JP2021052736A

JP2021052736A - 概日リズム調節剤

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Publication number: JP2021052736A
Application number: JP2020055737A
Authority: JP
Inventors: 千尋鈴木; Chihiro Suzuki; 秀明大池; Hideaki Oike
Original assignee: National Agriculture and Food Research Organization; NIPPN Corp
Current assignee: National Agriculture and Food Research Organization; NIPPN Corp
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2020-03-26
Publication date: 2021-04-08
Anticipated expiration: 2040-03-26
Also published as: JP7538495B2

Abstract

【課題】本発明は、哺乳類の時計遺伝子の発現リズム調節により、ヒトや動物の概日リズムを調節し、概日リズムの乱れに起因する諸症状を予防する組成物を提供することを課題とする。【解決手段】ホパン型トリテルペン、ククルビタン型トリテルペン及びそれらの薬理学的に許容される塩からなる群から選択される１以上を有効成分とすることにより上記課題を解決する。【選択図】なし

Description

本発明は特定のトリテルペン類を有効成分とする概日リズム調節剤に関する。

人を含む多くの生物は概日リズムという２４時間周期の行動パターンを持ち、睡眠・覚醒の周期だけでなく、体温、血圧、ホルモン分泌や自律神経活動などあらゆる生理現象がこのリズムに従って変動する。概日リズムを生む仕組みを体内時計といい、時計遺伝子と呼ばれる遺伝子群が組織ごとにタイミングを合わせて（これを同調という）、２４時間周期で発現変動を繰り返すことで、その下流で代謝の概日リズムが作られる。たとえば、植物においては生長や花形成、気孔の開閉、窒素代謝等の多様な活動がこの時計遺伝子の制御下で概日変動を示し、時計遺伝子の発現制御によりこれらを調節する試みがなされている（特許文献１）。哺乳類では、ＰＥＲ、ＣＲＹ、ＢＭＡＬ、ＣＬＯＣＫという時計遺伝子のネガティブフィードバックをコアループとした転写翻訳調節により、２４時間のリズムが作られる。哺乳類の体内時計は明暗情報から活動時間を定める中枢時計（視交叉上核）と、末梢の様々な組織に存在する末梢時計に大別される。基本的に中枢時計と末梢時計は一定の位相関係を維持してリズムを刻むが、末梢時計は、グルココルチコイドやインスリン等の刺激や、さらには特定の食品成分により、中枢時計とは独立して影響を受けることが報告されている（非特許文献１〜３）。
近年、交代勤務や夜更かしの習慣等による不規則な活動・食事の影響で身体的・精神的不調が生じることが指摘されている（非特許文献４）。また、身近な例として航空機による長距離移動が原因で時差ボケが起こることはよく知られている。これらに共通する要因の一つに、実際の睡眠や食事の時刻に対し、中枢時計や末梢時計が刻むリズムの間でずれが生じた時に、是正にかかる時間に組織ごとに差があることが考えられる。概日リズムを調節し正常に保つことができれば、体内時計の不調和を改善できる。特に、前者のような長期的な健康への悪影響を抑えるためには、概日リズム調節剤として、日常的に摂取することができ概日リズムの乱れを効果的に抑えることができる、安全性の高い食品形態のものが望ましい。

概日リズムの調整、特に時差ボケへの対応として、航空会社では照明の点灯時間や食事のタイミングを到着地に近づけるなどの対応を取る。また、医薬品として日本ではメラトニンが処方される。メラトニンは睡眠を誘導する内因性ホルモンで、夜間に分泌が上昇して朝目覚める前に減少する日内変動を示す。概日リズムの乱れに起因する睡眠障害の治療として、メラトニンリズムを整えることを目的に、その前駆物質や受容体作動薬、メラトニン分泌リズム改善剤が用いられる。
しかしながら、メラトニンは内因性のホルモンであるためその使用には注意が必要であり、特異的な概日リズム調整作用があるとは言いがたい。またメラトニンの前駆物質であるセロトニンは、経口摂取により消化器系・循環器系に悪影響があることが指摘されていて、これらは国内では食品としては認可されていない。

上記の問題点を解決するために、食品由来あるいは食品として利用可能な成分の体内時計調節機能の評価が盛んにおこなわれている。たとえばオリーブに含まれるポリフェノールであるオレアセインは時計遺伝子であるＢＭＡＬ１、ＰＥＲ１の発現調節により概日リズムを調整する（特許文献２）。また、小麦ふすま由来のアルキルレゾルシノールは時計遺伝子ＢＭＡＬ１の発現リズムを動かし周期を変えることで概日リズムを調整する（特許文献３）。温州みかんから抽出されるクリプトキサンチン／またはそのエステル体にも概日リズム調整能があることが報告されている（特許文献４）。

