependence of the ethanol concentration used for the treatment were investigated by WAXD measurement. For WAXD measurement, an X-ray diffractometer R-Axis Rapid II (Rigaku Co., Japan) equipped with a curved imaging plate was used, and the measurement conditions were 50 kV and 100 mA (MoKα ray).
40%エタノールに6日間及び240日間浸漬した2種類の絹糸腺試料について、絹糸腺の表皮とセリシンを除去した。図１４及び図１５は、除去直後（即ち、乾燥前）に測定したフィブロインの2d-WAXDパターンとその2θプロファイルの比較をそれぞれ示している。これらを比較する限り、いずれのフィブロインもβ-シート構造からなるsilk-II型結晶を形成しており、結晶性（結晶化度）も含めて浸漬時間による目立った差異は認められなかった。少なくとも240日までの浸漬期間において、フィブロインの状態は一定であり、安定的に保たれていることが明らかとなった。 The epidermis and sericin of the silk glands were removed from two types of silk gland samples immersed in 40% ethanol for 6 days and 240 days. 14 and 15 show a comparison of the 2d-WAXD pattern of fibroin measured immediately after removal (ie, before drying) and its 2θ profile, respectively. As far as these are compared, all fibroins formed silk-II type crystals having a β-sheet structure, and no conspicuous difference was observed depending on the immersion time including crystallinity (crystallinity). It was revealed that the state of fibroin was constant and kept stable during the immersion period of at least 240 days.
6日間浸漬試料の表皮とセリシンを除去した後に風乾させた試料についても2d-WAXDパターンとその2θプロファイルを調べた。その結果、明瞭な結晶化度の増加が認められ（図１４及び図１５）、乾燥試料はHFIPに不溶であった。 The 2d-WAXD pattern and its 2θ profile were also examined for the sample that was air-dried after removing the epidermis and sericin of the soaked sample for 6 days. As a result, a clear increase in crystallinity was observed (FIGS. 14 and 15), and the dried sample was insoluble in HFIP.
次に、20、40、70及び99%エタノールに6日間浸漬した各絹糸腺試料について、絹糸腺の表皮とセリシンを除去した。除去直後（即ち、乾燥前）に測定したフィブロインの2d-WAXDパターンとその2θプロファイルの結果を比較し、フィブロインの構造に対するエタノール濃度依存性について検討した。図１６は、得られたフィブロインの2d-WAXDパターンを示している。図１７は、純水(H2O)および99%エタノール(EtOH)の散乱と共に、得られたフィブロインの2θプロファイルを示している。いずれの濃度のエタノールについても、得られたフィブロインは、40%エタノールと同様、β-シート構造からなるsilk-II型の結晶を形成していることが確認された。 The silk gland epidermis and sericin were then removed from each silk gland sample soaked in 20, 40, 70 and 99% ethanol for 6 days. The 2d-WAXD pattern of fibroin measured immediately after removal (that is, before drying) was compared with the results of its 2θ profile, and the dependence of ethanol concentration on the structure of fibroin was examined. FIG. 16 shows the 2d-WAXD pattern of the obtained fibroin. FIG. 17 shows the 2θ profile of the resulting fibroin with scattering of pure water (H 2 O) and 99% ethanol (Et OH). It was confirmed that the obtained fibroin formed silk-II type crystals having a β-sheet structure, similar to 40% ethanol, at any concentration of ethanol.
次に、HFIPにフィブロインを溶解させ、キャストして得られる（水に対し不溶性の）フィルムについて2d-WAXDパターン（図１８）とその2θプロファイル（図１９）を調べた。その結果、やはりsilk-II型の結晶が形成されており、エタノール処理絹糸腺の乾燥試料と同レベルの結晶性であることが示された。 Next, the 2d-WAXD pattern (FIG. 18) and its 2θ profile (FIG. 19) were examined for the film obtained by dissolving fibroin in HFIP and casting it (insoluble in water). As a result, it was shown that silk-II type crystals were also formed and had the same level of crystallinity as the dried sample of ethanol-treated silk glands.
