JP2021020879A - ｐ６３スプライシングバリアントの分解剤およびその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】 医療において有用となる新たな薬剤を提供する。ミオパチーの治療に使用可能な新たな薬剤を提供する。【解決手段】 本発明のｐ６３スプライシングバリアントの分解剤は、ＣＲＢＮタンパク質またはそのペプチド断片と、サリドマイドまたはサリドマイド類縁体とを含むことを特徴とする。本発明の分解剤は、ｐ６３スプライシングバリアントが原因となる疾患の治療に有用である。【選択図】図１

Description

本発明は、ｐ６３スプライシングバリアントの分解剤およびその用途、サリドマイド関連疾患用の医薬組成物およびその用途に関する。

医療の分野においては、未だ、様々な疾患に対して、優れた有効性の医薬品の不足が問題視されている。

そこで、本発明は、医療において有用となる新たな薬剤の提供を目的とする。

前記目的を達成するために、本発明のｐ６３スプライシングバリアントの分解剤は、ＣＲＢＮタンパク質またはそのペプチド断片と、サリドマイドまたはサリドマイド類縁体とを含むことを特徴とする。

本発明のｐ６３スプライシングバリアントの分解方法は、ｐ６３スプライシングバリアントに、前記本発明のｐ６３スプライシングバリアントの分解剤を接触させる接触工程を含むことを特徴とする。

本発明のｐ６３スプライシングバリアント関連疾患に対する医薬組成物は、前記本発明のｐ６３スプライシングバリアントの分解剤を含むことを特徴とする。

本発明のｐ６３スプライシングバリアント関連疾患の治療方法は、前記本発明の医薬組成物を投与する工程を含むことを特徴とする。

本発明の幹細胞の分化制御剤は、前記本発明のｐ６３スプライシングバリアントの分解剤を含むことを特徴とする。

本発明の幹細胞の分化制御方法は、前記本発明の幹細胞の分化制御剤を投与する工程を含むことを特徴とする。

本発明のｐ６３スプライシングバリアントの分解抑制物質のスクリーニング方法は、候補物質と、ＣＲＢＮタンパク質またはそのペプチド断片と、サリドマイドまたはサリドマイド類縁体と、ｐ６３スプライシングバリアントとを共存させ、前記ｐ６３スプライシングバリアントの分解の抑制を検出する工程、および、前記ｐ６３スプライシングバリアントの分解を抑制した候補物質を、分解抑制物質として選択する工程を含むことを特徴とする。

本発明によれば、ｐ６３スプライシングバリアントを分解できることから、例えば、ｐ６３スプライシングバリアントが原因となる疾患の治療に有用である。

本発明によれば、ＣＲＢＮタンパク質とサリドマイドとが形成する複合体による前記ｐ６３スプライシングバリアントの分解を抑制する物質をスクリーニングができる。また、本発明によれば、前記ｐ６３スプライシングバリアントが分解されることが原因となるサリドマイド関連疾患を治療できる。

図１は、実施例１の結果であり、サリドマイドとＣＲＬ４^ＣＲＢＮとの結合により、前記ｐ６３スプライシングバリアントが分解されることを確認したブロッティングの図である。 図２は、実施例２の結果であり、前記ｐ６３スプライシングバリアントの分解が、ＣＲＬ４^ＣＲＢＮに依存するユビキチン化およびプロテアソーム分解に起因するかを確認したブロッティングの図である。 図３は、実施例３の結果であり、前記ｐ６３スプライシングバリアント（ΔＮｐ６３）の分解が、サリドマイドによる四肢の催奇形性に関与しているかを確認した写真とグラフである。 図４は、実施例４の結果であり、前記ｐ６３スプライシングバリアント（ＴＡｐ６３α）の分解が、サリドマイドによる耳小胞（耳）の催奇形性に関与しているかを確認した写真とグラフである。

本願は、ｐ６３スプライシングバリアントの分解の利用に関する発明と、ｐ６３スプライシングバリアントの補充または分解抑制に関する発明とを含む。

＜本発明１＞
本発明１は、前述のようにｐ６３スプライシングバリアントの分解に関する発明である。本発明者らは、サリドマイドが原因となる疾患（以下、サリドマイド関連疾患という）のメカニズムについて鋭意研究を行った。その結果、サリドマイドが原因となる四肢および耳等の催奇形性等の疾患は、四肢および耳等の形成に関与するｐ６３スプライシングバリアントが、ＣＲＢＮにサリドマイドが結合した複合体によって分解されることが原因であることを突き止めた。一方、前記ｐ６３スプライシングバリアントは、例えば、膵臓等の組織において、腫瘍の悪性化に関与することが知られている。そこで、本発明者らは、前述のようなサリドマイド関連疾患に対して解明したメカニズムに基づき、前記複合体を前記ｐ６３スプライシングバリアントに接触させることによって、前記ｐ６３スプライシングバリアントを分解し、腫瘍の悪性化を抑制できるとの知見を得て、本発明１を完成させるに至った。以下、本発明１について、それぞれ説明する。

（１）分解剤
本発明１の分解剤は、前述のように、ｐ６３スプライシングバリアントの分解剤であり、ＣＲＢＮタンパク質またはそのペプチド断片と、サリドマイドまたはサリドマイド類縁体とを含むことを特徴とする。前記ＣＲＢＮタンパク質またはそのペプチド断片と、前記サリドマイドまたはサリドマイド類縁体とは、共存させることで、互いに複合したＣＲＢＮ複合体を形成する。本発明１の分解剤は、例えば、使用時において、前記ＣＲＢＮタンパク質またはそのペプチド断片と、前記サリドマイドまたはサリドマイド類縁体との共存により、前記ＣＲＢＮ複合体を形成できればよく、使用前において、前記ＣＲＢＮタンパク質またはそのペプチド断片と、前記サリドマイドまたはサリドマイド類縁体とは、非共存の状態でも、共存の状態でもよい。以下、本発明１の分解剤の一例として、前記ＣＲＢＮ複合体をあげて説明するが、これには制限されない。

