JP2021164468A - 多細胞チューモロイドの形成およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】腫瘍細胞(TC)、癌関連線維芽細胞(CAF)、および内皮細胞(EC)を細胞培養培地で共培養する工程を含み、ここでTC対CAF対ECの数の比が5対1対1であり、前記細胞培養培地がある量の間葉系幹細胞培養上清を含有する、多細胞チューモロイドを形成する方法。また、前記多細胞チューモロイドを形成する工程と、ある量の抗癌剤に曝露させる工程とを含む、抗癌剤の有効性を決定する方法。
【選択図】図2
Description
本出願は、2015年5月19日に出願された「抗癌剤創薬の方法」の名称を有する米国仮出願第62/000,081号の利益を主張するものであり、該仮出願の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
[連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載]
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた助成金番号第HHSN261201300044C号の下での政府の支援により行われた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本明細書において「チューモロイド」は、腫瘍細胞の微小転移性の密集した凝集体を指す。チューモロイドは、細胞外マトリックスにおいて腫瘍進行を駆動するのと同じ生化学的、ナノトポグラフィー的、および機械的要因に応答することができる。
販売承認を受ける薬物は、臨床開発に入る薬物の推定9%にすぎない。新たな薬物の失敗率が高い理由の幾つかは、臨床的有効性の欠如をもたらすヒト疾患の背後の生物学の理解の乏しさ、薬物毒性、および副作用にある。臨床開発に入っている潜在的抗癌剤は、高騰する新薬開発費(約8億ドル)にもかかわらず、約95%の損耗率を有する。この高い損耗率は、二次元(2D)細胞培養アッセイおよびインビボ動物モデルを用いた抗癌剤創薬、癌細胞応答試験、および医薬品開発に使用されるアプローチに起因し得る。
ここで記載されるのは、多細胞チューモロイドを形成する方法である。形成されたチューモロイドの細胞集団は、異種であってもよい(すなわち異なる細胞タイプを含む)。該方法は、インビボでの腫瘍微小環境を模倣する大型のチューモロイド(直径約500μm超)をもたらすことができる。幾つかの実施形態において該方法は、腫瘍細胞(TC)、癌関連線維芽細胞(CAF)、および内皮細胞(EC)を細胞培養培地で共培養する工程を含んでもよい。幾つかの実施形態において、共培養はマクロファージを含むこともできる。幾つかの実施形態において、細胞共培養体(cell co−culture)はTC、CAF、およびECのみを含有する。他の実施形態において、細胞共培養体はTC、CAF、EC、およびマクロファージのみを含有する。細胞培養は、所望のサイズのチューモロイドが形成されるまで、細胞の1回または複数回の継代を通じて継続することができる。形成されたチューモロイドは、直径約1μm〜約500μm、500μm超、または500μM〜約1,000μMであってもよい。任意の培養において、チューモロイドサイズは実質的に均一であってもよい。
TC、CAF、EC、およびマクロファージは、本明細書に記載されているように共培養することができる。幾つかの実施形態において、TC対CAF対ECの比は約5対約1対約1であってもよい。言い換えれば、培養でのTC、CAF、およびECそれぞれの総数の比は、約5対約1対約1の比で存在してもよい。TC対CAF対ECの比は、約1〜約10:約1〜約10:約1〜約10の範囲であってもよい。TC対CAF対EC対マクロファージの比は、5:1:1:1の範囲であってもよい。TC対CAF対EC対マクロファージの比は、約1〜約10:約1〜約10:約1〜約10:約1〜約10の範囲であってもよい。TC、CAF、EC、およびマクロファージは、自己由来、異種、またはその組み合わせであってもよい。
