JP2020522529A - 癌の治療または予防のための薬剤およびその使用 - Google Patents
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
Description
本発明は概して癌を治療または予防する薬剤に関する。より具体的には、本発明は、癌(転移癌を含む)の発達、進行もしくは再発を治療または予防するための方法および組成物における、NF-κB受容体(RANK)リガンドのアンタゴニストおよび免疫チェックポイント分子を含む治療薬組合せに関する。
免疫療法は近年、癌治療で高い有望性を示し始め、転移メラノーマの治療では格段の進歩が達成されて、免疫チェックポイント分子封鎖抗体が承認された。イピリムマブ(抗細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA-4)抗体)は、抗腫瘍免疫をアップレギュレートするように作用し、前記は、転移メラノーマを有する患者を含むフェース3試験で全生存の改善に密接に関係する最初の薬剤であった(以下を参照されたい:Wolchok et al., 2013, New Engl J Med, 369:122-133;Smyth et al., 2016, J. Clin. Oncol. 34(12):e104-106)。まだ完全には解明されていない理由により、イピリムマブは患者の10%および15%のみが応答に関与し(Wolchock et al., 2013(上掲書);Smyth et al.2016(上掲書))、治療患者の約30%が長期生存を示した(Bostwick et al., 2015, J Immunoth Cancer, 3:19)。したがって、単独療法および併用治療の開発における急速な進行にもかかわらず、癌に起因する当該疾患の負担は顕著には除去されていない。
免疫チェックポイント分子、プログラム死1(PD-1)に対するモノクローナル抗体(MAb)の抗CTLA4との併用は、PD-1単独と比較して、進行メラノーマで優れた腫瘍応答および生存利益をもたらした。このことはは、腫瘍による免疫侵襲の非重複性メカニズムを標的とする併用免疫療法の重要性を明示する(以下を参照されたい:Larkin et al., 2015, N Eng J Med, 373:23-24;Postow et al., 2015, N Eng J Med, 372:2006-2017;およびWolchok et al., 2013(上掲書))。しかしながら、固形および血液学的悪性疾患の免疫療法における1つの難題は、現行の免疫療法併用に対して主要な耐性を示す患者のための新規な標的を見つけることである。
したがって、ある特徴では、本発明は、RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストを含む、それらから成る、または本質的にそれらから成る治療薬組合せを提供する。当該治療薬組合せは、それぞれRANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストを含む単一組成物(例えば混合物)の形態であり得る。また別には、RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストは、別々の組成物で別個の構成要素として提供され得る。
多数のRANKLおよびICMアンタゴニストが当業界では公知であり、そのいずれも本発明の実施に用いことができる。多様な実施態様で、アンタゴニストはアンタゴニスト抗原結合分子である。
これらの実施態様のいくつかでは、RANKLアンタゴニストは、RANKLと特異的に結合する抗RANKL抗原結合分子である。このタイプの例示的実施例では、抗RANKL抗原結合分子は、アミノ酸配列TEYLQLMVY(配列番号:1)(すなわち、配列番号:2で示される自然のままのRANKL配列の残基233−241)の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する。
いくつかの実施態様では、抗RANKL抗原結合分子はモノクローナル抗体(MAb)である。抗RANKL抗原結合分子の非限定的な例は、MAbデノスマブまたはその抗原結合フラグメントである。適切には、抗RANKL抗原結合分子は、配列番号:3に示される重鎖アミノ酸配列またはその抗原結合フラグメント、および/または配列番号:4に示される軽鎖アミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントを含む。
他の実施態様では、抗RANKL抗原結合分子はRANKLとの結合についてデノスマブと競合する。
いくつかの実施態様では、RANKLアンタゴニストはRANKと拮抗する。例えば、RANKアンタゴニスト(例えば抗RANK抗原結合分子またはアンタゴニストペプチド)は、CDR2(すなわち残基44−85)およびCRD3(すなわち残基86−123)から選択されるシステイン富裕ドメイン(CRD)の少なくとも一部分に対応するアミノ酸配列と特異的に結合するか、または前記を含むか、それらから成るかもしくは本質的に前記から成り得る。このタイプの非限定的な例では、RANKアンタゴニスト(例えば抗RANK抗原結合分子またはアンタゴニストペプチド)は、RANK CRD3の少なくとも一部分に対応するアミノ酸配列と特異的に結合するか、または前記を含むか、前記から成るかもしくは本質的に前記から成り、その代表的な例には、YCWNSDCECCY(配列番号:5)、YCWSQYLCY(配列番号:6)が含まれる。
適切には、それぞれのICMアンタゴニストは抗ICM抗原結合分子である。具体的な実施態様では、抗ICM抗原結合分子は、抗PD-1抗原結合分子、抗PD-L1抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子から選択される。
