JP2021141861A - Method for screening and producing antibody with improved affinity to antigen - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗原に対する親和力が向上した抗体のスクリーニング方法、抗原に対する親和力が向上した抗体の製造方法、抗体の抗原に対する親和力を向上させる方法およびコルチゾールに対する親和力が向上した抗コルチゾール抗体に関するものである。 The present invention relates to a method for screening an antibody having an improved affinity for an antigen, a method for producing an antibody having an improved affinity for an antigen, a method for improving the affinity of an antibody for an antigen, and an anti-cortisol antibody having an improved affinity for cortisol.
抗体は、医療分野において癌や自己免疫疾患の治療薬として使用されている。一方、抗体は、診断・分析試薬としても不可欠である。抗体を用いる微量測定法は「免疫測定法（イムノアッセイ）」と称され、生体試料のような複雑な組成のマトリックスに含まれる極微量の標的分子を定量するうえで不可欠の方法論である。免疫測定法の感度に影響する因子として、用いる抗体の標的抗原に対する結合親和力が極めて重要である。一般に、結合定数（Ka）が大きいほど、換言すれば解離定数Kd（=1/Ka）が小さいほど高感度な測定が可能になる。 Antibodies are used as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases in the medical field. On the other hand, antibodies are also indispensable as diagnostic / analytical reagents. The micromeasurement method using an antibody is called an "immunoassay" and is an indispensable methodology for quantifying a trace amount of a target molecule contained in a matrix having a complicated composition such as a biological sample. As a factor affecting the sensitivity of immunoassay, the binding affinity of the antibody used to the target antigen is extremely important. In general, the larger the coupling constant (Ka), in other words, the smaller the dissociation constant Kd (= 1 / Ka), the more sensitive the measurement becomes.
従来、抗体のアミノ酸配列に変異を導入することにより、抗体の機能を改変する技術が知られている。例えば、特許文献１には、抗体の相補性決定領域（CDR）のアミノ酸配列に変異を導入して、抗原に対する親和性を低下させる方法が記載されている。また、特許文献２には、抗体のＨ鎖可変部および／またはＬ鎖可変領部のアミノ酸配列に変異を導入して、親抗体より安定性および／または可溶性が改善された抗体を提供する技術が記載されている。
Conventionally, a technique for modifying the function of an antibody by introducing a mutation into the amino acid sequence of the antibody has been known. For example,
本発明は、既知の抗体のＨ鎖可変部のフレームワーク領域１のアミノ酸置換またはアミノ酸挿入により、元の抗体より抗原に対する親和力が向上した抗体をスクリーニングする方法および製造する方法を提供することを課題とする。さらに本発明は、抗体の抗原に対する親和力を向上させる方法および抗原に対する親和力が向上した抗体を提供することを課題とする。
An object of the present invention is to provide a method for screening and producing an antibody having an improved affinity for an antigen compared to the original antibody by amino acid substitution or amino acid insertion in the
本発明は、上記の課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］元の抗体より抗原に対する親和力が向上した抗体をスクリーニングする方法であって、
（１−１）元の抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク領域１の１番目〜３番目、５番目〜７番目、９番目および１０番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸を置換して改変抗体を作製する工程、または
（１−２）元の抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク領域１の４番目と５番目のアミノ酸の間、５番目と６番目のアミノ酸の間、６番目と７番目のアミノ酸の間および７番目と８番目のアミノ酸の間から選択される１か所以上の位置に、合計１個以上６個以下のアミノ酸を挿入して改変抗体を作製する工程、
（２）前記改変抗体の抗原に対する親和力を測定する工程、ならびに
（３）前記工程（２）で測定した改変抗体の抗原に対する親和力と元の抗体の抗原に対する親和力を比較して、抗原に対する親和力が向上した改変抗体を選択する工程
を含む、スクリーニング方法。
［２］前記工程（１−１）で作製された改変抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク領域１の１番目のアミノ酸がグルタミン（Ｑ）またはグルタミン酸（Ｅ）であり、２番目のアミノ酸がバリン（Ｖ）またはイソロイシン（Ｉ）であり、３番目のアミノ酸がグルタミン（Ｑ）またはリシン（Ｋ）であり、４番目のアミノ酸がロイシン（Ｌ）であり、５番目のアミノ酸がグルタミン（Ｑ）、リシン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、グルタミン酸（Ｅ）またはバリン（Ｖ）であり、６番目のアミノ酸がグルタミン（Ｑ）またはグルタミン酸（Ｅ）であり、７番目のアミノ酸がプロリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）であり、８番目のアミノ酸がグリシン（Ｇ）であり、９番目のアミノ酸がアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、アルギニン（Ｒ）またはプロリン（Ｐ）であり、１０番目のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはグリシン（Ｇ）である、前記［１］に記載のスクリーニング方法。
［３］前記抗原がハプテンである、前記［１］または［２］に記載のスクリーニング方法。
［４］前記元の抗体におけるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）が、Ｋａｂａｔのマウス抗体Ｈ鎖可変部（ＶＨドメイン）のサブグループＩＩ（Ａ）、ＩＩ（Ｂ）またはＩＩＩ（Ｄ）に属する、前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
［５］前記（１−１）の改変抗体を作製する工程を含む、前記［１］〜［４］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［６］前記（１−２）の改変抗体を作製する工程を含む、前記［１］〜［４］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［７］元の抗体より抗原に対する親和力が向上した抗体を製造する方法であって、
（ａ１）元の抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク領域１の１番目〜３番目、５番目〜７番目、９番目および１０番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸を置換して改変抗体を作製する工程、または
（ａ２）元の抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク領域１の４番目と５番目のアミノ酸の間、５番目と６番目のアミノ酸の間、６番目と７番目のアミノ酸の間および７番目と８番目のアミノ酸の間から選択される１か所以上の位置に、合計１個以上６個以下のアミノ酸を挿入して改変抗体を作製する工程、
（ｂ）前記改変抗体の抗原に対する親和力を測定する工程、ならびに
（ｃ）前記工程（ｂ）で測定した改変抗体の抗原に対する親和力と元の抗体の抗原に対する親和力を比較して、抗原に対する親和力が向上した改変抗体を選択する工程
を含む、製造方法。
［８］前記工程（ａ１）で作製された改変抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク領域１の１番目のアミノ酸がグルタミン（Ｑ）またはグルタミン酸（Ｅ）であり、２番目のアミノ酸がバリン（Ｖ）またはイソロイシン（Ｉ）であり、３番目のアミノ酸がグルタミン（Ｑ）またはリシン（Ｋ）であり、４番目のアミノ酸がロイシン（Ｌ）であり、５番目のアミノ酸がグルタミン（Ｑ）、リシン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、グルタミン酸（Ｅ）またはバリン（Ｖ）であり、６番目のアミノ酸がグルタミン（Ｑ）またはグルタミン酸（Ｅ）であり、７番目のアミノ酸がプロリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）であり、８番目のアミノ酸がグリシン（Ｇ）であり、９番目のアミノ酸がアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、アルギニン（Ｒ）またはプロリン（Ｐ）であり、１０番目のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはグリシン（Ｇ）である、前記［７］に記載の製造方法。
［９］前記抗原がハプテンである、前記［７］または［８］に記載の製造方法。
［１０］前記元の抗体におけるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）が、Ｋａｂａｔのマウス抗体Ｈ鎖可変部（ＶＨドメイン）のサブグループＩＩ（Ａ）、ＩＩ（Ｂ）またはＩＩＩ（Ｄ）に属する、前記［７］〜［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］前記（ａ１）の改変抗体を作製する工程を含む、前記［７］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］前記（ａ２）の改変抗体を作製する工程を含む、前記［７］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］抗体の抗原に対する親和力を向上させる方法であって、親和力を向上させようとする元の抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク領域１の１番目〜３番目、５番目〜７番目、９番目および１０番目から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸を置換して改変抗体を作製すること、または、親和力を向上させようとする元の抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク領域１の４番目と５番目のアミノ酸の間、５番目と６番目のアミノ酸の間、６番目と７番目のアミノ酸の間もしくは７番目と８番目のアミノ酸の間から選択される１か所以上の位置に、合計１個以上６個以下のアミノ酸を挿入して改変抗体を作製することを含む方法。
［１４］前記改変抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク領域１の１番目のアミノ酸がグルタミン（Ｑ）またはグルタミン酸（Ｅ）であり、２番目のアミノ酸がバリン（Ｖ）またはイソロイシン（Ｉ）であり、３番目のアミノ酸がグルタミン（Ｑ）またはリシン（Ｋ）であり、４番目のアミノ酸がロイシン（Ｌ）であり、５番目のアミノ酸がグルタミン（Ｑ）、リシン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、グルタミン酸（Ｅ）またはバリン（Ｖ）であり、６番目のアミノ酸がグルタミン（Ｑ）またはグルタミン酸（Ｅ）であり、７番目のアミノ酸がプロリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）であり、８番目のアミノ酸がグリシン（Ｇ）であり、９番目のアミノ酸がアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、アルギニン（Ｒ）またはプロリン（Ｐ）であり、１０番目のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）またはグリシン（Ｇ）である、前記［１３］に記載の方法。
［１５］前記抗原がハプテンである、前記［１３］または［１４］に記載の方法。
［１６］前記元の抗体におけるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）が、Ｋａｂａｔのマウス抗体Ｈ鎖可変部（ＶＨドメイン）のサブグループＩＩ（Ａ）、ＩＩ（Ｂ）またはＩＩＩ（Ｄ）に属する、前記［１３］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］親和力を向上させようとする元の抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク領域１の１番目〜３番目、５番目〜７番目、９番目および１０番目から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸を置換して改変抗体を作製することを含む方法である、前記［１３］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］親和力を向上させようとする元の抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク領域１の４番目と５番目のアミノ酸の間、５番目と６番目のアミノ酸の間、６番目と７番目のアミノ酸の間もしくは７番目と８番目のアミノ酸の間から選択される１か所以上の位置に、合計１個以上６個以下のアミノ酸を挿入して改変抗体を作製することを含む方法である、前記［１３］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１９］配列番号１〜１６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列からなるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）および配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるＬ鎖可変部（ＶＬドメイン）を有し、コルチゾールに対する親和力が向上した抗コルチゾール抗体。
［２０］コルチゾールに対する結合定数Ｋａが５×１０９Ｍ−１以上である前記［１９］に記載の抗コルチゾール抗体。
［２１］低分子抗体である前記［１９］または［２０］に記載の抗体。
The present invention includes the following inventions in order to solve the above problems.