本発明１の分解剤の対象は、前述のように、前記ｐ６３スプライシングバリアントである。ｐ６３は、転写因子ｐ５３のファミリータンパク質である。前記ｐ６３スプライシングバリアントは、同じｐ６３遺伝子について異なるスプライシングの上、発現された、配列が異なるタンパク質であり、アイソフォームともいう。前記ｐ６３スプライシングバリアントは、特に制限されず、例えば、下記表に示す、Ｖａｒｉａｎｔ １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３等があげられる。下記表に、前記各ｐ６３スプライシングバリアントは、例えば、そのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子配列が登録されているデータベースのアクセッション番号を合わせて示す。

前記ＣＲＢＮ複合体は、ＣＲＢＮタンパク質またはそのペプチド断片と、サリドマイドまたはサリドマイド類縁体とを含む複合体であればよい。以下、ＣＲＢＮタンパク質またはそのペプチド断片を「ＣＲＢＮ分子」といい、「サリドマイドまたはサリドマイド類縁体」を「サリドマイド分子」という。

前記ＣＲＢＮ分子は、前述のように、ＣＲＢＮタンパク質、またはそのペプチド断片である。ＣＲＢＮタンパク質とは、セレブロンともいう。

前記ＣＲＢＮタンパク質は、例えば、ヒトのアミノ酸配列でもよいし、非ヒト動物のアミノ酸配列でもよいし、異なる種のキメラのアミノ酸配列でもよい。前記ペプチド断片は、特に制限されず、例えば、ＣＲＢＮタンパク質における、サリドマイド分子が結合する領域があげられ、前記ペプチド断片は、例えば、前記領域のみからなる断片でもよいし、前記領域を含む断片でもよい。前記ＣＲＢＮタンパク質のヒトのアミノ酸配列は、例えば、データベースにおいてアクセッションＮｏ． NP_001166953およびNP_057386に登録されている（配列番号５）。本発明において、ＣＲＢＮタンパク質は、例えば、部分配列のペプチドであってもよく、ＣＲＢＮタンパク質の全長アミノ酸配列において、１８７番目から２６０番目の領域のペプチド、３３９番目から４４２番目の領域のペプチド等があげられる。

前記サリドマイド分子は、前述のように、サリドマイド、またはサリドマイド類縁体である。前記サリドマイド類縁体は、例えば、サリドマイドの機能を維持する範囲において、置換基を含んでもよい。前記サリドマイド類縁体としては、例えば、レナリドミド、ポマリドミド等があげられる。

前記ＣＲＢＮ複合体は、前記ＣＲＢＮ分子および前記サリドマイド分子からなる複合体でもよいし、前記ＣＲＢＮ分子および前記サリドマイド分子の他に、他の分子を含んでもよい。前記他の分子は、特に制限されず、例えば、ＤＤＢ１、Ｃｕｌ４、およびＲｏｃ１等のタンパク質分子があげられ、いずれか１つを含んでもよし、２つ以上を含んでもよいし、４つ全てを含んでもよい。

前記ＣＲＢＮ分子と前記サリドマイド分子とは、例えば、互いを接触させることで、結合により、前記複合体を形成できる。前記複合体の形成は、例えば、前記ＣＲＢＮ分子と前記サリドマイド分子とを、ｐＨ７〜８の緩衝液中に共存させ、温度４℃〜３７℃でインキュベートすることにより行える。

本発明１の分離剤は、例えば、使用前において、前記ＣＲＢＮ分子と前記サリドマイド分子とが、それぞれ分離した状態であり、使用時において、前記ＣＲＢＮ分子と前記サリドマイド分子とが接触して結合することにより、前記複合体を形成する形態でもよい。この形態においては、本発明１の分離剤は、例えば、前記ＣＲＢＮ分子に代えて、前記ＣＲＢＮ分子をコードする遺伝子を含んでもよい。この場合、例えば、前記遺伝子からＣＲＢＮ分子が発現し、発現したＣＲＢＮ分子と、前記サリドマイド分子とが結合して、前記複合体を形成してもよい。

本発明１の分解剤は、例えば、研究用試薬として使用することもでき、医薬組成物（医薬品）として使用することもできる。本発明の分解剤は、例えば、添加対象に対して、ｉｎ ｖｉｖｏで使用してもよいし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用してもよい。

本発明１の分解剤は、例えば、生体に添加（投与ともいう）して使用できる。添加対象の生体は、特に制限されず、例えば、動物であり、前記動物は、例えば、ヒト、または、ヒトを除く非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ネコ、ヤギ、サル、およびモルモット等の非ヒト哺乳動物、ゼブラフィッシュ等の魚類等があげられる。また、本発明１の分解剤の添加対象は、生体以外に、例えば、細胞、組織、器官等があげられ、それらの由来は、特に制限されず、前述のような動物である。前記細胞は、例えば、前記生体から採取した細胞、培養細胞等があげられる。

本発明１の分解剤の添加条件は、特に制限されず、例えば、添加対象の種類、添加目的等に応じて、適宜設定できる。また、本発明の分解剤において、前記ＣＲＢＮ複合体の含有量は、特に制限されず、例えば、前記添加条件に応じて適宜設定できる。

本発明１の分解剤を生体に投与する場合、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏで使用する場合、その投与形態は、特に制限されない。前記投与形態は、例えば、経口投与でもよいし、非経口投与でもよい。前記非経口投与は、例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、腹腔内投与、および局所投与等があげられる。また、本発明１の分解剤の生体への投与量は、特に制限されず、例えば、生体の種類、症状、年齢、投与方法、投与目的等により適宜決定できる。