抗PD-1抗原結合分子はMAbであり得る。その非限定的な例には、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、およびMEDI-0680(AMP-514)、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、BGB-317またはその抗原結合フラグメントが含まれる。また別には、抗PD-1抗原結合分子は、PD-1との結合についてニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、またはMEDI-0680と競合するものであり得る。
いくつかの実施態様では、抗PD-1抗原結合分子は、アミノ酸配列SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR(配列番号:9)(すなわち、配列番号:10に示される自然のままのPD-1配列の残基62から86)、および/またはアミノ酸配列SGTYLCGAISLAPKAQIKE(配列番号:11)(すなわち、配列番号:10に示される自然のままのPD-1配列の残基118から136)の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する。それと同じおよびその他の実施態様のいくつかでは、抗PD-1抗原結合分子は、アミノ酸配列NWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV(配列番号:12)(すなわち、配列番号:10に示される自然のままのPD-1配列の残基66から97に対応する)の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する。
いくつかの実施態様では、抗CTLA4抗原結合分子はMAbであり、その代表的な例にはイピリムマブおよびトレメリムマブまたはその抗原結合フラグメントが含まれる。また別には、抗CTLA4抗原結合分子は、CTLA4との結合についてイピリムマブまたはトレメリムマブと競合するものであり得る。このタイプの例示的な例では、抗CTLA4抗原結合分子は、YASPGKATEVRVTVLRQA(配列番号:15)(すなわち配列番号:16に示される完全長の自然のままのCTLA4アミノ酸配列の残基25から42)、DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD(配列番号:17)(すなわち配列番号:16に示される自然のままのCTLA4アミノ酸配列の残基43から65)、およびVELMYPPPYYLGIG(配列番号:18)(すなわち配列番号:16に示される自然のままのCTLA4アミノ酸配列の残基96から109)から選択されるアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する。
RANKLまたはICMアンタゴニストが抗原結合分子であるいくつかの実施態様では、抗原結合分子は、免疫グロブリン定常鎖(例えばIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3またはIgG4定常鎖)と連結する。免疫グロブリン定常鎖は、軽鎖(κ軽鎖またはラムダ軽鎖から選択される)および重鎖(γ1重鎖、γ2重鎖、γ3重鎖およびγ4重鎖から選択される)を含み得る。
ある種の実施態様では、治療薬組合せは、RANKLアンタゴニストおよび2つ以上の異なるICMアンタゴニストを含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。このタイプの代表的な例では、治療薬組合せは、RANKLアンタゴニスト並びにCTLA4アンタゴニスト、PD-1アンタゴニストおよびPD-L1アンタゴニストの少なくとも2つを含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。
具体的な実施態様では、治療薬組合せはマルチ特異性アンタゴニスト薬剤の形態であり、RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストを含む。マルチ特異性薬剤は2つ以上のポリペプチドの複合体であり得る。また別には、マルチ特異性薬剤は単一鎖ポリペプチドであり得る。RANKLアンタゴニストは、それぞれのICMアンタゴニストのN-末端でまたはC-末端で複合体化され得る。RANKLアンタゴニストおよびICMアンタゴニストは、直接的にまたは介在リンカー(例えばポリペプチドリンカー)によって結合され得る。有利な実施態様では、マルチ特異性アンタゴニスト薬剤は少なくとも2つの抗原結合分子を含む。適切には、そのようなマルチ特異性抗原結合分子は組換え分子の形態にある(キメラ、ヒト化およびヒト抗原結合分子を含む)。
関連する特徴では、本発明は、RANKLおよび少なくとも1つのICMに拮抗するマルチ特異性抗原結合分子を提供する。これらマルチ特異性抗原結合分子は、概して、RANKLまたはRANKと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを、さらにそれぞれのICMについては当該ICMと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。抗体および/または抗原結合フラグメントは、直接的にまたは介在リンカー(例えば化学的リンカーまたはポリペプチドリンカー)によって結合され得る。個々のマルチ特異性抗原結合分子は、抗体または抗原結合フラグメントが作動できるように結合されている単鎖ポリペプチドの形態であり得る。また別に、前記は、互いに連結され或いは会合して複合体を形成する複数の別個のポリペプチドを含むことができる。それと同じおよびその他の実施態様のいくつかでは、マルチ特異性抗原結合分子は二価、三価、または四価である。
適切な抗原結合フラグメントは、免疫グロブリン定常鎖(例えばIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、およびIgG4)に連結され得る。このタイプの代表的な例では、免疫グロブリン定常鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖から選択される軽鎖、および/またはγ1重鎖、γ2重鎖、γ3重鎖、およびγ4重鎖から選択される重鎖を含むことができる。
