JP2020533373A - アレルギー性気道疾患(aad)/喘息の処置方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)LiClとFGF2を含むが、PDGFを除く間葉系コロニー形成培地(M−CFM)の中で、間葉系コロニーが形成するのに十分な時間の間、酸素正常状態(normoxic conditions)の下で原始中胚葉細胞(primitive mesoderm cell)を培養すること;及び
(b)(a)の間葉系コロニーを付着させて培養し、MCA−MSCを作製すること、
を含む方法により作られる。
(a)AI、AWR、気道線維症、肺線維症、杯細胞化生、上皮肥厚化、気道トランスフォーミング増殖因子(TGF)−β1レベル、上皮下筋線維芽細胞密度、上皮下コラーゲン濃度、又は総肺コラーゲン濃度を低下させること;又は
(b)肺マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)活性を増加させること;又は
(c)(a)の何れか1つ以上の特徴の任意の組み合わせ、又は(a)と(b)の何れか1つ以上の特徴の任意の組み合わせ、
を含む。
・異常な気道TGF−β1レベル、気道/肺線維症、及びAHRの、完全ではなくても実質的な好転
・コラーゲン分解MMPレベルの増加
・AAD/喘息の安全且つ効果的な処置を示す、測定されたパラメーターの基礎発現に影響しないこと
の1つ以上を提供し得る。
気道リモデリング(AWR)として知られる構造変化は、慢性の/重篤な喘息の特徴であり、肺の機能不全に寄与する。一般的に、喘息はコルチコステロイド及び/又はβアゴニストにより管理される。
喘息及び/又はAADは下記の特徴の何れかの組み合わせの何れか1つ以上により特徴付けることができる:AI、AWR、AHR、気道/肺線維症、杯細胞化生、上皮肥厚化、気道トランスフォーミング増殖因子(TGF)−β1レベルの増加、肺MMP−9が無いか又はレベルが低いこと、上皮下筋線維芽細胞密度の増加、上皮下コラーゲン蓄積、及び総肺コラーゲン蓄積。
従って本発明は、MCA−MSCを投与することによる、ADD/喘息、又はその特有の特徴の1つ以上のための改良された療法を提供する。MCA−MSCはそれらの免疫調節の性質を介してそれらの効果を発揮し、AAD/喘息の特有の特徴を産生する部位において直接的に作用することができる。
被験体においてAAD/喘息を処置するために、MCA−MSCの治療有効量を被験体に投与する正確な方法は、医師の裁量によるであろうことは、本技術分野の当業者により理解されるであろう。用量、他の薬剤との組み合わせ、投与のタイミングと頻度等を含む投与のやり方は、被験体の状態と病歴により影響され得る。
1.ビトロネクチンで被覆された(0.5μg/cm2)プラスチック製品上で、E8完全培地(DMEM/F12基礎培地+E8サプリメント)+1μM H1152の中でiPSCを解凍した。プレートしたiPSCを37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)でインキュベートした。
表7の中に表されたIC50データは、LiClが補足されているが、PDGFが除かれている(すなわちPDGF−/LiCl+)M−CFMは、iPSCを分化させて、免疫調節性であるiPSC−MSCを作製するために最適であることを示している。さらに、アクチビンAのより低い濃度も、iPSC由来のMCA−MSCの免疫抑制を改善した。
実施例2において作製されたMCA−MSCは、1194のmiRNA、及び、(71のMSC試料と94の非MSC試料に対して検証された)miR−127−3p、miR−145−5p、miR−181b−5p、miR−214−3p、miR−299−5pからなる独自のmiRNAパネルを含む、マイクロRNA(miRNA)マイクロアレイに対する解析を受けた。
方法及び材料
動物
