JP2021032708A - 生体組織の識別方法、生体組織識別装置、生体組織識別プログラムおよび記憶媒体 - Google Patents

Abstract

【課題】短時間で生体組織の識別が可能な生体イメージング手法を提供する。【解決手段】生体装置識別装置（１）は、生体組織の所定領域に、中赤外光を含む測定光を照射可能な光源（１０）と、生体組織を透過した測定光または生体組織で反射した測定光のうち波長２μｍ〜２０μｍの範囲の特定の波長λ１を有する光を撮像して、測定画像を取得する撮像素子（１２）とを備える。測定画像のエッジ解析により、測定画像の複数の領域における合焦測度を算出し、合焦測度に基づいて、生体組織の識別を行う。【選択図】図１

Description

本発明は、中赤外光を用いた生体組織の識別方法、および生体組織識別装置に関する。さらに本発明は生体組織識別装置に処理を実行させるためのプログラムに関する。

生体組織の種類または状態の識別、例えば、がん等の有無の識別には、生体（被験者）から採取した組織を色素で染色し、病理医が光学顕微鏡観察により診断を行う組織病理学的手法が用いられている。この方法は、診断のために時間および労力を要することや、診断結果が、病理医の判断力に大きく依存するとの点において課題がある。

組織病理学的手法よりも短時間で生体組織を識別可能な方法として、中赤外光を用いたイメージング技術が注目されている。中赤外光の振動周波数は物質の固有振動周波数と一致し、中赤外光は物質の分子振動との共鳴により吸収される特徴があるため、中赤外領域の吸収スペクトルに基づいて、検査対象が正常組織であるか、がん等を含むものであるかを識別可能である。中赤外光を用いたイメージングでは、撮影領域内の複数の微小領域で吸収スペクトルを測定し、各微小領域（ピクセル）におけるスペクトルのセット（ハイパースペクトル）を所定のアルゴリズムで解析することにより、検査者の主観に依存しない客観的な識別結果が得られる。

特許文献１には、中赤外域に感度を有する２次元アレイ型のセンサーカメラを使用して、生体組織の広い範囲を一度に撮像できる技術を開示している。非特許文献１では、中赤外光の照射光源に光強度の高い量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）を用いることにより、短時間での測定を実現している。

国際公開第２０１３／０６３３１６号

Kroger et al., Journal of Biomedical Optics. 2014, 19(11), 111607.

中赤外光を利用した従来のイメージング手法では、生体組織のハイパースペクトル画像に対して、クラスター分析等の多変量解析を行い、カラーマップとして表示される組織イメージから、生体組織の識別を行っている。この手法は、組織病理学的な診断に比べると、短時間での識別が可能であるものの、データの処理量が多く、解析に時間を要するため、リアルタイムでの生体組織の識別への適用は困難である。

かかる現状に鑑み、本発明の一態様は、より短時間で生体組織の識別が可能な生体イメージング手法の提供を目的とする。

本発明の一形態は、生体組織の所定領域に測定光を照射し、生体組織を透過した測定光または生体組織で反射した測定光を撮像して、測定画像を取得し、測定画像の解析結果に基づいて生体組織を識別する方法に関する。測定光は中赤外光を含む光であり、コヒーレント光でもよく、インコヒーレント光でもよい。

生体組織を透過した測定光または生体組織で反射した測定光のうち、波長２μｍ〜２０μｍの範囲の特定の波長λ_１を有する光を撮像して、測定画像を取得する。測定光がコヒーレント光である場合は、波長λ_１を有する光を測定光として生体組織に照射すればよい。測定光がインコヒーレント光である場合は、適宜の分光手段を用いて、測定光のうち波長λ_１を有する光を撮像すればよい。

測定画像の解析により、合焦測度を算出し、合焦測度に基づいて生体組織の識別を行う。合焦測度は、例えば、測定画像のエッジ解析により算出する。例えば、測定画像の微分フィルタ処理によりエッジ解析が行われる。

生体組織の識別は、例えば、生体組織にがん等が含まれているか否かの識別である。例えば、合焦測度と所定の閾値との大小関係に基づいて、生体組織が正常組織であるか否か（腫瘍が含まれているか否か）の識別が行われる。

本発明の一態様は、上記の生体組織識別方法を実施するための生体組織識別装置である。生体組織識別装置は、生体組織の所定領域に、測定光を照射可能な光源と、生体組織を透過した測定光または生体組織で反射した測定光を撮像して、測定画像を取得する撮像素子とを備える。

生体組織識別装置は、さらに、測定画像を解析して合焦測度を算出する演算解析部を備えるコンピュータを備えていてもよい。コンピュータの記憶部には、前記撮像素子で取得した測定画像をエッジ解析して、測定画像の複数の領域における合焦測度を算出する処理を、演算解析部に実行させるためのプログラムが格納されていてもよい。コンピュータは、前記合焦測度をマッピングして解析画像を形成するイメージ形成部を備えていてもよい。

光源から生体組織に照射する光（測定光）は、好ましくはコヒーレント光である。生体組織に測定光としてのコヒーレント光を照射する光源は、例えば、波長を掃引可能なレーザ光源であり、量子カスケードレーザや、光パラメトリック発振器を備えるレーザが好適である。

本発明の一態様では、測定画像を取得する前に、合焦調整が行われる。各光学要素の位置関係を変更しながら、波長λ_１とは異なる波長λ_０を有する光について合焦度合いの指標である合焦関数を算出し、合焦関数が最大または最小となる（合焦度合いが最も高くなる）ように、光学要素の位置関係を調整すればよい。一実施形態では、試料を固定した試料台の位置を変更し、それぞれの試料台の位置において、測定および合焦関数の算出を行う。

