JP2020527582A - 非癌性医学的状態の治療のためのｗｘ−ｕｋ１及びそのプロドラッグ、ｗｘ−６７１の使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、トリプシン阻害剤で治療することによって改善される非癌性医学的状態を有する動物を治療する方法に関し、この方法は、動物から生体試料を得ることと、試料を試験して、トリプシン濃度を得ることと、を含み、トリプシン濃度が正常性の上限を上回る場合、動物は、薬学的に許容可能な担体と、化合物Ｎ−α−（２，４，６−トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−ヒドロキシアミジノ−フェニルアラニン−４−エトキシカルボニルピペラジド、立体異性体、ラセミ混合物、代謝産物、薬学的に許容される塩、結晶、又はこれらの任意の組み合わせと、を含む治療有効量の医薬組成物を動物に投与することによって、適切な期間治療される。一実施形態において、非癌性医学的状態は、膵炎、胃炎、過敏性腸症候群、及び炎症性腸疾患からなる群から選択される炎症性消化器疾患である。一実施形態において、医薬組成物は、経口投与可能な形態である。

Description

（関連出願）
本出願は、２０１７年７月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／５３５，３７６号、２０１７年１０月１９日に出願された米国仮出特許願第６２／５７４，４４９号、及び２０１７年１１月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／５８９，７３４号の利益及び優先権を主張するものであり、これらの出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。

プロテアーゼは、病理につながる多数の生命維持に関するプロセスに関与する重要なシグナル伝達分子であり、これらのプロテアーゼを標的とする新規な治療戦略を見出すことは、医学の強く希求する目標である。低分子薬物に関しては、根底にある薬物治療効果を標的とする分子標的の同定及び発見の重要な課題が残っている。

本明細書に示される態様によると、化合物Ｎ−α−（２，４，６−トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−アミジノ−（Ｌ）−フェニルアラニン４−エトキシカルボニルピペラジド（「ＷＸ−ＵＫ１」）に対する高親和性標的は、健康及び疾患における重要な影響が特定されており、非癌性医学的状態の治療におけるＷＸ−ＵＫ１の重要な使用を示す。一実施形態において、非癌性医学的状態は、トリプシン阻害剤による治療によって改善される消化器癌を除く、炎症性消化器疾患である。

本明細書に示される態様によると、方法は、非癌性医学的状態を有する動物から生体試料を得ることと、試料を試験して、トリプシン濃度を得ることと、を含み、トリプシン濃度が正常性の上限を上回る場合、動物は、薬学的に許容可能な担体と、化合物Ｎ−α−（２，４，６−トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−ヒドロキシアミジノ−フェニルアラニン−４−エトキシカルボニルピペラジド、立体異性体、ラセミ混合物、代謝産物、薬学的に許容される塩、結晶、又はこれらの任意の組み合わせと、を含む治療有効量の医薬組成物を動物に投与することによって、適切な期間治療される。一実施形態において、生体試料は、血液、血清、尿、唾液、十二指腸液、及び腸粘膜生検からなる群から選択される。一実施形態において、非癌性医学的状態は、膵炎、胃炎、過敏性腸症候群、及び炎症性腸疾患からなる群から選択される。一実施形態において、非癌性医学的状態は、過敏性腸症候群である。一実施形態において、過敏性腸症候群は、便秘優位型の過敏性腸症候群である。一実施形態において、過敏性腸症候群は、下痢優位型の過敏性腸症候群である。一実施形態において、非癌性医学的状態は、炎症性腸疾患である。一実施形態において、炎症性腸疾患は、クローン病である。一実施形態において、炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎である。一実施形態において、非癌性医学的状態は、急性膵炎である。一実施形態において、医薬組成物は、経口投与可能な形態である。一実施形態において、化合物は、硫酸塩又は硫酸水素塩として存在する。一実施形態において、化合物は、Ｎ−α−（２，４，６トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−ヒドロキシアミジノ−（Ｌ）フェニルアラニン−４−エトキシカルボニルピペラジド、ｎ−α−（２，４，６−トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−ヒドロキシアミジノ−（Ｄ）フェニルアラニン−４−エトキシカルボニルピペラジド、及びＮ−α−（２，４，６トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−ヒドロキシアミジノ−（Ｄ，Ｌ）フェニルアラニン−４−エトキシカルボニルピペラジド、又はこれらの生理学的に適合性の塩からなる群から選択される。一実施形態において、化合物は、Ｎ−α−（２，４，６トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−ヒドロキシアミジノ−（Ｌ）フェニルアラニン−４−エトキシカルボニルピペラジド硫酸水素塩である。一実施形態において、化合物は、Ｎ−α−（２，４，６トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−ヒドロキシアミジノ−（Ｌ）フェニルアラニン−４−エトキシカルボニルピペラジド又はその生理学的に適合性の塩の結晶形態である。一実施形態において、動物は、ヒトである。一実施形態において、生体試料を試験して、トリプシン−３のレベルを得る。一実施形態において、生体試料を試験して、トリプシン−２のレベルを得る。一実施形態において、医薬組成物は、非癌性医学的状態の治療のために承認された別の薬剤と同時投与される。

本明細書に示される態様によると、方法は、過敏性腸症候群を有するヒトから十二指腸流体の生体試料を得ることと、試料を試験して、トリプシン−３濃度を得ることと、を含み、トリプシン−３濃度が正常性の上限を上回る場合、ヒトは、薬学的に許容可能な担体と、化合物Ｎ−α−（２，４，６−トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−ヒドロキシアミジノ−（Ｌ）フェニルアラニン−４−エトキシカルボニルピペラジド硫酸水素塩と、を含む治療有効量の医薬組成物をヒトに投与することによって、適切な期間治療される。

本発明まで、ＷＸ−ＵＫ１がヒトトリプシン−３阻害剤であり、ＷＸ−ＵＫ１を使用して消化器性癌を除く炎症性消化器疾患を治療することができることは知られていなかった。本出願の出願日の前には、ＷＸ−ＵＫ１は、とりわけ、癌の治療において投与するために開示されていた。しかしながら、ＷＸ−ＵＫ１は、膵炎、胃炎、過敏性腸症候群、及び炎症性腸疾患を含むが、これらに限定されない炎症性非癌性消化器疾患の治療については知られていなかった。一実施形態において、以下に詳述するように、ＷＸ−ＵＫ１及びそのプロドラッグＷＸ−６７１は、現在承認されている治療法が存在しない急性膵炎の治療に使用することができる。一実施形態において、以下に詳述するように、ＷＸ−ＵＫ１及びそのプロドラッグＷＸ−６７１は、過敏性腸症候群の治療に使用することができる。一実施形態において、以下に詳述するように、ＷＸ−ＵＫ１及びそのプロドラッグＷＸ−６７１は、炎症性腸疾患の治療に使用することができる。一実施形態において、炎症性腸疾患は、クローン病である。一実施形態において、炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎である。

本明細書に示される態様によると、動物における膵炎を治療する方法が開示されており、このような治療を必要とする動物に、有効量の、式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）からなる群から選択される化合物、又はこの化合物を含有する薬学的に許容される組成物を投与することを含む、方法が開示される。一実施形態において、本方法は、動物から生体試料を得ることと、試料を試験して、トリプシンのレベルを得ることと、を更に含む。一実施形態において、生体試料は、血液、血清、尿、唾液、十二指腸液、及び腸粘膜生検からなる群から選択される。一実施形態において、平均血清トリプシン濃度が正常性の上限を超える場合、動物は処置される。一実施形態において、試料を試験して、トリプシンのレベルを得ることは、トリプシン及びそのプロ酵素のトリプシノーゲンの免疫学的濃度を測定し、酵素生物活性は測定しないラジオイムノアッセイを使用して行われる。

本明細書に示される態様によると、膵炎の治療に好適かつ意図される薬剤の製造における、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、及び式（ＩＩＩ）からなる群から選択される化合物の使用が開示される。

