JP2020534838A - イムノアッセイプラットフォームでの分析のための細胞ベースのアッセイを最適化するための分泌レポーターペプチド - Google Patents

イムノアッセイプラットフォームでの分析のための細胞ベースのアッセイを最適化するための分泌レポーターペプチド Download PDF

Info

Publication number
JP2020534838A
JP2020534838A JP2020517522A JP2020517522A JP2020534838A JP 2020534838 A JP2020534838 A JP 2020534838A JP 2020517522 A JP2020517522 A JP 2020517522A JP 2020517522 A JP2020517522 A JP 2020517522A JP 2020534838 A JP2020534838 A JP 2020534838A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
sequence
sequence identity
detection
nos
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2020517522A
Other languages
English (en)
Other versions
JP7476097B2 (ja
Inventor
トービー、マイケル
ラルマン、クリストフ
バレット、ブノワ
ファン、ルー
Original Assignee
スワール ライフ サイエンス エービー
スワール ライフ サイエンス エービー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by スワール ライフ サイエンス エービー, スワール ライフ サイエンス エービー filed Critical スワール ライフ サイエンス エービー
Publication of JP2020534838A publication Critical patent/JP2020534838A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7476097B2 publication Critical patent/JP7476097B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6867—Replicase-based amplification, e.g. using Q-beta replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、応答要素、ＴＡＴＡボックス、シグナルペプチド、抗体を生成できるアンカー配列と検出配列、及びポリＡ鎖に機能的に連結されている、特定の細胞内分子又は細胞表面分子との相互作用後に分析される薬理活性物質によって誘導される１つ又は複数の転写因子によって活性化される、応答要素を含む長さ１５〜１５０アミノ酸の小さい分泌レポーターペプチドに関する。アンカー配列はペプチドごとに異なる場合があり、又は複数の分泌レポーターペプチドに共通であるため、すべてのペプチドは、例えばＨＲＰで標識された検出抗体を使用したＥＬＩＳＡによって、又は一般的に利用可能な免疫検出プラットフォーム、例えばＭＳＤ、Ｇｙｒｏｓ、ＡｌｐｈａＬｉｓａ、Ｂｉａｃｏｒｅの使用によって、同時に分析することができる。検出配列は、各分泌レポーターペプチドに固有であり、ＭＳＤプラットフォームでペプチドの検出を可能にするスルホタグ、又はＧｙｒｏｓプラットフォームでの検出を可能にするＡｌｅｘａ、又はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＡｌｐｈａＬＩＳＡプラットフォームでの検出を可能にするジゴキシゲニンで標識することができ、又はＢｉａｃｏｒｅプラットフォームでのＳＰＲによる検出のために標識なしのままにすることができる。本発明は、自動免疫検出プラットフォームを使用した分析のための細胞ベースのアッセイの大幅な改善を提供し、複数の検体の同時分析、単一細胞培養からの複数のサンプリングを可能とし、自動化された免疫検出プラットフォームでの分析前に細胞を溶解し、遠心分離によって細胞破片を除去する必要がなくなる。本発明はまた、細胞ベースのアッセイのダイナミックレンジ、感度を高め、コストを削減する手段を提供し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子などのレポーター遺伝子を含む細胞などの既存の操作された細胞株に適用することができ、複数の分子構築体を含む細胞株を広範囲に再設計する必要性がなくなる。