6〜8週齢のメスのBalb/cマウスを、モナッシュ・アニマル・サービス(モナッシュ大学、クレイトン、ビクトリア、オーストラリア)から得、水と飼料(バラストック・ストックフィード、パケナム、ビクトリア、アーストラリア)を自由に摂取できる、12時間明るく/12時間暗い照明サイクルの、制御された環境下で飼育した。如何なる実験の前にも4〜5日の順応期間が全てのマウスに与えられ、行われた全ての手順は、モナッシュ大学動物倫理委員会(エシックス番号:MARP/2016/078)により承認され、科学的な目的のための実験動物のケアと使用のためのオーストラリアのガイダンスに従ったものである。
慢性AADにおけるMSCの効果を評価するために、オボアルブミン(OVA)誘導性の慢性AADのモデルを、マウスにおいて確立した(n=24)。10μgのグレードVの鶏卵OVA(シグマ−アルドリッチ、ミズーリ州、米国)及び400μg硫酸アルミニウムカリウムアジュバント(alum:AJAXケミカルズ、NSW、オーストラリア)を、0日目と14日目に、腹腔内(IP)注射を2回することによりマウスを感作した。その後それらを、21日目と63日目の間に、週に3回、超音波ネブライザー(オムロン NE−U07;オムロン、京都、日本)を使用して、30分間、エアロゾル化したOVA(0.9%の通常の生理食塩水中に2.5%w/v)を、全身吸入で暴露(噴霧)することにより接種した。しかしながらコントロールマウス(n=24)については、OVAの代わりに、500μLの0.9%生理食塩水のIP注射を行い、0.9%の生理食塩水により噴霧した。
慢性AADの確立の24時間後(64日目)、OVA又は生理食塩水で感作された/接種を受けたマウスの亜群(n=8匹マウス/群)は、MCA−MSCのIV又はIN投与を受けた。OVAに誘導されたAADの慢性モデルにおいて、ヒト骨髄由来の(間質の)MSCとヒト羊膜上皮細胞等の、他の幹細胞のINがもたらす効果を評価するのに使用された時間枠を再現するために、全ての場合において14日間の処置期間(64〜67日目)が選ばれた。
78日目(MCA−MSCの最後の処置に続く7日目)にマウスを、0.9%生理食塩水中のケタミン(10mg/kg体重)及びキシラジン(2mg/kg体重)により麻酔した。その後、18ゲージの気管切開チューブを用いて全てのマウスについて気管切開を行った。その後、Buxco FinePointe plethysmograph(ブクスコ、リサーチシステムズ、ウィルミントン、ノースカロライナ州、米国)のチャンバーにマウスを置き、通気した。その後PBS中に溶解され、噴霧されたメタコリン(メタコリン;シグマ−アルドリッチ、ミズ−リ州、米国)の増加する用量に応答した各マウスの気道抵抗を測定し、6.25〜50mg/mLを気管内に4回送達して気管支収縮を引き起こし、AHRを評価した。気道抵抗の変化(各投与後の最大気道抵抗からPBSのみのベースライン抵抗を引く)を対応するメタコリンの用量に対してプロットした。
侵襲的プレチスモグラフィーに続いて、各動物から肺組織を単離し、4つの別個の小葉(lobe)に分ける前に冷たいPBS内で洗浄した。最大の小葉を10%の中性緩衝ホルムアルデヒド中で一晩固定し、切断加工し、(種々のエンドポイントの組織学的及び免疫組織化学的な解析のために)パラフィンワックス中に包埋した。残る3つの小葉は、様々な他のアッセイのために液体窒素中で急速凍結した。
各マウス由来の最大の小葉が一旦パラフィンに包埋されたら、各組織ブロックを連続切片とし(厚さ3μm)、荷電した(charged)ミクロガラススライド(グレイル・サイエンティフィック、リングウッド、ヴィクトリア、オーストラリア)上に戴置し、様々な組織学的染色又は免疫組織化学に供した。炎症スコアを評価するために、上皮の厚みと上皮下細胞外マトリックス(ECM)沈着、各マウス由来の1つの切片(スライド当たり)はマッソンのトリクローム染色を受けた。杯細胞化生の評価のために、スライドの第二のセットは、アルシアンブルー過ヨウ素酸シッフ(ABPAS)染色を受けた。マッソンのトリクローム染色及びABPAS染色された切片を、以下に詳細に述べるように形態計測的に解析した。