本明細書に示される態様によると、動物における過敏性腸症候群を治療する方法が開示されており、このような治療を必要とする哺乳動物に、有効量の、式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）からなる群から選択される化合物、又はこの化合物を含有する薬学的に許容される組成物を投与することを含む、方法が開示される。一実施形態において、過敏性腸症候群は、下痢を伴う過敏性腸症候群である。一実施形態において、過敏性腸症候群は、便秘を伴う過敏性腸症候群である。一実施形態において、本方法は、動物がこのような治療を必要としているかどうかを判定することを更に含み、これには、動物から腸粘膜生検試料を得ることと、試料を試験して、ＰＲＳＳ３（トリプシン−３前駆体）の遺伝子発現のレベルを得ることと、が含まれ、ＰＲＳＳ３ ｍＲＮＡが健康な試料からの対照値と比較して有意に上方調節される場合、この動物は、有効量の、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）のいずれかの化合物を投与することによって治療される。一実施形態において、試料を試験して、ＰＲＳＳ３の遺伝子発現のレベルを得ることは、ＰＲＳＳ３転写物の存在を検出することを含む。一実施形態において、試料を試験することは、インサイチュザイモグラフィーを含む。

本明細書に示される態様によると、過敏性腸症候群の治療に好適かつ意図される薬剤の製造における、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、及び式（ＩＩＩ）からなる群から選択される化合物の使用が開示される。一実施形態において、過敏性腸症候群は、下痢を伴う過敏性腸症候群である。一実施形態において、過敏性腸症候群は、便秘を伴う過敏性腸症候群である。

本明細書に示される態様によると、化合物Ｎ−α−（２，４，６−トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−アミジノ−（Ｌ）−フェニルアラニン４−エトキシカルボニルピペラジド（「ＷＸ−ＵＫ１」）に対する高親和性標的は、健康及び疾患における重要な影響が特定されており、肺癌を除くヒト炎症性肺疾患の治療におけるＷＸ−ＵＫ１の重要な使用を示す。

本発明まで、ＷＸ−ＵＫ１がヒトトリプシン−２阻害剤であり、ＷＸ−ＵＫ１を使用して肺癌を除く炎症性肺疾患を治療することができることは知られていなかった。本出願の出願日の前には、ＷＸ−ＵＫ１は、とりわけ、癌の治療において投与するために開示されていた。しかしながら、ＷＸ−ＵＫ１は、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群（acute respiratory distress syndrome、ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease、ＣＯＰＤ）、気腫及び非結核菌（non-tuberculosis mycobacteria、ＮＴＭ）が挙げられるが、これらに限定されない炎症性肺疾患の治療には知られていなかった。一実施形態において、以下に詳述するように、ＷＸ−ＵＫ１及びそのプロドラッグＷＸ−６７１は、満たされていない医療ニーズがあるＣＯＰＤの治療に使用することができる。

本明細書に示される態様によると、動物において肺疾患を治療する方法が開示されており、このような治療を必要とする動物に、有効量の、式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）からなる群から選択される化合物、又はこの化合物を含有する薬学的に許容される組成物を投与することを含む、方法が開示される。

一実施形態において、本方法は、動物がこのような治療を治療しているかどうかを判定することを更に含み、これには、動物から肺組織試料を得ることと、組織試料を試験して、ＰＲＳＳ２（トリプシン−２前駆体）の遺伝子発現のレベルを得ることと、が含まれ、ＰＲＳＳ２ ｍＲＮＡが健康な組織試料からの対照値と比較して有意に上方調節される場合、この動物は、有効量の、式（Ｉ）、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）のいずれかの化合物のいずれかを投与することによって治療される。一実施形態において、組織試料を試験して、ＰＲＳＳ２の遺伝子発現のレベルを得ることは、ＰＲＳＳ２転写物の存在を検出することを含む。一実施形態において、組織試料を試験することは、インサイチュザイモグラフィーを含む。

本明細書に示される態様によると、肺損傷の治療に好適かつ意図される薬剤の製造における、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、及び式（ＩＩＩ）からなる群から選択される化合物の使用が開示される。

本明細書に示される態様によると、動物におけるα−１アンチトリプシン欠損症を治療する方法であって、このような治療を必要とする動物に、有効量の、式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）からなる群から選択される化合物、又はこの化合物を含有する薬学的に許容される組成物を投与することを含む、方法が開示される。一実施形態において、本方法は、動物がこのような治療を必要としているかどうかを判定することを更に含み、これには、動物から生体試料を得ることと、試料を試験して、α−１アンチトリプシンの濃度を得ることと、が含まれる。一実施形態において、生体試料は、血液、血清、尿、唾液、十二指腸液、及び腸粘膜生検からなる群から選択される。一実施形態において、平均血清α−１アンチトリプシン濃度が正常性の下限を下回る場合、動物は、有効量の式（Ｉ）、式（ＩＩ）、又は式（ＩＩＩ）の化合物のいずれかを投与することによって、治療される。一実施形態において、試料を試験して、α−１アンチトリプシンのレベルを得ることは、α−１アンチトリプシンの免疫学的濃度を測定するが酵素生物活性は測定しないラジオイムノアッセイを使用して行われる。

本明細書に示される態様によると、α−１アンチトリプシン欠損症の治療に好適かつ意図される薬剤の製造における、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、及び式（ＩＩＩ）からなる群から選択される化合物の使用が開示される。

動物における炎症性腸疾患を治療する方法は、このような治療を必要とする動物に、有効量の式（ＩＩＩ）の化合物又はいずれかの実体を含有する薬学的に許容される組成物を経口投与することを含む。

動物における炎症性腸疾患を治療する方法は、このような治療を必要とする動物に、有効量の式（ＩＩＩ）の化合物又はいずれかの実体を含有する薬学的に許容される組成物を経口投与することを含む。一実施形態において、化合物は、経口投与される。

動物における膵炎を治療する方法は、このような治療を必要とする動物に、有効量の式（ＩＩＩ）の化合物又はいずれかの実体を含有する薬学的に許容される組成物を投与することを含む。一実施形態において、化合物は、経口投与される。

動物における肺疾患を治療する方法は、このような治療を必要とする動物に、有効量の式（ＩＩＩ）の化合物又はいずれかの実体を含有する薬学的に許容される組成物を投与することを含む。一実施形態において、化合物は、経口投与される。

本明細書では、医療施術者によって使用されるとき、患者への本発明の剤形の適切な量の投与を単純化することができるキットも提供される。特定の実施形態において、本明細書に提供されるキットは、本明細書で提供されるＷＸ−６７１の剤形を有する少なくとも１つの容器と、所与の非癌性医学的状態を治療するために剤形を使用する方法を示すラベルと、を含む。一実施形態において、剤形は、経口投与のために調製された固形の剤形である。一実施形態において、剤形は、吸入投与のために調製された剤形である。

このセクション又は本出願の任意の他のセクションにおける任意の参照の引用又は識別は、このような参照が本出願の先行技術として利用可能であることを容認するものと解釈されるべきではない。

プロドラッグＷＸ−６７１の薬理学的に活性なＷＸ−ＵＫ１への還元的変換を示す。 ＷＸ−ＵＫ１標的を識別するために使用されるプロセスの概略図である。 ＷＸ−ＵＫ１の活性部位内及びその周辺のウシトリプシン上の構造セグメントが、ＷＸ−ＵＫ１結合の主要な予測決定因子であることを示す。 ヒトトリプシン−１阻害剤濃度に対するＵＫ１活性のグラフである。 ヒトトリプシン−２阻害剤濃度に対するＵＫ１活性のグラフである。 ヒトトリプシン−３阻害剤濃度に対するＵＫ１活性のグラフである。 ヒトマトリプターゼ（触媒ドメイン）阻害剤濃度に対するＵＫ１活性のグラフである。 対象となるリガンド（ヒトｕＰＡ）がセンサチップの表面上に固定化され、異なる濃度のＷＸ−ＵＫ１を有する溶液がそれを超えて流れ、溶液とヒトｕＰＡとの相互作用が特徴付けられる、表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance、ＳＰＲ）実験の実験設定を示す概略図である。 ヒトｕＰＡに対するＷＸ−ＵＫ１結合の結合動態を示す。 対象となるリガンドがセンサチップの表面上に固定化され、異なる濃度のＷＸ−ＵＫ１を有する溶液がそれを超えて流れ、溶液とヒトｕＰＡとの相互作用が特徴付けられる、ＳＰＲ実験の実験設定を示す概略図である。一実施形態において、対象となるリガンドは、ヒトトリプシン−１、ヒトトリプシン−３、又はヒトＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼのうちの１つから選択される。 トリプシン−１に対するＷＸ−ＵＫ１結合の結合動態を示す。 トリプシン−３に対するＷＸ−ＵＫ１結合の結合動態を示す。 ヒトＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼに対するＷＸ−ＵＫ１結合の結合動態を示す。

