JP2020534868A - ハイスループットシークエンシングに基づくオリゴヌクレオチド配列不純物の分析方法及び使用 - Google Patents
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Abstract
Description
検査対象のオリゴヌクレオチド配列の3’末端にpolyテールを付加して、polyテールが付加された生成物を得るステップ1)と、
前記polyテールが付加された生成物に対して逆方向伸長・増幅を行い、逆方向伸長・増幅生成物を得るステップ2)であって、
前記逆方向伸長・増幅に使用されるプライマーは、前記検査対象のオリゴヌクレオチドと伸長用プライマーからなり、
前記伸長用プライマー配列は、順次に配列2の第1−22位に示されるDNA分子と、N個の塩基A、塩基T、塩基C又は塩基Gとからなり、前記Nは6以上の整数であるステップ2)と、
前記逆方向伸長・増幅生成物を沈降させ、沈殿生成物を得るステップ3)と、
前記沈殿生成物に対して、末端修復、Aテール付加、リンガー接続及びPCR増幅を順次に行い、ハイスループットシークエンシングライブラリーを得るステップ4)と、を含む。
検査対象のオリゴヌクレオチド配列の3’末端にpolyテールを付加する前記方法は、具体的には、以下のとおりである。ターミナルトランスフェラーゼ 1.5μL、検査対象のオリゴヌクレオチド 1μL、dATP(又はdTTP、dCTP又はdGTP)(25μM) 0.5μL、5×TdT Buffer 4μL及びヌクレアーゼフリー水を均一に混合して、反応系(全体積20μL)を得る。反応系における前記検査対象のオリゴヌクレオチドの最終濃度は5μMである。
3a)逆方向伸長・増幅生成物に酢酸ナトリウム、無水エタノール及びグリコーゲンを加える。
3b)遠心分離して、上澄み液を捨てて、沈降物を収集する。
3c)前記沈降物にエタノールを加え、遠心分離して、上澄み液を捨てて、沈降物を収集する。
前記ステップ3a)では、逆方向伸長・増幅生成物に1/10体積の酢酸ナトリウム、2.5倍体積の無水エタノール及びグリコーゲン1μLを加え、前記酢酸ナトリウムのpHは5.2であり、前記グリコーゲンの濃度は20mg/mLであり、
前記ステップ3b)では、前記遠心分離の条件として、12000rpm、4℃で30分間遠心分離し、
前記ステップ3c)では、前記遠心分離条件として、12000rpm、4℃で5分間遠心分離し、前記エタノールは、80体積%のエタノールであり、
前記ステップ3a)と前記ステップ3b)との間には、−80℃で30分間放置するステップをさらに含み、前記ステップ3c)は1回繰り返される。
上記方法では、ステップ4)において、前記沈殿生成物に対して末端修復、Aテール付加、リンガー接続及びPCR増幅を順次に行う方法は、具体的には、以下のとおりである。
4b)前記修復生成物にリンガーを付加して、リンガーが付加された生成物を得る。
4c)前記リンガーが付加された生成物に対してPCR増幅を行い、増幅生成物として、オリゴヌクレオチド配列不純物を分析するハイスループットシークエンシングライブラリーを得る。
a1)上記伸長用プライマー
a2)a1)の前記伸長用プライマーを含むPCR試薬
a3)a1)の前記伸長用プライマー又はa2)の前記PCR試薬を含むキット。
上記方法によってオリゴヌクレオチド配列不純物を分析するためのハイスループットシークエンシングライブラリーを構築するステップ(1)と、
前記ハイスループットシークエンシングライブラリーに対してハイスループットシークエンシングを行い、シークエンシング結果に基づいてヌクレオチド配列成分を分析するステップ(2)と、を含む。
溶質及びその濃度:900mM MgCl2、30mM DTT、10mM ATP、1μg/μL BSA及び4mM dNTPs
溶媒:pH8.3、Tris−HCl緩衝液500mM。
ハイスループットシークエンシングに基づくオリゴヌクレオチド配列不純物の分析方法
一、オリゴヌクレオチドへのpolyテール付加
1、オリゴヌクレオチド配列の3’末端にpoly Aテールを付加する際に、表1に記載の各試薬及び添加量でテール付加反応系を調製した。オリゴヌクレオチド配列は、5’−CAGAGCAGCTTGTCTTTCTTC−3’(配列5)である。オリゴヌクレオチド配列は上海捷瑞生物工程有限公司により合成される。
2、37℃で25min反応させた。
3、70℃で10min反応させ、ターミナルトランスフェラーゼを不活性化させた。
1、上記ステップ一で得られた反応生成物に表2に示される各試薬を加えて、逆方向伸長・増幅系を調製した。
伸長用プライマーextpT配列は、以下のとおりである。
5’−GAGACACGAATAGACGGCACGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT−3’(配列1)。
2、ステップ1で調製された逆方向伸長・増幅系をPCR装置に入れて、表3に示される反応プログラムを行った。
1、ステップ二で得られた生成物に、1/10体積の酢酸ナトリウム(pH5.2)、2.5倍体積の無水エタノール及び濃度20mg/mLのグリコーゲン1μLを加えた。
2、−80℃で30分間放置した。
3、12000rpm、4℃で30分間遠心分離し、上澄みを捨てて、沈降物を収集した。
4、沈降物に80%エタノール1mLを加え、次に、12000rpm、4℃で5分間遠心分離し、上澄みを捨てて、沈降物を収集した。
5、ステップ4を1回繰り返した。
6、室温で乾燥し、TE 30μLを加えて溶解した。
7、沈殿生成物の品質を検査した。ステップは、具体的には、以下のとおりである。12%PAGEゲルを調製して、200V電気泳動を40分間行い、カセットにおいて10分間染色し、ゲルイメージングシステムにて結像して写真を撮る。電気泳動検査結果を図2に示した。
1、表4における各試薬及び添加量で末端修復反応系を調製した。調製後、均一に混合して、瞬時遠心を行った。
2、ステップ1における末端修復反応系に対してPCR装置において表5に示されるプログラムを行った。
1、表6における各試薬及び添加量でリンガー接続反応系を調製した。調製後、均一に混合して、瞬時遠心を行った。
上記Y型リンガーは、UAFとAI5とからなり、その配列がそれぞれ以下のとおりである。
UAF(下線で表記された塩基にチオ修飾を行う):5−AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT;
AI5(下線で表記された塩基にリン酸修飾を行う):5−GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACAGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG。
上記Y型リンガー配列は、すべて上海捷瑞生物工程有限公司により合成されものであえる。リンガー接続反応系におけるリンガーの濃度はすべて1.6μMである。
2、リンガー接続反応系をPCR装置に入れて16℃で2時間反応させ、リンガー接続生成物を得た。
1、Ampure XP磁気ビーズ(ベックマン・コールター株式会社製のAgencourt AMPure XP Kit、製品のカタログ番号A63880)を振とうさせて、十分に均一に混合した。
2、上記ステップ五で得られた連結生成物に1×のAmpure XP磁気ビーズを加え、ピペットを用いて10回均一に混合し、室温で1分間放置した。
3、マグネットスタンドに入れて5分間吸着させ、上澄みを捨てた。
4、磁気ビーズに調製されたばかりの80%エタノール200μLを加えて、室温で30s放置し、上澄みを捨てた。
5、上記ステップ4を1回繰り返した。
6、濃度10mM Tris−Hcl(pH8.0)を50μL加えて溶出し、上澄みを新しい遠心分離管に移した。
7、1倍体積の磁気ビーズを加えて、ピペットを用いて10回均一に混合し、室温で1分間放置した。
8、磁気ビーズに調製されたばかりの80%エタノール200μLを加えて、室温で30s放置し、上澄みを捨てた。
9、上記ステップ8を1回繰り返した。
10、蓋を開けて室温で10分間放置した。
11、濃度10mM Tris−Hcl(pH8.0)50μLを加え、ピペットを用いて均一に混合し、室温で1分間放置した。
12、マグネットスタンドで5分間放置し、上澄みを別の遠心分離管に移し、精製後のリンガー接続生成物を得た。
1、精製後のリンガー接続生成物に表7に記載の各試薬を加え、添加量を表7に示すようにし、PCR増幅系を調製した。
プライマーmPF配列は、以下のとおりである(上海捷瑞生物工程有限公司により合成される):AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT;
プライマーmRPI5配列は、以下のとおりである(上海捷瑞生物工程有限公司により合成される):CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。上記プライマー配列では、下線で表記される塩基にチオ修飾が行われた。
2、45μL/本でPCR管に分注し、次に連結生成物5μLを加えた。
3、PCR増幅系をPCR装置に入れて、表8に示されるPCR反応プログラムに従って増幅を行い、PCR増幅生成物を得た。PCR増幅生成物についてゲル電気泳動検査を行い、結果を図3に示した。