Description

本発明は、新規なシステム、及び小さい化学物質及び大きいタンパク質ベースの生物医薬品を含む薬理学的に活性な分子の活性を決定する方法におけるその使用に関する。本発明によるシステムを使用して、小さい化学物質のライブラリをスクリーニングし、小さい合成薬、大きいタンパク質ベースのバイオ医薬品、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入遺伝子、又はＣＡＲ‐Ｔ細胞を含む細胞療法の効力を定量化し、バイオ医薬品、ＡＡＶベクター、ＡＡＶ導入遺伝子、又はＣＡＲ‐Ｔ細胞を含む細胞療法に対する中和抗体応答、及び容易に自動化できるイムノアッセイプラットフォームを使用した治療抗体又はＦｃ融合タンパク質のエフェクター細胞機能を定量化することができる。本発明によるシステムは、診断の環境で使用され得るキット又はパーツのキットで使用され得る。重要なことに、本発明によるシステムは、小さい合成薬、大きい治療用タンパク質、組換え又は天然のＡＡＶ導入遺伝子、ＣＡＲ‐Ｔ細胞を含む細胞療法の使用、又は治療用抗体又はＦｃ融合タンパク質、又は治療用タンパク質、治療用抗体、ＡＡＶベクター、ＡＡＶ導入遺伝子、又は養子療法で使用される細胞によって誘発される免疫応答に基づいて治療の有効性を決定するために使用でき、これはエフェクター細胞機能の誘導の場合に有利であり、又は免疫寛容の中断や抗薬物抗体の産生の場合には不利であり得る。
細胞ベースのアッセイは、小さい化学物質又は大きいタンパク質ベースのバイオ医薬品にかかわらず、薬理学的に活性な物質の活性を検出及び定量化するために必要である。したがって、細胞ベースのアッセイは、薬物発見、効力アッセイ、タンパク質ベースのバイオ医薬品に対する中和抗体、及び補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などの抗体媒介エフェクター機能の評価に使用される。組換え生物医薬品の繰り返し投与は、免疫寛容の破壊（１）及び抗薬物抗体（ＡＤＡ）の産生につながる。薬物動態、薬力学、バイオアベイラビリティ、及び有効性に悪影響を与えることに加えて、ＡＤＡは免疫複合体疾患、アレルギー反応、場合によっては重度の自己免疫反応も引き起こす可能性がある。特定のタイプのＡＤＡは、タンパク質治療薬の活性を中和する場合もある。中和抗体（ＮＡｂ）は、タンパク質の活性部位内又は活性部位の近くのエピトープに直接結合するか、細胞表面受容体への薬物の結合を妨げるエピトープに結合することにより、生物医薬品の生物活性をブロックする。中和抗薬物抗体の開発は、特定の形態の癌及び自己免疫又は多発性硬化症又は関節リウマチなどの炎症性疾患を含む慢性疾患の治療において特に関心が持たれている。ＡＤＡは、患者が治療に反応しなくなる結果をもたらす可能性があり、ＥＰＯやトロンボポエチンなどの必須の非冗長内因性タンパク質と交差反応するＮＡｂの場合、生命を脅かす可能性さえある（２，３）。薬物誘発性免疫グロブリンＩｇＥ抗体は、重篤なアナフィラキシ‐反応を引き起こす可能性もある（４）。ＡＤＡはまた、治療中止後も長期間持続する可能性があり、それにより同じ薬物によるその後の治療が制限される（５）。したがって、免疫原性の評価は、前臨床試験と臨床試験の両方における薬物安全性評価の重要な要素である。規制当局は、中和抗薬物抗体を検出及び定量化するために、研究中の薬物の作用機序を可能な限り密接に反映する細胞ベースのアッセイの使用を推奨している。しかし、細胞ベースのアッセイは標準化が難しく、自動化を容易に受け入れられない。
例えば、国際公開第２０１５／１０８７６３号は、転写因子の結合に応答する応答要素、分泌酵素骨格、及び抗体の特異的結合の認識領域を含む少なくとも１つのレポーターを含むタンパク質レポーターシステムに関する。転写因子の結合、アッセイ及び活性の定量化のための多重化アッセイについても説明する。これらのアッセイは、必要な定量化を達成するために必要に応じて、セット、ライブラリ、又はその他のグループでタンパク質レポーターを使用する。この文献は、多重化アッセイの再現性、正確性、堅牢性を可能にしているようである。
欧州特許第１８６２８０１号は、レポーター遺伝子アッセイ、具体的にはそれに関連する方法に関する。具体的には、この文献の方法は、第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグをコードする遺伝子を含むレポーター遺伝子が転写因子の認識配列及び転写開始に必要なヌクレオチド配列に下流で連結されているベクターを有する細胞を、試験物質、第１のエピトープを認識する検出抗体、及び第２のエピトープを認識する抗体と接触させ；第１及び第２のエピトープに結合し、互いに接近する検出抗体の両方によって引き起こされる現象を検出し；検出された現象を転写調節機構に対する試験物質の効果と相関させることに関すると思われ、ここで第１のエピトープ及び第２のエピトープは、それらの認識検出抗体が結合すると、両方の検出抗体が互いに接近できるように配置される。この文献は、転写活性をより簡単に、迅速に、より正確に（つまり、より高い精度とより少ない干渉で）測定できるように思われる。
Tannous, B. A., et al., Biotech. Adv. 2011, 29, pp. 997‐1003は、体液で検出される分泌レポーターの使用に関するものであり、生体内の生体プロセスのエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）リアルタイムモニタリングにおける明らかにシンプルで有用なツールである。文献によると、細胞溶解が検出に必要であると思われる。
化学物質のスクリーニングライブラリ、医薬品開発と製造の両方における効力アッセイ、及び免疫原性研究では、多くの場合、自動化されたアッセイの使用を必要とする数百又は数千の個々のサンプルのテストが必要である。出願人は、レポーター遺伝子細胞株を再設計したり、機器を変更したりする必要がなく、創薬、化学及び製造管理（ＣＭＣ）におけるバイオ医薬品の効力の定量化、中和抗薬物抗体の検出、又はＣＤＣ、ＡＤＣＣ、又はＡＤＣＰなどの免疫媒介エフェクター細胞機能の定量化（ＥＰ１７１６５５０２）（これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に使用するための、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ電気化学発光（ＭＳＤ‐ＥＣＬ）、Ｌｕｍｉｎｅｘ、ＳＭＣ、Ａｌｐｃｏ、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ、Ｇｙｒｏｓ、又はＳＰＲ Ｂｉａｃｏｒｅなどのイムノアッセイプラットフォームでルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを含む細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイを分析することを可能にする発明を以前に記載した。
それにもかかわらず、細胞ベースのアッセイの使いやすさと性能をさらに改善したいという要望が常にある。複数の検体の同時分析を可能にし、単一の細胞培養から複数のサンプリングを可能にし、そして細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイの使用に比べて、ダイナミックレンジの拡大、感度の向上、コストの削減に加えて、自動化免疫検出プラットフォームでの分析の前に、細胞を溶解し、遠心分離によって細胞破片を除去する必要性を排除するアッセイを有することが望ましいだろう。
その結果、本発明は、以下の技術的利点の少なくとも１つを提供する：
ｉ）自動免疫検出プラットフォームでの分析の前に、細胞を溶解し、遠心分離によって細胞破片を除去する必要がなくなる、単一細胞培養からの複数サンプリングを可能にする複数の分析物の同時分析、
ｉｉ）ダイナミックレンジの拡大、
ｉｉｉ）感度の向上、
ｉｖ）細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイの使用に比べてのコストの削減。
一態様では、本発明は、
ｉ）自動免疫検出プラットフォームでの分析の前に、細胞を溶解し、遠心分離によって細胞破片を除去する必要がなくなる、単一細胞培養からの複数サンプリングを可能にする複数の分析物の同時分析、
ｉｉ）ダイナミックレンジの拡大、及び
ｉｉｉ）感度の向上
を提供できるアッセイの提供の問題を解決することに関する。
モデル分泌レポーターペプチド。 この図は一連のモデル分泌レポーターペプチドを示し、これらはシグナルペプチドに作動可能に連結されたＴＡＴＡボックスの上流の応答要素を含み、それぞれは、個々のペプチドに固有の認識配列、各レポーターペプチドに共通であるか、又はペプチドごとに異なり得るアンカー配列、及びポリＡ配列を保持している。
モデル分泌レポーターペプチド この図は本発明による２つのモデル分泌レポーターペプチドを示し、それぞれＣＭＶ構成的プロモーターの制御下にあり、それぞれインターフェロンα２をコードする遺伝子に由来し、２つのペプチドのそれぞれに特異的な認識配列に作動可能に連結されているシグナルペプチドを保持する。配列番号１によってコードされるペプチド番号１はｃ‐Ｍｙｃ認識配列を含み、配列番号２によってコードされるペプチド番号２は水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧカプシドタンパク質に由来する認識配列を保持する。認識配列は、ブルータンウイルスのＶ５タンパク質に由来するアンカーペプチド（アンカータグ）とポリＡ鎖に作動可能に連結されている。アンカーペプチドに対する抗体は、ビオチン標識されており、ストレプトアビジン被覆ＥＬＩＳＡプレートに付着する。検出ペプチドは、ＥＬＩＳＡで検出するために西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識されている。