定義
「患者」は、ヒトなどの霊長類などの任意の動物を指す。任意の動物は、本発明の方法及び組成物を用いて治療され得る。動物、例えば齧歯類、イヌ、及びサルにおける疾患又は障害の予防又は治療に有効であると決定されたＷＸ−ＵＫ１及びＷＸ−６７１は、ヒトにおける疾患の治療においても有用であり得る。ヒトにおける疾患治療の当業者であれば、動物研究において得られたデータに基づいて、ヒトへの化合物の投与量及び投与経路が分かるであろう。獣医学的使用のために、本発明の化合物又はその非毒性塩は、通常の獣医学的実践に従って好適に許容される製剤として投与され、獣医師は、特定の動物にとって最も適切である投与レジメン及び投与経路を決定するであろう。

本発明で使用される場合、「好適な期間」という用語は、対象が本開示の方法を使用して疾患に対する治療を始めるときに開始し、治療を通して、対象が治療を停止するときまでの期間を指す。一実施形態において、好適な期間は、１週間である。一実施形態において、好適な期間は、１週間〜２週間である。一実施形態において、好適な期間は、２週間である。一実施形態において、好適な期間は、２週間〜３週間である。一実施形態において、好適な期間は、３週間である。一実施形態において、好適な期間は、３週間〜４週間である。一実施形態において、好適な期間は、４週間である。一実施形態において、好適な期間は、４週間〜５週間である。一実施形態において、好適な期間は、５週間である。一実施形態において、好適な期間は、５週間〜６週間である。一実施形態において、好適な期間は、６週間である。一実施形態において、好適な期間は、６週間〜７週間である。一実施形態において、好適な期間は、７週間である。一実施形態において、好適な期間は、７週間〜８週間である。一実施形態において、好適な期間は、８週間である。一実施形態において、好適な期間は、１週間〜２年間である。一実施形態において、好適な期間は、２年間を超える。最終的に、処方者が、適切な期間を決定することになる。

「治療上許容される」という用語は、過度の毒性、刺激、及びアレルギー応答なしに患者の組織に接触して使用するために好適であり、適度な利益／リスク比に相応し、それらの意図された使用に有効である化合物（又は塩、プロドラッグ、互変異性体、双性イオン形態など）を指す。

「有効量」又は「有効量（efficacious amount）」又は「治療有効量」又は「治療有効用量」とは、非癌性医学的状態の進行を阻害するか、又は非癌性医学的状態の１つ以上の症状を少なくとも部分的に緩和する、ＷＸ−ＵＫ１又はＷＸ−６７１の量を意味する。治療有効量は、予防的に有効な量であり得る。治療有効量は、患者のサイズ及び性別、治療される非癌性医学的状態、疾患の重症度、並びに求められる結果に依存する。一実施形態において、治療有効用量は、患者における症状の改善をもたらす、ＷＸ−ＵＫ１又はＷＸ−６７１の量を指す。所与の患者について、治療有効量は、当業者に既知の方法によって決定され得る。疾患によって引き起こされる病態の治療的処置のために、本発明を実施するために使用されるＷＸ−ＵＫ１又はＷＸ−６７１の十分な量は、投与の様式、患者の年齢、体重、及び全身健康状態に応じて異なる。最終的に、処方者が、適切な量及び投与レジメンを決定することになる。

本発明によれば、生物、特に人におけるトリプシン阻害の１つの可能性は、有効量の本発明による化合物の投与によって提供される。投与される用量は、治療される疾患の性質及び重症度に依存する。一実施形態において、１日用量は、体重当たり０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇの活性物質の範囲である。一実施形態において、１日用量は、体重当たり０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの活性物質の範囲である。一実施形態において、１日用量は、体重当たり０．５〜４０ｍｇ／ｋｇの活性物質の範囲である。一実施形態において、１日用量は、体重当たり１〜３０ｍｇ／ｋｇの活性物質の範囲である。一実施形態において、１日用量は、体重当たり５〜２５ｍｇ／ｋｇの活性物質の範囲である。

本明細書で使用され鵜場合、「剤形」は、経口、皮下、静脈内、又は吸入投与を目的とする形態である。「固形経口剤形」としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、及び粉剤が挙げられるが、これらに限定されない。「吸入剤形」としては、吸入器及びネブライザが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「阻害剤」という用語は、酵素の活性に影響を及ぼす分子を指す。本発明の阻害剤は、可逆的であり、それらが、それらの標的酵素との弱い相互作用を形成し、容易に除去されることを意味する。可逆的阻害剤は、酵素との一過性相互作用を形成する。酵素と可逆的阻害剤との間の結合の強度は、解離定数（Ｋ_ｄ）によって定義される。Ｋ_ｄの値が小さいほど、酵素と阻害剤との間の相互作用が強くなり、阻害効果が大きくなる。酵素阻害について言及する場合、Ｋ_ｄは、Ｋ_ｉと称される。

本明細書で使用される場合、「消化器疾患」という用語は、胃腸管又は副消化管（肝臓、膵臓、及び胆嚢）に関与する任意の疾患を指す。本開示の消化器疾患の例としては、過敏性腸症候群（irritable bowel syndrome、ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease、ＩＢＤ）、胃炎及び膵炎が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、炎症性消化器疾患を有する患者は、トリプシンの血清レベルによって決定されるように、増加／上方調節されたトリプシン様活性を有する。一実施形態において、トリプシン様活性の増加は、トリプシン−２の上方調節である。一実施形態において、トリプシン様活性の増加は、トリプシン−３の上方調節である。

本明細書で使用される場合、「インサイチュザイモグラフィー」という用語は、消化時に容易に可視であるように改変されたプロテアーゼアッセイに特異的な基質を使用してプロテアーゼのタンパク質分解活性を測定する技術を指す。基質を組織切片上に配置し、次いで、試料を湿度チャンバ内において最適温度でインキュベートし、それにより、活性化酵素による基質の本来の位置での消化を可能にする。組織固定のために、固定されていない凍結組織（冷凍切片）又はエタノール若しくは亜鉛に基づく固定剤を使用することができる。可視化のために、いくつかの異なるアプローチを使用することができる。例えば、ヒト結腸組織試料に対するＷＸ−ＵＫ１インキュベーションの効果は、インサイチュザイモグラフィーにより測定することができる。ヒト結腸組織の例としては、例えば、Ｒｏｍｅ ＩＩＩ又はＲｏｍｅ ＩＶ基準を使用して定義されたＩＢＳ患者から得られるもの、及び健康な対照から得られるものが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「増加／上方調節トリプシン様活性」という用語は、正常性の上限よりも著しく上昇した平均トリプシンレベルを指す。一実施形態において、消化器疾患を有する患者における平均トリプシンは、正常性の上限よりも著しく高い（０．００１未満のＰ）。一実施形態において、平均トリプシンレベルは、血清中で検出される。

本発明によれば、生物、特に人におけるトリプシン阻害の１つの可能性は、有効量の本発明による化合物の投与によって提供される。投与される用量は、治療される疾患の性質及び重症度に依存する。一実施形態において、１日用量は、体重当たり０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇの活性物質、より大いに好ましくは、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、より大いに好ましくは、０．５〜４０ｍｇ／ｋｇ、より大いに好ましくは、１〜３０ｍｇ／ｋｇ、より大いに好ましくは５〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲である。

ＷＸ−ＵＫ１及びＷＸ−６７１
本明細書で使用される場合、ＷＸ−ＵＫ１という用語は、立体異性体、ラセミ混合物、代謝産物、薬学的に許容される塩、結晶、又はこれらの任意の組み合わせを含む、以下の式Ｉに示されるセリンプロテアーゼの合成小分子阻害剤を指す。

