JP4324730B2 - Method for preparing insect cell extract for cell-free protein synthesis, insect cell extract, and cell-free protein synthesis method using insect cell extract - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、無細胞系のタンパク質合成に使用できる昆虫細胞抽出液の調製方法、および昆虫細胞抽出液、ならびに該昆虫細胞抽出液を使用した無細胞系タンパク質合成方法に関する。 The present invention relates to a method for preparing an insect cell extract that can be used for cell-free protein synthesis, an insect cell extract, and a cell-free protein synthesis method using the insect cell extract.
近年、ヒトゲノムを始め多くの生物の遺伝情報が解読されてきている。このような中、ポストゲノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これらの遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品などに応用、利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡単に合成することが必要となってくる。 In recent years, genetic information of many organisms including the human genome has been decoded. Under such circumstances, functional analysis of proteins corresponding to these genetic information and genome drug discovery are attracting attention as post-genome research. In order to apply and use proteins corresponding to these genetic information in medicines, it is necessary to synthesize huge types of proteins easily in a short time.
現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子組換え技術によって酵母や昆虫細胞などの生細胞を用いる発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないなど発現が困難なタンパク質も多い。 At present, expression systems using living cells such as yeast and insect cells (hereinafter sometimes referred to as “cell systems”) are widely used as protein production methods by genetic recombination techniques. However, living cells tend to exclude foreign proteins in order to maintain self-function, and there are many proteins that are difficult to express, such as when cells express no cytotoxic proteins in living cells.
一方、細胞系を使用しないタンパク質の生産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系を試験管内に取り揃え、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡを用いて、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させることのできる合成系を再構築する、無細胞系のタンパク質合成が知られている。このような無細胞系タンパク質合成では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受けにくく、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質の合成を行うことができる。さらに無細胞系タンパク質合成では、生命体が利用していないアミノ酸配列からなるタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な発現方法であると期待されている。このような無細胞系のタンパク質合成に供する細胞破砕液や抽出液として、種々の生物由来のものを使用することが検討され、研究が進められている。この中で、昆虫細胞は、多くの哺乳類系の培養細胞と異なり二酸化炭素雰囲気下での培養を必要とせず、無血清培地においても培養が可能で、また細胞系においては翻訳後修飾により、本来の生物活性を保持しつつ大量発現が可能であることから、様々なタンパク質の発現に用いられている。このような昆虫細胞を無細胞系において利用することが可能となれば、糖鎖付加などの翻訳後修飾も充分に期待できるため、その開発が注目されている。 On the other hand, as a protein production method that does not use a cell system, a genetic information translation system for organisms is prepared in a test tube by adding a substrate or an enzyme to a cell lysate or extract, and mRNA that encodes the target protein is used. Thus, cell-free protein synthesis is known in which a synthetic system capable of combining amino acids with the required number of residues in the desired order is reconstructed. Such cell-free protein synthesis is less subject to the limitations of the above-mentioned cell-based protein synthesis, and can synthesize proteins without losing the lives of living organisms. Since it is not accompanied, protein synthesis can be performed in a short time compared with the cell system. Furthermore, cell-free protein synthesis is expected to be a promising expression method because it enables mass production of proteins consisting of amino acid sequences that are not utilized by living organisms. The use of cells derived from various organisms as cell disruption solutions and extracts for cell-free protein synthesis has been studied and research is being conducted. Among these, insect cells, unlike many mammalian cells, do not require culturing in a carbon dioxide atmosphere and can be cultured in serum-free media. It is used for the expression of various proteins since it can be expressed in large quantities while retaining its biological activity. If such insect cells can be used in a cell-free system, post-translational modifications such as glycosylation can be sufficiently expected.
従来、無細胞系タンパク質合成用の抽出液を調製すべく昆虫細胞から抽出を行う方法としては、不活性ガスの雰囲気中、加圧下の昆虫細胞を減圧させることによって、昆虫細胞を破砕して抽出する方法が知られている（たとえば、特許文献１を参照。）。しかし、この方法では昆虫細胞からの抽出に際し特別な装置や器具が必要であり、また操作も煩雑である。さらに、抽出液調製時の細胞数や窒素ガス圧、加圧時間によって無細胞系でのタンパク質合成能が大きく影響されるため、条件設定に煩雑な操作を要する。また、かかる方法によって得られた抽出液では、合成できるタンパク質の量は極めて少なく、放射能標識を行ったアミノ酸の取り込みによってのみ、そのタンパク質合成活性を測定できるという程度である。
このため、その調製が容易でありかつタンパク質合成量の高い昆虫細胞由来抽出液およびその調製方法の開発が望まれている。
Therefore, development of an insect cell-derived extract that is easy to prepare and has a high protein synthesis amount and a method for preparing the extract are desired.
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、調製が容易であり、かつ従来よりもタンパク質合成量の高い無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液の調製方法、および該昆虫細胞抽出液、ならびにこの昆虫細胞抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供することである。 The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and the object of the present invention is to provide an insect cell extract for cell-free protein synthesis that is easy to prepare and has a higher protein synthesis amount than conventional ones. And the insect cell extract, and a cell-free protein synthesis method using the insect cell extract.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）昆虫細胞から抽出を行って無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液を調製する方法であって、抽出用液中に懸濁した昆虫細胞を急激に凍結させる工程と、凍結させた昆虫細胞を０℃〜１０℃の水浴または氷水浴中で解凍する工程とを少なくとも含有する、無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液の調製方法。
（２）上記昆虫細胞を急激に凍結させ、解凍した後、遠心分離することによって昆虫細胞からの抽出を行う、上記（１）に記載の調製方法。
（３）昆虫細胞が、液体窒素によって凍結される、上記（１）または（２）に記載の調製方法。
（４）抽出用液がプロテアーゼインヒビターを含有するものである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の調製方法。
（５）ヌクレアーゼ処理を施すことを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の調製方法。
（６）昆虫細胞がＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ卵細胞由来および／またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣細胞由来の培養細胞である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の調製方法。
（７）上記（１）〜（６）のうちのいずれかに記載の方法で調製された、無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液。
（８）上記（７）に記載の昆虫細胞抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成方法。
（９）キャップ構造を有する外来ｍＲＮＡを使用することを特徴とする、上記（８）に記載の合成方法。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have completed the present invention. That is, the present invention is as follows.
(1) A method for preparing an insect cell extract for cell-free protein synthesis by extracting from insect cells, the step of rapidly freeing insect cells suspended in the extract, and the frozen insect A method for preparing an insect cell extract for cell-free protein synthesis, comprising at least a step of thawing cells in a water bath or ice water bath at 0 ° C to 10 ° C.
(2) The preparation method according to (1), wherein the insect cells are rapidly frozen, thawed, and then extracted from the insect cells by centrifugation.
(3) The preparation method according to (1) or (2) above, wherein the insect cells are frozen with liquid nitrogen.
(4) The preparation method according to any one of (1) to (3) above, wherein the extraction liquid contains a protease inhibitor.
(5) The preparation method according to any one of (1) to (4) above, wherein nuclease treatment is performed.
(6) The preparation method according to any one of (1) to (5) above, wherein the insect cells are cultured cells derived from Trichoplusia ni egg cells and / or Spodoptera frugiperda ovary cells.
(7) An insect cell extract for cell-free protein synthesis prepared by the method according to any one of (1) to (6) above.
(8) A cell-free protein synthesis method using the insect cell extract according to (7) above.
(9) The synthesis method according to (8) above, wherein a foreign mRNA having a cap structure is used.
本明細書における「無細胞系タンパク質合成」は、外来ｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する無細胞翻訳系によるタンパク質合成を指すものとする。ここで、本発明の合成方法によって無細胞系で合成される「タンパク質」は、複数のアミノ酸残基から構成される任意の分子量のペプチド、すなわち低分子量のペプチドから高分子量のいずれをも包含するものとする。また本明細書でいう「タンパク質」は、糖鎖修飾されてなる糖タンパク質も含む。 As used herein, “cell-free protein synthesis” refers to protein synthesis by a cell-free translation system that synthesizes a protein by reading information on foreign mRNA. Here, the “protein” synthesized in a cell-free system by the synthesis method of the present invention encompasses any molecular weight peptide composed of a plurality of amino acid residues, that is, any of low molecular weight peptides to high molecular weights. Shall. The “protein” as used herein also includes glycoproteins that are modified with a sugar chain.
本発明によれば、調製が容易であり、かつ従来よりもタンパク質合成量の高い無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液の調製方法、および該昆虫細胞抽出液、ならびにこの昆虫細胞抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供することができる。 According to the present invention, a method for preparing an insect cell extract for cell-free protein synthesis that is easy to prepare and has a higher protein synthesis amount than the conventional method, the insect cell extract, and the insect cell extract are used. A cell-free protein synthesis method can be provided.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、昆虫細胞から抽出を行って無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液を調製する方法であって、抽出用液中に懸濁した昆虫細胞を急激に凍結させる工程と、凍結させた昆虫細胞を０℃〜１０℃の水浴または氷水浴中で解凍する工程とを少なくとも含有することをその大きな特徴とするものである。抽出用液中に懸濁した昆虫細胞を急激に凍結させる工程を行うことで、上記特許文献１に記載の従来の手法と比較して、より緩和な状態で細胞の破砕を行うことができ、無細胞系タンパク質合成に必須な成分を破壊することなく細胞外に取り出すことができるので、従来よりも無細胞系にてタンパク質の合成量の高い抽出液を容易に調製することができる。さらに本発明の方法によれば、使用器具などからのＲＮａｓｅなどの混入も防ぐことができ、また、界面活性剤などの試薬を用いた細胞破砕法の場合に懸念される翻訳反応を阻害するような物質の持込みもない。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention relates to a method for preparing an insect cell extract for cell-free protein synthesis by extracting from insect cells, the step of rapidly freeing insect cells suspended in the extract solution, and the method of freezing It is characterized by containing at least a step of thawing insect cells in a water bath at 0 ° C. to 10 ° C. or an ice water bath. By performing the step of rapidly freezing insect cells suspended in the extraction solution, the cells can be crushed in a more relaxed state as compared to the conventional technique described in
本発明の調製方法では、抽出用液中に懸濁した昆虫細胞を急激に凍結させることを要する。本発明の調製方法において、「急激に凍結」とは、凍結処理に付した後、１０秒以下、好ましくは２秒以下で昆虫細胞を凍結させることを指す。本発明において、昆虫細胞の凍結を急激に行わなかった場合には、タンパク質合成に必須な成分が不活化する虞があるため、本発明の上記効果を達成することができない。
上記のように昆虫細胞を急激に凍結させる温度としては、通常−８０℃以下であり、好ましくは−１５０℃以下である。−８０℃を越える温度で急激に凍結させると、タンパク質合成に必須な成分が失活してタンパク質合成能が低下してしまう傾向にあるためである。
In the preparation method of the present invention, it is necessary to rapidly freeze insect cells suspended in the extraction solution. In the preparation method of the present invention, “rapid freezing” refers to freezing insect cells in 10 seconds or less, preferably 2 seconds or less after being subjected to a freezing treatment. In the present invention, when insect cells are not rapidly frozen, the above-described effects of the present invention cannot be achieved because components essential for protein synthesis may be inactivated.