TGF−β1(ポリクローナル抗体;sc−146;サンタクルス・バイオテクノロジー、サンタクルス、カリフォルニア州、米国;1:1000希釈)又はα−平滑筋アクチン(α−SMA;筋線維芽細胞分化のマーカー;モノクローナル抗体使用;M0851;ダコ、グロストロップ、デンマーク;1:200希釈)を検出するために、IHCを使用した。DAKO EnVision抗ウサギ又は抗マウスキットと3、3’−ジアミノベンジジン(DAB)色素原を使用して一次抗体染色を検出し、一方、如何なる一次抗体も無しでEnVisionキットに曝したネガティブコントロ−ルも含めた。全てのスライドをその後ヘマトキシリンにより対比染色し、形態計測分析的解析のために、ScanScope AT Turbo(アペリオ、カリフォルニア州、米国)を用いてモナッシュ・ヒストロジー・サービスによりスキャンした。
マッソンのトリクローム、ABPAS、及びIHC染色したスライドを、下記のようにして形態計測分析的解析をかけた。切片当たり(直径150〜300μmの)5つの気道を無作為に選択し、Aperio ImageScope(アペリオ、カリフォルニア州、米国)を用いて解析した。マッソンのトリクローム染色したスライドに、半定量的細気管支周囲炎症スコア付けを行い、ここで実験を盲検とし、個々の気道に0(気道の周囲に検出可能な炎症無し)から4(広範囲に及び、且つ大きな炎症性細胞凝集物、プールされた大きさ〜0.6mm2)のスコアを付けた。マッソンのトリクローム染色したスライドの、上皮及び上皮下のECM層(青色に染色)の厚みを測定することにより(基底膜(EM)の長さのμm2/μmとして表した)、上皮の厚みと上皮下ECM沈着の解析も行った。
各マウスに由来する二番目に大きな肺葉を、ヒドロキシプロリン含有量の測定について既に述べられたようにして加工し(Royce, S. G.ら, (2013) Clin. Sci. 124, 41-51)、それを精製されたトランス−4−ヒドロキシ−L−プロリン(シグマ−アルドリッチ)の標準曲線から測定した。総コラーゲン含有量を推定するために、ヒドロキシプロリンの値を6.94の係数(多くの哺乳動物組織中のコラーゲンのアミノ酸組成の〜14.4%を表しているヒドロキシプロリンに基づく)により掛け算を行い、次に各対応組織の乾燥重量により割り算を行いコラーゲン濃度パーセンテージを得た。
各マウスに由来する三番目に大きな肺葉を、総タンパク質(試料当たり10μg)の等量アリコートを1mg/mlのゼラチンを含む7.5%アクリルアミドゲル上で評価する前に、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)を含むタンパク質の抽出のために既に詳細に述べたようにして加工した(Woessner, J. F., (1995) Methods Enzymol. 248, 510-528)。ゼラチン分解活性を明らかなバンドとして可視化した。MMP−9(メスBalb/cマウスの肺内の主たるゼラチナーゼ)の濃度測定を、GS710濃度計(バイオラッド・ラボラトリ−ズ、グレイズヴィル、ニューサウスウェールズ、オーストラリア)及びQuantity−Oneソフトウェア(バイオラッド)を用いて行った。MMP−9の光学密度(OD)の相対平均±SEMをその後グラフ化した。
全ての統計解析は、GraphPad Prism v6.0(グラフパッド・ソフトウェア社、ラホヤ、カリフォルニア州、米国)を用いて行われ、平均±SEMで表した。AHRの結果を、ボンフェローニ事後解析(Bonferroni post-hoc test)を伴う二元配置分散分析(two-way ANOVA)により解析した。残りのデータを、群間の多重比較のために、ニューマン・コイルス事後解析(Newman-Keuls post-hoc test)を伴う一元配置分散分析(one-way ANOVA)により解析した。各場合において、データはp<0.05で有意であると見做された。
AIに対するMCA−MSCの効果
