JP2021043085A - Method for observing comparison between presence position of specific protein and shape characteristic of stratum corneum itself and/or presence position of specific tissue within stratum corneum - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は特定のタンパク質の存在位置と角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置とを対比観察する方法に関する。 The present invention relates to a method for observing the presence position of a specific protein in contrast with the shape characteristics of the stratum corneum itself and / or the presence position of a specific tissue in the stratum corneum.
肌荒れ、日焼けや乾燥により生じる角層の落屑等の肌状態の悪化に関し、コルネオデスモゾームタンパク質の増加が原因の一つとして知られている（特許文献１）。 It is known that an increase in Corneodesmosome protein is one of the causes of deterioration of skin condition such as desquamation of the stratum corneum caused by rough skin, sunburn and dryness (Patent Document 1).
ここで、コルネオデスモゾームタンパク質のうち、特に、デスモグレインが表皮細胞間及び角質細胞間の接着に関与していることが知られている（特許文献２−４）。 Here, among the corneodesmosome proteins, it is known that desmoglein is involved in adhesion between epidermal cells and keratinocytes (Patent Document 2-4).
そして、特許文献５には、蛍光抗体法により染色したデスモグレインの存在位置を指標とする表皮ターンオーバーの評価方法及び肌状態評価方法が開示されている。 Then, Patent Document 5 discloses an evaluation method of epidermis turnover and a skin condition evaluation method using the presence position of desmoglein stained by the fluorescent antibody method as an index.
上記の通り、特定のタンパク質の存在位置と角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置には、相関関係があることが知られている。 As described above, it is known that there is a correlation between the presence position of a specific protein and the shape characteristics of the stratum corneum itself and / or the presence position of a specific tissue in the stratum corneum.
前述の先行技術のあるところ、本発明者らは、簡便に、特定のタンパク質の存在位置と角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置とを対比観察する手段を見出し、本発明を完成させた。 Given the above-mentioned prior art, the present inventors can easily compare and observe the presence position of a specific protein with the shape characteristics of the stratum corneum itself and / or the presence position of a specific tissue in the stratum corneum. The heading has completed the present invention.
すなわち、本発明は、特定のタンパク質の存在位置と角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置とを対比観察する技術を提供することを課題とする。 That is, it is an object of the present invention to provide a technique for observing the presence position of a specific protein and the shape feature of the stratum corneum itself and / or the presence position of a specific tissue in the stratum corneum.
上記課題を解決する本発明は、角層における特定のタンパク質の存在位置を、免疫染色（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）により測定する第一測定工程と、
前記第一測定工程後に、前記第一測定工程で用いた角層と同一の角層に対し、組織染色処理により、角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置を測定する第二測定工程と、
前記第一測定工程及び前記第二測定工程の測定結果に基づき、同一の角層における、特定のタンパク質の存在位置と角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置と、を対比観察する対比観察工程と、
を有する、方法である。
The present invention that solves the above problems includes a first measurement step of measuring the presence position of a specific protein in the stratum corneum by immunostaining.
After the first measurement step, the same stratum corneum as the stratum corneum used in the first measurement step is subjected to tissue staining treatment to determine the shape characteristics of the stratum corneum itself and / or the position of a specific tissue in the stratum corneum. The second measurement process to measure and
Based on the measurement results of the first measurement step and the second measurement step, the location of a specific protein in the same stratum corneum, the shape characteristics of the stratum corneum itself, and / or the location of a specific tissue in the stratum corneum. , And the contrast observation process
Is a method.
角層は、多層構造を形成している。そして、角層は、熱、薬剤、物理的な衝撃によっても、その構造が崩れにくい。
以上の理由から、本発明においては、対比観察の対象として角層を用いることが好ましい。
The stratum corneum forms a multi-layered structure. The structure of the stratum corneum does not easily collapse due to heat, chemicals, or physical impact.
For the above reasons, in the present invention, it is preferable to use the stratum corneum as a target for contrast observation.
また、本発明の好ましい形態では、水溶性封入剤を用い、カバーガラスとスライドガラスとの間に配置された前記角層を封入する処理を前記第一測定工程が含み、
前記第一測定工程と前記第二測定工程との間に、中間処理工程を有し、
前記中間処理工程は、前記第一測定工程後に２５℃以上の温水に前記角層の配置されたスライドガラスを浸し、前記角層を崩さずに前記水溶性封入剤を除くことを含む。
Further, in a preferred embodiment of the present invention, the first measurement step includes a process of encapsulating the stratum corneum arranged between the cover glass and the slide glass using a water-soluble encapsulant.
An intermediate treatment step is provided between the first measurement step and the second measurement step.
The intermediate treatment step includes immersing the slide glass on which the stratum corneum is arranged in warm water at 25 ° C. or higher after the first measurement step, and removing the water-soluble mounting medium without breaking the stratum corneum.
また、本発明の好ましい形態では、前記水溶性封入剤がＦｌｕｏｒｏｍｏｕｔ−Ｇである。 Further, in a preferred embodiment of the present invention, the water-soluble encapsulant is Fluromout-G.