トリテルペンは広く植物界に分布する化合物群であり、６つのイソプレンから構成され、Ｃ₃₀Ｈ₄₈の分子式を持つテルペンの一種である。トリテルペンにはスクアレンなどの環状構造を有しないものやオレアナン型、ウルサン型、ルパン型、ホパン型、セラタン型、フリーデラン型、タラキセラン型、タラキサスタン型、マルチフロラン型、ジャーマニカン型等の５つの環状構造を有する化合物群、ククルビタン型、ダンマラン型、ラノスタン型、プロトスタン型等の４つの環状構造を有する化合物群等、数多くの化合物が含まれる。ホパン型トリテルペンにはセラストロール、ホパン、プリスチメリン等が含まれ、ククルビタン型トリテルペンには、ククルビタシンＡ〜Ｌ、Ｏ〜Ｔ、クグアシンＡ〜Ｓ等が含まれる。

ホパン型トリテルペンのセラストロール（２Ｒ，４ａＳ，６ａＲ，６ａＳ，１４ａＳ，１４ｂＲ）−１０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，６ａ，９，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，３，４，５，６，１３，１４，１４ｂ−オクタヒドロピセン−２−カルボン酸；ＣＡＳ３４１５７−８３−０）は、伝統的な漢方薬として炎症・腫れ・乾癬の治療に利用されるライコウトウ（タイワンクロヅル）に含まれる。高い抗酸化能を有し、抗炎症の他、肥満や神経変性疾患などへの治療効果が期待されている（非特許文献５）。プリスチメリン（メチル（２Ｒ，４ａＳ，６ａＲ，６ａＳ，１４ａＳ，１４ｂＲ）−１０−ヒドロキシ−２，４ａ，６ａ，６ａ，９，１４ａ−ヘキサメチル−１１−オキソ−１，３，４，５，６，１３，１４，１４ｂ−オクタヒドロピセン−２−カルボン酸塩；ＣＡＳ１２５８−８４−０）は、ニシキギ科の植物（Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒｉａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）などから単離可能なトリテルペノイドキノンメチドで、抗がん剤や抗ウイルス薬としての活性を示し（非特許文献６）、避妊薬としての効果も知られている（非特許文献７）。ククルビタシンＢ（［（Ｅ，６Ｒ）−６−［（２Ｓ，８Ｓ，９Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｒ）−２，１６−ジヒドロキシ−４，４，９，１３，１４−ペンタメチル−３，１１−ジオキソ−２，７，８，１０，１２，１５，１６，１７−オクタヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェネントレン−１７−イル］−６−ヒドロキシ−２−メチル−５−オキソヘプト−３−エン−２−イル］酢酸塩；ＣＡＳ６１９９−６７−３）、ククルビタシンＤ（（２Ｓ，８Ｓ，９Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｒ）−１７−［（Ｅ，２Ｒ）−２，６−ジヒドロキシ−６−メチル−３−オキソヘプト−４−エン−２−イル］−２，１６−ジヒドロキシ−４，４，９，１３，１４−ペンタメチル−２，７，８，１０，１２，１５，１６，１７−オクタヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレンｅ−３，１１−ジオン；ＣＡＳ３８７７−８６−９）、ククルビタシンＥ（［（Ｅ，６Ｒ）−６−［（８Ｓ，９Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｒ）−２，１６−ジヒドロキシ−４，４，９，１３，１４−ペンタメチル−３，１１−ジオキソ−８，１０，１２，１５，１６，１７−ヘキサヒドロ−７Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン −１７−イル］−６−ヒドロキシ−２−メチル−５−オキソヘプト−３−エン−２−イル］酢酸塩；ＣＡＳ１８４４４−６６−１）、ククルビタシンＩ（（８Ｓ，９Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｒ）−１７−［（Ｅ，２Ｒ）−２，６−ジヒドロキシ−６−メチル−３−オキソヘプト−４−エン−２−イル］−２，１６−ジヒドロキシ−４，４，９，１３，１４−ペンタメチル−８，１０，１２，１５，１６，１７−ヘキサヒドロ−７Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレンｅ−３，１１−ジオン；ＣＡＳ２２２２−０７−３）、ククルビタシンＳ（（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ，６Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１１Ｒ，１４Ｒ，１５Ｒ）−１７−ヒドロキシ−６−（２−ヒドロキシプロパン−２−イル）−２，９，１１，１４，１９，１９−ヘキサメチル−５−オキサペンタシクロ［１２．８．０．０２，１１．０４，１０．０１５，２０］ドコサ−１６，２０−ジエン−８，１３，１８−トリオン；ＣＡＳ６０１３７−０６−６）、イソククルビタシンＢ（［（Ｅ，６Ｒ）−６−［（３Ｒ，８Ｓ，９Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｒ）−３，１６−ジヒドロキシ−４，４，９，１３，１４−ペンタメチル−２，１１−ジオキソ−３，７，８，１０，１２，１５，１６，１７−オクタヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル］−６−ヒドロキシ−２−メチル−５−オキソヘプト−３−エン−２−イル］酢酸塩；ＣＡＳ１７２７８−２８−３）はククルビタン型トリテルペンで抗がん作用などが期待されており、ウリ科の植物全般に含まれる苦み成分の一つである（非特許文献８）。トリテルペンのうち、コロソリン酸、マスリン酸、オレアノール酸等のオレアナン型トリテルペンやウルソール酸などのウルサン型トリテルペンについては概日リズム調節に有効であることは公知（特許文献５）だが、ホパン型トリテルペンおよびククルビタン型トリテルペンが概日リズムの調整に有効であることはこれまで知られていなかった。