（２）固体13C核磁気共鳴（NMR）分光法による構造評価
WAXDによる構造評価より、HFIPに対し溶解性を示す濡れた試料は、HFIPに対し不溶性を示す乾燥試料に比べ結晶性が低いことが示された。ここで、固体NMR分光法により、40%エタノールで6日間処理した試料について、濡れた状態の試料(Wet)と乾燥状態の試料(Dry)についての分子鎖の運動性について評価・比較をおこなった（図２０）。固体NMR測定は、固体NMR装置Avance 600 WB（Bruker）を用いて行った。測定条件は、以下の通りである。試料管として4mmφのジルコニア製ローターを用い、10.0kHzでマジック角回転して測定した。1H 90°パルス幅は3.5 μsで、1H-13C交差分極は70kHzで行った。FID観測時にはSPINAL-64法による1Hでカップリングを行った。その結果、いずれの状態においても、得られたフィブロインからは、WAXD測定で示されたとおり、β-シート構造（silk-II型結晶）の形成を示すスペクトルが得られた。濡れた状態（すなわちHFIPに可溶な状態）では、乾燥状態の試料に対し、全体に観測ピークがシャープであり、β-シートの形成に寄与する分子由来のピークについても同様にシャープであった。従って、濡れた状態の試料におけるβ-シートドメインは、乾燥状態の試料のものに比べて、分子の運動性が大きく、分子鎖間のパッキングが弱い不完全なβ-シート構造で止まっていることが示唆された。このことから、濡れた状態の試料においては、凝集状態の弱いβ-シート構造が形成され、それが架橋点として振る舞うことで、凝固するに充分なネットワークが形成される一方で、HFIP分子が内部に侵入できる程度のスペースが、β-シート領域にも存在していることが推測された。これによって、濡れた状態の試料のHFIPへの溶解を可能にしているものと考えられる。
(2) Structural evaluation by solid 13 C nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy
Structural evaluation by WAXD showed that wet samples showing solubility in HFIP had lower crystallinity than dry samples showing insolubility in HFIP. Here, solid-state NMR spectroscopy was used to evaluate and compare the motility of the molecular chains of the wet sample (Wet) and the dry sample (Dry) of the sample treated with 40% ethanol for 6 days. (Fig. 20). Solid-state NMR measurements were performed using a solid-state NMR apparatus Avance 600 WB (Bruker). The measurement conditions are as follows. A 4 mmφ zirconia rotor was used as the sample tube, and the measurement was performed by rotating the magic angle at 10.0 kHz. 1
（３）フーリエ変換型赤外（FTIR）分光法による構造評価
本HFIPキャストフィルム（未分解フィブロインフィルム）と、上記2種類の再生フィブロインフィルム(i)及び(ii)についてFTIR測定を行い、構造の評価・比較を行った（図２１a、b及びc）。FTIR測定は、フーリエ変換赤外分光光度計JASCO FTIR-620 (JASCO Co., Japan)を用いて行い、測定条件は、全て透過測定、分解能2cm-1、そして積算回数32回とした。再生フィブロインフィルム(i)（水溶性）は、典型的な非晶性スペクトルを示した。また、再生フィブロインフィルム(ii)（水溶性）は、α-ヘリックス特有のスペクトルを示した。HFIPを代表とする含ハロゲン溶媒は、フィブロインタンパク質に対し、強力なヘリックス誘起溶媒として働くことは良く知られている。また、HFIPキャストフィルムもまた、α-ヘリックスリッチな構造をとることが知られている。しかしながら、本方法により得られた未分解フィブロインフィルムのHFIPキャストフィルムでは、WAXD及びNMR測定でも示されたとおり、β-シート結晶由来のスペクトルが得られ、FTIR測定においても水に対し不溶性を示すβ-シート型結晶の形成が確認された。
(3) Structural evaluation by Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy FTIR measurement was performed on this HFIP cast film (undecomposed fibroin film) and the above two types of regenerated fibroin films (i) and (ii) to determine the structure. Evaluation and comparison were performed (FIGS. 21a, b and c). The FTIR measurement was performed using a Fourier transform infrared spectrophotometer JASCO FTIR-620 (JASCO Co., Japan), and the measurement conditions were all transmission measurement, resolution 2 cm -1 , and integration number 32 times. The regenerated fibroin film (i) (water soluble) showed a typical amorphous spectrum. In addition, the regenerated fibroin film (ii) (water-soluble) showed a spectrum peculiar to the α-helix. It is well known that halogen-containing solvents typified by HFIP act as strong helix-induced solvents for fibroin proteins. The HFIP cast film is also known to have an α-helix-rich structure. However, in the HFIP cast film of the undecomposed fibroin film obtained by this method, as shown by WAXD and NMR measurements, a spectrum derived from β-sheet crystals was obtained, and β, which is insoluble in water even in FTIR measurement, was obtained. -Formation of sheet-type crystals was confirmed.