本発明の一態様は、生体組織識別プログラムである。生体組織識別プログラムには、上記の各処理をコンピュータに実行させるための処理手順が記述されている。生体組織識別プログラムは、コンピュータが読み取り可能な可読記憶媒体として提供されてもよい。

本発明の方法では、生体組織に中赤外測定光を照射して、特定波長の光を撮像した測定画像をエッジ解析し、得られた合焦測度に基づいて、がんの有無等の生体組織の識別が可能である。この方法は、データ処理を短時間で実施できるため、リアルタイム分析への適用も期待できる。

一実施形態の生体組織識別装置の構成図である。 生体組織識別装置における処理の流れの一例を示すフローチャートである。 正常組織とがん組織を含む肺由来のサンプルを染色し、光学顕微鏡で撮像した病理画像である。 正常組織とがん組織を含む肺由来のサンプル（未染色）の中赤外イメージングによる解析画像である。 正常組織と骨肉腫を含むサンプルを染色し、光学顕微鏡で撮像した病理画像である。 正常組織と骨肉腫を含むサンプル（未染色）の中赤外イメージングによる解析画像である。 正常組織とがん組織を含む肝臓由来のサンプルを染色し、光学顕微鏡で撮像した病理画像である。 正常組織とがん組織を含む肝臓由来のサンプル（未染色）の中赤外イメージングによる解析画像である。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、本発明は、以下の具体的形態に限定されるものではない。

［生体組織識別装置の構成］
図１は、一実施形態の生体組織識識別装置の構成図である。生体組織識別装置１は、光源１１からの測定光（中赤外光）Ｌ_０を、試料台１３に固定した試料Ｓに照射し、試料Ｓを透過した測定光Ｌ_１を撮像素子１２により撮像する。

光源１１、試料台１３および撮像素子１２は、コンピュータ３０に接続されている。コンピュータ３０は、光源１１の出力調整、試料台１３の位置調整、撮像素子１２からの情報の取得および解析等を司る制御部３１を備えている。撮像素子１２により得られた測定画像をコンピュータ３０により解析して、試料Ｓに含まれる生体組織の識別を行う。

コンピュータ３０は、制御部３１に加えて、表示部３３、記憶部３５および入力部３７を備えている。表示部３３は、各種の情報および測定結果を表示するディスプレイである。記憶部３５は、各種のデータを記憶するハードディスクまたは半導体メモリで構成されている。入力部３７は、ユーザの操作を受け付けるためのタッチパネル、キーボード、マウス等である。

図１に示す装置１では、試料Ｓを透過した測定光Ｌ_１を撮像素子１２により撮像するために、光源１１と撮像素子１２の間に試料台１３が配置されている。試料を反射した測定光を撮像する場合は、試料台の光源側に撮像素子を配置すればよい。

光源１１から試料Ｓに照射される測定光Ｌ_０は、中赤外光（波長２μｍ〜２０μｍ）を含む光である。測定光Ｌ_０は、コヒーレント光でもよくインコヒーレント光でもよい。測定光がコヒーレント光である場合、測定光Ｌ_０は中赤外領域の特定の波長を有する光である。測定光がインコヒーレント光である場合、測定光Ｌ_０は中赤外領域以外の波長の光を含んでいてもよい。

特定波長の光強度が高く、測定時間を短縮できることから、測定光Ｌ_０はコヒーレント光であることが好ましい。測定光としてのコヒーレント光を試料に照射する光源１１は、例えば、中赤外光を発振するレーザ光源であり、中赤外領域で波長を掃引可能なレーザ光源が好ましい。測定精度向上および測定時間短縮等の観点から、高輝度の中赤外レーザ光を発振する量子カスケードレーザ（ＱＣＬ）、または光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）を備える光源を用いることが好ましい。ＯＰＯの詳細は、例えば特開２０１０−２８１８９１号公報に記載されている。

ＯＰＯの励起光源としては、パルス状、かつ中赤外光よりも短波長の励起光を発振可能なレーザが用いられ、ＱスイッチＮｄ：ＹＡＧレーザ（発振波長１．０６４μｍ）や、ＱスイッチＹｂ：ＹＡＧレーザ（発振波長１．０３０μｍ）が特に好ましく用いられる。これらの励起光源は、過飽和吸収体を用いてスイッチング動作を自動的に行わせることができる。そのため、ＱスイッチＮｄ：ＹＡＧレーザまたはＱスイッチＹｂ：ＹＡＧレーザを励起光源として用いることにより、励起光源及びこれを制御するための構成を単純化、および小型化することができる。Ｑスイッチ発振においては、例えばパルス幅約８ｎｓで１０Ｈｚ以上の繰り返しで励起光を発振することができる。

ＯＰＯにおいては、入射側および反射側の半透鏡の間に、非線形光学結晶が設置される。非線形光学結晶としては、例えば、ＡｇＧａＳ_２が用いられる。その他の非線形光学結晶としては、ＧａＳｅ、ＺｎＧｅＰ_２、ＣｄＳｉＰ_２、ＬｉＩｎＳ_２、ＬｉＧａＳｅ_２、ＬｉＩｎＳｅ_２、ＬｉＧａＴｅ_２等が挙げられる。ＯＰＯ１２から発せられるレーザ光は、励起光に対応した繰り返し周波数、パルス幅（例えば約８ｎｓ）となり、この短いパルス幅により尖頭出力が１０Ｗ〜１ｋＷの高強度となる。

光源１１は、制御部３１の光調整部３１１からの信号に基づいて光量および発振波長が調整可能に構成されていてもよい。例えば、レーザの出力を調整することにより、試料Ｓに照射される光量を調整できる。光量調整は、レーザのパルス幅やビームサイズの調整、光学フィルタの使用、シャッター速度の調整、撮像素子の積算時間およびゲイン調整等により実施してもよい。