ＷＸ−ＵＫ１は、ラセミ体及びＬ型又はＤ型の化合物として存在し得る。一実施形態において、本発明の方法で使用されるＷＸ−ＵＫ１は、Ｌ型のみの化合物である。一実施形態において、ＷＸ−ＵＫ１は、無機酸、好ましくは塩酸との塩として、又は適切な有機酸との塩として存在する。一実施形態において、ＷＸ−ＵＫ１は、経口投与、皮下投与、又は静脈内投与可能な薬物の調製のために、少なくとも１つの適切な医薬添加剤と共に使用することができる。

本明細書で使用される場合、ＷＸ−６７１という用語は、立体異性体、ラセミ混合物、代謝産物、薬学的に許容される塩、結晶、又はこれらの任意の組み合わせを含む、以下の式ＩＩに示されるＷＸ−ＵＫ１の経口プロドラッグを指す。ＷＸ−６７１の化学名は、Ｎ−α−（２，４，６−トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−ヒドロキシアミジノ−（Ｌ）−フェニルアラニン−４−エトキシカルボニルピペラジドである。

ＷＸ−６７１は、その粉末、塩、及び結晶形態として存在し得る。本発明による化合物は、任意に、医薬の製造に好適な医薬賦形剤及び／又はビヒクルと共に使用することができ、好適な医薬製剤、例えば、錠剤、コーティング錠剤、カプセル剤、香錠剤、粉剤、シロップ、懸濁液、溶液などとして調製することができる。図１は、プロドラッグＷＸ−６７１の薬理学的に活性なＷＸ−ＵＫ１への還元的変換を示している。

一実施形態において、ＷＸ−６７１は、本明細書において「ＷＸ−６７１．１」又は「アパモスタット硫酸水素塩」又は「式（ＩＩＩ）」と表記される硫酸水素塩として入手可能である。

ＷＸ−６７１．１の分子式は、Ｃ_３２Ｈ_４７Ｎ_５Ｏ_６Ｓ × Ｈ_２ＳＯ_４であり、ジメチルスルホキシドに自由に可溶性であり、７２７．９１ｇ／ｍｏｌの相対分子質量を有するエタノールに可溶性である、非吸湿性の白色から黄色がかった粉末である（ＭＷ遊離塩基：６２９．８３ｇ／ｍｏｌ）。薬物物質は、水又は０．１ＭのＨＣｌに非常にわずかに可溶性であり、硬ゼラチンカプセル（Ｐｈ．Ｅｕｒ）に充填することができる。

以前に、非臨床動物腫瘍モデルにおいて、非経口投与ＷＸ−ＵＫ１が、移植された腫瘍の増殖速度を低下させ、近くのリンパ節への浸潤、及び転移の遠位標的器官へのその拡散を阻害することが示されている。同じ動物腫瘍モデルにおいて、プロドラッグＷＸ−６７１の経口投与は、非経口ＷＸ−ＵＫ１としての腫瘍関連エンドポイントの低減において同様に有効であった。プロドラッグとして、ＷＸ−６７１は、インビトロでセリンプロテアーゼ阻害剤として不活性であり、腸管吸収後にＷＸ−ＵＫ１に活性化される。以前に、活性代謝産物ＷＸ−ＵＫ１は、それぞれ０．６５〜０．９μΜ及び１．４６〜２．４μΜのＫ_ｉ値を有するウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）及びプラスミンを阻害したことが示された。加えて、ＷＸ−ＵＫ１は、０．０３７μＭのＫ_ｉ値を有するウシのトリプシンを阻害した。以下で論じられるように、ＷＸ−ＵＫ１は０．０３７μΜのＫ_ｉ値を有していたため、特異性（Ｋｉ値）は、ヒトトリプシンなどの他の哺乳動物と同じであろうことを意味しない。

本明細書に示される態様によると、ヒトセリンプロテアーゼとＷＸ−ＵＫ１との間の阻害定数（Ｋ_ｉ値）は、０．２５μΜ以下、０．２０μΜ以下、０．１５μΜ以下、及び０．１０μΜ以下である。一実施形態において、ヒトトリプシン−１とＷＸ−ＵＫ１との間のＫ_ｉ値は、０．５０μΜ〜０．１０μΜ、０．３０μΜ〜０．２μΜ、約０．１９±０．０１μΜである。一実施形態において、ヒトトリプシン−２とＷＸ−ＵＫ１との間のＫ_ｉ値は、０．０５０μΜ〜０．０１０μΜ、０．６０μΜ〜０．０９０μΜ、０．０７０μΜ〜０．０８０μΜ、約０．０７５±０．００３μΜである。一実施形態において、ヒトトリプシン−３とＷＸ−ＵＫ１との間のＫ_ｉ値は、０．００５μΜ〜０．０３０μΜ、０．０１０μΜ〜０．０２５μΜ、０．０１５μΜ〜０．０２０μΜ、約０．０１９±０．００４μΜである。一実施形態において、ヒトＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼとＷＸ−ＵＫ１との間のＫ_ｉ値は、０．５０μΜ〜０．１０μΜ、０．４０μΜ〜０．３μΜ、約０．２０±０．０１μΜである。

セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼは、実質的に全ての生物中に存在し、細胞の内側及び外側の両方で機能し、これらは、２つのファミリー、「トリプシン様」及び「サブチリシン様」として存在する。哺乳類セリンプロテアーゼは、共通の３Ｄ構造を有するが、表面の一部の領域には非常に有意な差があり、異なる生理学的機能を反映し、異なる分子との異なる相互作用をもたらす。

トリプシンは哺乳動物の間で大きく変化し、したがって、ウシトリプシンは、ヒトトリプシン１に対するセリンプロテアーゼホモログ（serine protease homolog、ＳＰＨ）であるが、これと同じではない。異なる哺乳動物間のトリプシンは、同様ではない。例えば、マウスは８個のトリプシンを有し、６個のヒトトリプシンのいずれとも類似していない。

予想外に、現時点まで固体腫瘍に対する治療的使用のための潜在的な抗腫瘍、抗転移剤として知られていたＷＸ−ＵＫ１が、膵炎、胃炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、炎症性肺疾患、及び炎症性血管疾患が挙げられるが、これらに限定されない、トリプシン駆動炎症性疾患の治療に潜在的な使用を有することが今では判明している。

ＷＸ−ＵＫ１とトリプシン−２との間の会合速度は、ＷＸ−ＵＫ１とｕＰＡとの間の会合速度よりも速く、ＷＸ−ＵＫ１の既知の標的であることが今では分かっている。更に、薬物結合動態試験により、ＷＸ−ＵＫ１とトリプシン−２との間の解離速度は、ＷＸ−ＵＫ１とｕＰＡとの間の会合速度よりも遅いことが今では分かっている。

ＷＸ−ＵＫ１とトリプシン−３との間の会合速度は、ＷＸ−ＵＫ１とｕＰＡとの間の会合速度よりも速く、ＷＸ−ＵＫ１の既知の標的であることが今では分かっている。更に、薬物結合動態試験により、ＷＸ−ＵＫ１とトリプシン−３との間の解離速度は、ＷＸ−ＵＫ１とｕＰＡとの間の会合速度よりも遅いことが今では分かっている。

一実施形態において、遅い解離は、多くの場合、高い結合親和性に関連するため、このような解離特性は、選択性及び毒性の問題に対するより大きな制御を提供する可能性があり、ＷＸ−ＵＫ１は、顕著な標的選択性及び広い治療用ウィンドウを表示する可能性が高い。逆に、ＷＸ−ＵＫ１は、副次的な標的に対するその潜在的な低い親和性のために、望ましくない有害事象媒介物からより速く解離する可能性がある。このような場合、薬の有益な効果が有害事象より長く続く可能性が高いように、薬物一次標的複合体は望ましくない複合体よりも長持ちする。

トリプシン−２及びトリスピン−３がＷＸ−ＵＫ１の高親和性標的であることを発見することによって、癌を治療するために教示されているＷＸ−ＵＫ１（又はそのプロドラッグＷＸ−６７１）の用量と比較して、ＷＸ−ＵＫ１又はそのプロドラッグＷＸ−６７１のよりも低い用量が、トリプシン駆動炎症性疾患を治療するために必要とされ得ると考えられる。