[1] A method for screening an antibody having an improved affinity for an antigen compared to the original antibody.
(1-1) From the 1st to 3rd, 5th to 7th, 9th and 10th amino acids of the
(2) The step of measuring the affinity of the modified antibody for the antigen, and (3) the affinity of the modified antibody measured in the step (2) for the antigen is compared with the affinity of the original antibody for the antigen, and the affinity for the antigen is determined. A screening method comprising the step of selecting an improved modified antibody.
[2] The first amino acid in the framework region 1 of the H chain variable part (VH domain) defined by the Kabat method in the modified antibody prepared in the above step (1-1) is glutamine (Q) or glutamic acid (Glutamic acid (Q)). E), the second amino acid is valine (V) or isoleucine (I), the third amino acid is glutamine (Q) or lysine (K), and the fourth amino acid is leucine (L). The fifth amino acid is glutamine (Q), lysine (K), isoleucine (I), leucine (L), glutamic acid (E) or valine (V), and the sixth amino acid is glutamine (Q) or glutamic acid ( E), the 7th amino acid is proline (P) or serine (S), the 8th amino acid is glycine (G), and the 9th amino acid is alanine (A), glycine (G), arginine. The screening method according to the above [1], wherein (R) or proline (P) and the 10th amino acid is glutamic acid (E) or glycine (G).
[3] The screening method according to the above [1] or [2], wherein the antigen is a hapten.
[4] The H chain variable part ( VH domain) in the original antibody is divided into subgroups II (A), II (B) or III (D) of the mouse antibody H chain variable part ( VH domain) of Kabat. The screening method according to any one of the above [1] to [3], to which the screening method belongs.
[5] The screening method according to any one of [1] to [4] above, which comprises the step of producing the modified antibody according to (1-1).
[6] The screening method according to any one of [1] to [4] above, which comprises the step of producing the modified antibody according to (1-2).
[7] A method for producing an antibody having an improved affinity for an antigen compared to the original antibody.
(A1) Selected from the 1st to 3rd, 5th to 7th, 9th and 10th amino acids of the
The affinity for the antigen is determined by comparing (b) the step of measuring the affinity of the modified antibody with respect to the antigen, and (c) the affinity of the modified antibody measured in the step (b) with respect to the antigen of the original antibody. A production method comprising the step of selecting an improved modified antibody.
[8] The first amino acid in the framework region 1 of the H chain variable portion (VH domain) defined by the Kabat method in the modified antibody prepared in the step (a1) is glutamine (Q) or glutamic acid (E). The second amino acid is valine (V) or isoleucine (I), the third amino acid is glutamine (Q) or lysine (K), the fourth amino acid is leucine (L), and 5 The sixth amino acid is glutamine (Q), lysine (K), isoleucine (I), leucine (L), glutamic acid (E) or valine (V), and the sixth amino acid is glutamine (Q) or glutamic acid (E). The 7th amino acid is proline (P) or serine (S), the 8th amino acid is glycine (G), and the 9th amino acid is alanine (A), glycine (G), arginine (R). ) Or proline (P), and the 10th amino acid is glutamic acid (E) or glycine (G), according to the production method according to the above [7].
[9] The production method according to the above [7] or [8], wherein the antigen is a hapten.
[10] The H chain variable part ( VH domain) in the original antibody is divided into subgroups II (A), II (B) or III (D) of the mouse antibody H chain variable part ( VH domain) of Kabat. The production method according to any one of the above [7] to [9], to which the product belongs.
[11] The production method according to any one of [7] to [10] above, which comprises the step of producing the modified antibody according to (a1).
[12] The production method according to any one of [7] to [10] above, which comprises the step of producing the modified antibody according to (a2).
[13] A method for improving the affinity of an antibody for an antigen, which is the first of the
[14] The first amino acid in the framework region 1 of the H chain variable region (VH domain) defined by the Kabat method in the modified antibody is glutamine (Q) or glutamic acid (E), and the second amino acid is Valin (V) or isoleucine (I), the third amino acid is glutamine (Q) or lysine (K), the fourth amino acid is leucine (L), and the fifth amino acid is glutamine (Q). , Ricin (K), isoleucine (I), leucine (L), glutamic acid (E) or valine (V), the sixth amino acid is glutamine (Q) or glutamic acid (E), and the seventh amino acid is Proline (P) or serine (S), the 8th amino acid is glycine (G), and the 9th amino acid is alanine (A), glycine (G), arginine (R) or proline (P). The method according to the above [13], wherein the 10th amino acid is glutamate (E) or glycine (G).
[15] The method according to [13] or [14] above, wherein the antigen is a hapten.
[16] The H chain variable portion ( VH domain) of the original antibody is divided into subgroups II (A), II (B) or III (D) of the mouse antibody H chain variable portion ( VH domain) of Kabat. The method according to any one of the above [13] to [15], to which the product belongs.
[17] The 1st to 3rd, 5th to 7th, 9th and 9th of the
[18] Between the 4th and 5th amino acids of the
[19] An H chain variable portion (VH domain) consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 16 and an L chain variable portion (VL domain) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 An anti-cortisol antibody that has an improved affinity for cortisol.
[20] The anti-cortisol antibody according to the above [19], wherein the binding constant Ka to cortisol is 5 × 10 9 M -1 or more.
[21] The antibody according to the above [19] or [20], which is a small molecule antibody.
本発明により、既知の抗体のＨ鎖可変部のフレームワーク領域１のアミノ酸置換またはアミノ酸挿入により、元の抗体より抗原に対する親和力が向上した抗体をスクリーニングする方法および製造する方法を提供することができる。また、本発明により、抗体の抗原に対する親和力を向上させる方法および抗原に対する親和力が向上した抗コルチゾール抗体を提供することができる。
INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide a method for screening and producing an antibody having improved affinity for an antigen than the original antibody by amino acid substitution or amino acid insertion in the
〔スクリーニング方法、製造方法〕
本発明は、元の抗体より抗原に対する親和力が向上した抗体のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、以下の工程を含むものであればよい。
（１−１）元の抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク領域１の１番目〜３番目、５番目〜７番目、９番目および１０番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸を置換して変異体を作製する工程、または
（１−２）元の抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク領域１の４番目と５番目のアミノ酸の間、５番目と６番目のアミノ酸の間、６番目と７番目のアミノ酸の間および７番目と８番目のアミノ酸の間から選択される１か所以上の位置に、合計１個以上６個以下のアミノ酸を挿入して変異体を作製する工程、
（２）前記変異体の抗原に対する親和力を測定する工程、ならびに
（３）前記工程（２）で測定した変異体の抗原に対する親和力と元の抗体の抗原に対する親和力を比較して、抗原に対する親和力が向上した変異体を選択する工程。
[Screening method, manufacturing method]
The present invention provides a method for screening an antibody having an improved affinity for an antigen compared to the original antibody. The screening method of the present invention may include the following steps.
(1-1) From the 1st to 3rd, 5th to 7th, 9th and 10th amino acids of the
(2) The step of measuring the affinity of the mutant for the antigen, and (3) the affinity of the mutant measured in the step (2) for the antigen is compared with the affinity of the original antibody for the antigen, and the affinity for the antigen is determined. The step of selecting an improved variant.
本発明は、元の抗体より抗原に対する親和力が向上した抗体の製造方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、以下の工程を含むものであればよい。
（ａ１）元の抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク領域１の１番目〜３番目、５番目〜７番目、９番目および１０番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸を置換して改変抗体を作製する工程、または
（ａ２）元の抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク１の４番目と５番目のアミノ酸の間、５番目と６番目のアミノ酸の間、６番目と７番目のアミノ酸の間および７番目と８番目のアミノ酸の間から選択される１か所以上の位置に、合計１個以上６個以下のアミノ酸を挿入して改変抗体を作製する工程、
（ｂ）前記工程ａ１または工程ａ２で得られた抗体の抗原に対する親和力を測定する工程、ならびに
（ｃ）前記工程ｂで測定した親和力と元の抗体の抗原に対する親和力を比較して、抗原に対する親和力が向上した抗体を選択する工程
The present invention provides a method for producing an antibody having an improved affinity for an antigen as compared with the original antibody. The screening method of the present invention may include the following steps.
(A1) Selected from the 1st to 3rd, 5th to 7th, 9th and 10th amino acids of the
(B) The step of measuring the affinity of the antibody obtained in the step a1 or the step a2 for the antigen, and (c) the affinity of the original antibody for the antigen by comparing the affinity measured in the step b with the affinity for the antigen. Steps to select antibodies with improved
本明細書において、「Kabat法で定義される」とは、抗体の可変部のアミノ酸残基の番号付けが、Kabatらによるナンバリング・スキーム（Kabat EA et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest; U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, U. S. Government Printing Office: Washington, DC, (1991)）に従うことをいう。 As used herein, "defined by the Kabat method" means that the numbering of amino acid residues in the variable part of an antibody is defined by Kabat et al. (Kabat EA et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest; US). Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, US Government Printing Office: Washington, DC, (1991)).
元の抗体は、少なくとも、VHドメインのフレームワーク領域1（FR1）のアミノ酸配列を確認可能な抗体であればどのような抗体でもよく、天然の抗体であっても人工的に作出された抗体であってもよい。人工的に作出された抗体としては、例えば、天然の抗体のアミノ酸配列に変異（アミノ酸残基の置換、付加または削除）を導入した抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などが挙げられる。元の抗体は、いずれの動物の抗体であってもよく、哺乳動物の抗体であってもよい。哺乳動物としては、例えばヒト、マウス、ウサギ、ラット、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマなどが挙げられ、ヒト、マウスが好ましい。本発明のスクリーニング方法および本発明の製造方法によって得られる抗体は、元の抗体と同じ動物の抗体である。 The original antibody may be at least any antibody capable of confirming the amino acid sequence of framework region 1 (FR1) of the VH domain, and even a natural antibody may be an artificially produced antibody. May be. Examples of the artificially produced antibody include an antibody in which a mutation (substitution, addition or deletion of an amino acid residue) is introduced into the amino acid sequence of a natural antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody and the like. The original antibody may be any animal antibody or a mammalian antibody. Examples of mammals include humans, mice, rabbits, rats, pigs, sheep, goats, camels, cows and horses, with humans and mice being preferred. The antibody obtained by the screening method of the present invention and the production method of the present invention is an antibody of the same animal as the original antibody.