光源１１と試料台１３の間には、照射光のサイズ（光径）を調整するために、レンズ等の光学要素２１が配置されていてもよい。光学要素２１は、試料Ｓへの照射光の光径を大きくするものでもよく、小さくするものでもよい。光学要素２１は、制御部３１の位置調整部３１３からの信号に基づいて移動可能に構成されていてもよい。光学要素２１をレーザ光の進行方向（ｚ方向）と平行に移動させることにより、試料Ｓへの照射光の光径の調整や、焦点の調整（合焦調整）を行うことができる。

試料台１３は、試料Ｓを固定可能である。例えば、試料台１３上に試料Ｓを載置することにより試料Ｓが固定される。クリップ等を用いて試料台１３に試料Ｓを固定してもよい。試料Ｓに含まれる生体組織は、ヒトから採取した組織でもよく、マウス、ラット等の非ヒト動物から採取した組織でもよい。

試料台１３は、試料Ｓを透過した測定光Ｌ_１を透過可能である。例えば、試料台１３は、試料Ｓを載置する部分が中赤外光に対して透明な材料で構成されていてもよい。図１に示すように、試料台１３には、測定光Ｌ_１を透過するための開口１３ｘが設けられていてもよい。

試料台１３は、測定光（中赤外レーザ光）Ｌ_０，Ｌ_１の進行方向（図１のｚ方向）と平行に移動可能に構成されていてもよい。試料台１３を測定光の進行方向に沿って移動させることにより、光源１１と試料Ｓとの距離（および光学要素２１と試料Ｓとの距離）、ならびに試料Ｓと撮像素子１２との距離（および試料Ｓと光学要素２３との距離）を変化させ、合焦調整を実施できる。試料台の移動（位置調整）は、手動で行ってもよく、制御部３１の位置調整部３１３からの信号に基づいて実施してもよい。

試料台１３は、測定光の進行方向と直交する方向（ｘ方向およびｙ方向）に二次元的に移動可能に構成されていてもよい。試料台がｘｙ方向に移動可能に構成されていれば、試料Ｓにおける測定光Ｌ_０の照射位置を調整できる。

試料Ｓを透過した測定光Ｌ_１は、撮像素子１２により検出される。撮像素子１２は、複数のピクセルが２次元（ｘ方向およびｙ方向）に配置されており、それぞれのピクセルに入射する測定光Ｌ_１の強度を検出する。各ピクセルに入射した光強度のデータが、コンピュータ３０に送信され、制御部３１のイメージ形成部３１７で測定画像が作成される。測定画像は、撮像素子１２の各ピクセルに入射した測定光Ｌ_１の輝度（積算光量）に基づいて作成される。すなわち、測定画像は、各ピクセルに入射した透過光強度をマッピングしたものである。

制御部３１の演算解析部３１５が、測定画像を解析する。解析結果に基づいて、イメージ形成部３１７が解析画像を作成する。作成された解析画像は、表示部３３に表示される。

試料台１３と撮像素子１２との間には、撮像素子１２に達する測定光Ｌ_１の光径を調整するための撮像用光学要素２３が配置されていてもよい。一般には、撮像素子１２の受光面積は、試料Ｓへの測定光Ｌ_０の照射領域に比べて大きい。撮像用光学要素２３により測定光Ｌ_１の光径を拡大して撮像素子１２に入射させ、撮像素子のより広い領域を利用することにより、イメージの解像度を高めることができる。

生体組織識別装置１は、試料Ｓを透過した測定光Ｌ_１（または試料Ｓで反射した測定光）を検出するための撮像素子１２に加えて、試料Ｓを直接撮像するための第二撮像素子１９を備えていてもよい。第二撮像素子１９は、試料Ｓから見て光源１１側に配置されており、試料Ｓにおける測定光Ｌ_０の照射部位を含む領域を撮像可能である。試料Ｓと第二撮像素子１９との間には、適宜の光学要素（不図示）が配置されていてもよい。第二撮像素子１９により撮像された試料Ｓの画像を表示部３３に表示してもよい。ユーザは、表示部の画像を確認しながら、試料Ｓにおける測定光Ｌ_０の照射位置を調節してもよい。なお、中赤外領域の測定光は、可視光用の撮像素子１９では確認できないため、照射位置を調節する際には、不図示の光源から試料Ｓに可視光を照射してもよい。

［生体組織の測定およびイメージング］
図２は、生体組織識別装置１による処理の一例を示すフローチャートである。まず、光源１１から試料Ｓに照射するレーザ光の波長を、合焦調整用波長λ_０に設定し（Ｓ１）、波長λ_０の中赤外光で合焦調整を実施する（Ｓ２）。合焦調整後に、レーザ光の波長を、測定用波長λ_１に変更し（Ｓ３）、必要に応じて波長λ_１の中赤外光で光量調整を実施する（Ｓ４）。その後、波長λ_１の中赤外光を試料Ｓに照射し、撮像素子１２により測定画像を取得する（Ｓ５）。得られた測定画像を解析し（Ｓ６）、解析結果をマッピングしてイメージ（解析画像）を作成し（Ｓ７）、解析画像を表示部３３に表示する（Ｓ７）。得られた解析画像に基づいて、病変組織の有無や、その場所の特定を行う。

上記の各処理は、制御部３１の制御ブロック（光調整部３１１、位置調整部３１３、演算解析部３１５、およびイメージ形成部３１７）により制御される。コンピュータ３０の記憶部３５には、これらの処理を実行するためのソフトウェアである生体組織識別プログラムが格納されていてもよい。制御部３１は、１つ以上のプロセッサを備えており、プロセッサが記憶部３５から生体組織識別プログラムを読み取り、各制御ブロックが生体組織識別装置の各要素を動作させることにより、処理が実行される。