本明細書に記載されているように形成されたチューモロイドは、抗癌剤または医薬品を含む薬物などの化合物または組成物の有効性および/または効果を決定するのに使用することができる。そのため、本明細書に記載された方法およびチューモロイドは、臨床試験および創薬のモデル系として有用であり得る。チューモロイドが対象者自身の腫瘍から形成される実施形態において、特定の治療レジメンの有効性が調べられてもよい。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されたチューモロイドおよび培養方法は、癌幹細胞のインビトロ集団を増殖するのに使用することができる。
3D細胞培養においては、ハイスループット系スクリーニングへの該培養の組み込みにおいて重要である再現性に主な障害があった。チューモロイドアッセイにおけるウェル間の変動を決定するために、n=8ウェル/群、異なる濃度のFiSSにおけるMCF−7細胞を、PrestoBlue(登録商標)アッセイにより播種5日後に腫瘍形成性を測定した。統計上の効果量の尺度であるZ因子を、方程式1を用いて決定した。
BT474またはHCC1569細胞を、ECおよびCAFと共培養した。共培養における腫瘍細胞(BT474またはHCC1569)対EC対CAFの比は、5:1:1(腫瘍細胞:EC:CAF)であった。図2A〜5Bに示されているように、ECおよびCAFとの共培養は、増加した増殖能および高いVEGF発現を有する頑強なチューモロイドを誘導した(図3)。図1A〜1Bは、癌関連線維芽細胞(CAF)および内皮細胞(EC)と共に(図1B)、または無しで(図1A)約5日培養した後のBT474乳癌細胞由来チューモロイドの増殖を示す代表的な蛍光顕微鏡画像を示す。
本明細書に記載された共培養においてチューモロイド増殖を増進させることが可能な増殖因子を調べるための、培養中のチューモロイド増殖に対する漸増血清濃度の影響。結果(示されていない)は、血清濃度の増加がチューモロイド増殖に著しい影響を与えるものでないことを示唆するものである。増殖培地へのマトリゲル(約5%〜約10%)の添加により、FiSSで培養した場合のHCC1569細胞のチューモロイド発生が高まった。これは、約5%〜約10%マトリゲルによる増殖培地(GM)の補充によって、他のタイプの乳癌細胞由来のチューモロイドの増殖を増進させられることを示唆している。
チューモロイドの臨床バイオマーカーとしてのKi67。臨床試験は、臨床的有効性のマーカーとしてKi67を利用する。Ki67がチューモロイドにおいて発現されるかどうかを決定するために、BT474細胞(104)をFiSSで5日間培養した。形成されたチューモロイドを固定し、抗Ki67抗体を用いて免疫染色した。図8Aから8Bは、生細胞を緑色、死細胞を赤色に染色するカルセインAM/EthD−1で染色したBT474チューモロイド培養物(図8A)、および3D足場におけるBT474の単独培養物に関するKi−67染色(図8B)を示す。
BT474およびHCC1569の単独培養または共培養に由来するチューモロイドの、ラパチニブに対する感受性を調べた。ラパチニブは、EGFRおよびHER2を標的にする二重低分子チロシンキナーゼ阻害剤である。図9A〜9Bに示されたデータに示されているように、チューモロイドはラパチニブ処理に対し様々な反応性を有した。BT474細胞は、2DまたはFiSSのいずれで培養した場合も、ラパチニブに対して感受性であることが観察された(IC50<2.5μM)が、ECおよびCAFの存在下でMT474−MCTは、ラプチニブ(Laptinib)に対して有意により高い耐性を有することが観察された(IC50>10μM)。HCC1569も、ECおよびCAFの存在下で培養した場合、ラパチニブに対する耐性の増加を示した。確立されたチューモロイドをラパチニブで処理した場合、類似の結果が観察された。