本発明１の分解剤の剤型は、特に制限されず、例えば、前記添加形態に応じて適宜決定できる。前記剤型は、例えば、液体状、および固体状があげられる。

本発明１の分解剤は、例えば、必要に応じて、添加剤を含んでもよい。本発明１の分解剤を医薬組成物として使用する場合、前記添加剤は、薬学上許容される添加剤が好ましい。前記添加剤は、特に制限されず、例えば、基剤原料、賦形剤、着色剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定化剤、保存剤、および、香料等の矯味矯臭剤等があげられる。本発明において、前記添加剤の配合量は、前記ＣＲＢＮ複合体の機能を妨げるものでなければ、特に制限されない。

前記賦形剤は、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、およびソルビトール等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、αデンプン、およびデキストリン等のデンプン誘導体；結晶セルロース等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン等の有機系賦形剤；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、およびメタ珪酸アルミン酸マグネシウム等のケイ酸塩誘導体；リン酸水素カルシウム等のリン酸塩；炭酸カルシウム等の炭酸塩；硫酸カルシウム等の硫酸塩等の無機系賦形剤があげられる。前記滑沢剤は、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、およびステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；タルク；ポリエチレングリコール；シリカ；硬化植物油等があげられる。前記矯味矯臭剤は、例えば、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、および桂皮末等の香料、甘味料、ならびに酸味料等があげられる。前記結合剤は、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、およびマクロゴール等があげられる。前記崩壊剤は、例えば、カルボキシメチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウムおよび架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾デンプン、ならびに化学修飾セルロース類等があげられる。前記安定化剤は、例えば、メチルパラベン、およびプロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、およびフェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、およびクレゾール等のフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；ソルビン酸等があげられる。

（２）分解方法
本発明１の分解方法は、前述のように、ｐ６３スプライシングバリアントの分解方法であり、前記ｐ６３スプライシングバリアントに、前記本発明１のｐ６３スプライシングバリアントの分解剤を接触させる接触工程を含むことを特徴とする。本発明１の分解方法は、前記本発明１の分解剤を使用することが特徴であって、特に示さない限り、前記本発明１の分解剤における記載を援用できる。

前記接触工程は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで行ってもよいし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行ってもよい。また、本発明１の分解方法は、例えば、前記接触工程を動物に対して行うことができ、前記動物は、前述と同様である。

（３）医薬組成物
本発明１の医薬組成物は、前述のように、ｐ６３スプライシングバリアント関連疾患に対する医薬組成物であり、前記本発明１のｐ６３スプライシングバリアントの分解剤を含むことを特徴とする。本発明１の医薬組成物は、前記本発明１の分解剤を使用することが特徴であって、特に示さない限り、前記本発明１の分解剤における記載を援用できる。

前記ｐ６３スプライシングバリアントは、前述のように、例えば、組織の悪性化に関与していることが知られている。前記本発明１の分解剤によれば、前記ｐ６３スプライシングバリアントを分解できるため、前記本発明１の分解剤を含む医薬組成物は、前記ｐ６３スプライシングバリアントが関与する疾患（ｐ６３スプライシングバリアント関連疾患）に対する医薬組成物として使用できる。

前記ｐ６３スプライシングバリアント関連疾患は、例えば、膵臓がん、皮膚がん（cutaneous carcinoma）、頭頸部扁平上皮がん等があげられる。

本発明１の医薬組成物は、例えば、前記ｐ６３スプライシングバリアント関連疾患の治療に使用できる。本発明において、「治療」は、例えば、疾患の症状の緩和、疾患の治癒、罹患の予防等の意味を含み、いずれか１つを目的として使用されてもよいし、２つ以上を目的として使用されてもよい。

（４）治療方法
本発明１の治療方法は、前述のように、ｐ６３スプライシングバリアント関連疾患の治療方法であり、前記本発明１の医薬組成物を投与する工程を含むことを特徴とする。本発明１の治療方法は、前記本発明１の分解剤を含む医薬組成物を使用することが特徴であって、特に示さない限り、前記本発明１の分解剤、分解方法、および医薬組成物における記載を援用できる。

前記投与工程は、例えば、投与対象が動物であり、前記動物は、前述と同様に、ヒト、または非ヒト動物である。

（５）幹細胞の分化制御剤および分化制御方法
本発明１の幹細胞の分化制御剤は、前述のように、前記本発明のｐ６３スプライシングバリアントの分解剤を含むことを特徴とする。

本発明１の幹細胞の分化制御方法は、前述のように、前記本発明の幹細胞の分化制御剤を投与する工程を含むことを特徴とする。

ｐ６３は、神経幹細胞の維持に関与する因子sox3の制御に関与しており、ｐ６３が分解されると、神経幹細胞の維持ができなくなり、ニューロン等に分化することが知られている（Jose M. Santos-Pereira et al., Nature Communications, 2019, 10/3049）。前述のように、本発明は、前記ＣＲＢＮ複合体がｐ６３スプライシングバリアントを分解できることを見出したことが特徴であるため、前記分解剤によれば、ｐ６３スプライシングバリアントを分解でき、結果的に、神経幹細胞の分化を抑制できるといえる。本発明において、幹細胞は、特に制限されず、例えば、神経幹細胞である。

（６）ＣＲＢＮ複合体の用途
本発明１のＣＲＢＮ複合体は、ｐ６３スプライシングバリアント関連疾患の治療または幹細胞の分化制御に使用するための、ＣＲＢＮタンパク質またはそのペプチド断片と、サリドマイドまたはサリドマイド類縁体との複合体である。前記ＣＲＢＮ複合体は、前述の通りであり、前記本発明１の分解剤、分解方法、医薬組成物、治療方法における記載を援用できる。

