JP4244625B2 - Extract for cell-free protein synthesis, cell-free protein synthesis method using the same, and method for preparing the extract - Google Patents

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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、無細胞系のタンパク質合成に使用できる抽出液、およびその調製方法、ならびに当該抽出液を使用した無細胞系でのタンパク質合成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒトゲノムを始め多くの生物の遺伝情報が解読されてきている。このような中、ポストゲノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これらの遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品などに応用、利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡単に合成することが必要となってくる。
【０００３】
現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子組換え技術によって酵母や昆虫細胞などの生細胞を用いる発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないなど発現が困難なタンパク質も多い。
【０００４】
一方、細胞系を使用しないタンパク質の生産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系を試験管内に取り揃え、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡを用いて、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させることのできる合成系を再構築する、無細胞系のタンパク質合成が知られている。このような無細胞系タンパク質合成では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受けにくく、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質の合成を行うことができる。さらに無細胞系タンパク質合成では、生命体が利用していないアミノ酸配列からなるタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な発現方法であると期待されている。このような無細胞系のタンパク質合成としては、たとえば、小麦胚芽の抽出液や大腸菌の抽出液を用いる方法が知られている。
【０００５】
しかし、小麦胚芽の抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成では、抽出液の抽出操作が一般に極めて煩雑であるという欠点がある。
小麦胚芽の抽出液の調製方法の一例として、たとえば、特許文献１には、以下のような手順が記載されている。小麦種子をミルに添加し、破砕した後、篩で粗胚芽画分を得、四塩化炭素とシクロヘキサン混液（四塩化炭素：シクロヘキサン＝２．５：１）を用いた浮選によって、発芽能を有する胚芽を浮上する画分から回収し、室温乾燥によって有機溶媒を除去する。この胚芽画分に混在する種皮などの不純物を静電気帯電体を用いて吸着除去する。次に、この試料から小麦胚乳成分を完全に除去するため、非イオン性界面活性剤であるＮＰ４０の０．５％溶液に懸濁し、超音波洗浄器を用いて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄を繰り返す。蒸留水の存在下に再度１回の超音波洗浄を行い、小麦胚芽を純化する。
このように小麦胚芽の抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成では、抽出液の調製が煩雑であり、多大な時間と労力を要するという不具合がある。
【０００６】
また大腸菌の抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成では、大腸菌が原核生物であるため、タンパク質への糖鎖修飾を行うことができず、糖タンパク質を合成することができないという欠点がある。上記糖鎖修飾によりタンパク質に付加される糖鎖は、物質間や細胞間の認識や接着に関与するシグナルやリガンドとして、タンパク質自身の機能調節因子として、またはタンパク質の保護や安定化因子として機能しているものと考えられる。そのため、糖鎖修飾を受けるタンパク質について生体内の機能を解析するためには、糖鎖修飾を受けたタンパク質（糖タンパク質）を取得することが必要であり、タンパク質への翻訳の後に糖鎖修飾も行えるような無細胞系のタンパク質合成が望まれている。
【０００７】
【特許文献１】
特開２０００−２３６８９６号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、調製が容易であり、糖タンパク質の合成も可能な無細胞系タンパク質合成を実現し得る新規な無細胞系タンパク質合成用抽出液、およびその調製方法、ならびに当該抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、カイコ組織由来の抽出物と、外来ｍＲＮＡとを少なくとも含有する抽出液が、調製が容易であるとともに、それを用いた無細胞系のタンパク質合成において大量のタンパク質合成が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）カイコ組織由来の抽出物と、外来ｍＲＮＡとを少なくとも含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液であって、
カイコ組織を凍結する工程、
凍結したカイコ組織をすり潰す工程、
すり潰したカイコ組織を抽出用液で抽出し、カイコ組織からの抽出物を含有する液状物を得る工程、
得られた液状物を１００００×ｇ〜５００００×ｇで遠心分離し上清を得る工程、
得られた上清をゲル濾過し、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する工程、及び
回収した画分に外来ｍＲＮＡを添加する工程を少なくとも含む調製法によって得られる、無細胞系タンパク質合成用抽出液。
（２）さらに、プロテアーゼインヒビターを含有する上記（１）に記載の抽出液。
（３）カイコ組織由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬである、上記（１）または（２）に記載の抽出液。
（４）カイコ組織が、カイコ幼虫の後部絹糸腺を少なくとも含有する上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抽出液。
（５）カイコ組織が、カイコ幼虫の脂肪体を少なくとも含有する上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抽出液。
（６）カイコ組織が、カイコの胚を少なくとも含有する上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抽出液。
（７）プロテアーゼインヒビターがフェニルメタンスルホニルフルオリドである、上記（２）〜（６）のいずれかに記載の抽出液。
（８）カイコ組織由来の抽出物と、プロテアーゼインヒビターとを少なくとも含有する無細胞系タンパク質合成用液状組成物であって、
カイコ組織を凍結する工程、
凍結したカイコ組織をすり潰す工程、
すり潰したカイコ組織をプロテアーゼインヒビターを含有する抽出用液で抽出し、カイコ組織からの抽出物を含有する液状物を得る工程、
得られた液状物を１００００×ｇ〜５００００×ｇで遠心分離し上清を得る工程、及び
得られた上清をゲル濾過し、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する工程を少なくとも含む調製法によって得られることを特徴とする、無細胞系タンパク質合成用液状組成物。
（９）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の抽出液を使用した無細胞系タンパク質合成方法。
（１０）カイコ組織を凍結する工程、
凍結したカイコ組織をすり潰す工程、
すり潰したカイコ組織を抽出用液で抽出し、カイコ組織からの抽出物を含有する液状物を得る工程、
得られた液状物を１００００×ｇ〜５００００×ｇで遠心分離し上清を得る工程、
得られた上清をゲル濾過し、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する工程、及び
回収した画分に外来ｍＲＮＡを添加する工程を少なくとも含むことを特徴とする、無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法。
（１１）抽出用液がプロテアーゼインヒビターを少なくとも含有するものである上記（１０）に記載の調製方法。
（１２）カイコ組織から抽出用液を用いて抽出したカイコ組織由来の抽出物に、液状フィブロインを除去する処理を施すことを特徴とする上記（１０）または（１１）に記載の調製方法。
【００１０】
なお本明細書において「カイコ」は、カイコガ科に属する鱗翅目昆虫（絹糸昆虫）と同義であり、その一生において「卵（胚）」（産卵直後より孵化直前までの間）、「幼虫」（孵化直後から繭の形成終了直前（１齢期〜５齢期に分けられる））、「蛹」（繭の形成終了直前から羽化する直前までの間）、ならびに「成虫（蛾）」（羽化直後より死亡までの間）の各状態を経るものであり、その一生にわたる形態のいずれをも含むものとする。
カイコは、卵より孵化した後の幼虫の状態では、桑を食べて発育する期間（齢）と、食べずに脱皮の準備をする期間（眠）を交互に繰り返す。カイコの幼虫において、孵化してから１回目の脱皮までを１齢期、１回目の脱皮から２回目の脱皮までを２齢期といい、通常、４回脱皮して５齢期で成熟する（この成熟した状態のカイコ幼虫は「熟蚕」とも呼ばれる）。カイコの幼虫は、熟蚕になると体が透明になり絹糸を吐いて繭を形成し、蛹化する。蛹の後、羽化して成虫となる。
【００１１】
本明細書における「絹糸腺」は、カイコ幼虫の両体側において、頭部の下唇先端に位置する吐出口から盲管にまで連なる一対の管状の外分泌腺であり、前部絹糸腺、中部絹糸腺および後部絹糸腺に大きく分けられる。後部絹糸腺は、絹糸の中心部を為すフィブロインを分泌する。また中部絹糸腺は、セリシンを分泌する。フィブロインは中部絹糸腺に蓄積されるとともに、セリシンによってその外周を覆われて、ゲル状の絹物質となる。この絹物質は、前部絹糸腺を通って吐出口から排出され、固体化して絹糸となる。
【００１２】
本明細書における「脂肪体」は、カイコ幼虫において、体内の至るところに分布し、白色の柔らかい扁平な帯状、ひも状あるいは葉状の組織である。脂肪体は、ヒトの肝臓に似て栄養、エネルギー源を貯蔵する役目を果たしているので、細胞内には脂肪球、タンパク質、グリコーゲンその他の新陳代謝に関係する種々の物質を含んでいる。
【００１３】
本明細書における「胚」は、カイコの卵の状態の組織を指すものとする。
【００１４】
本明細書における「無細胞系タンパク質合成」は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する無細胞翻訳系によるタンパク質合成を指すものとする。ここで、本発明の合成方法によって無細胞系で合成される「タンパク質」は、複数のアミノ酸残基から構成される任意の分子量のペプチド、すなわち低分子量のペプチドから高分子量のいずれをも包含するものとする。また本明細書でいう「タンパク質」は、糖鎖修飾されてなる糖タンパク質も含む。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の抽出液における「カイコ組織由来の抽出物」は、カイコの一生のうちのどの状態（卵、幼虫（１齢期〜５齢期）、蛹、成虫）のいずれの組織由来であってよい。またカイコ組織は、単一の状態における単一の組織（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹糸腺のみ）由来に限らず、単一の状態における複数の組織（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹糸腺および脂肪体）由来であってもよく、複数の状態における単一の組織（たとえば、３齢期、４齢期、５齢期の各カイコ幼虫における後部絹糸腺）由来であってもよいものとする。無論、複数の状態における複数の組織由来であってもよい。
なお上記「カイコ組織由来の抽出物」は、カイコの組織の全体（たとえば、後部絹糸腺全体）からの抽出物である必要はない。
【００１６】
本発明の抽出液中におけるカイコ組織由来の抽出物の含有量に特に制限はないが、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬであるのが好ましく、中でも１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ未満であると、本発明の作用に必須な成分の濃度が低くなり、充分な合成反応が行えなくなる虞があるためであり、また当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で２００ｍｇ／ｍＬを越えると、抽出液自体が高い粘性を有し、操作しづらい虞があるためである。
【００１７】
なお上記範囲の量のカイコ組織由来の抽出物を含有する抽出液は、抽出液のタンパク質濃度測定を利用して、調製できる。当該タンパク質濃度測定は、当分野において通常行われているように、たとえばＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する、といった手順によって行う。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用する。
【００１８】
上記カイコ組織としては、カイコ幼虫の後部絹糸腺、脂肪体およびカイコの胚から選ばれる少なくともいずれかであることが望ましい。抽出液中にカイコ幼虫由来の後部絹糸腺、脂肪体およびカイコの胚から選ばれる少なくともいずれか由来の抽出物が含有されているか否かは、たとえばアルドラーゼについてのアイソザイム解析を行うことによって判別することができる（Nagaokaら(1995)、Insect Biochem Mol Biol. 25, 819-825）。
【００１９】
カイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出物を少なくとも含有すると、短時間で大量のタンパク質が合成可能であるというような特に優れた利点を有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を実現できる上で好ましい。
【００２０】
カイコ幼虫の脂肪体由来の抽出物は、脂肪体が柔らかい組織であるために、すり潰す作業が短時間で済み、結果として容易に抽出液を調製できる、というような特に優れた利点を有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を実現できる上で好ましい。なお５齢期の脂肪体については、上記アイソザイム解析以外に、抽出液をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて脂肪体由来のタンパク質であるＳＰ−１、ＳＰ−２などを検出することによっても、抽出液中に含有されているか否かを判別することができる。
【００２１】
カイコの胚由来の抽出物は、胚が１つの個体であるために、他の組織とは異なり摘出する作業を要さず、結果として容易に抽出液を調製できる、というような特に優れた利点を有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を実現できる上で好ましい。なおカイコの胚については、上記アイソザイム解析以外に、抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて胚由来のタンパク質である３０Ｋ、ＥＳＰ、Ｖｉｔｅｌｌｉｎ（Ｈ）、Ｖｉｔｅｌｌｉｎ（Ｌ）などを検出することによっても、抽出液中に含有されているか否かを判別することができる。
【００２２】
抽出物がカイコ幼虫の後部絹糸腺または脂肪体由来である場合、カイコ幼虫の１齢期〜５齢期のものであれば、特に制限なく本発明に使用できるが、当該後部絹糸腺または脂肪体は、５齢期のカイコ幼虫由来であるのが好ましい。これは、５齢期のカイコ幼虫においては、後部絹糸腺および脂肪体が１齢期〜５齢期のうちで最も成熟しており、これを用いることで他の齢期のものと比べて短時間で大量のタンパク質合成が可能である、というような利点を有する。
中でも特に、絹糸の主成分である絹フィブロインを活発につくり、高いタンパク質合成能を有しているという観点から、本発明の抽出液は、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺、中でも５齢期の３日目〜７日目のカイコ幼虫の後部絹糸腺からの抽出物を必須成分として含有していることが好ましい。
【００２３】
また本発明の抽出液においては、外来ｍＲＮＡが、上記のカイコ組織由来の抽出物とともに必須成分として含有される。ここで、「外来ｍＲＮＡ」は、カイコ組織に由来しないｍＲＮＡを指し、カイコ組織に由来しないｍＲＮＡであるならば、コードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、毒性を有するタンパク質をコードするものであってもよいし、また糖タンパク質をコードするものであってもよい。なお、抽出液において、含有されるｍＲＮＡが外来ｍＲＮＡであるかカイコ組織に由来するｍＲＮＡであるかは、まず、抽出液中より、ｍＲＮＡを単離精製後、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、既知の外来ｍＲＮＡの塩基配列と比較することで判別することができる。
【００２４】
なお本発明に用いる外来ｍＲＮＡは、その塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならばｍＲＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各ｍＲＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。
【００２５】
当該抽出液中において、外来ｍＲＮＡは、タンパク質合成の速度の観点から、１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１５μｇ／ｍＬ〜１７００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。外来ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０ｍｇ／ｍＬを越えると、これを用いたタンパク質合成の際にタンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００２６】
このようなカイコ組織由来の抽出物と外来ｍＲＮＡとを含有する抽出液を用いてタンパク質合成反応を行うことによって、如何なるタンパク質、例えば生細胞で細胞毒となるタンパク質であっても、短時間にて合成することが可能となる。また、真核生物であるカイコ由来の抽出物を用いているため、糖タンパク質を無細胞系で合成することも可能であり、特に制限されることなく多くの種類のタンパク質を合成することができる。
さらに、このような抽出液は、後述するように従来の小麦胚芽からの抽出液の調製と比較して、無細胞系タンパク質合成に供することのできる抽出液を、格段に容易に調製することができ、効率的な無細胞系タンパク質合成を実現できる。
【００２７】
また本発明の抽出液は、上記のカイコ組織由来の抽出物および外来ｍＲＮＡに加えて、プロテアーゼインヒビターをさらに含有することが好ましい。プロテアーゼインヒビターをさらに含有することによって、調製が容易であり、タンパク質（糖タンパク質も含む）の合成を効率的に行うことができ、無細胞系タンパク質用として非常に有用な抽出液を提供することができる。これは、プロテアーゼインヒビターによりカイコ組織由来の抽出物に含有されるプロテアーゼの活性が阻害され、当該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパク質の不所望な分解を防止でき、結果としてカイコ組織由来の抽出物が有するタンパク質合成能を有効に引き出すことができるようになるためであると考えられる。
【００２８】
このようなプロテアーゼインヒビターとしては、プロテアーゼの活性を阻害し得るものであるならば特に制限はなく、たとえば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（以下、「ＰＭＳＦ」ということがある。）、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン）、エチレンジアミン四酢酸、ホスホラミドンなどを使用することができるが、カイコ組織由来の抽出液にはセリンプロテアーゼが含まれることから、上記中でも、セリンプロテアーゼに対して特異性の高いインヒビターとして働くＰＭＳＦを使用するのが好ましい。