また、本発明の好ましい形態では、前記角層を封入するときに、油溶性接着剤を用い、スライドガラスとカバーガラスとを固定する処理を前記第一測定工程が含み、
前記第一測定工程が、スライドガラスとカバーガラスとを有機溶剤に浸漬させ、前記角層を崩さずに前記油溶性接着剤を除くことを含む。
Further, in a preferred embodiment of the present invention, the first measurement step includes a process of fixing the slide glass and the cover glass by using an oil-soluble adhesive when encapsulating the stratum corneum.
The first measurement step includes immersing the slide glass and the cover glass in an organic solvent to remove the oil-soluble adhesive without breaking the stratum corneum.
また、本発明の好ましい形態では、前記有機溶剤がキシレンを含む液剤である。 Further, in a preferred embodiment of the present invention, the organic solvent is a liquid preparation containing xylene.
また、本発明の好ましい形態では、前記免疫染色（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）が蛍光染色であり、
前記対比観察工程が、
特定のタンパク質の蛍光強度と、
前記角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置と、
を対比観察することを含む。
Further, in a preferred embodiment of the present invention, the immunostaining is fluorescent staining.
The contrast observation step
With the fluorescence intensity of a particular protein,
The shape characteristics of the stratum corneum itself and / or the position of the specific tissue in the stratum corneum,
Includes contrasting observations.
また、本発明の好ましい形態では、前記第一測定工程が、角層における、デスモグレインの存在位置を測定する工程である。 Further, in a preferred embodiment of the present invention, the first measurement step is a step of measuring the presence position of desmoglein in the stratum corneum.
本発明によれば、特定のタンパク質の存在位置と角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置とを対比観察する技術を提供することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide a technique for observing the presence position of a specific protein in contrast with the shape characteristics of the stratum corneum itself and / or the presence position of a specific tissue in the stratum corneum.
以下、本発明の好ましい実施形態について説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施形態に限定されないことは言うまでもない。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described, but it goes without saying that the technical scope of the present invention is not limited to the following embodiments.
本発明は、角層における特定のタンパク質の存在位置を、免疫染色（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）により測定する第一測定工程と、
第一測定工程後に、第一測定工程で用いた角層と同一の角層に対し、組織染色処理により、角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置とを測定する第二測定工程と、
第一測定工程及び第二測定工程の測定結果に基づき、同一の角層における、特定のタンパク質の存在位置と角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置と、を対比観察する対比観察工程と、
を有する。
The present invention includes a first measurement step of measuring the position of a specific protein in the stratum corneum by immunostaining.
After the first measurement step, the same stratum corneum as the stratum corneum used in the first measurement step is subjected to tissue staining treatment to measure the shape characteristics of the stratum corneum itself and / or the position of a specific tissue in the stratum corneum. The second measurement process to be performed
Based on the measurement results of the first measurement step and the second measurement step, the position of a specific protein in the same stratum corneum, the shape characteristics of the stratum corneum itself, and / or the location of a specific tissue in the stratum corneum. The contrast observation process for contrast observation and
Have.
上記形態とすることにより、特定のタンパク質の存在位置と角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置とを対比観察することができる。 With the above form, the presence position of a specific protein can be observed in comparison with the shape characteristics of the stratum corneum itself and / or the presence position of a specific tissue in the stratum corneum.
以下、対比観察の対象とする角層に関し、より好ましい形態を説明する。 Hereinafter, a more preferable form of the stratum corneum to be compared and observed will be described.
対比観察の対象とする角層として、例えば、表皮における角層を挙げることができる。 As the stratum corneum to be compared and observed, for example, the stratum corneum in the epidermis can be mentioned.
角層は多層構造を形成している。そして、角層は、熱、薬剤、物理的な衝撃によっても、その構造が崩れにくい。
以上の理由から、対比観察の対象として角層を用いることが好ましい。
The stratum corneum forms a multi-layered structure. The structure of the stratum corneum does not easily collapse due to heat, chemicals, or physical impact.
For the above reasons, it is preferable to use the stratum corneum as a target for comparative observation.
なお、対比観察の対象とする角層は、被験者の皮膚から取得することで用意することができる。
ここで、被験者の皮膚から角層を取得する方法としては、例えば、テープストリッピング法に依り角層を取得する方法を挙げることができる。
The stratum corneum to be compared and observed can be prepared by obtaining it from the skin of the subject.
Here, as a method of obtaining the stratum corneum from the skin of the subject, for example, a method of obtaining the stratum corneum by a tape stripping method can be mentioned.
次に、本発明における各工程の詳細を説明する。 Next, the details of each step in the present invention will be described.
＜１＞ 第一測定工程
第一測定工程は、角層における特定のタンパク質の存在位置を、免疫染色（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）により測定する工程である。
<1> First measurement step The first measurement step is a step of measuring the presence position of a specific protein in the stratum corneum by immunostaining.
免疫染色は、蛍光染色、色素染色の何れであっても良い。本発明においては、蛍光染色であることが好ましい。 The immunostaining may be either fluorescent staining or dye staining. In the present invention, fluorescent staining is preferable.
本実施例において、免疫染色は、間接法である。
具体的には、本実施例における免疫染色は、標識していない一次抗体を用いて１度目の抗原抗体反応を行い、一次抗体自体を抗原とする別の標識された抗体（二次抗体）をさらに反応させ２回以上の抗原抗体反応を行う方法である。
In this example, immunostaining is an indirect method.