特開２０１６−４０２３１特開２０１６−１８３１８９特開２００９−１８３１９７国際公開２００２／０４３７３６特開２０１９−４３９１２

Balsalobre A et al., Science, 2000 Sep;289(5488):2344-7 Oishi K et al., Biochem Biophys Res Commun. 2017 Jan 29;483(1):165-170 Oike H, Biosci Biotechnol Biochem. 2017 May;81(5):863-870 Brum MC et al., Diabetol Metab Syndr. 2015 May 17;7:45 R Cascao et al., Front Med, 2017 Jun 15;4:69. Murayama T et al., Antivir Chem Chemother 2007 18 (3): 133-139 Mannowetza N et al., PNAS May 30, 2017 114 (22) 5743-5748 S Garg et al., Int J Oncol. 2018 Jan;52(1):19-37. Balsalobre A, Cell. 1998 Jun 12;93(6):929-37

本発明は、哺乳類の時計遺伝子の発現量、時計遺伝子の発現リズムの位相又は周期長を調節することにより、ヒトや動物の概日リズムを調節し、概日リズムの乱れに起因する諸症状を予防する組成物を提供することを課題とする。

本発明者らは、ホパン型トリテルペン及びククルビタン型トリテルペンが哺乳類の時計遺伝子の発現量、時計遺伝子の発現リズムの位相又は周期長を調節することにより概日リズム調節に有効であることを見出した。
すなわち本発明は以下の通りである。
[１]ホパン型トリテルペン、ククルビタン型トリテルペン及びそれらの薬理学的に許容される塩からなる群から選択される１以上を有効成分として含む概日リズム調節剤。
[２]ＰＥＲ２の発現量、発現リズムの位相又は発現リズムの周期長を調節する、請求項１に記載の概日リズム調節剤。
[３]ホパン型トリテルペンがセラストロール及びプリスチメリンからなる群から選択される１以上であり、ククルビタン型トリテルペンがククルビタシンＢ、ククルビタシンＤ、ククルビタシンＥ、ククルビタシンＩ、ククルビタシンＳ及びイソククルビタシンＢからなる群から選択される１以上である、前記［１］又は［２］に記載の概日リズム調節剤。
[４]前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の概日リズム調節剤を含む、概日リズム調節用飲食品。
[５]前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の概日リズム調節剤を含む、概日リズム調節用動物用飼料。
[６]前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の概日リズム調節剤を含む、概日リズムの調節を介した疾患の予防、緩和、または治療のための医薬組成物。
[７]前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の概日リズム調節剤を含む、概日リズムの調節を介した疾患の予防、緩和、または治療のための動物用医薬組成物。

本発明によれば、哺乳類の時計遺伝子、特にＰＥＲ２の発現量、発現リズムの位相又は発現リズムの周期長を調節し、概日リズムを調節することでき、概日リズムの乱れに起因する諸症状を予防する組成物を提供することができる。本発明の組成物は、投与のタイミングに応じて、概日リズムを前、あるいは後ろに動かすことができる。体内時計は外部刺激（食事、強い光、時差など）により攪乱されることがあるが、刺激のタイミングに応じてリズムが前進しやすい時間帯や後退しやすい時間帯があることが知られている。本発明のトリテルペンは、一方向だけでなく両方向にリズムを動かすため、乱れた概日リズムを効果的に調節することができる。