また、１種類のプロテアーゼインヒビターのみならず、数種類のプロテアーゼインヒビターの混合物（プロテアーゼインヒビターカクテル）を用いてもよい。
【００２９】
当該抽出液中におけるプロテアーゼインヒビターの含有量に特に制限はないが、本発明の作用に必須な酵素類の分解阻害能を好適に発揮できる観点から、１μＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。プロテアーゼインヒビターが１μＭ未満であると、プロテアーゼの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またプロテアーゼインヒビターが５０ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００３０】
また本発明の抽出液は、上記の抽出物、外来ｍＲＮＡおよびプロテアーゼインヒビターに加えて、カリウム塩、マグネシウム塩、ジチオトレイトールおよび緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。これにより、本発明の作用に必須な成分を安定に保つことができる、というような利点をさらに有する無細胞系タンパク質合成用の抽出液を実現できる。
【００３１】
上記カリウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ましい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
【００３２】
当該抽出液中におけるカリウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど１価のカリウム塩である場合、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることがより好ましい。カリウム塩が１０ｍＭ未満または５００ｍＭを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３３】
上記マグネシウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
【００３４】
当該抽出液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３５】
上記ジチオトレイトール（以下、「ＤＴＴ」ということがある。）は、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該抽出液中において０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３６】
上記緩衝剤は、抽出液に緩衝能を付与し、たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こる抽出液のｐＨの急激な変化による抽出物の変性を防止する目的で配合される。このような緩衝剤としては、特に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳなどを使用することができる。
緩衝剤は、当該抽出液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６〜８に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出液のｐＨが４未満またはｐＨが１０を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが特に好ましい。
【００３７】
当該抽出液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が５ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こし、抽出物が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤が２００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３８】
すなわち、本発明の抽出液は、後部絹糸腺、脂肪体および胚のうちの少なくともいずれかの抽出物をタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ含有するとともに、１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡ、１０ｍＭ〜５００ｍＭの酢酸カリウム、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍＭ〜１０ｍＭのＤＴＴ、１μＭ〜５０ｍＭのＰＭＳＦ、５ｍＭ〜２００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有するように実現されるのが好ましい。
【００３９】
本発明はまた、無細胞系タンパク質合成用抽出液の新規な調製方法を提供する。
本発明の抽出液の調製方法は、カイコ組織から抽出用液を用いて抽出したカイコ組織由来の抽出物に、外来ｍＲＮＡを添加して抽出液とするものである。本発明の抽出液の調製方法においては、カイコ組織からの抽出を行う処理を少なくとも含有し、好ましくは、カイコ組織からの抽出後、精製を行う。具体的には、次のような手順にて行う。
【００４０】
まず、常法にしたがって、たとえばハサミ、ピンセット、メスなどの器具を使用して、カイコより所望の組織を摘出する。この摘出によって得る後述の抽出に使用する組織量としては、特に制限はないが、通常、１ｇ〜１００ｇの範囲内である。次に、摘出した組織を、たとえば液体窒素で凍結した後、−８０℃で凍結させた乳鉢を用いてすり潰し、抽出用液で抽出する。ここで使用する抽出用液は、従来公知の抽出に用いる緩衝液を特に制限なく使用することができるが、好ましくは、プロテアーゼインヒビター、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴおよび緩衝剤を含有するものを使用する。特に好ましくは、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦ、５０ｍＭ〜２００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有する抽出用液を使用する。
このようにして、まず、カイコの組織からの抽出物を含有する液状物を得る。
【００４１】
次に、上記抽出処理で得られた液状物を遠心分離にかける。該遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１００００×ｇ〜５００００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行う。抽出液の調製方法としては、該遠心分離を１回行った後の上清（以下、「上清１」と呼ぶ。）をそのまま用い、これに外来ｍＲＮＡを添加して抽出液とする方法（以下、「調製方法１」と呼ぶ。）や、該上清に上記の条件にて再度の遠心分離を行い、得られた上清（以下、「上清２」と呼ぶ。）に外来ｍＲＮＡを添加して抽出液とする方法（以下、「調製方法２」と呼ぶ。）が挙げられるが、本発明の抽出液の調製方法としては、上記遠心分離で得られた上清をゲル濾過し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する処理を行い、得られた液状物に外来ｍＲＮＡを添加する（以下、「調製方法３」と呼ぶ。）。図１は、上記調製方法１〜３を簡略化して示すフローチャートである。
【００４２】
本発明の抽出液の調製方法３は、具体的には以下の手順にて行う。まず、遠心分離後の上清についてゲル濾過を行うが、ゲル濾過は、たとえば脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）を好適に使用することができ、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記抽出用液にて溶出する、というような条件にて行えばよい。上記ゲル濾過用緩衝液は、上記抽出用液にグリセロールを添加したものであることが好ましい。これにより、タンパク質合成に必須な成分を安定化できるというような利点がある。グリセロールは、通常、５（ｖ／ｖ）％〜４０（ｖ／ｖ）％（好ましくは、２０（ｖ／ｖ）％）となるように添加すればよい。
【００４３】
ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。
【００４４】
次に、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する。当該処理は、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャムバイオサイエンス社製）などの機器を用いて、各画分について上記２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、この吸光度が１０以上の画分を分取する。このようにして得られる画分に外来ｍＲＮＡを添加して、本発明の抽出液を得る。なお本発明の抽出液は、上記２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の複数の画分を混合したものに外来ｍＲＮＡを添加したものであっても当然よい。
【００４５】
また、本発明の抽出液は、タンパク質合成能のより高い抽出液を得る観点からは、液状フィブロインを除去する工程を含有する以下の調製方法（以下、「調製方法４」と呼ぶ。）によって、調製されるのが好ましい。抽出液に液状フィブロインが混入していると、この液状フィブロイン自体によって該抽出液を用いた後述するタンパク質合成反応が阻害される虞があり、また、カイコ組織中のタンパク質合成反応に必須な成分（たとえば、リボソーム、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、各種翻訳因子など）が液状フィブロイン中に取り込まれてしまい、それら成分を抽出することが困難となり、結果として抽出液中に含有される必須成分量が減少するため、タンパク質合成量が低下する虞があるためである。また液状フィブロインの混入により、抽出液自体の粘性が高くなってしまい、タンパク質合成反応が進行しづらく、操作性も悪くなる虞もある。
【００４６】
図２は、上記調製方法４を簡略化して示すフローチャートである。具体的には、まず、ｐＨ４〜１０の抽出用液を用いて上記の抽出を行った後、上述したようにして１回の遠心分離を行って得られた上清（上記上清１）、再度の遠心分離を行って得られた上清（上記上清２）、または該再度の遠心分離によって得られた下層をインキュベーションした後、凍結させる。解凍後、遠心分離して得られた上清（以下、「上清３」と呼ぶ。）をゲル濾過して得られた濾液（２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分）に、外来ｍＲＮＡを添加して抽出液とする。
かかる調製方法４では、まず、ｐＨ４〜１０の抽出用液を用いることで、カイコ組織からの抽出の際に液状フィブロインを固化させ、その結果、液状フィブロインが除去された抽出液を調製する。さらに、上記上清１、上清２または下層を、インキュベーションした後凍結させる処理を行うことで、液状フィブロインの固化をより進行させて、液状フィブロインを効果的に除去することが可能であり、かつ、液状フィブロインに取り込まれていたタンパク質合成反応に必須な成分を効率的に抽出することが可能である。
【００４７】
上記調製方法４にて抽出液を調製する場合、抽出用液としては、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ６〜７のものを用いる。ｐＨ４未満の抽出用液を用いると、後述するタンパク質合成反応に必須な成分が変性してしまう虞があるためである。また、ｐＨが１０を越える抽出用液を用いると、上記と同様にタンパク質合成反応に必須な成分が変性してしまう虞があり、また液状フィブロインの固化が生じない虞もあるためである。
【００４８】
上清１、上清２または上記下層のインキュベーションの条件に特に制限はなく、従来より当業者が通常行っている条件によって行えばよいが、インキュベーションの温度は、４０℃以下が好ましく、３０℃以下がより好ましい。該温度が４０℃を越えると、上記タンパク質合成反応に必須な成分が変性してしまう傾向にあるためである。また、インキュベーション時間は、２４時間以下であるのが好ましく、６時間以下であるのがより好ましい。インキュベーションの時間が２４時間を越えると、反応に必須な成分が変性してしまう虞があるためである。
【００４９】
上記インキュベーション後の凍結も、従来より当業者が通常行っている条件によって行えばよく特に制限されるものではないが、−１０℃以下で凍結するのが好ましく、−２０℃以下で凍結するのがより好ましい。−１０℃よりも高い温度で凍結すると、上記タンパク質合成反応に必須な成分が変性してしまう傾向にあるためである。また、凍結時間は、７２時間以下であるのが好ましく、４８時間以下であるのがより好ましい。７２時間を越えて凍結しても、液状フィブロインの固化は既に完了しており、更なる固化は期待できないためである。
【００５０】
解凍後の遠心分離の条件としては、たとえば、上記と同様の１００００×ｇ〜５００００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間の条件で行えばよい。該遠心分離で得られた上清（上清３）をゲル濾過し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する処理を行い、得られた液状物に外来ｍＲＮＡを添加すればよい。上記ゲル濾過および画分の分取処理を行う場合には、上述したのと同様に行えばよい。
【００５１】
所望の量の上記抽出物を含有する抽出液を得るためには、通常、複数体のカイコより抽出する必要がある。抽出に供するカイコの数は、使用するカイコの状態や個体差によっても異なるが、カイコ幼虫については、繭の形成期に近づくにつれて組織の成熟に伴って、同量の抽出物を得るために要する数は少なくて済む。特に絹糸腺は、５齢期のカイコ幼虫において日を追うごとに著しく成熟するため、たとえば、５齢期の１日目で３０匹程度のカイコ幼虫からと同程度の量を５齢期の７日目では６匹〜７匹程度のカイコ幼虫から得ることができる。
【００５２】
なお本発明の無細胞系タンパク質合成用抽出液は、上記の調製方法で得られると、上述したような利点を有する上で好ましいが、必ずしも上記調製方法で得られたものでなくともよい。
【００５３】
また本発明は、カイコ組織由来の抽出物と、プロテアーゼインヒビターとを少なくとも含有する無細胞系タンパク質合成用の液状組成物も提供する。この液状組成物に含有されるカイコ組織由来の抽出物およびプロテアーゼインヒビターは、本発明の抽出液について上述したのと同様である。また、本発明の液状組成物も、外来ｍＲＮＡを含有しない以外は上述したのと同様の含有量にて、カリウム塩、マグネシウム塩、ジチオトレイトールおよび緩衝剤をさらに含有するのが好ましい。かかる液状組成物を用いて無細胞系タンパク質合成反応を行う場合には、反応液に外来ｍＲＮＡをさらに添加する以外は、後述の抽出液からの反応液の調製と同様にして行えばよい。
【００５４】
本発明はまた、上記抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供するものである。当該タンパク質合成に使用する反応液としては、無細胞系のタンパク質合成の分野において従来より一般に使用されているものであれば特に制限はない。
【００５５】
なお上記反応液は、本発明の抽出液が１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有されるように調製されるのが好ましい。
すなわち、上記反応液の全体において、カイコ組織由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
また、反応液の全体において、外来ｍＲＮＡは、１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５６】
通常、上記反応液としては、上記抽出液を除く成分として、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、緩衝剤を少なくとも含有するものを用いる。これにより、短時間で大量のタンパク質の合成が可能であるというような利点をさらに有する無細胞系タンパク質合成用の反応液を実現できる。
【００５７】
当該反応液中におけるカリウム塩としては、抽出液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５８】
当該反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５９】
当該反応液中におけるＤＴＴは、上述した抽出液におけるＤＴＴの場合と同様の観点から、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００６０】
当該反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００６１】
当該反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００６２】
当該反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００６３】
当該反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００６４】
当該反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００６５】
当該反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在するカイコ由来のＲＮａｓｅによって、本発明の無細胞系タンパク質合成の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００６６】
当該反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００６７】
反応液に含有される緩衝剤としては、上述した本発明の抽出液と同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出液における緩衝剤の場合と同様の観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００６８】
また上記反応液は、グリセロールを含有するのがより好ましい。グリセロールを添加すると、タンパク質合成反応においてタンパク質合成に必須な成分を安定化できるというような利点があるためである。グリセロールを添加する場合、通常、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％となるように添加する。
【００６９】
さらに、上記反応液は、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（以下、「ＥＧＴＡ」ということがある。）を含有するのが好ましい。ＥＧＴＡを含有すると、ＥＧＴＡが抽出液中の金属イオンとキレートを形成することでリボヌクレアーゼ、プロテアーゼなどを不活化させることにより、本発明のタンパク質合成に必須な成分の分解を阻害することができるためである。該ＥＧＴＡは、上記反応液中において、上記分解阻害能を好適に発揮し得る観点から０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＥＧＴＡが０．０１ｍＭ未満であると必須な成分の分解活性を充分に抑えることができない傾向にあるためであり、また、１０ｍＭを越えるとタンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００７０】
すなわち、本発明の無細胞系タンパク質合成方法に用いる反応液は、上記抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％のグリセロール、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜２００μＭのアミノ酸成分、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｍＲＮＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有するように実現されるのが好ましい。また、上記に加えてさらに０．１ｍＭ〜５ｍＭのＥＧＴＡを含有するように実現されるのがより好ましい。
【００７１】
本発明の無細胞系タンパク質合成方法は、上記のような本発明の抽出液を含有する反応液を用いて、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。
【００７２】