Ki−67は、癌治験における臨床有効性の代理マーカーとして使用することができる。Ki−67の発現。単独培養チューモロイドおよび共培養チューモロイドを、ラパチニブを漸増濃度として(0〜10μM)処理した。チューモロイドを固定し、Ki−667について免疫染色した。ラパチニブ(2.5mM)による処理が、Ki−67の発現に影響を与えるかどうかをテストした。結果は、ラパチニブ処理がチューモロイド形成を阻害するだけでなく、Ki−67染色を完全に抑制することを示し、腫瘍細胞の増殖の完全な阻害を示唆した(図10Aおよび10B)。
チューモロイド培養の確立:条件をチューモロイド発生のために最適化した。HCC1569を除いて、乳房腫瘍細胞系MCF7、BT−474およびMDA−MB−231は全て、播種密度3,000から10,000細胞/96ウェル当たりでチューモロイドを形成した(ここでは単一細胞チューモロイド(SCT)と呼ばれる)。HCC1569の細胞系はゆるく接着しており、単層で培養した場合、細胞の約50%が浮遊物として残ったことが観察された。この細胞系によるチューモロイド形成を最適化する間に、HCC−1569細胞は、培養培地に10%マトリゲルを補充すると、他の細胞系と同じ頻度でチューモロイドを容易に発生させることが、思いがけなく観察された。図12A〜12Dは、4細胞系全てが5日目にSCTを容易に発生させたことを示している。チューモロイド増殖を9日目までモニターし、5日目および9日目のSCTのサイズを測定した(図13)。各細胞タイプのチューモロイドは、サイズが3〜20%差次的に増殖した。
乳癌細胞とCAFおよびECなどの間質細胞との共培養が、インビボでの腫瘍を模倣できる多細胞チューモロイド(MCT)を形成するかどうかを調べるために、共培養試験を行った。5日目のMCF−7チューモロイドとECまたはCAFのどちらかとの共培養では、共培養3〜5日後に識別可能なMCTが誘導された(図14A〜14D)が、細胞の正味の増殖は低減した(図15)。しかし、MCF−7細胞とECおよびCAFの両方との共培養は、チューモロイドサイズおよび数を有意に増加させただけでなく(図14A〜14D)、細胞増殖も回復させた(図15)。同様に、HCC−1569細胞系では、CAFおよびECと同時に共培養した場合、チューモロイドサイズおよび数が有意に増加した(図14A〜14D)。共培養条件を最適化し、EC(103)およびCAF(103)との共培養腫瘍細胞(3〜5×103)は、若干増加した増殖能を有する頑強なMCTを誘導したことが観察された(図16A〜16F)。MCTにおけるCAFおよびECの存在を、それぞれ、CAFおよびECに特異的な抗平滑筋アクチン(SMA)抗体および抗フォンウィルブランド因子(vWF)抗体を用いたIHCと、それに続く共焦点顕微鏡法により確認した。CAF(赤、抗SMA陽性)およびEC(緑、抗vWF陽性)について免疫染色したMCTの代表的な蛍光画像および合成zスタック画像を観察した。共培養後5日目でCAFがチューモロイド全体に分散しているのが見出されたのに対し、ECは大部分がMCTの端で見出された(図17A〜17F)。実験の別のセットにおいて、MDA−MB−231およびECの共培養もチューモロイド発生を示したが、正味の細胞増殖は低減した。まとめると、これらの結果は、チューモロイドと間質細胞との共培養が有意にチューモロイド発生を増加させることを示している。
FiSSチューモロイドの性能を他の3Dベースの培養プラットフォームと比較するために、増殖因子低減マトリゲルを用いた2つの乳癌細胞系、MCF7およびBT474におけるスフェロイド形成を評価した。比較のために、同数の細胞をFiSSにプレーティングし、調べた。細胞を5日間培養し、スフェロイドをカルセインAMで染色し、蛍光顕微鏡により調べた。図18A〜18Dに示された結果は、MCF7(図18A〜18B)においてマトリゲル培養がFiSSと類似したスフェロイドの数およびサイズを誘導したのに対し、BT474(図18C〜18D)ではマトリゲル培養はFiSSよりまとまりのないコロニーを形成したことを示している。しかし、さらに、マトリゲルの内部に組み込まれているマトリゲル培養のコロニーはほとんどないことが見出された。