元の抗体は、そのアミノ酸配列が公知であるか、その遺伝子の塩基配列が公知であるかまたは該アミノ酸配列を確認可能な抗体であるか、該塩基配列を確認可能な抗体であってもよい。例えば、公知のデータベースに、抗体遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列が開示されている抗体であってもよく、該抗体を産生するハイブリドーマが入手可能な抗体であってもよい。そのようなデータベースとしては、例えばNational Center for Biotechnology Information（NCBI）により提供されるGeneBankなどが挙げられる。元の抗体を産生するハイブリドーマが入手可能である場合、公知の方法により該ハイブリドーマから抗体遺伝子を取得し、その塩基配列をシーケンシングすることにより抗体遺伝子の塩基配列を得ることができる。 The original antibody may be an antibody whose amino acid sequence is known, the base sequence of the gene is known, the amino acid sequence can be confirmed, or an antibody whose base sequence can be confirmed. .. For example, it may be an antibody in which the base sequence or amino acid sequence of an antibody gene is disclosed in a known database, or an antibody in which a hybridoma producing the antibody is available. Such databases include, for example, GeneBank provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI). When a hybridoma that produces the original antibody is available, the antibody gene can be obtained from the hybridoma by a known method and the base sequence of the hybridoma can be sequenced to obtain the base sequence of the antibody gene.
元の抗体は、H鎖可変部（VHドメイン）が、Kabatのマウス抗体H鎖可変部（VHドメイン）のサブグループの何れであってもよく、サブグループII(A)、II(B)またはIII(D)に属するものが好ましい（Kabat EA et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest; U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, U. S. Government Printing Office: Washington, DC, (1991)）。Kabatの該サブグループは、VHドメインのフレームワーク領域の配列類似性に基づくものであり、マウス抗体のVHドメインのフレームワーク領域1（H鎖N末端アミノ酸を1番とするとき1〜30番のアミノ酸からなる）の1〜15番のアミノ酸について、各サブグループの典型的な配列（最も出現頻度が高いアミノ酸を選択して並べた配列）は図2に示されている。
In the original antibody, the H chain variable part (V H domain) may be any of the subgroups of Kabat's mouse antibody H chain variable part (V H domain), and the subgroups II (A) and II (B). ) Or III (D) is preferred (Kabat EA et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest; US Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, US Government Printing Office: Washington, DC, (1991) ). 1-30 when Kabat is of the subgroup, is based on the sequence similarity of the framework regions of the V H domain of the framework regions 1 (H chain N-terminal amino acid No. 1 of the V H domain of the murine antibody A typical sequence of each subgroup (a sequence in which the most frequently occurring amino acids are selected and arranged) for
元の抗体はいずれの抗原を認識する抗体であってもよく、ハプテンを認識する抗体が好ましい。ハプテンは、分子量１万以下の低分子のうち、単独ではヒトまたは動物に対して抗体産生を惹起させるのは困難であるが、タンパク質等の高分子物質と結合することにより抗体産生を惹起しうる物質を意味する。ハプテンとしては、例えば、テストステロン、エストラジオール、エストリオール、コルチゾール等のステロイドホルモン、ガストリン、バソプレシン、アンジオテンシン等の小ペプチドホルモン、モノニトロフェニル基、ジニトロフェニル基、トリニトロフェニル基、フルオレセイン基などを有する化合物（例えば2,4-ジニトロフェノール（DNP））、ジゴキシン、各種低分子合成薬剤等が挙げられる。また、元の抗体は二重特異性抗体であってもよい。 The original antibody may be an antibody that recognizes any antigen, and an antibody that recognizes a hapten is preferable. It is difficult for a hapten to induce antibody production in humans or animals by itself among small molecules having a molecular weight of 10,000 or less, but it can induce antibody production by binding to a high molecular substance such as a protein. Means a substance. Examples of the hapten include steroid hormones such as testosterone, estradiol, estriol and cortisol, small peptide hormones such as gastrin, vasopressin and angiotensin, mononitrophenyl groups, dinitrophenyl groups, trinitrophenyl groups and fluorescein groups. (For example, 2,4-dinitrophenol (DNP)), digoxin, various small molecule synthetic agents and the like can be mentioned. Also, the original antibody may be a bispecific antibody.
本発明のスクリーニング方法の工程（１−１）および本発明の製造方法の工程（ａ１）はいずれも、元の抗体におけるKabat法で定義されるH鎖可変部（VHドメイン）のフレームワーク領域1の1番目〜3番目、5番目〜7番目、9番目および10番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を置換して改変抗体を作製する工程である。 Both the step (1-1) of the screening method of the present invention and the step (a1) of the production method of the present invention are the framework regions of the H chain variable portion (VH domain) defined by the Kabat method in the original antibody. This is a step of producing a modified antibody by substituting at least one amino acid selected from the 1st to 3rd, 5th to 7th, 9th and 10th amino acids of 1.
本発明のスクリーニング方法の工程（１−２）および本発明の製造方法の工程（ａ２）はいずれも、元の抗体におけるKabat法で定義されるH鎖可変部（VHドメイン）のフレームワーク領域1の4番目と5番目のアミノ酸の間、5番目と6番目のアミノ酸の間、6番目と7番目のアミノ酸の間および7番目と8番目のアミノ酸の間から選択される１か所以上の位置に、合計1個以上6個以下のアミノ酸を挿入して改変抗体する工程である。 Both the step (1-2) of the screening method of the present invention and the step (a2) of the production method of the present invention are the framework regions of the H chain variable portion (VH domain) defined by the Kabat method in the original antibody. One or more selected between the 4th and 5th amino acids of 1 and between the 5th and 6th amino acids, between the 6th and 7th amino acids and between the 7th and 8th amino acids This is a step of inserting a total of 1 or more and 6 or less amino acids into the positions to modify the antibody.
本発明のスクリーニング方法の工程（１−１）および本発明の製造方法の工程（ａ１）、並びに本発明のスクリーニング方法の工程（１−２）および本発明の製造方法の工程（ａ２）は、いずれも前記した如き部位の改変（元の抗体におけるKabat法で定義されるH鎖可変部（VHドメイン）のフレームワーク領域1の1番目〜3番目、5番目〜7番目、9番目および10番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を置換、或いは元の抗体におけるKabat法で定義されるH鎖可変部（VHドメイン）のフレームワーク領域1の4番目と5番目のアミノ酸の間、5番目と6番目のアミノ酸の間、6番目と7番目のアミノ酸の間および7番目と8番目のアミノ酸の間から選択される１か所以上の位置に、合計1個以上6個以下のアミノ酸を挿入）以外に変異(アミノ酸残基の置換、付加または削除)を導入して改変を行ってもよいが、前記した如き部位のみを改変するのが好ましい。
The step of the screening method of the present invention (1-1), the step of the manufacturing method of the present invention (a1), the step of the screening method of the present invention (1-2), and the step of the manufacturing method of the present invention (a2) are All of the above-mentioned site modifications (1st to 3rd, 5th to 7th, 9th and 10th of the
アミノ酸置換、アミノ酸挿入等のアミノ酸配列の改変は、公知の遺伝子組換え技術や分子生物学的技術を用いて行うことができる。例えば、公知の部位特異的変異誘導法を用いることができる。例えば、元の抗体を産生するハイブリドーマから抽出したRNAを用いて、逆転写反応およびRACE（Rapid Amplification of cDNA ends）法により、L鎖およびH鎖をそれぞれコードするポリヌクレオチドを合成する。VHドメインのフレームワーク領域1にアミノ酸置換またはアミノ酸挿入を行うためには、H鎖をコードするポリヌクレオチドを鋳型として目的の変異を導入するためのプライマーを用いてPCRを行うことで、目的の変異が導入された改変H鎖ポリヌクレオチドを取得することができる。得られた改変H鎖ポリヌクレオチドを、元の抗体のL鎖をコードするポリヌクレオチドと共に、あるいは両者を連結した後に適切な発現ベクターに組み込むことにより、目的の改変抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが得られる。このような、本発明の製造方法で製造される抗体（目的の改変抗体）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターも、本発明に含まれる。 Modification of the amino acid sequence such as amino acid substitution and amino acid insertion can be performed using a known gene recombination technique or molecular biological technique. For example, a known site-specific mutagenesis method can be used. For example, RNA extracted from a hybridoma that produces the original antibody is used to synthesize polynucleotides encoding L and H chains by reverse transcription and RACE (Rapid Amplification of cDNA ends), respectively. In order to perform amino acid substitution or amino acid insertion in framework region 1 of the V H domain, PCR is performed using a polynucleotide encoding the H chain as a template and a primer for introducing the desired mutation. A modified H-chain polynucleotide into which the mutation has been introduced can be obtained. Expression containing the polynucleotide encoding the desired modified antibody by incorporating the obtained modified H chain polynucleotide together with the polynucleotide encoding the L chain of the original antibody, or by ligating both into an appropriate expression vector. A vector is obtained. Such an expression vector containing a polynucleotide encoding an antibody (a modified antibody of interest) produced by the production method of the present invention is also included in the present invention.
L鎖をコードするポリヌクレオチドおよびH鎖をコードするポリヌクレオチドは、1つの発現ベクターに組み込まれてもよいし、2つの発現ベクターに別個に組み込まれてもよい。発現ベクターの種類は特に限定されず、哺乳動物細胞用発現ベクターであってもよいし、大腸菌用発現ベクターであってもよい。得られた発現ベクターを適当な宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞または大腸菌）にトランスフェクションすることにより、改変抗体を得ることができる。 The polynucleotide encoding the L chain and the polynucleotide encoding the H chain may be integrated into one expression vector or may be integrated into two expression vectors separately. The type of the expression vector is not particularly limited, and it may be an expression vector for mammalian cells or an expression vector for Escherichia coli. Modified antibodies can be obtained by transfecting the resulting expression vector into a suitable host cell (eg, mammalian cell or E. coli).
