JP2021021709A - イメージングフローサイトメーター、ソート方法、及び、キャリブレーション方法 - Google Patents
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Abstract
Description
これに対し、検出部からソート部までの距離を短くすることにより、対象物の速度ばらつきの影響を抑制できる。そのため、従来のフローサイトメーターでは、対象物の速度ばらつきを考慮せず、対象物が検出部を通過してから、一定の遅延時間が経過したタイミングでソート部を動作させるのが一般的であった。
また、個々の対象物の速度を計測できたとしても、特許文献1では速度信号と細胞分類の計算を各々独立して行い、それらの結果を遅延処理回路に入力してソート部を制御するものである。そのため、カメラで撮像された個々の画像と速度計測部で計測された個々の対象物の速度とが、正確に1対1対応で紐付けされる確証がない。異なる対象物に由来する画像の処理結果と速度情報とが誤って紐付けられてしまうと、正確にソートできないため問題となる。具体的には、高いスループットで対象物を流路に流す場合には、個々の対象物の信号間隔が狭まり、場合によっては信号が重複して埋没し、紐付けにエラーを引き起こすことがある。あるいは、計測対象物が小さい場合など、カメラでは識別されたが速度検出部では検出できなかった場合も、信号の1対1対応にエラーを来たすことがある。
粒子が流れる流路上の第1視野及び第2視野を撮像する撮像部と、
システム時間を発するシステム時間管理部と、
前記システム時間とともに、前記撮像部が撮像した画像を記憶する画像記憶部と、
前記粒子が含まれる画像を検出する粒子検出部と、
前記粒子が対象粒子であるか否かを判断するソート判断部と、
前記粒子の遅延時間を計算する遅延時間計算部と、
前記ソート判断部の判断結果に応じて、前記遅延時間計算部によって計算されたタイミングに合わせて前記粒子をソートするために、ソート信号を発するソート信号制御部と、
前記ソート信号に基づいて、前記対象粒子をソートするソート部と、
を有し、
前記遅延時間計算部は、前記第1視野及び前記第2視野で撮像された前記粒子の画像に基づき、前記粒子が前記ソート部に到達するまでの前記遅延時間を計算する、
イメージングフローサイトメーターである。
粒子が流れる流路上の第1視野及び第2視野を撮像部が撮像し、
前記撮像部が撮像した画像を、システム時間とともに記憶し、
前記粒子が含まれる画像を粒子検出部が検出し、
前記粒子が対象粒子であるか否かをソート判断部が判断し、
前記第1視野及び前記第2視野で撮像された前記粒子の画像に基づき、前記粒子がソート部に到達するまでの遅延時間を計算し、
前記ソート判断部の判断結果に応じて、前記粒子の遅延時間に基づいてソート部が前記対象粒子をソートする、
ソート方法である。
粒子が流れる流路上の第1視野及び第2視野を撮像部が撮像し、
前記撮像部が撮像した画像を、システム時間とともに記憶し、
前記粒子が含まれる画像を第1粒子検出部が検出し、
前記流路上の検出位置を検出器が検出し、
前記検出器からの検出信号を、前記システム時間とともに記憶し、
前記粒子の通過に対応する検出信号を第2粒子検出部が検出し、
前記第1視野及び前記第2視野で撮像された前記粒子の画像により求められる、前記粒子が第1視野及び前記第2視野を通過した時間に基づき、前記粒子が前記検出位置に到達する到達予想時間を計算し、
前記検出信号に基づき、前記粒子が検出位置に到達した到達時間を取得し、
前記到達時間に基づいて、前記粒子が第1視野及び前記第2視野を通過した時間から計算される前記到達予想時間を調整する、
キャリブレーション方法である。
以下、図面を参照して、第1実施形態のイメージングフローサイトメーター1について説明する。図1は、本実施形態のイメージングフローサイトメーターの構成図である。本実施形態のイメージングフローサイトメーター1は、流路10を流れる粒子Pがソート対象となる対象粒子であるか否かを判断し、対象粒子をソートするものである。粒子Pは、例えば、ビーズ、細胞および細胞塊(血球細胞、骨髄細胞、リンパ球、循環がん細胞、血管内皮細胞、血小板、血小板凝集塊、卵子、精子、受精卵、スフェロイド、オルガノイドなど)、オルガネラ(染色体、葉緑体、ミトコンドリアなど)、微生物、寄生虫、花粉、藻(クラミドモナス、ユーグレナなど)である。多数の粒子Pは、流路10を一定の方向に流れる。図1は、異なる種類の粒子P1,P2,P3が、この順で流路10を流れる様子を示す。