＜本発明２＞
本発明２は、前述のように、ｐ６３スプライシングバリアントの補充または分解抑制に関する発明である。本発明者らは、前述のように、サリドマイドが原因となる四肢および耳等の催奇形性等の疾患は、四肢および耳等の形成に関与するｐ６３スプライシングバリアントが、ＣＲＢＮにサリドマイドが結合した複合体によって分解されることが原因であることを突き止めた。この知見に基づき、例えば、ＣＲＢＮとサリドマイドとの結合の抑制、または、前記ｐ６３スプライシングバリアントの分解の抑制を検出することで、サリドマイド関連疾患に対する有効候補物質をスクリーニングできること、また、分解される前記ｐ６３スプライシングバリアントを補充することで、前記ｐ６３スプライシングバリアントの機能を補い、サリドマイド関連疾患を治療できるとして、本発明２を完成させるに至った。なお、本発明２は、特に示さない限り、前記本発明１の記載を援用できる。

（１）スクリーニング方法
本発明２のスクリーニング方法は、前述のように、ｐ６３スプライシングバリアントの分解抑制物質のスクリーニング方法であり、候補物質と、前記ＣＲＢＮ分子（ＣＲＢＮタンパク質またはそのペプチド断片）と、前記サリドマイド分子（サリドマイドまたはサリドマイド類縁体）と、前記ｐ６３スプライシングバリアントとを共存させ、前記ｐ６３スプライシングバリアントの分解の抑制を検出する工程、および、前記ｐ６３スプライシングバリアントの分解を抑制した候補物質を、分解抑制物質として選択する工程を含むことを特徴とする。

また、本発明２のスクリーニング方法は、前述のように、サリドマイド関連疾患の有効候補物質のスクリーニング方法であり、前記本発明２の分解抑制物質のスクリーニング方法により、ｐ６３スプライシングバリアントの分解抑制物質を選択し、前記分解抑制物質を、サリドマイド関連疾患の有効候補物質として選択することを特徴とする。

前記検出工程は、例えば、液相の反応系を利用して行うことができる。前記液相の種類は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等が使用できる。前記反応系への各成分の添加順序は、特に制限されない。

前記検出工程において、分解抑制の検出は、例えば、直接的な方法として、前記ｐ６３スプライシングバリアントの分解を検出してもよいし、間接的な方法として、前記ＣＲＢＮ分子と前記サリドマイド分子との結合の抑制を検出してもよい。前述のように、前記ＣＲＢＮ分子と前記サリドマイド分子とが結合した前記複合体によって、前記ｐ６３スプライシングバリアントが分解されるため、前記結合の抑制を検出することで、前記分解の抑制を間接的に検出できる。

前記直接的な方法により、前記ｐ６３スプライシングバリアントの分解を検出する場合、例えば、前記反応系に、前記ＣＲＢＮ分子および前記サリドマイド分子を、それぞれ別個に添加してもよいし、前記ＣＲＢＮ複合体として添加してもよい。前記反応系への前記候補物質の添加順序は、特に制限されず、前記ＣＲＢＮ分子および前記サリドマイド分子、もしくは前記ＣＲＢＮ複合体と、前記ｐ６３スプライシングバリアントとが接触するよりも前、または前記接触と同時であることが好ましい。

前記ｐ６３スプライシングバリアントの分解の検出は、例えば、前記候補物質未添加の反応系における結果と、前記候補物質添加の反応系における結果との比較により、分解の有無または程度を判断することができる。

前記間接的な方法により、前記ＣＲＢＮ分子と前記サリドマイド分子との結合の抑制を検出する場合、例えば、前記反応系に、前記ＣＲＢＮ分子および前記サリドマイド分子を、それぞれ別個に添加する。前記反応系への前記候補物質の添加順序は、特に制限されず、例えば、前記ＣＲＢＮ分子および前記サリドマイド分子のいずれか一方と同時、または両方と同時である。前記間接的な方法の場合、例えば、前記反応系への前記ｐ６３スプライシングバリアントの添加を省略してもよい。

前記ＣＲＢＮ分子と前記サリドマイド分子との結合の抑制は、例えば、前記候補物質未添加の反応系における結果と、前記候補物質添加の反応系における結果との比較により、結合の有無または程度を判断することができる。

（２）新規改変タンパク質
本発明２の新規改変タンパク質は、ｐ６３スプライシングバリアントの改変タンパク質であり、（Ｘ）のタンパク質または（Ｙ）のタンパク質であることを特徴とする。

（Ｘ）下記（Ｘ１）、（Ｘ２）または（Ｘ３）のタンパク質
（Ｘ１）配列番号１または２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｘ２）前記（Ｘ１）のアミノ酸配列に対して同一性８５％以上のアミノ酸配列からなり、前記（Ｘ１）のタンパク質の機能を有するタンパク質
（Ｘ３）前記（Ｘ１）のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、前記（Ｘ１）のタンパク質の機能を有するタンパク質

前記（Ｘ１）において、配列番号１は、ヒト野生型ΔＮｐ６３の５０６番目のアミノ酸残基ＧをＡに改変したアミノ酸配列であり、配列番号２は、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）野生型ΔＮｐ６３の５０６番目のアミノ酸残基ＧをＡに改変したアミノ酸配列である。下記配列において、下線部が、改変箇所である。

前記（Ｘ２）において、同一性は、例えば、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。

前記（Ｘ３）において、「１または数個」は、例えば、１〜１０個、１〜８個、１〜５個、１〜３個、１または２個である。

前記（Ｘ２）または前記（Ｘ３）のタンパク質としては、例えば、配列番号１または２のアミノ酸配列において、５０６番目のアミノ酸残基Ａがアミノ酸残基Ｇ以外であるアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。