モデルレポーターペプチドの発現の分析 ＨＥＫ２９３細胞は、図２Ａに示される、配列番号１及び配列番号２によってコードされる２つのペプチドで一時的にトランスフェクトされた。細胞上清を１８時間後に回収し、２つのペプチドの発現をＶ５アンカー配列に特異的なビオチン標識抗体とｃ‐ＭＹＣ又はＶＳＶ Ｇタンパク質に特異的なＨＲＰ標識検出抗体を使用した架橋ＥＬＩＳＡで定量化した。
キメラプロモーターの制御下にある分泌レポーターペプチド この図は、ｇａｌ４上流活性化配列（ＵＡＳ）の５倍タンデムリピート及びインターフェロンα２をコードする遺伝子由来のシグナルペプチド、ｃ‐Ｍｙｃ認識配列、ブルータンウイルスのＶ５タンパク質に由来するペプチド（アンカータグ）、及び（配列番号３）によってコードされるポリＡ鎖に作動可能に連結されたＴＡＴＡボックスからなるシス作用性キメラ調節配列の制御下にある本発明によるレポーターペプチドを示す。
分泌レポーターペプチドを使用したＦＧＦ‐２１活性の定量化。 ＨＥＫ２９３細胞を、配列番号３によりコードされ、図３の凡例に記載される本発明による分泌レポーターペプチド、及び動物細胞に存在しない合成ＤＮＡ結合ドメインに融合し、レポーターペプチドのｇａｌ４ ＵＡＳシス作用性調節配列に結合できるＥｌｋ‐１のトランス活性化ドメインを含むキメラ転写因子のための発現ベクター、並びにチロシンキナーゼＦＧＦＲ１ｃ受容体鎖及びβクロトー（β−Ｋｌｏｔｈｏ）共受容体タンパク質をウミシイタケルシフェラーゼ正規化遺伝子とともに含む細胞表面結合ヘテロ二量体受容体タンパク質のための発現ベクターで同時トランスフェクトした。安定したクローン細胞株を単離し、ＦＧＦ‐２１の応答性について特徴付けした。分泌レポーターペプチドを含む組換え細胞をＦＧＦ‐２１で処理し、細胞上清を１８時間後に回収し、ストレプトアビジン被覆マイクロタイターアッセイプレートに結合したＶ５アンカー配列に特異的なビオチン標識付着抗体及びｃ‐Ｍｙｃに特異的なＨＲＰ標識検出抗体を使用して、架橋ＥＬＩＳＡでペプチドの発現を定量した。
分泌レポーターペプチドを使用したＶＥＧＦ活性の定量。 ＨＥＫ２９３細胞を、配列番号３によりコードされ、図３の凡例に記載される本発明による分泌レポーターペプチド、及び動物細胞には存在しない合成ＤＮＡ結合ドメインに融合し、分泌レポーターペプチドのｇａｌ４ ＵＡＳシス作用性調節配列に結合できるＥｌｋ‐１のトランス活性化ドメインを含むキメラ転写因子のための発現ベクター、及びウミシイタケルシフェラーゼ正規化遺伝子とともに細胞表面結合ＶＥＧＦＲ２受容体のための発現ベクターで同時トランスフェクトした。安定したクローン細胞株を単離し、ＶＥＧＦの応答性について特徴付けした。分泌レポーターペプチドを含む組換え細胞をＶＥＧＦで処理し、１８時間後に上清を回収し、ストレプトアビジン被覆アッセイプレートに付着したＶ５アンカー配列に特異的なビオチン標識付着抗体及びｃ‐Ｍｙｃに特異的なＨＲＰ標識検出抗体を使用して架橋ＥＬＩＳＡでレポーターペプチドの発現を定量した。
レポーターペプチドの無標識検出を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラム。 ＨＥＫ２９３細胞は、配列番号１によりコードされ、図２Ａに示されるペプチド番号１で一時的にトランスフェクトされた。１８時間後に細胞上清を回収し、Ｖ５アンカー配列に特異的で、レポーターペプチドを含む細胞上清の注入後、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００ ＳＰＲ機器のストレプトアビジン被覆金センサー表面に固定したビオチン標識付着抗体を使用してレポーターペプチドの発現を定量した。
レポーターペプチドの無標識検出を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムの拡大スケール。 図５Ａに示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムの一部のスケールを拡大して、ストレプトアビジン被覆金センサー表面に付着したビオチン標識抗Ｖ５抗体アンカー抗体へのレポーターペプチド番号１の特異的結合をより明確に示した。
発明の概要
本発明は、上述の問題を解決し、容易に自動化できる免疫検出プラットフォームを使用した分析のための細胞ベースのアッセイの大幅な改善を提供し、複数の分析物の同時分析、単一細胞培養からの複数サンプリングを可能とし、自動化された免疫検出プラットフォームでの分析に先立って細胞を溶解し、遠心分離によって細胞破片を除去する必要を回避する。本発明はまた、細胞ベースのアッセイのダイナミックレンジ、感度を増加させ、コストを削減する手段を提供する。
したがって、本発明は、特定の細胞内又は細胞表面分子との相互作用の後に、分析される薬理活性物質によって誘導される、１つ又は複数の転写因子によって活性化される応答要素を含む長さ１５〜１５０アミノ酸の小さい分泌レポーターペプチドに関する。レポーターペプチドの応答要素のすぐ下流には、細胞内のペプチド、シグナルペプチドの効率的な転写を可能にするＴＡＴＡボックスがあり、これは、抗体を産生させることができるアンカー配列及び検出配列とともに、ペプチドの効率的な分泌を細胞内で発現したときに確実にするものであり、後者の３つの要素は細胞内の効率的な翻訳を確実にするために、ポリアデニル化配列（ポリＡ鎖）に機能的に結合している。アンカー配列（アンカータグ）はペプチドごとに異なる場合があるが、複数のレポーターペプチドに共通する場合もあるため、ＥＬＩＳＡにより、又はＭＳＤ、Ｇｙｒｏｓ、ＡｌｐｈａＬｉｓａ、若しくはＢｉａｃｏｒｅなどの一般的に入手できる免疫検出プラットフォームの使用により、すべてのペプチドを同時に検出することができる。本発明のさらなる実施形態において、アンカー配列は、ペプチドがストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート又は他のストレプトアビジン被覆表面に直接付着することを可能にするストレプトアビジン結合タンパク質をコードし、抗体がアンカー配列に対して生じる必要性を排除している。検出シーケンス（検出タグ）はペプチドごとに異なるため、各検出シーケンスに特異的な抗体を使用して各ペプチドを同時に検出することができる。各検出抗体は、一般に入手可能な免疫検出プラットフォームの１つを使用して検出できるように標識されている。したがって、検出配列のそれぞれに対する抗体は、例えばＭＳＤプラットフォームでペプチドの検出を可能にするスルホタグ（Ｓｕｌｆｏ‐Ｔａｇ）、又はＧｙｒｏｓプラットフォームでの検出を可能にするＡｌｅｘａ、又はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＡｌｐｈａＬＩＳＡプラットフォームでの検出を可能にするジゴキシゲニンにより、Ｆｃ部分で標識されている。Ｂｉａｃｏｒｅシステムを使用したＳＰＲの場合、検出抗体は必要ない。
本発明は細胞にも関する。特に、本発明は、本発明によるレポーターペプチドを含む細胞に関する。細胞は、任意の起源のものであってよく、特に、哺乳類又は鳥類の細胞であり得る。重要なことに、細胞は、異なる調節配列及び認識配列を含む第２の又は複数のレポーターペプチドをさらに発現する場合がある。本発明による細胞は、動物又は鳥類を含む任意の起源のものであってよく、天然又は組換えの初代細胞、例えばＣＡＲ‐Ｔ細胞、又は例えばＪｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ、ＨＥＫ２９３、ＫＨＹＧ‐１、ＤＴ‐４０細胞、又はＭＳＢ‐１のような当技術分野で知られている任意の細胞株であり得る。
本発明は、キット又はパーツのキットにも関する。キットには以下が含まれる：
ｉ）本発明による細胞；
及び
ｉｉ）ビオチン化されていてもいなくてもよいアンカー配列に対する抗体；及び
ｉｉｉ）ＭＳＤプラットフォームでのペプチドの検出を可能にするスルホタグ、又はＧｙｒｏｓプラットフォームでの検出を可能にするＡｌｅｘａ、又はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＡｌｐｈａＬＩＳＡプラットフォームでの検出を可能にするジゴキシゲニンで標識された又は標識されていない、又はＢｉａｃｏｒｅプラットフォームを用いるＳＰＲ若しくは他のＳＰＲプラットフォームによる検出のために標識なしのままの、検出配列に対する抗体；
及び
ｉｖ）ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート又はＳＰＲチップなどの他のストレプトアビジン被覆表面。
キットはまた、１つ又は複数のバイアル、例えばアッセイ準備が整った凍結細胞の２つ以上のバイアルなどを含むことができる。
一態様では、本発明は、ペプチドがシグナルペプチド及び／又はアンカーとして作用する、本明細書に開示されるペプチドに関する。
本発明のさらなる態様では、シグナルペプチドとアンカーは異なる。さらなる態様において、シグナルペプチド及び／又はアンカーペプチドは、本明細書に開示される配列によるものであり得る。なおさらなる態様において、シグナルペプチド及び／又はアンカーペプチドは、配列が異なるという条件で、本明細書に開示される配列によるものである。したがって、本発明によれば、上記の検出ペプチド及び／又はアンカーは、配列番号４〜７のいずれか１つから選択することができる。
上述のように、一態様では、検出ペプチドはアンカーペプチドとは異なる。したがって、シグナルペプチドは、配列番号４〜７のいずれか１つから選択することができ、一方アンカーペプチドは、シグナルペプチドがアンカーペプチドとは異なるという条件で、配列番号４〜７のいずれか１つから選択することができる。
