JP2021078370A - 全身性エリトマトーデスの治療薬に対するコンパニオン診断薬 - Google Patents

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Abstract

【課題】全身性エリトマトーデスの治療薬に対するコンパニオン診断薬の提供。【解決手段】ＩＦＮ−Ｉ受容体を発現しており、ＩＦＮ−Ｉ誘導性制御領域と、前記制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子とを含むレポーター構築物が導入された細胞を含む、全身性エリトマトーデスの治療薬に対するコンパニオン診断薬。【選択図】なし

Description

本発明は、全身性エリトマトーデスの治療薬に対する感受性について患者の層別化を可能とする技術に関し、具体的には、全身性エリトマトーデスの治療薬に対するコンパニオン診断薬に関する。
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、若年女性に好発する難治性の自己免疫疾患で、日本には約７万人の患者がいると報告されている。遺伝的背景に、女性ホルモン、紫外線などの環境要因が加わり、自己抗原に反応するリンパ球（自己反応性リンパ球）、自己抗原に対する抗体（自己抗体）の産生が疾患の発症に寄与し、アポトーシス細胞の貪食・分解処理、ＤＮＡ・ＲＮＡ分解処理の異常が疾患増悪に寄与していると考えられている。ＳＬＥは、突然の倦怠感、発熱などの全身症状に加えて、皮疹、腎障害、中枢神経障害などの症状により診断され、グルココルチコイドをはじめとする免疫抑制剤により治療される。しかし、ＳＬＥは、炎症の遷延、薬の副作用によって、感染症、慢性臓器障害等を合併しうる。
ＳＬＥは、発症素因、発症原因、及び症状に到るまで、非常にヘテロジニアスな疾患であることを特徴としており、実際に、非特許文献１では、ＳＬＥ患者の末梢血球の遺伝子発現が、I型インターフェロン関連遺伝子群（ＩＦＮ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅｓ：ＩＳＧ）高値グループと、リンパ球系シグナチャー高値グループとに大別されると報告されている。このため、ＳＬＥは、病態の解明のみならず、診断及び治療方針の選択が非常に難しく、病態の遷延及び過度な免疫抑制治療による副作用は慢性臓器障害を生じさせるため、臨床上のリスクが非常に大きい。
近年、全身性エリトマトーデスに対する様々な支持療法の発展により、以前は７０％程度であった５年生存率も９５％程度に改善し、急性期治療成績は向上してきている。一方で、慢性炎症と薬の副作用による慢性臓器障害及びＱＯＬの低下が臨床上大きな課題となっている。
ＳＬＥに対する新規治療薬として多くの治験が行われてきたが、病態のヘテロジェナイティゆえに、一部の製剤を除いて悉く失敗しており、未だ、ステロイドと免疫抑制剤との組み合わせによる治療が主流である。一方で、ウイルス感染に重要なＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−Ｉ）、Ｂ細胞刺激因子のＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬなどが、ＳＬＥの疾患増悪因子として知られており、ＢＡＦＦ受容体を標的とした抗体（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）が臨床応用されるようになった。また、ＩＦＮ−Ｉ受容体を標的とした抗体（Ａｎｉｆｒｏｌｕｍａｂ）の第３相国際臨床試験も行われている、今後、ＳＬＥにおいても生物製剤による分子標的治療への道が開かれつつある。
Cell 165, 551-565, 2016
Ａｎｉｆｒｏｌｕｍａｂにおける第２相試験の結果から、ＡｎｉｆｒｏｌｕｍａｂはＩＦＮ−Ｉ関連遺伝子群の発現の高い患者で有効性が示されている。従って、ＩＦＮ−Ｉ高値症例の絞り込みがますます重要となっている。ここで、生体試料中の疾患因子の測定には一般的にＥＬＩＳＡ法が用いられるが、ＩＦＮ−Ｉ濃度についてはＥＬＩＳＡ法での検出は困難である。そこで、ＩＦＮ−Ｉ高値症例の絞り込みは、末梢血単核球における複数のＩＳＧ ｍＲＮＡの発現解析に基づいて試みられたが、非常に煩雑であることから実用性の点で課題がある。
Ｂｅｌｉｍｕｍａｂについては、臨床で使用されてはいるものの、Ｂｅｌｉｍｕｍａｂが有効な症例は不明であり、また、ＥＬＩＳＡ法によれば、ＢＡＦＦ活性が血中ＢＡＦＦ濃度依存的に得られないため、血中ＢＡＦＦ濃度に基づいた有効症例の絞り込みは奏功していない。その原因としては、Ｂ細胞刺激因子のリガンドＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬと受容体ＢＡＦＦＲ／ＴＡＣＩ／ＢＣＭＡとの関係が複雑であるために、ＢＡＦＦＲがＢＡＦＦのみに反応し、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡはＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬの両方に反応すること、並びに、それぞれが様々な多量体を形成することが考えられる。
このように、全身性エリトマトーデスの治療薬であるＩＦＮ−Ｉ受容体阻害剤及びＢＡＦＦ阻害剤について、それらの治療薬が有効な患者の絞り込みを行う手段はこれまで存在していなかった。
そこで、本発明の目的は、全身性エリトマトーデスの治療薬に対するコンパニオン診断薬を提供することを目的とする。
本発明者は鋭意検討を行った結果、ＳＬＥの疾患増悪因子を特異的に結合でき、且つ、当該憎悪因子によって応答又は活性化が誘導される制御領域と、制御領域の応答又は活性化により発現が誘導されるレポーター遺伝子を組み込んだレポーター細胞を用い、当該憎悪因子でレポーター細胞を刺激してレポーター遺伝子の発現を誘導したところ、レポーターシグナルが増悪因子の定量性に優れていることを見出した。その上、これまでＳＬＥ患者群における憎悪因子それぞれの分布は知られていなかったところ、レポーター細胞で憎悪因子を定量することで、ＩＦＮ−Ｉを多く発現している群と、ＢＡＦＦを多く発現している群とがあることを発見し、これにより、レポーター細胞が、全身性エリトマトーデスの治療薬に対するコンパニオン診断薬として有用であることも見出した。本発明は、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねることにより完成したものである。
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． ＩＦＮ−Ｉ受容体を発現しており、ＩＦＮ−Ｉ誘導性制御領域と、前記制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子とを含むレポーター構築物が導入された細胞を含む、全身性エリトマトーデスの治療薬に対するコンパニオン診断薬。
項２． 前記細胞がヒト胎児腎細胞である、請求項１に記載のコンパニオン診断薬。
項３． ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ受容体又はＢＡＦＦ受容体を発現しており、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ誘導性制御領域又はＢＡＦＦ誘導性制御領域と、前記制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子とを含むレポーター構築物が導入された細胞を含む、全身性エリトマトーデスの治療薬に対するコンパニオン診断薬。
項４． 前記ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ受容体が、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ及びＢＡＦＦ−Ｒからなる群より選択される、項３に記載のコンパニオン診断薬。
項５． 前記ＢＡＦＦ受容体が、ＢＡＦＦ−Ｒの細胞外領域とＢＣＭＡの細胞内領域とを含む融合タンパク質である、項３及び４に記載のコンパニオン診断薬。
項６． 前記細胞がヒト胎児腎細胞である、項３〜５のいずれかに記載のコンパニオン診断薬。
項７． 項１又は２に記載のコンパニオン診断薬と、項３〜５のいずれかに記載のコンパニオン診断薬とを含む、全身性エリトマトーデスの治療薬に対するコンパニオン診断キット。
項８． 被験動物から得られた生体試料について、項１又は２に記載のコンパニオン診断薬を用いて測定されるレポーター活性値を、ＩＦＮ−Ｉ活性値として取得する工程１と、
前記生体試料について、項３〜５のいずれかに記載のコンパニオン診断薬を用いて測定されるレポーター活性値を、ＢＡＦＦ活性値又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ活性値として取得する工程２と、
前記ＩＦＮ−Ｉ活性値並びに前記ＢＡＦＦ活性値又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ活性値に基づき、前記生体試料中のＩＦＮ−ＩとＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬとのうち、相対的に多く存在する全身性エリトマトーデス憎悪因子を決定する工程３と、を含む、生体試料の分析方法。
項９． 前記工程３が、
前記ＩＦＮ−Ｉ活性値並びに前記ＢＡＦＦ活性値又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ活性値を、ＩＦＮ−Ｉ軸とＢＡＦＦ軸又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ軸との二次元座標系に展開する工程３１と、