1、上記電気泳動に必要なバンドを切り取り、上海捷瑞生物工程有限公司製のアガロースゲルDNA回収キット(遠心カラム型、GK2042−50)を用いてゲルを回収した。
2、ゲルにBinding Solution 400μLを加えて、50℃のウォーターバス に入れ、塊状ゲルを溶解した。
3、その間に2分間おきに1回振動させた。
4、溶解した塊状ゲルをシリカゲルカラムに移し替え、室温で2分間放置し、6000回転/分で1分間遠心分離し、廃液を捨てた。
5、シリカゲルカラムに Washing Solution 500μLを加えて、室温で3分間放置した。
6、12000回転/分で1分間遠心分離し、廃液を捨てた。
7、ステップ6を1回繰り返した。
8、12000回転/分で1分間遠心分離し、シリカゲルカラムを別の1.5mL遠心分離管に移し替えた。
9、シリカゲルカラムにヌクレアーゼフリー水30μLを加えて、室温で2分間放置した。
10、12000回転/分で1分間遠心分離し、上澄み液を収集して、精製後のPCR増幅生成物を得た。精製後のPCR増幅生成物に対して電気泳動検査を行い、結果を図4に示し、M:20bp DNA Ladder;1:ライブラリーゲル回収生成物であり、図から明らかなように、ハイスループットシークエンシングライブラリーを得ることに成功した。
1、ハイスループットシークエンシング
ステップ八で構築されたライブラリーに対して、Hiseq 3000プラットフォーム用の単一末端150bpシークエンシングモードでシークエンシングを行った。
2、ハイスループットシークエンシング結果分析
trimmomatic−0.33ソフトウェア(trimmomatic−0.33ソフトウェアのウェブサイト:https://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic)を使用して、リード3’末端の低品質の塩基を除去し、自作されるperスクリプトExtractValid.plによりリンガーを含有する順方向シークエンシングのリードを抽出し、cutadapt1.2.1ソフトウェア(cutadapt1.2.1ソフトウェアのウェブサイト:https://github.com/marcelm/cutadapt/releases/tag/v1.2.1)を用いてリードにおけるPolyAリンガーを除去し、自作されるperスクリプトFilterTN.plによりN及びPolyTリンガーを含有するリードを除去し、自作されるperlスクリプトtrim_polytail.plにより、末端ではdNTPの不純さにより加えられるエラー塩基を含むPolyテールを除去し、自作されるperlスクリプトFastQ_ReadFilterByLength.plにより長すぎる又は短すぎるリードを濾過により除去し、FASTX Toolkit 0.0.13ソフトウェア(FASTX Toolkit 0.0.13ソフトウェアのウェブサイト:https://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)におけるfastx_collapserモジュールを用いて反復配列をマージし、1つだけあるリードを除去した。下記式によりオリゴヌクレオチドの各成分の純度を算出した。各成分割合(%)=この成分のリード数/各成分のリード数の和×100%。
結果を表9及び図5に示した。結果から分かるように、得られた9664589本のオリゴヌクレオチド配列のうち、オリゴヌクレオチド配列(CAGAGCAGCTTGTCTTTCTTC)と完全にマッチするオリゴヌクレオチド配列は合計7830352本であり、その割合が81.02%である。オリゴヌクレオチド配列に比べて、5’末端で配列の一部が欠損したオリゴヌクレオチド配列は、合計1331990本であり、その割合が13.78%であり、オリゴヌクレオチド配列に比べて、3’末端では配列の一部が欠損したオリゴヌクレオチド配列は、合計144439本であり、その割合が1.49%であり、オリゴヌクレオチド配列に比べて、5’末端及び3’末端ともに配列の一部が欠損したオリゴヌクレオチド配列は、合計18697本であり、その割合が0.19%であり、いくつかの(たとえば、挿入、欠損、エラー塩基の混入など)のオリゴヌクレオチド配列では、合計339111本であり、その割合が3.51%である。上記結果から明らかなように、本発明に係る方法は、オリゴヌクレオチド配列における各成分の含有量及びその割合を正確かつ網羅的に分析できた。
注:オリゴヌクレオチド配列はCAGAGCAGCTTGTCTTTCTTCである。
3、データ分析