The temperature at which insect cells are rapidly frozen as described above is usually −80 ° C. or lower, preferably −150 ° C. or lower. This is because, when frozen rapidly at a temperature exceeding −80 ° C., components essential for protein synthesis are deactivated and the protein synthesis ability tends to decrease.
上記昆虫細胞の急激な凍結は、たとえば、液体窒素や液体ヘリウムなどの不活性ガスを使用することなどによって実現できるが、入手が容易であり安価な液体窒素を用いて行うのが好ましい。 The rapid freezing of the insect cells can be realized, for example, by using an inert gas such as liquid nitrogen or liquid helium. However, it is preferable to use liquid nitrogen that is easily available and inexpensive.
本発明の調製方法においては、昆虫細胞からの抽出に際して、抽出用液中に懸濁した昆虫細胞を急激に凍結させる工程と、凍結させた昆虫細胞を０℃〜１０℃の水浴または氷水浴中で解凍する工程とを少なくとも含有しているならば、その他の工程について特に制限はない。たとえば、乳鉢中で乳棒を用いてすり潰す方法、ダウンスホモジナイザーを用いる方法、ガラスビーズを用いる方法など、大腸菌や小麦胚芽などから無細胞系タンパク質合成用の抽出液を得る際に従来より行われていた種々の手法にて昆虫細胞を破砕し、抽出を行えばよいが、昆虫細胞は、大腸菌や小麦胚芽などから無細胞系タンパク質合成用の抽出液を得る場合と比較して細胞の破砕が容易であり、さらには、この凍結・解凍によるだけの破砕法により得られた抽出液にはタンパク質合成に必須な成分が活性を保持した状態で含まれているという理由によりタンパク質合成能の高い抽出液を得ることができるという利点もあることから、上記昆虫細胞を急激に凍結させ、解凍した後、遠心分離することによって昆虫細胞を破砕するのが好ましい。
In the preparation method of the present invention, when extracting from insect cells, the step of rapidly freeing the insect cells suspended in the extraction solution and the frozen insect cells in a water bath or ice water bath at 0 ° C. to 10 ° C. If it contains at least the process of thawing in
上記急激に凍結した昆虫細胞を、解凍する工程においては、タンパク質合成に必須な成分の失活を防止し、タンパク質合成能の低下を確実に防ぐことから、０℃〜１０℃の水浴または氷水浴中での解凍を行う。また、０℃〜１０℃（特には、４℃〜１０℃）の水浴または氷水浴中で解凍を行うのが好ましい。解凍した昆虫細胞の遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行えばよい。かかる遠心分離後の上清には、目的とする昆虫細胞の抽出物が含有される。
In the step of thawing the rapidly frozen insect cells, inactivation of components essential for protein synthesis is prevented and a decrease in protein synthesis ability is surely prevented. Therefore , a water bath or an ice water bath at 0 ° C. to 10 ° C. Defrost in. Moreover, it is preferable to perform thawing | decompression in a 0 degreeC-10 degreeC (especially 4 degreeC-10 degreeC) water bath or an ice water bath. Centrifugation of the thawed insect cells may be performed under conditions usually performed in the art (10,000 × g to 50,000 × g, 0 ° C. to 10 ° C., 10 minutes to 60 minutes). The supernatant after the centrifugation contains an extract of the target insect cell.
本発明に用いる昆虫細胞としては、特に制限はなく、たとえば、鱗翅目、直翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目、甲虫目、脈翅目、半翅目などの昆虫由来の細胞を使用することができる。中でも、培養細胞株が多く樹立されていることから鱗翅目、半翅目などの昆虫由来の細胞が好ましい。また、本発明における昆虫細胞としては、いかなる組織由来の細胞であってもよく、たとえば、血球細胞、生殖巣由来細胞、脂肪体由来細胞、胚由来細胞、孵化幼虫由来細胞などを特に制限なく使用することができる。中でも、タンパク質生産能が高いと考えられる生殖巣由来細胞を使用するのが好ましい。特に、細胞系においてタンパク質合成能が高く、また無血清培地にて培養が可能であることから、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵細胞由来の細胞であるＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）やＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣細胞由来の細胞であるＳｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を昆虫細胞として用いるのが好ましい。
なお本発明においては、単一種の昆虫における単一の組織由来の昆虫細胞に限らず、単一種の昆虫における複数種の組織由来であってよく、複数種の昆虫における単一の組織由来であってもよく、無論、複数種の昆虫における複数種の組織由来であってもよい。
The insect cells used in the present invention are not particularly limited, and for example, cells derived from insects such as Lepidoptera, Diptera, Diptera, Hymenoptera, Coleoptera, Coleoptera, Coleoptera, Hemiptera, etc. Can be used. Of these, insect-derived cells such as Lepidoptera and Hemiptera are preferred because many cultured cell lines have been established. In addition, the insect cells in the present invention may be cells derived from any tissue, and for example, blood cells, gonad-derived cells, fat pad-derived cells, embryo-derived cells, hatched larva-derived cells and the like are used without particular limitation. can do. Among them, it is preferable to use gonad-derived cells which are considered to have high protein production ability. In particular, high protein synthesis ability in cell lines, and because it is possible cultured in serum-free medium, is an egg cell-derived cell Trichoplusia ni High Five (Invitrogen Corp.) and Spodoptera frug i perda ovary cell-derived It is preferable to use Sf21 (manufactured by Invitrogen), which is a cell, as an insect cell.
In the present invention, it is not limited to insect cells derived from a single tissue in a single species of insect, but may be derived from a plurality of types of tissue in a single species of insect, and may be derived from a single tissue in a plurality of types of insects. Of course, it may be derived from a plurality of types of tissues in a plurality of types of insects.
本発明の調製方法に用いられる抽出用液は、特に制限されるものではないが、プロテアーゼインヒビターを少なくとも含有するのが好ましい。プロテアーゼインヒビターを含有する抽出用液を用いると、昆虫細胞由来の抽出物に含有されるプロテアーゼの活性が阻害され、当該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパクの不所望な分解を防止でき、結果として昆虫細胞由来の抽出物が有するタンパク質合成能を有効に引き出すことができるようになるという利点がある。 The extraction solution used in the preparation method of the present invention is not particularly limited, but preferably contains at least a protease inhibitor. When an extraction solution containing a protease inhibitor is used, the activity of the protease contained in the insect cell-derived extract is inhibited, and undesired degradation of the active protein in the extract by the protease can be prevented. There is an advantage that the protein synthesis ability of the cell-derived extract can be effectively extracted.
上記プロテアーゼインヒビターとしては、プロテアーゼの活性を阻害し得るものであるならば特に制限はなく、たとえば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（以下、「ＰＭＳＦ」ということがある。）、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン）、エチレンジアミン四酢酸、ホスホラミドンなどを使用することができるが、昆虫細胞由来の抽出液にはセリンプロテアーゼが含まれることから、上記中でもセリンプロテアーゼに対して特異性の高いインヒビターとして働くＰＭＳＦを使用するのが好ましい。また、１種類のプロテアーゼインヒビターのみならず、数種類の混合物（プロテアーゼインヒビターカクテル）を用いてもよい。 The protease inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of the protease. For example, phenylmethanesulfonyl fluoride (hereinafter sometimes referred to as “PMSF”), aprotinin, bestatin, leupeptin, pepstatin A, E-64 (L-trans-epoxysuccinyl leucylamide-4-guanidinobutane), ethylenediaminetetraacetic acid, phosphoramidon, etc. can be used, but the extract derived from insect cells should contain serine protease Therefore, among the above, it is preferable to use PMSF which acts as a highly specific inhibitor for serine protease. Further, not only one type of protease inhibitor but also several types of mixtures (protease inhibitor cocktail) may be used.
当該抽出用液中におけるプロテアーゼインヒビターの含有量に特に制限はないが、本発明の作用に必須な酵素類の分解阻害能を好適に発揮できる観点から、１μＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。プロテアーゼインヒビターが１μＭ未満であると、プロテアーゼの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またプロテアーゼインヒビターが５０ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。 The content of the protease inhibitor in the extraction solution is not particularly limited, but is preferably 1 μM to 50 mM from the viewpoint of suitably exhibiting the ability to inhibit the degradation of enzymes essential for the action of the present invention. More preferably, it is contained in an amount of 0.01 mM to 5 mM. This is because if the protease inhibitor is less than 1 μM, the protease degradation activity tends not to be sufficiently suppressed, and if the protease inhibitor exceeds 50 mM, the protein synthesis reaction tends to be inhibited.
また本発明に用いる抽出用液は、上記プロテアーゼインヒビターに加えて、カリウム塩、マグネシウム塩、ジチオトレイトールおよび緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。
上記カリウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ましい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
The extraction solution used in the present invention preferably contains at least a potassium salt, a magnesium salt, dithiothreitol and a buffer in addition to the protease inhibitor.