炎症スコア付けシステム(0〜4)を使用して、H&E染色した肺切片からAIを半定量した。OVAで損傷されたマウスの気管支周囲の炎症スコア(2.75±0.09)は、生理食塩水(SAL)で感作された/接種を受けたコントロールのスコア付け(0.25±0.09;SAL群に対してP<0.001)よりも有意に高かった(図1)。OVA群における炎症レベルの上昇により、これらのマウスのOVAによる感作と接種が成功していることが確認された。
杯細胞化生
杯細胞化生をABPAS染色された肺切片から形態計測的に評価し、BM長さ100μm当たりの杯細胞の数として表した(図2)。OVA処置されたマウスは、それらのSALコントロールの対応物(0.001±0.00)と比較して、杯細胞数(6.08±0.52)が有意に増加した(SAL群に対してP<0.001;図2A、図2B)。MCA−MSCの投与は、OVA誘導性の杯細胞数の促進を、完全にではないが、有意に減少させることができた(3.97±0.64から2.89±0.48、OVA群に対してP<0.01;図2A、図2B)。しかしながら、MCA−MSCの送達は、OVA誘導性の杯細胞化生を、SALコントロールで測定されたところまで好転させることはなかった(両方はSAL群に対してP<0.001)が、SAL処置されたマウスにおける杯細胞数には影響しなかった。
気道上皮厚みを、マッソンのトリクロームで染色された肺切片から形態計測的に評価し、μm2/μmBM長さとして表した(図3)。OVA処置されたマウスの上皮厚み(19.16±0.63)は、SALコントロールにおいて測定されたもの(14.28±0.45)よりも有意に高かった(SAL群に対してP<0.001;図3A、図3B)。MCA−MSCの送達は上皮の厚みを、OVA群において測定されたもの(18.59±0.77から16.67±0.87)から、完全にではないが有意に減少させた(OVA群に対してP<0.05;SAL群に対してP<0.05;図3A,図3B)。重要なことに、MCA−MSC処置はSALコントロールマウスにおける基礎上皮厚みには影響しなかった。
マッソントリクロームで染色された肺切片から、上皮下コラーゲン沈着を形態計測的に評価し、μm2/μmBM長さとして表し(図3);SALコントロ−ルにおける値(14.31±1.87)と比較して、OVA損傷マウス(27.63±0.66)においては有意に上昇した(SAL群に対してP<0.001;図3A,図3C)。MCA−MSCの送達は、OVA誘導性の上皮下コラーゲン沈着の異常な促進を低下させた(22.39±1.78から16.98±0.98、OVA群に対してP<0.05;図3A、図3C)。
総肺コラーゲン濃度(コラーゲン濃度%/肺組織乾燥重量)を、各マウスの二番目に大きな肺葉中に存在するヒドロキシプロリンレベルから推定し、線維症の指標として使用した(図4);OVA損傷マウス(3.94±0.09%)においては、SALコントロールマウスにおいて測定されたものと比較して有意に増加していた(2.89±0.18%;SAL群に対してP<0.001)。OVA損傷マウスへのMCA−MSCの投与は、肺における線維症を低下させた(3.26±0.17%から3.62±0.07%;OVA群に対してP<0.05;図4)。
MCA−MSCがOVA誘導性の上皮下及び総コラーゲン沈着(線維症)を好転させることができる機構を決定するために、気道TGF−β1(線維症促進性サイトカイン)発現レベルにおける相対的な変化を、IHC−染色した肺切片から形態計測的に評価し、解析された気道当たりの染色%として表した(図5)。気道TGF−β1発現はOVA損傷マウス(1.85±0.13)において、SALコントロールで測定されたもの(1.00±0.08%)と比較して有意に増加した(SAL群に対してP<0.001;図5A、図5B)。OVA損傷マウスへのMCA−MSCの送達は、異常な気道TGF−β1発現レベルを、SALコントロールにおいて測定されたレベルに戻るまで好転させ(1.06±0.05から1.22±0.05、OVA群に対してP<0.001;SAL群と差がない)、SALコントロールマウスに投与したときに基礎気道TGF−β1発現レベルに影響することはなかった(図5A、図5B)。