展開された座標が、ＩＦＮ−Ｉ活性値が相対的に高くＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬが相対的に低いグループと、ＩＦＮ−Ｉ活性値が相対的に低くＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬが相対的に高いグループとのいずれに属するかを決定する工程３２とを含む、項８に記載の分析方法。
項１０． 前記生体試料が血清である、項８又は９に記載の分析方法。
本発明によれば、全身性エリトマトーデスの治療薬に対するコンパニオン診断薬が提供されるため、全身性エリトマトーデスの治療薬選択の根拠を得ることができる。
ＩＦＮ−Ｉ用レポーター細胞（ＨＥＫ−ＢｌｕｅTMＩＦＮ−α／β細胞）の模式図である。 リコンビナントＩＦＮ−ａサンプル濃度と、図１のレポーター細胞によるＳＥＡＰ活性との関係を示す。 ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ用レポーター細胞（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＢＣＭＡ細胞）の模式図である。 リコンビナントＢＡＦＦ及びリコンビナントＡＰＲＩＬ濃度と、図３のレポーター細胞によるＳＥＡＰ活性との関係を示す。 ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ用レポーター細胞（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＴＡＣＩ細胞）の模式図である。 リコンビナントＢＡＦＦ及びリコンビナントＡＰＲＩＬ濃度と、図５のレポーター細胞によるＳＥＡＰ活性との関係を示す。 ＢＡＦＦ濃度と、ＨＥＫ−ｂｌｕｅ−ＢＡＦＦＲ細胞によるＳＥＡＰ活性との関係を示す。 ＢＡＦＦ濃度と、ＣＨＯ−Ｋ１−ＢＡＦＦＲ細胞によるＳＥＡＰ活性との関係を示す。 ＢＡＦＦ用レポーター細胞（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＢＡＦＦＲ／ＢＣＭＡ細胞）の作製手順を示す。 ＢＡＦＦ用レポーター細胞（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＢＡＦＦＲ／ＢＣＭＡ細胞）の作製手順（図９の続き）を示す。 ＢＡＦＦ用レポーター細胞（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＢＡＦＦＲ／ＢＣＭＡ細胞）の模式図である。 リコンビナントＢＡＦＦ及びリコンビナントＡＰＲＩＬと、図１１のレポーター細胞によるＳＥＡＰ活性との関係を示す。 健康人（ＨＣ）１０名又はＳＬＥ患者２９名の血清の、ＩＦＮ−Ｉ活性、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ活性、及びＢＡＦＦ活性を示す。 図１のＩＦＮ−Ｉ用レポーター細胞によって測定されたＩＦＮ−Ｉ活性と、図３のＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ用レポーター細胞によって測定されたＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ活性とを二次元散布図として展開した結果を示す。 図１のＩＦＮ−Ｉ用レポーター細胞によって測定されたＩＦＮ−Ｉ活性と、図１１のＢＡＦＦ用レポーター細胞によって測定されたＢＡＦＦ活性とを二次元散布図として展開した結果を示す。
１．コンパニオン診断薬
本発明のコンパニオン診断薬は、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）治療薬に対する有効性を予測するコンパニオン診断薬として用いられるものであり、憎悪因子による刺激によってレポーター活性を生じるように設計された細胞（以下において、レポーター細胞とも記載する。）を含む。
１−１．ＳＬＥ治療薬
本発明のコンパニオン診断薬が有効性を予測するＳＬＥ治療薬としては、ＳＬＥの疾患憎悪因子又はその受容体に対する抗体が挙げられる。ＳＬＥの疾患憎悪因子としては、インターフェロン（ＩＦＮ−Ｉ）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）が挙げられる。具体的なＳＬＥ治療薬としては、ＩＦＮ−Ｉをターゲットとする治療薬として、ＩＦＮ−Ｉ受容体の中和抗体（例えば、Ａｎｉｆｒｏｌｕｍａｂ）が挙げられ、ＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬをターゲットとする治療薬として、ＢＡＦＦに対する抗体又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬに対する抗体（例えば、Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）が挙げられる。
１−２．レポーター細胞
本発明のコンパニオン診断薬に含まれるレポーター細胞は、ＳＬＥ増悪因子に対する受容体を表面に安定発現しており、ＳＬＥ増悪因子誘導性制御領域と、前記制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子とを含むレポーター構築物が導入された細胞である。このように設計されることで、レポーター細胞は、生体試料中に存在するＳＬＥ憎悪因子をレポーター活性により定量するために用いることができる。具体的には、生体試料中に存在するＳＬＥ憎悪因子がレポーター細胞表面の受容体に結合することで、ＳＬＥ憎悪因子のシグナル伝達経路に対してＳＬＥ憎悪因子誘導性制御領域が応答又は活性化され、それによりレポーター遺伝子の発現（レポーター分子の産生）を誘導することができ、更に、産生されたレポーター分子に由来するシグナル量（レポーター活性）を定量することで、生体試料中に存在するＳＬＥ憎悪因子を定量することができる。
本発明において用いられるレポーター細胞は、生体試料中に存在するＩＦＮ−Ｉを定量するために用いられるレポーター細胞として、ＩＦＮ−Ｉ受容体を発現しており、ＩＦＮ−Ｉ誘導性制御領域と、前記制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子とを含むレポーター構築物が導入された細胞（以下において、「ＩＦＮ−Ｉ用レポーター細胞」とも記載する。）；並びに、ＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ（以下において、「ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ」とも記載する。）又はＢＡＦＦを定量するために用いられるレポーター細胞として、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ受容体又はＢＡＦＦ受容体を発現しており、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ誘導性制御領域又はＢＡＦＦ誘導性制御領域と、前記制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子とを含むレポーター構築物が導入された細胞（以下において、それぞれ「ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ用レポーター細胞」又は「ＢＡＦＦ用レポーター細胞」とも記載する。）を含む。
１−２−１．ＳＬＥ増悪因子に対する受容体
ＳＬＥ増悪因子に対する受容体は、所定のＳＬＥ増悪因子に対して特異的であり、当該ＳＬＥ憎悪因子の刺激を細胞内シグナルに変換して細胞の反応を開始させる機能を有するタンパク質である。
ＩＦＮ−Ｉ用レポーター細胞の表面に発現しているＩＦＮ−Ｉ受容体としては、ＩＦＮ−Ｉに対して特異的であり、ＩＦＮ−Ｉの刺激を細胞内シグナルに変換して細胞の反応を開始させる機能を有するタンパク質であれば特に限定されず、野生型及び変異型を問わない。ＩＦＮ−Ｉ受容体の具体例としては、ＩＦＮＡＲ−１及びＩＦＮＡＲ−２からなる複合体等が挙げられる。
ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ用レポーター細胞の表面に発現しているＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ受容体としては、ＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬの両方に対して特異的であり、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬの刺激を細胞内シグナルに変換して細胞の反応を開始させる機能を有するタンパク質であれば特に限定され、野生型及び変異型を問わない。ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ受容体の具体例としては、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）、ＴＡＣＩ（膜貫通活性化因子又はカルシウム調節シクロフィリンリガンド相互作用因子）及びＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体）等が挙げられる。