（Ｙ）下記（Ｙ１）、（Ｙ２）または（Ｙ３）のタンパク質
（Ｙ１）配列番号３または４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｙ２）前記（Ｙ１）のアミノ酸配列に対して同一性８５％以上のアミノ酸配列からなり、前記（Ｙ１）のタンパク質の機能を有するタンパク質
（Ｙ３）前記（Ｙ１）のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、前記（Ｙ１）のタンパク質の機能を有するタンパク質

前記（Ｙ１）において、配列番号３は、ヒト野生型ＴＡｐ６３の６００番目のアミノ酸残基ＧをＡに改変したアミノ酸配列であり、配列番号４は、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）野生型ＴＡｐ６３の５９９番目のアミノ酸残基ＧをＡに改変したアミノ酸配列である。下記配列において、下線部が、改変箇所である。

前記（Ｙ２）において、同一性は、例えば、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。

前記（Ｙ３）において、「１または数個」は、例えば、１〜１０個、１〜８個、１〜５個、１〜３個、１または２個である。

前記（Ｙ２）のタンパク質としては、例えば、配列番号３のアミノ酸配列において、６００番目のアミノ酸残基Ａがアミノ酸残基Ｇ以外であるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号４のアミノ酸配列において、５９９番目のアミノ酸残基Ａがアミノ酸残基Ｇ以外であるアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。

（３）医薬組成物
本発明２の医薬組成物は、前述のように、サリドマイド関連疾患用の医薬組成物であり、前記本発明２のｐ６３スプライシングバリアントの改変タンパク質、または、前記改変タンパク質のコード遺伝子を含むことを特徴とする。前記ｐ６３スプライシングバリアントの改変タンパク質は、前述のとおりである。

前記改変タンパク質のコード遺伝子は、特に制限されず、前記改変タンパク質のアミノ酸配列をコドンに置き換えることで設計できる。前記コード遺伝子は、例えば、発現ベクターの形態でもよい。具体的に、本発明２の医薬組成物は、例えば、前記発現ベクターを含み、前記発現ベクターに前記コード遺伝子が発現可能に挿入されている。前記発現ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記医薬組成物を投与する対象に応じて、適宜設定できる。

本発明２の医薬組成物は、例えば、前記サリドマイド関連疾患の治療に使用できる。前記サリドマイド関連疾患は、特に制限されず、例えば、四肢の催奇形性、耳の催奇形性等があげられる。本発明において、「治療」は、例えば、疾患の症状の緩和、疾患の治癒、罹患の予防等の意味を含み、いずれか１つを目的として使用されてもよいし、２つ以上を目的として使用されてもよい。

（４）治療方法
本発明２の治療方法は、前述のように、サリドマイド関連疾患の治療方法であり、前記本発明２の医薬組成物を投与する工程を含むことを特徴とする。本発明２の治療方法は、前記本発明２の医薬組成物を使用することが特徴であって、特に示さない限り、前記本発明２の改変タンパク質、および医薬組成物における記載を援用できる。また、前記本発明１の治療方法における記載を援用できる。

前記投与工程は、例えば、投与対象が動物であり、前記動物は、前述と同様に、ヒト、または非ヒト動物である。

（５）改変タンパク質の用途
本発明２の改変タンパク質は、サリドマイド関連疾患の治療に使用するための、前記（Ｘ）または（Ｙ）の改変タンパク質である。前記改変タンパク質は、前述の通りであり、前記本発明２の改変タンパク質、医薬組成物、治療方法における記載を援用できる。

つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。

［実施例１］
サリドマイドとＣＲＬ４^ＣＲＢＮとの結合により、前記ｐ６３スプライシングバリアントが分解されることを確認した。前記ＣＲＬ４^ＣＲＢＮは、Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体ＣＵＬ４−ＲＢＸ１−ＤＤＢ１−ＣＲＢＮであり、これとサリドマイドとの結合体を、以下、サリドマイド−ＣＲＬ４^ＣＲＢＮと示す。

（１） ＤＭＳＯ（サリドマイド未含有）、またはサリドマイド（１００μｍｏｌ／Ｌ サリドマイド含有ＤＭＳＯ）で、ヒトHaCat細胞を２４時間インキュベート処理した。そして、イムノブロッティングにより、前記細胞におけるΔＮｐ６３αを検出した。また、コントロールとして、チューブリンも検出した。この結果を、図１（ａ）に示す。図に示すように、ΔＮｐ６３αは、サリドマイドの添加によって減少した。一方、サリドマイドの添加によっても、ｐ６３ｍＲＮＡ濃度は、減少しなかったことから（図示せず）、発現したΔＮｐ６３αが、サリドマイドの添加によって分解され減少したといえる。

（２） ヒトHaCat細胞（ＷＴ）、およびＣＲＢＮを発現しないヒトHaCat細胞（ＣＲＢＮ^−／−）を、同様に２４時間処理し、イムノブロッティングにより、ΔＮｐ６３、ＣＲＢＮを検出した。また、コントロールとして、ビンキュリンも検出した。この結果を、図１（ｂ）に示す。図に示すように、ＣＲＢＮを発現しないヒトHaCat細胞（ＣＲＢＮ^−／−）では、ΔＮｐ６３αの量は、ほとんど変化しなかった。このことから、サリドマイドとＣＲＢＮとの共存により、ΔＮｐ６３αが分解されたといえる。

（３） ヒト293T細胞において、Ｍｙｃで標識化したＴＡｐ６３αまたはΔＮｐ６３を、それぞれ異所的に過剰発現させ、且つ、同様に２４時間処理した。そして、イムノブロッティングにより、ΔＮｐ６３αまたはＴＡｐ６３αを検出した。この結果を、図１（ｃ）および（ｄ）に、それぞれ示す。図に示すように、ΔＮｐ６３αおよびＴＡｐ６３αは、それぞれ、サリドマイドの添加によって減少した。