一実施形態において、トリプシン駆動炎症性疾患のために患者を治療するとき、ＷＸ−６７１は、治療有効性を高めるために他の医薬品と同時投与される。一実施形態において、トリプシン駆動炎症性疾患のために患者を治療するとき、ＷＸ−ＵＫ１は、治療有効性を高めるために他の医薬品と同時投与される。

ヒトトリプシン−２及びヒトトリプシン−３
トリプシンは、通常、上部胃腸管に放出された消化酵素とみなされる。トリプシンの３つのアイソフォームは、すなわち、カチオン性トリプシンのＰＲＳＳ１、アニオン性トリプシンのＰＲＳＳ２、及びメソトリプシンのＰＲＳＳ３は、膵臓からクローニングされている。従来、膵臓酵素と考えられていたが、ニューロン、上皮、及び内皮細胞などの多数の異なる細胞型によって合成された異なる形態のトリプシンは、他の組織内で放出され得る。特に、メソトリプシンは、正常な結腸粘膜に由来する上皮細胞株（ＮＣＭ−４６０）で発現される。トリプシン様活性の有意な増加は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の動物モデルの結腸内腔洗浄液及び結腸組織において検出された。ＩＢＤ患者の組織生検から収集されたデータは、健康な個体において検出された活性と比較して、トリプシン様酵素と同様の増加したセリンプロテアーゼ活性を示した。これらの結果は、腸内トリプシン活性の制御されていない増加が、慢性的に炎症した腸内で起こり、ＩＢＤの病因において役割を果たし得ることを強く示唆している。更に、膵臓内のトリプシンの早期活性化は、自己消化を通しての自己破壊をもたらし、ひいては膵炎をもたらす。トリプシンは、プロテイナーゼ活性化受容体２（proteinase-activated receptor 2、ＰＡＲ_２）の強力な活性化因子であり、身体全体に広く分布し、炎症において重要な役割を果たすと考えられるＧタンパク質結合受容体である。ＰＡＲは、受容体を刺激するテザーリガンドのタンパク質分解性アンマスキングを含む固有の活性化機構によって特徴付けられる。

ヒト膜型セリンプロテアーゼ１（ＭＴ−ＳＰ１）／マトリプターゼ
予想外に、現時点まで固体腫瘍に対する治療的使用のための潜在的な抗腫瘍、抗転移剤として知られていたＷＸ−ＵＫ１が、両方とも非癌性適応症である炎症性皮膚疾患及び炎症性血管疾患が挙げられるが、これらに限定されない、ＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼ駆動炎症性疾患の治療に潜在的な使用を有することが今では判明している。

ＷＸ−ＵＫ１とマトリプターゼとの間の会合速度は、ＷＸ−ＵＫ１とｕＰＡとの間の会合速度よりも速く、ＷＸ−ＵＫ１の既知の標的であることが今では分かっている。更に、薬物結合動態試験により、ＷＸ−ＵＫ１とマトリプターゼとの間の解離速度は、ＷＸ−ＵＫ１とｕＰＡとの間の会合速度よりも遅いことが今では分かっている。

一実施形態において、遅い解離は、多くの場合、高い結合親和性に関連するため、このような解離特性は、選択性及び毒性の問題に対するより大きな制御を提供する可能性があり、ＷＸ−ＵＫ１は、顕著な標的選択性及び広い治療用ウィンドウを表示する可能性が高い。逆に、ＷＸ−ＵＫ１は、副次的な標的に対するその潜在的な低い親和性のために、望ましくない有害事象媒介物からよりも速く解離する可能性がある。このような場合、薬の有益な効果が有害事象より長く続く可能性が高いように、薬物一次標的複合体は望ましくない複合体よりも長持ちする。

マトリプターゼがＷＸ−ＵＫ１の高親和性標的であることを発見することによって、癌を治療するために教示されているＷＸ−ＵＫ１（又はそのプロドラッグＷＸ−６７１）の用量と比較して、ＷＸ−ＵＫ１又はそのプロドラッグＷＸ−６７１のより低い用量が、マトリプターゼ駆動炎症性疾患を治療するために必要とされ得ると考えられる。

ＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼは、ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（transmembrane serine protease、ＴＴＳＰ）ファミリーのメンバーであり、広範なヒト組織において検出される全てのＴＴＳＰの最も広い発現パターンを有する。ＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼは、凝固カスケードを上皮シグナル伝達及びタンパク質分解に結びつけることが示されている。マトリプターゼと凝固開始との間の関連は、炎症における外因性経路活性化の病原性効果に寄与し得る。研究は、マトリプターゼが、炎症刺激に応答して活性化されることを示している。マトリプターゼは、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（urokinase-type plasminogen activator、ｕＰＡ）、肝細胞増殖因子（hepatocyte growth factor、ＨＧＦ）、及びＰＡＲ_２のプロフォームを切断かつ活性化する。

マトリプターゼとその阻害剤である肝細胞増殖因子活性化因子阻害剤（hepatocyte growth factor activator inhibitor、ＨＡＩ−１）は、正常な表皮バリア機能に必要であり、マトリプターゼ活性はプロセス中に厳密に調節される。マトリトリプターゼが皮膚バリア形成及びマトリプナーゼ活性の非常に厳密な調節において果たす役割を考慮すると、不適切な上昇は、表皮分化に悪影響を及ぼし、疾患表現型を強化するか、又は皮膚疾患からの回復を延長する可能性がある。多くの皮膚疾患は、サイトカイン放出をもたらす炎症性白血球の動員に関連する炎症を伴う。

更に、最近の研究では、そのタンパク質分解活性に依存して、内皮細胞におけるＰＡＲ２の活性化を通して、炎症誘発性サイトカインＩＬ−８及びＩＬ−６の新たな合成を刺激することが判明している。更に、ＰＡＲ_２は、ＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼ誘導ＩＬ−８発現のメディエーターとして同定されている。ＭＴ−ＳＰ１／マトリトリプターゼは単球で発現され、したがって、内皮ＰＡＲ２との単球ＭＴ−ＳＰ１／マトリトリプターゼとの相互作用は、動脈炎及びアテローム性動脈硬化症を含むが、これらに限定されない炎症性血管疾患に寄与し得る。

恐らく、マトリプターゼは、皮膚障害、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、変形性関節症、及びある特定のウイルス表面糖タンパク質の活性化を含むが、これらに限定されない、いくつかの生理学的及び病態生理学的機能に関与する。

過敏性腸症候群を治療するための本発明の化合物
過敏性腸症候群（「ＩＢＳ」）は、根本的な損傷の証拠がない腹部痛及び排便のパターンの変化を含む、症状の群を有する機能性胃腸障害を指す。トリプシン−３は、刺激された腸上皮細胞及びＩＢＳ患者からの組織内で上方調節されることが示されている。この上方調節は、全てプロテアーゼ活性化受容体−２依存性機構によって、ヒト粘膜下腸内ニューロン及びマウス感覚ニューロンへのシグナル伝達を引き起こし、インビボでの内臓過敏症を誘発させる。トリプシン−３は、ＩＢＳ患者における上皮機能不全のマーカーとして使用することができる。一実施形態において、有効量のＷＸ−ＵＫ１又はそのプロドラッグＷＸ−６７１は、過敏性腸症候群を有する患者に好適な期間にわたって投与される。一実施形態において、ＷＸ−ＵＫ１又はそのプロドラッグＷＸ−６７１は、単独療法として単独で投与される。一実施形態において、ＷＸ−ＵＫ１又はそのプロドラッグＷＸ−６７１は、別の薬剤と同時投与される。