ＢＡＦＦ用レポーター細胞の表面に発現しているＢＡＦＦ受容体としては、ＢＡＦＦに対して特異的である一方でＡＰＲＩＬに対しては特異的でなく、ＢＡＦＦの刺激を細胞内シグナルに変換して細胞の反応を開始させる機能を有するタンパク質であれば特に限定され、野生型及び変異型を問わない。ＢＡＦＦ受容体の具体例としては、上記のＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ受容体のうちのいずれかの細胞外領域と、上記のＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ受容体のうちの他のいずれかの細胞内領域とを含む融合タンパク質が挙げられ、より具体的には、ＢＡＦＦ−Ｒの細胞外領域とＢＣＭＡの細胞内領域とを含む融合タンパク質（以下において、「ＢＡＦＦＲ−ＢＣＭＡキメラ受容体」とも記載する。）が挙げられる。ＢＡＦＦＲ−ＢＣＭＡキメラ受容体は、ＢＡＦＦ−Ｒの細胞外領域（ＥＣＤ）とＢＣＭＡの細胞内領域（ＩＣＤ）とを含んでいればよく、膜貫通領域（ＴＭＤ）については、ＢＡＦＦ−Ｒ及びＢＣＭＡのいずれの受容体の膜貫通領域を用いてもよい。従って、ＢＡＦＦＲ−ＢＣＭＡキメラ受容体は、具体的には、ＢＡＦＦ−ＲのＥＣＤと、ＢＣＭＡのＴＭＤと、ＢＣＭＡのＩＣＤとを含んで構成してもよいし、ＢＡＦＦ−ＲのＥＣＤと、ＢＡＦＦ−ＲのＴＭＤと、ＢＣＭＡのＩＣＤとを含んで構成してもよい。さらに、これらのキメラ受容体においては、ＥＣＤとＴＭＤとの間及び／又はＴＭＤとＩＣＤとの間、好ましくはＥＣＤとＴＭＤとの間に、例えば１〜６アミノ酸残基、好ましくは２〜５アミノ酸残基、更に好ましくは２〜４アミノ酸残基からなる他のアミノ酸配列が介入していてもよい。例えば、ＢＡＦＦ−ＲのＥＣＤと、ＢＣＭＡのＴＭＤと、ＢＣＭＡのＩＣＤを含んで構成されるキメラ受容体は、ＢＡＦＦ−ＲのＥＣＤと、ＢＣＭＡのＴＭＤのＥＣＤ側に隣接するアミノ酸配列（上記他のアミノ酸配列に該当する）と、ＢＣＭＡのＴＭＤと、ＢＣＭＡのＩＣＤとがこの順で直接連結するように構成されていてもよい。
１−２−２．ＳＬＥ憎悪因子誘導性の制御領域
本発明で用いられるレポーター細胞において、ＳＬＥ憎悪因子誘導性の制御領域は、レポーター遺伝子の発現を制御しており、ＳＬＥ憎悪因子で刺激されることによって、レポーター遺伝子を発現するよう応答又は活性化が誘導される領域である。ＳＬＥ憎悪因子誘導性の制御領域は、当業者が適宜選択することができる。
ＩＦＮ−Ｉ用レポーター細胞におけるＩＦＮ−Ｉ誘導性制御領域としては、ＩＦＮ−Ｉの刺激に応答するプロモーター（ＩＦＮ−Ｉシグナル応答配列）を用いることができ、野生型及び変異型を問わない。ＩＦＮ−Ｉ誘導性制御領域の具体例としては、ＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーター等が挙げられる。
ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ用レポーター細胞又はＢＡＦＦ用レポーター細胞におけるＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ誘導性制御領域又はＢＡＦＦ誘導性制御領域としては、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦによって活性化する転写制御配列を用いることができ、野生型及び変異型を問わない。ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ誘導性制御領域又はＢＡＦＦ誘導性制御領域の具体例としては、ＮＦ−κＢ遺伝子、ＡＰ−１遺伝子、ＮＦ−ＡＴ遺伝子、ＰＰＡＲ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ＨＩＦ−１遺伝子、ＣＲＥＢ遺伝子等が挙げられる。これらの転写制御配列は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。好ましい転写制御配列としては、ＮＦ−κＢ遺伝子及びＡＰ−１遺伝子が組み合わせられたＮＦ−κＢ／ＡＰ１レポーター構造体が挙げられる。
１−２−３．レポーター遺伝子
レポーター遺伝子は、上記の制御領域の下流に連結されており、制御領域がＳＬＥ憎悪因子による刺激で応答又は刺激されることでその発現が誘導（上方制御）される。
レポーター遺伝子としては、当業者が適宜決定することができるが、例えば、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ルシフェラーゼ、カタラーゼ、ＬａｃＺ等の発色タンパク質の遺伝子；Ｖｅｎｕｓ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ｄｓＲｅｄ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＦｌＡｓＨ、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲＦＰ１、ｍＰｌｕｍ、ＰｈｉＹＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ等の蛍光タンパク質の遺伝子を用いることができる。これらのレポーター遺伝子の中でも、定量感度の観点から、好ましくはＳＥＡＰ遺伝子が挙げられる。
１−２−４．細胞
レポーター細胞として用いられる細胞としては特に限定されず、原核細胞及び真核細胞を問わない。原核細胞としては、大腸菌、桿菌、酵母等があげられる。真核細胞としては、好ましくは哺乳類細胞、昆虫類細胞等が挙げられ、より具体的には、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３等）、骨髄腫（ＳＰ２／０、ｖＮＳ０等）、肺癌腫（Ａ５４９等）、結腸癌腫（ＨＣＴ１１６等）、子宮頸癌腫（ＨｅＬａ等）、リンパ球（Ｊｕｒｋａｔ Ｔ、Ｒａｍｏｓ Ｂ等）、単球（ＴＨＰ−１等）等のヒト細胞、メラノーマ（Ｂ１６等）、マクロファージ（Ｊ７７４、ＲＡＷ ２６４．７等）等のマウス細胞等が挙げられる。これらの細胞の中でも、好ましくは真核細胞が挙げられ、より好ましくは哺乳類細胞が挙げられ、更に好ましくはヒト細胞が挙げられ、一層好ましくはヒト胎児腎細胞が挙げられる。
１−２−５．レポーター細胞の作製
レポーター細胞は、必要な遺伝情報を組み込んだ核酸構築物を細胞に導入する公知の方法によって作製することができる。細胞に導入するための核酸構築物は、導入する細胞に応じて、当業者が適宜設計することができる。
例えば、レポーター細胞の作製方法は、前記１−２−４に記載の細胞に、ＳＬＥ増悪因子誘導性制御領域と、前記制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子とを含むレポーター構築物を導入する工程を含むことができる。レポーター構築物は、ＳＬＥ増悪因子誘導性制御領域とレポーター遺伝子とを、レポーター遺伝子が発現可能となるように公知の方法で連結することで作製することができる。なお、この工程は、既に前記１−２−４に記載の細胞にレポーター構築物が組み込まれたものを用いることで省略することもできる。このような細胞は市販されており、その例としては、ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞（ＮＦκＢおよびＡＰ１の結合配列の下流にＳＥＡＰを繋いだベクターがＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入されたもの）、ＨＥＫ−ＢｌｕｅTMＩＦＮ−α／β細胞（ＩＦＮ−Ｉシグナル応答性のＩＳＧ５４プロモーターの下流にＳＥＡＰを繋いだベクターがＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入されたもの）が挙げられる。
レポーター細胞の作製方法は、必要に応じ、ＳＬＥ増悪因子受容体をコードする核酸を細胞に導入する工程を含んでもよい。この場合、ＳＬＥ増悪因子受容体をコードする核酸と上記のレポーター構築物とを組み合わせた核酸構築物を前記１−２−４に記載の細胞に導入してもよいし、ＳＬＥ増悪因子受容体をコードする核酸を単独で組み込んだ核酸構築物を、既に前記１−２−４に記載の細胞にレポーター構築物が組み込まれたものに導入してもよい。なお、この工程は、既に前記１−２−４に記載の細胞にＳＬＥ増悪因子受容体が発現しているものを用いることで省略することもできる。このような細胞は市販されており、その例としては、ＨＥＫ−ＢｌｕｅTMＩＦＮ−α／β細胞（ＩＦＮ−Ｉの受容体であるＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２がＨＥＫ２９３Ｔ細胞表面に発現しているもの）が挙げられる。
ＩＦＮ−Ｉ用レポーター細胞の作製においては、ＩＦＮ−Ｉ受容体（例えば、ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２）をコードする核酸を導入することができる。
ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ用レポーター細胞の作製においては、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ受容体（例えば、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−Ｒ）をコードする核酸を導入することができる。
ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−Ｒをコードする核酸の配列の例としては、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３に示す塩基配列が挙げられる。また、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−Ｒをコードする核酸の配列の例としては、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３に示す塩基配列に相補する塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、それぞれＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−Ｒと同等の活性（ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬに特異的で、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬにより制御領域の応答又は活性化を特異的に誘導する活性）を有する遺伝子産物（タンパク質）をコードする塩基配列も挙げられる。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列とは、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／Ｌ ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ及び１．８５ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）、２×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡを含む溶液中で４２℃でハイブリダイゼーション、続いて０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄する条件、又はこれと等価の条件を含む。更に、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−Ｒをコードする核酸の配列の例としては、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３に示す塩基配列に対して、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の同一性を有し、且つ、それぞれＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−Ｒと同等の活性（ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬに特異的で、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬにより制御領域の応答又は活性化を特異的に誘導する活性）を有する遺伝子産物（タンパク質）をコードする塩基配列も挙げられる。塩基配列の同一性は、２つの塩基配列の間の最適アライメントを決定、比較することによって算定される。塩基配列の最適アライメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３ （１９７０））の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ （１９８８））の類似性方法のためのサーチによって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，及びＴＦＡＳＴＡ）によって、又は検分によって、Ｓｍｉｔｈら（Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２ （１９８１））の局所相同性アルゴリズムを用いて行うことができる。配列類似性を測定するのに適したアルゴリズムはＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））ｏｙｏｂｉＳｈｐａｅｒ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３８：１７９−１９１（１９９６））に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｗｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で公的に入手可能である。
また、ＢＡＦＦ用レポーター細胞の作製においては、ＢＡＦＦ受容体（具体的には、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ受容体のうちのいずれかの細胞外領域と、上記のＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ受容体のうちの他のいずれかの細胞内領域とを含む融合タンパク質、好ましくは、ＢＡＦＦ−Ｒの細胞外領域とＢＣＭＡの細胞内領域とを含む融合タンパク質）をコードする核酸配列を導入することができる。ＢＡＦＦ−Ｒの細胞外領域とＢＣＭＡの細胞内領域とを含む融合タンパク質をコードする核酸配列は、ＢＡＦＦ−Ｒの細胞外領域（ＥＣＤ）をコードする核酸配列とＢＣＭＡの細胞内領域（ＩＣＤ）をコードする核酸配列とが、膜貫通領域（ＴＭＤ）をコードする核酸配列を介して連結されているキメラ遺伝子である。膜貫通領域（ＴＭＤ）をコードする核酸配列は、ＢＡＦＦ−Ｒ及びＢＣＭＡのいずれの受容体に由来していてもよい。さらに、これらのキメラ遺伝子において、ＥＣＤをコードする核酸配列とＴＭＤをコードする核酸配列との間及び／又はＴＭＤをコードする核酸配列とＩＣＤをコードする核酸配列との間、好ましくはＥＣＤをコードする核酸配列とＴＭＤをコードする核酸配列との間に、例えば３〜１８塩基、好ましくは６〜１５塩基、更に好ましくは６〜１２塩基の他の核酸配列が介入していてもよい。例えば、ＢＡＦＦ−ＲのＥＣＤをコードする核酸配列と、ＢＣＭＡのＴＭＤをコードする核酸配列と、ＢＣＭＡのＩＣＤをコードする核酸配列を含んで構成されるキメラ遺伝子は、ＢＡＦＦ−ＲのＥＣＤをコードする核酸配列と、ＢＣＭＡのＴＭＤをコードする核酸配列の上流側に隣接する核酸配列（上記他の核酸配列に該当する）と、ＢＣＭＡのＴＭＤコードする核酸配列と、ＢＣＭＡのＩＣＤコードする核酸配列とがこの順で直接連結するように構成されていてもよい。このキメラ遺伝子の作成方法は、当業者が適宜決定することができるが、例えば、必要な核酸断片を、オーバーラップＰＣＲ法等の公知の方法で連結することで作製する方法が挙げられる。
ＢＡＦＦ−Ｒの細胞外領域とＢＣＭＡの細胞内領域とを含む融合タンパク質をコードする核酸配列の例としては、配列番号４及び配列番号５に示す塩基配列が挙げられ、好ましくは配列番号４に示す塩基配列が挙げられる。また、ＢＡＦＦ−Ｒの細胞外領域とＢＣＭＡの細胞内領域とを含む融合タンパク質をコードする核酸配列の例としては、配列番号４及び配列番号５に示す塩基配列に相補する塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、それぞれＢＡＦＦ−Ｒと同等の活性（ＢＡＦＦに特異的で、ＢＡＦＦにより制御領域の応答又は活性化を特異的に誘導する活性）を有する遺伝子産物（タンパク質）をコードする塩基配列も挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、前述する条件と同様である。更に、ＢＡＦＦ−Ｒの細胞外領域とＢＣＭＡの細胞内領域とを含む融合タンパク質をコードする核酸配列の例としては、配列番号４及び配列番号５に示す塩基配列に対して、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の同一性を有し、且つＢＡＦＦ−Ｒと同等の活性（ＢＡＦＦに特異的で、ＢＡＦＦにより制御領域の応答又は活性化を特異的に誘導する活性）を有する遺伝子産物（タンパク質）をコードする核酸配列も挙げられる。ここで、塩基配列の「同一性」については、前述する算定法により求めることができる。
レポーター細胞の作製方法は、必要に応じ、ＳＬＥ増悪因子シグナル経路を得るために、当該シグナル経路を構築する遺伝子含む核酸構築物を前記の細胞に導入する工程を含んでもよい。例えば、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）をベースとしたＩＦＮ−Ｉ用レポーター細胞の作製においては、ＩＦＮ−Ｉシグナル伝達経路を得るために、ＳＴＡＴ２およびＩＲＦ９遺伝子を導入することができる。これによって、他の遺伝子（ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＪＡＫ１、ＴｙＫ２、およびＳＴＡＴ１）を自動発現することができる。なお、この工程は、既に前記１−２−４に記載の細胞にシグナル経路が構築されているものを用いることで省略することもできる。このような細胞は市販されており、その例としては、ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社のＨＥＫ−ＢｌｕｅTMＩＦＮ−α／β細胞（ＩＦＮ−Ｉシグナル伝達経路を得るために、ヒトＳＴＡＴ２およびＩＲＦ９遺伝子をＨＥＫ２９３細胞に安定的にトランスフェクションすることにより生成されたものであり、シグナル伝達経路を構成するＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＪＡＫ１、ＴｙＫ２、及びＳＴＡＴ１を自然発現させたもの）が挙げられる。