トリテルペン（（Ａ）セラストロール、（Ｂ）ククルビタシンＢ、（Ｃ）グリチルレチン酸）を図中矢印のタイミングで添加した時のヒトＰＥＲ２の発現の概日リズムの変化を示す。ランダムに選抜した１６種類のテルペン(２種類のジテルペンを含む)の添加によるＰＥＲ２の発現の概日リズムの変化について、試料添加後（Ａ）２番目に出現するピークの位相（Ｂ）３番目に出現するピークの位相を示す。（Ａ）セラストロールおよび（Ｂ）ククルビタシンＢの位相後退効果の濃度依存性を示す。血清刺激からの各時間（１５、２１、２７、３３時間後）における（Ａ）セラストロールまたは（Ｂ）ククルビタシンＢの添加による概日リズムの位相への影響を示す。トリテルペン（（Ａ）セラストロール、（Ｂ）ククルビタシンＢ）を図中矢印のタイミングで添加した時のマウスＰＥＲ２の発現の概日リズムの変化を示す。セラストロール、プリスチメリンを図中矢印のタイミングで添加した時のヒトＰＥＲ２の発現の概日リズムの変化を示す。ククルビタシンＤ、ククルビタシンＥ、ククルビタシンＩを図中矢印のタイミングで添加した時のマウスＰＥＲ２の発現の概日リズムの変化を示す。ククルビタシンSを図中矢印のタイミングで添加した時のマウスＰＥＲ２の発現の概日リズムの変化を示す。イソククルビタシンＢを図中矢印のタイミングで添加した時のマウスＰＥＲ２の発現の概日リズムの変化を示す。濃度の異なるセラストロールを図中矢印のタイミングで添加した時のマウスＰＥＲ２の発現量の増強作用（Ａ）と、周期長の短縮作用（Ｂ）。濃度の異なるプリスチメリンを図中矢印のタイミングで添加した時のマウスＰＥＲ２の発現量の増強作用。

本発明の概日リズム調節剤は、ホパン型トリテルペン、ククルビタン型トリテルペン及びそれらの薬理学的に許容される塩からなる群から選択される１以上を有効成分として含有する。
本発明において、トリテルペンは炭素数３０を基本骨格とする化合物であり、その代表例として五環性トリテルペンや四環性トリテルペンが挙げられる。ここで、五環性トリテルペン、四環性トリテルペンとは、トリテルペン類の１種であり、イソプレン単位６個から成るそれぞれ五環性、四環性の化合物で、炭素数は３０個を基本とするが、生合成過程で転位、酸化、脱離あるいはアルキル化され炭素数が前後するものも含まれる。
五環性トリテルペンや四環性トリテルペンは、一般に、その骨格により分類されており、五環性トリテルペンとしては例えばオレアナン型トリテルペン、ウルサン型トリテルペン、ルパン型トリテルペン、ホパン型トリテルペン、セラタン型トリテルペン、フリーデラン型トリテルペン、タラキセラン型トリテルペン、タラキサスタン型トリテルペン、マルチフロラン型トリテルペン、ジャーマニカン型トリテルペン等が、四環性トリテルペンとしてはククルビタン型、ダンマラン型、ラノスタン型、プロトスタン型等が挙げられる。
五環性トリテルペン類のうち、ホパン型トリテルペンの代表例としてはセラストロール、ホパン、プリスチメリン等が挙げられ、ククルビタン型トリテルペンの例としてはククルビタシンＡ〜Ｌ、Ｏ〜Ｔ、クグアシンＡ〜Ｓ等が挙げられる。

セラストロールはホパン型トリテルペンであり、タイワンクロヅル、Ｃｅｌａｓｔｒｕｓｒｅｇｅｌｉｉ（ツルウメモドキの近縁種）等に含まれる。
プリスチメリンは、ニシキギ科の植物（Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒｉａｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）などから単離可能なトリテルペノイドキノンメチドである。プリスチメリンはセラステロールのメチルエステルであってホパン型トリテルペンに分類される。

ククルビタン型トリテルペンとして例示される、ククルビタシンＢ、ククルビタシンＤ、ククルビタシンＥ、ククルビタシンＩ、ククルビタシンＳ）、イソククルビタシンＢは、ウリ科植物（メロン、ユウガオ、ヘビウリ、トゲヘチマ、キカラスウリ、ペポカボチャ、コロシント、ルッファなど）等に含まれる。

本発明において、ホパン型トリテルペンは好ましくはセラストロール及びプリスチメリンからなる群から選択される１以上である。またククルビタン型トリテルペンは好ましくはククルビタシンＢ、ククルビタシンＤ、ククルビタシンＥ、ククルビタシンＩ、ククルビタシンＳ及びイソククルビタシンＢからなる群から選択される１以上である。