これらの結果から、ΔＮｐ６３αおよびＴＡｐ６３αは、いずれも、サリドマイド−ＣＲＬ４^ＣＲＢＮの下流因子であること、サリドマイドとＣＲＢＮとの共存により、分解することがわかった。

［実施例２］
前記ｐ６３スプライシングバリアントの分解が、ＣＲＬ４^ＣＲＢＮに依存するユビキチン化およびプロテアソーム分解に起因するかを確認した。

（１） ヒトHaCat細胞を、実施例１と同様にして、ＤＭＳＯまたはサリドマイドで２４時間処理した。前記処理終了の６時間前には、１０μｍｏｌ／Ｌプロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２）または０．１μｍｏｌ／Ｌネジル化阻害剤（ＭＬＮ４９２４）を添加した。そして、イムノブロッティングにより、ΔＮｐ６３αの検出、コントロール（アクチンまたはＧＡＰＤＨ）の検出を行った。この結果を、図２（ａ）、（ｂ）に示す。図に示すように、サリドマイド存在下における、ΔＮｐ６３αの減少は、各阻害剤の添加により抑制された。この結果から、ΔＮｐ６３αの分解は、ユビキチン化およびプロテアソーム分解に起因することが確認された。

（２） ヒトHaCat細胞に、翻訳停止のために、タンパク質合成阻害剤である５０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド（ＣＨＸ）をあわせて添加した以外は、実施例１と同様にして、ＤＭＳＯまたはサリドマイドで４８時間処理した。そして、イムノブロッティングにより、経時的なΔＮｐ６３αおよびコントロール（アクチン）の減少を確認した。この結果を、図２（ｃ）に示す。図に示すように、ＣＨＸの添加により、ＤＭＳＯ添加の系においてもΔＮｐ６３αの減少が確認されたが、さらにサリドマイドを添加した系においては、ΔＮｐ６３αのさらなる減少が確認された。この結果から、サリドマイド処理が、ｐ６３をタンパク質レベルで減少させることが確認された。

（３） ヒト293T細胞において、Ｍｙｃで標識化したヒトＴＡｐ６３αまたはヒトΔＮｐ６３αと、ＨＡで標識化したユビキチンとを、異所的に過剰発現させ、且つ、サリドマイドまたはＤＭＳＯとプロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２）とにより、６時間処理した。そして、抗ＨＡビーズで免疫沈降（ＩＰ）を行い、ΔＮｐ６３αまたはＴＡｐ６３αを検出した。この結果を、図２（ｄ）に示す。図に示すように、ΔＮｐ６３αおよびＴＡｐ６３αは、それぞれ、サリドマイド存在下でラダーなブロットを示したことから、分解されたことが確認できた。

（４） ヒト293T細胞において、Ｍｙｃで標識化したヒトΔＮｐ６３αまたはヒトＴＡｐ６３αと、ＦＬＡＧで標識化したＣＲＢＮとを、それぞれ異所的に過剰発現させ、且つ、実施例１と同様に２４時間処理した。そして、共免疫沈澱により、ΔＮｐ６３αまたはＴＡｐ６３αと、ＣＲＢＮとを検出した。この結果を、図２（ｅ）に示す。図に示すように、ΔＮｐ６３αおよびＴＡｐ６３αは、それぞれ、サリドマイドの非存在下では、ＣＲＢＮとの結合は極めて弱いものであったが、サリドマイド存在下では、ＣＲＢＮと安定した結合することが確認された。これらの結果から、ｐ６３スプライシングバリアントは、ＣＲＢＮのサリドマイド依存型の基質であるといえる。

（５） ヒト野生型ΔＮｐ６３（ＷＴ）を発現するヒト293T細胞（ＷＴ）、およびヒトΔＮｐ６３改変体（ｈＤＮｐ６３α Ｇ５０６Ａ、配列番号１）を発現するヒト293T細胞（Ｇ５０６Ａ）、ヒト野生型ＴＡｐ６３（ＷＴ）を発現するヒト293T細胞（ＷＴ）、およびヒトＴＡｐ６３改変体（ｈＴＡｐ６３ Ｇ６００Ａ、配列番号３）を発現するヒト293T細胞（Ｇ６００Ａ）について、前記実施例１と同様にして２４時間処理を行い、イムノブロッティングにより、ΔＮｐ６３αまたは改変体（Ｇ５０６Ａ）、ＴＡｐ６３または改変体（Ｇ６００Ａ）、およびコントロール（ＧＡＰＤＨ）の検出を行った。この結果を、図２（ｆ）に示す。図に示すように、ΔＮｐ６３αの改変体（Ｇ５０６Ａ）は、ΔＮｐ６３（ＷＴ）と比較して、サリドマイド存在下での分解が抑制され、また、ＴＡｐ６３の改変体（Ｇ６００Ａ）は、ＴＡｐ６３（ＷＴ）と比較して、サリドマイド存在下での分解が抑制された。これらの結果から、前記ｐ６３スプライシングバリアントの改変体によれば、サリドマイドに起因する分解を抑制できることがわかった。

［実施例３］
前記ｐ６３スプライシングバリアント（ΔＮｐ６３）の分解が、サリドマイドによる四肢の催奇形性に関与しているかを確認した。

（１） ゼブラフィッシュにおいて、ゼブラフィッシュΔＮｐ６３α（ｚΔＮｐ６３α）は、胸びれの発生に必須であることが知られている。そこで、ゼブラフィッシュの受精卵に、ＥＧＦＰ（enhanced green fluorescent protein）ｍＲＮＡまたはｚΔＮｐ６３α−ＥＧＦＰｍＲＮＡを導入し、サリドマイド非存在下（−）または４００μｍｏｌ／Ｌサリドマイド存在下、胚を発生させ、７２時間後の外観を背面から確認した。この結果を、図３（ａ）に示す。図に示すように、ＥＧＦＰｍＲＮＡを導入したゼブラフィッシュは、サリドマイド非存在下では、胸びれが発生しているが、サリドマイド存在下において、胸びれが発生しなかった。そして、ｚΔＮｐ６３αを過剰発現するゼブラフィッシュは、サリドマイド存在下であっても、サリドマイド非存在下と同様に、胸びれが発生した。つまり、サリドマイド存在下において、ｚΔＮｐ６３αは分解されるが、これを過剰発現させると、ｚΔＮｐ６３αが補充されるため、補充されたｚΔＮｐ６３αの機能によって、胸びれが発生したといえる。