Specifically, in the immunostaining in this example, the first antigen-antibody reaction is carried out using an unlabeled primary antibody, and another labeled antibody (secondary antibody) using the primary antibody itself as an antigen is used. This is a method of further reacting and carrying out an antigen-antibody reaction two or more times.
ただし、本発明における免疫染色は直接法であってもよい。
具体的には、本発明における免疫染色は、抗原に直接反応する一次抗体を標識し、抗原抗体反応を１度しか行わない方法とすることもできる。
However, the immunostaining in the present invention may be a direct method.
Specifically, the immunostaining in the present invention may be a method in which a primary antibody that directly reacts with an antigen is labeled and the antigen-antibody reaction is carried out only once.
測定対象とするタンパク質としては、例えば、コルネオデスモゾームを好ましく挙げることができる。中でも、第一測定工程における測定対象は、デスモグレイン１であることが好ましい。 As the protein to be measured, for example, Corneodesmosome can be preferably mentioned. Above all, the measurement target in the first measurement step is preferably desmoglein 1.
ただし、本発明において、第一測定工程で測定対象とするタンパク質は、測定においてその局在が把握できるものであれば、その種類に特に制限はない。 However, in the present invention, the type of the protein to be measured in the first measurement step is not particularly limited as long as its localization can be grasped in the measurement.
また、本実施例において、第一測定工程は、免疫染色後の角層の観察にあたり、水溶性封入剤を用い、カバーガラスとスライドガラスとの間に配置された角層を封入する処理を含む。
上記処理を行うことで、より簡便に、特定のタンパク質の存在位置と角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置とを対比観察することができる。
Further, in the present embodiment, the first measurement step includes a treatment of encapsulating the stratum corneum arranged between the cover glass and the slide glass by using a water-soluble encapsulant when observing the stratum corneum after immunostaining. ..
By performing the above treatment, it is possible to more easily compare and observe the presence position of a specific protein and the shape characteristics of the stratum corneum itself and / or the presence position of a specific tissue in the stratum corneum.
また、本実施例において、第一測定工程は、角層を封入するときに、油溶性接着剤を用い、スライドガラスとカバーガラスとを固定する処理を含む。
上記処理を行うことで、より簡便に、特定のタンパク質の存在位置と角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置とを対比観察することができる。
Further, in the present embodiment, the first measurement step includes a process of fixing the slide glass and the cover glass by using an oil-soluble adhesive when encapsulating the stratum corneum.
By performing the above treatment, it is possible to more easily compare and observe the presence position of a specific protein and the shape characteristics of the stratum corneum itself and / or the presence position of a specific tissue in the stratum corneum.
また、第一測定工程の測定結果は、画像として取得する形態であることが好ましい。 Moreover, it is preferable that the measurement result of the first measurement step is acquired as an image.
また、本発明の好ましい実施の形態では、第一測定工程が、スライドガラスとカバーガラスとを有機溶剤に浸漬させ、角層を崩さずに油溶性接着剤を除くことを含む。 Further, in a preferred embodiment of the present invention, the first measurement step includes immersing the slide glass and the cover glass in an organic solvent to remove the oil-soluble adhesive without breaking the stratum corneum.
特に、油溶性接着剤がマニキュアである場合に、有機溶剤に浸漬させ、角層を崩さずに油溶性接着剤を除くことが好ましい。 In particular, when the oil-soluble adhesive is nail polish, it is preferable to immerse it in an organic solvent to remove the oil-soluble adhesive without destroying the stratum corneum.
また、有機溶剤としては、キシレンを含む液剤を好ましく挙げることができる。 Further, as the organic solvent, a liquid agent containing xylene can be preferably mentioned.
ここで、角層の配置されたスライドガラスへの有機溶剤の適用時間は、１分以上、より好ましくは２分以上である。
下限以上の時間とすることで、より確実に油溶性接着剤を除くことができる。
Here, the application time of the organic solvent to the slide glass on which the stratum corneum is arranged is 1 minute or more, more preferably 2 minutes or more.
By setting the time to be equal to or greater than the lower limit, the oil-soluble adhesive can be removed more reliably.
また、角層の配置されたスライドガラスへの有機溶剤の適用時間は、３０分以下、より好ましくは２０分以下、さらに好ましくは１０分以下である。
上限以下の時間とすることで、角層を壊さずに、油溶性接着剤を除くことができる。
The application time of the organic solvent to the slide glass on which the stratum corneum is arranged is 30 minutes or less, more preferably 20 minutes or less, still more preferably 10 minutes or less.
By setting the time to be less than or equal to the upper limit, the oil-soluble adhesive can be removed without damaging the stratum corneum.
ここで、有機溶剤の温度は、好ましくは３０℃以下、より好ましくは２５℃以下である。 Here, the temperature of the organic solvent is preferably 30 ° C. or lower, more preferably 25 ° C. or lower.
有機溶剤に浸漬させ、角層を崩さずに油溶性接着剤を除く処理は、温水に角層の配置されたスライドガラスを浸す前に行うことが好ましい。 The treatment of immersing in an organic solvent to remove the oil-soluble adhesive without destroying the stratum corneum is preferably performed before immersing the slide glass in which the stratum corneum is arranged in warm water.