α−SMA染色された上皮下筋線維芽細胞密度も、IHC染色された肺切片から形態計測的に評価し、BM長さの筋線維芽細胞/100μmの数として表した(図6)。SALコントロールマウスにおいて、微量の上皮下のα−SMAポシティブな筋線維芽細胞が検出された(0.14±0.05)一方で、OVA損傷マウスでは筋線維芽細胞密度が〜30倍増加した(4.37±0.37;SAL群に対してP<0.001;図6A、図6B)。MCA−MSCの投与は、OVA誘導性の上皮下筋線維芽細胞密度の増加を減少させ(2.86±0.27から3.42±0.09;OVA群に対してP<0.05)、SALコントロールマウスに投与されたときの基礎筋線維芽細胞数に何ら影響することはなかった(図6A、図6B)。しかしながら、MCA−MSCの投与が、異常な上皮下筋線維芽細胞負荷を、SALコントロールマウスにおいて測定されたところに戻るまで十分に回復させることはなかった(両方ともSAL群に対してP<0.001;図6A、図6B)。
我々はMCA−MSCに仲介された、OVA誘導性の気道/肺線維症の回復が、コラーゲン分解性のMMPレベルに影響するそれらの能力に関連しているどうかかも決定した。ゼラチンザイモグラフィーは、メスBalb/cマウスの肺は主としてMMP−9(ゼラチナーゼB)を発現し、MMP−13(コラゲナーゼ−3)の程度は低いことを明らかにした(図7)。OVA損傷マウスにおける相対的MMP−9発現レベル(1.62±0.22)は、SALコントロール動物において測定されたものと有意差はなかった(1.00±0.09)(図7A;図7B)。それと比較して、OVA損傷マウスへのMCA−MSCの投与は、MMP−9レベルを顕著に増加させ(3.77±0.18から4.56±0.20;OVA MCA−MSC群に対してP<0.05)、OVA処置されたマウス単独において測定されたものに対して〜1.3倍と〜1.8倍であった(OVA群に対してP<0.001;SAL群に対してP<0.001;図7A;図7B)。興味深いことに、SAL処置マウスへのMCA−MSCの送達も、MMP−9レベルを有意に増加させた(1.95±0.38から2.65±0.30;SAL群に対してP<0.05)。
AHRを、噴霧されたメタコリン(気管支収縮剤)の濃度増加に応答した侵襲的なプレチスモグラフフィーにより評価した(図8)。予期された様に、OVA処置されたマウスはSALコントロールにおいて測定されたものと比較して、AHRが有意に上昇した(P<0.001対SAL群;図8)。MCA−MSCの送達は、OVA誘導性のAHRの増加を好転させた(P<0.05対OVA群;図8)。測定された多くの他のエンドポイントと同様に、SALコントロ−ルマウスに投与されたときには、MCA−MSCの送達は基礎AHR測定には影響しなかった(図8)。
この研究は、確立された疾患病理に対する治療として与えられたときに、慢性AAD/喘息の病因の3つの中心要素:AI、AWR、及びAHRに対する、新規なiPSC由来のMCA−MSCの治療潜在能力を評価することを目的としている。
実施例4における6週間の代わりに、週に3回8週間(21〜77日目、図9)、オボアルブミンの噴霧エアロゾル溶液で30分間マウスに接種した以外は、実施例4と同様にして6〜8匹のマウスの群にAAD/喘息を誘発した。5つの群:1非処置群(喘息なし);2非処置感作動物(喘息);3MCA−MSCのIN注入により処置された感作動物(喘息);4デキサメタゾン(DEX)のIN注入により処置された感作動物(喘息);5MCA−MSC+DEXのIN注入により処置された感作動物(喘息)、の1つにマウスを無作為に割り当てた。全てのMCA−MSC処置されたマウスは、106個の細胞の用量でIN投与を2回(9週と10週に週1回)受けた。9〜11週にDEX(1mg/kg/日)を毎日1回投与した。DEXはAHRを改善したが、MCA−MSCは有意に顕著な効果を有し、DEXはMCA−MSC単独を超える追加効果を有さなかった(図10)。