また反応温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を越えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。
反応の時間は、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
【００７３】
本発明の無細胞系タンパク質合成方法にて合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。
【００７４】
本発明の無細胞系のタンパク質合成方法にて合成できるタンパク質に特に制限はない。
【００７５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１
：カイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出液の調製
５齢期に達したカイコ幼虫を１日目から７日目まで１日ごとにサンプリングした。サンプリングしたカイコから、ハサミ、ピンセット、メスを使用して、後部絹糸腺を摘出し、以下の手順に従って各日の後部絹糸腺について抽出を行った。
サンプリングしたカイコ幼虫の数と摘出した後部絹糸腺の量を表１に示す。
【００７６】
【表１】

Figure 0004244625
【００７７】
抽出は、まず、５齢期のカイコ幼虫より摘出した後部絹糸腺を、それぞれ液体窒素で凍結し、−８０℃で凍結させた乳鉢ですり潰し、下記組成の抽出用液を用いて、抽出を行った。
〔抽出用液の組成〕
・２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３（日立工機社製））にて、３００００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。
遠心分離後、上清のみを単離し、再び３００００×ｇ、１０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離した。脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）に、２０％グリセロールを含む抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上清を供給し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。
ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取して、これに４０μｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡを添加し、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を得た。外来ｍＲＮＡとしては、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ、プロメガ社製）を用いた。
得られた抽出液について、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用い、タンパク質濃度を測定した。まず反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとして、ＢＳＡを用い、検量線を作成した。得られた各抽出液のタンパク質濃度は、次のとおりであった。
【００７８】
【表２】
Figure 0004244625
【００７９】
熟練者（１人）が上記の調製方法にて抽出液を調製するのにかかった平均時間は、約２時間であった。
【００８０】
実施例２
：カイコ幼虫の脂肪体由来の抽出液の調製
１日目から７日目まで１日ごとにサンプリングしてなる５齢期に達したカイコ幼虫より、脂肪体を摘出して、各日の脂肪体を含有する抽出液をそれぞれ調製した以外は、実施例１と同様に行った。
サンプリングしたカイコ幼虫の数と摘出した脂肪体の量を表３に、得られた各抽出液のタンパク質濃度を表４に示す。
【００８１】
【表３】
Figure 0004244625
【００８２】
【表４】
Figure 0004244625
【００８３】
熟練者（１人）が上記の調製方法にて抽出液を調製するのにかかった平均時間は、約２時間であった。
【００８４】
実験例１
：実施例１，２の抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成
上記実施例１、２で得られた各抽出液を用いて、下記の組成の反応液を調製した。
〔反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 抽出液（反応液中における外来ｍＲＮＡ：２０μｇ／ｍＬ）
・３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・１ｍＭ 酢酸マグネシウム
・３ｍＭ ＤＴＴ
・１０（ｖ／ｖ）％ グリセロール
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．１ｍＭ ＧＴＰ
・２５ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・４０μＭ アミノ酸（２０種）
・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。
各々調製した反応液を用いて、反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用い、無細胞系のタンパク質（ルシフェラーゼ）の合成反応を行った。反応液量は２５μＬとした。反応温度は２０℃とし、反応時間ごとにサンプリングを行い、合成されたルシフェラーゼ量を測定した。
合成されたルシフェラーゼは、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて各々定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ ＤｅｓｉｇｎｓＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
【００８５】
図３は、実施例１の抽出液（カイコ幼虫の後部絹糸腺を含有）を用いた各反応液についての、反応開始より２時間後のルシフェラーゼ合成量を示すグラフである。図３において、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は５齢期カイコ幼虫の生育日数を示す。
また図４は、実施例２の抽出液（カイコ幼虫の脂肪体を含有）を用いた各反応液についての反応開始より２時間後のルシフェラーゼ合成量を示すグラフである。図４において、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は５齢期カイコ幼虫の生育日数を示す。
【００８６】
また図５は、実施例１の抽出液を用いた各反応液（１日目〜７日目の各日のサンプル）についての、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフである。図５において、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（分）を示す。
図５に示すように、５齢期４日目のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出物を含有する抽出液を用いて調製した無細胞系タンパク質合成用の反応液は、６時間後まで反応が継続し、３９７．４ｎｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成されていることがわかった。さらに、この反応液を用いた反応では、２３時間後には６５７．４ｎｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成されていた。
【００８７】
実験例２
実施例１の抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成反応における各成分添加量の影響を調べたところ、最適な反応液組成は、以下のとおりであった。
〔反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 抽出液（カイコ幼虫５齢期４日目の後部絹糸腺を含有）（反応液中における外来ｍＲＮＡ：４０μｇ／ｍＬ）
・３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・７５ｍＭ 酢酸カリウム
・１．５ｍＭ 酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ ＤＴＴ
・１０（ｖ／ｖ）％ グリセロール
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．５ｍＭ ＧＴＰ
・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ
・２５ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・４０μＭ アミノ酸（２０種）
・２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
上記最適化した組成の反応液を用い、反応温度を２５℃とした以外は上記実験例１で行ったのと同様にしてルシフェラーゼの合成を行った。
図６は、上記最適化した組成の反応液についての、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフである。図６において、縦軸はルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（分）を示す。図６に示すように、組成を最適化した反応液では、４時間まで反応が継続し、４．６μｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成されていることがわかった。
【００８８】
実施例３
：カイコの胚由来の抽出液の調製
産下後２５℃に保温した０日目、２日目、５日目および７日目のカイコの卵をそれぞれ２ｇ採取し、実施例１と同様の方法で抽出液を調製した。得られた各抽出液のタンパク質濃度は、次のとおりであった。
【００８９】
【表５】
Figure 0004244625
【００９０】
熟練者（１人）が上記の調製方法にて抽出液を調製するのにかかった平均時間は、約１．５時間であった。
【００９１】
実験例３
：実施例３の抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成
上記実施例３で得られた各抽出液を用いた以外は、上記の実験例１と同様の組成で反応液を作成し、無細胞系のタンパク質（ルシフェラーゼ）合成を行った。
その結果、２日目の胚由来の抽出液を用いた場合、１６ｎｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成されていた。
【００９２】
実施例４
：カイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出液の調製
５齢期の５日目に達したカイコ幼虫をサンプリングした。サンプリングしたカイコから、ハサミ、ピンセット、メスを使用して、後部絹糸腺を摘出し、以下の手順に従って後部絹糸腺について抽出を行った。
抽出は、まず、５齢期の５日目に達したカイコ幼虫より摘出した後部絹糸腺を液体窒素で凍結し、−８０℃で凍結させた乳棒ですり潰し、下記組成の抽出用液を用いて、抽出を行った。
〔抽出用液の組成〕
・２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３（日立工機社製））にて、３００００×ｇ、１０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離し、再び３００００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行い、下層を単離した。この下層を室温（２５℃）、６時間インキュベーションを行った後、−８０℃、一昼夜凍結させた。
凍結させた下層を室温にて解凍後、２２０００×ｇ、６０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離した。得られた上清に、３２０μｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡを添加し、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を得た。外来ｍＲＮＡとしては、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ、プロメガ社製）を用いた。この抽出液について分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いた２８０ｎｍにおける吸光度は６２．４であった。
熟練者（１人）が上記の調製方法にて抽出液を調製するのにかかった平均時間は、２４時間であった。
【００９３】
実験例４
：実施例４の抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成
上記実施例４で得られた抽出液を用いて、下記の組成の反応液を調製し、実験例１で行ったのと同様にしてルシフェラーゼの合成を行った。
〔反応液組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 抽出液（反応液中における外来ｍＲＮＡ：１６０μｇ／ｍＬ）
・３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・１．５ｍＭ 酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ ＤＴＴ
・１０％（ｖ／ｖ）％ グリセロール
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．５ｍＭ ＧＴＰ
・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ
・２５ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ
・４０μＭ アミノ酸（２０種）
・２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ
図７は、実施例４の抽出液（カイコ幼虫の後部絹糸腺を含有）を用いた反応液についての、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフである。図７において、縦軸はルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（分）を示す。
図７に示すように、５齢期５日目カイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出物を含有する抽出液を用いて調製した無細胞系タンパク質合成用の反応液は、７時間後まで反応が継続し、２８μｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成されていた。
【００９４】
実施例５
：カイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出液の調製
５齢期の４日目に達したカイコ幼虫をサンプリングした。サンプリングしたカイコから、ハサミ、ピンセット、メスを使用して、後部絹糸腺を摘出し、以下の手順に従って後部絹糸腺について抽出を行った。
抽出は、まず、５齢期の４日目に達したカイコ幼虫より摘出した後部絹糸腺を液体窒素で凍結し、−８０℃で凍結させた乳棒ですり潰し、下記組成の抽出用液を用いて、抽出を行った。
〔抽出用液の組成〕
・２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３（日立工機社製））にて、３００００×ｇ、１０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。
遠心分離後、上清のみを単離し、再び３００００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離した。
脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）に、２０％グリセロールを含む抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上清を供給し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。
ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取して、これに８０μｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡを添加し、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を得た。外来ｍＲＮＡとしては、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ、プロメガ社製）を用いた。
熟練者（１人）が上記の調製方法にて抽出液を調製するのにかかった平均時間は、約２時間であった。
【００９５】
実験例５
：実施例５の抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成
上記実施例５で得られた抽出液を用いて、下記の組成の反応液を調製し、実験例１で行ったのと同様にしてルシフェラーゼの合成を行った。
〔反応液組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 抽出液（反応液中における外来ｍＲＮＡ：４０μｇ／ｍＬ）
・３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・１．５ｍＭ 酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ ＤＴＴ
・１０％（ｖ／ｖ）％ グリセロール
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．５ｍＭ ＧＴＰ
・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ
・２５ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ
・４０μＭ アミノ酸（２０種）
・２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ
結果、抽出液にＰＭＳＦを未添加の場合のタンパク質（ルシフェラーゼ）合成量は、ＰＭＳＦを添加した場合の５０．２％にまで減少していた。
【００９６】
【発明の効果】
以上の説明で明らかなように、本発明によれば、調製が容易であり、真核生物由来であるため、糖タンパク質の合成も可能な無細胞系タンパク質合成を実現し得る新規な無細胞系タンパク質合成用抽出液、およびその調製方法、ならびに当該抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】抽出液の調製方法１〜３を簡略化して示すフローチャートである。
【図２】抽出液の調製方法４を簡略化して示すフローチャートである。
【図３】実施例１の抽出液（カイコ幼虫の後部絹糸腺を含有）を用いた各反応液についての、反応開始より２時間後のルシフェラーゼ合成量を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は５齢期カイコ幼虫の生育日数を示す。
【図４】実施例２の抽出液（カイコ幼虫の脂肪体を含有）を用いた各反応液についての、反応開始より２時間後のルシフェラーゼ合成量を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は５齢期カイコ幼虫の生育日数を示す。
【図５】実施例１の抽出液を用いた各反応液（１日目〜７日目の各日のサンプル）についての、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（分）を示す。
【図６】最適化した組成の反応液についての、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（分）を示す。
【図７】実施例４の抽出液（カイコ幼虫の後部絹糸腺を含有）を用いた反応液についての、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（分）を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an extract that can be used for cell-free protein synthesis, a method for preparing the same, and a method for protein synthesis in a cell-free system using the extract.