本発明のスクリーニング方法の工程（２）および本発明の製造方法の工程（ｂ）はいずれも、得られた改変抗体の抗原に対する親和力を測定する工程である。抗体の抗原に対する親和力の測定方法は特に限定されず、公知の方法から適宜選択して用いることができる。例えば、Scatchard解析、表面プラズモン共鳴、Bio-layer interferometry、蛍光消光法、平衡透析法、ELISA等を用いることができる。また、コロニーアレイプロファイリング（colony-array profiling: CAP）法を用いることもできる。 Both the step (2) of the screening method of the present invention and the step (b) of the production method of the present invention are steps of measuring the affinity of the obtained modified antibody with respect to the antigen. The method for measuring the affinity of an antibody for an antigen is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected and used. For example, Scatchard analysis, surface plasmon resonance, Bio-layer interferometry, fluorescence quenching, equilibrium dialysis, ELISA and the like can be used. It is also possible to use the colony-array profiling (CAP) method.
本発明のスクリーニング方法の工程（３）および本発明の製造方法の工程（ｃ）はいずれも、改変抗体の抗原に対する親和力の測定値と元の抗体の抗原に対する親和力を比較して、抗原に対する親和力が向上した改変抗体を選択する工程である。比較対象の元の抗体の抗原に対する親和力を、改変抗体の親和力を測定した方法と同じ方法で測定し、得られた両者の測定値を比較すればよい。また、測定値に基づいて結合定数（Ka）を算出し、結合定数を比較してもよい。 In both the step (3) of the screening method of the present invention and the step (c) of the production method of the present invention, the measured value of the affinity of the modified antibody for the antigen is compared with the affinity of the original antibody for the antigen, and the affinity for the antigen is compared. Is a step of selecting an improved modified antibody. The affinity of the original antibody to be compared with respect to the antigen may be measured by the same method as the method for measuring the affinity of the modified antibody, and the obtained measured values of both may be compared. Alternatively, the coupling constant (Ka) may be calculated based on the measured value and the coupling constants may be compared.
改変抗体の抗原に対する親和力が元の抗体の抗原に対する親和力より向上している程度は特に限定されず、目的に応じて親和力向上の程度を設定すればよい。例えば、改変抗体の抗原に対する親和力が元の抗体の抗原に対する親和力より2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上または20倍以上向上している改変抗体を選択してもよい。 The degree to which the affinity of the modified antibody with respect to the antigen is improved from that of the original antibody with respect to the antigen is not particularly limited, and the degree of improvement in affinity may be set according to the purpose. For example, the affinity of the modified antibody for the antigen is 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, 10 times the affinity of the original antibody for the antigen. A modified antibody that is improved by a factor of 2 or more, 15 times or more, or 20 times or more may be selected.
本発明のスクリーニング方法の工程（１−１）または本発明の製造方法の工程（ａ１）により得られる改変抗体におけるKabat法で定義されるVHドメインのフレームワーク領域１（FR1）の1番目から10番目のアミノ酸は、それぞれ以下のアミノ酸から選択されるものであってもよい。
1番目：グルタミン（Q）またはグルタミン酸（E）
2番目：バリン（V）またはイソロイシン（I）
3番目：グルタミン（Q）またはリシン（K）
4番目：ロイシン（L）
5番目：グルタミン（Q）、リシン（K）、イソロイシン（I）、ロイシン（L）、グルタミン酸（E）またはバリン（V）
6番目：グルタミン（Q）またはグルタミン酸（E）
7番目：プロリン（P）またはセリン（S）
8番目：グリシン（G）
9番目：アラニン（A）、グリシン（G）、アルギニン（R）またはプロリン（P）
10番目：グルタミン酸（E）またはグリシン（G）
From the first of the framework region 1 (FR1) of the V H domain defined by the Kabat method in the modified antibody obtained by the step (1-1) of the screening method of the present invention or the step (a1) of the production method of the present invention. The tenth amino acid may be selected from the following amino acids, respectively.
First: glutamine (Q) or glutamic acid (E)
Second: valine (V) or isoleucine (I)
Third: Glutamine (Q) or Lysine (K)
Fourth: Leucine (L)
Fifth: Glutamine (Q), Lysine (K), Isoleucine (I), Leucine (L), Glutamic Acid (E) or Valine (V)
Sixth: Glutamine (Q) or Glutamic Acid (E)
7th: Proline (P) or Serine (S)
8th: Glycine (G)
Ninth: Alanine (A), Glycine (G), Arginine (R) or Proline (P)
10th: Glutamic acid (E) or glycine (G)
本発明のスクリーニング方法の工程（１−２）または本発明の製造方法の工程（ａ２）により得られる改変抗体は、元の抗体におけるKabat法で定義されるH鎖可変部（VHドメイン）のフレームワーク1の4番目と5番目のアミノ酸の間、5番目と6番目のアミノ酸の間、6番目と7番目のアミノ酸の間および7番目と8番目のアミノ酸の間から選択される1か所以上の位置に、合計1個以上6個以下のアミノ酸が挿入されているものであればよい。挿入位置は5番目と6番目のアミノ酸の間、6番目と7番目のアミノ酸の間および7番目と8番目のアミノ酸の間から選択されてもよく、5番目と6番目のアミノ酸の間および6番目と7番目のアミノ酸の間から選択されてもよく、6番目と7番目のアミノ酸の間および7番目と8番目のアミノ酸の間から選択されてもよく、6番目と7番目のアミノ酸の間であってもよい。
The modified antibody obtained by the step (1-2) of the screening method of the present invention or the step (a2) of the production method of the present invention is the H chain variable portion ( VH domain) defined by the Kabat method in the original antibody. One location selected from between the 4th and 5th amino acids of
挿入されるアミノ酸は特に限定されず、任意のアミノ酸を挿入することができる。1か所に挿入されるアミノ酸数は、5個以下であってもよく、4個以下であってもよく、3個以下であってもよく、2個以下であってもよく、1個であってもよい。また、2個以上のアミノ酸を挿入する場合、同じアミノ酸であっても異なるアミノ酸であってもよい。挿入されるアミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸（D）、プロリン（P）、アラニン（A）−グリシン（G）−フェニルアラニン（F）、アルギニン（R）、グルタミン（Q）−グリシン（G）、ヒスチジン（H）、グルタミン（Q）−アスパラギン（N）−ロイシン（L）、ロイシン（L）−ロイシン（L）−ロイシン（L）、グルタミン（Q）等が挙げられる。 The amino acid to be inserted is not particularly limited, and any amino acid can be inserted. The number of amino acids inserted in one place may be 5 or less, 4 or less, 3 or less, 2 or less, or 1 amino acid. There may be. When two or more amino acids are inserted, they may be the same amino acid or different amino acids. The amino acids to be inserted include, for example, aspartic acid (D), proline (P), alanine (A) -glycine (G) -phenylalanine (F), arginine (R), glutamine (Q) -glycine (G), Examples thereof include histidine (H), glutamine (Q) -aspartin (N) -leucine (L), leucine (L) -leucine (L) -leucine (L), glutamine (Q) and the like.
元の抗体および改変抗体のクラスは、IgG、IgA、IgM、IgD、IgEのいずれであってもよいが、好ましくはIgGである。IgGのサブクラスは特に限定されず、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4のいずれであってもよい。 The class of the original antibody and the modified antibody may be any of IgG, IgA, IgM, IgD and IgE, but IgG is preferable. The subclass of IgG is not particularly limited, and may be any of IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.
元の抗体は、全長抗体であってもよく低分子抗体であってもよい。低分子抗体は、全長抗体の一部が欠損しているが、標的となる抗原に対する結合活性を有する抗体断片を含む。抗体断片は、H鎖可変部（VHドメイン）およびL鎖可変部（VLドメイン）のいずれか、または両方を含んでいることが好ましい。低分子抗体としては、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv（single chain Fv）、ダイアボディー（Diabody）、sc(Fv)2（single chain (Fv)2）、Fv-claspなどを挙げることができる。これらの低分子抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の低分子抗体に含まれる。 The original antibody may be a full-length antibody or a small molecule antibody. Small molecule antibodies include antibody fragments that are partially deficient in full-length antibodies but have binding activity to the target antigen. The antibody fragment preferably contains either or both of the H chain variable part (V H domain) and the L chain variable part ( VL domain). Examples of small molecule antibodies include Fab, Fab', F (ab') 2 , Fv, scFv (single chain Fv), Diabody, sc (Fv) 2 (single chain (Fv) 2 ), Fv. -clasp etc. can be mentioned. Multimers of these small molecule antibodies (eg, dimers, trimmers, tetramers, polymers) are also included in the small molecule antibodies of the invention.
低分子抗体は、抗体を酵素で処理して抗体断片を生成させることによって得ることができる。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、プラスミン等が挙げられる。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子が挿入された発現ベクターが導入された適切な宿主細胞を培養して発現した抗体断片を、その培養液から単離および精製して取得することができる。 Small molecule antibodies can be obtained by treating the antibody with an enzyme to produce antibody fragments. Examples of the enzyme that produces an antibody fragment include papain, pepsin, plasmin, and the like. Alternatively, an antibody fragment expressed by culturing an appropriate host cell into which an expression vector into which a gene encoding these antibody fragments has been introduced has been introduced can be isolated and purified from the culture medium to obtain the antibody fragment.
〔抗体の抗原に対する親和力を向上させる方法〕
本発明は、抗体の抗原に対する親和力を向上させる方法を提供する。本発明の親和力向上方法は、親和力を向上させようとする元の抗体におけるKabat法で定義されるH鎖可変部（VHドメイン）のフレームワーク領域1の1番目〜3番目、5番目〜7番目、9番目および10番目から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を置換して改変抗体を作製すること、または、親和力を向上させようとする元の抗体におけるKabat法で定義されるH鎖可変部（VHドメイン）のフレームワーク領域1の4番目と5番目のアミノ酸の間、5番目と6番目のアミノ酸の間、6番目と7番目のアミノ酸の間もしくは7番目と8番目のアミノ酸の間から選択される1か所以上の位置に、合計1個以上6個以下のアミノ酸を挿入して改変抗体を作製することを含むものであればよい。
[Method of improving the affinity of an antibody for an antigen]
The present invention provides a method of improving the affinity of an antibody for an antigen. The affinity improving method of the present invention is the 1st to 3rd and 5th to 7th of the
本発明の親和力向上方法によって得られる改変抗体および元の抗体については、上記本発明のスクリーニング方法および本発明の製造方法の説明において説明したものと同じである。本発明の親和力向上方法により、元の抗体の抗原に対する親和力より2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、25倍以上、30倍以上向上している改変抗体を得ることが可能である。 The modified antibody and the original antibody obtained by the affinity improving method of the present invention are the same as those described in the above description of the screening method of the present invention and the production method of the present invention. By the affinity improving method of the present invention, the affinity of the original antibody with respect to the antigen is 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, 10 times. As mentioned above, it is possible to obtain a modified antibody that is improved by 15 times or more, 20 times or more, 25 times or more, and 30 times or more.