SCTおよびMCT培養におけるバイオマーカーの特徴付けに向けて、チューモロイドの培養上清に分泌される因子を調べた。チューモロイドの上清中のVGEFレベルの比較により、MCF7−MCTと比べてMCF7−SCTはVGEFが少ないことが示された(図19)。さらに、図11A〜11Cに示されているように、BT474−SCTおよび−MCTは両方とも有意な量のVEGFおよびIL−6を産生した。興味深いことに共培養は、培養培地に放出されるVGEFおよびIL−6の量の2倍の増加を示した。共培養で産生されたVGEFおよびIL−6のレベルのこの増加は、共培養で見られる細胞の増殖およびチューモロイドの増殖の増加に重要であり得ることを示唆するものであり、したがって、これらの2つのタンパク質は臨床的有効性のマーカーとして機能する可能性がある。
これらの結果をさらに確証するために、図20〜21に記載されたquantibody Arrayを用いてSCTおよびMCTの培養上清を調べた。ラパチニブ処理培養物を、SCTと比較してMCTで差次的に発現が見られる因子について調べた。図22A〜24は、結果を示すグラフを示した図である。結果は、MCTの培養上清がIL−6およびIL−8における>7倍の増加を示し、用量依存的にラパチニブ処理すると基礎レベルまで低減したことを示した(図22A〜22B)。対照的に、単球走化性タンパク質(MCP−1)発現は、MCTにおいて変わらないままであった。しかし、ラパチニブ処理は、MCP−1発現をSCTにおいて完全に消失させたが、MCTでは中程度(12.5uMラパチニブの存在下で高々50%)に消失させた。これは、MCTにおけるラパチニブに対する耐性が、持続的MCP−1に起因する可能性があることを示唆するものである(図22C)。
臨床的有効性の予測に関して、マトリゲルベースの3D培養と比較してFiSSチューモロイドを評価するために、3日齢BT−474 SCT(マトリゲルまたはFiSSで培養)をラパチニブで処理し、チューモロイド形成(図26A〜26D)および細胞生存率(図27A〜27B)を調べた。マトリゲルは、FiSSチューモロイドと比較して多数のより小さなサイズのチューモロイドを誘導したが、それらのラパチニブに対する応答は図27A〜27Bに示されているように類似していた。
チューモロイド培養物の自動イメージングおよび定量
高含量分析(HCA)は、蛍光顕微鏡法および定量的画像分析を行うための自動プラットフォームであり、マイクロタイタープレートに固定され染色された細胞を分析するのに使用されており、リン酸化、転移、細胞1個当たりベースのタンパク質の存在量、および細胞学的変化を含む多くの細胞変化を(ソフトウェアにより)定量化することができる。HCA分析を行うためにOperetta(Perkin Elmer)におけるFiSSチューモロイドのデータ取得を開始した。
3D細胞培養においては、ハイスループット系スクリーニング(HTS)への該培養の組み込みに重要な再現性に主な障害があった。以前の試験において、レザズリン(青)からレゾルフィン(高蛍光性の赤)への変換により細胞代謝および生存率のリアルタイムモニタリングを可能にするPrestoBlueアッセイの実現可能性が実証されていた。変換は代謝的に活性な細胞の数に比例し、故に定量的に測定することができる。LLC1チューモロイドに関するPrestoBlueアッセイ(Life Technologies、NY)の精度を実証するために、FiSSを予め加えた96ウェルプレートでLLC1細胞を培養した。バックグラウンド蛍光を考慮するために、一部のウェルは、LLC1チューモロイドなしでFiSSおよび培地のみを含有した。72時間後、PrestoBlueアッセイを行った。スクリーニングアプリケーションとしての該アッセイの適合性を評価するために、Z’因子を計算した。Z’因子は0.63および0.72で計算し、HTS即応性に優れていると見なされた(図30A〜30B)。結果は、96ウェルプレートにおいてPrestoBlueアッセイは、チューモロイド培養の最小ウェル間変動を示し、反復実験における標準偏差(SD)は12%および10%以内であることが見出されたことを示している。