一態様では、検出及び／又はアンカーペプチドは、配列番号４に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を含む任意のペプチド配列、又は配列番号４と同一の配列を含む配列であり得る。
一態様では、検出及び／又はアンカーペプチドは、配列番号５に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の同一性を含む任意のペプチド配列、又は配列番号５と同一の配列を含む配列であり得る。
一態様では、検出及び／又はアンカーペプチドは、配列番号６に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を含む任意のペプチド配列、又は配列番号６と同一の配列を含む配列であり得る。
一態様では、検出及び／又はアンカーペプチドは、配列番号７に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を含む任意のペプチド配列、又は配列番号７と同一の配列を含む配列であり得る。
本発明はまた、ポリヌクレオチドに関する。
一態様では、本発明は、配列番号１〜３の配列のいずれか１つであり得るポリヌクレオチドに関する。
一態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を含む任意のＤＮＡ配列、又は配列番号１と同一の配列を含む配列であり得る。
一態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号２に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を含む任意のＤＮＡ配列、又は配列番号２と同一の配列を含む配列であり得る。
一態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号３に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を含む任意のＤＮＡ配列、又は配列番号３と同一の配列を含む配列であり得る。
本発明はまた、薬物、小分子、大型生物医薬品、ＡＡＶ導入遺伝子、細胞療法の活性、又はタンパク質ベースの薬物、ＡＡＶベクター、ＡＡＶ導入遺伝子、又は細胞療法に対する抗体応答、又は治療用抗体、Ｆｃ融合タンパク質、又は治療薬で治療された患者からの臨床サンプルにおけるエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）での細胞療法のエフェクター細胞機能を定量化する方法に関する。
この方法は以下のステップを含むことができる：
ａ）治療を受けている患者から得られたサンプルを本発明による細胞と接触させるステップ、
ｂ）本発明による細胞から培養上清を採取するステップ、
ｃ）ＥＬＩＳＡ又は一般的に利用可能な免疫分析プラットフォームでサンプルを分析するステップ。
本明細書で使用されるレポーターペプチドという用語は、応答要素（又は上流活性化配列）、ＴＡＴＡボックス、シグナルペプチド、アンカータグ及び検出タグの１つ又は複数を含むことを意図している。
本明細書で使用するポリアデニル化配列（ポリＡ）という用語は、細胞内のペプチドの効率的な翻訳を保証するために必要であるが、一般的であり翻訳ペプチドの一部ではないアデニンの配列を意味することを意図している。ポリＡ配列は、ＳＶ４０又は他のポリＡ配列、例えばｈＧＨ、ＢＧＨ、又はｒｂＧｌｏｂからのものであり得る。
発明の詳細な説明
本発明は、酵素活性を欠く小さい分泌レポーターペプチドに関し、したがって、細胞内で発現される場合、培養条件及び他の外部因子による影響が少なく、ルシフェラーゼレポーター遺伝子、他の酵素検出システム、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、又はアルカリホスファターゼなどの従来のレポーター遺伝子とは対照的に、基質の活性の違いによる影響を受けない。本発明は、特定の細胞内又は細胞表面分子との相互作用の後に分析される薬理活性物質によって誘導され、細胞内でのペプチドの効率的な転写を可能にするＴＡＴＡボックス、細胞内で発現されたときにペプチドの効率的な分泌を保証するシグナルペプチド、抗体を産生できるアンカー及び検出配列、及び細胞内の効率的な翻訳を保証するポリアデニル化配列に操作可能に連結された、１つ又は複数の転写因子によって活性化される応答要素を含む長さ１５〜１５０アミノ酸の小さい分泌レポーターペプチドに関する。アンカー配列は、細胞タンパク質と交差反応せず、ブルータンウイルス由来のＶ５タンパク質などの抗体が市販されているペプチドをコードするか、又は細胞タンパク質との配列相同性が最小限で、免疫原性があり、配列番号４から７に示すようなペプチドに対する抗体を産生できると予測される新規の独自のペプチドをコードし得る。検出配列は、ＶＳＶ Ｇカプシドタンパク質などのペプチド又は抗体が容易に市販されているｃ‐Ｍｙｃ癌原遺伝子、又は細胞タンパク質との配列相同性が最小限で、免疫原性があり、配列番号４から７に示すようなペプチドに対する抗体を産生できると予測される新規の独自のペプチドをコードする。配列番号４から７に示す配列はアンカー配列又は検出配列のいずれかとして用いることができる。
さらに、上記から明らかなように、レポーターペプチドは、上記の検出配列とアンカー配列の両方に関連する配列を含む。一態様では、検出配列及びアンカー配列は異なり、交換可能であり得る。すなわち、１つの配列に対する抗体をアンカー又は検出抗体として使用することができる。
アンカー配列（アンカータグ）は、ペプチドごとに異なる場合があり、又は、ＥＬＩＳＡによって、又はＭＳＤ、Ｇｙｒｏｓ、ＡｌｐｈａＬｉｓａ、又はＢｉａｃｏｒｅなどの一般的に利用可能な免疫検出プラットフォームの一つを使用して、すべてのペプチドを同時に検出できるように共通している場合がある。Ｇｙｒｏｓプラットフォームテクノロジーは、ナノリットルのマイクロフルイディクスと、レーザー活性化蛍光に基づく検出システムを組み込むように設計されたＣＤを使用した、毛管作用の遠心制御の使用に基づいている。Ｇｙｒｏｓプラットフォームを使用した免疫原性アッセイは架橋ＥＬＩＳＡに基づいており、これは、ビオチンで標識された治療用抗体（モノクローナル又はポリクローナル）の１分子、及びＡｌｅｘａなどの蛍光マーカーで標識された治療用抗体（モノクローナル又はポリクローナル）のもう一つの分子からなる薬物の２分子間の架橋の形成により抗薬物抗体が検出されるものである。サンプル中の抗薬物抗体の存在は、Ａｌｅｘａ標識薬物分子をビオチン標識薬物分子に結合させる架橋を形成し、それが今度はストレプトアビジン被覆ビーズに結合する。Ａｌｅｘａ標識結合薬物から放出される蛍光は、次いでレーザーによる活性化後に定量化される。あるいは、治療用抗体の効力は、治療用抗体に特異的な、ビオチンで標識された抗薬物抗体ペアと、２つの抗薬物抗体分子（モノクローナル又はポリクローナル）の間に架橋を形成する薬物を検出するＡｌｅｘａを使用して定量化することができる。各Ｇｙｒｏｓ ＡＤＡアッセイには、異なる二重標識薬物ペアが必要である。対照的に、本発明によれば、単一の共通アンカー配列を異なる分析物の検出用の複数のレポーターペプチドに使用して、単一の捕捉抗体、モノクローナル又はポリクローナル、を使用して、すべてのレポーターペプチドを固定することができる。本発明のさらなる実施形態において、アンカー配列は、ペプチドがストレプトアビジン被覆Ｇｙｒｏｓビーズに直接付着することを可能にするストレプトアビジン結合タンパク質をコードし、抗体がアンカー配列に対して生じる必要性を排除する。検出配列のそれぞれに対する抗体は、ＰＣＲ搭載プレートの異なるウェルを使用することにより、Ｇｙｒｏｓプラットフォーム上の複数の分析物の検出を可能にするＡｌｅｘａでＦｃ部分に標識されている。
ＭＳＤプラットフォームテクノロジーは、電気化学発光の使用と、捕捉抗体に結合した分析物を検出するスルホタグ標識抗体に基づいた検出システムに基づいており、この捕捉抗体が今度は埋設電極とともに炭素又は金被覆９６ウェルプレートに結合する。ＭＳＤプラットフォームを使用した免疫原性アッセイは、２分子の薬物間の架橋の形成によって抗薬物抗体が検出される架橋ＥＬＩＳＡに基づいている。ここで２分子の薬物の一つはビオチンで標識され、ストレプトアビジン被覆金プレートに結合しており、もう一つの薬物分子はスルホタグで標識されている。サンプル中の抗薬物抗体の存在は、スルホタグ標識薬物分子をビオチン標識薬物分子に結合させる架橋を形成し、それが今度はストレプトアビジン被覆プレートに結合する。次に、スルホタグで標識された結合薬物から発せられる光信号が定量化される。あるいは、治療抗体の効力は、ビオチン、及び２つの抗薬物抗体分子（モノクローナル又はポリクローナル）間の架橋を形成する薬物を検出するスルホタグで標識された、治療抗体に特異的な、抗薬物抗体ペアを使用して定量化することができる。各ＭＳＤ ＡＤＡアッセイには、異なる二重標識薬物ペアが必要である。対照的に、本発明によれば、単一の抗体、モノクローナル又はポリクローナル、をすべての分泌レポーターペプチドに使用できるように、単一の共通アンカー配列を、異なる分析物の検出用の複数のレポーターペプチドに使用することができる。本発明のさらなる実施形態では、アンカー配列はストレプトアビジン結合タンパク質をコードし、ペプチドをストレプトアビジン被覆ＭＳＤプレートに直接付着させることを可能にし、アンカー配列に対して抗体を生じさせる必要性を排除する。各検出配列に対する抗体は、ＭＳＤアッセイプレートの異なるウェルを使用することにより、ＭＳＤプラットフォーム上の複数の検体の検出を可能にするスルホタグでＦｃ部分に標識されている。
