JP2020528557A - 生体試料及び対応するプローブを画像化する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はまた、例えば免疫細胞化学実験、又は関心のある特定の分子を同定する実験など、顕微鏡法による生体試料に対する実験を行うために使用される画像化プローブに関する。
他の電子顕微鏡技術は、この特定の分野では免疫金とも呼ばれる免疫細胞化学実験を実行して、生体試料中の特定の抗原をナノメートルスケールで局在決定することを可能にする。
これに関連して、CLEM及び免疫細胞化学実験の両方に使用可能なプローブを利用できるようにする必要があり、これにより、生体試料にアーチファクトや変更を生じさせることなく、特定の分子を高精度で検出できるようになる。
他のCLEMプローブは、ベンジジンの誘導体であるジアミノベンジジン(DAB)をTEMで明確に見えるオスミウム親和性沈殿物を形成するDABポリマーに光変換するために、それに関連付けられた分子の蛍光を利用する。
光変換の代替法として、DABオスミウム親和性ポリマーは、ペルオキシダーゼ結合プローブ、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)によっても生成できる。
これは、HRP酵素が個々の細胞内に浸透できず、それが見られる環境の条件に応じて変性しやすいことを意味する。
いくつかの既知の解決策は、特定の分子と結合できる発光性イオンでドープされた格子を含む無機ナノ粒子の使用し、それらを生体試料中で検出できるようにすることである。
生体試料の成分の典型的なサイズと比較して、これらの既知の格子はサイズが大きいため、それらが結合する特定の分子及び生体試料自体の両方に潜在的に干渉する可能性がある。
生体試料の既知の画像化法のいくつかには、使用するプローブのサイズ、電子密度、毒性に密接に関連する多くの欠点がある。
したがって、最新技術の欠点の少なくとも1つを克服する生体試料の画像化方法を完成させ、利用可能にする必要がある。
出願人は、最新技術の欠点を克服し、これら及び他の目的及び利点を得るために、本発明を創案、試験及び具体化した。
本明細書で説明する実施形態は、優先的な例として、蛍光光学顕微鏡法、電子顕微鏡法、相関顕微鏡法、イオンビーム顕微鏡法、電磁放射線顕微鏡法、及びそれらの組合せなどの顕微鏡法を使用して生体試料を画像化する方法に関する。
この解決手段により、CLEM及び免疫細胞化学実験の両方の実施が可能になり、白金のナノ粒子を生物学的分子及び/又は蛍光を発する分子、つまり蛍光マーカーで機能化し得る。
出願人は、白金のナノ粒子に関する電子顕微鏡法でのシグナルの増幅が、同じサイズの、既知のように電子密度がより高い金ナノ粒子で得られるシグナルよりも約1桁大きいことを発見した。
シグナルの増幅のおかげで、銀や金の富化によってナノ粒子の付着を実施する必要なく、生体試料に存在する可能性のある細胞の内部にある約1nmのサイズの白金のナノ粒子でも検出することができる。
可能な解決手段によれば、被酸化性基質は、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)、3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)、p−フェニレンジアミン−ピロカテコール及びホモバニリン酸からなる群から選択される少なくとも1つの化学化合物を含む。
選択した酸化剤に応じて、酸化時間及び必要な酸化度をそれぞれの場合の特定の必要性に関して決定できる。
白金のナノ粒子は、細胞毒性が低いだけでなく、複雑な表面機能化やバイオコンジュゲーション手順を必要としないという利点もある。
これにより、周囲温度でもナノ粒子を保存でき、決められた環境条件を維持するためのシステムに頼る必要がない。
白金のナノ粒子及び酸化剤は、白金のナノ粒子の周囲に局在する電子密度の高いオスミウム親和性の沈殿物を得るために、被酸化性基質の酸化を活性化するように構成されている。
この画像化方法は、生体試料において顕微鏡による検出が可能な画像化プローブの使用を提供する。
本発明によれば、画像化方法は、白金のナノ粒子、酸化剤及び被酸化性基質からなる画像化プローブの生体試料における使用を提供する。