（２） ｚΔＮｐ６３α ｍＲＮＡを導入していない受精卵（−）、野生型のｚΔＮｐ６３α ｍＲＮＡ（ＷＴ）を導入した受精卵（ＷＴ）、変異型のｚΔＮｐ６３α ｍＲＮＡ（ｄｒＤＮｐ６３α１ Ｇ５０６Ａ、配列番号２）を導入した受精卵（Ｇ５０６Ａ）を使用し、それぞれ、前記（１）と同様にして、胚を発生させた。そして、サリドマイドによる胸びれ発生への影響を、図３（ｂ）の評価基準にしたがって、影響なし（ｎｏ ｅｆｆｅｃｔ）、軽度（ｍｉｌｄ）、重度（ｓｅｖｅｒｅ）のいずれであるかを評価した。これらの結果を、図３（ｃ）に示す。図３（ｃ）において、発生率（％）は、各群の全体（ｎ数）に対する割合である。図３（ｃ）に示すように、受精卵（−）からの胚は、サリドマイド存在下、半分以上の個体が、重度であったのに対して、ｚΔＮｐ６３α（ＷＴ）を過剰発現させた受精卵（ＷＴ）からの胚は、サリドマイド存在下、半分以上の個体が影響なしであり、残りも軽度であった。そして、さらに、変異型ｚΔＮｐ６３α（Ｇ５０６Ａ）を過剰発現させた受精卵（Ｇ５０６Ａ）からの胚は、サリドマイド存在下でも、大半の個体が影響なしであり、残りも軽度であり、この結果は、サリドマイド非存在下と同等であった。

（３） ｚΔＮｐ６３α ｍＲＮＡを導入していない受精卵（−）、野生型のｚΔＮｐ６３α ｍＲＮＡ（ＷＴ）を導入した受精卵（ＷＴ）を使用し、それぞれ、前記（１）と同様にして、胚を発生させた。そして、４８時間後の外観を、背面と側面とから確認した。この結果を、図３（ｄ）に示す。図において、上段は、背面の写真、中段は、側面の写真、下段は、中段で確認されるひれの拡大写真であり、矢頭は、ひれを示す。図に示すように、受精卵（−）からの胚は、サリドマイド存在下、ひれが欠損したのに対して、ｚΔＮｐ６３α（ＷＴ）を過剰発現させた受精卵（ＷＴ）からの胚は、サリドマイド存在下でも、サリドマイド非存在下と同様にひれの発生が確認できた。

［実施例４］
前記ｐ６３スプライシングバリアント（ＴＡｐ６３α）の分解が、サリドマイドによる耳小胞（耳）の催奇形性に関与しているかを確認した。

（１） ゼブラフィッシュにおいて、ゼブラフィッシュＴＡｐ６３α（ｚＴＡｐ６３α）は、耳小胞の発生に必須であることが知られている。そこで、ｚＴＡｐ６３α ｍＲＮＡを導入していない受精卵（−）、ｚＴＡｐ６３α ｍＲＮＡを導入した受精卵（ｚＴＡｐ６３α）を使用し、それぞれ、前記実施例３（１）と同様にして、サリドマイド非存在下（−）または４００μｍｏｌ／Ｌサリドマイド存在下、胚を発生させ、７２時間後の外観を確認した。この結果を、図４（ａ）に示す。図において、左の２列は、ゼブラフィッシュの側面の写真であり、右の２列は、耳小胞付近を拡大した写真である。また、耳小胞の直径を測定し、各群の平均値から相対値を求めた。これらの結果を、図４（ｂ）に示す。前記相対値は、サリドマイド非存在下（−）で発生させた受精卵（−）からの胚における耳小胞の直径を１として算出し、平均±Ｓ．Ｄ（* ｐ＜0.001）とした。図４（ａ）、（ｂ）に示すように、ｚＴＡｐ６３αを過剰発現させていないゼブラフィッシュ（−）は、サリドマイド存在下では、耳小胞の大きさが、サリドマイド非存在下と比較して小さかった。これに対して、ｚＴＡｐ６３αを過剰発現させたゼブラフィッシュ（ｚＴＡｐ６３α）は、サリドマイド存在下であっても、サリドマイド非存在下と同様に耳小胞が発達した。つまり、サリドマイド存在下において、ｚＴＡｐ６３αは分解されるが、これを過剰発現させると、ｚＴＡｐ６３αが補充されるため、補充されたｚＴＡｐ６３αの機能によって、耳小胞が発達したといえる。

（２） さらに、感覚ニューロンおよび蝸牛殻の発生に必須とされている転写因子Ａｔｏｈ１の発現を確認した。前記（１）と同様にして発生させた４８時間の胚について、in situハイブリダイゼーションを行った。この結果を、図４（ｃ）に示す。図に示すように、ｚＴＡｐ６３αを過剰発現させていないゼブラフィッシュ（−）は、サリドマイド存在下では、Ａｔｏｈ１の発現が消失した。これに対して、これに対して、ｚＴＡｐ６３αを過剰発現させたゼブラフィッシュ（ｚＴＡｐ６３α）は、サリドマイド存在下であっても、サリドマイド非存在下と同様にＡｔｏｈ１が発現した。

