JP2021159073A - 細胞含有容器及びその製造方法 - Google Patents
細胞含有容器及びその製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021159073A JP2021159073A JP2021010564A JP2021010564A JP2021159073A JP 2021159073 A JP2021159073 A JP 2021159073A JP 2021010564 A JP2021010564 A JP 2021010564A JP 2021010564 A JP2021010564 A JP 2021010564A JP 2021159073 A JP2021159073 A JP 2021159073A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- medium
- nerve
- nerve cells
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims abstract description 173
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 65
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 41
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 41
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 19
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 abstract description 44
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 abstract description 44
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 114
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 20
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 15
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 10
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 6
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 5
- -1 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 5
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 4
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 3
- 239000000306 component Substances 0.000 description 3
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 3
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 3
- 229920002284 Cellulose triacetate Polymers 0.000 description 2
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000004642 Polyimide Substances 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N [(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-diacetyloxy-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-triacetyloxy-6-(acetyloxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-triacetyloxy-2-(acetyloxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@@H](COC(C)=O)O1)OC(C)=O)COC(=O)C)[C@@H]1[C@@H](COC(C)=O)O[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 2
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 2
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 2
- 229920001684 low density polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004702 low-density polyethylene Substances 0.000 description 2
- 229920001179 medium density polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004701 medium-density polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 2
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 2
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 2
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 2