[0002]
[Prior art]
In recent years, genetic information of many organisms including the human genome has been decoded. Under such circumstances, functional analysis of proteins corresponding to these genetic information and genome drug discovery are attracting attention as post-genome research. In order to apply and use proteins corresponding to these genetic information in medicines, it is necessary to synthesize huge types of proteins easily in a short time.
[0003]
At present, expression systems using living cells such as yeast and insect cells (hereinafter sometimes referred to as “cell systems”) are widely used as protein production methods by genetic recombination techniques. However, living cells tend to exclude foreign proteins in order to maintain self-function, and there are many proteins that are difficult to express, such as when cells express no cytotoxic proteins in living cells.
[0004]
On the other hand, as a protein production method that does not use a cell system, a genetic information translation system for organisms is prepared in a test tube by adding a substrate or an enzyme to a cell lysate or extract, and mRNA that encodes the target protein is used. Thus, cell-free protein synthesis is known in which a synthetic system capable of combining amino acids with the required number of residues in the desired order is reconstructed. Such cell-free protein synthesis is less subject to the limitations of the above-mentioned cell-based protein synthesis, and can synthesize proteins without losing the lives of living organisms. Since it is not accompanied, protein synthesis can be performed in a short time compared with the cell system. Furthermore, cell-free protein synthesis is expected to be a promising expression method because it enables mass production of proteins consisting of amino acid sequences that are not utilized by living organisms. As such cell-free protein synthesis, for example, a method using an extract of wheat germ or an extract of Escherichia coli is known.
[0005]
However, cell-free protein synthesis using an extract of wheat germ has a drawback that the extraction operation of the extract is generally very complicated.
As an example of a method for preparing an extract of wheat germ, for example, Patent Document 1 describes the following procedure. After adding wheat seeds to the mill and crushing, the crude germ fraction is obtained with a sieve, and the germination ability is increased by flotation using a mixture of carbon tetrachloride and cyclohexane (carbon tetrachloride: cyclohexane = 2.5: 1). The germs that have them are collected from the floating fraction, and the organic solvent is removed by drying at room temperature. Impurities such as seed coat mixed in the embryo fraction are adsorbed and removed using an electrostatically charged body. Next, in order to completely remove the wheat endosperm components from this sample, it is suspended in a 0.5% solution of NP40, which is a nonionic surfactant, and washed using an ultrasonic cleaner until the cleaning solution does not become cloudy. repeat. Ultrasonic cleaning is performed once again in the presence of distilled water to purify the wheat germ.
As described above, cell-free protein synthesis using an extract of wheat germ has a problem that the preparation of the extract is complicated and requires a lot of time and labor.
[0006]
In addition, cell-free protein synthesis using an E. coli extract has the disadvantage that since E. coli is a prokaryotic organism, sugar chain modification to the protein cannot be performed and glycoproteins cannot be synthesized. The sugar chain added to the protein by the above sugar chain modification functions as a signal or ligand involved in recognition and adhesion between substances or cells, as a function regulator of the protein itself, or as a protein protection or stabilization factor. It is thought that. Therefore, in order to analyze the in vivo function of a protein that undergoes sugar chain modification, it is necessary to obtain a protein that has undergone sugar chain modification (glycoprotein). Cell-free protein synthesis that can be performed is desired.
[0007]
[Patent Document 1]
JP 2000-236896 A
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in order to solve the above-mentioned problems, and the object of the present invention is to provide a novel non-cellular protein synthesis that can be easily prepared and can also synthesize glycoproteins. It is intended to provide an extract for cell-based protein synthesis, a preparation method thereof, and a cell-free protein synthesis method using the extract.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
  As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that an extract containing at least an extract derived from a silkworm tissue and an exogenous mRNA is easy to prepare, and no extract using it. It has been found that a large amount of protein synthesis is possible in cell-based protein synthesis, and the present invention has been completed.
  That is, the present invention is as follows.
  (1) Extract for cell-free protein synthesis containing at least an extract derived from silkworm tissue and foreign mRNABecause
Freezing the silkworm tissue,
Crushing the frozen silkworm tissue,
Extracting the ground silkworm tissue with an extraction liquid to obtain a liquid material containing an extract from the silkworm tissue;
A step of centrifuging the obtained liquid at 10,000 × g to 50000 × g to obtain a supernatant,
A step of gel filtration of the obtained supernatant and fractionating a fraction having an absorbance at 280 nm of 10 or more; and
Extract for cell-free protein synthesis obtained by a preparation method including at least a step of adding foreign mRNA to the collected fraction.
  (2) The extract according to (1), further comprising a protease inhibitor.
  (3) The extract according to (1) or (2) above, wherein the content of the extract derived from silkworm tissue is 1 mg / mL to 200 mg / mL in terms of protein concentration.
  (4) The extract according to any one of (1) to (3), wherein the silkworm tissue contains at least the posterior silk gland of the silkworm larva.
  (5) The extract according to any one of (1) to (3), wherein the silkworm tissue contains at least a fat body of a silkworm larva.
  (6) The extract according to any one of (1) to (3), wherein the silkworm tissue contains at least silkworm embryos.
  (7) The extract according to any one of (2) to (6) above, wherein the protease inhibitor is phenylmethanesulfonyl fluoride.
  (8) Contains at least a silkworm tissue-derived extract and a protease inhibitorRuLiquid composition for cell-based protein synthesisBecause
Freezing the silkworm tissue,
Crushing the frozen silkworm tissue,
Extracting the ground silkworm tissue with an extraction solution containing a protease inhibitor to obtain a liquid containing an extract from the silkworm tissue;
A step of centrifuging the obtained liquid at 10,000 × g to 50000 × g to obtain a supernatant, and
A liquid composition for cell-free protein synthesis characterized by being obtained by a preparation method comprising at least a step of subjecting the obtained supernatant to gel filtration and fractionating a fraction having an absorbance at 280 nm of 10 or more..
  (9) A cell-free protein synthesis method using the extract according to any one of (1) to (7) above.
  (10)Freezing the silkworm tissue,
Crushing the frozen silkworm tissue,
Extracting the ground silkworm tissue with an extraction liquid to obtain a liquid material containing an extract from the silkworm tissue;
A step of centrifuging the obtained liquid at 10,000 × g to 50000 × g to obtain a supernatant,
A step of gel filtration of the obtained supernatant and fractionating a fraction having an absorbance at 280 nm of 10 or more; and
At least a step of adding foreign mRNA to the collected fractionA method for preparing an extract for cell-free protein synthesis characterized by the above.
  (11) The preparation method according to the above (10), wherein the extraction liquid contains at least a protease inhibitor.
  (12) The preparation method as described in (10) or (11) above, wherein a treatment for removing liquid fibroin is applied to an extract derived from a silkworm tissue extracted from a silkworm tissue using an extraction solution.
[0010]
In the present specification, “silkworm” is synonymous with lepidopterous insects (silk insects) belonging to the family Bombycidae. In its lifetime, “egg (embryo)” (from just after spawning to just before hatching), “larva” ( Immediately after hatching, immediately before the end of wing formation (divided into 1st to 5th stage)), 蛹 (from the time immediately before wing formation to just before emergence), and "adult (wing)" (immediately after emergence) (Until death), and includes all of its life-long forms.
In the state of larvae after hatching from eggs, silkworms alternate between the period of growing by eating mulberry (age) and the period of preparing for molting without eating (sleeping). In the silkworm larvae, the period from hatching to the first molting is called the 1st instar period, and the period from the 1st molting to the 2nd molting is called the 2nd instar stage. This mature silkworm larva is also called "ripe". Silkworm larvae become transparent when they become mature and spit out silk to form cocoons and hatch. After the pupae, they emerge and become adults.
[0011]
The “silk gland” in the present specification is a pair of tubular exocrine glands that continue from the discharge port located at the tip of the lower lip of the head to the blind tube on both sides of the silkworm larvae. It is roughly divided into glands and posterior silk glands. The posterior silk gland secretes fibroin, which forms the center of the silk thread. The middle silk gland also secretes sericin. Fibroin accumulates in the middle silk gland, and its outer periphery is covered with sericin to form a gel-like silk substance. This silk substance is discharged from the outlet through the front silk gland and solidifies into a silk thread.
[0012]
In the present specification, the “fatty body” is a white soft flat band-like, string-like or leaf-like tissue that is distributed throughout the body in the silkworm larva. The fat body plays a role of storing nutrients and energy sources similar to the human liver, and therefore contains fat globules, proteins, glycogen, and other substances involved in metabolism in the cells.
[0013]
As used herein, “embryo” refers to a tissue in a silkworm egg state.
[0014]
As used herein, “cell-free protein synthesis” refers to protein synthesis by a cell-free translation system that synthesizes a protein by reading mRNA information. Here, the “protein” synthesized in a cell-free system by the synthesis method of the present invention encompasses any molecular weight peptide composed of a plurality of amino acid residues, that is, any of low molecular weight peptides to high molecular weights. Shall. The “protein” as used herein also includes glycoproteins that are modified with a sugar chain.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The “extract derived from silkworm tissue” in the extract of the present invention is derived from any tissue in any state (egg, larva (1st to 5th instar), pupa, adult) in the lifetime of the silkworm. Good. The silkworm tissue is not limited to a single tissue in a single state (for example, only the posterior silk gland in a silkworm larva at the age of 5 years), but a plurality of tissues in a single state (for example, silkworms at the age of 5 years) Posterior silk gland and fat body in larvae), or derived from a single tissue in multiple states (eg, posterior silk gland in each silkworm larvae in 3rd, 4th, and 5th stages) It may be. Of course, it may be derived from a plurality of tissues in a plurality of states.
The “extract derived from silkworm tissue” does not need to be an extract from the whole silkworm tissue (for example, the entire posterior silk gland).
[0016]
Although there is no restriction | limiting in particular in the content of the extract derived from the silkworm tissue in the extract of this invention, It is preferable that it is 1 mg / mL-200 mg / mL by protein concentration, and it is 10 mg / mL-100 mg / mL among them. Is more preferable. This is because if the content of the extract is less than 1 mg / mL in terms of protein concentration, the concentration of components essential for the action of the present invention will be low, and a sufficient synthesis reaction may not be possible. This is because the extract itself has a high viscosity and may be difficult to operate when the content of the protein exceeds 200 mg / mL in protein concentration.