＜２＞中間処理工程
中間処理工程とは、第一測定工程後の角層を第二測定工程に供するための準備工程をいう。
<2> Intermediate treatment step The intermediate treatment step refers to a preparatory step for subjecting the stratum corneum after the first measurement step to the second measurement step.
水溶性封入剤を用い、カバーガラスとスライドガラスとの間に配置された角層を封入する処理を第一測定工程が含む場合には、中間処理工程として、第一測定工程後に２５℃以上の温水に角層の配置されたスライドガラスを浸し、角層を崩さずに水溶性封入剤を除くことを含むことが好ましい。 When the first measurement step includes a process of encapsulating the stratum corneum arranged between the cover glass and the slide glass using a water-soluble encapsulant, the intermediate treatment step is 25 ° C. or higher after the first measurement step. It is preferable to immerse the slide glass on which the stratum corneum is arranged in warm water to remove the water-soluble mounting medium without breaking the stratum corneum.
特に、水溶性封入剤がＦｌｕｏｒｏｍｏｕｔ−Ｇである場合に、中間処理工程として、第一測定工程後に２５℃以上の温水に角層の配置されたスライドガラスを浸す処理を行うことが好ましい。 In particular, when the water-soluble mounting medium is Fluromout-G, it is preferable to perform a treatment of immersing the slide glass in which the stratum corneum is arranged in warm water of 25 ° C. or higher after the first measurement step as an intermediate treatment step.
ここで、角層を崩さずに水溶性封入剤を除く処理における、温水の温度は、好ましくは２５℃以上、より好ましくは３０℃以上、より好ましくは３５℃以上である。
下限以上の温度とすることで、水溶性封入剤を除くことができる。
Here, the temperature of the hot water in the treatment for removing the water-soluble mounting medium without breaking the stratum corneum is preferably 25 ° C. or higher, more preferably 30 ° C. or higher, and more preferably 35 ° C. or higher.
By setting the temperature above the lower limit, the water-soluble mounting medium can be removed.
また角層を崩さずに水溶性封入剤を除く処理における、温水の温度は、好ましくは４５℃以下、より好ましくは４０℃以下である。
上限以下の温度とすることで、角層を壊さずに、水溶性封入剤を除くことができる。
Further, the temperature of the hot water in the treatment for removing the water-soluble mounting medium without breaking the stratum corneum is preferably 45 ° C. or lower, more preferably 40 ° C. or lower.
By setting the temperature below the upper limit, the water-soluble mounting medium can be removed without damaging the stratum corneum.
ここで、温水の温度が２５℃〜３０℃の場合の浸漬時間は、好ましくは３日以上、より好ましくは４日以上である。 Here, when the temperature of the hot water is 25 ° C. to 30 ° C., the immersion time is preferably 3 days or more, more preferably 4 days or more.
また、温水の温度が３０℃〜３５℃の場合の浸漬時間は、好ましくは１日以上、より好ましくは２日以上である。 When the temperature of the hot water is 30 ° C. to 35 ° C., the immersion time is preferably 1 day or longer, more preferably 2 days or longer.
また、温水の温度が３５℃〜４０℃の場合の浸漬時間は、好ましくは１２時間以上、より好ましくは１６時間以上である。 When the temperature of the hot water is 35 ° C. to 40 ° C., the immersion time is preferably 12 hours or more, more preferably 16 hours or more.
また、温水の温度が４０℃以上の場合の浸漬時間は、好ましくは１２時間未満である。 The immersion time when the temperature of the hot water is 40 ° C. or higher is preferably less than 12 hours.
上記の条件とすることで、より確実に、角層を崩さずに水溶性封入剤を除くことができる。 Under the above conditions, the water-soluble mounting medium can be removed more reliably without destroying the stratum corneum.
＜３＞ 第二測定工程
第二測定工程は、第一測定工程後に、第一測定工程で用いた角層と同一の角層に対し、組織染色処理により、角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置を測定する工程である。
<3> Second measurement step In the second measurement step, after the first measurement step, the same stratum corneum as the stratum corneum used in the first measurement step is subjected to tissue staining treatment to obtain the shape characteristics of the stratum corneum itself and /. Alternatively, it is a step of measuring the existence position of a specific tissue in the stratum corneum.
本明細書において、組織染色処理とは、所望の形状的特徴の存在位置を組織学的に染色する処理をいう。 As used herein, the tissue staining process refers to a process of histologically staining the presence position of a desired shape feature.
本明細書において、角層自体の形状的特徴とは、角層そのもの形状、形状的特徴をいう。 In the present specification, the shape feature of the stratum corneum itself means the shape and shape feature of the stratum corneum itself.
角層自体の染色処理は、角層の形状的特徴が観察できるものであれば、その手法に特に制限はない。
ここで、角層染色剤としては、例えば本出願人による特開２００６−０５３１１７号公報などに記載された、ゲンチアナバイオレットといった角層染色剤を挙げることができる。
The method for dyeing the stratum corneum itself is not particularly limited as long as the shape characteristics of the stratum corneum can be observed.
Here, as the stratum corneum dyeing agent, for example, a stratum corneum dyeing agent such as Gentian Violet described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-053117 by the present applicant can be mentioned.