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＡｌｐｈａＬＩＳＡソリューションＥＬＩＳＡプラットフォームテクノロジーは、ストレプトアビジン被覆ドナービーズとジゴキシゲニン標識アクセプタービーズに基づく検出システムの使用に基づいており、ここでＡＤＡはストレプトアビジン被覆ドナービーズに付着したビオチン標識薬物とジゴキシゲニン標識アクセプタービーズとの間に架橋を形成する。標識薬物ＡＤＡ複合体は、抗ジゴキシゲニン‐ＨＲＰコンジュゲートと発光シグナルの定量を使用して検出される。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ ＡＤＡアッセイごとに、異なる二重標識薬物ペアが必要である。対照的に、本発明によれば、単一の抗体、モノクローナル又はポリクローナル、をすべての分泌レポーターペプチドに使用できるように、単一の共通アンカー配列を異なる分析物の検出用の複数の分泌レポーターペプチドに使用できる。本発明のさらなる実施形態では、アンカー配列はストレプトアビジン結合タンパク質をコードし、これがペプチドをストレプトアビジン被覆ドナービーズに直接付着させることを可能にし、アンカー配列に対して抗体を産生する必要性を排除する。検出配列のそれぞれに対する抗体は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡプラットフォームで複数の分析物を検出することを可能にするジゴキシゲニン‐ＨＲＰでＦｃ部分に標識されている。
Ｂｉａｃｏｒｅプラットフォームは、生体分子相互作用をリアルタイムで標識なしで検出できる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の使用に基づいている。ビオチン標識アンカー抗体をＢｉａｃｏｒｅ機器のストレプトアビジン被覆金センサー表面に固定し、分泌レポーターペプチドでトランスフェクトした細胞の上清を含むサンプルを表面に注入する。次いで、偏光をセンサー表面に向け、最小強度の反射光の角度を検出する。これにより、プラズモンと呼ばれる電子電荷密度波が生成され、センサー表面の質量に比例して、共鳴角と呼ばれる特定の角度で反射光の強度が低下する。この角度は、分子が結合及び解離するにつれて変化し、したがって相互作用プロファイルはセンサーグラムにリアルタイムで記録される。例４に示された実験の結果は、レポーターペプチドの発現が、Ｂｉａｃｏｒｅ無標識検出システムを使用して容易に定量化できることを示している。
本発明のさらなる実施形態では、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むものなどの既存のレポーター遺伝子細胞株を、既存のレポーター遺伝子からの干渉なしにレポーターペプチドの１つ又は複数と同時トランスフェクトすることができる。これにより、既存のレポーター遺伝子細胞株、特に例３及び４に記載されているレポーター遺伝子細胞株などの複数の分子構築物を含むものを再設計する必要がなくなる。
本発明のさらなる実施形態では、細胞は、異なる応答要素及び検出配列、並びに同じ又は異なるアンカー配列をそれぞれ含む複数のレポーターペプチドでトランスフェクトすることができ、したがって、複数の薬理学的に活性な物質を同時に検出し、生物活性を一般的に利用可能な免疫検出プラットフォームを使用して自動化された方法で分析することを可能にする。前記分泌レポーターペプチドはまた、併用療法で使用される異なる薬理学的に活性な物質間の相互作用を決定するために使用することができる。さらに、分泌レポーターペプチドは、一般的に利用可能な免疫検出プラットフォームを使用した自動化された方法で、適切な標的細胞の存在下で、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、及び補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）などの治療用抗体又はＦｃ融合タンパク質のエフェクター細胞機能を定量化するためにも使用できる。前記ペプチドはまた、一般に利用可能な免疫検出プラットフォームを使用する自動化された方法で、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及び１つ以上の特定のＡＡＶ導入遺伝子に対する効力及び中和抗体応答を定量化するために使用できる。
本発明は細胞にも関する。特に、本発明は、本発明による分泌レポーターペプチドを含む細胞に関する。細胞は任意の起源のものであってよく、Ｔ又はＢリンパ球などの初代細胞、単球又はナチュラルキラー細胞、又はＣＡＲ‐Ｔ細胞などの遺伝子改変初代細胞、特にヒト、動物、又は鳥類細胞のいずれかであってよい。重要なことに、細胞は、異なる調節配列及び認識配列を含む第２又は複数のレポーターペプチドをさらに発現する場合がある。本発明による細胞はまた、例えば、ヒト細胞株、Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ、ＨＥＫ２９３、ＫＨＹＧ１、又はマウス細胞株ＲＡＷ２６４．７、又はＤＴ‐４０やＭＳＢ‐１などの鳥類細胞株のような当該分野で公知の任意の細胞株であり得る。
さらなる態様において、本発明は、アッセイにおける本発明による細胞の使用に関し、ここでアッセイは、自動化されたアッセイ又は任意の他の自動化された診断設定であり得る。
本発明は、キット又はパーツのキットにも関する。キットは以下を含むことができる：
ｉ）本発明による細胞；
及び
ｉｉ）ビオチン化されていてもいなくてもよいアンカー配列に対する抗体；
及び
ｉｉｉ）ＭＳＤプラットフォームでのペプチドの検出を可能にするスルホタグ、又はＧｙｒｏｓスプラットフォームでの検出を可能にするＡｌｅｘａ、又はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＡｌｐｈａＬＩＳＡプラットフォームでの検出を可能にするジゴキシゲニンで標識された又は標識されていない、又はＢｉａｃｏｒｅプラットフォームでのＳＰＲによる検出のために標識なしのままの、検出配列に対する抗体；
及び
ｉｖ）ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート又はストレプトアビジン被覆ビーズ、又はストレプトアビジン被覆ＳＰＲチップ。
キットはまた、１つ又は複数のバイアル、例えばアッセイ準備が整った凍結細胞の２つ以上のバイアル等を含むことができる。
本発明はまた、薬物、小分子、大型生物医薬品、ＡＡＶ導入遺伝子、又はＣＡＲ‐Ｔ細胞などの細胞療法の活性；又はタンパク質ベースの薬物、又はＡＡＶウイルスベクター又はＡＡＶ導入遺伝子、又はＣＡＲ‐Ｔ細胞などの細胞療法に対する抗体反応；又は治療用抗体又はＦｃ融合タンパク質、又は治療用抗体、Ｆｃ融合タンパク質、又は細胞療法で治療された患者からの臨床サンプルにおけるエクスビボでの細胞療法のエフェクター細胞機能を定量化する方法に関する。
この方法は以下のステップを含んでもよい：
ａ）治療を受けている患者から得られたサンプルを本発明による細胞と接触させるステップ
ｂ）適切な時間の後に上清を回収するステップ
ｃ）アンカー抗体及び検出抗体の追加のステップ
ｄ）ＥＬＩＳＡにより又は適切なイムノアッセイプラットフォームでのサンプルの分析のステップ。
要約すると、本発明は、応答要素、ＴＡＴＡボックス、シグナルペプチド、抗体を生成できるアンカー配列及び検出配列、及びポリＡ鎖に機能的に連結された、特定の細胞内又は細胞表面分子との相互作用の後に分析される薬理活性物質によって誘導される１つ又は複数の転写因子によって活性化される、応答要素を含む、長さ１５〜１５０アミノ酸の小さい分泌レポーターペプチドに関する。アンカー配列はペプチドごとに異なり得るか、又は、複数の分泌レポーターペプチドに共通であることもあり、ＥＬＩＳＡにより、又はＭＳＤ、Ｇｙｒｏｓ、ＡｌｐｈａＬｉｓａ、又はＢｉａｃｏｒｅなどの一般的に利用可能な免疫検出プラットフォームを使用して、すべてのペプチドを同時に分析することができる。検出配列は、各分泌レポーターペプチドに固有であり、ＭＳＤプラットフォームでペプチドの検出を可能にするスルホタグ、Ｇｙｒｏｓプラットフォームでの検出を可能にするＡｌｅｘａ、又はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＡｌｐｈａＬＩＳＡプラットフォームでの検出を可能にするジゴキシゲニンで標識するか、又はＢｉａｃｏｒｅプラットフォームでのＳＰＲによる検出のために標識なしのままにすることができる。本発明は、自動免疫検出プラットフォームを使用した分析のための細胞ベースのアッセイの大幅な改善を提供し、複数の検体の同時分析、単一細胞培養からの複数のサンプリングを可能とし、自動化された免疫検出プラットフォームでの分析前に細胞を溶解し、遠心分離によって細胞破片を除去する必要がなくなる。本発明はまた、細胞ベースのアッセイのダイナミックレンジ、感度を高め、コストを削減する手段を提供し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子などのレポーター遺伝子を含む細胞などの既存の操作された細胞株に適用することができ、ルシフェラーゼ活性を定量化するためのルシフェラーゼ基質の必要性、及び複数の分子構築物を含む細胞株を広範囲に再設計する必要性がなくなる。
例１