膵炎を治療するための本発明の化合物
膵消化酵素は、膵臓腺細胞において不活性化された前駆体として保存され、通常、小腸に到達した後にのみ活性化される。通常の条件下では、消化酵素の活性化は厳密に制御されている。トリプシノーゲンは、膵臓により高濃度で産生される。胃腸管への分泌後、これらは、エンテロキナーゼによってトリプシンに活性化される。トリプシンは主要な消化酵素であり、これらは他の膵臓酵素を更に活性化する。膵臓内の膵臓細胞は、膵臓内のトリプシン活性化に対する安全保護として機能するトリプシン阻害剤のセリンプロテアーゼインヒビターＫａｚａｌタイプ１（ＳＰＩＮＫ１）を分泌する。トリプシノーゲン３は、膵臓内の微量のトリプシノーゲンアイソフォームである。トリプシン１及び２とは対照的に、トリプシン３は、膵ＳＰＩＮＫ１を分解し、これは、過剰な活性トリプシン及び膵炎の発症をもたらし得る。トリプシノーゲン活性化は、膵炎の重症度を決定する因子である。一実施形態において、有効量のＷＸ−ＵＫ１又はそのプロドラッグＷＸ−６７１は、膵炎を有する患者に好適な期間にわたって投与される。一実施形態において、ＷＸ−ＵＫ１又はそのプロドラッグＷＸ−６７１は、単独療法として単独で投与される。一実施形態において、ＷＸ−ＵＫ１又はそのプロドラッグＷＸ−６７１は、別の薬剤と同時投与される。

肺損傷を治療するための本発明の化合物
一実施形態において、有効量のＷＸ−ＵＫ１又はそのプロドラッグＷＸ−６７１は、動物の肺損傷に関連する症状を停止又は軽減することができる好適な期間にわたって投与される。理論に束縛されるものではないが、トリプシンは、補体系を活性化することによって、及び白血球活性化を生成することによって、肺血管損傷を誘発する場合がある。活性化された白血球及び酸素ラジカル、プロテアーゼ、及びサイトカインを含むそれらの分泌産物は、その後、組織破壊において重要であり得る。トリプシン及び循環トリプシノーゲンの活性化は、膵炎関連肺損傷（pancreatitis-associated lung injury、ＰＡＬＩ）に寄与する。急性肺損傷（acute lung injury、ＡＬＩ）は、肺内で流体が蓄積する状態である。血流及び生命維持に重要な臓器内に十分な酸素を得ることが困難になる。急性呼吸窮迫症候群（acute respiratory distress syndrome、ＡＲＤＳ）は、肺における広範な炎症を特徴とするＡＬＩの例である。肺において、トリプシンは、マトリックス分解タンパク質分解カスケードを開始するだけでなく、炎症誘発性作用によっても組織損傷を誘発し得る。活性化されたトリプシンは、肺血管系への損傷を引き起こし、内皮透過性を増加させる。以前の実験室実験では、トリプシンは、肺血管系内に白血球うっ滞を引き起こすことが示されており、したがって活性化されたトリプシンは、肺微小循環中の血管内凝固を強化することができる。死後研究では、急性膵炎を有する患者は、肺を含む異なる組織に血管内フィブリン血栓を有することが示されている。トリプシンは、異なる補体因子を直接活性化することができ、これは、細胞分解及び走化性白血球を刺激することができる。補体は、呼吸不全を発症する可能性を高めるＡＲＤＳを生成することが示されている。一実施形態において、有効量のＷＸ−ＵＫ１又はそのプロドラッグＷＸ−６７１は、肺損傷を有する患者に好適な期間にわたって投与される。一実施形態において、ＷＸ−ＵＫ１又はそのプロドラッグＷＸ−６７１は、単独療法として単独で投与される。一実施形態において、ＷＸ−ＵＫ１又はそのプロドラッグＷＸ−６７１は、別の薬剤と同時投与される。

本発明の化合物の、ヒトセリンプロテアーゼの阻害剤としての有効性は、関連する精製セリンプロテアーゼ、及び適切な合成基質を使用して決定することができる。関連するセリンプロテアーゼによる発色性又は蛍光性基質の加水分解速度は、本発明の化合物の非存在下及び存在下の両方で測定することができる。アッセイは、室温又は３７℃で行うことができる。基質の加水分解は、アミノトリフルオロメチルクマリン（amino trifluoromethylcoumarin、ＡＦＣ）の放出をもたらし、これは、４０５ｎｍでの励起による５１０ｎｍでの発光の増加を測定することによって、分光光度測定によりモニターした。阻害剤の存在下での蛍光変化率の減少は、酵素阻害を示す。このような方法は、当業者に既知である。このアッセイの結果は、阻害定数、Ｋ_ｉとして表される。

一実施形態において、ＷＸ−ＵＫ１は、８０ｋｇの患者に対して、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４．０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約３．５ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ〜約２．８ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約２．１ｍｇ／ｋｇ、及び約１．１ｍｇ／ｋｇ〜約１．６ｍｇ／ｋｇの投与量で、静脈内投与され得る。静脈内注入は、中心静脈又は末梢静脈カテーテルを介して投与されてもよい。１０００ｍＬの総体積は、注入ポンプによって５００ｍＬ／時間の速度で２時間にわたって投与され得る。一実施形態において、ＷＸ−ＵＫ１注入は、適切な期間にわたって週１回投与されてもよい。一実施形態において、ＷＸ−ＵＫ１注入は、適切な期間にわたって週２回投与されてもよい。一実施形態において、ＷＸ−ＵＫ１注入は、適切な期間にわたって週３回投与されてもよい。一実施形態において、ＷＸ−ＵＫ１注入は、適切な期間にわたって週４回投与されてもよい。一実施形態において、ＷＸ−ＵＫ１注入は、適切な期間にわたって週５回投与されてもよい。

本明細書に示される態様によると、化合物Ｎ−α−（２，４，６−トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−アミジノ−（Ｌ）−フェニルアラニン４−エトキシカルボニルピペラジド（「ＷＸ−ＵＫ１」）に対する高親和性標的は、健康及び疾患における重要な影響が特定されており、ヒト炎症性血管疾患の治療におけるＷＸ−ＵＫ１の重要な使用を示す。本出願の出願日の前には、ＷＸ−ＵＫ１は、とりわけ、癌の治療において投与するために開示されていた。しかしながら、ＷＸ−ＵＫ１は、動脈炎及びアテローム性動脈硬化症を含むが、これらに限定されない血管炎の治療には知られていなかった。一実施形態において、以下に詳述するように、ＷＸ−ＵＫ１及びそのプロドラッグＷＸ−６７１は、動脈炎の治療に使用することができる。一実施形態において、ＷＸ−ＵＫ１及びそのプロドラッグＷＸ−６７１は、アテローム性動脈硬化症の治療に使用することができる。

ＰＡＲ_２は、トリプシンなどの炎症誘発性プロテアーゼによって活性化され、またＴＦ−依存性ＦＶＩＩ／Ｘａ／マトリプターゼ経路によっても活性化される。一実施形態において、ＷＸ−ＵＫ１は、ヒトトリプシン及びヒトマトリプターゼが、ヒトプロテアーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ_２）の細胞外Ｎ末端ドメインを切断することを阻害し、その結果ＰＡＲ_２が活性化されないと考えられている。一実施形態において、ＰＡＲ_２の活性化を遮断することにより、炎症性プロセスは低減又は停止される。一実施形態において、ＷＸ−ＵＫ１は、ヒトトリプシン及びヒトマトリプターゼを阻害し、次いで、一次求心神経及び粘膜下腸ニューロンなどの感覚ニューロンのシグナル伝達に関与するＰＡＲ_２依存機構を遮断し、したがって、神経新生炎症及び疼痛の減少をもたらすと考えられている。本明細書に示される態様によれば、ＷＸ−ＵＫ１又はそのプロドラッグＷＸ−６７１は、ＰＡＲ_２障害の治療のための治療効果のある化合物として使用することができる。

本明細書に示される態様によると、化合物Ｎ−α−（２，４，６−トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−アミジノ−（Ｌ）−フェニルアラニン４−エトキシカルボニルピペラジド（「ＷＸ−ＵＫ１」）に対する高親和性標的は、健康及び疾患における重要な影響が特定されており、ヒトα−１アンチトリプシン欠損症（Ａ１ＡＤ）の治療におけるＷＸ−ＵＫ１の重要な使用を示す。Ａ１ＡＤは、α−１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、最も豊富なヒトセリンプロテアーゼインヒビターの産生不良を引き起こす遺伝子障害であり、血液及び肺におけるＡ１ＡＴ活性の低下、並びに肝臓細胞における過剰な異常Ａ１ＡＴタンパク質の沈着をもたらす遺伝子障害である。本出願の出願日の前には、ＷＸ−ＵＫ１は、とりわけ、癌の治療において投与するために開示されていた。しかしながら、ＷＸ−ＵＫ１は、Ａ１ＡＤの治療については知られていなかった。一実施形態において、ＷＸ−ＵＫ１及びそのプロドラッグＷＸ−６７１は、満たされていない医療ニーズがあるヒトＡ１ＡＤの治療に使用することができる。