また、本明細書において、角層内における特定組織の存在位置とは、生体組織、細胞の構造、機能特徴の存在する位置をいう。 Further, in the present specification, the presence position of a specific tissue in the stratum corneum means a position where a biological tissue, a cell structure, and a functional feature are present.
特定組織の染色処理としては、たとえば、フォンタナマッソン染色を挙げることができる。 Examples of the staining treatment for a specific tissue include Fontana Masson staining.
特定組織としては、染色により観察可能な組織であれば特に制限はなく、例えば、メラニンの局在を挙げることができる。 The specific tissue is not particularly limited as long as it is a tissue that can be observed by staining, and examples thereof include localization of melanin.
また、第二測定工程の測定結果は、第一測定工程で取得した画像と同一の部分を画像として取得する形態であることが好ましい。 Further, it is preferable that the measurement result of the second measurement step is in the form of acquiring the same portion as the image acquired in the first measurement step as an image.
＜４＞対比観察工程
対比観察工程は、第一測定工程及び第二測定工程の測定結果に基づき、同一の角層における特定のタンパク質の存在位置と角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置を対比観察する工程である。
<4> Comparison observation step In the comparison observation step, based on the measurement results of the first measurement step and the second measurement step, the presence position of a specific protein in the same stratum corneum, the shape characteristics of the stratum corneum itself, and / or the stratum corneum This is a step of comparing and observing the existence position of a specific tissue in the inside.
ここで、第一測定工程での免疫染色（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）が蛍光染色である場合には、
対比観察工程は、特定のタンパク質の蛍光強度と、角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置と、を対比観察することを含む形態であることが好ましい。
Here, when the immunostaining in the first measurement step is fluorescent staining,
The contrast observation step preferably includes a comparative observation of the fluorescence intensity of the specific protein and the shape characteristics of the stratum corneum itself and / or the position of the specific tissue in the stratum corneum.
また、第一測定工程及び第二測定工程の測定結果を対比する方法としては、第一測定工程の測定結果の画像と、第二測定工程の測定結果の画像とを並列に配置し、本分野を専門とする評価者により、特定のタンパク質の存在位置と角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置とを対比観察する方法を挙げることができる。 Further, as a method of comparing the measurement results of the first measurement step and the second measurement step, an image of the measurement result of the first measurement step and an image of the measurement result of the second measurement step are arranged in parallel in this field. A method of observing the presence position of a specific protein and the shape characteristics of the stratum corneum itself and / or the presence position of a specific tissue in the stratum corneum in comparison with an evaluator specializing in the above can be mentioned.
また、第一測定工程及び第二測定工程の測定結果を対比する他の方法として、第一測定工程の測定結果の画像と、第二測定工程の測定結果の画像とを重ね合わせた照合後画像を生成することを挙げることができる。
具体的には、照合後画像生成手段により、第一測定工程の測定結果の画像と、第二測定工程の測定結果の画像とを重ね合わせた照合後画像を生成し、端末に表示可能とすることもできる。
Further, as another method for comparing the measurement results of the first measurement step and the second measurement step, the image after collation in which the image of the measurement result of the first measurement step and the image of the measurement result of the second measurement step are superimposed is superimposed. Can be mentioned to generate.
Specifically, the post-matching image generation means generates a post-matching image in which the image of the measurement result of the first measurement step and the image of the measurement result of the second measurement step are superimposed, and can be displayed on the terminal. You can also do it.
ここで、照合後画像を生成する方法に特に制限はなく、例えば、第一測定工程の測定結果の画像と、第二測定工程の測定結果の画像の一致率が高くなるよう、画像の向き変更処理、画像の拡大縮小処理をおこなうことで、第一測定工程の測定結果の画像と、第二測定工程の測定結果の画像とを重ね合わせた照合後画像を生成する方法をとることができる。 Here, there is no particular limitation on the method of generating the image after collation. For example, the orientation of the image is changed so that the matching rate between the image of the measurement result of the first measurement step and the image of the measurement result of the second measurement step is high. By performing the processing and the enlargement / reduction processing of the image, it is possible to take a method of generating a collated image by superimposing the image of the measurement result of the first measurement step and the image of the measurement result of the second measurement step.
中でも、照合後映像を生成する方法は、各染色前の細胞の配置の一致率が高くなるよう、画像の拡大縮小処理をおこなうことで、第一測定工程の測定結果の画像と、第二測定工程の測定結果の画像とを重ね合わせた照合後映像を生成する方法とすることが好ましい。 Above all, in the method of generating the image after collation, the image of the measurement result of the first measurement step and the second measurement are performed by performing enlargement / reduction processing of the image so that the matching rate of the cell arrangement before each staining becomes high. It is preferable to use a method of generating a collated image by superimposing the image of the measurement result of the process.
また、照合後映像における、第一測定工程及び第二測定工程の測定結果の差分を可視化することが好ましい。
具体的には、差分可視化手段により、差分の色付け、差分の透かし、差分の切り出し、差分の印付け、から選ばれる１又は２以上の方法により、照合後映像における、第一測定工程及び第二測定工程の測定結果の差分を可視化し、端末に表示可能とすることもできる。
Further, it is preferable to visualize the difference between the measurement results of the first measurement step and the second measurement step in the collated video.