上記のレポーター構築物等の核酸構築物を前記１−２−４に記載の細胞に導入する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、当該核酸構築物を、適宜、プロモーターに作動可能（当該プロモーターによって核酸構築物の転写が制御されている状態）に連結してベクターを作製し、当該ベクターを用いて核酸構築物を上記１−２−４に記載の細胞に形質導入することができる。
上記のベクターとしては、ＢＡＢＥベクター等のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ付随ウイルスベクター（ＡＡＶ）等のウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターは、核酸構築物及びプロモーター以外に、複製開始点、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー等を含んでいてもよい。
前記１−２−４に記載の細胞への核酸構築物の導入は、公知の方法を用いることができる。使用して前記１−２−４に記載の細胞に導入することができる。細胞への導入をインビトロで行う場合、トランスフェクション、リポソーム、ウイルス感染などの方法を用いることができ、好ましくはウイルス感染を用いることができる。
細胞への導入をウイルス感染により行う場合は、ウイルスベクターをウイルス粒子にパッケージ化（ウイルス化）したウイルス構築物を用いることができる。ウイルス化に用いるウイルスとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、レオウイルス、アデノ随伴ウイルス等を用いることができる。また、ウイルス化においては、上記のウイルスベクター以外に、発現効率向上及び／又は感染力向上のために、適宜他のベクターを同時にパッケージ化することもできる。発現効率向上のための他のベクターとしては、例えば、ＳＩＮベクターと呼ばれる、ＬＴＲのエンハンサー／プロモーター部分を削除して安定性を高めたベクターが挙げられ、感染力向上のための他のベクターとしては、パントロピック（ＶＳＶ−Ｇ）、エコトロピック（ｇｐ７０）、アンホトロピック（４０７０Ａ）、あるいはデュアルトロピック（１０Ａ１）等のエンベロープタンパク質をコードするベクターが挙げられる。
１−２−６．その他の成分
本発明のコンパニオン診断薬は、前記レポーター細胞の他に、緩衝液、安定化剤、防腐剤等を含んでいてもよく、また、従来公知の方法に従って製剤化されていてもよい。
２．コンパニオン診断キット
本発明のコンパニオン診断キットは、ＳＬＥ治療薬に対する有効性を予測するコンパニオン診断のために用いられるものであり、上述のコンパニオン診断薬を含む。
本発明のコンパニオン診断キットに含まれるコンパニオン診断薬は、ＩＦＮ−Ｉ用レポーター細胞を含むコンパニオン診断薬と、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ用レポーター細胞及び／又はＢＡＦＦ用レポーター細胞を含むコンパニオン診断薬とを含む。これによって、後述の生体試料の分析方法を行うことができる。
本発明のコンパニオン診断キットには、他に、発現したレポーター分子の検出を可能とする検出試薬、洗浄剤、コントロール試料、検査プロトコル等が含まれていてもよい。検査プロトコルには、後述の生体試料の分析方法を行う操作及び手順等の情報が含まれる。
３．生体試料の分析方法
本発明の生体試料の分析方法は、上記のコンパニオン診断薬を用いて、生体試料中のＳＬＥ憎悪因子を測定する方法であり、後述の工程１、工程２及び工程３を含む。また、工程３は、後述の工程３１及び工程３２を含むことができる。これによって、生体試料に由来する被験動物の、ＳＬＥ治療薬の有効性を予測するコンパニオン診断を行うことが可能となる。なお、工程１及び工程２は、順不同であり、工程３は、工程１及び工程２の後に行う。
３−１．工程１
工程１では、被験動物から得られた生体試料について、上記のＩＦＮ−Ｉ用レポーター細胞を含むコンパニオン診断薬を用いて測定されるレポーター活性値を、ＩＦＮ−Ｉ活性値として取得する。
生体試料としては、ＳＬＥに対してコンパニオン診断すべき被験動物から採取した生体試料であれば特に限定されないが、好ましくは血液試料が挙げられる。血液試料の種類はＳＬＥ憎悪因子を検出し得る限り特に限定されないが、例えば全血、血清、血漿等が挙げられる。簡便に調製することができ、より感度良くＳＬＥ憎悪因子を定量する観点から血清が好適な例として挙げられる。
被験動物としては特に限定されず、具体的には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類及びウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。これらの被験動物の中でも、好ましくは霊長類、更に好ましくはヒトが挙げられる。
生体試料とＩＦＮ−Ｉ用レポーター細胞とを接触させることで、生体試料中のＩＦＮ−Ｉがレポーター細胞を刺激し、レポーター分子が発現する。
レポーター活性値の測定方法は、生じたレポーター分子の種類に応じて当業者が適宜決定することができる。例えばレポーター分子が発色タンパク質である場合は、対応する発色基質を加えて発色させ、得られたシグナルを測定することができる。また、レポーター分子が蛍光タンパク質である場合は、蛍光タンパク質そのもののシグナルを測定することができる。
３−２．工程２
工程２では、工程１の対象となった生体試料について、上記のＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ用レポーター細胞又はＢＡＦＦ用レポーター細胞を含むコンパニオン診断薬を用いて測定されるレポーター活性値を、ＢＡＦＦ活性値又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ活性値として取得する。
生体試料とＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ用レポーター細胞又はＢＡＦＦ用レポーター細胞とを接触させることで、生体試料中のＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦがレポーター細胞を刺激し、レポーター分子が発現する。
レポーター活性値の測定方法は、工程１と同じ方法で行うことができる。
３−３．工程３
工程３では、工程１で得られたＩＦＮ−Ｉ活性値、並びに、工程２で得られたＢＡＦＦ活性値又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ活性値に基づき、前記生体試料中のＩＦＮ−ＩとＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬとのうち、相対的に多く存在する全身性エリトマトーデス憎悪因子を決定する。
例えば、前記生体試料中のＩＦＮ−ＩとＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬとのうち、ＩＦＮ−Ｉが相対的に多くＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬが相対的に少なく含まれていると決定される場合は、被験動物が、ＩＦＮ−Ｉをターゲットとする治療薬に対して感受性が高いと判断することができる。また、前記生体試料中のＩＦＮ−ＩとＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬとのうち、ＩＦＮ−Ｉが相対的に少なくＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬが相対的に多く含まれていると決定される場合は、被験動物が、ＢＡＦＦをターゲットとする治療薬に対して感受性が高いと判断することができる。
ＩＦＮ−ＩとＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬとのうちいずれが相対的に多いかの決定は、ＳＬＥ患者群から経験的に取得したＩＦＮ−Ｉ活性値とＢＡＦＦ活性値又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ活性値との分布データに基づいて行うことができる。この分布データにおいて、予め、「ＩＦＮ−Ｉが相対的に多くＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬが相対的に少ない」群と「ＩＦＮ−Ｉが相対的に少なくＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬが相対的に多い」群と（更に、「ＩＦＮ−ＩとＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬとが両方とも低い」群と「ＩＦＮ−ＩとＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬとが両方とも高い」群と）の範囲を経験的に決定しておき、測定対象の生体試料のデータを当てはめることで、いずれの群に属するか、若しくはいずれの群にも属さないかを判断することができる。この分布データを、ＩＦＮ−Ｉをターゲットとする治療薬又はＢＡＦＦをターゲットとする治療薬による治療成績を根拠に分類すると、さらに感度のよいコンパニオン診断が可能となる。
３−３−１．工程３１
工程３では、工程３１として、前記ＩＦＮ−Ｉ活性値並びに前記ＢＡＦＦ活性値又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ活性値を、ＩＦＮ−Ｉ軸とＢＡＦＦ軸又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ軸との二次元座標系に展開する工程を含むことができる。