ＨＥＫ２９３細胞に、図２Ａに示す２つの分泌レポーターペプチドを同時トランスフェクトした。各ペプチドは構成的プロモーターの制御下にあり、インターフェロンα２シグナルペプチドを保持する。また、各ペプチドは、ブルータンウイルスのＶ５タンパク質（アンカータグ）に由来するペプチドと、２つのペプチドの一方又は他方に特異的な認識配列を保持している。配列番号１によってコードされるペプチド番号１はｃ‐Ｍｙｃ認識配列を含み、配列番号２によってコードされるペプチド番号２は水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧカプシドタンパク質に由来する認識配列を保持する。アンカーペプチドに対する抗体は、ビオチン標識されており、ストレプトアビジン被覆ＥＬＩＳＡプレートに付着するようになっている。検出ペプチドに対する抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識されている。両方のペプチドによるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションの１８時間後に培養上清を収集し、ストレプタビジン被覆マイクロタイターアッセイプレートに結合したブルータンＶ５タンパク質（ＡｂＣａｍカタログ番号ａｂ１８６１７）に対するビオチン標識モノクローナル抗体及びＨＲＰ標識抗ｃ‐Ｍｙｃ（ＡｂＣａｍ、カタログ番号ａｂ１２６１）及びＨＲＰ標識抗ＶＳＶ Ｇタンパク質（ＡｂＣａｍカタログ番号ａｂ３５５６）検出抗体からなる架橋ＥＬＩＳＡを使用して分析した。実験の結果は、各ペプチド間又は他の分泌ペプチド又はタンパク質との交差反応なしに、培養上清で両方のレポーターペプチドを容易に検出できることを明確に示している（図２Ｂ）。
例２
ＨＥＫ２９３細胞を、ｇａｌ４上流活性化配列（ＵＡＳ）の５倍タンデムリピート、及びインターフェロンα２をコードする遺伝子に由来するシグナルペプチド、ｃ‐Ｍｙｃ認識配列、ブルータンウイルスのＶ５タンパク質に由来するペプチド（アンカータグ）、及びポリＡ鎖に作動可能に連結されたＴＡＴＡボックスからなるシス作用性キメラ調節配列の制御下で、配列番号３によりコードされる本発明による分泌レポーターペプチドで同時トランスフェクトした（図３）。細胞は、分泌レポーターペプチドのｇａｌ４ ＵＡＳシス作用性調節配列に結合できる合成ＤＮＡ結合ドメインに融合したＥｌｋ‐１のトランス活性化ドメインを含むキメラ転写因子の発現ベクター、及びウミシイタケルシフェラーゼ正規化遺伝子とともに、チロシンキナーゼＦＧＦＲ１ｃ受容体鎖とβクロトー共受容体タンパク質を含む細胞表面結合ヘテロ二量体受容体タンパク質の発現ベクターで同時トランスフェクトされた（図４）。安定したクローン細胞株を単離し、ＦＧＦ‐２１の応答性について特徴付けた。分泌レポーターペプチドを含む組換え細胞を組換えＦＧＦ‐２１で処理し、１８時間後に細胞上清を回収し、ストレプトアビジン被覆マイクロタイターアッセイプレートに結合されたＶ５アンカー配列に特異的なビオチン標識付着抗体、及びｃ‐Ｍｙｃに特異的なＨＲＰ標識検出抗体を用いた架橋ＥＬＩＳＡでペプチドの発現を定量した。
例３
ＨＥＫ２９３細胞を、ｇａｌ４上流活性化配列（ＵＡＳ）の５倍タンデムリピート、及びインターフェロンα２をコードする遺伝子に由来するシグナルペプチド、ｃ‐Ｍｙｃ認識配列、ブルータンウイルスのＶ５タンパク質に由来するペプチド（アンカー配列）、及びポリＡ鎖に作動可能に連結されたＴＡＴＡボックスからなるシス作用性キメラ調節配列の制御下で、本発明による分泌レポーターペプチドで同時トランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞はまた、レポーターペプチドのｇａｌ４ ＵＡＳシス作用性調節配列に結合することができる合成ＤＮＡ結合ドメインに融合したＥｌｋ‐１のトランス活性化ドメインを含むキメラ転写因子の発現ベクター、及び細胞表面結合ＶＥＧＦＲ２受容体タンパク質の発現ベクターで、ウミシイタケルシフェラーゼ正規化遺伝子とともに、同時トランスフェクトされた（図５）。安定したクローン細胞株を単離し、ＶＥＧＦの応答性について特徴付けした。分泌レポーターペプチドを含む組換え細胞を、組換えＶＥＧＦで処理し、１８時間後に上清を回収し、分泌レポーターペプチドの発現を、ストレプトアビジン被覆アッセイプレートに結合しているＶ５アンカー配列に特異的なビオチン標識付着抗体、及びｃ‐Ｍｙｃに特異的なＨＲＰ標識検出抗体を用いた架橋ＥＬＩＳＡで定量化した。
例４
ＨＥＫ２９３細胞を、図２Ａに示される配列番号３によりコードされる分泌レポーターペプチド番号１で一時的にトランスフェクトした。細胞上清を１８時間後に回収し、分泌レポーターペプチドの発現を、ＳＰＲを使用して定量化した。ビオチン標識抗Ｖ５抗体をＢｉａｃｏｒｅ ３０００機器のストレプトアビジン被覆金センサー表面に固定し、分泌レポーターペプチドでトランスフェクトした細胞の上清を含むサンプルを表面に注入した。
参考文献
1. Tovey, M.G., In Detection and Quantification of antibodies to biopharmaceuticals: Practical and Applied Considerations.（バイオ医薬品に対する抗体の検出と定量における：実用的及び応用上の考慮事項。）Editor, Michael G Tovey, John Wiley & Sons Inc; New York. pp 1‐11, 2011.
2. Casadevall, ., et al N. Eng. J. Med. 346 :469‐475, 2002
3. Li J. et al Blood, 98 :3241‐3248, 2001
4. Chung C.H. et al Eng. J. Med. 358 :1109‐1117, 2008
5. Philips, J.T. Arch. Neurol. 64:386‐387, 2010
特定の実施形態では、本発明は以下の項目にも関する：
１．１つ以上の転写因子が結合でき、ＴＡＴＡボックスに作動可能に連結された応答要素、抗体を産生できるシグナルペプチド、アンカー及び検出配列、及びポリアデニル化配列を含むポリヌクレオチドであって、その発現が
分析物と特異的に相互作用する細胞内又は細胞表面分子を有する細胞において、細胞上清へのレポーターペプチドの分泌、及びＥＬＩＳＡ又は一般的に利用可能な免疫検出プラットフォームを使用した分析後の、定量化できる分析物の活性に比例し、ここで、免疫検出プラットフォームは
‐ＥＬＩＳＡ
‐ＭＳＤ
‐ジャイロ（Ｇｙｒｏｓ）
‐アルファライザ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）
‐ＳＰＲ-バイアコア（ＳＰＲ-Ｂｉａｃｏｒｅ）
‐又は同様の免疫検出プラットフォーム
である、上記ポリヌクレオチド。
２．各々が異なる応答要素をコードし、各々が細胞内又は細胞表面分子と分析物との相互作用に続いて、異なる薬理学的に活性な分析物によって活性化される項目１の１つ以上のポリヌクレオチド、及び各ポリペプチドに固有の検出配列でトランスフェクトされた細胞であって；
本発明による細胞は、Ｔ又はＢリンパ球などの初代細胞、ＣＡＲ‐Ｔ細胞などの天然又は組換えのヒト又は動物起源の単球又はナチュラルキラー細胞、又は当技術分野で知られている任意の細胞株、例えばヒトＪｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ、ＨＥＫ２９３、ＫＨＹＧ１、又はマウスＲＡＷ２６４．７、又はＤＴ‐４０やＭＳＢ‐１などの鳥類細胞株、又はレポーター遺伝子を単独で又は他の組換え成分と一緒に含有する細胞株のような以前に確立された改変細胞株である、上記細胞。
３．各々が異なる応答要素をコードし、各々が細胞内又は細胞表面分子と分析物との相互作用に続いて、異なる薬理学的に活性な分析物によって活性化される本発明による１つ以上のポリヌクレオチド、及び各ポリペプチドに固有の検出配列でトランスフェクトされた細胞を含むキット。本発明は、キット又はパーツのキットにも関する。キットは以下を含むことができる：
ｉ）本発明による細胞；
及び
ｉｉ）ビオチン化されていてもいなくてもよいアンカー配列に対する抗体；
及び
ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡによる検出のためにＨＲＰ又はＭＳＤプラットフォームでの分泌レポーターペプチドの検出を可能にするスルホタグ、又はＧｙｒｏｓプラットフォームでの検出を可能にするＡｌｅｘａ、又はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＡｌｐｈａＬＩＳＡプラットフォームでの検出を可能にするジゴキシゲニンで標識された又は標識されていない、又はＳＰＲによる分析用のために標識なしの、検出配列に対する抗体；
及び
ｉｖ）ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート、又はストレプトアビジン被覆ビーズ、又はストレプトアビジン被覆ＳＰＲチップ
キットはまた、１つ又は複数のバイアル、例えば本発明によるアッセイ準備の整った凍結細胞の２つ以上のバイアル等を単独で又は凍結バイアルに含まれるアンカー抗体及び検出抗体と一緒に含むこともできる。
４．薬物、小分子、大型生物医薬品、ＡＡＶ導入遺伝子、又はＣＡＲ‐Ｔ細胞などの細胞療法の活性；又は、タンパク質ベースの薬物、又はＡＡＶウイルスベクター又はＡＡＶ導入遺伝子、又はＣＡＲ‐Ｔ細胞などの細胞療法に対する抗体反応；又は、治療用抗体又はＦｃ融合タンパク質、又は治療用抗体、Ｆｃ融合タンパク質、又は細胞療法で治療された患者からの臨床サンプルにおけるエクスビボでの細胞療法のエフェクター細胞機能を定量化する方法；
‐ここで、該方法は以下のステップを含んでもよい；
‐治療を受けている患者から得られたサンプルを、本発明による細胞と接触させるステップ、
‐適切な時間後に上清を回収するステップ、
‐アンカー抗体及び検出抗体の追加のステップ、
‐ＥＬＩＳＡによる又は適切なイムノアッセイプラットフォームでのサンプルの分析のステップ。
配列番号４：＜２２３＞人工配列
配列番号５：＜２２３＞人工配列
配列番号６：＜２２３＞人工配列
配列番号７：＜２２３＞人工配列