一実施形態において、疾患を治療するためにトリプシン−３阻害剤を必要とする患者で使用するためのキットは、複数の固形形態のＮ−α−（２，４，６−トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−ヒドロキシアミジノ−（Ｌ）−フェニルアラニン４−エトキシカルボニルピペラジド（「ＷＸ−６７１」）を含む１つ以上の容器を含み、固形形態は、患者を治療するために治療有効量のＷＸ−６７１を含む。一実施形態において、固形形態は、薬学的に許容される賦形剤又は担体を更に含む医薬組成物の一部である。一実施形態において、医薬組成物は、単一の単位剤形である。一実施形態において、医薬組成物は錠剤である。一実施形態において、医薬組成物はカプセル剤である。

一実施形態において、疾患を治療するためにトリプシン−２阻害剤を必要とする患者で使用するためのキットは、複数の固形形態のＮ−α−（２，４，６−トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−ヒドロキシアミジノ−（Ｌ）−フェニルアラニン４−エトキシカルボニルピペラジド（「ＷＸ−６７１」）を含む１つ以上の容器を含み、固形形態は、患者を治療するために治療有効量のＷＸ−６７１を含む。一実施形態において、固形形態は、薬学的に許容される賦形剤又は担体を更に含む医薬組成物の一部である。一実施形態において、医薬組成物は、単一の単位剤形である。一実施形態において、医薬組成物は錠剤である。一実施形態において、医薬組成物はカプセル剤である。

実施例１
バイオインフォマティクス分析
図２に概略的に示されるように、選択プロセスの出発点は、ヒトプロテアソームの約２００個のトリプシン様セリンプロテアーゼであり、そのほとんどは恒常性及び疾患において、並びにＷＸ−ＵＫ１による阻害のために様々な効力を有する全ての潜在的標的において、重要な役割を果たす。反復プロセスの適用により、潜在的な高親和性標的の選択が徐々に小さくなった。トリプシン様特異性を有する全てのヒトキモトリプシン様セリンプロテアーゼの配列データベース及び利用可能な構造情報を完全に分析することによって、ＷＸ−ＵＫ１阻害の構造及び配列に基づく基準を、選択されたプロテアーゼのＷＸ−ＵＫ１阻害を測定することによって試験する循環反復プロセスを実行し、図３に示すようにキー構造成分を解明した。これらの中でも、可能性のあるＷＸ−ＵＫ１：プロテアーゼ複合体の計算された３Ｄ構造モデルの検査からの結合の可能性の高い評価に基づいて、生化学分析のサブセットを選択し、相互作用表面の残基に着目した配列アラインメントを選択した。選択されたプロテアーゼの試料を調製し、ＷＸ−ＵＫ１−１による阻害の阻害定数（Ｋｉ）及び相互作用の親和性（Ｋ_ｄ）に関して生化学的に特徴付けた。Ｋ_ｉ値は、一連の酵素活性アッセイから決定され、ここでは、ＷＸ−ＵＫ１濃度を増加させた存在下でのアルブミンの存在下で、３７℃で発色基質の代謝回転により監視した。可能な場合、結合の解離定数Ｋ_ｄは、最新の表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ）を使用して決定し、全て２５℃で会合速度定数及び解離速度定数のリアルタイム動態を監視した。

実施例２
様々なヒトプロテアーゼに対するＷＸ−ＵＫ１の阻害定数
Ｋ_ｉ値は、発色基質のヒトセリンプロテアーゼ開裂に対するＷＸ−ＵＫ１の効果を測定することによって決定した。Ｋ_ｉ値の決定については、発色基質を添加して反応を開始する前に、一連の濃度のＷＸ−ＵＫ１を標的ヒトセリンプロテアーゼと共にプレインキュベートした。反応速度を、線形回帰を使用して勾配から決定し、これらを非阻害反応のものに正規化した。正規化された活性をＷＸ−ＵＫ１濃度に対してプロットした後、Ｋ_ｉ値を、等式１を用いて非線形回帰によって得た。

ＫＭ−パラメータは、標準的なミカエリス・メンテン速度式によって得られた。セリンプロテアーゼを、実験Ｖｍａｘ値を得るのに十分に高い好適な濃度の基質に添加した。その後の反応速度を、基質濃度に対してプロットした後、ミカエリス・メンテンの式（２）を用いてＫＭ値を導出した。

全ての実験は、ＨＢＳ（３０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ＝７．４；１５０ｍＭのＮａＣｌ；０．５％のＢＳＡ）中、３７℃で少なくとも３回実施した。反応を、４０５ｎｍにおいて、２読み取り／分で、少なくとも４５分間監視した。ＷＸ−ＵＫ１を１００％のＤＭＳＯ中に保存したため、プロテアーゼ活性に対する望ましくないＤＭＳＯ効果を排除するために、全ての実験には阻害されていないＤＭＳＯ−対照が含まれた。ＷＸ−ＵＫ１の水への溶解度が低いため、最大最終ＷＸ−ＵＫ１濃度は２５０μΜであった。基質濃度を、１回の実行当たり約１０％の代謝回転を維持するために、高く保った。

ＷＸ−ＵＫ１によるヒトトリプシン−１の阻害
図４は、ヒトトリプシン−１阻害剤濃度に対するＵＫ１活性のグラフである。

ＷＸ−ＵＫ１によるヒトトリプシン−２の阻害
図５は、ヒトトリプシン−２阻害剤濃度に対するＵＫ１活性のグラフである。

ＷＸ−ＵＫ１によるヒトトリプシン−３の阻害
図６は、ヒトトリプシン−３阻害剤濃度に対するＵＫ１活性のグラフである。

ＷＸ−ＵＫ１によるヒトＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼの阻害
図７は、ヒトマトリプターゼ（触媒ドメイン）阻害剤濃度に対するＵＫ１活性のグラフである。

上述したように、ヒトプロテアソームの約２００個のトリプシン様セリンプロテアーゼのバイオインフォマティクス分析を実施したが、そのほとんどは恒常性及び疾患において、並びにＷＸ−ＵＫ１による阻害のために様々な効力を有する全ての潜在的標的において、重要な役割を果たす。これらの中でも、我々は、可能性のあるＷＸ−ＵＫ１：プロテアーゼ複合体の計算された３Ｄ構造モデルの検査からの結合の可能性の高い評価に基づいて、生化学分析のサブセットを選択し、相互作用表面の残基に着目した配列アラインメントを選択した。様々な基準に基づいて、サブセットの選択を絞り込んだ。

以下の表１は、現在までのこのサブセット中のプロテアーゼの一部のＫ_ｉ値を掲載する。

実施例３
ＷＸ−ＵＫ１の様々なヒトプロテアーゼへの結合動態
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、入射光によって刺激された負の誘電材料と正の誘電率材料との間の界面における伝導電子の共振振動である。ＳＰＲは、平面金属（典型的には金又は銀）表面上又は金属ナノ粒子の表面上への材料の吸着を測定するための多くの標準的なツールの基礎である。多色ベースのバイオセンサ用途及び異なるラボオンチップセンサーの背後にある基本原理である。表面プラズモン波が、粗面などの局所的な粒子又は不規則性と相互作用するとき、エネルギーの一部は、光として再放射され得る。この放射された光は、金属膜の後方で様々な方向から検出することができる。