以上を纏めると、絹糸腺を10-99%濃度のエタノール水溶液に浸漬することで、HFIP分子の侵入が可能な程度の不完全さを持ったβ-シート様の凝集体があちこちで形成され、その結果、この凝集体がネットワークの架橋点として振る舞うことで、水に不溶な凝固物となる。この凝固物を含ハロゲン溶媒であるHFIPに浸漬すると、HFIP分子は不完全なβ-シート内にも侵入し、ネットワークがある程度解かれ、見かけ上、HFIPに溶解する。これにより、フィルム、繊維、スポンジ、ロッド、微粒子等、様々な形状に加工が可能となる。しかしながら、実際には、ある程度β-シート様の構造は残存しており、その結果、HFIP溶液中でもヘリックスを形成することなく、HFIPの乾燥過程で再び、かつより完全性の高いβ-シート構造が形成され、水に対し不溶性を示す成形品への加工が可能となると推察される。 To summarize the above, by immersing the silk glands in an aqueous ethanol solution at a concentration of 10-99%, β-sheet-like aggregates with imperfections capable of invading HFIP molecules were formed here and there. As a result, this agglomerate acts as a cross-linking point of the network, resulting in a water-insoluble agglomerate. When this coagulated product is immersed in HFIP, which is a halogen-containing solvent, the HFIP molecule also penetrates into the incomplete β-sheet, the network is broken to some extent, and it apparently dissolves in HFIP. This makes it possible to process various shapes such as films, fibers, sponges, rods, and fine particles. However, in reality, the β-sheet-like structure remains to some extent, and as a result, the β-sheet structure becomes more complete again in the drying process of HFIP without forming a helix even in the HFIP solution. It is presumed that it will be possible to process a molded product that is formed and is insoluble in water.
本実施例の結果から、水に対して不溶性のフィブロイン成形体を得ることができる。この成形体は、絹素材由来であり、生体適合性が高い。従って、この成形体は、再生医療用細胞培養足場材料を含む医療用生体材料として利用することができる。 From the results of this example, a fibroin molded product that is insoluble in water can be obtained. This molded product is derived from a silk material and has high biocompatibility. Therefore, this molded body can be used as a medical biomaterial including a cell culture scaffold material for regenerative medicine.
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。例えば、蚕から取り出された中部絹糸腺を10から100%アルコール水溶液に浸漬して固定化する工程と、上記固定化した中部絹糸腺から夾雑物を取り除きフィブロインタンパク質を取得する工程と、を含む、フィブロインタンパク質を取得する方法を提供することができる。 The present invention has been described above based on examples. It is understood by those skilled in the art that this embodiment is merely an example, and that various modifications are possible and that such modifications are also within the scope of the present invention. For example, it comprises a step of immersing the central silk gland taken out from the silk moth in a 10 to 100% alcohol aqueous solution to immobilize it, and a step of removing impurities from the immobilized central silk gland to obtain fibroin protein. A method for obtaining fibroin protein can be provided.
Claims (7)
前記固定化した中部絹糸腺から夾雑物を取り除きフィブロインタンパク質を取得する工程と、
含ハロゲン溶媒を用いて、湿潤状態にある前記フィブロインタンパク質を溶解してフィブロイン溶液を調製する工程と、
前記フィブロイン溶液を乾燥させてフィブロイン成形体を形成する工程と、を含む、
水に対して不溶性のフィブロイン成形体を形成する方法。 The process of immersing the central silk gland taken out from the silk moth in a 10 to 100% alcohol aqueous solution to immobilize it, and
The step of removing impurities from the immobilized central silk gland to obtain fibroin protein, and
A step of dissolving the wet fibroin protein to prepare a fibroin solution using a halogen-containing solvent, and
A step of drying the fibroin solution to form a fibroin molded product, and the like.
A method for forming a fibroin molded article that is insoluble in water.
前記固定化した中部絹糸腺から夾雑物を取り除きフィブロインタンパク質を取得する工程と、を含む、
フィブロインタンパク質を取得する方法。 The process of immersing the central silk gland taken out from the silk moth in a 10 to 100% alcohol aqueous solution to immobilize it, and
A step of removing impurities from the immobilized central silk gland to obtain fibroin protein, and the like.
How to get fibroin protein.
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