ホパン型トリテルペンやククルビタン型トリテルペンは、それらを含有することが公知である天然の植物から公知の方法で抽出、精製して得ることができるほか、化学合成によって人工的に得ることもできる。薬理学的に許容される塩及び／又は誘導体の形態で使用することもできる。また市販品も好適に利用することができる。
ホパン型トリテルペン、ククルビタン型トリテルペンは、植物の抽出物の形態で用いても良い。

植物の抽出物の形態で用いる場合には、原料として使用する植物に適した方法でホパン型トリテルペン、ククルビタン型トリテルペンを得ることができる。例えば、セラストロールであればタイワンクロヅルを抽出原料として、Kutney et al, Can. J. Chem. 59:2677, 1981に開示される方法で得ることが出来る。ククルビタシンＢであればウリ科植物を抽出原料として、植物体を粉砕し、適切な低級アルコール（エタノール、メタノールなど）またはその含水アルコール、ケトン（アセトン）、エステル（ジエチルエーテル、酢酸エチルエステル、アセトニトリル）等の有機溶剤で抽出して得ることが出来る。

ホパン型トリテルペン、ククルビタン型トリテルペンのヒトの摂取量は、摂取する患者等の年齢、性別、症状の程度、摂取形態によって異なるが、成人（体重約６０ｋｇ）では１日あたりホパン型トリテルペンの上限は好ましくは５０００ｍｇ、より好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇ、ククルビタン型トリテルペンの上限は好ましくは１０ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ〜１ｍｇである。

またホパン型トリテルペン、ククルビタン型トリテルペンの動物の摂取量は、摂取する動物の種類、年齢、性別、症状の程度、摂取形態によって異なるが、例えばマウス（体重約３０ｇ）では１日あたりホパン型トリテルペンの上限は好ましくは３０ｍｇ、より好ましくは６μｇ〜３ｍｇ、ククルビタン型トリテルペンの上限は好ましくは６０μｇ、より好ましくは０．０６〜６μｇである。

本発明の概日リズム調節剤は、医薬組成物の態様でもよく、助剤とともに任意の形態に製剤化して、経口投与または非経口投与が可能な医薬品とすることができる。医薬組成物の投与対象はヒトに限られず、動物を投与対象とした動物用医薬組成物も含まれる。例えば、経口用の剤形としては、錠剤、口腔内速崩壊錠、カプセル、顆粒、細粒などの固形投薬形態、シロップ及び懸濁液のような液体投薬形態とすることができる。非経口の剤形としては、注射剤、点眼剤、点鼻剤、貼付剤、坐剤、皮膚外用剤の形態で投与される。なお、医薬品には医薬部外品も含まれる。

固形投薬形態とする場合、一般製剤の製造に用いられる種々の添加剤を適当量含んでいてもよい。このような添加剤として、例えば賦形剤、結合剤、酸味料、発泡剤、人工甘味料、香料、滑沢剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などが挙げられる。

液体投薬形態とする場合、本発明の概日リズム調節剤は必要に応じてｐＨ調整剤、緩衝剤、溶解剤、懸濁剤等、等張化剤、安定化剤、防腐剤などの存在下、常法により製剤化することができる。

皮膚外用剤の形態としては、特に限定されず、例えば、乳液、クリーム、化粧水、パック、分散液、洗浄料、メーキャップ化粧料、頭皮・毛髪用品等の化粧品や、軟膏剤、クリーム剤、外用液剤等の医薬品などとすることができる。上記成分以外に、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば、美白剤、保湿剤、各種皮膚栄養成分、紫外線吸収剤、酸化防止剤、油性成分、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、色剤、水、防腐剤、香料等を必要に応じて適宜配合することができる。

本発明の概日リズム調節剤は、機能性食品、健康食品、特定保健用食品、栄養機能食品等の保健機能食品、特別用途食品（例えば、病者用食品）、健康補助食品、サプリメント等として調製されてもよい。サプリメントとして、例えば、一般的なサプリメントの製造に用いられる種々の添加剤とともに錠剤、丸状、カプセル（ハードカプセル、ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）状、粉末状、顆粒状、細粒状、トローチ状、液状（シロップ状、乳状、懸濁状を含む）等の形状とすることができる。