〔コルチゾールに対する親和力が向上した抗コルチゾール抗体〕
本発明は、抗原であるコルチゾールに対する親和力が向上した抗コルチゾール抗体を提供する。本発明の抗コルチゾール抗体は、配列番号1〜16のいずれか1つで示されるアミノ酸配列からなるH鎖可変部（VHドメイン）および配列番号17で示されるアミノ酸配列からなるL鎖可変部（VLドメイン）を有する抗体である。
[Anti-cortisol antibody with improved affinity for cortisol]
The present invention provides an anti-cortisol antibody having an improved affinity for the antigen cortisol. The anti-cortisol antibody of the present invention has an H chain variable portion (VH domain) consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 16 and an L chain variable portion consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 (L chain variable portion). It is an antibody having a V L domain).
元の抗体は、本発明者らが以前に樹立したモノクローナル抗コルチゾール抗体（Ab#3）（Oyama H et al., Anal. Chem., 87, 12387-12395 (2015)）であり、配列番号17で示されるアミノ酸配列からなるＬ鎖可変部（ＶＬドメイン）と配列番号18で示されるアミノ酸配列からなるH鎖可変部（VHドメイン）を有する。 The original antibody is a monoclonal anti-cortisol antibody (Ab # 3) (Oyama H et al., Anal. Chem., 87, 12387-12395 (2015)) previously established by the present inventors, SEQ ID NO: 17 It has an L chain variable portion ( VL domain) consisting of the amino acid sequence shown by and an H chain variable portion (V H domain) consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 18.
本発明の抗コルチゾール抗体は、コルチゾールに対する結合定数Kaが5×109M-1以上でああり、元の抗体のコルチゾールに対する結合定数Kaより15倍以上親和力が向上している。 The anti-cortisol antibody of the present invention has a binding constant Ka to cortisol of 5 × 10 9 M -1 or more, and its affinity is improved by 15 times or more from the binding constant Ka of the original antibody to cortisol.
本発明の抗コルチゾール抗体は、全長抗体であってもよく低分子抗体であってもよいが、低分子抗体であることが好ましい。本発明の抗コルチゾール抗体は、scFv（single chain Fv）であってもよい。 The anti-cortisol antibody of the present invention may be a full-length antibody or a small molecule antibody, but is preferably a small molecule antibody. The anti-cortisol antibody of the present invention may be scFv (single chain Fv).
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
〔実施例１：高親和力を有する改良型抗コルチゾール変異scFvの作製〕
１−１ 野生型抗コルチゾールscFvの作製
（１）モノクローナル抗コルチゾール抗体（Ab#3）の可変部遺伝子のクローニングとscFv遺伝子の構築
本発明者らが以前に樹立したモノクローナル抗コルチゾール抗体（Ab#3）（Oyama H et al., Anal. Chem., 87, 12387-12395 (2015)）を産生するハイブリドーマから総RNAを抽出し、Superscript IITM reverse transcriptaseを用いて逆転写反応を行いcDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型としてrapid amplification of cDNA 5’-ends（5’-RACE）を行い、VH遺伝子およびVL遺伝子を含むDNA断片を得た。これらDNA断片をpBluescript IIプラスミドのXmaI−SalIサイトヘサブクローニングし、VH遺伝子およびVL遺伝子の塩基配列を常法により決定した。得られた塩基配列情報に基づいて、scFvの構築に必要となる制限酵素認識配列を付加したVH遺伝子断片（VH’ 断片）およびVL遺伝子断片（VL’ 断片）をPCRで作製した。PCRにはEx Taq DNAポリメラーゼを使用し、制限酵素認識配列を付加するためのPCRプライマーは以下のものを使用した。
VH’ 断片用
CS#3VH-Rev：5’-CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTG-3’（配列番号19）
CS#3VH-For：5’-TGAACCGCCTCCACCGCTCGAGACTGCAGAGACAGTGACCAGAGTC-3’（配列番号20）
VL’ 断片用
CS#3VL-Rev：5’-GGATCCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATTGTGCTGACACAGTCTC-3’（配列番号21）
CS#3VL-For：5’-GGGCTCAACTTTCTTTGCGGCCGCAGCCCGTTTTATTTCCAGCTTG-3’（配列番号22）
[Example 1: Preparation of improved anti-cortisol mutant scFv having high affinity]
1-1 Preparation of wild-type anti-cortisol scFv (1) Cloning of variable part gene of monoclonal anti-cortisol antibody (Ab # 3) and construction of scFv gene The monoclonal anti-cortisol antibody (Ab # 3) previously established by the present inventors. ) (Oyama H et al., Anal. Chem., 87, 12387-12395 (2015)), total RNA was extracted from the hybridoma, and reverse transcription reaction was performed using Superscript II TM reverse transcriptase to synthesize cDNA. .. Rapid amplification of cDNA 5'-ends (5'-RACE) was performed using the obtained cDNA as a template to obtain DNA fragments containing the V H gene and the V L gene. These DNA fragments were subcloned into the XmaI-SalI site of the pBluescript II plasmid, and the nucleotide sequences of the V H gene and the V L gene were determined by a conventional method. Based on the obtained nucleotide sequence information, were V H gene fragment obtained by adding a restriction enzyme recognition sequence which is required for the construction of scFv (V H 'fragment) and V L gene fragment (V L' fragment) was prepared by PCR .. Ex Taq DNA polymerase was used for PCR, and the following PCR primers were used for adding restriction enzyme recognition sequences.
V H'for fragments
CS # 3V H -Rev: 5'-CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTG-3'(SEQ ID NO: 19)
CS # 3V H -For: 5'-TGAACCGCCTCCACCGCTCGAGACTGCAGAGACAGTGACCAGAGTC-3'(SEQ ID NO: 20)
V L' for fragments
CS # 3V L -Rev: 5'-GGATCCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATTGTGCTGACACAGTCTC-3'(SEQ ID NO: 21)
CS # 3V L -For: 5'-GGGCTCAACTTTCTTTGCGGCCGCAGCCCGTTTTATTTCCAGCTTG-3'(SEQ ID NO: 22)
得られたVH’ 断片を制限酵素NcoIおよびXhoIで、VL’ 断片を制限酵素SalIおよびNotIでそれぞれ消化し、scFv発現用プラスミドベクターに順次導入し、ベクター内にscFv遺伝子（5’-VH-linker-VL-FLAG-3’）を構築した。VH遺伝子およびVL遺伝子を連結するリンカー配列は、VVSGGGGSGGGGSGGGGST（配列番号23）の19アミノ酸をコードしている。またscFvの3’末端には、発現するscFvの精製と検出を容易にするため、FLAGタグの塩基配列が付加されている。 'Restriction fragments enzymes NcoI and XhoI, V L' resulting V H fragment was digested respectively with the restriction enzymes SalI and NotI, and successively introduced into a plasmid vector for scFv expression, scFv genes into the vector (5'-V H -linker-V L -FLAG-3') was constructed. The linker sequence linking the V H gene and the V L gene encodes 19 amino acids of VVSGGGGSGGGGSGGGGST (SEQ ID NO: 23). In addition, the base sequence of the FLAG tag is added to the 3'end of scFv to facilitate purification and detection of the expressed scFv.
（２）可溶型scFvタンパク質の産生と精製
構築したscFv発現用プラスミドベクターを大腸菌XL1-Blue細胞に電気穿孔法により導入した。形質転換菌をアガープレート上に塗布して37℃で一晩培養し、出現したコロニーがscFv遺伝子を保持していることを、scFv遺伝子に特異的なコロニーPCRおよびscFv遺伝子塩基配列の解析により確認した。この形質転換菌を、アンピシリンとグルコースを含む2×YT培地に加え、600 nmにおける吸光度が0.8に達するまで37℃で振とう培養した。培養液を遠心分離し、沈殿をisopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside（IPTG）を含むタンパク質発現誘導培地に懸濁し、25℃で一晩振とう培養した。培養液を遠心分離し、沈殿を浸透圧ショック用緩衝液（スクロースおよびエチレンジアミン四酢酸を含むトリス緩衝液）で懸濁した後、氷上で1時間インキュベートした。インキュベート後の菌懸濁液を遠心分離し、上清のペリプラズム抽出液（scFvタンパク質を含む）を回収し、-20℃で保存した。この一部を抗FLAG-M2抗体固定化アガロースゲルを充填したアフィニティーカラムに供し、緩衝液で洗浄後、0.10 mol/L グリシン塩酸緩衝液（pH 3.5）で可溶型scFvを溶出した。この画分を4℃で一晩透析した後、遠心式限外濾過膜を用いて濃縮した。この抗コルチゾールscFvの一次構造（アミノ酸配列）を図1に示した。
(2) Production and purification of soluble scFv protein The constructed plasmid vector for scFv expression was introduced into Escherichia coli XL1-Blue cells by electroporation. The transformant was applied on an agar plate and cultured at 37 ° C overnight, and it was confirmed by colony PCR specific for the scFv gene and analysis of the scFv gene nucleotide sequence that the emerging colonies retained the scFv gene. bottom. The transformant was added to 2 × YT medium containing ampicillin and glucose and cultured with shaking at 37 ° C. until the absorbance at 600 nm reached 0.8. The culture broth was centrifuged, the precipitate was suspended in a protein expression-inducing medium containing isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), and cultured with shaking at 25 ° C. overnight. The culture was centrifuged and the precipitate was suspended in osmotic shock buffer (Tris buffer containing sucrose and ethylenediaminetetraacetic acid) and then incubated on ice for 1 hour. The bacterial suspension after incubation was centrifuged, and the supernatant periplasmic extract (containing scFv protein) was collected and stored at -20 ° C. A part of this was applied to an affinity column packed with an anti-FLAG-M2 antibody-immobilized agarose gel, washed with buffer, and then soluble scFv was eluted with 0.10 mol / L glycine hydrochloride buffer (pH 3.5). This fraction was dialyzed overnight at 4 ° C. and then concentrated using a centrifugal ultrafiltration membrane. The primary structure (amino acid sequence) of this anti-cortisol scFv is shown in FIG.