[0017]
An extract containing the silkworm tissue-derived extract in an amount within the above range can be prepared by measuring the protein concentration of the extract. The protein concentration is measured using, for example, BCA Protein assay Kit (manufactured by PIERCE), 0.1 mL of the sample is added to 2 mL of the reaction reagent, and the reaction is performed at 37 ° C. for 30 minutes. And measuring the absorbance at 562 nm. As a control, bovine serum albumin (BSA) is usually used.
[0018]
The silkworm tissue is preferably at least one selected from the posterior silk gland of the silkworm larva, the fat body, and the silkworm embryo. Whether or not the extract contains an extract derived from at least one of the silkworm larvae-derived posterior silk glands, fat bodies and silkworm embryos, for example, by performing isozyme analysis on aldolase (Nagaoka et al. (1995), Insect Biochem Mol Biol. 25, 819-825).
[0019]
The inclusion of at least an extract derived from the silkworm larvae of the silkworm larvae is preferable in that an extract for cell-free protein synthesis having a particularly excellent advantage that a large amount of protein can be synthesized in a short time is preferable.
[0020]
The extract derived from the fat body of the silkworm larvae has a particularly excellent advantage that the fat body is a soft tissue, so that the work of grinding can be done in a short time, and as a result, the extract can be easily prepared. It is preferable because an extract for cell-based protein synthesis can be realized. In addition to the above isozyme analysis, the 5-year-old fat pad was subjected to sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to obtain SP-1, SP-2, etc., which are fat pad-derived proteins. Whether or not it is contained in the extract can also be determined by detection.
[0021]
Extracts derived from silkworm embryos have a particularly excellent advantage that, since the embryo is one individual, it does not require extraction work unlike other tissues, and as a result, the extract can be easily prepared. It is preferable in that an extract for cell-free protein synthesis having the above can be realized. For silkworm embryos, in addition to the above isozyme analysis, the extract is subjected to SDS-PAGE to detect embryo-derived proteins 30K, ESP, Vitellin (H), Vitellin (L), etc. It can be discriminated whether or not it is contained.
[0022]
When the extract is derived from the posterior silk gland or fat body of the silkworm larvae, the silkworm larvae can be used in the present invention as long as they are from the 1st to 5th instar stages of the silkworm larvae. Is preferably derived from 5th instar silkworm larvae. In the silkworm larvae at the 5th instar stage, the posterior silk gland and the fat body are most matured among the 1st to 5th instar stages. It has the advantage that a large amount of protein can be synthesized in time.
In particular, from the viewpoint of actively producing silk fibroin, which is the main component of silk thread, and having high protein synthesis ability, the extract of the present invention is the silk gland of the posterior silk gland of the 5th instar silkworm, especially the 5th instar. It is preferable that an extract from the posterior silk gland of the silkworm larvae on the 3rd to 7th days of the season is contained as an essential component.
[0023]
In the extract of the present invention, foreign mRNA is contained as an essential component together with the above-mentioned extract derived from silkworm tissue. Here, “foreign mRNA” refers to mRNA that does not originate from silkworm tissue, and if it is mRNA that does not originate from silkworm tissue, the encoding protein (including peptides) is not particularly limited and encodes a toxic protein. It may be a thing or may encode a glycoprotein. In addition, in the extract, whether the mRNA contained is foreign mRNA or mRNA derived from silkworm tissue, first, from the extract, after isolating and purifying mRNA, cDNA is synthesized by reverse transcriptase, It can be determined by analyzing the base sequence of the obtained cDNA and comparing it with the base sequence of a known foreign mRNA.
[0024]
The foreign mRNA used in the present invention is not particularly limited in the number of bases, and all mRNAs may not have the same number of bases as long as the target protein can be synthesized. In addition, each mRNA may have a plurality of bases deleted, substituted, inserted or added as long as the sequences are homologous enough to synthesize the target protein.
[0025]
In the extract, foreign mRNA is preferably contained in an amount of 1 μg / mL to 10 mg / mL, more preferably 15 μg / mL to 1700 μg / mL, from the viewpoint of protein synthesis rate. This is because if the foreign mRNA is less than 1 μg / mL or exceeds 10 mg / mL, the rate of protein synthesis tends to decrease during protein synthesis using this.
[0026]
By performing a protein synthesis reaction using an extract containing such an extract derived from silkworm tissue and foreign mRNA, any protein, for example, a protein that becomes a cytotoxic agent in a living cell, can be obtained in a short time. It is possible to synthesize. In addition, because it uses an extract derived from the eukaryotic silkworm, it is possible to synthesize glycoproteins in a cell-free system, and many types of proteins can be synthesized without any particular limitation. .
Further, as described later, such an extract can be prepared much more easily as an extract that can be used for cell-free protein synthesis as compared with the conventional preparation of an extract from wheat germ. Efficient cell-free protein synthesis.
[0027]
The extract of the present invention preferably further contains a protease inhibitor in addition to the silkworm tissue-derived extract and foreign mRNA. By further containing a protease inhibitor, preparation is easy, protein (including glycoproteins) can be efficiently synthesized, and a very useful extract for cell-free proteins can be provided. it can. This is because the protease inhibitor inhibits the activity of the protease contained in the extract derived from silkworm tissue, and can prevent unwanted degradation of the active protein in the extract by the protease. As a result, the extract derived from silkworm tissue This is considered to be because the protein synthesis ability possessed can be effectively extracted.
[0028]
Such a protease inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of the protease. For example, phenylmethanesulfonyl fluoride (hereinafter sometimes referred to as “PMSF”), aprotinin, bestatin, leupeptin , Pepstatin A, E-64 (L-trans-epoxysuccinylleucylamide-4-guanidinobutane), ethylenediaminetetraacetic acid, phosphoramidon and the like, but the silkworm tissue-derived extract contains serine protease. Therefore, among the above, it is preferable to use PMSF that acts as an inhibitor having high specificity for serine protease.
Further, not only one type of protease inhibitor but also a mixture of several types of protease inhibitors (protease inhibitor cocktail) may be used.
[0029]
Although there is no restriction | limiting in particular in content of the protease inhibitor in the said extract, From a viewpoint which can demonstrate suitably the decomposition | disassembly inhibitory ability of enzymes essential for the effect | action of this invention, it is preferable to contain 1 micromol-50mM. More preferably, the content is 01 mM to 5 mM. This is because if the protease inhibitor is less than 1 μM, the protease degradation activity tends not to be sufficiently suppressed, and if the protease inhibitor exceeds 50 mM, the protein synthesis reaction tends to be inhibited.
[0030]
The extract of the present invention preferably contains at least a potassium salt, a magnesium salt, dithiothreitol, and a buffering agent in addition to the extract, foreign mRNA and protease inhibitor. Thereby, it is possible to realize an extract for cell-free protein synthesis, which further has the advantage that components essential for the action of the present invention can be kept stable.
[0031]
The potassium salt is not particularly limited as long as it does not inhibit the action of the present invention. For example, potassium acetate, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate, potassium chloride, dipotassium hydrogen phosphate, dipotassium hydrogen citrate, It can be used in a general form such as potassium sulfate, potassium dihydrogen phosphate, potassium iodide, potassium phthalate, etc. Among them, potassium acetate is preferably used. Potassium salts act as cofactors in protein synthesis reactions.
[0032]
Although there is no restriction | limiting in particular in content of the potassium salt in the said extract, From a viewpoint of storage stability, when it is monovalent potassium salts, such as potassium acetate, for example, it is preferable to contain 10 mM-500 mM, 50 mM-200 mM. More preferably it is contained. This is because if the potassium salt is less than 10 mM or exceeds 500 mM, components essential for protein synthesis tend to become unstable.
[0033]
The magnesium salt is not particularly limited as long as it does not inhibit the action of the present invention. For example, magnesium acetate, magnesium sulfate, magnesium chloride, magnesium citrate, magnesium hydrogen phosphate, magnesium iodide, magnesium lactate, It can be used in a general form such as magnesium nitrate and magnesium oxalate, and it is preferable to use magnesium acetate. Magnesium salts also act as cofactors in protein synthesis reactions.
[0034]
Although there is no restriction | limiting in particular in content of the magnesium salt in the said extract, From a viewpoint of storage stability, when it is a bivalent salt, such as magnesium acetate, it is preferable that 0.1-10 mM is contained, for example. More preferably, 5 mM to 5 mM is contained. This is because if the magnesium salt is less than 0.1 mM or exceeds 10 mM, components essential for protein synthesis tend to become unstable.
[0035]
The dithiothreitol (hereinafter sometimes referred to as “DTT”) is blended for the purpose of preventing oxidation, and is preferably contained in the extract at a concentration of 0.1 mM to 10 mM, preferably 0.5 mM. More preferably, it is contained at -5 mM. This is because when DTT is less than 0.1 mM or more than 10 mM, components essential for protein synthesis tend to become unstable.
[0036]
The buffering agent is blended for the purpose of imparting buffering capacity to the extract and preventing the denaturation of the extract due to a rapid change in the pH of the extract caused by, for example, addition of an acidic or basic substance. Such a buffer is not particularly limited, and for example, HEPES-KOH, Tris-HCl, acetic acid-sodium acetate, citric acid-sodium citrate, phosphoric acid, boric acid, MES, PIPES, etc. may be used. it can.
As the buffer, it is preferable to use a buffer that maintains the pH of the extract at 4 to 10, and it is more preferable to use a buffer that maintains the pH to 6 to 8. This is because if the pH of the extract is less than 4 or exceeds 10, the components essential for the reaction of the present invention may be denatured. From such a viewpoint, it is particularly preferable to use HEPES-KOH (pH 6 to 8) among the above.
[0037]
Although there is no restriction | limiting in particular in content of the buffer in the said extract, From a viewpoint of hold | maintaining suitable buffer capacity, it is preferable to contain 5 mM-200 mM, and it is more preferable that 10 mM-50 mM are contained. This is because when the buffer is less than 5 mM, the pH tends to fluctuate due to the addition of an acidic or basic substance, and the extract tends to denature. When the buffer exceeds 200 mM, the salt concentration increases. This is because the components essential for protein synthesis tend to become unstable.
[0038]
That is, the extract of the present invention contains an extract of at least one of the posterior silk gland, fat pad and embryo in a protein concentration of 1 mg / mL to 200 mg / mL and an exogenous amount of 1 μg / mL to 10 mg / mL. Realized to contain mRNA, 10 mM-500 mM potassium acetate, 0.1 mM-10 mM magnesium acetate, 0.1 mM-10 mM DTT, 1 μM-50 mM PMSF, 5 mM-200 mM HEPES-KOH (pH 6-8) It is preferred that
[0039]
The present invention also provides a novel method for preparing an extract for cell-free protein synthesis.
In the method for preparing an extract of the present invention, an exogenous mRNA is added to an extract derived from a silkworm tissue extracted from a silkworm tissue using an extraction solution to obtain an extract. The method for preparing an extract of the present invention includes at least a treatment for extracting from a silkworm tissue, and preferably, purification is performed after extraction from a silkworm tissue. Specifically, the procedure is as follows.
[0040]
First, according to a conventional method, a desired tissue is extracted from a silkworm using instruments such as scissors, tweezers, and a scalpel. Although there is no restriction | limiting in particular as a tissue quantity used for the below-mentioned extraction obtained by this extraction, Usually, it exists in the range of 1g-100g. Next, the extracted tissue is frozen with, for example, liquid nitrogen, then ground using a mortar frozen at −80 ° C., and extracted with an extraction solution. As the extraction solution used here, a conventionally known buffer solution for extraction can be used without particular limitation, but preferably a solution containing a protease inhibitor, potassium salt, magnesium salt, DTT and a buffering agent is used. To do. Particularly preferably, 0.01 mM-5 mM PMSF, 50 mM-200 mM potassium acetate, 0.5 mM-5 mM magnesium acetate, 0.5 mM-5 mM DTT, 10 mM-50 mM HEPES-KOH (pH 6-8) Use the extraction solution.
In this way, first, a liquid material containing an extract from a silkworm tissue is obtained.
[0041]
  Next, the liquid obtained by the extraction process is centrifuged. The centrifugation is carried out under conditions usually performed in the art (10000 × g to 50000 × g, 0 ° C. to 10 ° C., 10 minutes to 60 minutes).ExtractPreparation methodAsUses the supernatant after the centrifugation (hereinafter referred to as “supernatant 1”) as it is, and adds exogenous mRNA to this to obtain an extract.Method(Hereinafter referred to as “Preparation Method 1”.)AndThe supernatant is centrifuged again under the above conditions, and exogenous mRNA is added to the resulting supernatant (hereinafter referred to as “supernatant 2”).To make an extract(Hereinafter referred to as “Preparation Method 2”.)As a method for preparing the extract of the present invention,The supernatant obtained by the above centrifugation is subjected to gel filtration, and a fraction having an absorbance at 280 nm of 10 or more is fractionated from the filtrate after gel filtration, and exogenous mRNA is added to the obtained liquid.(Hereinafter, it is referred to as “Preparation Method 3”. ). FIG. 1 is a flowchart showing the preparation methods 1 to 3 in a simplified manner.