足場の大規模製造の質を向上する試みにおいて、電界紡糸技術を可能にし、様々なポリマー、化学製品、および生物製剤に適合する世界初の統合機器である、適合Spraybaseシステムを使用した。Spraybaseは、FiSS技術に必要とされる使いやすさ、安全性、柔軟性、およびスケーラビリティ(scalability)を提供する。Spraybaseは、我々のニーズに応じて様々なサイズの繊維を形成するのに使用することができる。ローラードラムと組み合わせたSpraybaseは、チューモロイド技術用の大容量のFiSSマットを製造するための最良のアプローチを提供する。抗癌剤のハイスループットスクリーニングおよび高含量イメージングのための96および384マイクロウェルFiSSプレートの両方を製造可能なこのプロセスのさらなる自動化を発展させる努力も払われている。チューモロイド形成を調べるのに、製造した96ウェルFiSSマイクロプレートの潜在能力を用いて、Z’因子を計算した。Z因子は、スクリーニングアプリケーションとしてのプレートの適合性を評価するのに使用した。結果は、製造した96ウェルマイクロプレートで培養したMCF7およびBT474細胞が、それぞれZ’因子、0.87および0.846、Z因子、0.812および0.501でチューモロイドを形成することを示した。これらの結果は、FiSS−製造した製造96ウェルマイクロプレートがチューモロイド培養のウェル間変動が最小限であり、故に抗癌剤のHTSに優れていると見なされたことを示している(図33A〜33B)。
本発明の例示的な態様を以下に記載する。
<1> 腫瘍細胞(TC)、癌関連線維芽細胞(CAF)、および上皮細胞(EC)を細胞培養培地で共培養する工程を含み、ここでTC対CAF対ECの数の比が5対1対1であり、前記細胞培養培地がある量の間葉系幹細胞培養上清を含有する、多細胞チューモロイドを形成する方法。
<2> 前記腫瘍細胞が乳癌細胞である、<1>に記載の方法。
<3> 前記乳癌細胞が対象者の腫瘍に由来する、<2>に記載の方法。
<4> 前記間葉系幹細胞培養上清が、前記細胞培養培地の総量の少なくとも約20%存在する、<1>〜<3>のいずれか一項に記載の方法。
<5> 前記間葉系幹細胞培養上清が、前記細胞培養培地の総量の少なくとも約20%〜約50%存在する、<1>〜<3>のいずれか一項に記載の方法。
<6> 前記間葉系幹細胞培養上清がVEGFを少なくとも約800pg/mL含有する、<1>〜<5>のいずれか一項に記載の方法。
<7> 前記間葉系幹細胞培養上清がIL−6を少なくとも約100pg/mL含有する、<1>〜<6>のいずれか一項に記載の方法。
<8> 前記間葉系幹細胞培養上清がTGF−β1を少なくとも約1200pg/mL含有する、<1>〜<7>のいずれか一項に記載の方法。
<9> 前記細胞培養培地が約5%〜約10%マトリゲルをさらに含む、<1>〜<8>のいずれか一項に記載の方法。
<10> 前記TC、CAF、およびECが三次元足場で共培養される、<1>〜<9>のいずれか一項に記載の方法。
<11> 前記三次元足場が繊維状誘導スマートスキャフォールドである、<10>に記載の方法。
<12> 腫瘍細胞(TC)、癌関連線維芽細胞(CAF)、および上皮細胞(EC)を細胞培養培地で共培養することを含み、ここでTC対CAF対ECの数の比が5対1対1であり、前記細胞培養培地がある量の間葉系幹細胞培養上清を含有する、多細胞チューモロイドを形成させる工程と、
前記多細胞チューモロイドをある量の抗癌剤に曝露させる工程と、
を含む、抗癌剤の有効性を決定する方法。
<13> 前記腫瘍細胞が乳癌細胞である、<12>に記載の方法。
<14> 前記乳癌細胞が 対象者の腫瘍に由来する、<13>に記載の方法。
<15> 前記乳癌細胞が標準的な乳癌細胞系由来である、<13>に記載の方法。
<16> 前記間葉系幹細胞培養上清が、前記細胞培養培地の総量の少なくとも約20%存在する、<12>〜<15>のいずれか一項に記載の方法。
<17> 前記間葉系幹細胞培養上清が、前記細胞培養培地の総量の少なくとも約20%〜約50%存在する、<12>〜<15>のいずれか一項に記載の方法。
<18> 前記間葉系幹細胞培養上清が、VEGFを少なくとも約800pg/mL、IL−6を少なくとも約100pg/mL、およびTGF−β1を少なくとも約1200pg/mL含有する、<12>に記載の方法。