白金のナノ粒子は、本質的に蛍光性であるか、又はフルオロフォア及び/又は蛍光マーカーなどの蛍光を発することができる分子と結合させることができる。
可能な解決手段によれば、白金のナノ粒子は100nm以下のサイズを有する。
可能な解決手段によれば、白金のナノ粒子は2nm〜10nmのサイズを有する。
これらのサイズの範囲は、白金のナノ粒子が本質的に蛍光を発する特定のサイズを含むだけでなく、白金のナノ粒子が生体試料に存在する可能性のある細胞に浸透することができる範囲でもある。
本発明によれば、画像化プローブは、特にそのようなサイズを有する白金のナノ粒子に特有な固有のペルオキシダーゼ活性に基づいている。
出願人は、白金のナノ粒子が、被酸化性基質を用いて、例えば水中の過酸化水素などの酸化剤の還元を触媒し、白金のナノ粒子の周囲に局在するオスミウム親和性の沈殿物の生成を促進できることを発見した。
白金のナノ粒子の表面のペルオキシダーゼ活性によって誘導されるオスミウム親和性の沈殿物の局在化のおかげで、オスミウム親和性の沈殿物の電子密度の高さを活用して、生体試料において白金のナノ粒子を局在化させることができる。
可能な実施形態によれば、酸化剤は、過酸化水素、tert−ブチルペルオキシド、tert−ブチルヒドロペルオキシド、過酢酸、過酸化ベンゾイル、イソプロピルベンゼンヒドロペルオキシド、アラキドン酸5−ヒドロペルオキシド及びドデシル2−メトキシプロパン−2−イルペルオキシドからなる群から選択される。
可能な実施形態によれば、白金のナノ粒子は表面官能化することもでき、すなわち、少なくとも1つの関連分子と直接又は間接的に結合することができる。
可能な解決手段によれば、関連分子は、抗体、タンパク質、アプタマー、ペプチド、糖、多糖類、生体分子、及び化学化合物からなる群から選択される。
本発明による画像化プローブにより提供される別の可能性は、生体試料内部で、今日では電子顕微鏡技術により視覚化することが困難な10nmよりもさらに小さい白金のナノ粒子の動態をモニタリングすることである。
白金のナノ粒子のペルオキシダーゼ活性によって生成される電子密度シグナルの実際の増幅を試験するために、出願人は、DAB基質及び過酸化水素の存在下、生体試料において様々なサイズの白金のナノ粒子を使用した。
記載された実施形態のいずれかに従って、白金のナノ粒子、酸化剤及び被酸化性基質を使用して、前記白金のナノ粒子の周囲に局在する電子密度の高いオスミウム親和性の沈殿物を画像化プローブとして取得し、記載された実施形態のいずれかにおけるような顕微鏡法を用いて生体試料のための画像化方法を実施することが、本発明の保護の範囲に含まれることも明らかである。
実施例1
図1に示す例では、細胞内の生体試料中の白金のナノ粒子のペルオキシダーゼ活性によって生成される電子密度の高いシグナルの実際の増幅を試験するために、腫瘍細胞株(HeLa)を含む生体試料を、4nm及び10nmの白金のナノ粒子を有する画像化プローブとともにインキュベートした。
実施例2
図2の例では、細胞内のトランスフェリンのエンドソーム経路を視覚化するために、CLEMによって画像化プローブの有効性を試験した。
図2において文字「a」で表示された四角を参照して、蛍光トランスフェリンとバイオコンジュゲーションした白金のナノ粒子の蛍光シグナルは、FOMで明確に認識可能であり、黒色と符号「T」で示され、ミトコンドリアは灰色と符号「M」で示される。
領域3は拡大され、TEMを使用して及び視覚化され、四角「b」で示されていることを考慮すべきである。
高倍率のTEM画像は、電子密度の高い領域内に白金の個々のナノ粒子が存在することを示している(四角の「e」及び「g」で矢印で示されている)。
Claims (14)
- 顕微鏡法を使用して生体試料を画像化する方法であって、白金のナノ粒子の周りに局在化した電子密度の高いオスミウム親和性の沈殿物を得るための、白金のナノ粒子、酸化剤、及び、被酸化性基質の前記生体試料における使用を提供することを特徴とし、前記オスミウム親和性の沈殿物は、前記白金のナノ粒子によって、及び前記酸化剤によって活性化された前記被酸化性基質の酸化段階によって得られる方法。