１−２ 「FR1ランダム化」変異scFv遺伝子ライブラリーの構築
（１）マウス抗体VHドメイン各サブグループのFR1の一次構造の比較
抗体分子のうち、抗原との相互作用に直接関わるのは上述のVHおよびVLドメインであり、その結合特異性と親和力はこれらドメインの立体構造と連関する。いずれのドメインも、ループ構造を形成し抗原と接触する相補性決定部（complementarity-determining region; CDR）と、β-シート構造を形成しCDRループを支える土台となる枠組み配列（framework region; FR）が交互に現れるモザイク様構造をとる。すなわち、そのN末端から、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 の順に連なっている。CDRのアミノ酸配列は抗原特異性を異にする抗体分子間で大きく異なり莫大な多様性を示すが、FRの多様性はCDRに比べると小さい。このため、VHおよびVLドメインはFRの配列の類似性により、サブグループに分類されている。すなわち、マウス抗体のVHドメインはIA、IB、IIA、IIB、IIC、IIIA、IIIB、IIIC、IIID、VA、VBの11グループに、L鎖のうちκタイプ（マウス抗体の約95%がκタイプである）の可変部（Vκ）は、I、II、III、IV、V、VI、VII の7グループに分類されている（Kabat EA et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest; U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, U. S. Government Printing Office: Washington, DC, (1991)）。VHドメインのFR1は、H鎖N末端アミノ酸を1番とするとき1〜30番のアミノ酸からなるが、そのうち1〜15番のアミノ酸について、各サブグループの典型的な配列（最も出現頻度が高いアミノ酸を選択して並べた配列）を図2に示した。N末端の1〜10番目に着目すると、2、4、8番目のアミノ酸はいずれのサブグループでもそれぞれV、L、Gであり、高度に保存されていることがわかる。これに対して、1番目と6番目はEまたはQ、3番目はQまたはKであり、サブグループの違いに応じた変動がある。5番目はさらに変化が激しく、Q、K、V、E、またはLのいずれかであり、各サブグループを特徴づける部位となっている。
1-2 Construction of “FR1 randomized” mutant scFv gene library (1) Comparison of primary structure of FR1 of each subgroup of mouse antibody V H domain Among the antibody molecules, those directly involved in the interaction with the antigen are described above. It is a V H and V L domain, and its binding specificity and affinity are associated with the three-dimensional structure of these domains. Each domain has a complementarity-determining region (CDR) that forms a loop structure and contacts with an antigen, and a framework region (FR) that forms a β-sheet structure and supports the CDR loop. Has a mosaic-like structure in which appears alternately. That is, from the N-terminal, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 are connected in this order. The amino acid sequence of CDR varies greatly among antibody molecules with different antigen specificities and shows enormous diversity, but the diversity of FR is smaller than that of CDR. Therefore, the V H and V L domains are subgrouped by the sequence similarity of FR. That is, the VH domain of mouse antibodies is divided into 11 groups of IA, IB, IIA, IIB, IIC, IIIA, IIIB, IIIC, IIID, VA, and VB, and the κ type of L chain (about 95% of mouse antibodies are κ). The variable part (Vκ) of the type) is divided into 7 groups I, II, III, IV, V, VI, and VII (Kabat EA et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest; US Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, US Government Printing Office: Washington, DC, (1991)). FR1 of the V H domain consists of
本発明者らは、予備検討において、サブグループ間で変動するVHドメインのFR1内の1〜10番の位置について、本来のアミノ酸を異なるサブグループにおける頻出アミノ酸に置換したところ、scFvの抗原結合親和力が顕著に高いscFv変異体が出現することに気付いた。そこで、上記１−１で作製した野生型抗コルチゾールscFvのVHドメインのFR1内の1〜10番の位置について、本来のアミノ酸を異なるサブグループの頻出アミノ酸に置換した変異scFvを作製し、抗原結合親和力が向上した変異scFvを見出すことを試みた。
In a preliminary study, the present inventors replaced the original amino acids with frequently occurring amino acids in different subgroups at
（２）抗コルチゾールscFvの「FR1ランダム化」変異体ライブラリーの構築
上記１−１で作製した野生型抗コルチゾールscFvのVHドメインの1、2、3、5、6、7、9および10番目のアミノ酸について、表１に示すアミノ酸のいずれかが出現する変異体ライブラリーを構築した。2番目のアミノ酸については、頻度は小さいながらVに加えIが出現することを考慮した。理論上は2×2×2×6×2×2×4×2=1,536通りの1〜10番のアミノ酸配列を持つ変異体が含まれることになる。
(2) Construction of "FR1 randomized" mutant library of
上記１−１で構築したscFv発現用プラスミドベクターを鋳型とし、縮重プライマーVH-FR1-1〜10mut（5’-ATTGTTATTACTCGCGGCCCAACCGGCCATGGCCSAGRTCMAACTGVWASAGYCTGGGSSTGRACTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAA-3’、配列番号24）と上記プライマーCS#3VL-Forを用い、複製酵素としてKOD Fx DNA ポリメラーゼを用いてPCRを行い、VHの1〜10番のアミノ酸のコドンとして縮重コドン（SAG RTC MAA CTG VWA SAG YCT GGG SST GRA：配列番号25）を有する変異scFv遺伝子群を作製した。得られた変異scFv遺伝子群を制限酵素NcoIおよびNotI で消化し、scFvファージ提示用ベクターに導入した。得られた組換えプラスミドを大腸菌TG1株に電気穿孔法により導入した。形質転換菌をアガープレート上に塗布して37℃で一晩培養し、出現したコロニーの一部を後述のコロニーアレイプロファイリング（colony-array profiling: CAP）法に供して、コルチゾールに対する結合親和力が向上した変異scFvを産生する大腸菌クローンを探索した。なお、核酸塩基の一文字表記を表２に示す。
Using the scFv expression plasmid vector constructed in 1-1 above as a template, the degenerate primers V H -FR1-1 to 10 mut (5'-ATTGTTATTACTCGCGGCCCAACCGGCCATGGCCSAGRTCMAACTGVWASAGYCTGGGSSTGRACTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAA-3', SEQ ID NO: 24) and the above primers CS # 3V L- For PCR was performed using KOD Fx DNA polymerase as a replication enzyme, and a mutation having a degenerate codon (SAG RTC MAA CTG VWA SAG YCT GGG SST GRA: SEQ ID NO: 25) as a codon of
１−３ 「FR1伸長」変異scFv遺伝子ライブラリーの構築
（１）「FR1伸長」変異scFv遺伝子について
本発明者らは、予備検討において、VHドメインのFR1内の6番目のアミノ酸と7番目のアミノ酸の間に1つのアミノ酸が挿入されたscFv変異体は抗原結合親和力が顕著に高いことを見出した。そこで、上記１−１で作製した野生型抗コルチゾールscFvのVHドメインのFR1内の6番目のアミノ酸と7番目のアミノ酸の間に1〜6個のアミノ酸を挿入した変異体ライブラリーを構築することにした。アミノ酸の挿入はNNS縮重コドンの挿入により行い、挿入されたアミノ酸として20種のタンパク質構成アミノ酸のすべてがランダムに出現し得るようにした。したがって、1個、2個、3個、4個、5個または6個のアミノ酸を挿入した変異体ライブラリーは、理論上、それぞれ20種、202＝400種、203＝8,000種、204＝160,000種、205＝3,200,000種、206＝64,000,000種の変異体を含み得ることになる。
1-3 Construction of "FR1 Elongation" Mutant scFv Gene Library (1) Regarding "FR1 Elongation" Mutant scFv Gene In preliminary studies, the present inventors conducted a preliminary study on the 6th amino acid and the 7th amino acid in FR1 of the V H domain. We found that scFv mutants with one amino acid inserted between amino acids have significantly higher antigen-binding affinity. Therefore, we construct a mutant library in which 1 to 6 amino acids are inserted between the 6th and 7th amino acids in FR1 of the VH domain of the wild-type anticortisol scFv prepared in 1-1 above. It was to be. Amino acids were inserted by inserting NNS degenerate codons so that all 20 proteinogenic amino acids could appear randomly as the inserted amino acids. Therefore, in theory, there are 20 mutant libraries with 1, 2, 3, 4, 5, or 6 amino acids inserted, 20 2 = 400, 20 3 = 8,000, and 20 respectively. 4 = 160,000 species, 20 5 = 3,200,000 species, 20 6 = 64,000,000 species can be included.
（２）抗コルチゾールscFvの「FR1伸長」変異scFv遺伝子ライブラリーの構築
上記１−１で構築したscFv発現用プラスミドベクターを鋳型とし、伸長用プライマー（5’-ATTGTTATTACTCGCGGCCCAACCGGCCATGGCCCAGGTCCAACTGCAGCAG(NNS)nCCTGGGGCTGAACTTGTGAAGC-3’; n=1、2、3、4、5、6、配列番号26〜31）および上記プライマーCS#3VL-Forを用い、複製酵素としてKOD Fx DNAポリメラーゼを用いてPCRを行った。得られた6種の変異scFv遺伝子群を、n=1、2、3の遺伝子群の混合物、n=4、5の遺伝子群の混合物、n=6の遺伝子群に分けて、それぞれ制限酵素NcoIおよびNotIで消化し、scFvファージ提示用ベクターに導入した。得られた組換えプラスミドを大腸菌TG1株に電気穿孔法により導入した。形質転換菌をアガープレート上に塗布して37℃で一晩培養し、出現したコロニーの一部を後述のコロニーアレイプロファイリング（colony-array profiling: CAP）法に供して、コルチゾールに対する結合親和力の向上した変異scFvを産生する大腸菌クローンを探索した。
(2) Construction of "FR1 extension" mutant scFv gene library of anticortisol scFv Using the scFv expression plasmid vector constructed in 1-1 above as a template, extension primers (5'-ATTGTTATTACTCGCGGCCCAACCGGCCATGGCCCAGGTCCAACTGCAGCAG (NNS) nCCTGGGGCTGAACTTGTGAAGC-3'; PCR was performed using n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, SEQ ID NOs: 26 to 31) and the above-mentioned primer CS # 3V L- For, and KOD Fx DNA polymerase as a replication enzyme. The obtained 6 types of mutant scFv gene clusters were divided into a mixture of n = 1, 2, and 3 gene clusters, a mixture of n = 4, 5 gene clusters, and an n = 6 gene cluster, and each of them was a limiting enzyme NcoI. And NotI digested and introduced into the scFv phage presentation vector. The obtained recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli TG1 strain by electroporation. The transformant was applied on an agar plate and cultured at 37 ° C. overnight, and some of the colonies that appeared were subjected to the colony-array profiling (CAP) method described later to improve the binding affinity for cortisol. We searched for E. coli clones that produced the mutant scFv.