<19> 前記量の前記抗癌剤に曝露後の前記多細胞チューモロイドにおけるKi−67の発現を測定する工程をさらに含む、<12>〜<18>のいずれか一項に記載の方法。
<20> 前記量の前記抗癌剤に曝露後の前記培養培地に存在するVEGFまたはIL−6の量を測定する工程をさらに含む、<12>〜<19>のいずれか一項に記載の方法。
Claims (17)
- 腫瘍細胞(TC)、癌関連線維芽細胞(CAF)、および内皮細胞(EC)を三次元(3D)ナノ繊維足場上において細胞培養培地で共培養する工程を含み、ここでTC対CAF対ECの数の比が5対1対1であり、前記細胞培養培地が間葉系幹細胞培養上清を含有し、前記間葉系幹細胞培養上清が前記細胞培養培地の総量の少なくとも20%存在する、多細胞チューモロイドを形成する方法。
- 前記腫瘍細胞が乳癌細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記乳癌細胞が対象者の腫瘍に由来する、請求項2に記載の方法。
- 前記間葉系幹細胞培養上清が、前記細胞培養培地の総量の少なくとも20%〜50%存在する、請求項1〜請求項3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記間葉系幹細胞培養上清がVEGFを少なくとも800pg/mL含有する、請求項1〜請求項4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記間葉系幹細胞培養上清がIL−6を少なくとも100pg/mL含有する、請求項1〜請求項5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記間葉系幹細胞培養上清がTGF−β1を少なくとも1200pg/mL含有する、請求項1〜請求項6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞培養培地が5%〜10%マトリゲルをさらに含む、請求項1〜請求項7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記3Dナノ繊維足場が繊維状誘導スマートスキャフォールドである、請求項1に記載の方法。
- 腫瘍細胞(TC)、癌関連線維芽細胞(CAF)、および内皮細胞(EC)を三次元(3D)ナノ繊維足場上において細胞培養培地で共培養することを含み、ここでTC対CAF対ECの数の比が5対1対1であり、前記細胞培養培地が間葉系幹細胞培養上清を含有し、前記間葉系幹細胞培養上清が前記細胞培養培地の総量の少なくとも20%存在する、多細胞チューモロイドを形成させる工程と、
前記多細胞チューモロイドをある量の抗癌剤に曝露させる工程と、
を含む、抗癌剤の有効性を決定する方法。 - 前記腫瘍細胞が乳癌細胞である、請求項10に記載の方法。
- 前記乳癌細胞が対象者の腫瘍に由来する、請求項11に記載の方法。
- 前記乳癌細胞が標準的な乳癌細胞系由来である、請求項11に記載の方法。
- 前記間葉系幹細胞培養上清が、前記細胞培養培地の総量の少なくとも20%〜50%存在する、請求項10〜請求項13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記間葉系幹細胞培養上清が、VEGFを少なくとも800pg/mL、IL−6を少なくとも100pg/mL、およびTGF−β1を少なくとも1200pg/mL含有する、請求項10に記載の方法。
- 前記量の前記抗癌剤に曝露後の前記多細胞チューモロイドにおけるKi−67の発現を測定する工程をさらに含む、請求項10〜請求項15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記量の前記抗癌剤に曝露後の前記培養培地に存在するVEGFまたはIL−6の量を測定する工程をさらに含む、請求項10〜請求項16のいずれか一項に記載の方法。
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