生体組織識別プログラムは、コンピュータ３０の記憶部３５に格納された状態で生体装置識別装置とともに提供されてもよい。また、生体組織識別プログラムは、コンピュータ読み取り可能な可読記憶媒体に格納して提供されてもよく、外部のサーバ等から優先または無線のネットワークを介して提供されてもよい。可読記憶媒体や外部のサーバ等に格納されたプログラムを、コンピュータ３０の記憶部３５に格納して使用してもよい。

＜実施例１：肺サンプルの測定＞
図３は、正常組織とがん組織を含む肺サンプルを染色し、光学顕微鏡で撮像した病理画像である。図中の破線Ｄで囲まれた領域Ｐが、がん組織を含む領域であり、その他の領域Ｑは正常組織である。図４は、正常組織とがん組織を含む肺サンプル（未染色）を試料として、波長９．６μｍのレーザ光を試料に照射し、得られた測定画像から、対象領域の解析を行い、各ピクセルの合焦測度を２０階調でマッピングした解析画像である。合焦測度は、微分フィルタの１種であるＳｏｂｅｌフィルタを用いたエッジ解析により算出した。

図４におおける破線Ｇの位置が、図３における破線Ｄの位置に対応しており、破線Ｇに囲まれた領域Ｓが、癌を含む領域Ｐに対応しており、外側の領域Ｔが正常組織の領域Ｑに対応している。図４において、領域Ｓは合焦測度が小さく、領域Ｔは合焦測度が大きいことから、合焦測度の大小が、がんの有無に対応していることが分かる。

以下では、正常組織とがん組織を含む肺サンプルを試料として、生体組織識別装置１により、図４のイメージを取得して生体組織を識別した実施例について、その処理の流れを、図２のフローチャートに沿って説明する。

本実施例では、ＱスイッチＮｄ：ＹＡＧレーザ（発振波長１．０６４μｍ）と、非線形光学結晶としてＡｇＧａＳ_２を用いた光パラメトリック発振器とを組み合わせた光源１１から、試料台１３に載置した試料Ｓに、パルス幅８ｎｓ、測定用波長λ_１＝９．６μｍの中赤外レーザを照射し、その透過光を、撮像素子１２により撮影した。撮像素子１２としては、４８０×６４０ピクセルの２次元型ボロメータアレイセンサ（１４ビット）を用いた。光源１１と試料台１３との間、および試料台１３と撮像素子１２との間には、それぞれ、光学要素２１，２３としてレンズを配置した。

（合焦調整用波長の選択）
まず、光源１１から試料Ｓに照射する中赤外光の波長を、合焦調整用の波長λ_０に設定する（Ｓ１）。光源１１が発振するレーザ光の波長は、光調整部３１１からの信号に基づいて変更可能である。本実施例では、合焦調整用の波長λ_０を１１μｍに設定したが、他の波長でもよく、正常組織と病変組織（例えばがん）の光吸収の差異が小さい波長を選択すればよい。

生体組織（器官）の種類または状態により、吸光度が変化し難い波長の範囲が存在する。例えば、吸収スペクトルのピークまたはその近傍には、組織の状態が変化しても吸光度が変化しない波長（等吸収点）が存在する。正常組織と病変組織が混在している場合でも、等吸収点またはその近傍の波長では、正常組織と病変組織の光吸収の差が小さいため、合焦調整用波長として好適である。合焦調整用波長は、吸収スペクトルの谷に対応する波長でもよいし、吸収スペクトルのフラットな部分に対応する波長でもよい。

（合焦調整）
合焦調整や測定画像の解析は、撮像画像（中赤外光を試料に照射した領域）から、診断対象の領域を選択し、選択した領域に対して実施すればよい。本実施例では、図４に示した円形の領域を対象領域とした。

まず、ｚ方向における試料台１３の位置を初期位置ｚ_１に調整し（Ｓ２１〜２３）、波長λ_０（本実施例では１１μｍ）の中赤外レーザ光を試料Ｓに照射し、その透過光像を撮像素子１２で撮像し、合焦調整用画像Ａ_１を取得する（Ｓ２４）。前述のように、測定画像は、撮像素子１２の各ピクセルに入射した積算光量に基づいて作成される。合焦調整用画像Ａ_１を解析して、合焦の指標となる合焦関数ｆ_１を算出する（Ｓ２５）。

その後、試料台１３をｚ方向に移動して位置ｚ_２に調整し（Ｓ２６，Ｓ２２，Ｓ２３）、合焦調整用画像Ａ_２を取得し（Ｓ２４）、合焦関数ｆ_２を算出する（Ｓ２５）。試料台の位置を変化させることにより、レンズ２３と試料Ｓとの距離を変えながら、それぞれの試料台の位置ｚ_ｋ（ｋは１〜Ｋの整数）で、合焦調整用画像Ａ_ｋを取得し、合焦の程度を表す評価値である合焦関数ｆ_ｋを算出する。合焦関数ｆ_ｋが最も小さくなる（または大きくなる）位置ｚ_ｋを合焦位置ｚ_ｎと決定し（Ｓ２７）、ステージを合焦位置ｚ_ｎに移動させる（Ｓ２８）。

本実施例では、試料台１３を移動させながら合焦調整を実施したが、試料台を移動させる代わりに、レンズ２３をｚ方向に移動させてもよい。また、レンズ２３と試料台１３の両方をｚ方向に移動させてもよく、光源１１、レンズ２３、撮像素子１２をｚ方向に移動させてもよい。

本実施例では、合焦調整用画像Ａ_ｋに、微分フィルタの１種であるＳｏｂｅｌフィルタを適用してエッジ解析を行い、対象領域の各ピクセルの微分値を合焦測度とし、対象領域内の合焦測度の最小値と最大値の差を合焦関数ｆ_ｋとした。