１−４ ファージディスプレイを利用した抗コルチゾールscFv高親和力変異体の探索
（１）コロニーアレイプロファイリング（colony-array profiling: CAP）法
上記１−２および１−３で作製した変異scFv遺伝子を導入した形質転換菌をアガープレートに播種し、クローン化されたコロニーを形成させた。あらかじめコルチゾール基がアルブミン結合体としてコーティングされた96ウェルマイクロプレートのマイクロウェル（KM13ヘルパーファージを含む2×YT培地が分注されている）に、形質転換菌のコロニーを1つずつ移植し、25℃で45時間振とう培養し、各ウェルにおいて単一の形質転換菌から「モノクローナルscFv提示ファージ」を産生させた。ファージ粒子上に提示されているscFvがコルチゾールに対して十分な親和力を示す場合、これらファージはコルチゾール基が結合しているマイクロウェルに捕捉される。そこで、プレートを洗浄後、新規に作製した抗ファージscFv（Kiguchi Y et al., Biol. Pharm. Bull., 41, 1062-1070 (2018)）と海洋性カイアシ類（Gaussia princeps）由来ルシフェラーゼ（GLuc）の融合タンパク質を反応させ、GLucの基質であるセレンテラジンを加え、生じる発光の強度を計測した。
1-4 Search for anti-cortisol scFv high-affinity mutant using phage display (1) Colony-array profiling (CAP) method The trait into which the mutant scFv gene prepared in 1-2 and 1-3 above was introduced. The transformants were seeded on agar plates to form cloned colonies. One colony of transformant was transplanted into each microwell of a 96-well microplate (2 × YT medium containing KM13 helper phage was dispensed) pre-coated with a cortisol group as an albumin conjugate, and 25 The cells were cultured with shaking at ° C for 45 hours, and "monoclonal scFv-presenting phage" were produced from a single transformant in each well. If the scFv presented on the phage particles show sufficient affinity for cortisol, these phages are captured in the microwells to which the cortisol group is attached. Therefore, after washing the plate, newly prepared anti-phage scFv (Kiguchi Y et al., Biol. Pharm. Bull., 41, 1062-1070 (2018)) and luciferase derived from marine copepod (Gaussia princeps) (GLuc) ) Fusion protein was reacted, coelenterazine, which is a substrate of GLuc, was added, and the intensity of luminescence generated was measured.
上記１−２で作製した「FR1ランダム化」ライブラリーおよび１−３で作製した「FR1伸長」ライブラリーのそれぞれについて、約5,000個の形質転換菌に由来するモノクローナルscFv提示ファージの発光強度を比較し、上位40種を更なる評価に供した。 Comparison of luminescence intensity of monoclonal scFv-presenting phage derived from about 5,000 transformants was compared for each of the "FR1 randomized" library prepared in 1-2 and the "FR1 extended" library prepared in 1-3. However, the top 40 species were used for further evaluation.
（２）CAP法に用いるコルチゾール基固定化マイクロプレートの作製
コルチゾール3-(O-carboxymethyl)oximeを常法によりN-hydroxysuccinimide esterに変換した。そのピリジン溶液をウシ血清アルブミンのリン酸緩衝溶液と混和して、室温で１時間、更に4℃で一晩撹拌した。これを透析し、アセトンの添加によるタンパク質沈殿反応に付して未反応のステロイド等を除去し、コルチゾール−アルブミン結合体（平均結合モル比12）を得た。本結合体を含む0.10 mol/L炭酸緩衝液（pH 8.6）を、発光ELISA用白色96ウェルマイクロプレートに分注し（100μL/ウェル）、室温で一晩放置した。溶液を除去してリン酸緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline; PBS）で3回洗浄した後、ブロックエース溶液（300μL/ウェル）を加えて37℃で2時間放置した。溶液を除去した後、0.050(v/v)% Tween 20を含むPBS（T-PBS）で3回洗浄し、コルチゾール基固定化マイクロプレートを得た。
(2) Preparation of cortisol group-immobilized microplate used in the CAP method Cortisol 3- (O-carboxymethyl) oxime was converted to N-hydroxysuccinimide ester by a conventional method. The pyridine solution was mixed with a phosphate buffer solution of bovine serum albumin and stirred at room temperature for 1 hour and further at 4 ° C. overnight. This was dialyzed and subjected to a protein precipitation reaction by adding acetone to remove unreacted steroids and the like to obtain a cortisol-albumin conjugate (average binding molar ratio 12). 0.10 mol / L carbonate buffer (pH 8.6) containing the conjugate was dispensed into a white 96-well microplate for luminescent ELISA (100 μL / well) and left overnight at room temperature. After removing the solution and washing with phosphate-buffered saline (PBS) three times, a block ace solution (300 μL / well) was added and the mixture was left at 37 ° C. for 2 hours. After removing the solution, the mixture was washed 3 times with PBS (T-PBS) containing 0.050 (v / v)
（３）CAP法による高親和力変異scFv提示ファージクローンの探索と回収
上記（２）で作製したコルチゾール基固定化マイクロプレートのウェルに、アンピシリン（100 μg/mL）、カナマイシン（5.0μg/mL）およびKM13（5×108 pfu/mL）を含む2×YT培地を分注した（200μL/ウェル）。上記１−２および１−３で作製した変異scFv遺伝子を導入した形質転換菌のアガープレート上のコロニーを滅菌した爪楊枝を用いてマイクロプレートのウェルの培地中に懸濁させ、25℃で45時間振とう培養した。培地を除去し、T-PBSで3回洗浄した後、2.0%スキムミルクを含むPBSで500倍に希釈した抗ファージscFv-GLuc結合体を加え（100μL/ウェル）、37℃で30分インキュベートした。同様に洗浄後、セレンテラジン（5.0μmol/L）を含むPBSを加え（100μL/ウェル）、直後に300〜700 nmにおける発光強度を測定した。発光強度が大きく、高親和力のscFv提示ファージの産生が期待できるウェルを選択し、残存する溶液を除いた後、ウェルに結合したファージを解離させるために0.10 mol/L グリシン塩酸緩衝液（pH 2.2, 100μL）を加えて室温で10分振とうした。ウェル内の溶液をマイクロチューブに回収し、2.0 mol/L Trisを加えて中和した後、その一部を対数増殖期の大腸菌TG1に加え、37 ℃で30分インキュベーションした。その一部を2×YT培地で段階希釈し（10〜1,000倍希釈）、アンピシリンとグルコースを含む2×YTアガープレートに塗布して37℃で一晩培養した。得られるコロニーをscFv遺伝子に特異的なコロニーPCRに付して、scFv遺伝子を保持する大腸菌を特定した。
(3) Search and recovery of high-affinity mutant scFv-presenting phage clones by the CAP method Ampicillin (100 μg / mL), kanamycin (5.0 μg / mL) and canamycin (5.0 μg / mL) and canamycin (5.0 μg / mL) and canamycin (5.0 μg / mL) and canamycin (5.0 μg / mL) and canamycin (5.0 μg / mL) and canamycin (5.0 μg / mL) 2 × YT medium containing KM13 (5 × 10 8 pfu / mL) was dispensed (200 μL / well). The colonies on the agar plate of the transformant into which the mutant scFv gene prepared in 1-2 and 1-3 above were introduced were suspended in the medium of the well of the microplate using a sterilized toothpick, and at 25 ° C. for 45 hours. It was shake-cultured. After removing the medium and washing 3 times with T-PBS, anti-phage scFv-GLuc conjugate diluted 500-fold with PBS containing 2.0% skim milk was added (100 μL / well) and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Similarly, after washing, PBS containing coelenterazine (5.0 μmol / L) was added (100 μL / well), and immediately after that, the emission intensity at 300 to 700 nm was measured. Select wells that are expected to produce scFv-presenting phages with high luminescence intensity and high affinity, remove the remaining solution, and then 0.10 mol / L glycine hydrochloride buffer (pH 2.2) to dissociate the phages bound to the wells. , 100 μL) was added and shaken for 10 minutes at room temperature. The solution in the well was collected in a microtube, neutralized by adding 2.0 mol / L Tris, and a part thereof was added to Escherichia coli TG1 in the logarithmic growth phase and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. A portion thereof was serially diluted with 2 × YT medium (diluted 10 to 1,000 times), applied to a 2 × YT agar plate containing ampicillin and glucose, and cultured at 37 ° C. overnight. The obtained colonies were subjected to colony PCR specific for the scFv gene to identify Escherichia coli carrying the scFv gene.
（４）可溶型変異scFvの調製
上記（３）で特定したscFv遺伝子を保持する大腸菌を培養してプラスミドを抽出し、このプラスミドを鋳型としてPCR を行い、scFv遺伝子を増幅した。増幅したscFv遺伝子を可溶型scFv発現用プラスミドにサブクローニングし、大腸菌XL1Blueに導入した。得られた形質転換菌を上記１−１（２）と同じ手順で処理して、可溶型変異scFvタンパク質をペリプラズム抽出液として回収し、-20℃で保存した。
(4) Preparation of soluble mutant scFv Escherichia coli carrying the scFv gene identified in (3) above was cultured to extract a plasmid, and PCR was performed using this plasmid as a template to amplify the scFv gene. The amplified scFv gene was subcloned into a soluble scFv expression plasmid and introduced into Escherichia coli XL1 Blue. The obtained transformant was treated in the same procedure as in 1-1 (2) above, and the soluble mutant scFv protein was recovered as a periplasmic extract and stored at -20 ° C.