Claims (24)

  1. ｉ）１つ又は複数の転写因子を結合できる応答要素であって、該応答要素はＴＡＴＡボックスに連結されている応答要素、及び
    ｉｉ）抗体が産生されるレポーター／シグナルペプチド、アンカー配列、及び検出配列をコードする、
    ｉｉｉ）及びポリアデニル化配列
    を含むポリヌクレオチド。
  2. 分析物と特異的に相互作用する細胞内又は細胞表面分子を有する細胞において、前記ポリヌクレオチド配列の発現が、定量される分析物の活性に比例する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 分析物の活性の定量化が、細胞上清へのレポーター／シグナルペプチドの分泌の検出によって行われる、請求項１〜２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  4. 応答要素が、配列番号１〜３に示される配列のいずれか１つ、又は配列番号１〜３と少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号１〜３に対して７９％の配列同一性、例えば配列番号１〜３に対して８５％の配列同一性、例えば配列番号１〜３に対して９０％の配列同一性、例えば配列番号１〜３に対して９５％の配列同一性、例えば配列番号１〜３に対して９７％の配列同一性、例えば配列番号１〜３に対して９８％の配列同一性、例えば配列番号１〜３に対して９９％の配列同一性を有する配列、又は配列番号１〜３に示される配列を含むか、又はそれからなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  5. 応答要素が、配列番号１に示される配列のいずれか１つ、又は配列番号１に対して少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号１に対して７９％の配列同一性、例えば配列番号１に対して８５％の配列同一性、例えば配列番号１に対して９０％の配列同一性、例えば配列番号１に対して９５％の配列同一性、例えば配列番号１に対して９７％の配列同一性、例えば配列番号１に対して９８％の配列同一性、例えば配列番号１に対して９９％の配列同一性を有する配列、又は配列番号１に示される配列を含むか、又はそれからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  6. 応答要素が、配列番号２に示される配列のいずれか１つ、又は配列番号２に対して少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号２に対して７９％の配列同一性、例えば配列番号２に対して８５％の配列同一性、例えば配列番号２に対して９０％の配列同一性、例えば配列番号２に対して９５％の配列同一性、例えば配列番号２に対して９７％の配列同一性、例えば配列番号２に対して９８％の配列同一性、例えば配列番号２に対して９９％の配列同一性を有する配列、又は配列番号２に示される配列を含むか、又はそれからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  7. 応答要素が、配列番号３に示される配列のいずれか１つ、又は配列番号３に対して少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号３に対して７９％の配列同一性、例えば配列番号３に対して８５％の配列同一性、例えば配列番号３に対して９０％の配列同一性、例えば配列番号３に対して９５％の配列同一性、例えば配列番号３に対して９７％の配列同一性、例えば配列番号３に対して９８％の配列同一性、例えば配列番号３に対して９９％の配列同一性を有する配列、又は配列番号３に示される配列を含むか、又はそれからなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  8. レポーターペプチドが、配列番号４〜７に示される配列のいずれか１つ、又は配列番号４〜７配列に対する少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号４〜７に対して７９％の配列同一性、例えば配列番号４〜７に対して８５％の配列同一性、例えば配列番号４〜７に対して９０％の配列同一性、例えば配列番号４〜７に対して９５％の配列同一性、例えば配列番号４〜７に対して９７％の配列同一性、例えば配列番号に対して９８％の配列同一性、例えば配列番号４〜７に対して９９％の配列同一性を有する配列を含むか、又はそれからなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  9. レポーターペプチドがアンカー配列及び検出配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  10. レポーターペプチドが異なるアンカー配列及び検出配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  11. レポーターペプチドが、同一又は異なるアンカー配列及び検出配列であって、配列番号４〜７に示される配列のいずれか１つ、又は配列番号４〜７に対して少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号４〜７に対して７９％の配列同一性、例えば配列番号４に対して８５％の配列同一性、例えば配列番号４〜７に対して９０％の配列同一性、例えば配列番号４〜７に対して９５％の配列同一性、例えば配列番号４〜７に対して９７％の配列同一性、例えば配列番号４〜７に対して９８％の配列同一性、例えば配列番号４〜７に対して９９％の配列同一性を有する配列から選択されるアンカー配列及び検出配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  12. レポーター／シグナルペプチドの検出が、ＥＬＩＳＡ又は一般に利用可能な免疫検出プラットフォーム、例えば、
    ‐ ＭＳＤ
    ‐ ジャイロス（Ｇｙｒｏｓ）
    ‐ アルファライザ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）
    ‐ ＳＰＲ‐ビアコア（ＳＰＲ‐Ｂｉａｃｏｒｅ）
    ‐ 又は同様の免疫検出プラットフォーム
    を使用することにより行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞。
  14. ポリヌクレオチドのそれぞれが異なる応答要素をコードし、それぞれが異なる薬理学的に活性な分析物によって活性化される、請求項１３に記載の細胞。
  15. 分析物と細胞内又は細胞表面分子との相互作用により、各ポリペプチド（レポーターペプチド）に特有の検出配列が得られる、請求項７〜８のいずれか一項に記載の細胞。
  16. 前記細胞が、初代細胞、例えばＴ又はＢリンパ球、ＣＡＲ‐Ｔ細胞などの天然又は組換えのヒト又は動物起源の単球又はナチュラルキラー細胞、又は当技術分野で公知の任意の細胞株、例えばヒトＪｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ、ＨＥＫ２９３、ＫＨＹＧ１、又はマウスＲＡＷ２６４．７、又はＤＴ‐４０やＭＳＢ‐１などの鳥類細胞株、又はレポーター遺伝子を単独で又は他の組換え成分と一緒に含む細胞株のような以前に確立された改変細胞株である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の細胞。
  17. 自動化されたアッセイ又は自動化された診断設定における、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の細胞の使用。
  18. 以下を含むキット又はパーツのキット：
    ｉ）請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の本発明による細胞；及び
    ｉｉ）任意にビオチン化されていてもよいアンカー配列に対する抗体；及び
    ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡによる検出のためにＨＲＰで任意に標識された、又は分泌レポーターペプチドの検出を可能にするスルホタグで任意に標識された検出配列に対する抗体；及び
    ｉｖ）ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート、又はストレプトアビジン被覆ビーズ、又はストレプトアビジン被覆ＳＰＲチップ。
  19. アンカー配列及び検出配列が異なる、請求項１８に記載のキット又はパーツのキット。
  20. アンカー配列又は検出配列が請求項１１の配列番号４〜７に記載されている、請求項１８〜１９のいずれか一項に記載のキット又はパーツのキット。
  21. 検出が、例えば、ＭＳＤプラットフォーム、又はジャイロス（Ｇｙｒｏｓ）プラットフォームでの検出を可能にするアレクサ（Ａｌｅｘａ）、パーキンエルマーアルファライザ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）プラットフォームでの検出を可能にするジゴキシゲニンにより、又はＳＰＲによる分析用のために標識なしによって行われる、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のキット又はパーツのキット。
  22. １つ以上のバイアル、例えば、凍結バイアルに含まれるストレプトアビジン結合タンパク質をコードするアンカー配列の場合、単独で、又はアンカー抗体と検出抗体若しくは検出抗体のみとともに、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のアッセイ準備凍結細胞を含む２つ以上のバイアルを含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のキット又はパーツのキット。
  23. 薬物の活性を定量化する方法であって、
    ‐ 治療を受けている患者から得られたサンプルを、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の細胞と接触させるステップ、
    ‐ 適切な時間後に上清を回収するステップ、
    ‐ アンカー抗体及び検出抗体の添加のステップ、
    ‐ ＥＬＩＳＡにより又は適切なイムノアッセイプラットフォームで、添加されたアンカー抗体及び検出抗体により上清を分析するステップ
    を含む、上記方法。
  24. 薬物が、例えば、小分子、大型生物医薬品、ＡＡＶ導入遺伝子、又はＣＡＲ‐Ｔ細胞などの細胞療法；又は、タンパク質ベースの薬物、又はＡＡＶウイルスベクター又はＡＡＶ導入遺伝子、又はＣＡＲ‐Ｔ細胞などの細胞療法に対する抗体反応；又は治療用抗体又はＦｃ融合タンパク質、又は治療用抗体、Ｆｃ融合タンパク質、又は細胞療法で治療された患者からの臨床サンプルにおけるエクスビボでの細胞療法のエフェクター細胞機能である、請求項２３に記載の薬物の活性を定量化する方法。
JP2020517522A 2017-10-27 2018-10-25 イムノアッセイプラットフォームでの分析のための細胞ベースのアッセイを最適化するための分泌レポーターペプチド Active JP7476097B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17198818.1 2017-10-27
EP17198818 2017-10-27
PCT/EP2018/079292 WO2019081643A1 (en) 2017-10-27 2018-10-25 SECRET REPORTER PEPTIDES FOR OPTIMIZING CELL-BASED ASSAYS FOR ANALYSIS ON IMMUNOASSAY PLATFORMS