まず、ncbi−blast−2.2.28+ソフトウェア(ncbi−blast−2.2.28+ソフトウェアのウェブサイト:https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.2.28/)を使用して、オリゴヌクレオチド基準配列と比較し、自作されるスクリプトにより比較結果を解析し、解析的結果を標準化し、次に標準化した結果を分類し、最後に、分類した結果を統計した。
含有量が0.1%より大きい成分及び含有量の分析結果を表10に示した。N−1のリード数とN+1のリード数の分析結果を表11及び表12に示した。表には、含有量が0.1%よりも大きい各成分のオリゴヌクレオチド配列及びその含有量、N−1のリード数及びN+1のリード数における各成分の含有量及び割合が示されている。
注:オリゴヌクレオチド配列はCAGAGCAGCTTGTCTTTCTTCである。
注:オリゴヌクレオチド配列はCAGAGCAGCTTGTCTTTCTTCである。
Claims (13)
- オリゴヌクレオチド配列不純物を分析するためのハイスループットシークエンシングライブラリーの構築方法であって、
検査対象のオリゴヌクレオチド配列の3’末端にpolyテールを付加して、polyテールが付加された生成物を得るステップ1)と、
前記polyテールが付加された生成物に対して逆方向伸長・増幅を行い、逆方向伸長・増幅生成物を得るステップ2)であって、
前記逆方向伸長・増幅に使用されるプライマーは、前記検査対象のオリゴヌクレオチドと伸長用プライマーとからなり、
前記伸長用プライマー配列は、順次に配列2の第1−22位に示されるDNA分子と、N個の塩基A、塩基T、塩基C又は塩基Gとからなり、前記Nは6以上の整数である、ステップ2)と、
前記逆方向伸長・増幅生成物を沈降させ、沈殿生成物を得るステップ3)と、
前記沈殿生成物に対して末端修復、Aテール付加、リンガー接続及びPCR増幅を順次に行い、ハイスループットシークエンシングライブラリーを得るステップ4)とを含む、
方法。 - 前記伸長用プライマー配列が配列1、配列2、配列3又は配列4に示されるDNA分子であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記伸長用プライマー配列が配列1に示されるDNA分子であることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが一本鎖DNA又は二本鎖DNAであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが一本鎖DNAであることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドの長さが8−120bpであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- a1)請求項1に記載の伸長用プライマー
a2)a1)の前記伸長用プライマーを含むPCR試薬
a3)a1)の前記伸長用プライマー又はa2)の前記PCR試薬を含むキット、のうちのいずれか1つである、
製品。 - 前記PCR試薬における前記伸長用プライマーの最終濃度が0.1−100μMであることを特徴とする、請求項7に記載の製品。
- オリゴヌクレオチド配列不純物を分析するためのハイスループットシークエンシングライブラリーの構築における、請求項7又は8に記載の製品の使用。
- オリゴヌクレオチド配列不純物の分析における、請求項7又は8に記載の製品の使用。
- オリゴヌクレオチド配列不純物の分析方法であって、
請求項1−6のいずれか1項に記載の方法により、オリゴヌクレオチド配列不純物を分析するためのハイスループットシークエンシングライブラリーを構築するステップ(1)と、
前記ハイスループットシークエンシングライブラリーに対してハイスループットシークエンシングを行い、シークエンシング結果に基づいてオリゴヌクレオチド配列成分を分析するステップ(2)とを含む、
方法。 - 人工的に合成される遺伝子治療用のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド配列成分の分析における、請求項11に記載の方法の使用。
- 人工的に合成される遺伝子治療用のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド配列中の各成分の純度及び/又は含有量の分析における、請求項11に記載の方法の使用。
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