１−５ 改良型抗コルチゾール変異scFvの一次構造と親和力の解析
（１）コルチゾールに対して高い親和力を示す変異scFvの選抜
１−４で作製した可溶型変異scFv、および１−１で作製した野生型scFvを用いてコルチゾールの競合ELISAを行い、標準曲線の50%置換値の比較によりコルチゾールに対する親和力向上の程度を推定した（一般に、50%置換値が小さいほどそのscFvは親和力が高い）。有望な変異scFvについては、Scatchard法（Scatchard G., Ann. N. Y. Acad. Sci., 51, 660-972 (1949)）により結合定数（Ka）を算出した。その結果、野生型scFvに比べ10倍以上大きいKaを示す改良型変異scFvを、１−２で作製した「FR1ランダム化」ライブラリーから7種、１−３で作製した「FR1伸長」ライブラリーから9種、それぞれ特定した。特定した16種の改良型変異scFvの一次構造と結合定数（Ka）を図3に示した。
1-5 Analysis of primary structure and affinity of improved anti-cortisol mutant scFv (1) Selection of mutant scFv showing high affinity for cortisol Soluble mutant scFv prepared in 1-4 and 1-1 prepared Competitive ELISA of cortisol was performed using wild-type scFv, and the degree of improvement in affinity for cortisol was estimated by comparing the 50% substitution values of the standard curve (generally, the smaller the 50% substitution value, the higher the affinity of scFv). For the promising mutant scFv, the binding constant (Ka) was calculated by the Scatchard method (Scatchard G., Ann. NY Acad. Sci., 51, 660-972 (1949)). As a result, 7 types of improved mutant scFv showing Ka, which is more than 10 times larger than wild-type scFv, from the "FR1 randomized" library prepared in 1-2, and the "FR1 extension" library prepared in 1-3. 9 species were identified from each. The primary structure and binding constant (Ka) of the 16 improved mutant scFv identified are shown in Fig. 3.
（２）コルチゾールの競合ELISA
上記１−４（２）に記載のコルチゾール基固定化マイクロプレートを作製した。0.10%ゼラチンを含むPBS（G-PBS）で適切に希釈したペリプラズム抽出液（可溶型変異scFvを含む）（100μL/ウェル）および各種濃度のコルチゾール標準品を含むG-PBS溶液（50μL/ウェル）を加えて混合し、4℃で2時間インキュベートした。同様に洗浄後、G-PBSで5,000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗FLAG抗体（100μL/ウェル）を加えて37℃で30分インキュベートした。溶液を除去し、ウェルを洗浄した後、各ウェルに0.04% o-フェニレンジアミン塩酸塩および0.018% 過酸化水素を含む基質溶液を分注し（100μL/ウェル）、十分な発色が認められるまで（10〜30分）室温で放置した後、1.0 mol/L 硫酸水溶液を添加して（100μL/ウェル）混合し、酵素反応を停止させた。マイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの490 nmの吸光度を測定し、GraphPad Prism version 3.0aを用いてデータ処理を行い、コルチゾールの標準曲線を作成し、50%置換値を求めた。
(2) Cortisol competing ELISA
The cortisol group-immobilized microplate described in 1-4 (2) above was prepared. Periplasmic extract (containing soluble mutant scFv) (100 μL / well) appropriately diluted with PBS (G-PBS) containing 0.10% gelatin and G-PBS solution (50 μL / well) containing various concentrations of cortisol standard. ) Was added, mixed, and incubated at 4 ° C. for 2 hours. After washing in the same manner, a peroxidase-labeled anti-FLAG antibody (100 μL / well) diluted 5,000 times with G-PBS was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After removing the solution and washing the wells, dispense a substrate solution containing 0.04% o-phenylenediamine hydrochloride and 0.018% hydrogen peroxide into each well (100 μL / well) until sufficient color development is observed (100 μL / well). After leaving at room temperature (10 to 30 minutes), a 1.0 mol / L sulfuric acid aqueous solution was added (100 μL / well) and mixed to stop the enzymatic reaction. The absorbance at 490 nm of each well was measured using a microplate reader, data processing was performed using GraphPad Prism version 3.0a, a standard curve of cortisol was created, and a 50% substitution value was determined.
（３）Scatchard法によるscFvのコルチゾールに対する結合定数の算出
ガラス試験管（12×75 mm）に、G-PBSで各種濃度に希釈したコルチゾールの標準液（100μL）、[1,2,6,7-3H (N)]-コルチゾール（1.5×104 dpm; 500μL）、および可溶型scFv (ペリプラズム抽出液) を添加して撹拌後、4℃で一晩インキュベートした。反応液を氷上で10分間インキュベートし、これにデキストラン炭末懸濁液（0.4%の活性炭末を0.010%のデキストランを含むG-PBSで懸濁した液）（500μL）を添加して撹拌後、氷上で更に20分間インキュベートした。この懸濁液を遠心分離し（2000 rpm, 10分, 4℃）、上清をクリアゾルII（10 mL）と混和し、放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。得られた放射能（dpm）と添加したコルチゾール量（pmol）からScatchardプロットを行い、可溶型scFvのコルチゾールに対する結合定数Kaを算出した。
(3) Calculation of binding constant of scFv to cortisol by Scatchard method Standard solution of cortisol (100 μL) diluted to various concentrations with G-PBS in a glass test tube (12 × 75 mm), [1,2,6,7 -3H (N)]-Cortisol (1.5 × 10 4 dpm; 500 μL) and soluble scFv (periplasmum extract) were added, stirred, and then incubated overnight at 4 ° C. The reaction solution was incubated on ice for 10 minutes, and a dextran charcoal powder suspension (a solution in which 0.4% activated carbon powder was suspended in G-PBS containing 0.010% dextran) (500 μL) was added and stirred. Incubated on ice for an additional 20 minutes. The suspension was centrifuged (2000 rpm, 10 minutes, 4 ° C.), the supernatant was mixed with Clearsol II (10 mL), and the radioactivity was measured with a liquid scintillation counter. A Scatchard plot was performed from the obtained radioactivity (dpm) and the amount of cortisol added (pmol), and the binding constant Ka of soluble scFv to cortisol was calculated.
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 The present invention is not limited to the above-described embodiments and examples, and various modifications can be made within the scope of the claims, and the technical means disclosed in the different embodiments may be appropriately combined. The obtained embodiments are also included in the technical scope of the present invention.
Claims (21)
（１−１）元の抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク領域１の１番目〜３番目、５番目〜７番目、９番目および１０番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸を置換して改変抗体を作製する工程、または
（１−２）元の抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク領域１の４番目と５番目のアミノ酸の間、５番目と６番目のアミノ酸の間、６番目と７番目のアミノ酸の間および７番目と８番目のアミノ酸の間から選択される１か所以上の位置に、合計１個以上６個以下のアミノ酸を挿入して改変抗体を作製する工程、
（２）前記改変抗体の抗原に対する親和力を測定する工程、ならびに
（３）前記工程（２）で測定した改変抗体の抗原に対する親和力と元の抗体の抗原に対する親和力を比較して、抗原に対する親和力が向上した改変抗体を選択する工程
を含む、スクリーニング方法。 This is a method for screening an antibody that has an improved affinity for an antigen compared to the original antibody.
(1-1) From the 1st to 3rd, 5th to 7th, 9th and 10th amino acids of the framework region 1 of the H chain variable part (VH domain) defined by the Kabat method in the original antibody. The step of substituting at least one selected amino acid to prepare a modified antibody, or (1-2) the fourth of the framework region 1 of the H chain variable part (VH domain) defined by the Kabat method in the original antibody. And at one or more positions selected between the 5th and 5th amino acids, between the 5th and 6th amino acids, between the 6th and 7th amino acids, and between the 7th and 8th amino acids. A step of preparing a modified antibody by inserting 1 or more and 6 or less amino acids,
(2) The step of measuring the affinity of the modified antibody for the antigen, and (3) the affinity of the modified antibody measured in the step (2) for the antigen is compared with the affinity of the original antibody for the antigen, and the affinity for the antigen is determined. A screening method comprising the step of selecting an improved modified antibody.
（ａ１）元の抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク領域１の１番目〜３番目、５番目〜７番目、９番目および１０番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸を置換して改変抗体を作製する工程、または
（ａ２）元の抗体におけるＫａｂａｔ法で定義されるＨ鎖可変部（ＶＨドメイン）のフレームワーク領域１の４番目と５番目のアミノ酸の間、５番目と６番目のアミノ酸の間、６番目と７番目のアミノ酸の間および７番目と８番目のアミノ酸の間から選択される１か所以上の位置に、合計１個以上６個以下のアミノ酸を挿入して改変抗体を作製する工程、
（ｂ）前記改変抗体の抗原に対する親和力を測定する工程、ならびに
（ｃ）前記工程（ｂ）で測定した改変抗体の抗原に対する親和力と元の抗体の抗原に対する親和力を比較して、抗原に対する親和力が向上した改変抗体を選択する工程
を含む、製造方法。 A method for producing an antibody having an improved affinity for an antigen compared to the original antibody.
(A1) Selected from the 1st to 3rd, 5th to 7th, 9th and 10th amino acids of the framework region 1 of the H chain variable part (VH domain) defined by the Kabat method in the original antibody. The step of substituting at least one amino acid to prepare a modified antibody, or (a2) the fourth and fifth of the framework region 1 of the H chain variable part (VH domain) defined by the Kabat method in the original antibody. A total of 1 or more at one or more positions selected between amino acids, between the 5th and 6th amino acids, between the 6th and 7th amino acids, and between the 7th and 8th amino acids. The process of producing modified antibodies by inserting less than one amino acid,
The affinity for the antigen is determined by comparing (b) the step of measuring the affinity of the modified antibody with respect to the antigen, and (c) the affinity of the modified antibody measured in the step (b) with respect to the antigen of the original antibody. A production method comprising the step of selecting an improved modified antibody.
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