- 前記被酸化性基質は、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)、3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)、p−フェニレンジアミン−ピロカテコール、及びホモバニリン酸からなる群から選択される少なくとも1つの化学化合物を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記酸化剤は、過酸化水素、tert−ブチルペルオキシド、tert−ブチルヒドロペルオキシド、過酢酸、過酸化ベンゾイル、イソプロピルベンゼンヒドロペルオキシド、アラキドン酸5−ヒドロペルオキシド及びドデシル2−メトキシプロパン−2イルペルオキシドからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記酸化剤は過酸化水素であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記白金のナノ粒子は、前記生体試料中に存在する特定の物質と結合することができる少なくとも1つの関連分子と直接又は間接的に結合され、前記関連分子は、抗体、タンパク質、アプタマー、ペプチド、糖、多糖類、生物学的分子、及び化学化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 白金のナノ粒子と結合した前記関連分子の少なくとも1つとは異なる少なくとも関連分子と直接又は間接的に結合した、前記生体試料における金及び/又は銀のナノ粒子の使用を提供することを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 白金のナノ粒子は100nm以下のサイズを有することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 顕微鏡法は、蛍光光学顕微鏡法、電子顕微鏡法、相関顕微鏡法、イオンビーム顕微鏡法、電磁放射線顕微鏡法、及びそれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の画像化する方法を実行するために、生体試料において顕微鏡による検出が可能な画像化プローブであって、白金のナノ粒子、酸化剤及び被酸化性基質を含み、前記白金のナノ粒子及び前記酸化剤は、前記白金のナノ粒子の周囲に局在する電子密度の高いオスミウム親和性の沈殿物を得るために、前記被酸化性基質の酸化を活性化するように構成されていることを特徴とするプローブ。
- 前記被酸化性基質は、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)、3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)、p−フェニレンジアミン−ピロカテコール、及びホモバニリン酸からなる群から選択される少なくとも1つの化学化合物を含むことを特徴とする、請求項9に記載のプローブ。
- 前記酸化剤は、過酸化水素、tert−ブチルペルオキシド、tert−ブチルヒドロペルオキシド、過酢酸、過酸化ベンゾイル、イソプロピルベンゼンヒドロペルオキシド、アラキドン酸5−ヒドロペルオキシド及びドデシル2−メトキシプロパン−2イルペルオキシドからなる群から選択されることを特徴とする、請求項9又は10に記載のプローブ。
- 前記酸化剤は過酸化水素であることを特徴とする、請求項9又は10に記載のプローブ。
- 前記白金のナノ粒子は、前記生体試料中に存在する特定の物質と結合することができる少なくとも1つの関連分子と直接又は間接的に結合され、前記関連分子は、抗体、タンパク質、アプタマー、ペプチド、糖、多糖類、生物学的分子、及び化学化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項9〜12のいずれか一項に記載のプローブ。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の顕微鏡法を使用して生体試料を画像化する方法を実行するために、白金のナノ粒子の周りに局在化した電子密度の高いオスミウム親和性の沈殿物を得るための、白金のナノ粒子、酸化剤及び被酸化性基質の、請求項9〜13のいずれか一項に記載の画像化プローブとしての使用。
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