第1視野12及び第2視野14は、いずれも撮像部20の光学系の視野に含まれる。なお、単一のカメラ上で第1視野12及び第2視野14の双方を撮像してもよいし、各々の視野に対して個別にカメラを割り当ててもよい。
システム時間管理部40は、システム時間を発する。システム時間管理部40により発せられたシステム時間は、画像記憶部30とソート信号制御部38に送信される。
また、市販の画像解析ソフトウエアや、オープンソースの画像解析ソフトウエアなどを用いて、細胞の輪郭抽出や細胞領域のセグメンテーションなどにより細胞領域を検出してもよい。
粒子検出部32で検出され識別番号を付与された粒子Pの画像は、ソート判断部34に出力される。また、粒子検出部32は、識別番号を付与され、かつ、画像記憶部30でシステム時間を付与された粒子Pの画像より、検出された粒子Pの所定の特徴点(例えば、中心、重心、先端、後端など)が第1視野12及び第2視野14の所定の基準位置(例えば、中央)を通過した時間t1およびt2を計算する。
ここで、第1視野12及び第2視野14の中で粒子Pが撮像される位置が所定の基準位置と異なる場合は、画像に付与されたシステム時間及び粒子Pの特徴点の位置情報より、t1およびt2の推定値を計算できる。例えば、第1視野12及び第2視野14での粒子Pを含む画像に付与されたシステム時間がT1およびT2、画像上の基準位置から粒子Pの特徴点の流路の流れ方向へのずれ量がΔy1およびΔy2、粒子の流れ方向での移動速度の推定値がVである場合、t1=T1+Δy1/V、t2=T2+Δy2/Vなどとして計算できる。
粒子検出部32は、粒子Pに対して算出されたシステム時間t1及びt2を、粒子Pに対して付与された識別番号とともに、遅延時間計算部36に出力する。
ソート判断部34は、対象となる粒子の種類に応じて様々な画像解析方法を用いることが出来る。例えば、画像から1つ以上の特徴量を計算し、その分布から粒子Pを分類する方法、特徴量の分布に対してSVM(Support Vector Machine)などの機械学習により分類する方法、画像に対して深層学習を適用することで分類する方法などが用いられる。
また、深層学習による分類方法として、ソート判断部34は、ビーズ粒子を対象として2クラスを分類するCNN(Convolutional Neural Network)を構成して、一方のクラスをソート対象とした方法を用いてもよい。また、ソート判断部34は、ヒトの血球細胞を対象として、3クラスを分類するCNNを構成して、各クラスの確信度の分布に対して、特定の領域をソートする方法を用いてもよい。
このほか、ソート判断部34は、米国特許第6,211,955号公報に記載されるように、細胞核内部の蛍光画像から輝点の有無により分類する方法を用いてもよい。
なお、上記の遅延時間ΔTは、粒子Pが第1視野12の基準位置を通過してから粒子Pがソート部50に到達するまでの時間であるが、これに限られない。遅延時間は、粒子Pが第2視野14の基準位置を通過してからソート部50に到達するまでの時間でもよい。
ソート信号制御部38には、システム時間管理部40からシステム時間が送信されているため、粒子Pがソート部50に到達するタイミングに合わせて、ソート信号制御部38はソート部50に適切なソート信号を発する。
また、ソート部50が対象粒子を2種類以上に分けてソートする場合がある。例えば、2種類に分けてソートする場合(2-way sorting)、4種類に分けてソートする場合(4-way sorting)がある。そのような場合には、ソート判断部34が対象粒子をさらに複数の異なる種類に分類し、その分類結果がソート信号に含まれる。その場合、例えば、パルス信号の振幅や符号などを用いて、分類結果をパルス信号に含ませることができる。
または、パルス信号と合わせて別途準備した信号線を用いて、分類結果をデジタル信号などとしてソート部50に伝達してもよい。
さらに、ソート信号はソートのタイミングを開始時間としてソートを持続する時間幅を伝達してもよい。その場合、ソートを持続する時間幅を、パルス信号のパルス幅として伝達してもよいし、ソートを持続する時間幅を符号化した信号を別途準備した信号線を用いて伝達してもよい。
ソート判断部34の判断結果により、粒子Pが対象粒子である場合のみに、ソート信号制御部38がソート信号を発してもよい。また、ソート判断部34の判断結果により、粒子Pが対象粒子である場合と対象粒子ではない場合に、ソート信号制御部38が異なるソート信号を発してもよい。