The potassium salt is not particularly limited as long as it does not inhibit the action of the present invention. For example, potassium acetate, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate, potassium chloride, dipotassium hydrogen phosphate, dipotassium hydrogen citrate, It can be used in a general form such as potassium sulfate, potassium dihydrogen phosphate, potassium iodide, potassium phthalate, etc. Among them, potassium acetate is preferably used. Potassium salts act as cofactors in protein synthesis reactions.
当該抽出用液中におけるカリウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど１価のカリウム塩である場合、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜３００ｍＭ含有されることがより好ましい。カリウム塩が１０ｍＭ未満または５００ｍＭを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。 Although there is no restriction | limiting in particular in content of the potassium salt in the said liquid for extraction, From a viewpoint of storage stability, when it is monovalent potassium salts, such as potassium acetate, for example, it is preferable that 10 mM-500 mM are contained, 50 mM- More preferably, it contains 300 mM. This is because if the potassium salt is less than 10 mM or exceeds 500 mM, components essential for protein synthesis tend to become unstable.
上記マグネシウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。 The magnesium salt is not particularly limited as long as it does not inhibit the action of the present invention. For example, magnesium acetate, magnesium sulfate, magnesium chloride, magnesium citrate, magnesium hydrogen phosphate, magnesium iodide, magnesium lactate, It can be used in a general form such as magnesium nitrate and magnesium oxalate, and it is preferable to use magnesium acetate. Magnesium salts also act as cofactors in protein synthesis reactions.
当該抽出液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。 Although there is no restriction | limiting in particular in content of the magnesium salt in the said extract, From a viewpoint of storage stability, when it is a bivalent salt, such as magnesium acetate, it is preferable that 0.1-10 mM is contained, for example. More preferably, 5 mM to 5 mM is contained. This is because if the magnesium salt is less than 0.1 mM or exceeds 10 mM, components essential for protein synthesis tend to become unstable.
上記ジチオトレイトール（以下、「ＤＴＴ」ということがある。）は、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該抽出液中において０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。 The dithiothreitol (hereinafter sometimes referred to as “DTT”) is blended for the purpose of preventing oxidation, and is preferably contained in the extract at a concentration of 0.1 mM to 10 mM, preferably 0.5 mM. More preferably, it is contained at -5 mM. This is because when DTT is less than 0.1 mM or more than 10 mM, components essential for protein synthesis tend to become unstable.
上記緩衝剤は、抽出液に緩衝能を付与し、たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こる抽出液のｐＨの急激な変化による抽出物の変性を防止する目的で配合される。このような緩衝剤としては、特に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳなどを使用することができる。
緩衝剤は、当該抽出液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６．５〜８．５に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出液のｐＨが４未満またはｐＨが１０を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を使用するのが特に好ましい。
The buffering agent is blended for the purpose of imparting buffering capacity to the extract and preventing the denaturation of the extract due to a rapid change in the pH of the extract caused by, for example, addition of an acidic or basic substance. Such a buffer is not particularly limited, and for example, HEPES-KOH, Tris-HCl, acetic acid-sodium acetate, citric acid-sodium citrate, phosphoric acid, boric acid, MES, PIPES, etc. may be used. it can.
It is preferable to use a buffering agent whose pH of the extract is maintained at 4 to 10, and more preferably a buffering agent whose pH is maintained at 6.5 to 8.5. . This is because if the pH of the extract is less than 4 or exceeds 10, the components essential for the reaction of the present invention may be denatured. From such a viewpoint, it is particularly preferable to use HEPES-KOH (pH 6.5 to 8.5) among the above.
当該抽出液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が５ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こし、抽出物が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤が２００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。 Although there is no restriction | limiting in particular in content of the buffer in the said extract, From a viewpoint of hold | maintaining suitable buffer capacity, it is preferable to contain 5 mM-200 mM, and it is more preferable that 10 mM-100 mM are contained. This is because when the buffer is less than 5 mM, the pH tends to fluctuate due to the addition of an acidic or basic substance, and the extract tends to denature. When the buffer exceeds 200 mM, the salt concentration increases. This is because the components essential for protein synthesis tend to become unstable.
また、上記組成に加えて、塩化カルシウムおよびグリセロールをさらに含有してなる抽出用液を用いると、タンパク質合成能がより向上された昆虫細胞抽出液を得ることができるため好ましい。
この場合、塩化カルシウムの含有量は特に制限されないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、０．１ｍＭ〜１０ｍＭであるのが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭであるのがより好ましい。また、グリセロールの添加量についても特に制限されるものではないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、５（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのが好ましく、１０（ｖ／ｖ）％〜５０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのがより好ましい。
Moreover, it is preferable to use an extraction solution further containing calcium chloride and glycerol in addition to the above composition because an insect cell extract with improved protein synthesis ability can be obtained.
In this case, the content of calcium chloride is not particularly limited, but it is preferably 0.1 mM to 10 mM, and preferably 0.5 mM to 5 mM, from the viewpoint of effectively exhibiting the effect of improving the protein synthesis ability. Is more preferable. Also, the amount of glycerol added is not particularly limited, but from the viewpoint of effectively exhibiting the effect of improving the protein synthesis ability, it is 5 (v / v)% to 80 (v / v)%. It is preferable to add so that it may become, and it is more preferable to add so that it may become 10 (v / v)%-50 (v / v)%.
本発明の昆虫細胞抽出液の調製方法において、細胞破砕後から、無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液を得るまでの手順等については特に制限されるものではない。図１は、本発明の好ましい調製方法１〜３を簡略化して示すフローチャートである。図１に示す各調製方法１〜３においては、上述したように急激な凍結後、解凍して遠心分離を行う方法によって細胞破砕を行う例を示している。
図１に示すように、本発明の調製方法においては、細胞破砕後、上記遠心分離後の上清（上清１Ａ）をそのまま抽出液としてもよいし、また上清１Ａをさらに遠心分離（１０，０００×ｇ〜１００，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜１２０分間）にかけて、得られた上清（上清１Ｂ）を抽出液（上清１）としてもよい（以下「調製方法１」と呼ぶ）。さらに、上記上清１（上清１Ａまたは１Ｂ）をゲル濾過し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分（吸収の大きな画分）を分取して、これを抽出液としてもよい（以下「調製方法２」と呼ぶ）。この場合、具体的には以下の手順にて行う。
In the method for preparing an insect cell extract of the present invention, there are no particular limitations on the procedure after cell disruption until obtaining an insect cell extract for cell-free protein synthesis. FIG. 1 is a simplified flowchart showing
As shown in FIG. 1, in the preparation method of the present invention, after the cell disruption, the supernatant after centrifugation (supernatant 1A) may be used as an extract as it is, or the supernatant 1A is further centrifuged (10 The resulting supernatant (supernatant 1B) may be used as an extract (supernatant 1) (hereinafter “preparation”). Called
まず、上清１Ａまたは上清１Ｂについてゲル濾過を行うが、ゲル濾過は、たとえば脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）を好適に使用することができ、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記ゲル濾過用緩衝液にて溶出する、というような条件にて行えばよい。上記ゲル濾過用緩衝液としては、従来公知の適宜の組成のものを特に制限なく使用することができ、たとえば、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）、５０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦを含有するゲル濾過用緩衝液を用いることができる。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。
続いて、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャム バイオサイエンス社製）などの機器を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分（吸収の大きな画分）をゲル濾過後の濾液より分取して、これを抽出液とする。
First, the supernatant 1A or the supernatant 1B is subjected to gel filtration. For the gel filtration, for example, a desalting column PD-10 (manufactured by Amersham Biosciences) can be suitably used. After equilibrating the column with the buffer solution, the sample may be supplied and eluted with the gel filtration buffer solution. As the buffer solution for gel filtration, a conventionally known appropriate composition can be used without particular limitation. For example, 10 mM to 100 mM HEPES-KOH (pH 6.5 to 8.5), 50 mM to 300 mM. A gel filtration buffer containing potassium acetate, 0.5 mM to 5 mM magnesium acetate, 0.5 mM to 5 mM DTT, 0.01 mM to 5 mM PMSF can be used. The filtrate obtained by gel filtration should be 0.1 mL to 1 mL as one fraction, as is done by normal gel filtration, and efficiently fractions having a high protein synthesis ability. From a viewpoint, it is preferable to make 0.4 mL-0.6 mL into 1 fraction.
Subsequently, using a device such as Ultraspec 3300pro (manufactured by Amersham Biosciences), a fraction having a absorbance of 30 or more at 280 nm (a fraction with high absorption) is fractionated from the filtrate after gel filtration and extracted. Use liquid.
また上記調製方法２で得られた吸収の大きな画分を、さらに遠心分離にかけて、得られた上清（上清２）を抽出液とするようにしてもよい（以下、「調製方法３」と呼ぶ）。このゲル濾過後の遠心分離は、翻訳反応を阻害する不溶性の成分を除去するという理由から、３０，０００×ｇ〜１００，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間の条件で行うのが、好ましい。
Further, the fraction having a large absorption obtained by the
なお、本発明の調製方法に供する昆虫細胞は、培養に用いる培地の翻訳反応液への持込みを避けるため、上記急激な凍結を行う前に、プロテアーゼインヒビターおよびグリセロールを含有しない以外は、上述した昆虫細胞用の好適な抽出用液と同じ組成の洗浄液にて予め洗浄しておくのが好ましい。洗浄液での洗浄は、昆虫細胞に洗浄液を添加し、これを遠心分離（たとえば、７００×ｇ、１０分間、４℃という条件）することによって行う。洗浄に用いる洗浄液の量は、培地を完全に洗い流すという理由から、湿重量１ｇの昆虫細胞に対し５ｍＬ〜１００ｍＬであるのが好ましく、１０ｍＬ〜５０ｍＬであるのがより好ましい。洗浄回数は、１回〜５回行うのが好ましく、２回〜４回行うのがより好ましい。 In addition, in order to avoid bringing the culture medium used for culture into the translation reaction solution, the insect cells used in the preparation method of the present invention are the insects described above except that they do not contain a protease inhibitor and glycerol before the rapid freezing. It is preferable to wash in advance with a washing solution having the same composition as the suitable extraction solution for cells. Washing with a washing solution is performed by adding a washing solution to insect cells and centrifuging (for example, 700 × g, 10 minutes, 4 ° C.). The amount of the washing solution used for washing is preferably 5 mL to 100 mL, more preferably 10 mL to 50 mL with respect to insect cells having a wet weight of 1 g because the medium is completely washed away. The number of washings is preferably 1 to 5 times, more preferably 2 to 4 times.