３−３−２．工程３２
工程３では、工程３１の後、展開された座標が、ＩＦＮ−Ｉ活性値が相対的に高くＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬが相対的に低いグループと、ＩＦＮ−Ｉ活性値が相対的に低くＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬが相対的に高いグループとのいずれに属するかを決定することができる。これによって、相対的に多く存在する全身性エリトマトーデス憎悪因子の決定を視覚的に容易に行うことができる。
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
試験例１：ＩＦＮ−Ｉ用レポーター細胞（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ TM ＩＦＮ−α／β細胞）
（レポーター細胞）
ＩＦＮ−Ｉ用レポーター細胞としては、ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社製のＨＥＫ−ＢｌｕｅTMＩＦＮ−α／β細胞を用いた。このレポーター細胞の模式図を図１に示す。このレポーター細胞は、ＩＦＮ−Ｉシグナル経路を構築するヒトＳＴＡＴ２およびＩＲＦ９遺伝子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に安定的にトランスフェクションすることにより生成されたものであり、ＩＦＮ−Ｉシグナル経路を構築する他の遺伝子（Ｒｅｃｅｔｏｒ（ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２）、ＪＡＫ１、ＴｙＫ２、およびＳＴＡＴ１）も発現している。また、この細胞には、ＩＦＮ−Ｉ誘導性ＩＳＧ（ＩＳＧ５４プロモーター）及びその制御下にある誘導性ＳＥＡＰ（分泌型アルカリ性ホスファターゼ）レポーター遺伝子が導入されている。つまり、この細胞は、ＩＦＮによって細胞が刺激されると、Ｒｅｃｅｐｔｏｒを介したシグナル経路によりＩＳＧが応答し、ＳＥＡＰを発現するように設計されている。
（ＩＦＮによる刺激とレポーター活性）
リコンビナントＩＦＮ−ａ又はＩＦＮ−ｂを１０００Ｕ／ｍｌで含むサンプルを８段階希釈し、希釈系列サンプルを調製した。希釈系列サンプルそれぞれと、１ウェル当たり２５，０００細胞のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＩＦＮ−ａ／ｂ細胞とを混合し、室温（３７℃）で２４時間培養した。培養後、培養上清のＳＥＡＰ活性を取得するため、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に対する発色（ＯＤ６２０）を吸光度計にて測定した。
これによって得られた、サンプル濃度とＳＥＡＰ活性との関係を図２に示す。図２に示されるとおり、ＨＥＫ−ＢｌｕｅTMＩＦＮ−α／β細胞は、ＩＦＮ−ａ刺激に対して、感度が高く、且つ濃度依存的にＳＥＡＰ活性を生じることが分かった。なお、ＨＥＫ−ＢｌｕｅTMＩＦＮ−α／β細胞は、ＩＦＮ−ｂ刺激に対しても同様に、感度が高く、且つ濃度依存的にＳＥＡＰ活性を生じることが分かった。
試験例２：ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ用レポーター細胞（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＢＣＭＡ細胞）
（レポーター細胞の作製）
ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ用レポーター細胞として、以下のように、ＢＣＭＡ強制発現株であるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＢＣＭＡ細胞を作製した。このレポーター細胞の模式図を図３に示す。このレポーター細胞は、ＢＣＭＡが強制発現されており、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＮＦκＢおよびＡＰ１の結合配列の下流にＳＥＡＰを繋いだベクターが導入されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）に対して、ＢＣＭＡを強制発現させた細胞である。
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から、以下のプライマーを用いたＰＣＲ増幅により、配列番号１に示すＢＣＭＡをコードするＤＮＡを得た。
Fw: 5'-AATTCTGCAGCGGCCGCATGTTGCAGATGGCTGGG-3'（配列番号６）
Rv: 5'-GGAGAGGGGCGGATCCTTACCTAGCAGAAATTGATTTC-3'（配列番号７）
ＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ２−Ｖｅｎｕｓ（Ｎｏｔ１／ＢａｍＨ１で切断したレンチウイルスベクター；ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ ＤＮＡ ＢＡＮＫより入手、Ｃａｔ．ＲＤＢ０４３８３）レンチウイルスベクターに、得られたＰＣＲ産物をＩｎｆｕｓｉｏｎ法にて挿入し、ＢＣＭＡ−発現レンチウイルスベクターをクローニングした。このベクターと、ＶＳＶ−Ｇ／Ｒｅｖプラスミド、ＳＩＮプラスミドをトランスフェクトした。７２時間培養後、上清を回収してＰＥＧで濃縮し、ＢＣＭＡ−発現レンチウイルスを得た。
得られたウイルスをＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞に感染させて形質導入し、限界希釈法にて、ＢＣＭＡを発現するシングルクローン（ＢＣＭＡを強制発現株；ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＢＣＭＡ細胞）を樹立した。また、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）にて、ＢＣＭＡの細胞表面への発現を確認した。
（ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬによる刺激とレポーター活性）
ＢＣＭＡのリガンドであるリコンビナントＢＡＦＦ及びリコンビナントＡＰＲＩＬを用い、試験例１と同様にして、レポーター細胞の刺激及びそれによるレポーター活性を測定した。
これによって得られた、サンプル濃度とＳＥＡＰ活性との関係を図４に示す。図４に示されるとおり、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＢＣＭＡ細胞は、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ刺激に対して、感度が高く、且つ濃度依存的にＳＥＡＰ活性を生じることが分かった。
試験例３：ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ用レポーター細胞（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＴＡＣＩ細胞）
（レポーター細胞の作製）
ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ用レポーター細胞として、以下のように、ＴＡＣＩ強制発現株であるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＢＣＭＡ細胞を作製した。このレポーター細胞の模式図を図５に示す。このレポーター細胞は、ＴＡＣＩが強制発現されており、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＮＦκＢおよびＡＰ１の結合配列の下流にＳＥＡＰを繋いだベクターが導入されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）に対して、ＴＡＣＩを強制発現させた細胞である。
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から、以下のプライマーを用いたＰＣＲ増幅により配列番号２に示すＴＡＣＩをコードするＤＮＡを得た。
Fw: 5'-AATTCTGCAGCGGCCGCATGAGTGGCCTGGGCCGG-3'（配列番号８）
Rv: 5'-GGAGAGGGGCGGATCCTTATGCACCTGGGCCCCC-3'（配列番号９）
ＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ２−Ｖｅｎｕｓ（Ｎｏｔ１／ＢａｍＨ１で切断したレンチウイルスベクター；ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ ＤＮＡ ＢＡＮＫより入手、Ｃａｔ．ＲＤＢ０４３８３）レンチウイルスベクターに、得られたＰＣＲ産物をＩｎｆｕｓｉｏｎ法にて挿入し、ＴＡＣＩ−発現レンチウイルスベクターをクローニングした。このベクターと、ＶＳＶ−Ｇ／Ｒｅｖプラスミド、ＳＩＮプラスミドをトランスフェクトした。７２時間培養後、上清を回収してＰＥＧで濃縮し、ＴＡＣＩ−発現レンチウイルスを得た。
得られたウイルスをＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞に感染させて形質導入し、限界希釈法にて、ＢＣＭＡを発現するシングルクローン（ＢＣＭＡを強制発現株；ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＴＡＣＩ細胞）を樹立した。また、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）にて、ＴＡＣＩの細胞表面への発現を確認した。
（ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬによる刺激とレポーター活性）
ＴＡＣＩのリガンドであるリコンビナントＢＡＦＦ及びリコンビナントＡＰＲＩＬを用い、試験例１と同様にして、レポーター細胞の刺激及びそれによるレポーター活性を測定した。
これによって得られた、サンプル濃度とＳＥＡＰ活性との関係を図６に示す。図６に示されるとおり、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＴＡＣＩ細胞は、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ刺激に対して、感度が高く、且つ濃度依存的にＳＥＡＰ活性を生じることが分かった。
予備試験例１：ＨＥＫ−ｂｌｕｅ−ＢＡＦＦＲ細胞
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞に、ＢＡＦＦのみと結合するＢＡＦＦ−Ｒを受容体として発現させた、ＨＥＫ−ｂｌｕｅ−ＢＡＦＦＲ細胞を作製した。具体的には、Ｖｅｃｔｏｒ−ｂｕｉｌｄｅｒ社にてＥＦ１ａ−ＢＡＦＦＲ−Ｔ２Ａ−ＲＦＰレンチウイルスベクターを作成し（ＢＡＦＦ−Ｒをコードする配列として用いた配列は配列番号３に示す通りであり、Ｔ２Ａへの連結のため、ＢＬＡＳＴデータベース配列から終結コドンtaaを取り除いて使用した。）、ウイルス化した後、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞に強制発現させることによって、ＨＥＫ−ｂｌｕｅ−ＢＡＦＦＲ細胞を得た。また、ＦＡＣＳにてＢＡＦＦ−Ｒの細胞表面への発現を確認した。
ＢＡＦＦ−ＲのリガンドであるＢＡＦＦを用い、試験例１と同様にして、細胞の刺激及びそれによるレポーター活性を測定した。
これによって得られた、サンプル濃度とＳＥＡＰ活性との関係を図７に示す。図７に示されるとおり、ＨＥＫ−ｂｌｕｅ−ＢＡＦＦＲ細胞は、ＢＡＦＦに対して反応しなかった。つまり、ＨＥＫ−ｂｌｕｅ−ＢＡＦＦＲ細胞には、ＢＡＦＦ−ＲからＮＦκＢの活性化に至るシグナル分子が欠落していると考えられる。従って、ＮＦκＢがＢＡＦＦ誘導性として機能しておらず、本発明のレポーター細胞として構築されなかった。
予備試験例２：ＣＨＯ−Ｋ１−ＢＡＦＦＲ細胞
ハムスター卵巣由来細胞であるＣＨＯ−Ｋ１細胞に、ＡＰ１遺伝子及びＮＦκＢ遺伝子とＳＥＡＰ遺伝子とを組み込み、ＢＡＦＦのみと結合するＢＡＦＦ−Ｒを受容体として発現させた、ＣＨＯ−Ｋ１−ＢＡＦＦＲ細胞を作製した。具体的には、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ 社より購入したｐＮｉＦｔｙ３−ＳＥＡＰ ｖｅｃｔｏｒ（ＡＰ１−ＮＦｋＢ−ｍＩＦＮ−βｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＳＥＡＰ）と、ＥＦ１ａ−ＢＡＦＦＲ−Ｔ２Ａ−ＲＦＰレンチウイルスとをレンチウイルス化して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に複数の多重感染度（ＭＯＩ）にて強制発現させることによって、ＣＨＯ−Ｋ１−ＢＡＦＦＲ細胞を得た。また、ＦＡＣＳにてＢＡＦＦ−Ｒの細胞表面への発現を確認した。
ＢＡＦＦ−ＲのリガンドであるＢＡＦＦを用い、試験例１と同様にして、細胞の刺激及びそれによるレポーター活性を測定した。
これによって得られた、サンプル濃度とＳＥＡＰ活性との関係を図８に示す。図８に示されるとおり、ＣＨＯ−Ｋ１−ＢＡＦＦＲ細胞は、バックグラウンドが非常に高く、濃度依存的なＳＥＡＰの産生誘導が観察されなかった。（なお、ｐＮｉＦｔｙ２ベクターをＨＥＫ２９３細胞に形質導入した場合は、ＴＮＦ−ａへの反応バックグランドは低く維持されていた。）つまり、ＣＨＯ−Ｋ１−ＢＡＦＦＲ細胞は、レポーターベクターの導入により、ＢＡＦＦの存在の有無にかかわらずＮＦκＢ／ＡＰ１経路が活性化するため、ＢＡＦＦ特異的応答ができないもの（ＮＦκＢ／ＡＰ１がＢＡＦＦ誘導性として機能していない）であり、本発明のレポーター細胞として構築されなかった。
予備試験例３：ＴＨＰ−１−ＢＡＦＦＲ細胞
ヒト単球系細胞株ＴＨＰ−１細胞に、ＡＰ１遺伝子及びＮＦκＢ遺伝子とＳＥＡＰ遺伝子とを組み込み、ＢＡＦＦのみと結合するＢＡＦＦ−Ｒを受容体として発現させた、ＴＨＰ−１−ＢＡＦＦＲ細胞を作製した。具体的には、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ 社より購入したｐＮｉＦｔｙ３−ＳＥＡＰ ｖｅｃｔｏｒ（ＡＰ１−ＮＦｋＢ−ｍＩＦＮ−βｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＳＥＡＰ）と、ＥＦ１ａ−ＢＡＦＦＲ−Ｔ２Ａ−ＲＦＰレンチウイルスとをレンチウイルス化して、ＴＨＰ−１細胞に複数の多重感染度（ＭＯＩ）にて強制発現させることによって、ＴＨＰ−１−ＢＡＦＦＲ細胞を得た。また、ＦＡＣＳにてＢＡＦＦ−Ｒの細胞表面への発現を確認した。
ＢＡＦＦ−ＲのリガンドであるＢＡＦＦを用い、試験例１と同様にして、細胞の刺激及びそれによるレポーター活性を測定した。しかしながら、ＴＨＰ−１−ＢＡＦＦＲ細胞は、ＢＡＦＦに対して反応しなかった。つまり、ＴＨＰ−１−ＢＡＦＦＲ細胞には、ＢＡＦＦ−ＲからＮＦκＢの活性化に至るシグナル分子が欠落していると考えられる。従って、ＮＦκＢがＢＡＦＦ誘導性として機能しておらず、本発明のレポーター細胞として構築されなかった。
試験例４：ＢＡＦＦ用レポーター細胞（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＢＡＦＦＲ／ＢＣＭＡ細胞）
（レポーター細胞の作製）
ＢＡＦＦ用レポーター細胞として、以下のように、ＢＡＦＦＲ／ＢＣＭＡキメラ受容体発現株であるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＢＡＦＦＲ／ＢＣＭＡ細胞を作製した。このレポーター細胞は、ＢＡＦＦ−Ｒの細胞外領域とＢＣＭＡの細胞内領域とを含む融合タンパク質（キメラ受容体）を、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）に対して強制発現させた細胞であり、図９〜図１０に示す手順で作製された。図１１に、このレポーター細胞の模式図を示す。
図９に示す工程について以下に説明する。キメラ受容体を発現するＤＮＡのデザインは２種設計した。具体的には、キメラ受容体を発現するＤＮＡのデザインを、（１）ＢＡＦＦＲの１−２１９ｂｐ領域と、ＢＣＭＡの１５４−１６２ｂｐ領域（ＢＣＭＡのＴＭＤより９ｂｐ上流）と、ＢＣＭＡの１６３−５５５ｂｐ領域（ＢＣＭＡのＴＭＤ＋ＩＣＤ）とを結合した、配列番号４に記載のキメラ配列；又は、（２）ＢＡＦＦＲの１−２３４ｂｐ領域と、ＢＣＭＡの１５４−１６２ｂｐ領域（ＢＣＭＡのＴＭＤより９ｂｐ上流）と、ＢＣＭＡの１６３−５５５ｂｐ領域（ＢＣＭＡのＴＭＤ＋ＩＣＤ）とを結合した、配列番号５に記載のキメラ配列として設計した。
先にクローニングしたＥＦ１ａ−ＢＡＦＦＲ−Ｔ２Ａ−ＲＦＰベクターをテンプレートにして、以下のプライマーを用いたＰＣＲ増幅により、ＢＡＦＦ−ＲのＥＣＤをコードするＤＮＡを得た。
Fw: 5'-GGCTGCCACCACGCGTGCCACCATGAGGCGAGGGccccgg-3'（配列番号１０）
Rv（i）: 5'-aatcgcattcgtgggcagcgccgcctcgccgg-3'（配列番号１１）、又は
Rv（ii）: 5'-aatcgcattcgtgagcagcccgggcaggggca-3'（配列番号１２）
先にクローニングしたＣＳＩＩ−ＥＦ−ＢＣＭＡ−ＩＲＥＳ２−Ｖｅｎｕｓをテンプレートにして、以下のプライマーを用いたＰＣＲ増幅により、ＢＣＭＡのＴＭＤ＋ＩＣＤをコードするＤＮＡを得た。
Fw（i）: 5'-gcggcgctgcccacgaatgcgattctctggac-3'（配列番号１３）、又は
Fw（ii）: 5'-cccgggctgctcacgaatgcgattctctggac-3'（配列番号１４）
Rv: 5'-AAAGCTGGGTTCTAGATTACCTAGCAGAAATTGATTTC-3'（配列番号１５）
作成したＰＣＲ産物をテンプレートとして、ＢＡＦＦＲ−ＥＣＤ ＦｗプライマーとＢＣＭＡ ＴＭＤ＋ＩＣＤ Ｒｖプライマーとを用いて、ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲにより、キメラ受容体をコードするＤＮＡの作製を行った。
ＥＦ１ａ−Ｍｌｕ１−ＥＧＦＰ−Ｘｂａ１（Ｍｌｕ１／Ｘｂａ１で切断したレンチウイルスベクター）レンチウイルスベクターに、得られたＰＣＲ産物をＩｎｆｕｓｉｏｎ法にて挿入し、ＮＡＦＦＲ−ＢＣＭＡ−発現レンチウイルスベクターをクローニングした。
図１０に示す工程について説明する。得られたベクターと、ＶＳＶ−Ｇ／Ｒｅｖプラスミド、ＳＩＮプラスミドをトランスフェクトした。７２時間培養後、上清を回収してＰＥＧで濃縮し、ＢＡＦＦＲ−ＢＣＭＡ−発現レンチウイルスを得た。
得られたウイルスをＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞に感染させて形質導入し、限界希釈法にて、図１１に示すＢＡＦＦＲ−ＢＣＭＡキメラ受容体を発現するシングルクローン（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＢＡＦＦＲ−ＢＣＭＡ細胞）をレポーター細胞として２種樹立した。また、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）にて、いずれのレポーター細胞においてもＢＡＦＦ−Ｒの細胞表面への発現を確認した。
（ＢＡＦＦによる刺激とレポーター活性）
２種のレポーター細胞それぞれについて、キメラ受容体のリガンドであるリコンビナントＢＡＦＦと、参考用にリコンビナントＡＰＲＩＬとを用い、試験例１と同様にして、レポーター細胞の刺激及びそれによるレポーター活性を測定した。
これによって得られた、サンプル濃度とＳＥＡＰ活性との関係を図１２に示す。図１２は、（１）のＤＮＡデザインによる受容体を発現しているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＢＡＦＦＲ−ＢＣＭＡ細胞の結果である。図１２に示されるとおり、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＢＡＦＦＲ−ＢＣＭＡ細胞は、ＢＡＦＦ刺激に対して、感度が高く、且つ濃度依存的にＳＥＡＰ活性を生じ、ＡＰＲＩＬに対しては反応しないことが分かった。なお、（２）のＤＮＡデザインによる受容体を発現しているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＢＡＦＦＲ−ＢＣＭＡ細胞についても、（１）のＤＮＡデザインによる受容体を発現しているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＢＡＦＦＲ−ＢＣＭＡ細胞ほどではないもののＢＡＦＦ刺激に対して感度が高く、且つ濃度依存的にＳＥＡＰ活性を生じ、ＡＰＲＩＬに対しては反応しないことを確認した。
試験例５：ＳＬＥの層別化
試験例１、２、３、４で得られた各レポーター細胞（ＨＥＫ−ＢｌｕｅTMＩＦＮ−α／β細胞、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＴＡＣＩ細胞、及び（１）のＤＮＡデザインによる受容体を発現しているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＢＡＦＦＲ−ＢＣＭＡ細胞）を、９６ウェルプレートに２．５ｘ１０4細胞ずつ播種し、２４時間培養した。コンプリート培地１００μｌに健康人（ＨＣ）１０名又はＳＬＥ患者２９名の血清２０μｌを加えたサンプルを添加し、さらに２４時間培養した。培養後、上清を回収し、ＳＥＡＰの発色基質であるＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅを加えて３０分間３７℃で反応させ、吸光度計を用いて６２０ｎｍ吸収波長を測定した。得られたＳＥＰＡ活性を、ＳＬＥ憎悪因子活性（ＩＦＮ−Ｉ活性、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ活性、及びＢＡＦＦ活性）として評価した。
結果を図１３に示す。図１３に示される通り、各レポーター細胞により、いずれのＳＬＥ憎悪因子活性についても、ＳＬＥ患者の血清の方が健康人の血清に比べて高いことが認められた。
また、ＨＥＫ−ＢｌｕｅTMＩＦＮ−α／β細胞によって測定されたＩＦＮ−Ｉ活性と、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＢＡＦＦＲ−ＢＣＭＡ細胞によって測定されたＢＡＦＦ活性とを二次元散布図として展開した。結果を図１４に示す。図１４に示されるとおり、ＩＦＮ−Ｉ活性とＢＡＦＦ活性との二次元展開によって、両低値群（表中Ａ群）、ＩＦＮ−Ｉ高値ＢＡＦＦ低値群（表中Ｂ群）、ＩＦＮ−Ｉ低値ＢＡＦＦ高値群（表中Ｃ群）、両高値群（表中Ｄ群）、の４群に分類できた。
更に、ＨＥＫ−ＢｌｕｅTMＩＦＮ−α／β細胞によって測定されたＩＦＮ−Ｉ活性と、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ ＴＡＣＩ細胞によって測定されたＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ活性とを二次元散布図として展開した。結果を図１５に示す。図１５に示されるとおり、ＩＦＮ−Ｉ活性とＢＡＦＦ活性との二次元展開によって、両低値群（表中Ａ群）、ＩＦＮ−Ｉ高値ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ低値群（表中Ｂ群）、ＩＦＮ−Ｉ低値ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ高値群（表中Ｃ群）、両高値群（表中Ｄ群）、の４群に分類できた。
以上の結果から、ＩＦＮ−Ｉ高値群患者（Ｂ群）に対してはＳＬＥ治療薬としてＡｎｉｆｒｏｌｕｍａｂを、ＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ＋ＡＰＲＩＬ高値群患者（Ｃ群）に対してはＳＬＥ治療薬としてＢｅｌｉｍｕｍａｂを選択するといった、コンパニオン診断が可能であることが認められる。
配列番号４は、ＢＡＦＦＲの１−２１９ｂｐ領域と、ＢＣＭＡの１５４−１６２ｂｐ領域と、ＢＣＭＡの１６３−５５５ｂｐ領域とを結合したキメラ配列である。
配列番号５は、ＢＡＦＦＲの１−２３４ｂｐ領域と、ＢＣＭＡの１５４−１６２ｂｐ領域と、ＢＣＭＡの１６３−５５５ｂｐ領域とを結合したキメラ配列である。
配列番号６〜１５は、プライマーである。

Claims (10)

  1. ＩＦＮ−Ｉ受容体を発現しており、ＩＦＮ−Ｉ誘導性制御領域と、前記制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子とを含むレポーター構築物が導入された細胞を含む、全身性エリトマトーデスの治療薬に対するコンパニオン診断薬。
  2. 前記細胞がヒト胎児腎細胞である、請求項１に記載のコンパニオン診断薬。
  3. ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ受容体又はＢＡＦＦ受容体を発現しており、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ誘導性制御領域又はＢＡＦＦ誘導性制御領域と、前記制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子とを含むレポーター構築物が導入された細胞を含む、全身性エリトマトーデスの治療薬に対するコンパニオン診断薬。
  4. 前記ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ受容体が、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ及びＢＡＦＦ−Ｒからなる群より選択される、請求項３に記載のコンパニオン診断薬。
  5. 前記ＢＡＦＦ受容体が、ＢＡＦＦ−Ｒの細胞外領域とＢＣＭＡの細胞内領域とを含む融合タンパク質である、請求項３及び４に記載のコンパニオン診断薬。
  6. 前記細胞がヒト胎児腎細胞である、請求項３〜５のいずれかに記載のコンパニオン診断薬。
  7. 請求項１又は２に記載のコンパニオン診断薬と、請求項３〜６のいずれかに記載のコンパニオン診断薬とを含む、全身性エリトマトーデスの治療薬に対するコンパニオン診断キット。
  8. 被験動物から得られた生体試料について、請求項１又は２に記載のコンパニオン診断薬を用いて測定されるレポーター活性値を、ＩＦＮ−Ｉ活性値として取得する工程１と、
    前記生体試料について、請求項３〜６のいずれかに記載のコンパニオン診断薬を用いて測定されるレポーター活性値を、ＢＡＦＦ活性値又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ活性値として取得する工程２と、
    前記ＩＦＮ−Ｉ活性値並びに前記ＢＡＦＦ活性値又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ活性値に基づき、前記生体試料中のＩＦＮ−ＩとＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬとのうち、相対的に多く存在する全身性エリトマトーデス憎悪因子を決定する工程３と、を含む、生体試料の分析方法。
  9. 前記工程３が、
    前記ＩＦＮ−Ｉ活性値並びに前記ＢＡＦＦ活性値又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ活性値を、ＩＦＮ−Ｉ軸とＢＡＦＦ軸又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ軸との二次元座標系に展開する工程３１と、
    展開された座標が、ＩＦＮ−Ｉ活性値が相対的に高くＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬが相対的に低いグループと、ＩＦＮ−Ｉ活性値が相対的に低くＢＡＦＦ又はＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬが相対的に高いグループとのいずれに属するかを決定する工程３２とを含む、請求項８に記載の分析方法。
  10. 前記生体試料が血清である、請求項８又は９に記載の分析方法。
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