- 229920001721 polyimide Polymers 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 210000001176 projection neuron Anatomy 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OEPOKWHJYJXUGD-UHFFFAOYSA-N 2-(3-phenylmethoxyphenyl)-1,3-thiazole-4-carbaldehyde Chemical compound O=CC1=CSC(C=2C=C(OCC=3C=CC=CC=3)C=CC=2)=N1 OEPOKWHJYJXUGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical class O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006096 Attention Deficit Disorder with Hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 206010003805 Autism Diseases 0.000 description 1
- 208000020706 Autistic disease Diseases 0.000 description 1
- 241001057184 Axion Species 0.000 description 1
- 208000020925 Bipolar disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108700019745 Disks Large Homolog 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000047174 Disks Large Homolog 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100024117 Disks large homolog 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 102100028652 Gamma-enolase Human genes 0.000 description 1
- 101710191797 Gamma-enolase Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101001053980 Homo sapiens Disks large homolog 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000979001 Homo sapiens Methionine aminopeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000969087 Homo sapiens Microtubule-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001092197 Homo sapiens RNA binding protein fox-1 homolog 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100021118 Microtubule-associated protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 239000004734 Polyphenylene sulfide Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102100035530 RNA binding protein fox-1 homolog 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- BZHJMEDXRYGGRV-UHFFFAOYSA-N Vinyl chloride Chemical compound ClC=C BZHJMEDXRYGGRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004727 amygdala Anatomy 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000467 autonomic pathway Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 description 1
- OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L calcium;(2s,3s,4s,5s,6r)-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxy-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxylato-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Ca+2].O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H](C([O-])=O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O2)C([O-])=O)O)[C@H](C(O)=O)O1 OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 210000002932 cholinergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 101150069842 dlg4 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- UHESRSKEBRADOO-UHFFFAOYSA-N ethyl carbamate;prop-2-enoic acid Chemical compound OC(=O)C=C.CCOC(N)=O UHESRSKEBRADOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 210000001222 gaba-ergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000003371 gabaergic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000000742 histaminergic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000012806 monitoring device Methods 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 229920000069 polyphenylene sulfide Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000862 serotonergic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002210 silicon-based material Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【課題】神経細胞の凝集を抑制する技術を提供することができる。【解決手段】細胞含有容器であって、神経細胞及び培地を含み、前記神経細胞は、前記細胞含有容器の培養面に接着しており、前記神経細胞と前記培養面との接着面積は、前記神経細胞８０，０００個あたり０．５ｍｍ２以上であり、前記培地中のグルコースの濃度は１ｇ／Ｌ以上である、細胞含有容器。【選択図】なし