また本発明の調製方法に供する昆虫細胞の量は、特に制限されるものではないが、抽出効率を最適に保つため、抽出液１ｍＬに対して０．１ｇ〜５ｇであるのが好ましく、０．５ｇ〜２ｇであるのがより好ましい。 The amount of insect cells to be subjected to the preparation method of the present invention is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 5 g per 1 mL of the extract in order to keep the extraction efficiency optimal. It is more preferable that it is 5g-2g.
本発明の方法にて調製された無細胞系タンパク質合成用の昆虫細胞抽出液は、昆虫細胞由来の抽出物をタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ含有することが好ましく、１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ含有することがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ未満であると、本発明の作用に必須な成分の濃度が低くなり、充分な合成反応が行えなくなる虞があるためであり、また当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で２００ｍｇ／ｍＬを越えると、抽出液自体が高い粘性を有し、操作しづらい虞があるためである。
該抽出液中の昆虫細胞由来の抽出物の含有量は、タンパク質濃度を測定することで決定され、たとえば、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、タンパク質濃度を測定することによって決定される。具体的には、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用し、検量線を作成する。このような手法により測定することができる。
The insect cell extract for cell-free protein synthesis prepared by the method of the present invention preferably contains an extract derived from insect cells in a protein concentration of 1 mg / mL to 200 mg / mL, 10 mg / mL to 100 mg. / ML is more preferable. This is because if the content of the extract is less than 1 mg / mL in terms of protein concentration, the concentration of components essential for the action of the present invention will be low, and a sufficient synthesis reaction may not be possible. This is because the extract itself has a high viscosity and may be difficult to operate when the content of the protein exceeds 200 mg / mL in protein concentration.
The content of the insect cell-derived extract in the extract is determined by measuring the protein concentration, for example, by measuring the protein concentration using BCA Protein assay Kit (manufactured by PIERCE). The Specifically, 0.1 mL of a sample is added to 2 mL of the reaction reagent, reacted at 37 ° C. for 30 minutes, and the absorbance at 562 nm is measured using a spectrophotometer (Ultraspec 3300pro, manufactured by Amersham Biosciences). As a control, bovine serum albumin (BSA) is usually used and a calibration curve is prepared. It can be measured by such a method.
また抽出液中に含有される抽出物が昆虫細胞由来のものであるか否かは、たとえば、抽出液中のリボソームＲＮＡの塩基配列解析を行うことによって判別することができる。 Whether or not the extract contained in the extract is derived from insect cells can be determined, for example, by performing a base sequence analysis of ribosomal RNA in the extract.
本発明の抽出液は、昆虫細胞由来の抽出物をタンパク質濃度で１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ含有するとともに、５０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を含有するように実現されるのが好ましい。 The extract of the present invention contains an extract derived from insect cells at a protein concentration of 10 mg / mL to 100 mg / mL, 50 mM to 300 mM potassium acetate, 0.5 mM to 5 mM magnesium acetate, 0.5 mM to 5 mM. It is preferably realized to contain DTT, 0.01 mM to 5 mM PMSF, 10 mM to 100 mM HEPES-KOH (pH 6.5 to 8.5).
本発明の昆虫細胞抽出液は、無細胞系タンパク質合成に供する前に、ヌクレアーゼ処理を施されたものであることが好ましい。ヌクレアーゼ処理の施された昆虫細胞抽出液を無細胞系タンパク質合成に供することで、ヌクレアーゼ処理を施さなかった昆虫細胞抽出液を用いた場合と比較して、より多くの量の目的タンパク質を合成することができる。これは、以下のような理由による。
無細胞系において目的タンパク質を合成する際、細胞抽出液由来の内在性ｍＲＮＡが含まれると、この内在性ｍＲＮＡがコードするタンパク質も合成されてしまう。たとえば、無細胞系において目的タンパク質を標識したいときに、この内在性ｍＲＮＡより合成されたタンパク質についても同時に標識されてしまい、その後の目的タンパク質の解析に支障をきたすことがある。また内在性ｍＲＮＡ存在下では目的のタンパク質の合成量も低下してしまう可能性が高い。よって、無細胞系タンパク質合成に用いられる細胞抽出液中には内在性ｍＲＮＡは含まれないことが望ましい。
The insect cell extract of the present invention is preferably subjected to nuclease treatment before being subjected to cell-free protein synthesis. By using the nuclease-treated insect cell extract for cell-free protein synthesis, a larger amount of target protein is synthesized compared to the case of using the nuclease-treated insect cell extract. be able to. This is due to the following reasons.
When a target protein is synthesized in a cell-free system, if an endogenous mRNA derived from a cell extract is contained, a protein encoded by the endogenous mRNA is also synthesized. For example, when it is desired to label a target protein in a cell-free system, the protein synthesized from this endogenous mRNA is also labeled at the same time, which may hinder subsequent analysis of the target protein. In addition, in the presence of endogenous mRNA, the synthesis amount of the target protein is also likely to decrease. Therefore, it is desirable that endogenous mRNA is not contained in the cell extract used for cell-free protein synthesis.
ヌクレアーゼ処理は、従来公知の適宜の手法を特に制限なく用いることができるが、内在性のＲＮＡの中で、ｍＲＮＡのみに対し選択的に消化を行うことから、ｍＲＮＡをカルシウム存在下で選択的に分解するミクロコッカルヌクレアーゼを用いて昆虫細胞抽出液を処理することが好ましい。
具体的には、昆虫細胞抽出液に、ミクロコッカルヌクレアーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）及び塩化カルシウムを添加し、１５℃〜２５℃で５分間〜６０分間反応させる。ミクロコッカルヌクレアーゼは、翻訳反応開始後に外来ｍＲＮＡを分解または抽出液中のタンパク質合成に必須な成分を分解する虞があるため、終濃度が１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬとなるように添加するのが好ましく、３０μｇ／ｍＬ〜６０μｇ／ｍＬとなるように添加するのがより好ましい。また塩化カルシウムはカルシウムがミクロコッカルヌクレアーゼの活性化に必須であるが、翻訳反応を阻害する虞があるため、終濃度が０．０５ｍＭ〜５０ｍＭとなるように添加するのが好ましく、０．１ｍＭ〜１ｍＭとなるように添加するのがより好ましい。上記反応後、ミクロコッカルヌクレアーゼがカルシウム依存性であるため、カルシウムイオンをキレートし、ミクロコッカルヌクレアーゼを失活させることを目的として、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（以下、「ＥＧＴＡ」ということがある。）を添加する。ＥＧＴＡは、カルシウムイオンを充分にキレートできるように、終濃度が０．１ｍＭ〜１００ｍＭとなるように添加するのが好ましく、１ｍＭ〜２０ｍＭとなるように添加するのがより好ましい。
The nuclease treatment can be performed using any conventionally known appropriate method without any particular limitation. However, since endogenous RNA is selectively digested with respect to only mRNA, the mRNA is selectively selected in the presence of calcium. It is preferred to treat the insect cell extract with a micrococcal nuclease that degrades.
Specifically, micrococcal nuclease (manufactured by Roche Diagnostics) and calcium chloride are added to the insect cell extract and allowed to react at 15 to 25 ° C. for 5 to 60 minutes. Micrococcal nuclease may be added so that the final concentration is 10 μg / mL to 100 μg / mL because there is a risk of decomposing foreign mRNA or degrading components essential for protein synthesis in the extract after the start of the translation reaction. Is preferable, and it is more preferable to add so that it may be set to 30 μg / mL to 60 μg / mL. Calcium chloride is essential for the activation of micrococcal nuclease, but since there is a possibility of inhibiting the translation reaction, it is preferably added so that the final concentration is 0.05 mM to 50 mM, 0.1 mM. It is more preferable to add so as to be ˜1 mM. After the reaction, since micrococcal nuclease is calcium-dependent, for the purpose of chelating calcium ions and inactivating micrococcal nuclease, ethylene glycol bis (2-aminoethyl ether) tetraacetic acid (hereinafter, "EGTA") is added. EGTA is preferably added so as to have a final concentration of 0.1 mM to 100 mM, more preferably 1 mM to 20 mM, so that calcium ions can be sufficiently chelated.
本発明はまた、上記抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供するものである。かかる合成反応においては、通常、上記抽出液に無細胞系でのタンパク質合成に要する添加物を添加した反応液として調製する。上記添加物に特に制限はなく、無細胞系のタンパク質合成の分野において従来より一般に使用されているものであれば特に制限はない。
なお上記反応液は、本発明の抽出液が１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有されるように調製されるのが好ましい。
すなわち、上記反応液の全体において、昆虫細胞由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを越えると、目的のタンパク質の合成速度が低下する虞があるためである。
The present invention also provides a cell-free protein synthesis method using the above extract. In such a synthesis reaction, it is usually prepared as a reaction solution in which additives necessary for protein synthesis in a cell-free system are added to the above extract. The additive is not particularly limited, and is not particularly limited as long as it is conventionally used in the field of cell-free protein synthesis.
Note that the reaction solution contains 10 (v / v)% to 80 (v / v)%, particularly 30 (v / v)% to 60 (v / v)% of the extract of the present invention. Preferably it is prepared.
That is, it is preferable that the content of the insect cell-derived extract is preferably 0.1 mg / mL to 160 mg / mL in terms of protein concentration in the whole reaction solution. 3 mg / mL to 60 mg / mL It is more preferable to prepare so that. This is because if the content of the extract is less than 0.1 mg / mL or exceeds 160 mg / mL in terms of protein concentration, the synthesis rate of the target protein may decrease.