ソート判断部34は、粒子Pが対象粒子であるか否かを判断する。また、遅延時間計算部36は、粒子Pが第1視野12及び第2視野14の基準位置を通過した時間t1及びt2に基づき、粒子Pがソート部50に到達するまでの遅延時間を計算する。そして、ソート部50は、ソート判断部34の判断結果に応じて、遅延時間に基づいて粒子Pをソートする。
以下、図面を参照して、第2実施形態のイメージングフローサイトメーター1について説明する。図3は、本実施形態のイメージングフローサイトメーター1の構成図である。本実施形態のイメージングフローサイトメーター1は、遅延時間のキャリブレーション機能を有する。具体的には、イメージングフローサイトメーター1では、キャリブレーション用のビーズ(粒子P)を流路10に流し、第1視野12、第2視野14を流れる粒子Pが、検出位置Xで検出される到達時間を測定する。これにより、第1視野12、第2視野14を流れる粒子Pから計算される粒子Pの到達予想時間のキャリブレーションを行う。
また、第1粒子検出部32は、粒子Pに対して算出されたシステム時間t1及びt2を、粒子Pに対して付与された識別番号とともに、遅延時間計算部36に出力する。
遅延時間計算部36は、粒子Pの識別番号とともに粒子Pの到達予想時間を比較部80へ出力する。
なお、検出器60が画像を取得する場合は、第1視野12、第2視野14、検出位置Xを同時に検出できるものであることが好ましい。
検出器60が画像を取得する場合、検出信号記憶部70は、画像記憶部30と同様の構成を採用してもよい。検出器60がディテクタのように時間方向に連続な信号を取得する場合、検出信号記憶部70は、検出信号をデジタル信号に変換するADC(Analog Digital Converter)と、検出信号バッファとなる内部メモリおよび処理回路を搭載したFPGA(Field Programmable Gate Array)で構成できる。検出信号バッファと処理回路については、FPGAとDRAM(Dynamic Random Access Memory)などの外部メモリを組合わせた構成や、FPGAを専用もしくは汎用の論理回路に置き換えた構成、マイクロプロセッサとメモリを組合わせたコンピュータシステムでもよい。
検出器60が画像を取得する場合は、第2粒子検出部72は、第1粒子検出部32と同様の構成を採用してもよい。検出器60がディテクタのように時間方向に連続な信号を取得する場合、例えば、信号の変化が一定の閾値以上であった時間を粒子Pの通過時間として粒子Pを検出するなどの方法により、粒子を検出することができる。
比較部80は、紐付けられた粒子Pの識別番号、到達予想時間、到達時間をセットで出力する。
第1視野12及び第2視野14の各々の基準位置の間の距離をL1、第1視野12の基準位置と検出位置Xの間の距離をL2とすると、粒子Pが等速運動をしている場合には、到達予想時間は(L2/L1)×(t2−t1)として求められる。ここでは係数A=L2/L1の値をキャリブレーションにより求めることで、t1およびt2が与えられた際に到達予想時間を求めることができる。
まず、多数の粒子Pが流路10を流れる。撮像部20は、第1視野12及び第2視野14を連続的に撮像する。撮像部20が撮像した画像は、システム時間とともに画像記憶部30に記憶される。そして、第1粒子検出部32は、粒子Pが含まれる画像を検出する。遅延時間計算部36は、粒子Pが第1視野12及び第2視野14を通過した時間に基づき、粒子Pが検出位置Xに到達する到達予想時間を計算する。
また、検出器60は、検出位置Xを流れる粒子Pを検出する。検出器60が検出した検出信号は、システム時間とともに検出信号記憶部70に記憶される。そして、第2粒子検出部72は、粒子Pの通過に対応する検出信号を検出し、粒子Pが検出位置Xに到達した到達時間を出力する。
比較部80は、到達時間に基づいて、遅延時間計算部36で計算される粒子Pの到達予想時間の計算式をキャリブレーションし調整する。そして、ソート信号制御部38とソート部50は、調整された到達予想時間に基づき、粒子Pをソートするタイミングを調整する。
10 流路
12 第1視野
14 第2視野
20 撮像部
30 画像記憶部
32 粒子検出部(第1粒子検出部)
34 ソート判断部
36 遅延時間計算部
38 ソート信号制御部
40 システム時間管理部
50 ソート部
60 検出器
70 検出信号記憶部
72 第2粒子検出部
80 比較部
P,P1,P2,P3 粒子
X 検出位置
Claims (8)