Specifically, the first measurement step and the second in the collated video by one or more methods selected from coloring the difference, watermarking the difference, cutting out the difference, and marking the difference by the difference visualization means. It is also possible to visualize the difference in the measurement result of the measurement process and display it on the terminal.
以下、本発明の基礎となる知見を裏付ける各種試験結果を示す。 Hereinafter, various test results supporting the findings underlying the present invention are shown.
＜試験１＞ 角層の同一部位における、デスモグレイン１の免疫染色と、細胞形態染色（角層染色）による二重染色を試みた。 <Test 1> We attempted immunostaining of desmoglein-1 and double staining by cell morphological staining (horny layer staining) at the same site of the stratum corneum.
（１）被検試料の採取
テープストリッピング法により、角層を５１歳男性の腕から採取した。
採取した角層をスライドガラスに貼付した。
(1) Collection of test sample The stratum corneum was collected from the arm of a 51-year-old man by the tape stripping method.
The collected stratum corneum was attached to a slide glass.
（２）第一測定工程：デスモグレイン１の免疫染色
角層を添付したスライドガラスを、キシレン（Ｗａｋｏ 製）に一晩浸漬した。
浸漬後の角層を洗浄、風乾し、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（Ｗａｋｏ 製）中、室温条件下で１５分間静置した。
(2) First measurement step: Immunostaining of desmoglein 1 A slide glass attached with a stratum corneum was immersed in xylene (manufactured by Wako) overnight.
The stratum corneum after immersion was washed, air-dried, and allowed to stand in a 4% paraformaldehyde / phosphate buffer (manufactured by Wako) at room temperature for 15 minutes.
角層をＰＢＳ（Ｗａｋｏ 製）で洗浄した。洗浄後の角層を、２０％ブロックエース水溶液（ＤＳ バイオファーマメディカル株式会社 製）中、室温条件下、１時間静置した。 The stratum corneum was washed with PBS (manufactured by Wako). The washed stratum corneum was allowed to stand in a 20% aqueous block ace solution (manufactured by DS Bioffer Ma Medical Co., Ltd.) under room temperature conditions for 1 hour.
角層を添付したスライドガラス（ＭＡＳ コート ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ 製）をスーパーパップペンリキッドブロッカー（大道産業株式会社 製）で枠付けし、角層に一次抗体（Ａｎｔｉ−Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ１，Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｎｏ（Ｄｓｇ１−Ｐ２３）（Ｐｒｏｇｅｎ，６５１１１０）原液：ＩｇＧ 濃度：１０−１５μｇ／ｍＬ）を加え、湿潤箱中、室温条件下で２時間静置した。
静置後、ＰＢＳを用い、角層を洗浄した。
A slide glass (manufactured by MAS Coat MATSUNAMI) with a stratum corneum is framed with a super pappen liquid blocker (manufactured by Daido Sangyo Co., Ltd.), and the primary antibody (Anti-Desmoglein1, Mouse-Mono (Dsg1-P23)) ( Progen, 651110) Undiluted solution: IgG concentration: 10-15 μg / mL) was added, and the mixture was allowed to stand in a wet box at room temperature for 2 hours.
After standing, the stratum corneum was washed with PBS.
洗浄後、二次抗体（Ａｌｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ＠４８８ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ−１１００１ ＰＢＳ２００倍希釈液）を加え、湿潤箱中で室温、遮光条件下で、１時間静置した。
静置後、ＰＢＳ、蒸留水を用い、角層を洗浄した。
After washing, a secondary antibody (Allexa Fluor @ 488 Goat Anti-mouse IgG (Invitrogen, A-11001 PBS 200-fold diluted solution) was added, and the mixture was allowed to stand in a wet box at room temperature under light-shielded conditions for 1 hour.
After standing, the stratum corneum was washed with PBS and distilled water.
洗浄後、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｔ−Ｇ（水溶性封入剤）を用い、角層をスライドガラスとカバーガラスとの間に封入した。封入後、マニキュア（有機接着剤）を用い、角層をスライドガラスとカバーガラスとを固定した。
固定後、乾燥させ、デスモグレイン１の蛍光を観察した。
ここで、観察終了まで、作業時以外は、遮光条件を維持していた。
観察後、キシレンに３分間浸漬させることにより、マニキュア（有機接着剤）を除去した。
After washing, the stratum corneum was sealed between the slide glass and the cover glass using Fluoromout-G (water-soluble mounting medium). After encapsulation, nail polish (organic adhesive) was used to fix the slide glass and cover glass to the stratum corneum.
After fixing, it was dried and the fluorescence of desmoglein 1 was observed.
Here, until the end of the observation, the shading condition was maintained except during the work.
After the observation, the nail polish (organic adhesive) was removed by immersing it in xylene for 3 minutes.
（３）中間処理工程（第一測定工程後、第二測定工程前の処理）
角層を、３７℃蒸留水に一晩浸漬させることにより、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｔ−Ｇ（水溶性封入剤）を除去し、カバーガラスを外した。
ここで、上記中間処理を経ずにカバーガラスを外した角層は、後の第二測定工程において、角層細胞の形状が崩れてしまうものが散見された。
(3) Intermediate processing process (processing after the first measurement process and before the second measurement process)
By immersing the stratum corneum in distilled water at 37 ° C. overnight, Fluoromout-G (water-soluble mounting medium) was removed, and the cover glass was removed.