Ｓｏｂｅｌ法では、１つの中心ピクセルの光強度（輝度）と、中心ピクセルに隣接する８つのピクセルの光強度との微分値を算出し、８つのピクセルとの微分値を平均化することにより、中心ピクセルの微分値とする。平均化に際しては、中心ピクセルの上下と左右に位置する４つのピクセルとの微分値を加重する。上下と左右のピクセルの微分値を加重して平均化することにより、エッジ検出の精度が高められる。対象領域のすべてのピクセルに対して微分値を算出し、対象領域における微分値の最大値と最小値の差を合焦関数ｆ_ｋとする。合焦関数ｆ_ｋが最小となる位置ｚ_ｋで、合焦が最適化されたと判断できる。

エッジ検出に用いる微分フィルタは、Ｓｏｂｅｌフィルタに限定されず、Ｐｒｅｗｉｔｔフィルタ、Ｒｏｂｅｒｔｓフィルタ等の各種の一次微分フィルタを用いてもよく、二次微分フィルタを用いてもよい。また、微分フィルタと他の処理（例えば、平滑化によるノイズ低減処理）を組み合わせてエッジ検出を実施してもよい。

エッジ検出では、微分法に代えて、フーリエ変換やウェーブレット変換等の周波数フィルタを用いた画像解析により合焦関数を算出してもよい。また、輝度の分散に基づいて合焦測度を算出することも可能であり、一例として、測定画像を複数の領域に分割し、各領域での輝度の分散を合焦測度として使用してもよい。合焦画像では輝度の分散が大きく、非合焦画像では輝度の分散が小さくなるため、分散が大きい領域ほど合焦されていると判断できる。合焦調整には、中赤外以外の波長（例えば可視光）用の撮像装置で利用されている各種の合焦調整法を転用することもできる。

（測定用波長の選択）
合焦調整後に、光源１１から試料Ｓに照射する中赤外光の波長を、測定用波長λ_１に変更する（Ｓ３）。本実施例では、測定用波長λ_１を９．６μｍに設定したが、他の波長でもよい。前述のように、中赤外領域には、正常組織と病変組織の光吸収（吸光度）の差が大きい波長が存在する。組織の種類に応じて、このような吸光度の差が大きい波長を、測定用波長λ_１として選択すればよい。

合焦調整に用いる波長λ_０および測定に用いる波長λ_１には、識別対象の組織（器官）の種類に応じた最適値が存在する。これらの波長λ_０，λ_１は、ユーザが入力部３７から数値を入力してもよく、表示部に表示された候補の中から選択してもよい。種々の器官について、適切な合焦波長λ_０および測定用波長λ_１を、記憶部３５に記憶させておき、ユーザが入力または選択した識別対象の組織に応じた波長λ_０，λ_１を記憶部から読み出してもよい。記憶部に予め最適波長を格納しておく代わりに、外部に蓄積されたデータベースから、有線または無線のネットワークを介して波長λ_０，λ_１を受信してもよい。ネットワークを介して受信した波長λ_０，λ_１の情報を、一旦記憶部３５に格納し、合焦および測定の際に、器官の種類に応じて、記憶部に格納された波長を読み出してもよい。

（光量調整）
光源１１から発振する光の波長を測定用波長λ_１に切り替えた後、測定を実施する前に光量調整（Ｓ４）を行ってもよい。光量は、光調整部３１１からの信号に基づいて変更可能である。光量を最適化して、撮像素子のダイナミックレンジをできる限り広い範囲で使用すれば、試料Ｓの透過光画像のコントラストが強調されるため、解析の精度が向上し、これに伴って組織の識別精度を高めることが可能となる。

光量調整においては、まず、光量を初期光量Ｉ_０に設定する（Ｓ４１）。試料Ｓに波長λ_１の測定光Ｌ_０を照射し、試料Ｓを透過した測定光Ｌ_１を撮像素子１２が受光し、光量調整用測定画像Ｂ_０を取得する（Ｓ４２）。

測定画像Ｂ_０の中で最大の輝度（カウント数）が、予め設定された範囲内であるか否かを判定する（Ｓ４３）。最大輝度は、撮像素子１２の検出器が飽和しない範囲で、できるだけ高い範囲に設定することが好ましく、例えば、撮像素子の最大カウント数の５５〜９５％程度の範囲に設定すればよい。

光量調整用測定画像の輝度の最大値が設定範囲外である場合は、光量を変更し（Ｓ４４）、変更後の光量で光量調整用画像を取得し（Ｓ４２）、輝度の最大値が設定範囲内となるまでこれを繰り返し、測定用光量を決定する（Ｓ４５）。本実施例では、１４ビット（最大１６３８３カウント）のダイナミックレンジに対して、測定画像の最大輝度が約１００００カウントとなるように、レーザのパルス数を調整した。

輝度の最大値が設定範囲内となった後に、輝度の最大値が設定範囲内の最適値に近づけるための光量を算出し、これを測定用光量としてもよい。光量変更と光量調整用測定画像の取得を繰り返す代わりに、初期光量Ｉ_０で測定した光量調整用測定画像Ｂ_０における輝度の最大値と、設定値との比に基づいて、最適な測定用光量を算出してもよい。

（撮像）
波長λ_０で合焦調整を行い（Ｓ１，Ｓ２）、波長をλ_１に変更し（Ｓ３）、必要に応じて光量調整（Ｓ４）を実施した後、本測定を行い、測定画像Ｃを取得する（Ｓ５）。本測定では、試料Ｓに測定光Ｌ_０を照射し、試料Ｓを透過した波長λ_１の測定光Ｌ_１を撮像素子１２で撮像する。

（解析）
本測定で取得した測定画像Ｃの解析を行い、対象領域の各ピクセルにおける合焦測度を算出する（Ｓ６）。本実施例では、合焦調整と同様、Ｓｏｂｅｌフィルタを適用して測定画像のエッジ解析を行い、各ピクセルの微分値を合焦測度とした。