通常、上記反応液としては、上記抽出液を除く成分として、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、外来ｍＲＮＡ、緩衝剤を少なくとも含有するものを用いる。これにより、短時間で大量のタンパク質の合成が可能であるというような利点をさらに有する無細胞系タンパク質合成用の反応液を実現できる。 Usually, as the reaction solution, as components other than the extract solution, potassium salt, magnesium salt, DTT, adenosine triphosphate, guanosine triphosphate, creatine phosphate, creatine kinase, amino acid component, RNase inhibitor, tRNA, foreign Those containing at least mRNA and a buffer are used. Thereby, it is possible to realize a reaction solution for cell-free protein synthesis that further has an advantage that a large amount of protein can be synthesized in a short time.
当該反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。 As the potassium salt in the reaction solution, various potassium salts described above as a component of the extraction solution, preferably potassium acetate, can be preferably used. The potassium salt is preferably contained in the reaction solution in an amount of 10 mM to 500 mM, more preferably 50 mM to 150 mM, from the same viewpoint as in the case of the potassium salt in the extraction solution described above.
当該反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。 As the magnesium salt in the reaction solution, various magnesium salts described above as a component of the extraction solution, preferably magnesium acetate, can be preferably used. The magnesium salt is preferably contained in the reaction solution in an amount of 0.1 mM to 10 mM, more preferably 0.5 mM to 3 mM, from the same viewpoint as in the case of the magnesium salt in the above-described extract.
当該反応液中におけるＤＴＴは、上述した抽出用液におけるＤＴＴの場合と同様の観点から、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。 The DTT in the reaction solution is preferably contained in a concentration of 0.1 mM to 10 mM, more preferably 0.2 mM to 5 mM, from the same viewpoint as in the case of the DTT in the extraction solution described above.
当該反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。 Adenosine triphosphate (hereinafter sometimes referred to as “ATP”) in the reaction solution is preferably contained in an amount of 0.01 mM to 10 mM in the reaction solution from the viewpoint of the rate of protein synthesis. It is more preferable to contain 1 mM-5 mM. This is because if ATP is less than 0.01 mM or exceeds 10 mM, the protein synthesis rate tends to decrease.
当該反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。 From the viewpoint of the rate of protein synthesis, guanosine triphosphate (hereinafter sometimes referred to as “GTP”) in the reaction solution is preferably contained in an amount of 0.01 mM to 10 mM. More preferably, it is contained in a concentration of 05 mM to 5 mM. This is because if GTP is less than 0.01 mM or exceeds 10 mM, the rate of protein synthesis tends to decrease.
当該反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。 Creatine phosphate in the reaction solution is a component for continuously synthesizing proteins, and is blended for the purpose of regenerating ATP and GTP. From the viewpoint of protein synthesis rate, creatine phosphate is preferably contained in the reaction solution in an amount of 1 mM to 200 mM, more preferably 10 mM to 100 mM. This is because if creatine phosphate is less than 1 mM, sufficient amounts of ATP and GTP are difficult to regenerate, resulting in a tendency for the protein synthesis rate to decrease, and if creatine phosphate exceeds 200 mM, an inhibitory substance This is because the protein synthesis rate tends to decrease.
当該反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。 Creatine kinase in the reaction solution is a component for continuously synthesizing proteins, and is formulated for the purpose of regenerating ATP and GTP together with creatine phosphate. From the viewpoint of protein synthesis rate, creatine kinase is preferably contained in the reaction solution in an amount of 1 μg / mL to 1000 μg / mL, and more preferably 10 μg / mL to 500 μg / mL. This is because when creatine kinase is less than 1 μg / mL, sufficient amounts of ATP and GTP are difficult to be regenerated, and as a result, the protein synthesis rate tends to decrease. When creatine kinase exceeds 1000 μg / mL, This is because it acts as an inhibitor and tends to decrease the rate of protein synthesis.
当該反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
The amino acid component in the reaction solution includes 20 types of amino acids, namely valine, methionine, glutamic acid, alanine, leucine, phenylalanine, glycine, proline, isoleucine, tryptophan, asparagine, serine, threonine, histidine, aspartic acid, tyrosine, lysine. , Glutamine, cystine and arginine at least. This amino acid also includes radioisotope labeled amino acids. Furthermore, you may contain the modified amino acid as needed. The amino acid component usually contains approximately equal amounts of each type of amino acid.
In the present invention, from the viewpoint of protein synthesis speed, the amino acid component is preferably contained in the reaction solution in an amount of 1 μM to 1000 μM, more preferably 10 μM to 200 μM. This is because if the amino acid component is less than 1 μM or exceeds 1000 μM, the protein synthesis rate tends to decrease.
当該反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在する昆虫細胞由来のＲＮａｓｅによって、本発明の無細胞系タンパク質合成の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。 The RNase inhibitor in the reaction solution prevents the synthesis of the protein by undesirably digesting mRNA and tRNA during the cell-free protein synthesis of the present invention by the insect cell-derived RNase mixed in the extract. It is blended for the purpose of preventing, and is preferably contained in the reaction solution in an amount of 0.1 U / μL to 100 U / μL, and more preferably 1 U / μL to 10 U / μL. If the RNase inhibitor is less than 0.1 U / μL, the degradation activity of RNase tends not to be sufficiently suppressed. If the RNase inhibitor exceeds 100 U / μL, the protein synthesis reaction tends to be inhibited. Because.
当該反応液中における外来ｍＲＮＡにおいては、昆虫細胞に由来しないｍＲＮＡであるならば、コードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、毒性を有するタンパク質をコードするものであってもよいし、また糖タンパク質をコードするものであってもよい。反応液に含有されるｍＲＮＡが外来ｍＲＮＡであるか昆虫細胞に由来するｍＲＮＡであるかは、まず、抽出液中より、ｍＲＮＡを単離精製後、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、既知の外来ｍＲＮＡの塩基配列と比較することで判別することができる。 As long as the foreign mRNA in the reaction solution is mRNA not derived from insect cells, the encoding protein (including peptide) is not particularly limited, and may encode a toxic protein, It may also encode a glycoprotein. Whether mRNA contained in the reaction solution is foreign mRNA or insect cell-derived mRNA was obtained by first isolating and purifying mRNA from the extract, and then synthesizing cDNA with reverse transcriptase. It can be discriminated by analyzing the base sequence of cDNA and comparing it with the base sequence of a known foreign mRNA.
なお用いる外来ｍＲＮＡは、塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならば外来ｍＲＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各外来ｍＲＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。
本発明に用いる外来ｍＲＮＡは、市販のものでもよいし、目的とするタンパク質のＯＲＦ（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を市販のベクター、たとえば、ｐＴＮＴ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）の５’−βグロビンリーダー配列の下流に挿入し、これを用いて転写反応で得られたｍＲＮＡを用いても構わない。また、転写反応の際にメチル化されたリボヌクレオチドなどを加えることにより付加されたキャップ構造を有する外来ｍＲＮＡを用いてもよい。
The foreign mRNA to be used is not particularly limited in the number of bases, and all foreign mRNAs may not have the same number of bases as long as the target protein can be synthesized. In addition, each foreign mRNA may have a plurality of bases deleted, substituted, inserted, or added as long as the sequences are homologous enough to synthesize the target protein.
The foreign mRNA used in the present invention may be a commercially available one, or a 5′-β globin leader sequence of a target vector ORF (Open reading frame) of a commercially available vector, for example, pT N T Vector (manufactured by Promega). Alternatively, mRNA obtained by transcription reaction using this can be used. Moreover, you may use the foreign mRNA which has the cap structure added by adding the methylated ribonucleotide etc. in the case of transcription | transfer reaction.
当該反応液中において、外来ｍＲＮＡは、タンパク質合成の速度の観点から、５μｇ／ｍＬ〜２０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、２０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。外来ｍＲＮＡが５μｇ／ｍＬ未満または２０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。 In the reaction solution, the foreign mRNA is preferably contained at 5 μg / mL to 2000 μg / mL, more preferably 20 μg / mL to 1000 μg / mL, from the viewpoint of the rate of protein synthesis. This is because when the exogenous mRNA is less than 5 μg / mL or exceeds 2000 μg / mL, the rate of protein synthesis tends to decrease.
当該反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。 The tRNA in the reaction solution contains approximately equal amounts of the tRNA types corresponding to the 20 amino acids. In the present invention, from the viewpoint of the rate of protein synthesis, the reaction solution preferably contains 1 μg / mL to 1000 μg / mL, more preferably 10 μg / mL to 500 μg / mL. This is because if the tRNA is less than 1 μg / mL or exceeds 1000 μg / mL, the rate of protein synthesis tends to decrease.
反応液に含有される緩衝剤としては、上述した本発明の抽出液と同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出液における緩衝剤の場合と同様の観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。 As the buffer contained in the reaction solution, those similar to the above-described extract of the present invention can be suitably used. For the same reason, HEPES-KOH (pH 6.5 to 8.5) is used. preferable. Moreover, it is preferable that 5 to 200 mM is contained, and it is more preferable that 10 to 50 mM is contained for a buffering agent from the viewpoint similar to the case of the buffering agent in the extract mentioned above.
また上記反応液は、ＥＧＴＡを含有するのが好ましい。ＥＧＴＡを含有すると、ＥＧＴＡが抽出液中の金属イオンとキレートを形成することでリボヌクレアーゼ、プロテアーゼ等が不活化することにより、本発明のタンパク質合成に必須な成分の分解を阻害することができるためである。また上記のように抽出液にヌクレアーゼ処理を施した場合であっても、反応液がＥＧＴＡを含有することにより、ヌクレアーゼが無細胞系タンパク質合成に悪影響を及ぼすことを確実に防止することができる。該ＥＧＴＡは、上記反応液中において、上記分解阻害能を好適に発揮し得る観点から０．０１ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることがより好ましい。ＥＧＴＡが０．０１ｍＭ未満であると必須な成分の分解活性を充分に抑えることができない傾向にあるためであり、また、５０ｍＭを越えるとタンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。 Moreover, it is preferable that the said reaction liquid contains EGTA. When EGTA is contained, EGTA can form a chelate with a metal ion in the extract to inactivate ribonuclease, protease, etc., thereby inhibiting degradation of components essential for protein synthesis of the present invention. is there. Even when the nuclease treatment is performed on the extract as described above, the reaction solution containing EGTA can surely prevent the nuclease from adversely affecting the cell-free protein synthesis. The EGTA is preferably contained in the reaction solution in an amount of 0.01 mM to 50 mM, more preferably 0.1 mM to 10 mM, from the viewpoint of suitably exhibiting the above-described degradation inhibitory ability. This is because if EGTA is less than 0.01 mM, the degradation activity of essential components tends not to be sufficiently suppressed, and if it exceeds 50 mM, the protein synthesis reaction tends to be inhibited.