本発明の概日リズム調節剤は、飲食品に配合することができる。配合可能な食品に特に限定はないが、例えば、飴、グミ、チューインガム等の菓子類；クッキー、クラッカー、ビスケット、チョコレート、プリン、ゼリー、スナック菓子、米菓、饅頭、羊羹などの菓子類；アイスクリーム、アイスキャンディー、シャーベット、ジェラート等の冷菓；ドーナツ、ケーキ、食パン、フランスパン、クロワッサン等のベーカリー食品；うどん、そば、中華めん、きしめん等の麺類；白飯、赤飯、ピラフ等の米飯類；カレー、シチュー、ドレッシング等のソース類；ハム、ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、魚肉ソーセージ等の練り製品；天ぷら、コロッケ、ハンバーグなどの各種惣菜類；ジュース、お茶等の飲料等が挙げられる。

本発明の概日リズム調節剤は、動物用飼料に配合することができる。動物用飼料としてどのような飼料に配合しても良く、飼料の製造工程中に原料に添加しても良い。動物用飼料として用いる場合には、その添加量については、特に限定的ではなく、動物用飼料の種類に応じ適宜決めればよい。

本発明の概日リズム調節剤によれば、時計遺伝子の発現量、発現リズムの位相又は発現リズムの周期長を調節することが出来る。本明細書において、遺伝子の「発現リズム」とは、遺伝子が一定周期で発現の活性化及び発現の抑制を繰り返すリズムをいい、「時計遺伝子の発現リズムの位相を調節する」とは、時計遺伝子がある発現リズム(又は、発現リズムの周期)に沿って発現の活性化及び発現の抑制を示す際に、当該発現リズム(又は、発現リズムの周期)の位相を時系列的に遅らせる(後退)、又は、早めること(前進)をいう。よって、時計遺伝子の「発現リズムの位相を調節する」の好ましい態様としては、本来の発現リズム(又は、発現リズムの周期)と比較して差異が生じた位相の分、位相を時間軸に沿って遅らせる、又は、早めることにより調節することである。時計遺伝子の「発現リズムの周期長を調節する」とは、時計遺伝子がある発現リズム(又は、発現リズムの周期)に沿って発現の活性化及び発現の抑制を示す際に、その周期長を長くしたり短くしたりすることをいう。本発明の概日リズム改善剤は、例えば、時計遺伝子のうちＰＥＲ２の発現リズムの位相を、時間軸に沿って遅らせる、又は、早めることにより、又は発現リズムの周期長を長くしたり短くしたりすることにより調節することができる。

時計遺伝子とは、概日リズム(サーカディアンリズム)をつかさどる遺伝子である。時計遺伝子としては、ＰＥＲ（ＰＥＲ１、ＰＥＲ２など）、ＣＲＹ（ＣＲＹ１、ＣＲＹ２など）、ＢＭＡＬ（ＢＭＡＬ１など）、ＣＬＯＣＫ（ＣＬＯＣＫ）が挙げられる。これらの遺伝子は、ヒト、マウスなど様々な動物が有し、またほぼ全身の細胞に発現していることが知られている。
概日リズムは上記時計遺伝子間の発現変動により生じる。ほぼ全身の細胞に発現している時計遺伝子が組織ごとにタイミングを合わせて（これを同調という）２４時間周期で発現変動を繰り返し、その下流で代謝のリズムを作る。時計遺伝子のネガティブフィードバックをコアループとした転写翻訳調節により、２４時間のリズムが生まれる。その中心的な役割を担っているＰＥＲ２の発現リズムを制御することにより、一連の時計遺伝子の発現が制御され、その結果として概日リズムの制御が可能である。

例えば、交代勤務によって概日リズムが大きく乱れることは、肥満・がんのリスク要因となる(van Drongelen et al., Scand J Work Environ Health 2011;37(4):263-275、Wegrzyn LR et al., Am J Epidemiol. 2017 Sep 1;186(5):532-540) 。また、概日リズムが乱れている人ほど、大うつ病、双極性障害、著しい孤独感、幸福感の欠如、健康不安、反応時間の悪化、気分の不安定化といった症状が高確率で出現する(Jones, Lane et al., Nat Commun. 2019 Jan 29;10(1):343)。さらに、概日リズムが夜型の生活を続ける人は朝型の人と比較して糖尿病、神経障害、精神疾患、消化器・呼吸器疾患のリスクが大きいなどといった報告がある(Knutson and von Schantz et al., Chronobiol Int. 2018 August ; 35(8): 1045-1053)。本発明の概日リズム調節剤により、概日リズムの調節が可能であることから、概日リズムの調節を介した疾患の予防、緩和、治療等に使用することができる。そのような疾患としては、以下に限定されるものではないが例えば、睡眠障害や不眠症、時差ぼけ（ジェットラグ）、癌、肥満、高血圧、脳梗塞、脳溢血、冠攣縮性狭心症、自律神経失調症、躁うつ病、うつ病、大うつ病、双極性障害、著しい孤独感、幸福感の欠如、健康不安、反応時間の悪化、気分の不安定化、消化器・呼吸器疾患、神経障害、神経疾患、糖尿病などの内分泌・代謝系および自律神経系疾患を挙げることができる。