本実施例では、Ｓｏｂｅｌ法により測定画像のエッジ解析を行った結果、対象領域における合焦測度（微分値）の最小値は１３０、最大値は１８７であった。微分値が小さいほど合焦の度合いが低く、微分値が大きいほど合焦の度合いが高いことを示す。

エッジ解析は、合焦の度合いの指標となる合焦測度をピクセルごとに算出できる手法を採用すればよく、Ｓｏｂｅｌ法に限定されるものではない。例えば、Ｐｒｅｗｉｔｔフィルタ、Ｒｏｂｅｒｔｓフィルタ等の各種の一次微分フィルタや、二次微分フィルタを用いてもよい。また、微分法に代えて、フーリエ変換やウェーブレット変換等の周波数フィルタを適用して、各ピクセルの合焦測度を算出してもよい。測定画像の解像度が十分大きい場合は、複数のピクセルを平均化して１つの領域とし、解像度を落としてエッジ解析を実施してもよい。

（マッピングおよび結果の出力）
イメージ形成部３１７は、エッジ解析により得られた各ピクセルの合焦測度を、マッピングして画像化する（Ｓ７）。本実施例では、合焦測度の最小値１３０から最大値１８７の範囲を２０階調に分けてイメージを作成した（図４参照）。イメージ形成部３１７により作成された画像は、表示部３３に表示される（Ｓ８）。

本実施例では、図４の解析画像において、合焦測度の最小値（第１階調）から最大値（第２０階調）までの中央の階調（第１０階調：４７〜５２％）の位置が、図３の病理画像における正常組織とがん組織との境界と概ね一致していることが確認された。図４では、図３の病理画像との対応関係に基づいて、正常組織とがん組織との境界に破線を付している。破線が付された箇所の合焦測度は１５７〜１６６であり、いずれも２０階調の解析画像における第１０階調の範囲内であった。

図４において破線Ｇで囲まれた領域Ｓは、第９階調以下（合焦測度１５６以下）であり、合焦測度が閾値よりも小さく、がんを含む領域である。破線の外側の領域Ｔは第１１階調以上（合焦測度１６７以上）であり、合焦測度が閾値よりも大きい正常組織領域である。すなわち、この境界線よりも高階調（第１１〜２０階調）の領域が正常組織、低階調（第１〜９階調）の領域ががんと判定される。本実施例では、合焦測度の小さい低階調領域が、がんを含む領域であり、合焦測度が大きい高階調領域は正常組織である。

本実施例では、病理画像（図３）と合焦測度のマップ（図４）との対応関係を示すために、病理画像に基づいてがん組織と正常組織が既知となっている試料を用い、図３の病理画像における境界線Ｄに対応する位置に破線Ｇを付している。病変領域が未知の試料の測定においては、イメージ出力の際に、閾値となる階調の境界に境界線を付してもよい。階調分けした画像に、境界線を付加することにより、検査者の主観に依らない組織の識別を、より簡便かつ容易に実現できる。

本実施例では、合焦測度の最小値から最大値の範囲を２０階調に分けてイメージを作成したが、解析画像の階調数は２０以上でもよく、２以上１９以下でもよい。例えば、合焦測度が閾値以上（または閾値より大きい）領域と、合焦測度が閾値未満（または閾値以下）の２階調でイメージを表示してもよい。本実施例では、解析画像を２０階調のモノクロ表示としたが、イメージをカラー化してもよい。

解析画像とともに、第二撮像素子１９により撮像された試料Ｓの画像を表示部３３に表示してもよい。試料Ｓの画像と解析画像を対比することにより、試料Ｓにおける測定箇所（診断対象部位）を視覚的に把握することが可能となる。第二撮像素子１９により撮像された試料Ｓの画像に、解析画像を重ね合わせてもよい。

＜組織の識別原理および利点＞
上記のように、本実施例では、測定光を試料Ｓに照射し、特定の波長λ_１の透過光イメージを撮像し、得られた測定画像のエッジ解析により求めた合焦測度（微分値）の大小に基づいて、正常組織とがん組織の識別を行った。肺サンプルでは、微分値が大きい（合焦度合いが高い）場合は正常組織、微分値が小さい（合焦度合いが低い）場合はがん組織であると判定できる。これは、生体組織に所定波長の中赤外光を照射した際に、正常組織とがん等の病変組織で画像のコントラストが異なり、合焦度合いに差異が生じるとの知見を利用したものである。

すなわち、肺サンプルに所定波長（本実施例では９.６μｍ）の中赤外光を照射して透過光イメージを取得すると、がん組織は透過光輝度の変化（バラツキ）が小さく「ぼやけた」領域として認識され、正常組織は透過光輝度の変化が大きく「ピントが合った」領域として認識される。これを、微分フィルタ等を用いた解析により、領域（ピクセル）ごとに合焦測度として数値化し、階調分けを行って解析画像として出力することにより、検査者の主観に依らない組織の識別が可能となる。

単一波長で撮像および解析を実施するため、多波長でハイパースペクトルを取得する場合に比べて、測定時間を大幅に短縮できる。本実施例における測定時間は、１秒未満である。また、合焦測度の算出は、アルゴリズムが単純であり、クラスター解析のような大量のデータ処理を必要としないため、データ処理時間を大幅に短縮できる。本実施例におけるデータ処理時間（測定画像を取得後、表示部に解析画像を表示するまでに要する時間）は１秒未満である。このように、本発明の方法によれば、測定およびデータ処理の時間を大幅に短縮可能であり、リアルタイム診断への適用も可能である。

＜実施例２：筋肉組織と骨肉腫の識別＞
実施例１では、被検試料（識別対象）として正常組織とがん組織を含む肺サンプルを使用したが、中赤外光イメージのエッジ解析による組織の識別は、肺以外の器官にも適用可能である。また、がん以外の組織の病変等の診断にも適用可能である。実施例２では、骨肉腫と正常組織である筋肉組織を含む試料を用いて、実施例１と同様に中赤外光の透過光イメージの取得、およびエッジ解析を行った。