すなわち、本発明の無細胞系タンパク質合成方法に用いる反応液は、上記抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．０５ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜２００μＭのアミノ酸成分、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、２０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を含有するように実現されるのが好ましい。また、上記に加えてさらに０．１ｍＭ〜１０ｍＭのＥＧＴＡを含有するように実現されるのがより好ましい。 That is, the reaction solution used in the cell-free protein synthesis method of the present invention contains 30 (v / v)% to 60 (v / v)% of the above extract, 50 mM to 150 mM potassium acetate, 0.5 mM. ˜3 mM magnesium acetate, 0.2 mM to 5 mM DTT, 0.1 mM to 5 mM ATP, 0.05 mM to 5 mM GTP, 10 mM to 100 mM creatine phosphate, 10 μg / mL to 500 μg / mL creatine kinase, 10 μM ~ 200 μM amino acid component, 1 U / μL to 10 U / μL RNase inhibitor, 10 μg / mL to 500 μg / mL tRNA, 20 μg / mL to 1000 μg / mL foreign mRNA, 10 mM to 50 mM HEPES-KOH (pH 6.5) 8.5) is preferably realized. In addition to the above, it is more preferable that 0.1 to 10 mM EGTA is contained.
本発明の無細胞系タンパク質合成方法は、上記のような本発明の抽出液を用いて、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。反応に際しては、通常、上記抽出液を含有する反応液を調製して、これを用いて行う。 The cell-free protein synthesis method of the present invention is performed in a conventionally known low temperature thermostat using the extract of the present invention as described above. In the reaction, a reaction solution containing the above extract is usually prepared and used.
また反応温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは１５℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を越えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。
反応の時間は、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
Moreover, reaction temperature is 10 to 40 degreeC normally, Preferably it exists in the range of 15 to 30 degreeC. This is because if the reaction temperature is less than 10 ° C., the protein synthesis rate tends to decrease, and if the reaction temperature exceeds 40 ° C., essential components tend to denature.
The reaction time is usually 1 hour to 72 hours, preferably 3 hours to 24 hours.
本発明の無細胞系タンパク質合成方法にて合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。 The amount of protein synthesized by the cell-free protein synthesis method of the present invention can be measured by measuring enzyme activity, SDS-PAGE, immunoassay, and the like.
本発明の無細胞系のタンパク質合成方法にて合成できるタンパク質に特に制限はない。 The protein that can be synthesized by the cell-free protein synthesis method of the present invention is not particularly limited.
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
参考例１
：昆虫細胞の培養
細胞数２．１×１０７個の昆虫細胞Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、Ｌ−グルタミンを添加したＥｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を入れた培養フラスコ（６００ｃｍ２）内で２７℃で６日間培養した。結果、細胞数１．０×１０８個、湿重量１．２１ｇとなった。
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
Reference example 1
: Number of cultured cells of insect cells 2.1 × 10 7 Insect cells High Five (manufactured by Invitrogen), culture flask (600 cm 2 ) containing Express Five serum-free medium (manufactured by Invitrogen) supplemented with L-glutamine ) And cultured at 27 ° C. for 6 days. As a result, the number of cells was 1.0 × 10 8 and the wet weight was 1.21 g.
実施例１
：昆虫細胞抽出液の調製
まず、上記参考例１で培養した昆虫細胞を集菌し、下記組成の抽出用液で３回洗浄（７００×ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心分離）した後、１ｍＬの抽出用液中に懸濁した。
〔抽出用液の組成〕
・６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・２００ｍＭ 酢酸カリウム
・４ｍＭ 酢酸マグネシウム
・４ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
この懸濁液を液体窒素中にて急速（１０秒以内）に凍結させた。充分に凍結させた後、約１０℃の水浴中で解凍した。完全に解凍した後、１５０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）し、上清を回収した。回収した上清１．５ｍＬを下記組成のゲル濾過用緩衝液で平衡化したＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャム バイオサイエンス社製）にアプライした。
〔ゲル濾過用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
アプライした後、ゲル濾過用緩衝液４ｍＬにて溶出し、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分を回収した。回収した濾液をさらに４５，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、その上清を昆虫細胞抽出液とした。
Example 1
: Preparation of insect cell extract First, insect cells cultured in Reference Example 1 were collected and washed three times with an extraction solution having the following composition (centrifuged at 700 × g, 4 ° C. for 10 minutes). Thereafter, it was suspended in 1 mL of the extraction solution.
[Composition of extraction liquid]
・ 60 mM HEPES-KOH (pH 7.9)
・ 200 mM potassium acetate ・ 4 mM magnesium acetate ・ 4 mM DTT
・ 0.5 mM PMSF
This suspension was frozen rapidly (within 10 seconds) in liquid nitrogen. After sufficiently freezing, it was thawed in a water bath at about 10 ° C. After thawing completely, the mixture was centrifuged at 15000 × g and 4 ° C. for 15 minutes (himacCR20B3, manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd.), and the supernatant was collected. The collected supernatant (1.5 mL) was applied to a PD-10 desalting column (Amersham Biosciences) equilibrated with a gel filtration buffer having the following composition.
[Composition of buffer solution for gel filtration]
・ 40 mM HEPES-KOH (pH 7.9)
・ 100 mM potassium acetate ・ 2 mM magnesium acetate ・ 1 mM DTT
・ 0.5 mM PMSF
After the application, elution was performed with 4 mL of gel filtration buffer, and fractions having an absorbance at 280 nm of 30 or more were collected using a spectrophotometer (Ultraspec 3300pro, manufactured by Amersham Biosciences). The collected filtrate was further centrifuged at 45,000 × g for 30 minutes at 4 ° C., and the supernatant was used as an insect cell extract.
参考例２
：外来ｍＲＮＡの作製
（１）ベクターＤＮＡの構築
ｐＧＥＭ−ｌｕｃ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）５ｎｇを鋳型とし、配列表配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ）と、配列表配列番号２に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ）と、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９７℃１５秒、５５℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行った。エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を精製した後、ＫｐｎＩで消化した。
これとは別に、ｐＴＮＴ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）をＫｐｎＩで消化した。これらの反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いてＤＮＡ断片を精製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて、これらのＤＮＡ断片をライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５α（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換した大腸菌からアルカリ−ＳＤＳ法により調製したプラスミドＤＮＡを、配列表配列番号３に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）およびＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｃｉｎｇ ＦＳ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてシークエンシング反応（９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分、３０サイクル）を行った。この反応液をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、塩基配列解析を行った。ｐＴＮＴ Ｖｅｃｔｏｒ由来の５’−βグロビンリーダー配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子の開始コドンが挿入されたプラスミドをｐＴＮＴ−Ｌｕｃと命名した。
Reference example 2
: Preparation of exogenous mRNA (1) Construction of vector DNA Primer (Luc T7-F3-Kpn) having 5 ng of pGEM-luc Vector (manufactured by Promega) and having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 Using a primer (Luc T7-R4-Kpn) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and KOD plus (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), 97 ° C. for 15 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 120 seconds, 30 cycles PCR was performed. The DNA fragment was purified by ethanol precipitation and then digested with KpnI.
Separately, pT N T Vector (Promega) was digested with KpnI. These reaction solutions were separated by agarose gel electrophoresis, and then DNA fragments were purified using Gen Elute Gel Purification Kit (manufactured by Sigma). These DNA fragments were ligated using Ligation High (Toyobo Co., Ltd.), and then transformed into E. coli DH5α (Toyobo Co., Ltd.). Plasmid DNA prepared from transformed E. coli by alkaline-SDS method was sequenced using a primer (T7 promoter) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing and Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS (Applied Biosystems). Singing reaction (96 ° C. for 10 seconds, 50 ° C. for 5 seconds, 60 ° C. for 4 minutes, 30 cycles) was performed. This reaction solution was subjected to ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), and base sequence analysis was performed. The plasmid in which the start codon of the luciferase gene was inserted downstream of the 5′-β globin leader sequence derived from pT N T Vector was named pT N T-Luc.
（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応
上記（１）で作製したｐＴＮＴ−ＬｕｃをＢａｍＨＩで消化した後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。これを鋳型とし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を行った。転写反応液としては、以下の組成のものを用いた。
〔転写反応液の組成〕
・８０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・２４ｍＭ 酢酸マグネシウム
・４０ｍＭ ＤＴＴ
・７．５ｍＭ ＮＴＰｓ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ）
・２ｍＭ スペルミジン
・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・１Ｕ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
・５０μｇ／ｍＬ ｐＴＮＴ−Ｌｕｃ／ＢａｍＨＩ
ＮＴＰｓ（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ（プロメガ社製）をそれぞれ用いた。反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。転写反応は３７℃、４時間で行い、反応液量は２０μＬとした。
(2) After the pT N T-Luc produced in in vitro transcription reaction above (1) was digested with BamHI, phenol - chloroform extraction, and purified by ethanol precipitation. Using this as a template, an in vitro transcription reaction was performed. As a transcription reaction solution, one having the following composition was used.
[Composition of transcription reaction solution]
・ 80 mM HEPES-KOH (pH 7.4)
・ 24 mM magnesium acetate ・ 40 mM DTT
・ 7.5 mM NTPs (ATP, GTP, UTP, CTP)
・ 2 mM spermidine ・ 1 U / μL RNase inhibitor (derived from human placenta)
1 U / μL T7 RNA polymerase 50 μg / mL pT N T-Luc / BamHI
NTPs (manufactured by Sigma), RNase inhibitor (manufactured by Takara Shuzo), and T7 RNA polymerase (manufactured by Promega) were used. A low temperature aluminum block thermostatic chamber MG-1000 (manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) was used as a reaction apparatus. The transcription reaction was performed at 37 ° C. for 4 hours, and the reaction volume was 20 μL.