Description
本発明は、細胞含有容器及びその製造方法に関する。本願は、２０２０年３月３０日に、日本に出願された特願２０２０−０６１２５１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
神経細胞に対する薬効評価や毒性評価に、神経細胞の活動電位を用いる場合がある。神経細胞の活動電位を検出し評価する方法の一つに、Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ Ａｒｒａｙ（ＭＥＡ）を用いた評価方法が知られている。ＭＥＡは細胞培養を行う基材に配置された微小な電極のアレイであり、細胞の電気的な活動を検出することができる。
ところで、ヒトｉＰＳ細胞由来の神経細胞をＭＥＡ上で培養し、活動電位を検出する際には、ヒト以外の動物由来の神経細胞を用いた場合よりも、神経細胞を高密度で且つ長期間培養することが必要であることが知られている。
発明者らは、ｉＰＳ由来の神経細胞を、高密度で長期間培養すると、細胞が凝集し、培養容器の培養面から剥離してしまう場合があることを見出した。
例えば、特許文献１（特開２０１８−１１７５６７号公報）には、生体細胞の培養環境を適切に維持し、安定させることを課題とする細胞培養装置が記載されている。当該細胞培養装置は、生体細胞を培養する培養槽と、オンライン／インラインモニタリング装置と、無菌サンプリング装置、分析装置、データ収集装置、データ解析装置、クラスタ分析機能を備えた細胞状態判別装置と、クラスタごとの細胞の反応モデルの参照機能を備えた運転制御補正装置とを備えるものである。しかしながら、特許文献１には、神経細胞を、高密度で長期間培養した場合に神経細胞の凝集が生じることは記載されておらず、このような神経細胞の凝集を抑制するために必要な具体的なパラメータも記載されていない。
本発明は、神経細胞の凝集を抑制する技術を提供することを目的とする。
本発明に係る、細胞含有容器は、神経細胞及び培地を含み、前記神経細胞は、前記細胞含有容器の培養面に接着しており、前記神経細胞と前記培養面との接着面積は、前記神経細胞８０，０００個あたり０．９４９〜２８．２ｍｍ２であり、前記培地中のグルコースの濃度は１ｇ／Ｌ以上である。
本発明に係る、細胞含有容器の製造方法は、神経細胞及び培地を収容した容器を、所定のタイミングで前記培地を交換しながら、培養条件下でインキュベートする工程を含み、前記培地中のグルコースの濃度を所定期間１ｇ／Ｌ以上に維持する製造方法である。
本発明によれば、神経細胞の凝集を抑制する技術を提供することができる。
［細胞含有容器］
１実施形態において、本発明は、細胞含有容器であって、神経細胞及び培地を含み、前記神経細胞は、前記細胞含有容器の培養面に接着しており、前記神経細胞と前記培養面との接着面積は、前記神経細胞８０，０００個あたり０．５ｍｍ２以上であり、前記培地中のグルコースの濃度は１ｇ／Ｌ以上である、細胞含有容器を提供する。
１実施形態において、本発明は、細胞含有容器であって、神経細胞及び培地を含み、前記神経細胞は、前記細胞含有容器の培養面に接着しており、前記神経細胞と前記培養面との接着面積は、前記神経細胞８０，０００個あたり０．５ｍｍ２以上であり、前記培地中のグルコースの濃度は１ｇ／Ｌ以上である、細胞含有容器を提供する。
実施例において後述するように、発明者らは、神経細胞の凝集と、培地中のグルコース濃度に関連性があることを見出した。また、通常のプロトコールにしたがって神経細胞を培養した場合、培地中のグルコース濃度が１ｇ／Ｌ未満になる場合があることを明らかにした。また、培地中のグルコース濃度を１ｇ／Ｌ以上に維持することにより、神経細胞の凝集を抑制できることを明らかにした。
神経細胞の凝集が抑制されていると、ＭＥＡ等を用いて神経細胞の活動電位を良好に検出して評価することができる。また、神経細胞の凝集が抑制されていると、免疫染色等の他の解析手段によっても神経細胞の状態を良好に評価することができる。
本実施形態の細胞含有容器は、培養容器中で神経細胞を培養したものである。培養容器は一般に細胞培養に用いられる容器であってよく、ディッシュ、ウェルプレート等が挙げられる。ディッシュの直径、ウェルプレートのウェル数等は、用途に応じて適宜選択することができる。
本実施形態の細胞含有容器は、容器の培養面に電極アレイが配置されていてもよい。すなわち、本実施形態の細胞含有容器はＭＥＡプレートであってもよい。ＭＥＡの電極数等は用途に応じて適宜選択することができる。
培養容器の培養面の材質としては、例えば、以下に記載の有機材料や無機材料が挙げられる。これらは１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用して使用してもよい。
有機材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、ウレタンアクリレート等のアクリル系材料、セルロース、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のシリコーン系材料、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギン酸カルシウム等のアルギン酸金属塩、ポリアクリルアミド、メチルセルロース、アガロース等のゲル状材料等が挙げられる。
無機材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス、セラミックス等が挙げられる。
培養容器の培養面はコーティング剤でコートされていてもよい。コーティング剤は、通常細胞培養に用いられるものを適宜用いることができ、例えば、コラーゲン、マトリゲル（登録商標、コーニング社）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＰＬＯ（シグマ−アルドリッチ社）、ＰＤＬＯ（シグマ−アルドリッチ社）、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ゼラチン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ラミニン等が挙げられる。