Here, in the stratum corneum from which the cover glass was removed without undergoing the above intermediate treatment, the shape of the stratum corneum cells was sometimes deformed in the subsequent second measurement step.
（４）第二測定工程：細胞形態染色（角層染色） (4) Second measurement step: Cell morphology staining (horny layer staining)
中間処理工程後の角層を、細胞形態染色液（角層染色液 下記表１）に、室温条件下、１０分間浸漬させた。浸漬後、角層を水洗、風乾した。
風乾後の角層をＮｅｗ Ｍ・Ｘ（ポリスチレン樹脂封入剤）でスライドガラスとカバーガラスとの間に封入し、角層の観察を行った。
The stratum corneum after the intermediate treatment step was immersed in a cell morphological staining solution (corne layer staining solution, Table 1 below) under room temperature conditions for 10 minutes. After soaking, the stratum corneum was washed with water and air-dried.
The stratum corneum after air drying was sealed between the slide glass and the cover glass with New MX (polystyrene resin encapsulant), and the stratum corneum was observed.
（５）結果、考察
測定結果を図１に示す。
ここで、第一測定工程の測定結果の画像と、第二測定工程の測定結果の画像とを並列に配置し、本分野を専門とする評価者により、デスモグレイン１の存在位置と、角層の重なりの多い位置とを対比観察した。
(5) Results and discussion The measurement results are shown in Fig. 1.
Here, the image of the measurement result of the first measurement step and the image of the measurement result of the second measurement step are arranged in parallel, and an evaluator specializing in this field determines the existence position of desmoglein 1 and the stratum corneum. The position where there is a lot of overlap was observed in comparison.
図１に示す通り、蛍光免疫染色によりデスモグレイン１の存在位置を測定する第一測定工程を行った後、角層の重なりの多い位置を細胞形態染色液（角層染色液）を用い測定する第二測定工程を行うことで、同一の角層におけるデスモグレイン１の存在位置と角層における角層の重なりの多い位置を、効率よく対比観察できることがわかった。 As shown in FIG. 1, after performing the first measurement step of measuring the presence position of desmoglein 1 by fluorescent immunostaining, the position where the stratum corneum overlaps is measured using a cell morphology staining solution (corne layer staining solution). By performing the second measurement step, it was found that the existence position of desmoglein 1 in the same stratum corneum and the position where the stratum corneum overlaps a lot in the stratum corneum can be efficiently compared and observed.
ここで、デスモグレイン１は、染色により、細胞膜の輪郭を示すことのできるタンパク質である。すなわち、デスモグレイン１は、第一測定工程によりそのタンパク質の存在位置が把握できるものである。 Here, desmoglein 1 is a protein capable of showing the outline of a cell membrane by staining. That is, the existence position of the protein of desmoglein 1 can be grasped by the first measurement step.
以上の通り、免疫染色（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）により特定のタンパク質の存在位置を測定する第一測定工程を行った後、角層自体の形状的特徴を染色処理により測定する第二測定工程を行うことで、同一の角層における特定のタンパク質の存在位置と角層自体の形状的特徴を測定することができることがわかった。 As described above, after performing the first measurement step of measuring the presence position of a specific protein by immunostaining, the second measurement step of measuring the shape characteristics of the stratum corneum itself by the staining process is performed. It was found that the location of a specific protein in the same stratum corneum and the shape characteristics of the stratum corneum itself can be measured.
＜試験２＞ 角層の同一部位における、デスモグレイン１の免疫染色と、フォンタナマッソン染色の二重染色を試みた。 <Test 2> We attempted double staining of desmoglein 1 immunostaining and Fontana Masson staining at the same site in the stratum corneum.
（１）被検試料の採取
テープストリッピング法により、角層を５１歳男性の両頬から採取した。
採取した角層をスライドガラスに貼付した（図２ 参照）。
(1) Collection of test samples The stratum corneum was collected from both cheeks of a 51-year-old man by the tape stripping method.
The collected stratum corneum was attached to a slide glass (see FIG. 2).
（２）第一測定工程：デスモグレイン１の免疫染色
試験１と同様の方法により、第一測定工程を行った。
(2) First measurement step: The first measurement step was carried out by the same method as in immunostaining test 1 of desmoglein 1.
（３）中間処理工程（第一測定工程後、第二測定工程前の処理）
試験１と同様の方法により、中間処理工程を行った。
(3) Intermediate processing process (processing after the first measurement process and before the second measurement process)
The intermediate treatment step was carried out by the same method as in Test 1.
（４）第二測定工程：フォンタナマッソン染色法による組織染色
中間処理工程後の角層を、フォンタナ・アンモニア銀溶液（武藤化学株式会社 製）に、３７℃、２４時間浸漬させた。浸漬後、角層を水洗、風乾した。
風乾後の角層をＮｅｗ Ｍ・Ｘ（ポリスチレン樹脂封入剤）でスライドガラスとカバーガラスとの間に封入し、角層の観察を行った。
(4) Second measurement step: Tissue staining by Fontana Masson staining method The stratum corneum after the intermediate treatment step was immersed in a Fontana-ammonia silver solution (manufactured by Muto Chemical Co., Ltd.) at 37 ° C. for 24 hours. After soaking, the stratum corneum was washed with water and air-dried.