（３）外来ｍＲＮＡの精製
転写反応終了後、上記（２）の反応液２０μＬに１ＵのＲＱ１ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を添加し、３７℃、１５分間インキュベートし、鋳型ＤＮＡを消化した。フェノール−クロロホルム抽出によりタンパク質を除去した後、酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１００μＬの滅菌水に溶解し、Ｎｉｃｋ Ｃｏｌｕｍｎ（アマシャム バイオサイエンス社製）にアプライした。滅菌水４００μＬで溶出を行った。溶出画分を回収し、酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。合成された外来ｍＲＮＡの定量は、２６０ｎｍの吸光度を測定して行った。その結果、２０μＬスケールの反応で約６０μｇの外来ｍＲＮＡが合成された。
(3) Purification of foreign mRNA After completion of the transcription reaction, 1 U of RQ1 RNase free DNase (manufactured by Promega) was added to 20 μL of the reaction solution of (2) above, and incubated at 37 ° C. for 15 minutes to digest the template DNA. After removing the protein by phenol-chloroform extraction, potassium acetate was added to a final concentration of 0.3 M and ethanol precipitation was performed. The obtained precipitate was dissolved in 100 μL of sterilized water and applied to Nick Column (manufactured by Amersham Biosciences). Elution was performed with 400 μL of sterile water. The eluted fraction was collected, potassium acetate was added to a final concentration of 0.3 M, and ethanol precipitation was performed. The quantification of the synthesized foreign mRNA was performed by measuring the absorbance at 260 nm. As a result, about 60 μg of exogenous mRNA was synthesized in a 20 μL scale reaction.
実験例１
：実施例１の昆虫細胞抽出液および参考例２の外来ｍＲＮＡを用いた無細胞系タンパク質合成
実施例１で調製した昆虫細胞抽出液、および参考例２で合成した外来ｍＲＮＡを用いて、下記組成の反応液を調製し、無細胞系でのタンパク質合成を行った。
〔反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 昆虫細胞抽出液
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＡＴＰ
・０．２５ｍＭ ＧＴＰ
・２０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・８０μＭ アミノ酸（２０種）
・０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ
・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
・３２０μｇ／ｍＬ 外来ｍＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００を用いた。反応液量は２５μＬ、反応温度は２５℃とし、反応時間ごとにサンプリングを行い、合成されたルシフェラーゼ量を測定した。合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
図２は、実施例１の昆虫細胞抽出液を用いた各反応時間におけるルシフェラーゼの合成量を示すグラフである。図２において縦軸はルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）、横軸は反応時間（ｈ）を示す。図２に示すように、タンパク質合成反応は反応開始後８時間まで継続し、２４．７μｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成された。
Experimental example 1
: Cell-free protein synthesis using insect cell extract of Example 1 and exogenous mRNA of Reference Example 2 Using the insect cell extract prepared in Example 1 and the exogenous mRNA synthesized in Reference Example 2, the following composition The protein was synthesized in a cell-free system.
[Composition of reaction solution]
-50 (v / v)% insect cell extract-40 mM HEPES-KOH (pH 7.9)
・ 100 mM potassium acetate ・ 2 mM magnesium acetate ・ 2 mM DTT
・ 0.5 mM ATP
・ 0.25 mM GTP
・ 20 mM creatine phosphate ・ 200 μg / mL creatine kinase ・ 80 μM amino acids (20 types)
・ 0.25 mM EGTA
1U / μL RNase inhibitor (derived from human placenta)
・ 200μg / mL tRNA
・ 320μg / mL foreign mRNA
ATP (manufactured by Sigma), GTP (manufactured by Sigma), amino acids (20 types) (manufactured by Sigma), RNase inhibitor (manufactured by Takara Shuzo), and tRNA (manufactured by Roche Diagnostics) were used. A low temperature aluminum block thermostatic chamber MG-1000 was used as a reaction apparatus. The reaction volume was 25 μL, the reaction temperature was 25 ° C., sampling was performed for each reaction time, and the amount of synthesized luciferase was measured. The synthesized luciferase was quantified using a luciferase assay kit (E-1500, manufactured by Promega). 2.5 μL of the reaction solution was added to 50 μL of the luciferase assay reagent, and luminescence by luciferase was measured using a luminometer (Tuner Designs TD-20 / 20, manufactured by Promega).
FIG. 2 is a graph showing the amount of luciferase synthesized in each reaction time using the insect cell extract of Example 1. In FIG. 2, the vertical axis represents the amount of luciferase synthesis (μg / mL), and the horizontal axis represents the reaction time (h). As shown in FIG. 2, the protein synthesis reaction continued for 8 hours after the start of the reaction, and 24.7 μg / mL luciferase was synthesized.
実施例２
：実施例１の昆虫細胞抽出液のヌクレアーゼ処理
実施例１の抽出液に対し、ミクロコッカルヌクレアーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）終濃度３６μｇ／ｍＬ、塩化カルシウム終濃度０．３６ｍＭで添加し、２０℃で１５分間反応させた。反応後、ＥＧＴＡを終濃度６ｍＭで添加し、これを昆虫細胞抽出液とした。
Example 2
: Nuclease treatment of insect cell extract of Example 1 To the extract of Example 1, micrococcal nuclease (Roche Diagnostics) was added at a final concentration of 36 μg / mL and a final concentration of calcium chloride of 0.36 mM. And reacted at 20 ° C. for 15 minutes. After the reaction, EGTA was added at a final concentration of 6 mM to obtain an insect cell extract.
実験例２
：実施例２の昆虫細胞抽出液および参考例２の外来ｍＲＮＡを用いた無細胞系タンパク質合成
実施例２で調製した昆虫細胞抽出液、および参考例２で合成した外来ｍＲＮＡを用いた以外は実験例１で用いたのと同様の組成の反応液を調製し、無細胞系でのタンパク質合成を行った。
図３は、実験例１、２の昆虫細胞抽出液を用いた合成反応開始から５時間のルシフェラーゼの合成量の変化を示すグラフである。図３において、縦軸はヌクレアーゼ未処理の抽出液を用いた反応液において、５時間後のルシフェラーゼ合成量を１００％とした相対合成量（％）を示し、横軸は反応時間（ｈ）を示す。図３に示すように、ヌクレアーゼ処理を施した実施例２の昆虫細胞抽出液を用いると、タンパク質の合成量が増加することが判った。
Experimental example 2
: Cell-free protein synthesis using the insect cell extract of Example 2 and the exogenous mRNA of Reference Example 2 The experiment was conducted except that the insect cell extract prepared in Example 2 and the exogenous mRNA synthesized in Reference Example 2 were used. A reaction solution having the same composition as that used in Example 1 was prepared, and protein synthesis was performed in a cell-free system.
FIG. 3 is a graph showing changes in the amount of luciferase synthesized from the start of the synthesis reaction using the insect cell extracts of Experimental Examples 1 and 2 for 5 hours. In FIG. 3, the vertical axis indicates the relative synthesis amount (%) in the reaction solution using the nuclease-untreated extract, with the luciferase synthesis amount after 5 hours being 100%, and the horizontal axis is the reaction time (h). Show. As shown in FIG. 3, it was found that the amount of protein synthesis increased when the nuclease-treated insect cell extract of Example 2 was used.
参考例３
：キャップ構造の付加
多くの真核細胞由来のｍＲＮＡにみられる７−メチルグアノシン５’キャップ構造は、ｍＲＮＡの安定化、リボソームとの親和性の向上といった働きがあることが知られている。転写反応の際にメチル化されたリボヌクレオチドを加えると、転写産物の５’末端にキャップ構造を組み込むことができる。具体的には、以下の手順にて、キャップ構造を有する外来ｍＲＮＡを合成した。
参考例２（１）と同様にして作製したｐＴＮＴ−ＬｕｃをＢａｍＨＩで消化した後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。これを鋳型とし、メチル化されたリボヌクレオチドとしてＲｉｂｏ ｍ７ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（プロメガ社製）を用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を行った。転写反応液の組成を以下に示す。
〔転写反応液の組成〕
・８０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・２４ｍＭ 酢酸マグネシウム
・４０ｍＭ ＤＴＴ
・７．５ｍＭ ＡＴＰ
・７．５ｍＭ ＵＴＰ
・７．５ｍＭ ＣＴＰ
・０．６ｍＭ ＧＴＰ
・３ｍＭ Ｒｉｂｏ ｍ７ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ
・２ｍＭ スペルミジン
・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・１Ｕ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
・５０μｇ／ｍＬ ｐＴＮＴ−Ｌｕｃ／ＢａｍＨＩ
Reference example 3
: Addition of cap structure It is known that the 7-methylguanosine 5 ′ cap structure found in mRNAs derived from many eukaryotic cells has functions of stabilizing mRNA and improving affinity with ribosome. By adding methylated ribonucleotides during the transcription reaction, a cap structure can be incorporated at the 5 ′ end of the transcript. Specifically, exogenous mRNA having a cap structure was synthesized by the following procedure.
After the pT N T-Luc prepared in the same manner as in Reference Example 2 (1) was digested with BamHI, phenol - chloroform extraction, and purified by ethanol precipitation. Using this as a template, Ribo m 7 Cap Analog (manufactured by Promega) was used as a methylated ribonucleotide to carry out an in vitro transcription reaction. The composition of the transcription reaction solution is shown below.