本実施形態の細胞含有容器が含有する神経細胞は、生体から採取された細胞であってもよく、株化され培養された細胞であってもよい。また、所望の神経細胞を多く含む細胞集団を得やすいという観点から、幹細胞から分化誘導された細胞であってもよい。すなわち、幹細胞由来神経細胞であってもよい。
幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血由来幹細胞、神経幹細胞等が挙げられる。人工多能性幹細胞としては、例えば、核移植胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。間葉系幹細胞としては、例えば、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞等が挙げられる。中でも、幹細胞としては、ｉＰＳ細胞が好ましい。
ｉＰＳ細胞は健常者由来のものであってもよく、各種神経系の疾患を有する患者由来のものであってもよい。また、各種遺伝子編集が施されたものであってもよく、例えば、遺伝子編集により各種神経系の疾患の原因又はリスク因子となる遺伝子を持つように操作された細胞であってもよい。
ｉＰＳ細胞が各種神経系の疾患を有する患者由来の細胞である場合には、当該神経系の疾患モデルを構築するために利用することができる。神経系の疾患としては、特別に限定されないが、例えば、神経変性疾患、自閉症、てんかん、注意欠陥−多動性障害（Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｔ ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒ、ＡＤＨＤ）、統合失調症、双極性障害等が挙げられる。神経変性疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症等が挙げられる。
神経細胞の由来となる動物種は、特に限定されず、例えば、ヒト、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等が挙げられる。中でも、ヒトが好ましい。
また、神経細胞は、１種単独であってもよく、２種以上の神経細胞が混合されたものであってもよい。神経細胞は、例えば末梢神経と中枢神経に大別することができる。末梢神経としては、例えば、感覚神経細胞、運動神経細胞、自律神経細胞が挙げられる。中枢神経としては、例えば、介在神経細胞、投射ニューロンが挙げられる。投射ニューロンとしては、例えば、皮質ニューロン、海馬ニューロン、扁桃体ニューロン等が挙げられる。また、中枢神経細胞は、興奮性ニューロンと抑制性ニューロンとに大別することができる。中枢神経系で主に興奮性伝達を担うグルタミン酸作動性ニューロン、主に抑制性伝達を担うＧＡＢＡ（γ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）作動性ニューロン等が挙げられる。
その他、神経調節物質を放出するニューロンとして、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、ノルアドレナリン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、ヒスタミン作動性ニューロン等が挙げられる。
本実施形態の細胞含有容器は、神経細胞と共に、アストロサイト、マイクログリア等を含んでいてもよい。神経細胞と培養容器の培養面との接着面積は、神経細胞８０，０００個あたり０．５ｍｍ２以上であり、０．９４９ｍｍ２以上であることが好ましく、３ｍｍ２以上であることがより好ましく、３．１４ｍｍ２以上であることが更に好ましい。また、神経細胞と培養容器の培養面との接着面積の上限は２８．２ｍｍ２程度であることが好ましい。
また、目的によっては、神経細胞は成熟していることが好ましく、例えばＴｕｂｕｌｉｎ ｂｅｔａ３、ＭＡＰ２、ＮｅｕＮ、１６０ｋＤａ Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ、２００ｋＤａ Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ、ＮＳＥ、ＰＳＤ９３、ＰＳＤ９５のいずれかのマーカー遺伝子の発現が陽性であることが好ましい。
本実施形態の細胞含有容器が含む培地としては、培地中のグルコースの濃度は１ｇ／Ｌ以上である限り、使用する細胞に適したものを適宜選択して用いることができる。
具体的な培地としては、基礎培地に必要成分を添加した培地が挙げられる。基礎培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ−１６４０）培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｍ１９９培地、高性能改良１９９培地（Ｈｉｇｈｔ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍ １９９）、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １０（Ｃｈｅｍｂｒｅｘ社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １５（Ｃｈｅｍｂｒｅｘ社製）、ＨＰＧＭ（Ｃｈｅｍｂｒｅｘ社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジーズ社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジーズ社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマ−アルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ｍＴｅＳＲ１又はｍＴｅＳＲ２培地（ステムセルテクノロジーズ社製）、ＲｅｐｒｏＦＦ又はＲｅｐｒｏＦＦ２（リプロセル社製）、ＰＳＧｒｏ ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＣＳＴＩ−７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。