[0042]
  Of the extract of the present inventionPreparation method 3IsSpecifically, the following procedure is performed. First, gel filtration is performed on the supernatant after centrifugation. For the gel filtration, for example, a desalting column PD-10 (manufactured by Amersham Biosciences) can be suitably used. After equilibrating the column with the buffer, the sample may be supplied and eluted with the extraction solution. The gel filtration buffer is preferably a solution obtained by adding glycerol to the extraction solution. Thereby, there exists an advantage that the component essential for protein synthesis can be stabilized. Glycerol is usually added so as to be 5 (v / v)% to 40 (v / v)% (preferably 20 (v / v)%).
[0043]
The filtrate obtained by gel filtration should be 0.1 mL to 1 mL as one fraction, as is done by normal gel filtration, and efficiently fractions having a high protein synthesis ability. From a viewpoint, it is preferable to make 0.4 mL-0.6 mL into 1 fraction.
[0044]
Next, a fraction having an absorbance at 280 nm of 10 or more is collected from the filtrate after gel filtration. In the treatment, for example, the absorbance at 280 nm is measured for each fraction using an instrument such as Ultraspec 3300pro (manufactured by Amersham Bioscience), and a fraction having this absorbance of 10 or more is collected. Foreign mRNA is added to the thus obtained fraction to obtain the extract of the present invention. It should be noted that the extract of the present invention may naturally be one obtained by adding exogenous mRNA to a mixture of a plurality of fractions having an absorbance at 280 nm of 10 or more.
[0045]
Further, the extract of the present invention is obtained from the viewpoint of obtaining an extract having a higher protein synthesis ability by the following preparation method (hereinafter referred to as “preparation method 4”) including a step of removing liquid fibroin. Preferably it is prepared. If liquid fibroin is mixed in the extract, the liquid fibroin itself may inhibit the protein synthesis reaction described later using the extract, and components essential for the protein synthesis reaction in the silkworm tissue ( For example, ribosome, aminoacyl-tRNA synthetase, various translation factors, etc.) are taken into liquid fibroin and it becomes difficult to extract these components, resulting in a decrease in the amount of essential components contained in the extract, This is because the amount of protein synthesis may decrease. In addition, the liquid fibroin is mixed to increase the viscosity of the extract itself, making it difficult for the protein synthesis reaction to proceed and the operability to deteriorate.
[0046]
  FIG. 2 is a flowchart showing the preparation method 4 in a simplified manner. Specifically, first, after performing the above extraction using an extraction solution having a pH of 4 to 10, a supernatant obtained by performing one centrifugation as described above (the above supernatant 1), After incubating the supernatant obtained by re-centrifugation (the above supernatant 2) or the lower layer obtained by re-centrifugation, it is frozen. After thawing, the supernatant obtained by centrifugation (hereinafter referred to as “supernatant 3”).)Foreign mRNA is added to the filtrate obtained by gel filtration (fraction having an absorbance at 280 nm of 10 or more) to obtain an extract.
  In the preparation method 4, first, an extraction liquid having a pH of 4 to 10 is used to solidify liquid fibroin at the time of extraction from a silkworm tissue, and as a result, an extract from which liquid fibroin has been removed is prepared. Furthermore, it is possible to effectively remove the liquid fibroin by further solidifying the liquid fibroin by performing a treatment of freezing the supernatant 1, the supernatant 2 or the lower layer after incubation, and In addition, it is possible to efficiently extract the components essential for the protein synthesis reaction incorporated into the liquid fibroin.
[0047]
When preparing an extract by the above preparation method 4, a solution having a pH of 4 to 10, preferably 6 to 8, more preferably 6 to 7 is used as the extraction solution. This is because if an extraction solution having a pH of less than 4 is used, components essential for the protein synthesis reaction described below may be denatured. Further, when an extraction solution having a pH exceeding 10 is used, there is a possibility that components essential for the protein synthesis reaction may be denatured as described above, and liquid fibroin may not be solidified.
[0048]
There are no particular restrictions on the conditions for incubation of the supernatant 1, the supernatant 2 or the lower layer, and it may be carried out according to the conditions conventionally used by those skilled in the art. Is more preferable. This is because when the temperature exceeds 40 ° C., components essential for the protein synthesis reaction tend to be denatured. Further, the incubation time is preferably 24 hours or less, and more preferably 6 hours or less. This is because if the incubation time exceeds 24 hours, components essential for the reaction may be denatured.
[0049]
The freezing after the incubation is not particularly limited as long as it is performed according to conditions conventionally used by those skilled in the art. However, it is preferable to freeze at -10 ° C or lower, and to freeze at -20 ° C or lower. More preferred. This is because freezing at a temperature higher than −10 ° C. tends to denature components essential for the protein synthesis reaction. The freezing time is preferably 72 hours or shorter, more preferably 48 hours or shorter. This is because the solidification of the liquid fibroin has already been completed even after freezing for more than 72 hours, and no further solidification can be expected.
[0050]
  Centrifuge conditions after thawingasFor example, what is necessary is just to carry out on the conditions of 10000 * g-50000 * g similar to the above, 0 degreeC-10 degreeC, 10 minutes-60 minutes. The supernatant obtained by the centrifugation (Supernatant 3)Gel filtration is performed, and a fraction having an absorbance at 280 nm of 10 or more is collected from the filtrate after gel filtration, and foreign mRNA may be added to the obtained liquid. What is necessary is just to perform like the above-mentioned, when performing the said gel filtration and fraction collection processing.
[0051]
In order to obtain an extract containing a desired amount of the above extract, it is usually necessary to extract from a plurality of silkworms. The number of silkworms used for extraction varies depending on the condition of silkworms used and individual differences, but for silkworm larvae, it is necessary to obtain the same amount of extract as the tissue matures as it approaches the stage of silkworm formation. The number is small. In particular, the silk gland matures significantly every day in the 5th instar silkworm larvae. Therefore, for example, the same amount as about 30 silkworm larvae on the first day of the 5th instar, On the day, it can be obtained from about 6 to 7 silkworm larvae.
[0052]
The cell-free protein synthesis extract of the present invention is preferably obtained by the above preparation method in view of the above-described advantages, but may not necessarily be obtained by the above preparation method.
[0053]
The present invention also provides a liquid composition for cell-free protein synthesis containing at least an extract derived from silkworm tissue and a protease inhibitor. Silkworm tissue-derived extracts and protease inhibitors contained in this liquid composition are the same as described above for the extract of the present invention. The liquid composition of the present invention preferably further contains a potassium salt, a magnesium salt, dithiothreitol and a buffering agent at the same content as described above except that it does not contain foreign mRNA. When a cell-free protein synthesis reaction is carried out using such a liquid composition, it may be carried out in the same manner as in the preparation of a reaction solution from an extract described later, except that foreign mRNA is further added to the reaction solution.
[0054]
The present invention also provides a cell-free protein synthesis method using the above extract. The reaction solution used for the protein synthesis is not particularly limited as long as it is conventionally used in the field of cell-free protein synthesis.
[0055]
Note that the reaction solution contains 10 (v / v)% to 80 (v / v)%, particularly 30 (v / v)% to 60 (v / v)% of the extract of the present invention. Preferably it is prepared.
That is, it is preferable that the content of the silkworm tissue-derived extract is preferably 0.1 mg / mL to 160 mg / mL in terms of protein concentration in the whole reaction solution, and 3 mg / mL to 60 mg / mL. It is more preferable to prepare so that. This is because when the content of the extract is less than 0.1 mg / mL or exceeds 160 mg / mL in terms of protein concentration, the protein synthesis rate tends to decrease.
Further, in the entire reaction solution, the foreign mRNA is preferably contained at 1 μg / mL to 1000 μg / mL, and more preferably 10 μg / mL to 500 μg / mL. This is because if the mRNA is less than 1 μg / mL or exceeds 1000 μg / mL, the rate of protein synthesis tends to decrease.
[0056]
Usually, as the reaction solution, components other than the extract solution are potassium salt, magnesium salt, DTT, adenosine triphosphate, guanosine triphosphate, creatine phosphate, creatine kinase, amino acid component, RNase inhibitor, tRNA, buffer. The one containing at least an agent is used. Thereby, it is possible to realize a reaction solution for cell-free protein synthesis that further has an advantage that a large amount of protein can be synthesized in a short time.
[0057]
As the potassium salt in the reaction solution, various potassium salts described above as a component of the extract, preferably potassium acetate, can be preferably used. The potassium salt is preferably contained in the reaction solution at a concentration of 10 mM to 500 mM, and more preferably 50 mM to 150 mM, from the same viewpoint as that of the potassium salt in the extract described above.
[0058]
As the magnesium salt in the reaction solution, the above-described various magnesium salts, preferably magnesium acetate, can be preferably used as a component of the extract. The magnesium salt is preferably contained in the reaction solution in an amount of 0.1 mM to 10 mM, more preferably 0.5 mM to 3 mM, from the same viewpoint as in the case of the magnesium salt in the above-described extract.
[0059]
The DTT in the reaction solution is preferably contained in a concentration of 0.1 mM to 10 mM, more preferably 0.2 mM to 5 mM, from the same viewpoint as in the case of the DTT in the extract described above.
[0060]
Adenosine triphosphate (hereinafter sometimes referred to as “ATP”) in the reaction solution is preferably contained in an amount of 0.01 mM to 10 mM in the reaction solution from the viewpoint of the rate of protein synthesis. It is more preferable to contain 1 mM-5 mM. This is because if ATP is less than 0.01 mM or exceeds 10 mM, the protein synthesis rate tends to decrease.
[0061]
From the viewpoint of the rate of protein synthesis, guanosine triphosphate (hereinafter sometimes referred to as “GTP”) in the reaction solution is preferably contained in an amount of 0.01 mM to 10 mM. It is more preferable to contain 1 mM-5 mM. This is because if GTP is less than 0.01 mM or exceeds 10 mM, the rate of protein synthesis tends to decrease.
[0062]
Creatine phosphate in the reaction solution is a component for continuously synthesizing proteins, and is blended for the purpose of regenerating ATP and GTP. From the viewpoint of protein synthesis rate, creatine phosphate is preferably contained in the reaction solution in an amount of 1 mM to 200 mM, more preferably 10 mM to 100 mM. This is because if creatine phosphate is less than 1 mM, sufficient amounts of ATP and GTP are difficult to regenerate, resulting in a tendency for the protein synthesis rate to decrease, and if creatine phosphate exceeds 200 mM, an inhibitory substance This is because the protein synthesis rate tends to decrease.
[0063]
Creatine kinase in the reaction solution is a component for continuously synthesizing proteins, and is formulated for the purpose of regenerating ATP and GTP together with creatine phosphate. From the viewpoint of protein synthesis rate, creatine kinase is preferably contained in the reaction solution in an amount of 1 μg / mL to 1000 μg / mL, and more preferably 10 μg / mL to 500 μg / mL. This is because when creatine kinase is less than 1 μg / mL, sufficient amounts of ATP and GTP are difficult to be regenerated, and as a result, the protein synthesis rate tends to decrease. When creatine kinase exceeds 1000 μg / mL, This is because it acts as an inhibitor and tends to decrease the rate of protein synthesis.
[0064]
The amino acid component in the reaction solution includes 20 types of amino acids, namely valine, methionine, glutamic acid, alanine, leucine, phenylalanine, glycine, proline, isoleucine, tryptophan, asparagine, serine, threonine, histidine, aspartic acid, tyrosine, lysine. , Glutamine, cystine and arginine at least. This amino acid also includes radioisotope labeled amino acids. Furthermore, you may contain the modified amino acid as needed. The amino acid component usually contains approximately equal amounts of each type of amino acid.
In the present invention, from the viewpoint of protein synthesis speed, the amino acid component is preferably contained in the reaction solution in an amount of 1 μM to 1000 μM, more preferably 10 μM to 200 μM. This is because if the amino acid component is less than 1 μM or exceeds 1000 μM, the protein synthesis rate tends to decrease.
[0065]
The RNase inhibitor in the reaction solution prevents undesired digestion of mRNA and tRNA during the cell-free protein synthesis of the present invention by the silkworm-derived RNase mixed in the extract, thereby preventing protein synthesis. It is mix | blended for the objective, It is preferable to contain 0.1U / microliter-100U / microliter in the said reaction liquid, and it is more preferable that 1U / microliter-10U / microliter is contained. If the RNase inhibitor is less than 0.1 U / μL, the degradation activity of RNase tends not to be sufficiently suppressed. If the RNase inhibitor exceeds 100 U / μL, the protein synthesis reaction tends to be inhibited. Because.