図５は、筋肉組織（正常組織）と骨肉腫を含むサンプルを染色し、光学顕微鏡で撮像した病理画像である。骨肉腫を含む領域Ｐと正常組織領域Ｑとの境界では、両組織が混ざりあっているため、図５では、これらの大まかな境界を破線Ｄで示している。図６は、正常組織と骨肉腫を含むサンプル（未染色）を試料として、波長９．８６μｍの赤外線レーザを試料に照射し、得られた測定画像から、対象領域の解析を行い、各ピクセルの合焦測度を２０階調でマッピングした解析画像である。図５において破線Ｃで囲まれた円形の領域が、図６の解析対象領域に対応している。

本実施例では、測定画像の解析領域における合焦測度の最小値が１３７、最大値が１９９であり、この範囲を２０階調に分けてイメージを作成した。図６では、図５の境界線Ｄに対応する位置を破線Ｇで示している。破線Ｇが付された箇所の合焦測度は１６３〜１６９であり、合焦測度の最小値と最大値の４２〜５２％の領域内であった。図６において破線Ｇよりも下側の領域Ｓ（図５の領域Ｐに対応）は、境界線Ｇよりも合焦測度が小さい領域であり、破線Ｇよりも上側の領域Ｔ（図５の領域Ｑに対応）は、境界線Ｇよりも合焦測度が大きい領域である。この結果から、骨肉腫サンプルにおいても、中赤外光の透過光イメージのエッジ解析を行い、微分フィルタ処理により算出した合焦測度と所定の閾値との大小関係に基づいて、正常組織と骨肉腫の識別が可能であることが分かる。

＜実施例３：肝臓細胞とがんの識別＞
上記の実施例１（肺サンプル）および実施例２（骨肉腫サンプル）では、合焦測度が大きい（高階調の）領域が正常組織であり、合焦測度が小さい（低階調の）領域が病変組織を含む領域であった。一方、生体組織（器官）の種類や、測定用波長λ_１の選択によっては、合焦測度が大きい領域に病変組織が含まれ、合焦測度の小さい領域が正常組織となる場合がある。実施例３では、がんと正常組織、およびリンパ球（正常組織）を含む肝臓サンプルを用いて、実施例１および実施例２と同様に中赤外光の透過光イメージの取得、および解析を行った。

図７は、がんと正常組織、およびリンパ球を含む肝臓サンプルを染色し光学顕微鏡で撮像した病理画像である。図中の破線Ｃで囲まれた円内に、各組織の領域の境界を破線Ｄ_１，Ｄ_２で示した。図８は、がんと正常組織、およびリンパ球を含む肝臓サンプル（未染色）を試料として、波長９．３μｍの赤外線レーザを試料照射し、得られた測定画像から、対象領域の解析を行い、各ピクセルの合焦測度を２０階調でマッピングした解析画像である。

本実施例では、測定画像の解析領域における合焦測度の最小値が１３３、最大値が１６３であり、この範囲を２０階調に分けてイメージを作成した。図８には、各組織の大まかな境界を破線Ｇ_１，Ｇ_２で示している。がんを含む領域と正常組織の領域との境界の合焦測度は１４５〜１４８であり、合焦測度の最小値と最大値の４２〜５２％の領域内であった。がんを含む領域とリンパ球の領域との境界の合焦測度も１４５〜１４８の範囲内であった。一方、図８の解析画像では、正常組織の領域とリンパ球の領域との境界Ｇ_２には、階調の差はみられなかった。

本実施例では、実施例１，２とは逆に、境界階調よりも高階調で合焦測度が大きい領域が病変組織（がん）を含む領域であり、境界階調よりも低階調で合焦測度が小さい領域が正常組織であった。

実施例１〜３のそれぞれについて、測定サンプル、測定用波長λ_１、合焦測度の範囲（最大値および最小値）、および病変組織と正常組織との境界の合焦測度の範囲を、表１に一覧で示す。

＜応用例＞
前述のように、測定用波長λ_１は、測定対象の組織（器官）の種類に応じて、吸光度の差が大きい波長を選択すればよく、実施例に示した組織以外でも、測定用波長λ_１を適切に選択して測定および解析を行うことにより、合焦測度に基づく生体組織の識別が可能である。

器官が未知の場合や、識別対象の器官に最適な測定用波長が未知の場合は、合焦調整を行った後に、複数の波長で測定および解析を行い、合焦測度の最大値と最小値の差が小さい波長での測定結果を採用すればよい。また、複数の波長での測定・解析結果をデータベースと照合して、器官の同定や病変種類の同定を行ってもよい。病変組織と正常組織を識別するための解析画像と病理画像のマッチングデータを蓄積してデータベース化することにより、人工知能による識別の自動化への応用も期待できる。解析結果のデータベースには、組織の識別を行うための合焦測度の閾値に関する情報等が格納されていてもよい。解析対象の病変としては、がんの他に、筋梗塞、脂肪肝、肝硬変、腎臓組織のアミロイド沈着した糸球体等の非がん組織が挙げられる。

上記の実施例では、測定光として、コヒーレント光であるレーザを用いている。測定光が単一波長λ_１のコヒーレント光であれば、撮像素子では波長λ_１を有する光が撮像され、単一波長での撮像および解析が行われるため、多波長で撮像および解析を実施する場合（例えばハイパースペクトルを取得する場合）に比べて、測定・解析時間を短縮できる。