また、基礎培地に添加する添加剤としては、神経細胞の培養に通常用いられるものが挙げられ、例えば、Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｎ（Ｅｌｉｘｉｒｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｇ２（Ｅｌｉｘｉｒｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ｉＣｅｌｌ Ｎｅｕｒａｌ ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔＢ（ＣＤＩ社）、ｉＣｅｌｌ Ｎｅｕｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｂ−２７ ｐｌｕｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）等が挙げられる。
［細胞含有容器の製造方法］
１実施形態において、本発明は、神経細胞及び培地を収容した容器を、所定のタイミングで前記培地を交換しながら、培養条件下でインキュベートする工程を含み、前記培地中のグルコースの濃度を所定期間１ｇ／Ｌ以上に維持する、細胞含有容器の製造方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、神経細胞及び培地を収容した容器を、所定のタイミングで前記培地を交換しながら、培養条件下でインキュベートする工程を含み、前記培地中のグルコースの濃度を所定期間１ｇ／Ｌ以上に維持する、細胞含有容器の製造方法を提供する。
本実施形態の製造方法により、上述した細胞含有容器を製造することができる。また、実施例において後述するように、本実施形態の製造方法により、神経細胞の凝集が抑制された細胞含有容器を製造することができる。
本実施形態の製造方法において、容器（培養容器）、神経細胞、培地については上述したものと同様である。具体的には、例えば、細胞含有容器の培養面に電極アレイが配置されていてもよい。また、神経細胞は、幹細胞由来神経細胞であってもよい。また、幹細胞は、ヒト細胞であってもよい。
本実施形態の製造方法において、容器（培養容器）、神経細胞、培地については上述したものと同様である。具体的には、例えば、細胞含有容器の培養面に電極アレイが配置されていてもよい。また、神経細胞は、幹細胞由来神経細胞であってもよい。また、幹細胞は、ヒト細胞であってもよい。
所定のタイミングで培地を交換するとは、例えば、１週間に１〜１０回、培地全量の１０〜１００体積％を交換することが挙げられる。培地交換のタイミングは、例えば、１週間に１〜８回であってもよく、１週間に１〜５回であってもよく、１週間に１〜３回であってもよい。培地交換から次の培地交換までの期間はほぼ一定であることが好ましい。
また、１回の培地交換で交換する培地の量は、培地全量の１０〜８０体積％であってもよく、培地全量の１０〜５０体積％であってもよく、培地全量の１０〜３０体積％であってもよい。
また、培養条件は、通常神経細胞の培養に用いられる条件であってよく、例えば、３７℃、５％ＣＯ２の条件が挙げられる。また、酸素濃度を０〜１％に設定してもよい。
インキュベートの期間は、目的に応じて適宜設定することができるが、例えば、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した神経細胞で活動電位を検出する場合には、単一細胞に解離させた神経細胞を培養容器に播種した時点から、例えば３０日間以上、例えば４０日間以上、例えば５０日間以上、例えば６０日間以上、例えば７０日間以上であることができる。
本実施形態の製造方法では、培地中のグルコースの濃度を所定期間１ｇ／Ｌ以上に維持する。ここで、所定期間とは、神経細胞を培養条件下でインキュベートする全期間であってもよいし、例えば、少なくとも培養開始から２０日間、例えば２２日間、例えば２４日間であってもよい。また、培地中のグルコースの濃度は、少なくとも培養開始から３０日間、例えば培養開始から３５日間、例えば培養開始から４０日間、０．２ｇ／Ｌ以上に維持することが好ましい。ここで、培養開始とは、単一細胞に解離させた神経細胞を培養容器に播種した時点をいう。
本実施形態の製造方法において、神経細胞は、細胞含有容器の培養面に接着しており、神経細胞と培養面との接着面積は、神経細胞８０，０００個あたり０．５ｍｍ２以上であることが好ましく、０．９４９ｍｍ２以上であることが好ましく、３ｍｍ２以上であることがより好ましく、３．１４ｍｍ２以上であることが更に好ましい。また、神経細胞と培養容器の培養面との接着面積の上限は２８．２ｍｍ２程度であることが好ましい。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（培地中のグルコース濃度の経時変化の検討）
ヒト神経細胞を培養した。また、この過程で、培地中のグルコース濃度の経時変化を測定した。細胞の培地は、１週間に３回交換した。また、培地の交換量を変化させて比較した。
（培地中のグルコース濃度の経時変化の検討）
ヒト神経細胞を培養した。また、この過程で、培地中のグルコース濃度の経時変化を測定した。細胞の培地は、１週間に３回交換した。また、培地の交換量を変化させて比較した。
ヒト神経細胞としては、Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ Ｎｅｕｒｏｎｓ（Ｅｌｉｘｉｒｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用した。
また、細胞培養容器としては、微小電極アレイ（ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ａｒｒａｙ、ＭＥＡ）を有するＭＥＡプレート（型番「Ｍ７６８−ｔＭＥＡ−４８Ｗ」、Ａｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。ＭＥＡプレートの培養面をポリエチレンイミン（ＰＥＩ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）及びラミニン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）でコートして使用した。培養容器１ウェルあたりの容量は３００μＬであった。
神経細胞の播種日（０ ｄａｙｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ、以下、「ＤＩＶ０」という場合がある。）から、５日目（以下、「ＤＩＶ５」という場合があり、以下同様である。）までは、培地として、製品名「Ｑｕｉｃｋ−Ｎｅｕｒｏｎ（ＴＭ） ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍ」（Ｅｌｉｘｉｒｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用した。この培地中のグルコース濃度は５ｇ／Ｌであった。ＤＩＶ６以降は、培地として、製品名「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｂｒａｉｎｐｙｓ Ｍｅｄｉｕｍ」（ＣＤＩ社）を使用した。この培地中のグルコース濃度は０．５ｇ／Ｌであった。