The stratum corneum after air drying was sealed between the slide glass and the cover glass with New MX (polystyrene resin encapsulant), and the stratum corneum was observed.
（５）結果、考察
染色結果を図３、図４に示す。
なお、第一測定工程の測定結果の画像と、第二測定工程の測定結果の画像とを並列に配置し、本分野を専門とする評価者により、デスモグレイン１の存在位置と、角層におけるメラニン組織の存在位置とを対比観察した。
(5) Results and discussion The staining results are shown in FIGS. 3 and 4.
An image of the measurement result of the first measurement step and an image of the measurement result of the second measurement step are arranged in parallel, and an evaluator specializing in this field determines the existence position of desmoglein 1 and the stratum corneum. The location of the melanin tissue was compared and observed.
図３、図４に示す通り、蛍光免疫染色によりデスモグレイン１の存在位置を測定する第一測定工程を行った後、角層におけるメラニン組織をフォンタナマッソン染色処理により測定する第二測定工程を行うことで、同一の角層におけるデスモグレイン１の存在位置と角層におけるメラニン組織の存在位置を、効率よく測定することができることがわかった。 As shown in FIGS. 3 and 4, after performing the first measurement step of measuring the presence position of desmoglein 1 by fluorescent immunostaining, the second measurement step of measuring the melanin tissue in the stratum corneum by Fontana Masson staining treatment is performed. Therefore, it was found that the presence position of desmoglein 1 in the same stratum corneum and the presence position of melanin tissue in the stratum corneum can be efficiently measured.
すなわち、免疫染色（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）により特定のタンパク質の存在位置を測定する第一測定工程を行った後、角層における特定の形状的特徴の存在位置を染色処理により測定する第二測定工程を行うことで、同一の角層における特定のタンパク質の存在位置と角層内における特定組織の存在位置を対比観察することができることがわかった。 That is, after performing the first measurement step of measuring the presence position of a specific protein by immunostaining, the second measurement step of measuring the presence position of a specific morphological feature in the stratum corneum is performed. Therefore, it was found that the position of a specific protein in the same stratum corneum and the position of a specific tissue in the stratum corneum can be observed in comparison.
本発明は、特定のタンパク質の存在位置と角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置とを対比観察する技術に応用することができる。 The present invention can be applied to a technique for observing the presence position of a specific protein in contrast with the shape characteristics of the stratum corneum itself and / or the presence position of a specific tissue in the stratum corneum.
Claims (7)
前記第一測定工程後に、前記第一測定工程で用いた角層と同一の角層に対し、組織染色処理により、角層における特定の形状的特徴の存在位置を測定する第二測定工程と、
前記第一測定工程及び前記第二測定工程の測定結果に基づき、同一の角層における、特定のタンパク質の存在位置と角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置と、を対比観察する対比観察工程と、
を有する、方法。 The first measurement step of measuring the position of a specific protein in the stratum corneum by immunostaining, and
After the first measurement step, a second measurement step of measuring the presence position of a specific morphological feature in the stratum corneum by a tissue staining treatment on the same stratum corneum as the stratum corneum used in the first measurement step.
Based on the measurement results of the first measurement step and the second measurement step, the location of a specific protein in the same stratum corneum, the shape characteristics of the stratum corneum itself, and / or the location of a specific tissue in the stratum corneum. , And the contrast observation process
The method.
前記第一測定工程と前記第二測定工程との間に、中間処理工程を有し、
前記中間処理工程は、前記第一測定工程後に２５℃以上の温水に前記角層の配置されたスライドガラスを浸し、前記角層を崩さずに前記水溶性封入剤を除くことを含む、請求項１に記載の方法。 The first measurement step includes a process of encapsulating the stratum corneum arranged between the cover glass and the slide glass using a water-soluble encapsulant.
An intermediate treatment step is provided between the first measurement step and the second measurement step.
The intermediate treatment step comprises immersing the slide glass on which the stratum corneum is arranged in warm water of 25 ° C. or higher after the first measurement step, and removing the water-soluble mounting medium without breaking the stratum corneum. The method according to 1.
前記第一測定工程が、スライドガラスとカバーガラスとを有機溶剤に浸漬させ、前記角層を崩さずに前記油溶性接着剤を除くことを含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。 The first measurement step includes a process of fixing the slide glass and the cover glass using an oil-soluble adhesive when encapsulating the stratum corneum.
The first measurement step according to any one of claims 1 to 3, wherein the first measurement step includes immersing the slide glass and the cover glass in an organic solvent and removing the oil-soluble adhesive without breaking the stratum corneum. the method of.
前記対比観察工程が、
特定のタンパク質の蛍光強度と、
特定のタンパク質の存在位置と角層自体の形状的特徴及び／又は角層内における特定組織の存在位置と、
を対比観察することを含む、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。 The immunostaining is fluorescent staining,
The contrast observation step
With the fluorescence intensity of a particular protein,
The location of specific proteins and the morphological characteristics of the stratum corneum itself and / or the location of specific tissues within the stratum corneum,
The method according to any one of claims 1 to 5, which comprises observing in comparison with each other.
The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the first measuring step is a step of measuring the presence position of desmoglein in the stratum corneum.
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