- 粒子(P)が流れる流路(10)上の第1視野(12)及び第2視野(14)を撮像する撮像部(20)と、
システム時間を発するシステム時間管理部(40)と、
前記システム時間とともに、前記撮像部(20)が撮像した画像を記憶する画像記憶部(30)と、
前記粒子(P)が含まれる画像を検出する粒子検出部(32)と、
前記粒子(P)が対象粒子であるか否かを判断するソート判断部(34)と、
前記粒子(P)の遅延時間を計算する遅延時間計算部(36)と、
前記ソート判断部(34)の判断結果に応じて、前記遅延時間計算部(36)によって計算されたタイミングに合わせて前記粒子(P)をソートするために、ソート信号を発するソート信号制御部(38)と、
前記ソート信号に基づいて、前記対象粒子をソートするソート部(50)と、
を有し、
前記遅延時間計算部(36)は、前記第1視野(12)及び前記第2視野(14)で撮像された前記粒子(P)の画像に基づき、前記粒子(P)が前記ソート部(50)に到達するまでの前記遅延時間を計算する、
イメージングフローサイトメーター(1)。 - 前記撮像部(20)は、TDIカメラである、
請求項2に記載のイメージングフローサイトメーター。 - 前記粒子検出部(32)は、検出された前記粒子(P)に識別番号を付与する、
請求項1又は2に記載のイメージングフローサイトメーター。 - 前記遅延時間計算部(36)は、同じ識別番号が付与された前記粒子(P)の前記第1視野(12)及び前記第2視野(14)における画像の前記システム時間に基づいて、前記粒子(P)が前記ソート部(50)に到達するまでの遅延時間を計算する、
請求項1〜3のいずれかに記載のイメージングフローサイトメーター。 - 前記流路(10)上の検出位置(X)において前記粒子(P)を検出する検出器(60)と、
前記システム時間とともに、前記検出器(60)からの検出信号を記憶する検出信号記憶部(70)と、
前記粒子(P)の検出信号を検出する第2粒子検出部(72)と、
前記遅延時間計算部(36)によって計算された前記粒子(P)の前記検出位置(X)への到達予想時間と、前記検出器(60)によって検出された前記粒子(P)の前記検出位置(X)への到達時間とを比較する比較部(80)と、を更に有し、
前記ソート信号制御部(38)は、前記到達予想時間と前記到達時間との比較結果に基づき、前記ソート部(50)が前記対象粒子をソートするタイミングを調整する、
請求項1〜4のいずれかに記載のイメージングフローサイトメーター。 - 粒子(P)が流れる流路(10)上の第1視野(12)及び第2視野(14)を撮像部(20)が撮像し、
前記撮像部(20)が撮像した画像を、システム時間とともに記憶し、
前記粒子(P)が含まれる画像を粒子検出部(32)が検出し、
前記粒子(P)が対象粒子であるか否かをソート判断部(34)が判断し、
前記第1視野(12)及び前記第2視野(14)で撮像された前記粒子(P)の画像に基づき、前記粒子(P)がソート部(50)に到達するまでの遅延時間を計算し、
前記ソート判断部(34)の判断結果に応じて、前記粒子(P)の遅延時間に基づいて前記ソート部(50)が前記対象粒子をソートする、
ソート方法。 - 粒子(P)が流れる流路(10)上の第1視野(12)及び第2視野(14)を撮像部(20)が撮像し、
前記撮像部(20)が撮像した画像を、システム時間とともに記憶し、
前記粒子(P)が含まれる画像を第1粒子検出部(32)が検出し、
前記流路(10)上の検出位置(X)を検出器(60)が検出し、
前記検出器(60)からの検出信号を、前記システム時間とともに記憶し、
前記粒子(P)の通過に対応する検出信号を第2粒子検出部(72)が検出し、
前記第1視野(12)及び前記第2視野(14)で撮像された前記粒子(P)の画像により求められる、前記粒子(P)が第1視野(12)及び前記第2視野(14)を通過した時間に基づき、前記粒子(P)が前記検出位置(X)に到達する到達予想時間を計算し、
前記検出信号に基づき、前記粒子(P)が検出位置(X)に到達した到達時間を取得し、
前記到達時間に基づいて、前記粒子(P)が第1視野(12)及び前記第2視野(14)を通過した時間から計算される前記到達予想時間を調整する、
キャリブレーション方法。 - 調整された前記到達予想時間に基づき、ソート部(50)が前記粒子(P)をソートするタイミングを調整する、
請求項7に記載のキャリブレーション方法。
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