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2020534838A true JP2020534838A (ja) 2020-12-03
JP7476097B2 JP7476097B2 (ja) 2024-04-30

Family

ID=60409110

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020517522A Active JP7476097B2 (ja) 2017-10-27 2018-10-25 イムノアッセイプラットフォームでの分析のための細胞ベースのアッセイを最適化するための分泌レポーターペプチド

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220315919A1 (ja)
EP (1) EP3701046A1 (ja)
JP (1) JP7476097B2 (ja)
KR (1) KR102399458B1 (ja)
WO (1) WO2019081643A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006095654A1 (ja) * 2005-03-07 2006-09-14 Shionogi & Co., Ltd. レポータ遺伝子アッセイ法
JP2012525844A (ja) * 2009-05-05 2012-10-25 アムジエン・インコーポレーテツド Ｆｇｆ２１変異体及びその使用
JP2015126746A (ja) * 2001-12-21 2015-07-09 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイ アルブミン融合タンパク質
WO2015108763A1 (en) * 2014-01-18 2015-07-23 Attagene, Inc. Multiplexing transcription factor reporter protein assay process and system

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015126746A (ja) * 2001-12-21 2015-07-09 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイ アルブミン融合タンパク質
WO2006095654A1 (ja) * 2005-03-07 2006-09-14 Shionogi & Co., Ltd. レポータ遺伝子アッセイ法
JP2012525844A (ja) * 2009-05-05 2012-10-25 アムジエン・インコーポレーテツド Ｆｇｆ２１変異体及びその使用
WO2015108763A1 (en) * 2014-01-18 2015-07-23 Attagene, Inc. Multiplexing transcription factor reporter protein assay process and system

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TANNOUS, BAKHOS A. ET AL., BIOTECHNOLOGY ADVANCES, vol. 29, JPN6021010544, 7 September 2011 (2011-09-07), pages 997 - 1003, ISSN: 0004470982 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20220315919A1 (en) 2022-10-06
KR102399458B1 (ko) 2022-05-17
JP7476097B2 (ja) 2024-04-30
WO2019081643A1 (en) 2019-05-02
KR20200058526A (ko) 2020-05-27
EP3701046A1 (en) 2020-09-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU741376B2 (en) High-throughput assay
Uchida et al. Application of a novel protein biochip technology for detection and identification of rheumatoid arthritis biomarkers in synovial fluid
US20130310266A1 (en) Methods and Compositions For The Diagnosis And Treatment Of Cancer and Autoimmune Disorders
CN103620405A (zh) 全面单克隆抗体产生
EP3224360A1 (en) Method
US20210293784A1 (en) System for the adaptation of cell-based assays for analysis on automated immuno-assay platforms
JP4700626B2 (ja) 分子上のエピトープの免疫検出のための試薬、キット及び方法
Manole et al. Immunoassay techniques highlighting biomarkers in immunogenetic diseases
KR101794403B1 (ko) 쇼그렌증후군 특이적 항체반응 검사를 이용한 쇼그렌증후군 진단방법
JP2018500553A (ja) 患者試料における生物製剤の検出のための間接的均一移動度シフトアッセイ
JP5380303B2 (ja) 高分子アディポネクチン測定法
JP2012504939A (ja) 架橋結合タンパク質による活性化シグナルの産生を予測するための方法
US20230417742A1 (en) Improved assays to detect nucleosome modifications using antibody-targeted enzyme digestion
JP4414138B2 (ja) 蛍光染料を通した分子のエピトープの免疫検出及び分子の相互作用の検出のための方法
JP7476097B2 (ja) イムノアッセイプラットフォームでの分析のための細胞ベースのアッセイを最適化するための分泌レポーターペプチド
JP2005500053A5 (ja)
US11779643B2 (en) Methods and compositions for the treatment of an inflammatory bowel disease
EP4453236A1 (en) Methods and systems for analyzing target engagement data from biological assays
Anaya Modernization of monoclonal antibody screening and protein-interaction assays
CN116802191A (zh) 转换肽及使用该转换肽的免疫测定法
Kibat Development of a protein microarray platform for the characterization of antibodies and quantitative immunoassays
WO2004094638A1 (ja) 血管炎抗原ペプチドと血管炎診断方法
Springer et al. Characterization of Nodes in Cell-Signaling Pathways Using High-Throughput Array Technologies

Legal Events

Date Code Title Description
A529 Written submission of copy of amendment under article 34 pct

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A529

Effective date: 20200326

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20200326

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210323

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210622

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20210903

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20211224

C60 Trial request (containing other claim documents, opposition documents)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60

Effective date: 20211224

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20211227

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20220120

C21 Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21

Effective date: 20220121

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20220218

C211 Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211

Effective date: 20220222

C22 Notice of designation (change) of administrative judge

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22

Effective date: 20230104

C13 Notice of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C13

Effective date: 20230201

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230501

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230529

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231115

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20240417

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7476097

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150