培地の交換は次のようにして行った。まず、培養容器から、１回あたり、２５０μＬ、１５０μＬ又は５０μＬの培地を吸引した。続いて、吸引した培地と等容量の新しい培地を添加した。培地の交換は１週間に３回行った。吸引した培地は、グルコース濃度の測定に使用した。グルコース濃度の測定には、培地成分解析装置である、ＦＬＥＸ２（ノババイオメディカル社）を使用した。
図１は、培地中のグルコース濃度の経時変化を測定した結果を示すグラフである。横軸は、神経細胞の播種からの培養日数を示し、縦軸は培地中のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）を示す。
その結果、１週間に３回、１回あたり５０μＬの培地を交換した場合に培地中のグルコース濃度が最も高く維持されたことが明らかとなった。１回あたり５０μＬの培地を交換した場合、神経細胞の播種から２２日目における培地中のグルコース濃度は約１．４ｇ／Ｌであった。また、神経細胞の播種から４０日目における培地中のグルコース濃度は約０．２ｇ／Ｌであった。
一方、１週間に３回、１回あたり１５０μＬの培地を交換した場合、神経細胞の播種から２２日目における培地中のグルコース濃度は約０．４ｇ／Ｌであった。また、神経細胞の播種から４０日目における培地中のグルコース濃度は約０ｇ／Ｌであった。
また、１週間に３回、１回あたり２５０μＬの培地を交換した場合、神経細胞の播種から２２日目における培地中のグルコース濃度は約０．３ｇ／Ｌであった。また、神経細胞の播種から４０日目における培地中のグルコース濃度は約０ｇ／Ｌであった。
［実験例２］
（神経細胞の凝集レベルの検討）
実験例１で培養した各神経細胞を顕微鏡で観察し、その凝集レベルを評価した。凝集レベルの評価基準は以下の通りであった。凝集レベルが高くなるほど、神経細胞と培養面との接着面積が小さくなり、神経細胞が培養面から剥離する傾向が認められた。
（神経細胞の凝集レベルの検討）
実験例１で培養した各神経細胞を顕微鏡で観察し、その凝集レベルを評価した。凝集レベルの評価基準は以下の通りであった。凝集レベルが高くなるほど、神経細胞と培養面との接着面積が小さくなり、神経細胞が培養面から剥離する傾向が認められた。
《凝集レベルの評価基準》
１：神経細胞と培養面との接着面積が、神経細胞８０，０００個あたり３．１４ｍｍ２以上２８．２ｍｍ２以下であった。
２：神経細胞と培養面との接着面積が、神経細胞８０，０００個あたり０．９４９ｍｍ２以上３．１４ｍｍ２未満であった。
３：神経細胞と培養面との接着面積が、神経細胞８０，０００個あたり０．１９６ｍｍ２以上０．９４９ｍｍ２未満であった。
４：神経細胞と培養面との接着面積が、神経細胞８０，０００個あたり０ｍｍ２以上０．１９６ｍｍ２未満であった。
１：神経細胞と培養面との接着面積が、神経細胞８０，０００個あたり３．１４ｍｍ２以上２８．２ｍｍ２以下であった。
２：神経細胞と培養面との接着面積が、神経細胞８０，０００個あたり０．９４９ｍｍ２以上３．１４ｍｍ２未満であった。
３：神経細胞と培養面との接着面積が、神経細胞８０，０００個あたり０．１９６ｍｍ２以上０．９４９ｍｍ２未満であった。
４：神経細胞と培養面との接着面積が、神経細胞８０，０００個あたり０ｍｍ２以上０．１９６ｍｍ２未満であった。
図２（ａ）〜（ｃ）は、神経細胞の播種から５３日目（ＤＩＶ５３）の各神経細胞の代表的な顕微鏡写真である。図２（ａ）は、１週間に３回、１回あたり２５０μＬの培地を交換した神経細胞の顕微鏡写真であり、図２（ｂ）は、１週間に３回、１回あたり１５０μＬの培地を交換した神経細胞の顕微鏡写真であり、図２（ｃ）は、１週間に３回、１回あたり５０μＬの培地を交換した神経細胞の顕微鏡写真である。
その結果、１週間に３回、１回あたり２５０μＬの培地を交換した神経細胞のＤＩＶ５３における凝集レベルは４であった。また、１週間に３回、１回あたり１５０μＬの培地を交換した神経細胞のＤＩＶ５３における凝集レベルは３であった。また、１週間に３回、１回あたり５０μＬの培地を交換した神経細胞のＤＩＶ５３における凝集レベルは１であった。
この結果から、培地中のグルコース濃度が高く維持された条件で培養した神経細胞は、凝集レベルが低い傾向にあることが明らかとなった。より具体的には、神経細胞の播種から２２日目における培地中のグルコース濃度が１ｇ／Ｌ以上である神経細胞は、凝集レベルが低い傾向にあることが明らかとなった。更に、神経細胞の播種から４０日目における培地中のグルコース濃度が０．２ｇ／Ｌ以上である神経細胞は、凝集レベルが低い傾向にあることが明らかとなった。
［実験例３］
（神経細胞の凝集レベルと活動電位の検討）
実験例１と同様にして、神経細胞の播種から４２日間培養した神経細胞を顕微鏡で観察し、その凝集レベルを評価した。凝集レベルの評価基準は実験例２と同様であった。また、微小電極アレイを用いて各神経細胞の活動電位を測定し評価した。活動電位の評価基準は以下の通りとし、活動電位の検出可否を判定した。
（神経細胞の凝集レベルと活動電位の検討）
実験例１と同様にして、神経細胞の播種から４２日間培養した神経細胞を顕微鏡で観察し、その凝集レベルを評価した。凝集レベルの評価基準は実験例２と同様であった。また、微小電極アレイを用いて各神経細胞の活動電位を測定し評価した。活動電位の評価基準は以下の通りとし、活動電位の検出可否を判定した。
《活動電位の評価基準》
Ａ：活動電位を良好に検出することができた。
Ｂ：活動電位を検出することができた。
Ｃ：活動電位を検出することができなかった。
Ａ：活動電位を良好に検出することができた。
Ｂ：活動電位を検出することができた。
Ｃ：活動電位を検出することができなかった。
図３（ａ）は、凝集レベル１と評価された神経細胞の代表的な顕微鏡写真である。図３（ｂ）は、凝集レベル２と評価された神経細胞の代表的な顕微鏡写真である。図３（ｃ）は、凝集レベル３と評価された神経細胞の代表的な顕微鏡写真である。図３（ｄ）は、凝集レベル４と評価された神経細胞の代表的な顕微鏡写真である。また、下記表１に、凝集レベルと活動電位の評価結果を示す。
その結果、凝集レベル１と評価された神経細胞を用いると、活動電位を良好に検出することができることが明らかとなった。
［実験例４］
（神経細胞の凝集レベルの経時変化の検討）
実験例１と同様にして培養した各神経細胞の凝集レベルの経時変化を観察した。凝集レベルの評価基準は実験例２と同様であった。
（神経細胞の凝集レベルの経時変化の検討）
実験例１と同様にして培養した各神経細胞の凝集レベルの経時変化を観察した。凝集レベルの評価基準は実験例２と同様であった。