以下本発明を具体的に説明する為に実施例を示すが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

試験例１セラストロール、プリスチメリン、ククルビタシンＢ、ククルビタシンＤ、ククルビタシンＥ、ククルビタシンＩ、ククルビタシンＳ、または、イソククルビタシンＢの概日リズム調節効果
代表的な時計遺伝子の一つＰＥＲに着目し、ヒトＰＥＲ２の発現リズムを概日リズムの指標とし、トリテルペン類の概日リズム調節機能を検討した。ヒトＰＥＲ２の発現リズムを概日リズムの指標とすることは、概日リズムの調節作用を評価する系として確立されており、例えばIsojima et al., PNAS 2009 Sep;106(37):15744-15749、Hirota et al., Science 2012 Aug;337:1094-1097 等に開示されている。

（被験物質）
セラストロール（東京化成工業(株)、Ｃ２７３７）、プリスチメリン（ＭｅｄＣｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ、ＨＹ-N１９３７）、ククルビタシンＢ（東京化成工業(株)、Ｃ３４４２）ククルビタシンＤ（ＣｈｅｍＦａｃｅｓ、ＣＦＮ９０２０９）、ククルビタシンＥ（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ、１４８２１）、ククルビタシンＩ（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ、１４７４７）、ククルビタシンＳ（ＣｈｅｍＦａｃｅｓ、ＣＦＮ９０５３５）、イソククルビタシンＢ（ＣｈｅｍＦａｃｅｓ、ＣＦＮ９１００３）、は市販されているものを用いた。
各試薬はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｗａｋｏ, ０４８−２１９８５）に溶解し、細胞に各試薬を添加するとき、ＤＭＳＯ終濃度が０．１％になるようにした。

（試験方法）
試験系として、ヒトＰＥＲ２プロモーター下にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ概日リズムレポーターを安定発現するヒト骨肉腫由来Ｕ２ＯＳ細胞（Ｕ２ＯＳ−ＰＥＲ２−Ｌｕｃ）、マウスＰＥＲ２プロモーター下にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ概日リズムレポーターを安定発現するマウス由来３Ｔ３細胞（３Ｔ３−ＰＥＲ２−Ｌｕｃ）、あるいはマウスＰＥＲ２下流にルシフェラーゼ遺伝子をノックインしたＰＥＲ２：：ＬＵＣノックインマウスの培養組織片を用いた。ルシフェリンールシフェラーゼ反応による発光値の変化が、ＰＥＲ２の転写活性変化を表す。発光を数日間計測し、連続的な発光の波形を得て概日リズムの指標とした。なお、ＰＥＲ２：：ＬＵＣとは、ＰＥＲ２のＣ末端にルシフェラーゼが連結された融合タンパク質である。
（１）Ｕ２ＯＳ−ＰＥＲ２−Ｌｕｃ細胞、あるいは、３Ｔ３−ＰＥＲ２−Ｌｕｃ細胞を３５ｍｍ径ディッシュに播種し、１０％牛胎児血清、ペニシリンーストレプトマイシンを添加した２ｍＬのＤＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ）でコンフルエントまで培養した。
（２）５０％ウマ血清を添加したＤＭＥＭ培地で２時間培養し、細胞のリズムを合わせた（非特許文献９）。この２時間の５０％ウマ血清入り培地での培養を以下血清刺激と表す。血清刺激の後、０．１Ｍのルシフェリン２μＬ、ペニシリンーストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地２ｍＬ（最終濃度：０．１ｍＭルシフェリン）に交換して、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で３日以上連続的に発光を計測した。計測にはＡＴＴＯ社の発光測定装置Ｋｒｏｎｏｓｄｉｏを用いた。発光量は１分間の積算値を１０分間隔で測定した。
（３）ＰＥＲ２：：ＬＵＣノックインマウスについては解剖後、ペニシリンーストレプトマイシン、０．１Ｍルシフェリン１μＬを添加した１ｍＬのＤＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ）（最終濃度：０．１ｍＭルシフェリン）に肺組織片を注意深く移して３７℃、５％ＣＯ₂条件下で３日以上連続的に発光を計測した。計測には細胞と同様、ＡＴＴＯ社の発光測定装置Ｋｒｏｎｏｓｄｉｏを用いた。発光量は１分間の積算値を１０分間隔で測定した。
（４）計測途中に装置を止め培地中に試薬を添加した。添加後装置を再開し、続けて発光を記録した。
（５）Ｋｒｏｎｏｓｄｉｏに搭載されている解析システムにより、得られた発光値の経時変化の波形からノイズを除去し、デトレンドして発光リズムを得た。得られた発光リズムの位相を求め、対照群（溶媒として使用したジメチルスルホキシドを等量添加したもの）との比較検証を行った。