（３） ｚＴＡｐ６３α ｍＲＮＡを導入していない受精卵（−）、野生型のｚＴＡｐ６３α ｍＲＮＡ（ＷＴ）を導入した受精卵（ＷＴ）、変異型のｚＴＡｐ６３α ｍＲＮＡ（ｄｒＴＡｐ６３αＧ５９９Ａ、配列番号４）を導入した受精卵（Ｇ５９９Ａ）を使用し、それぞれ、前記（１）と同様にして、胚を発生させ、耳小胞の大きさについて相対値を算出した。これらの結果を、図４（ｄ）に示す。図に示すように、受精卵（−）からの胚は、サリドマイド存在下では、耳小胞の大きさが、サリドマイド非存在下に対して半分以下となった。これに対して、ｚＴＡｐ６３α（ＷＴ）を過剰発現させた受精卵（ＷＴ）からの胚は、サリドマイド存在下、サリドマイド非存在下での耳小胞の大きさと同等に発達した。そして、さらに、変異型ｚＴＡｐ６３α（Ｇ５９９Ａ）を過剰発現させた受精卵（Ｇ５９９Ａ）からの胚は、サリドマイド存在下でも、サリドマイド非存在下と同等であり、且つ、受精卵（−）からの胚よりも、耳小胞は大きく発達した。

以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。

本発明によれば、ｐ６３スプライシングバリアントを分解できることから、例えば、ｐ６３スプライシングバリアントが原因となる疾患の治療に有用である。

本発明によれば、ＣＲＢＮタンパク質とサリドマイドとの複合体による前記ｐ６３スプライシングバリアントの分解を抑制する物質をスクリーニングができる。また、本発明によれば、前記ｐ６３スプライシングバリアントが分解されることが原因となるサリドマイド関連疾患を治療できる。

Claims (24)

1. ＣＲＢＮタンパク質またはそのペプチド断片と、サリドマイドまたはサリドマイド類縁体とを含むことを特徴とする、ｐ６３スプライシングバリアントの分解剤。
2. 前記ＣＲＢＮタンパク質またはそのペプチド断片と、前記サリドマイドまたはサリドマイド類縁体と複合体を形成している、請求項１記載の分解剤。
3. 前記スプライシングバリアントが、Ｖａｒｉａｎｔ １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１または２に記載の分解剤。
4. 前記ＣＲＢＮが、ヒトＣＲＢＮである、請求項１から３のいずれか一項に記載の分解剤。
5. ｐ６３スプライシングバリアントに、請求項１から４のいずれか一項に記載のｐ６３スプライシングバリアントの分解剤を接触させる接触工程を含むことを特徴とする、ｐ６３スプライシングバリアントの分解方法。
6. 前記接触工程を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで行う、請求項５に記載の分解方法。
7. 動物において、前記接触工程を行う、請求項５または６に記載の分解方法。
8. 前記動物が、ヒト、または、非ヒト動物である、請求項７に記載の分解方法。
9. 請求項１から４のいずれか一項に記載のｐ６３スプライシングバリアントの分解剤を含むことを特徴とするｐ６３スプライシングバリアント関連疾患に対する医薬組成物。
10. 前記ｐ６３スプライシングバリアント関連疾患が、がんである、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 前記がんが、膵臓がん、皮膚がん、および頭頸部扁平上皮がんからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 請求項９から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与する工程を含むことを特徴とするｐ６３スプライシングバリアント関連疾患の治療方法。
13. 投与対象が、ヒト、または非ヒト動物である、請求項１２に記載の治療方法。
14. ｐ６３スプライシングバリアント関連疾患の治療に使用するための、ＣＲＢＮタンパク質またはそのペプチド断片と、サリドマイドまたはサリドマイド類縁体との複合体。
15. 請求項１から４のいずれか一項に記載のｐ６３スプライシングバリアントの分解剤を含むことを特徴とする幹細胞の分化制御剤。
16. 請求項１５に記載の幹細胞の分化制御剤を投与する工程を含むことを特徴とする幹細胞の分化制御方法。
17. 投与対象が、ヒト、または非ヒト動物である、請求項１６に記載の分化制御方法。
18. 幹細胞の分化制御に使用するための、ＣＲＢＮタンパク質またはそのペプチド断片と、サリドマイドまたはサリドマイド類縁体との複合体。
19. 候補物質と、ＣＲＢＮタンパク質またはそのペプチド断片と、サリドマイドまたはサリドマイド類縁体と、ｐ６３スプライシングバリアントとを共存させ、前記ｐ６３スプライシングバリアントの分解の抑制を検出する工程、および、
    前記ｐ６３スプライシングバリアントの分解を抑制した候補物質を、分解抑制物質として選択する工程を含むことを特徴とする、ｐ６３スプライシングバリアントの分解抑制物質のスクリーニング方法。
20. 前記スプライシングバリアントが、Ｖａｒｉａｎｔ １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１９に記載のスクリーニング方法。
21. 前記検出工程において、ＣＲＢＮタンパク質またはそのペプチド断片と、サリドマイドまたはサリドマイド類縁体とを、複合体として共存させる、請求項１９または２０に記載のスクリーニング方法。
22. 前記ＣＲＢＮが、ヒトＣＲＢＮである、請求項１９から２１のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
23. 請求項１９から２２のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により、ｐ６３スプライシングバリアントの分解抑制物質を選択し、前記分解抑制物質を、サリドマイド関連疾患の有効候補物質として選択することを特徴とする、サリドマイド関連疾患の有効候補物質のスクリーニング方法。
24. 請求項１９から２２のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により、ｐ６３スプライシングバリアントの分解抑制物質を選択し、前記分解抑制物質を、幹細胞の分化制御の有効候補物質として選択することを特徴とする、幹細胞の分化制御の有効候補物質のスクリーニング方法。