図４は、１週間に３回、１回あたり２５０μＬ、１５０μＬ又は５０μＬの培地を交換した神経細胞の凝集レベルの経時変化を示すグラフである。その結果、１週間に３回、１回あたり５０μＬの培地を交換した神経細胞は、神経細胞の播種から５６日目においても凝集レベル１を維持したことが明らかとなった。
一方、１週間に３回、１回あたり１５０μＬの培地を交換した神経細胞は、神経細胞の播種から３８日目以降に凝集レベルの上昇が認められた。また、１週間に３回、１回あたり２５０μＬの培地を交換した神経細胞は、神経細胞の播種から３１日目以降に凝集レベルの上昇が認められた。
この結果は、培地中のグルコース濃度が低いほど、神経細胞の凝集レベルが上昇する傾向にあることを示す。従来、１週間に３回、１回あたり１５０μＬの培地を交換する神経細胞の培養条件が一般的に採用されている。これに対し、１週間に３回、１回あたり５０μＬの培地を交換する神経細胞の培養条件の方が、神経細胞の凝集レベルを低く維持することができることが明らかになった。
［実験例５］
（培地中のグルコース濃度と神経細胞の凝集レベルとの関連性の検討）
実験例１と同様にして、培地の交換量を様々に変化させて神経細胞を培養した。そして、神経細胞の播種から２２日目（ＤＩＶ２２）における神経細胞の培地中のグルコース濃度と、神経細胞の播種から、それぞれ、３１日目（ＤＩＶ３１）、３８日目（ＤＩＶ３８）、４５日目（ＤＩＶ４５）、５６日目（ＤＩＶ５６）における神経細胞の凝集レベルとの関連性を検討した。
（培地中のグルコース濃度と神経細胞の凝集レベルとの関連性の検討）
実験例１と同様にして、培地の交換量を様々に変化させて神経細胞を培養した。そして、神経細胞の播種から２２日目（ＤＩＶ２２）における神経細胞の培地中のグルコース濃度と、神経細胞の播種から、それぞれ、３１日目（ＤＩＶ３１）、３８日目（ＤＩＶ３８）、４５日目（ＤＩＶ４５）、５６日目（ＤＩＶ５６）における神経細胞の凝集レベルとの関連性を検討した。
図５は、検討結果を示すグラフである。図５中、横軸は、ＤＩＶ２２における神経細胞の培地中のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）を示し、縦軸は、実験例２と同様の評価基準で評価した神経細胞の凝集レベルを示す。
その結果、神経細胞の播種から２２日目（ＤＩＶ２２）における神経細胞の培地中のグルコース濃度が１ｇ／Ｌ以上であると、３１日目（ＤＩＶ３１）、３８日目（ＤＩＶ３８）、４５日目（ＤＩＶ４５）、５６日目（ＤＩＶ５６）においても神経細胞の凝集レベルが低く維持される傾向にあることが明らかとなった。
一方、神経細胞の播種から２２日目（ＤＩＶ２２）における神経細胞の培地中のグルコース濃度が１ｇ／Ｌ未満であると、３１日目（ＤＩＶ３１）、３８日目（ＤＩＶ３８）、４５日目（ＤＩＶ４５）、５６日目（ＤＩＶ５６）における神経細胞の凝集レベルが上昇していく傾向にあることが明らかとなった。
本発明は、以下の態様を含む。
［１］細胞含有容器であって、神経細胞及び培地を含み、前記神経細胞は、前記細胞含有容器の培養面に接着しており、前記神経細胞と前記培養面との接着面積は、前記神経細胞８０，０００個あたり０．５ｍｍ２以上であり、前記培地中のグルコースの濃度は１ｇ／Ｌ以上である、細胞含有容器。
［２］前記培養面に電極アレイが配置されている、［１］に記載の細胞含有容器。
［３］前記神経細胞は、幹細胞由来神経細胞である、［１］又は［２］に記載の細胞含有容器。
［４］前記幹細胞は、ヒト細胞である、［３］に記載の細胞含有容器。
［５］神経細胞及び培地を収容した容器を、所定のタイミングで前記培地を交換しながら、培養条件下でインキュベートする工程を含み、前記培地中のグルコースの濃度を所定期間１ｇ／Ｌ以上に維持する、細胞含有容器の製造方法。
［６］前記インキュベートする工程が３０日間以上行われる、［５］に記載の製造方法。
［７］前記神経細胞は、前記細胞含有容器の培養面に接着しており、前記神経細胞と前記培養面との接着面積は、前記神経細胞８０，０００個あたり３ｍｍ２以上である、［５］又は［６］に記載の製造方法。
［８］前記培養面に電極アレイが配置されている、［７］に記載の製造方法。
［９］前記神経細胞は、幹細胞由来神経細胞である、［５］〜［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］前記幹細胞は、ヒト細胞である、［９］に記載の製造方法。
［１］細胞含有容器であって、神経細胞及び培地を含み、前記神経細胞は、前記細胞含有容器の培養面に接着しており、前記神経細胞と前記培養面との接着面積は、前記神経細胞８０，０００個あたり０．５ｍｍ２以上であり、前記培地中のグルコースの濃度は１ｇ／Ｌ以上である、細胞含有容器。
［２］前記培養面に電極アレイが配置されている、［１］に記載の細胞含有容器。
［３］前記神経細胞は、幹細胞由来神経細胞である、［１］又は［２］に記載の細胞含有容器。
［４］前記幹細胞は、ヒト細胞である、［３］に記載の細胞含有容器。
［５］神経細胞及び培地を収容した容器を、所定のタイミングで前記培地を交換しながら、培養条件下でインキュベートする工程を含み、前記培地中のグルコースの濃度を所定期間１ｇ／Ｌ以上に維持する、細胞含有容器の製造方法。
［６］前記インキュベートする工程が３０日間以上行われる、［５］に記載の製造方法。
［７］前記神経細胞は、前記細胞含有容器の培養面に接着しており、前記神経細胞と前記培養面との接着面積は、前記神経細胞８０，０００個あたり３ｍｍ２以上である、［５］又は［６］に記載の製造方法。
［８］前記培養面に電極アレイが配置されている、［７］に記載の製造方法。
［９］前記神経細胞は、幹細胞由来神経細胞である、［５］〜［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］前記幹細胞は、ヒト細胞である、［９］に記載の製造方法。
Claims (10)
- 細胞含有容器であって、
神経細胞及び培地を含み、
前記神経細胞は、前記細胞含有容器の培養面に接着しており、
前記神経細胞と前記培養面との接着面積は、前記神経細胞８０，０００個あたり０．５ｍｍ２以上であり、
前記培地中のグルコースの濃度は１ｇ／Ｌ以上である、
細胞含有容器。 - 前記培養面に電極アレイが配置されている、請求項１に記載の細胞含有容器。
- 前記神経細胞は、幹細胞由来神経細胞である、請求項１又は２に記載の細胞含有容器。
- 前記幹細胞は、ヒト細胞である、請求項３に記載の細胞含有容器。
- 神経細胞及び培地を収容した容器を、所定のタイミングで前記培地を交換しながら、培養条件下でインキュベートする工程を含み、
前記培地中のグルコースの濃度を所定期間１ｇ／Ｌ以上に維持する、
細胞含有容器の製造方法。 - 前記インキュベートする工程が３０日間以上行われる、請求項５に記載の製造方法。
- 前記神経細胞は、前記細胞含有容器の培養面に接着しており、