（結果）
概日リズムの位相は発光が示す波形の頂点の時間（横軸：Kronosで発光計測を開始してからの経過時間）により特徴づけられる。試薬添加直後は添加の刺激により発光がやや乱れるため、発光値が回復した後の頂点位相を基準とし、位相の解析を行った。血清刺激から２４時間後にセラストロール（終濃度０．５μＭ）またはククルビタシンＢ（終濃度０．１μＭ）を添加し、数日間の計測後得られたピークの位相を比較すると、概日リズムの位相がセラストロールで最大約１０時間、ククルビタシンＢで最大約５時間後退した（図１）。図１にはこの時の代表的な波形データと、同じトリテルペン類の中でも、位相に影響を及ぼさない例としてグリチルレチン酸（終濃度５μＭ）の波形データを示す。試薬の添加は図中矢印のタイミングで行った。
ランダムに選抜した１６種類のテルペン(２種類のジテルペンを含む)で同様の試験を行うと、血清添加後２、３番目に出現するピークの位相は、セラストロール、コロソリン酸の２種類のトリテルペンにより、有意に後退した（ｎ=６〜１０、一元配置分散分析の後ＴｕｋｅｙＨＳＤテストにより解析）。また、ククルビタシンＢにおいては３番目のピークにおいて後退傾向（p=０．０７９）を示した（図２）。コロソリン酸については、この細胞における位相変異作用は上述の通り公知である（特許文献５）。
このセラストロールおよびククルビタシンＢの位相後退効果は、濃度依存性を示した（図３）。また、血清刺激からの時間を変えて、１５、２１、２７、３３時間後にセラストロールまたはククルビタシンＢを添加すると、概日リズムの位相はタイミングに応じて前進、または後退した(図４)。
また、セラストロール、ククルビタシンＢをＰＥＲ２：：ＬＵＣノックインマウスの肺培養組織片に添加すると、ヒト培養細胞と同様に、ＰＥＲ２の概日発現リズムの位相が変化した（図５）。
プリスチメリン（終濃度０．５μＭ）の添加は、セラストロール（終濃度０．５μＭ）の添加と同様に、Ｕ２ＯＳ−ＰＥＲ２−Ｌｕｃ細胞の位相を大きく変化させた（図６）。
ククルビタシンＤ（終濃度０．５μＭ）ククルビタシンＥ（終濃度０．１μＭ）、ククルビタシンＩ（終濃度０．１μＭ）、ククルビタシンＳ（終濃度５μＭ）もしくは、イソククルビタシンＢ（終濃度５μＭ）の添加は、３Ｔ３−ＰＥＲ２−Ｌｕｃ細胞の位相を変化させた（図７、図８、図９）。
また、セラストロールおよびプリスチメリンは、濃度依存的に３Ｔ３−ＰＥＲ２−Ｌｕｃ細胞の発光量を増加させた（図１０Ａ、図１１）。すなわち、ＰＥＲ２の発現量を増加させたことを意味する。
さらに、セラストロールは、濃度依存的に３Ｔ３−ＰＥＲ２−Ｌｕｃ細胞の概日時計の周期長を短縮させた（図１０Ｂ）。

Claims

ホパン型トリテルペン、ククルビタン型トリテルペン及びそれらの薬理学的に許容される塩からなる群から選択される１以上を有効成分として含む概日リズム調節剤。
ＰＥＲ２の発現量、発現リズムの位相又は発現リズムの周期長を調節する、請求項１に記載の概日リズム調節剤。
ホパン型トリテルペンがセラストロール及びプリスチメリンからなる群から選択される１以上であり、ククルビタン型トリテルペンがククルビタシンＢ、ククルビタシンＤ、ククルビタシンＥ、ククルビタシンＩ、ククルビタシンＳ及びイソククルビタシンＢからなる群から選択される１以上である、請求項１または２に記載の概日リズム調節剤。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の概日リズム調節剤を含む、概日リズム調節用飲食品。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の概日リズム調節剤を含む、概日リズム調節用動物用飼料。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の概日リズム調節剤を含む、概日リズムの調節を介した疾患の予防、緩和、または治療のための医薬組成物。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の概日リズム調節剤を含む、概日リズムの調節を介した疾患の予防、緩和、または治療のための動物用医薬組成物。