[0066]
The tRNA in the reaction solution contains approximately equal amounts of the tRNA types corresponding to the 20 amino acids. In the present invention, from the viewpoint of the rate of protein synthesis, the reaction solution preferably contains 1 μg / mL to 1000 μg / mL, more preferably 10 μg / mL to 500 μg / mL. This is because if the tRNA is less than 1 μg / mL or exceeds 1000 μg / mL, the rate of protein synthesis tends to decrease.
[0067]
As the buffer contained in the reaction solution, those similar to the above-described extract of the present invention can be suitably used. For the same reason, it is preferable to use HEPES-KOH (pH 6 to 8). Moreover, it is preferable that 5 to 200 mM is contained, and it is more preferable that 10 to 50 mM is contained for a buffering agent from the viewpoint similar to the case of the buffering agent in the extract mentioned above.
[0068]
The reaction solution preferably contains glycerol. This is because the addition of glycerol has an advantage that components essential for protein synthesis can be stabilized in the protein synthesis reaction. When glycerol is added, it is usually added so as to be 5 (v / v)% to 20 (v / v)%.
[0069]
Further, the reaction solution preferably contains ethylene glycol bis (2-aminoethyl ether) tetraacetic acid (hereinafter sometimes referred to as “EGTA”). When EGTA is contained, EGTA forms a chelate with a metal ion in the extract to inactivate ribonuclease, protease, etc., thereby inhibiting degradation of components essential for protein synthesis of the present invention. is there. The EGTA is preferably contained in the reaction solution in an amount of 0.01 mM to 10 mM, more preferably 0.1 mM to 5 mM, from the viewpoint of suitably exhibiting the above-described degradation inhibitory ability. This is because if EGTA is less than 0.01 mM, the degradation activity of essential components tends not to be sufficiently suppressed, and if it exceeds 10 mM, the protein synthesis reaction tends to be inhibited.
[0070]
That is, the reaction solution used in the cell-free protein synthesis method of the present invention contains 30 (v / v)% to 60 (v / v)% of the above extract, 50 mM to 150 mM potassium acetate, 0.5 mM. ˜3 mM magnesium acetate, 0.2 mM to 5 mM DTT, 5 (v / v)% to 20 (v / v)% glycerol, 0.1 mM to 5 mM ATP, 0.1 mM to 5 mM GTP, 10 mM to 100 mM creatine phosphate, 10 μg / mL to 500 μg / mL creatine kinase, 10 μM to 200 μM amino acid component, 1 U / μL to 10 U / μL RNase inhibitor, 10 μg / mL to 500 μg / mL tRNA, 10 μg / mL to 500 μg Realized to contain 10 mL / mL mRNA, 10 mM to 50 mM HEPES-KOH (pH 6-8) It is preferably. In addition to the above, it is more preferable that the EGTA is further contained in an amount of 0.1 mM to 5 mM.
[0071]
The cell-free protein synthesis method of the present invention is performed in a conventionally known, for example, low temperature thermostat using the reaction solution containing the extract of the present invention as described above.
[0072]
The reaction temperature is usually in the range of 10 ° C to 40 ° C, preferably 20 ° C to 30 ° C. This is because if the reaction temperature is less than 10 ° C., the protein synthesis rate tends to decrease, and if the reaction temperature exceeds 40 ° C., essential components tend to denature.
The reaction time is usually 1 hour to 72 hours, preferably 3 hours to 24 hours.
[0073]
The amount of protein synthesized by the cell-free protein synthesis method of the present invention can be measured by measuring enzyme activity, SDS-PAGE, immunoassay, and the like.
[0074]
The protein that can be synthesized by the cell-free protein synthesis method of the present invention is not particularly limited.
[0075]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but these are merely illustrative and do not limit the scope of the present invention.
Example 1
: Preparation of extracts from silkworm glands of silkworm larvae
Silkworm larvae that reached the age of 5 were sampled every day from day 1 to day 7. The posterior silk gland was extracted from the sampled silkworm using scissors, tweezers and a scalpel, and the posterior silk gland was extracted on each day according to the following procedure.
Table 1 shows the number of silkworm larvae sampled and the amount of the rear silk gland extracted.
[0076]
[Table 1]
Figure 0004244625
[0077]
For extraction, first, the rear silk glands extracted from the 5th instar silkworm larvae were frozen in liquid nitrogen and ground in a mortar frozen at −80 ° C., and extraction was performed using an extraction liquid having the following composition. It was.
[Composition of extraction liquid]
・ 20 mM HEPES-KOH (pH 7.4)
・ 100 mM potassium acetate
・ 2 mM magnesium acetate
・ 2 mM DTT
・ 0.5 mM PMSF
After extraction, the obtained liquid substance was centrifuged with a centrifuge (himacCR20B3 (manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd.)) at 30000 × g for 30 minutes at 4 ° C.
After centrifugation, only the supernatant was isolated and centrifuged again at 30000 × g for 10 minutes at 4 ° C. Only the supernatant was isolated after centrifugation. A desalting column PD-10 (Amersham Biosciences) was added with an extraction solution containing 20% glycerol to equilibrate the column, then the supernatant was supplied and gel filtration was performed by elution with the extraction solution. Went.
Using a spectrophotometer (Ultraspec 3300pro, manufactured by Amersham Biosciences), the fraction of the filtrate after gel filtration was fractionated with an absorbance at 280 nm of 10 or more, and 40 μg / mL of foreign mRNA was added thereto. In addition, an extract for cell-free protein synthesis derived from the posterior silk gland of silkworm larvae at the age of 5 was obtained. As the exogenous mRNA, mRNA encoding luciferase (luciferase control RNA, manufactured by Promega) was used.
About the obtained extract, protein concentration was measured using BCA Protein assay Kit (made by PIERCE). First, 0.1 mL of a sample was added to 2 mL of the reaction reagent, reacted at 37 ° C. for 30 minutes, and the absorbance at 562 nm was measured using a spectrophotometer (Ultratroc 3300pro, manufactured by Amersham Biosciences). A calibration curve was prepared using BSA as a control. The protein concentration of each obtained extract was as follows.
[0078]
[Table 2]
Figure 0004244625
[0079]
The average time taken for one expert to prepare the extract by the above preparation method was about 2 hours.
[0080]
Example 2
: Preparation of silkworm larvae fat body extract
From the silkworm larvae that reached the age of 5 years, which was sampled every day from the first day to the seventh day, except that fat bodies were extracted and each day's fat body containing extract was prepared. The same operation as in Example 1 was performed.
Table 3 shows the number of silkworm larvae sampled and the amount of fat body extracted, and Table 4 shows the protein concentration of each of the obtained extracts.
[0081]
[Table 3]
Figure 0004244625
[0082]
[Table 4]
Figure 0004244625
[0083]
The average time taken for one expert to prepare the extract by the above preparation method was about 2 hours.
[0084]
Experimental example 1
: Protein synthesis in cell-free system using extracts of Examples 1 and 2
A reaction solution having the following composition was prepared using each of the extracts obtained in Examples 1 and 2 above.
[Composition of reaction solution]
50 (v / v)% extract (foreign mRNA in the reaction solution: 20 μg / mL)
・ 30 mM HEPES-KOH (pH 7.4)
・ 100 mM potassium acetate
・ 1 mM magnesium acetate
・ 3 mM DTT
・ 10 (v / v)% Glycerol
・ 0.5 mM ATP
・ 0.1 mM GTP
・ 25 mM creatine phosphate
・ 200μg / mL creatine kinase
・ 40μM amino acids (20 types)
・ 1U / μL RNase inhibitor
・ 200μg / mL tRNA
ATP (manufactured by Sigma), GTP (manufactured by Sigma), amino acid (20 types) (manufactured by Sigma), RNase inhibitor (manufactured by Takara Shuzo), and tRNA (manufactured by Roche Diagnostics) were used.
Using each prepared reaction solution, a cell-free protein (luciferase) was synthesized using a low-temperature aluminum block thermostatic chamber MG-1000 (manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) as a reaction apparatus. The reaction volume was 25 μL. The reaction temperature was 20 ° C., sampling was performed every reaction time, and the amount of synthesized luciferase was measured.
The synthesized luciferase was quantified using a luciferase assay kit (E-1500, manufactured by Promega). 2.5 μL of the reaction solution was added to 50 μL of the luciferase assay reagent, and luminescence by luciferase was measured using a luminometer (Turner Designs TD-20 / 20, manufactured by Promega).
[0085]
FIG. 3 is a graph showing the amount of luciferase synthesized 2 hours after the start of the reaction for each reaction solution using the extract of Example 1 (containing the silk gland of the silkworm larvae). In FIG. 3, the vertical axis indicates the amount of luciferase synthesis (ng / mL), and the horizontal axis indicates the number of days of growth of the 5th instar silkworm larvae.
FIG. 4 is a graph showing the amount of luciferase synthesized 2 hours after the start of the reaction for each reaction solution using the extract of Example 2 (containing silkworm larvae fat bodies). In FIG. 4, the vertical axis represents the amount of luciferase synthesis (ng / mL), and the horizontal axis represents the number of days of growth of 5th instar silkworm larvae.
[0086]
FIG. 5 is a graph showing the amount of luciferase synthesized with respect to the reaction time for each reaction solution (samples on the first day to the seventh day) using the extract of Example 1. In FIG. 5, the vertical axis indicates the amount of luciferase synthesis (ng / mL), and the horizontal axis indicates the reaction time (minutes).
As shown in FIG. 5, a reaction solution for cell-free protein synthesis prepared using an extract containing an extract derived from the posterior silk gland of silkworm larvae on the 4th day of the 5th infancy was reacted until 6 hours later. It was found that 397.4 ng / mL luciferase was synthesized. Furthermore, in the reaction using this reaction solution, 657.4 ng / mL luciferase was synthesized after 23 hours.
[0087]
Experimental example 2
When the influence of each component addition amount in the cell-free protein synthesis reaction using the extract of Example 1 was examined, the optimum reaction solution composition was as follows.
[Composition of reaction solution]
-50 (v / v)% extract (contains the silk gland of the silkworm larvae 5th instar 4th day) (foreign mRNA in the reaction solution: 40 μg / mL)
・ 30 mM HEPES-KOH (pH 7.4)
・ 75 mM potassium acetate
・ 1.5 mM magnesium acetate
・ 0.5 mM DTT
・ 10 (v / v)% Glycerol
・ 0.5 mM ATP
・ 0.5 mM GTP
・ 0.25 mM EGTA
・ 25 mM creatine phosphate
・ 200μg / mL creatine kinase
・ 40μM amino acids (20 types)
・ 2U / μL RNase inhibitor
・ 200μg / mL tRNA
Luciferase was synthesized in the same manner as in Example 1 except that the reaction solution having the optimized composition was used and the reaction temperature was 25 ° C.
FIG. 6 is a graph showing the amount of luciferase synthesized with respect to the reaction time for the reaction solution having the optimized composition. In FIG. 6, the vertical axis indicates the amount of luciferase synthesis (μg / mL), and the horizontal axis indicates the reaction time (minutes). As shown in FIG. 6, it was found that in the reaction solution with the optimized composition, the reaction continued until 4 hours, and 4.6 μg / mL luciferase was synthesized.
[0088]
Example 3
: Preparation of extracts from silkworm embryos
Two grams of silkworm eggs on day 0, day 2, day 5 and day 7 kept at 25 ° C. after delivery were collected, and an extract was prepared in the same manner as in Example 1. The protein concentration of each obtained extract was as follows.
[0089]
[Table 5]
Figure 0004244625
[0090]
The average time taken for one expert to prepare the extract by the above preparation method was about 1.5 hours.
[0091]
Experimental example 3
: Protein synthesis in cell-free system using the extract of Example 3
A reaction solution was prepared with the same composition as in Experimental Example 1 except that each extract obtained in Example 3 was used, and cell-free protein (luciferase) synthesis was performed.
As a result, 16 ng / mL luciferase was synthesized when the embryo-derived extract from the second day was used.
[0092]
Example 4
: Preparation of extracts from silkworm glands of silkworm larvae
Silkworm larvae that reached the fifth day of the 5th infancy were sampled. The posterior silk gland was extracted from the sampled silkworm using scissors, tweezers and a scalpel, and the posterior silk gland was extracted according to the following procedure.
In the extraction, first, the rear silk gland extracted from the silkworm larvae that reached the fifth day of the 5th infancy was frozen with liquid nitrogen and ground with a pestle frozen at −80 ° C., and an extraction solution having the following composition was used. Extraction was performed.