前記神経細胞と前記培養面との接着面積は、前記神経細胞８０，０００個あたり３ｍｍ２以上である、請求項５又は６に記載の製造方法。 - 前記培養面に電極アレイが配置されている、請求項７に記載の製造方法。
- 前記神経細胞は、幹細胞由来神経細胞である、請求項５〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記幹細胞は、ヒト細胞である、請求項９に記載の製造方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US17/198,474 US20210301240A1 (en) | 2020-03-30 | 2021-03-11 | Cell-containing container and method for producing same |
| CN202110267268.1A CN113462647A (zh) | 2020-03-30 | 2021-03-12 | 细胞容纳容器及其生产方法 |
| EP21163365.6A EP3901245A1 (en) | 2020-03-30 | 2021-03-18 | Cell container and method for producing same |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020061251 | 2020-03-30 | ||
| JP2020061251 | 2020-03-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021159073A true JP2021159073A (ja) | 2021-10-11 |
Family
ID=78003939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021010564A Pending JP2021159073A (ja) | 2020-03-30 | 2021-01-26 | 細胞含有容器及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2021159073A (ja) |
-
2021
- 2021-01-26 JP JP2021010564A patent/JP2021159073A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Guo et al. | Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse | |
| Przybyla et al. | Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia | |
| Park et al. | Real‐Time Monitoring of Neural Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Electric Cell‐Substrate Impedance Sensing | |
| Ai et al. | DNA methylation profile is associated with the osteogenic potential of three distinct human odontogenic stem cells | |
| CN107438669A (zh) | 用于治疗神经退行性疾病的干细胞衍生多巴胺能细胞的生产方法和组合物 | |
| WO2017115865A1 (ja) | 幹細胞の凝集塊の集団の調製方法 | |
| CN106574248A (zh) | 由源自多能干细胞的细胞形成的神经网络 | |
| JPWO2014199622A1 (ja) | 組織構造体及びその作製方法 | |
| KR20070018738A (ko) | 층분리배양법을 이용한 골수에서의 중간엽 줄기세포분리방법 | |
| CN105283541B (zh) | 干细胞培养用培养基 | |
| Sozzi et al. | Silk scaffolding drives self-assembly of functional and mature human brain organoids | |
| CN106715683A (zh) | 间充质干细胞用培养基 | |
| Abbasi et al. | Mesenchymal stem cell behavior on soft hydrogels with aligned surface topographies | |
| CN101336293A (zh) | 用于鉴定细胞信号转导调节物的方法 | |
| JP2021159073A (ja) | 細胞含有容器及びその製造方法 | |
| US20210301240A1 (en) | Cell-containing container and method for producing same | |
| Marom et al. | Spontaneous activity characteristics of 3D “optonets” | |
| Amărandi et al. | Advantages of graphene biosensors for human stem cell therapy potency assays | |
| Phillips et al. | Developing HiPSC derived serum free embryoid bodies for the interrogation of 3-D stem cell cultures using physiologically relevant assays | |
| JP2021185780A (ja) | 細胞含有容器の製造方法 | |
| CN115948339A (zh) | 高通量气液交界法培养神经胶质瘤类器官的方法 | |
| EP4159844A1 (en) | Cell containing structure | |
| JPWO2006057444A1 (ja) | 細胞の分化度自動診断方法 | |
| EP4379044A1 (en) | Cell culture method, cell culture container, method for producing cell culture container, and cell-containing structure | |
| JP2023051793A (ja) | 細胞含有構造物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20231114 |