２つのリガンドの親和性が決定されなければならない場合、結合定数は決定される必要がある。これは、生成物の商の平衡値である。この値はまた、動的ＳＰＲパラメータを使用して見出すことができ、任意の化学反応のように、会合速度を解離速度で除算したものである。このため、釣り餌（bait）リガンドは、ＳＰＲ結晶のデキストラン表面上に固定化される。マイクロフローシステムを介して、餌食（prey）分析物を有する溶液が、釣り餌層の上に注入される。餌食分析物が釣り餌リガンドに結合すると、ＳＰＲシグナル（応答単位、ＲＵで表される）の増加が観測される。所望の会合時間後、餌食分析物を含まない溶液（通常は緩衝液）が、マイクロ流体に注入され、これは、釣り餌リガンドと餌食分析物との間の結合した複合体を解離させる。餌食分析物が釣り餌リガンドから解離すると、ＳＰＲシグナル（応答単位、ＲＵで表される）の減少が観測される。これらの会合（「オンレート」、ｋ_ａ）及び解離速度（「オフレート」、ｋ_ｄ）から、平衡解離定数（「結合定数」、Κ_Ｄ）を計算することができる。

実際のＳＰＲシグナルは、入射光の電磁「結合」によって、金層の表面プラズモンによって説明することができる。このプラズモンは、金−溶液界面にわたる、すなわち、釣り餌タンパク質、及び場合によっては餌食タンパク質にわたるわずか数ナノメートルの層によって影響され得る。結合は、反射角を変化させる。

Ｂｉａｃｏｒｅは、タンパク質−タンパク質相互作用、小分子／断片タンパク質相互作用を含む生体分子相互作用の測定を専門とする。その技術は、結合親和性だけでなく、速度定数及び熱力学も測定するために使用されることが多い。この技術は、ＳＰＲに基づいている。ＳＰＲベースのバイオセンサは、活性濃度の決定、並びに親和性及び化学的動態の両方の観点から分子相互作用の特性評価に使用することができる。

様々なセリンプロテアーゼに対するＷＸ−ＵＫ１の結合速度を決定するために、以下の実験を実施した。
Ｂｉａｃｏｒｅ用の緩衝組成物及び希釈方法：
・固定化緩衝液（０．５Ｌ）：
−３０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４
−１４０ｍＭのＮａＣｌ
・ランニング緩衝液（０．５Ｌ）：
−３０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４
−１４０ｍＭのＮａＣｌ
−０．５％のＢＳＡ
−０．１％のＴｗｅｅｎ２０
−０．０５％のＤＭＳＯ（後に添加）
・希釈：
−ＤＭＳＯを添加する前に、５０ｍＬのランニング緩衝液を除去する（「−ＤＭＳＯ」と呼ばれる）。
−２２５μＬのＤＭＳＯをランニング緩衝液に添加する。
−ＤＭＳＯを含む５０ｍＬのランニング緩衝液を除去する（「＋ＤＭＳＯ」と呼ばれる）
−４μΜ〜０μΜの一連の濃度のＷＸ−ＵＫ１ストック：
−１００％のＤＭＳＯ中の８ｍＭのＷＸ−ＵＫ１のストックを調製する。
−「−ＤＭＳＯ」ストックを使用して４μΜに希釈する。この後、「＋ＤＭＳＯ」緩衝液を使用して全ての希釈液を作製する。

図８は、ヒトｕＰＡの設定を示す概略図であり、図９は、ヒトｕＰＡに対するＷＸ−ＵＫ１結合の結合動態を示す。

図１０は、ヒトトリプシン−１、ヒトトリプシン−３、及びヒトＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼの設定を示す概略図である。図１１は、トリプシン−１に対するＷＸ−ＵＫ１結合の結合動態を示す。図９及び１１を比較すると、ＷＸ−ＵＫ１が、ｕＰＡよりも１０倍速くトリプシン−１に会合し、ｕＰＡよりも２倍遅くトリプシン−１から解離することが分かる。図１２は、トリプシン−３に対するＷＸ−ＵＫ１結合の結合動態を示す。図９及び１２の比較は、ＷＸ−ＵＫ１が、ｕＰＡよりも３倍速くトリプシン−３に会合し、ｕＰＡよりも１００倍遅くトリプシン−３から解離することを示している。図１３は、ヒトＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼに対するＷＸ−ＵＫ１結合の結合動態を示す。図９及び１３の比較は、ＷＸ−ＵＫ１がｕＰＡよりも３倍速くＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼに会合し、ｕＰＡよりも１０倍遅くＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼから解離することを示している。

当業者であれば、本明細書に記載される化合物、組成物、及びその使用方法に対する多数の等価物を認識するか、又は確認することができるであろう。このような等価物は、本開示の範囲内であると考えられ、以下の実施形態によって網羅される。

当業者であれば、広範に記載される本発明の範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されるように、多数の変形及び／又は修正が本発明になされ得ることが理解されるであろう。したがって、本実施形態は、全ての点で限定的ではなく、例示的なものとして考慮されるべきである。

Claims (20)

1. 非癌性医学的状態を有する動物から生体試料を得ることと、
   前記試料を試験して、トリプシン濃度を得ることと、を含み、前記トリプシン濃度が正常性の上限を上回る場合、前記動物が、薬学的に許容可能な担体と、化合物Ｎ−α−（２，４，６−トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−ヒドロキシアミジノ−フェニルアラニン−４−エトキシカルボニルピペラジド、立体異性体、ラセミ混合物、代謝産物、薬学的に許容される塩、結晶、又はこれらの任意の組み合わせと、を含む治療有効量の医薬組成物を前記動物に投与することによって、適切な期間治療される、方法。
2. 前記生体試料が、血液、血清、尿、唾液、十二指腸液、及び腸粘膜生検からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記非癌性医学的状態が、膵炎、胃炎、過敏性腸症候群、及び炎症性腸疾患からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
4. 前記非癌性医学的状態が、過敏性腸症候群である、請求項３に記載の方法。
5. 前記過敏性腸症候群が、便秘優位型の過敏性腸症候群である、請求項４に記載の方法。
6. 前記過敏性腸症候群が、下痢優位型の過敏性腸症候群である、請求項４に記載の方法。
7. 前記非癌性医学的状態が、炎症性腸疾患である、請求項３に記載の方法。
8. 前記炎症性腸疾患が、クローン病である、請求項７に記載の方法。
9. 前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎である、請求項７に記載の方法。
10. 前記非癌性医学的状態が、急性膵炎である、請求項１に記載の方法。
11. 前記医薬組成物が、経口投与可能な形態である、請求項１に記載の方法。
12. 前記化合物が、硫酸塩又は硫酸水素塩として存在する、請求項１に記載の方法。
13. 前記化合物が、
    Ｎ−α−（２，４，６−トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−ヒドロキシアミジノ−（Ｌ）−フェニルアラニン−４−エトキシカルボニルピペラジド、
    Ｎ−α−（２，４，６−トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−ヒドロキシアミジノ−（Ｄ）−フェニルアラニン−４−エトキシカルボニルピペラジド、及び
    Ｎ−α−（２，４，６−トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−ヒドロキシアミジノ−（Ｄ，Ｌ）−フェニルアラニン−４−エトキシカルボニルピペラジド、
    又はその生理学的に適合性の塩からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
14. 前記化合物が、Ｎ−α−（２，４，６−トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−ヒドロキシアミジノ−（Ｌ）フェニルアラニン−４−エトキシカルボニルピペラジド硫酸水素塩である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記化合物が、Ｎ−α−（２，４，６トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−ヒドロキシアミジノ−（Ｌ）フェニルアラニン−４−エトキシカルボニルピペラジド又はその生理学的に適合性の塩の結晶形態である、請求項１３に記載の方法。
16. 前記動物が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
17. 前記生体試料を試験して、トリプシン−３のレベルを得る、請求項１に記載の方法。
18. 前記生体試料を試験して、トリプシン−２のレベルを得る、請求項１に記載の方法。
19. 前記医薬組成物が、前記非癌性医学的状態の治療のために承認された別の薬剤と同時投与される、請求項１に記載の方法。
20. 過敏性腸症候群を有するヒトから十二指腸流体の生体試料を得ることと、
    前記試料を試験して、トリプシン−３濃度を得ることと、を含み、前記トリプシン−３濃度が正常性の上限を上回る場合、前記ヒトが、薬学的に許容可能な担体と、化合物Ｎ−α−（２，４，６−トリイソプロピルフェニルスルホニル）−３−ヒドロキシアミジノ−（Ｌ）フェニルアラニン−４−エトキシカルボニルピペラジド硫酸水素塩と、を含む治療有効量の医薬組成物を前記ヒトに投与することによって、適切な期間治療される、方法。

Images