この実施例において使用されたモデルは実施例5と同じであり、メスのBalb/cマウスを使用して9週にアレルゲンで誘発された慢性気道疾患モデルは、このモデルにおいて反応性が最も高かった。
i)生理食塩水で感作された/接種を受けたコントロール;
ii)OVAで感作された/接種を受けた(AAD);
iii)OVAで感作された/接種を受けた+IN投与による1×106個のMCA−MSC/マウス;
iv)OVAで感作された/接種を受けた+IV投与による1×106個のMCA−MSC/マウス;
vi)OVAで感作された/接種を受けた+ET投与による1×106個のMCA−MSC/マウス。
i)炎症スコア;
ii)杯細胞化生;
iii)上皮厚み;
iv)上皮損傷;
v)上皮下コラーゲン厚み;
vi)総肺コラーゲン濃度;
vii)上皮TGF−ベータ1(betal)染色;
viii)上皮下筋線維芽細胞密度;及び
ix)ゼラチナーゼ(MMP−2及びMMP−9)発現/活性
を含む。
Claims (14)
- 被験体においてアレルギー性気道疾患(AAD)/喘息を処置するための方法であって、該方法は間葉系血管芽細胞−間葉系幹細胞(MCA−MSC)を該被験体に投与することを含み、ここでMCA−MSCはmiR−145−5p、miR−181b−5p及びmiR−214−3pを発現するが、miR−127−3p及びmiR−299−5pを発現しない、方法。
- 被験体におけるアレルギー性気道疾患(AAD)/喘息を処置するための薬剤の製造における間葉系血管芽細胞−間葉系幹細胞(MCA−MSC)の使用であって、ここでMCA−MSCはmiR−145−5p、miR−181b−5p及びmiR−214−3pを発現するが、miR−127−3p及びmiR−299−5pを発現しない、使用。
- MCA−MSCは、CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-の表現型を有する、請求項1の方法又は請求項2の使用。
- MCA−MSCは、
(a)LiCl及びFGF2を含むが、PDGFを除く間葉系コロニー形成培地(M−CFM)の中で、間葉系コロニーを形成するのに十分な時間の間、酸素正常状態の下で原始中胚葉細胞を培養すること;及び
(b)(a)の間葉系コロニーを付着させて培養し、MCA−MSCを作製すること、
を含む方法により作られた、請求項1〜3の何れか1項の方法又は使用。 - MCA−MSCは静脈内に又は鼻腔内に投与される、請求項1〜4の何れか1項の方法又は使用。
- MCA−MSCは鼻腔内に投与される、請求項1〜5の何れか1項の方法又は使用。
- 処置することが、約1×106個〜約1×109個のMCA−MSCを被験体に投与することを含む、請求項1〜6の何れか1項の方法又は使用。
- 被験体は哺乳動物である、請求項1〜7の何れか1項の方法又は使用。
- 被験体はヒトである、請求項1〜8の何れか1項の方法又は使用。
- 喘息を処置するために、被験体は過去にコルチコステロイド又はβアゴニストの投与を受けている、請求項1〜9の何れか1項の方法又は使用。
- 喘息を処置するために、被験体は過去にコルチコステロイド又はβアゴニストの投与を受けていない、請求項1〜9の何れか1項の方法又は使用。
- 被験体は重篤な喘息又は重篤な難治性喘息を有する、請求項1〜11の何れか1項の方法又は使用。
- AAD/喘息を処置することは;
(a)AI、AWR、気道線維症、肺線維症、杯細胞化生、上皮肥厚化、気道トランスフォーミング増殖因子(TGF)−β1レベル、上皮下筋線維芽細胞密度、上皮下コラーゲン濃度、又は総肺コラーゲン濃度を減少させること、又は
(b)肺MMP活性を増加させること、又は
(c)(a)の何れか1つ以上の特徴の任意の組み合わせ、又は(a)と(b)の何れか1つ以上の特徴の任意の組み合わせ、
を含む、請求項1〜12の何れか1項の方法又は使用。 - 被験体がコルチコステロイド又はβ−アゴニストの投与を受けない、請求項1〜13の何れか1項の方法又は使用。
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