[Composition of transcription reaction solution]
・ 80 mM HEPES-KOH (pH 7.9)
・ 24 mM magnesium acetate ・ 40 mM DTT
・ 7.5 mM ATP
・ 7.5 mM UTP
・ 7.5 mM CTP
・ 0.6 mM GTP
・ 3 mM Ribo m 7 Cap Analog
・ 2 mM spermidine ・ 1 U / μL RNase inhibitor (derived from human placenta)
1 U / μL T7 RNA polymerase 50 μg / mL pT N T-Luc / BamHI
実験例３
実施例１で調製した昆虫細胞抽出液、および参考例３で合成したキャップ構造を有する外来ｍＲＮＡを用いた以外は実験例１で用いたのと同様の組成の反応液を調製し、無細胞系でのタンパク質合成を行った。結果、反応時間１０時間で、キャップ構造を有しない外来ｍＲＮＡを用いた場合（実験例１）の約２．６倍のルシフェラーゼが合成された。
図４は、実施例１の昆虫細胞抽出液と参考例３のｍＲＮＡを用いた合成反応開始から１０時間のルシフェラーゼ合成量の変化を示すグラフである。図４において、縦軸は実施例１の昆虫細胞抽出液とキャップ構造を有しない外来ｍＲＮＡ（参考例２）を用いた翻訳反応において１０時間後のルシフェラーゼ合成量を１００％とした相対合成量（％）を示し、横軸は反応時間（ｈ）を示す。
Experimental example 3
A reaction liquid having the same composition as that used in Experimental Example 1 was prepared except that the insect cell extract prepared in Example 1 and the foreign mRNA having the cap structure synthesized in Reference Example 3 were used. Protein synthesis was carried out. As a result, the reaction time was 10 hours, and about 2.6 times as much luciferase was synthesized as when exogenous mRNA having no cap structure was used (Experimental Example 1).
FIG. 4 is a graph showing the change in the amount of luciferase synthesized from the start of the synthesis reaction using the insect cell extract of Example 1 and the mRNA of Reference Example 3 for 10 hours. In FIG. 4, the vertical axis represents the relative synthetic amount (100% of the amount of luciferase synthesized after 10 hours in the translation reaction using the insect cell extract of Example 1 and the foreign mRNA having no cap structure (Reference Example 2)). %), And the horizontal axis represents the reaction time (h).
比較例１
参考例１と同様にして培養した昆虫細胞Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、冷却した昆虫細胞を懸濁後、５分間激しく攪拌して抽出を行った以外は、実施例１および実験例１と同様にして、無細胞系でのタンパク質合成を行った。
結果、反応は２時間で停止し、ルシフェラーゼの合成量も２０ｎｇ／ｍＬと、実験例１の約１０００分の１程度であった。
Comparative Example 1
Example 1 and Experimental Example 1 except that the insect cell High Five (manufactured by Invitrogen) cultured in the same manner as in Reference Example 1 was suspended and extracted by stirring vigorously for 5 minutes. Similarly, protein synthesis was performed in a cell-free system.
As a result, the reaction was stopped in 2 hours, and the amount of luciferase synthesized was 20 ng / mL, which was about 1/1000 of that in Experimental Example 1.
比較例２
参考例１と同様にして培養した昆虫細胞Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、細胞溶解用試薬（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ、プロメガ社製）に溶解した後、抽出を行った以外は、実施例１および実験例１と同様にして、無細胞系でのタンパク質合成を行った。
結果、反応は２時間で停止し、ルシフェラーゼの合成量も２００ｎｇ／ｍＬと、実験例１の約１００分の１程度であった。
Comparative Example 2
Except that the insect cells High Five (manufactured by Invitrogen) cultured in the same manner as in Reference Example 1 were dissolved in a cell lysis reagent (Cell Culture Lysis Reagent, Promega) and then extracted, Example 1 and In the same manner as in Experimental Example 1, protein synthesis was performed in a cell-free system.
As a result, the reaction was stopped in 2 hours, and the amount of luciferase synthesized was 200 ng / mL, which was about 1/100 of that of Experimental Example 1.
参考例４
：昆虫細胞の培養
昆虫細胞Ｓｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＳｆ９００−ＩＩ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中にて２７℃で培養した。培地１ｍＬあたりの細胞数６.０×１０５個のＳｆ２１を１２５ｍＬ三角フラスコ内の培地５０ｍＬ中で２７℃・１３０ｒｐｍ・５日間懸濁培養を行った。結果、培地１ｍＬあたりの細胞数１.０×１０８個、湿重量３ｇとなった。この細胞を用いて細胞抽出液を調製した。
Reference example 4
Insect cell culture Insect cells Sf21 (Invitrogen) were cultured at 27 ° C. in Sf900-II serum-free medium (Invitrogen). Suspension culture of Sf21 having 6.0 × 10 5 cells per mL of medium was carried out in suspension at 27 ° C., 130 rpm, 5 days in 50 mL of medium in a 125 mL Erlenmeyer flask. As a result, the number of cells per 1 mL of the medium was 1.0 × 10 8 cells, and the wet weight was 3 g. A cell extract was prepared using these cells.
実施例３
：昆虫細胞抽出液の調製
まず、上記参考例４で培養した昆虫細胞を集菌し、下記組成の洗浄液にて３回洗浄（７００×ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心分離）した後、３ｍＬの下記組成の抽出用液中に懸濁した。
〔洗浄液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
〔抽出用液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ 塩化カルシウム
・２０％（ｖ／ｖ） グリセロール
・１ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
この細胞懸濁液を液体窒素中にて急速（１０秒以内）に凍結させた。充分に凍結させた後、約４℃の氷水浴中で解凍した。完全に解凍した後、３００００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）し、上清１Ａを回収した。回収した上清１Ａをさらに４５０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）して上清１Ｂを回収した。回収した上清１Ｂを下記組成のゲル濾過用緩衝液で平衡化したＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャム バイオサイエンス社製）に２.５ｍＬアプライした。
〔ゲル濾過用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
アプライした後、ゲル濾過用緩衝液３ｍＬにて溶出し、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分を回収し、これを昆虫細胞抽出液とした。
Example 3
: Preparation of insect cell extract First, the insect cells cultured in Reference Example 4 above were collected and washed three times with a washing solution having the following composition (centrifuged at 700 × g, 4 ° C. for 10 minutes). It was suspended in 3 mL of the extraction liquid having the following composition.
[Composition of cleaning liquid]
・ 40 mM HEPES-KOH (pH 7.9)
・ 100 mM potassium acetate ・ 2 mM magnesium acetate ・ 2 mM calcium chloride ・ 1 mM DTT
[Composition of extraction liquid]
・ 40 mM HEPES-KOH (pH 7.9)
• 100 mM potassium acetate • 2 mM magnesium acetate • 2 mM calcium chloride • 20% (v / v) glycerol • 1 mM DTT
・ 0.5 mM PMSF
This cell suspension was rapidly frozen (within 10 seconds) in liquid nitrogen. After sufficiently freezing, it was thawed in an ice water bath at about 4 ° C. After thawing completely, the mixture was centrifuged at 30000 × g and 4 ° C. for 10 minutes (himacCR20B3, manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd.), and the supernatant 1A was recovered. The collected supernatant 1A was further centrifuged at 45,000 × g and 4 ° C. for 30 minutes (himacCR20B3, manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd.) to collect the supernatant 1B. The collected supernatant 1B was applied to a PD-10 desalting column (Amersham Biosciences) equilibrated with a gel filtration buffer having the following composition.
[Composition of buffer solution for gel filtration]
・ 40 mM HEPES-KOH (pH 7.9)
・ 100 mM potassium acetate ・ 2 mM magnesium acetate ・ 1 mM DTT
・ 0.5 mM PMSF
After application, elution was performed with 3 mL of gel filtration buffer, and fractions having an absorbance at 280 nm of 30 or more were collected using a spectrophotometer (Ultraspec 3300pro, manufactured by Amersham Biosciences). It was.
実験例４
：実施例３の昆虫細胞抽出液および参考例２の外来ｍＲＮＡを用いた無細胞系タンパク質合成
実施例３で調製した昆虫細胞抽出液、および参考例２で合成した外来ｍＲＮＡを用いて、下記組成の反応液を調製し、無細胞系でのタンパク質合成を行った。
〔反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 昆虫細胞抽出液
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・１．５ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．２５ｍＭ ＡＴＰ
・０．１ｍＭ ＧＴＰ
・２０ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・８０μＭ アミノ酸（２０種）
・０．１ｍＭ ＥＧＴＡ
・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
・３２０μｇ／ｍＬ 外来ｍＲＮＡ（ルシフェラーゼ遺伝子をコード）
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００を用いた。反応液量は２５μＬ、反応温度は２５℃、反応時間は６時間で実施した。実験例１と同様にして合成されたルシフェラーゼ量を経時的に測定した結果、１６．３μｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成された（図５）。
Experimental Example 4
: Cell-free protein synthesis using the insect cell extract of Example 3 and the foreign mRNA of Reference Example 2 Using the insect cell extract prepared in Example 3 and the foreign mRNA synthesized in Reference Example 2, the following composition The protein was synthesized in a cell-free system.
[Composition of reaction solution]
-50 (v / v)% insect cell extract-40 mM HEPES-KOH (pH 7.9)
・ 100 mM potassium acetate ・ 1.5 mM magnesium acetate ・ 2 mM DTT
・ 0.25 mM ATP
・ 0.1 mM GTP
・ 20 mM creatine phosphate ・ 200 μg / mL creatine kinase ・ 80 μM amino acids (20 types)
・ 0.1 mM EGTA
1U / μL RNase inhibitor 200μg / mL tRNA
・ 320μg / mL foreign mRNA (encoding luciferase gene)
ATP (manufactured by Sigma), GTP (manufactured by Sigma), amino acids (20 types) (manufactured by Sigma), RNase inhibitor (manufactured by Takara Shuzo), and tRNA (manufactured by Roche Diagnostics) were used. A low temperature aluminum block thermostatic chamber MG-1000 was used as a reaction apparatus. The reaction volume was 25 μL, the reaction temperature was 25 ° C., and the reaction time was 6 hours. As a result of measuring the amount of luciferase synthesized in the same manner as in Experimental Example 1 over time, 16.3 μg / mL luciferase was synthesized (FIG. 5).
配列番号１：プライマー Ｌｕｃ Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ
配列番号２：プライマー Ｌｕｃ Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ
配列番号３：プライマー Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ
SEQ ID NO: 1: Primer Luc T7-F3-Kpn
SEQ ID NO: 2: Primer Luc T7-R4-Kpn
Sequence number 3: Primer T7 promoter
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