[Composition of extraction liquid]
・ 20 mM HEPES-KOH (pH 7.0)
・ 100 mM potassium acetate
・ 2 mM magnesium acetate
・ 1 mM DTT
・ 0.5 mM PMSF
After extraction, the obtained liquid substance was centrifuged with a centrifuge (himacCR20B3 (manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd.)) at 30000 × g for 10 minutes at 4 ° C. After centrifugation, only the supernatant was isolated, and again centrifuged at 30000 × g for 30 minutes at 4 ° C. to isolate the lower layer. This lower layer was incubated at room temperature (25 ° C.) for 6 hours, and then frozen at −80 ° C. overnight.
The frozen lower layer was thawed at room temperature and then centrifuged at 22000 × g for 60 minutes at 4 ° C. Only the supernatant was isolated after centrifugation. 320 μg / mL exogenous mRNA was added to the obtained supernatant to obtain an extract for cell-free protein synthesis derived from the posterior silk gland of the 5th instar silkworm larvae. As the exogenous mRNA, mRNA encoding luciferase (luciferase control RNA, manufactured by Promega) was used. The absorbance at 280 nm of this extract using a spectrophotometer (Ultraspec 3300pro, Amersham Biosciences) was 62.4.
The average time required for an expert (one person) to prepare the extract by the above preparation method was 24 hours.
[0093]
Experimental Example 4
: Protein synthesis in a cell-free system using the extract of Example 4
Using the extract obtained in Example 4 above, a reaction solution having the following composition was prepared, and luciferase was synthesized in the same manner as in Example 1.
[Reaction solution composition]
50 (v / v)% extract (foreign mRNA in the reaction solution: 160 μg / mL)
・ 30 mM HEPES-KOH (pH 7.4)
・ 100 mM potassium acetate
・ 1.5 mM magnesium acetate
・ 0.5 mM DTT
・ 10% (v / v)% Glycerol
・ 0.5 mM ATP
・ 0.5 mM GTP
・ 0.25 mM EGTA
・ 25 mM creatine phosphate
・ 200μg / ml creatine kinase
・ 40μM amino acids (20 types)
・ 2U / μL RNase inhibitor
・ 200μg / ml tRNA
FIG. 7 is a graph showing the amount of luciferase synthesized with respect to the reaction time for the reaction solution using the extract of Example 4 (containing the posterior silk gland of the silkworm larvae). In FIG. 7, the vertical axis represents the amount of luciferase synthesis (μg / mL), and the horizontal axis represents the reaction time (minutes).
As shown in FIG. 7, the reaction solution for cell-free protein synthesis prepared using an extract containing an extract derived from the posterior silk gland of 5th instar silkworm larvae reacted until 7 hours later. Continuing, 28 μg / mL luciferase was synthesized.
[0094]
Example 5
: Preparation of extracts from silkworm glands of silkworm larvae
Silkworm larvae that reached the fourth day of the 5th infancy were sampled. The posterior silk gland was extracted from the sampled silkworm using scissors, tweezers and a scalpel, and the posterior silk gland was extracted according to the following procedure.
In the extraction, first, the rear silk gland extracted from the silkworm larvae that reached the 4th day of the 5th infancy was frozen with liquid nitrogen and ground with a pestle frozen at −80 ° C., and the extraction liquid with the following composition was used. Extraction was performed.
[Composition of extraction liquid]
・ 20 mM HEPES-KOH (pH 7.4)
・ 100 mM potassium acetate
・ 2 mM magnesium acetate
・ 1 mM DTT
After extraction, the obtained liquid substance was centrifuged with a centrifuge (himacCR20B3 (manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd.)) at 30000 × g for 10 minutes at 4 ° C.
After centrifugation, only the supernatant was isolated and centrifuged again at 30000 × g for 30 minutes at 4 ° C. Only the supernatant was isolated after centrifugation.
A desalting column PD-10 (Amersham Biosciences) was added with an extraction solution containing 20% glycerol to equilibrate the column, then the supernatant was supplied and gel filtration was performed by elution with the extraction solution. Went.
Using a spectrophotometer (Ultraspec 3300pro, manufactured by Amersham Biosciences), the fraction of the filtrate after gel filtration was fractionated with an absorbance at 280 nm of 10 or more, and 80 μg / mL of exogenous mRNA was collected in this fraction. In addition, an extract for cell-free protein synthesis derived from the posterior silk gland of silkworm larvae at the age of 5 was obtained. As the exogenous mRNA, mRNA encoding luciferase (luciferase control RNA, manufactured by Promega) was used.
The average time taken for one expert to prepare the extract by the above preparation method was about 2 hours.
[0095]
Experimental Example 5
: Protein synthesis in a cell-free system using the extract of Example 5
Using the extract obtained in Example 5 above, a reaction solution having the following composition was prepared, and luciferase was synthesized in the same manner as in Example 1.
[Reaction solution composition]
50 (v / v)% extract (foreign mRNA in the reaction solution: 40 μg / mL)
・ 30 mM HEPES-KOH (pH 7.4)
・ 100 mM potassium acetate
・ 1.5 mM magnesium acetate
・ 0.5 mM DTT
・ 10% (v / v)% Glycerol
・ 0.5 mM ATP
・ 0.5 mM GTP
・ 0.25 mM EGTA
・ 25 mM creatine phosphate
・ 200μg / ml creatine kinase
・ 40μM amino acids (20 types)
・ 2U / μL RNase inhibitor
・ 200μg / ml tRNA
As a result, the amount of protein (luciferase) synthesis when PMSF was not added to the extract was reduced to 50.2% when PMSF was added.
[0096]
【The invention's effect】
As is clear from the above description, according to the present invention, a novel cell-free system capable of realizing cell-free protein synthesis that is easy to prepare and is derived from a eukaryote and can also synthesize glycoproteins. An extract for protein synthesis, a preparation method thereof, and a cell-free protein synthesis method using the extract can be provided.
[Brief description of the drawings]
[Figure 1]ExtractionIt is a flowchart which simplifies and shows the preparation methods 1-3 of a effluent.
[Figure 2]ExtractionIt is a flowchart which simplifies and shows the preparation method 4 of a effluent.
FIG. 3 is a graph showing the amount of luciferase synthesized for each reaction solution using the extract of Example 1 (containing the silk gland of the silkworm larvae), and the vertical axis represents the luciferase synthesis. The amount (ng / mL) is shown, and the horizontal axis shows the number of days of growth of 5th instar silkworm larvae.
4 is a graph showing the amount of luciferase synthesized 2 hours after the start of the reaction for each reaction solution using the extract of Example 2 (containing silkworm larvae fat pad), and the vertical axis represents the amount of luciferase synthesized. FIG. (Ng / mL) is shown, and the horizontal axis indicates the number of days of growth of 5th instar silkworm larvae.
FIG. 5 is a graph showing the amount of luciferase synthesized with respect to the reaction time for each reaction solution (samples on the first day to the seventh day) using the extract of Example 1, where the vertical axis represents luciferase. The amount of synthesis (ng / mL) is shown, and the horizontal axis shows the reaction time (minutes).
FIG. 6 is a graph showing the amount of luciferase synthesized with respect to the reaction time for a reaction solution having an optimized composition, where the vertical axis represents the amount of luciferase synthesized (μg / mL), and the horizontal axis represents the reaction time (minutes). Show.
FIG. 7 is a graph showing the amount of luciferase synthesized with respect to the reaction time for the reaction solution using the extract of Example 4 (containing the silk gland of the silkworm larvae), and the vertical axis represents the amount of luciferase synthesized (μg / mL), and the horizontal axis represents the reaction time (minutes).

Claims (12)

カイコ組織由来の抽出物と、外来ｍＲＮＡとを少なくとも含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液であって、
カイコ組織を凍結する工程、
凍結したカイコ組織をすり潰す工程、
すり潰したカイコ組織を抽出用液で抽出し、カイコ組織からの抽出物を含有する液状物を得る工程、
得られた液状物を１００００×ｇ〜５００００×ｇで遠心分離し上清を得る工程、
得られた上清をゲル濾過し、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する工程、及び
回収した画分に外来ｍＲＮＡを添加する工程を少なくとも含む調製法によって得られる、無細胞系タンパク質合成用抽出液。An extract for cell-free protein synthesis containing at least a silkworm tissue-derived extract and foreign mRNA ,
Freezing the silkworm tissue,
Crushing the frozen silkworm tissue,
Extracting the ground silkworm tissue with an extraction liquid to obtain a liquid material containing an extract from the silkworm tissue;
A step of centrifuging the obtained liquid at 10,000 × g to 50000 × g to obtain a supernatant,
A step of gel filtration of the obtained supernatant and fractionating a fraction having an absorbance at 280 nm of 10 or more; and
An extract for cell-free protein synthesis obtained by a preparation method including at least a step of adding foreign mRNA to the collected fraction . さらに、プロテアーゼインヒビターを含有する請求項１に記載の抽出液。 The extract according to claim 1, further comprising a protease inhibitor. カイコ組織由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬである、請求項１または２に記載の抽出液。 The extract according to claim 1 or 2, wherein the content of the extract derived from silkworm tissue is 1 mg / mL to 200 mg / mL in terms of protein concentration. カイコ組織が、カイコ幼虫の後部絹糸腺を少なくとも含有する請求項１〜３のいずれかに記載の抽出液。 The extract according to any one of claims 1 to 3, wherein the silkworm tissue contains at least a posterior silk gland of a silkworm larva. カイコ組織が、カイコ幼虫の脂肪体を少なくとも含有する請求項１〜３のいずれかに記載の抽出液。 The extract according to any one of claims 1 to 3, wherein the silkworm tissue contains at least a silkworm larvae fat body. カイコ組織が、カイコの胚を少なくとも含有する請求項１〜３のいずれかに記載の抽出液。 The extract according to any one of claims 1 to 3, wherein the silkworm tissue contains at least silkworm embryos. プロテアーゼインヒビターがフェニルメタンスルホニルフルオリドである、請求項２〜６のいずれかに記載の抽出液。 The extract according to any one of claims 2 to 6, wherein the protease inhibitor is phenylmethanesulfonyl fluoride. カイコ組織由来の抽出物と、プロテアーゼインヒビターとを少なくとも含有する無細胞系タンパク質合成用液状組成物であって、
カイコ組織を凍結する工程、
凍結したカイコ組織をすり潰す工程、
すり潰したカイコ組織をプロテアーゼインヒビターを含有する抽出用液で抽出し、カイコ組織からの抽出物を含有する液状物を得る工程、
得られた液状物を１００００×ｇ〜５００００×ｇで遠心分離し上清を得る工程、及び
得られた上清をゲル濾過し、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する工程を少なくとも含む調製法によって得られることを特徴とする、無細胞系タンパク質合成用液状組成物。And extracts derived from silkworm tissue, a cell-free protein synthesis liquid composition for you contains at least a protease inhibitor,
Freezing the silkworm tissue,
Crushing the frozen silkworm tissue,
Extracting the ground silkworm tissue with an extraction solution containing a protease inhibitor to obtain a liquid containing an extract from the silkworm tissue;
A step of centrifuging the obtained liquid at 10,000 × g to 50000 × g to obtain a supernatant, and
A liquid composition for cell-free protein synthesis, which is obtained by a preparation method including at least a step of subjecting the obtained supernatant to gel filtration and fractionating a fraction having an absorbance at 280 nm of 10 or more . 請求項１〜７のいずれかに記載の抽出液を使用した無細胞系タンパク質合成方法。 A cell-free protein synthesis method using the extract according to any one of claims 1 to 7. カイコ組織を凍結する工程、
凍結したカイコ組織をすり潰す工程、
すり潰したカイコ組織を抽出用液で抽出し、カイコ組織からの抽出物を含有する液状物を得る工程、
得られた液状物を１００００×ｇ〜５００００×ｇで遠心分離し上清を得る工程、
得られた上清をゲル濾過し、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する工程、及び
回収した画分に外来ｍＲＮＡを添加する工程を少なくとも含むことを特徴とする、無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法。 Freezing the silkworm tissue,
Crushing the frozen silkworm tissue,
Extracting the ground silkworm tissue with an extraction liquid to obtain a liquid material containing an extract from the silkworm tissue;
A step of centrifuging the obtained liquid at 10,000 × g to 50000 × g to obtain a supernatant,
A step of gel filtration of the obtained supernatant and fractionating a fraction having an absorbance at 280 nm of 10 or more; and
A method for preparing an extract for cell-free protein synthesis, comprising at least a step of adding foreign mRNA to the collected fraction . 抽出用液がプロテアーゼインヒビターを少なくとも含有するものである請求項１０に記載の調製方法。 The preparation method according to claim 10, wherein the extraction solution contains at least a protease inhibitor. カイコ組織から抽出用液を用いて抽出したカイコ組織由来の抽出物に、液状フィブロインを除去する処理を施すことを特徴とする請求項１０または１１に記載の調製方法。 The preparation method according to claim 10 or 11, wherein a treatment for removing liquid fibroin is applied to an extract derived from a silkworm tissue extracted from a silkworm tissue using an extraction liquid.
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