（インコヒーレント光の利用）
前述のように、測定光は複数の波長の光を含むインコヒーレント光でもよい。測定光がインコヒーレント光である場合、光源１１と試料Ｓの間、または／および試料Ｓと撮像素子１２との間に波長フィルタや分光器等の分光手段を配置すれば、光源に含まれる多波長光のうち、特定の波長λ_１を有する光のみを撮像素子により撮像可能であり、測定光がコヒーレント光である場合と同様に解析を実施できる。インコヒーレント光を用いる場合は、波長フィルタの交換や、分光器の調整により、撮像素子に到達する光の波長を変更すれば同一の光源を用いて、波長λ_０の光での合焦調整と、波長λ_１の光での測定を実施できる。

（タイリング）
上記の実施例では、１回の測定により得られた測定画像のエッジ解析を行い、算出された合焦測度に基づいて、組織の識別を行ったが、複数の測定結果を組み合わせて、画像解析および組織の識別を実施してもよい。例えば、試料台１３をｘ，ｙ方向に移動させて、試料Ｓの異なる箇所にレーザ光を照射して、測定画像を取得し、複数の測定画像を合成（タイリング）することにより、試料のより広い領域の測定画像が得られる。

タイリングにより得られた測定画像のエッジ解析を行い、合焦測度を算出することにより、１回の測定よりも広範囲での組織の識別が可能となる。測定ごとにエッジ解析を行って解析画像を作成し、複数の解析画像の合成（タイリング）を実施してもよい。複数の測定画像および／または解析画像のタイリングに際しては、光学顕微鏡や電子顕微鏡等の撮影画像のタイリングに用いられている各種のアルゴリズムを適用してもよい。

１ 生体組織識別装置
１１ 光源
Ｌ_０，Ｌ_１ 測定光（中赤外光）
１２ 撮像素子
１３ 試料台
Ｓ 試料
２１，２３ 光学要素
３０ コンピュータ
３１ 制御部
３１１ 光調整部
３１３ 位置調整部
３１５ 演算解析部
３１７ イメージ形成部
３３ 表示部
３５ 記憶部
３７ 入力部

Claims (18)

1. 生体組織の所定領域に、中赤外光を含む測定光を照射し、
   生体組織を透過した測定光または生体組織で反射した測定光のうち波長２μｍ〜２０μｍの範囲の特定の波長λ_１を有する光を撮像して、測定画像を取得し、
   前記測定画像のエッジ解析により、前記測定画像の複数の領域における合焦測度を算出し、
   前記合焦測度に基づいて、生体組織を識別する、生体組織の識別方法。
2. 前記測定画像の微分フィルタ処理により前記エッジ解析を行う、請求項１に記載の生体組織の識別方法。
3. 前記測定光として、波長λ_１を有するレーザ光を前記生体組織に照射する、請求項１または２に記載の生体組織の識別方法。
4. 前記測定光が、量子カスケードレーザ光、または光パラメトリック発振により増幅されたレーザ光である、請求項３に記載の生体組織の識別方法。
5. 前記測定画像を取得する前に合焦調整を実施する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体組織の識別方法。
6. 前記合焦調整において、
   前記生体組織の所定領域に、中赤外光を含む光を照射し、
   前記波長λ_１とは異なる２μｍ〜２０μｍの範囲の波長λ_０を有する光を撮像して合焦調整用画像を取得し、
   合焦調整用画像の合焦度合いが高くなるように、生体組織を含む試料の位置、および／または他の光学要素の位置を調整する、請求項５に記載の生体組織の識別方法。
7. 前記合焦調整において、波長λ_０を有するレーザ光を前記生体組織に照射する、請求項６に記載の生体組織の識別方法。
8. 前記合焦測度と所定の閾値の大小関係に基づいて、生体組織が正常組織であるか否かを識別する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体組織の識別方法。
9. 生体組織にがんが含まれているか否かを識別する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の生体組織の識別方法。
10. 生体組織の所定領域に、中赤外光を含む測定光を照射可能な光源と；
    生体組織を透過した測定光または生体組織で反射した測定光のうち波長２μｍ〜２０μｍの範囲の特定の波長λ_１を有する光を撮像して、測定画像を取得する撮像素子と；
    前記測定画像のエッジ解析により、前記測定画像の複数の領域における合焦測度を算出可能な演算解析部を備えるコンピュータと、を備える、生体組織識別装置。
11. 前記演算解析部は、前記測定画像を微分フィルタ処理することにより、前記合焦測度を算出する、請求項１０に記載の生体組織識別装置。
12. 前記演算解析部は、前記合焦測度に基づいて生体組織を識別する、請求項１０または１１に記載の生体組織識別装置。
13. 前記演算解析部は、前記合焦測度と所定の閾値の大小関係に基づいて、生体組織が正常組織であるか否かを識別する、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の生体組織識別装置。
14. 前記コンピュータが、前記合焦測度をマッピングして解析画像を形成するイメージ形成部を備える、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の生体組織識別装置。
15. 前記光源は、波長を掃引可能なレーザ光源である、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の生体組織識別装置。
16. 前記光源は、量子カスケードレーザ、または光パラメトリック発振器を備えるレーザである、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の生体組織識別装置。
17. 前記撮像素子で取得した測定画像をエッジ解析して、前記測定画像の複数の領域における合焦測度を算出する処理を、前記演算解析部に実行させるためのプログラムが、前記コンピュータの記憶部に格納されている、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の生体組織識別装置。
18. 生体組織の所定領域に、中赤外光を含む測定光を照射するステップ；
    生体組織を透過した測定光または生体組織で反射した測定光のうち波長２μｍ〜２０μｍの範囲の特定の波長λ_１を有する光を撮像して、測定画像を取得するステップ；
    前記測定画像のエッジ解析により、前記測定画像の複数の領域における合焦測度を算出するステップ；および
    前記合焦測度に基づいて、生体組織を識別するステップを、
    コンピュータに実行させるための処理手順が記述されている、生体組織識別プログラム。