マルチ特異性抗原結合分子がPD-1と拮抗するいくつかの実施態様では、抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントは、SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR(配列番号:9)(すなわち、配列番号:10に示される自然のままのヒトPD-1配列の残基62から86)、SGTYLCGAISLAPKAQIKE(配列番号:11)(すなわち、配列番号:10に示される自然のままのヒトPD-1配列の残基118から136)、およびNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV(配列番号:12)(すなわち、配列番号:10に示される自然のままのヒトPD-1配列の残基66から97)から選択されるアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する。
同じ実施態様のいくつかおよび他の実施態様では、抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントは、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、およびMEDI-0680(AMP-514)、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、BGB-317またはその抗原結合フラグメントから選択されるMAbの重鎖および軽鎖を含む。
マルチ特異性抗原結合分子がPD-L1と拮抗するいくつかの実施態様では、抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントは、SKKQSDTHLEET(配列番号:13)(すなわち、配列番号:14に示される自然のままのヒトPD-L1アミノ酸配列の残基279から290)と特異的に結合する。このタイプの例示的抗体および抗原結合フラグメントは、デュルバルマブ(MEDI4736)、アテゾリズマブ(Tecentriq)、アベルマブ、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480およびMPDL3280A、またはその抗原結合フラグメントから選択されるMAbの重鎖および軽鎖を含むものを含む。
いくつかの実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は、抗RANKL抗原結合分子および抗PD-1抗原結合分を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。他の実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は、抗RANKL抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。さらに他の実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は、抗RANKL抗原結合分子、抗PD-1抗原結合分および抗PD-L1抗原結合分子を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。さらに他の実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は、抗RANKL抗原結合分子、抗PD-1抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。他の実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は、抗RANK抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。
いくつかの実施態様では、治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子は、デリバリービヒクル(例えばリポソーム、ナノ粒子、ミクロ粒子、デンドリマーまたはシクロデキストリン)に収納される。
さらに別の特徴では、本発明は、上記および本明細書のいずれかの場所に広く記載されるマルチ特異性抗原結合分子をコードする核酸配列を含む構築物(1つ以上の制御配列に作動できるように結合されている)を提供する。適切な構築物は、好ましくは発現構築物の抗体であり、その代表的な例にはプラスミド、コスミド、ファージおよびウイルスが含まれる。
本発明のさらに別の特徴は、上記および本明細書のいずれかの場所に広く記載される構築物を含む宿主細胞を提供する。
本発明のさらに別の特徴は、対象動物において免疫を刺激するかまたは増大させる方法を提供する。これらの方法は概して、上記に広く記載した治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子の有効量を対象動物に投与し、それによって対象動物において免疫を刺激するかまたは増大させる工程を含む。治療薬組合せでRANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストが別個の構成要素として提供される実施態様では、当該成分は適切には対象動物に同時発生的に投与される。このタイプの例示的な例では、RANKLアンタゴニストは少なくとも1つのICMアンタゴニストと同時に投与される。他の例示的な例では、RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストは逐次的に投与される。例えば、RANKLアンタゴニストは、少なくとも1つのICMアンタゴニストの投与前に投与することができる。適切には、RANKLアンタゴニストは、少なくとも1つのICMアンタゴニストの投与後に投与される。
典型的には、刺激または増大される免疫は有益な宿主免疫応答を含み、その例示的な例には以下のいずれか1つ以上が含まれる:腫瘍サイズの減少、腫瘍量の減少、疾患の安定化、内因性または外因性抗原に対する抗体の産生、免疫系の誘発、免疫系の1つ以上の成分の誘発、細胞媒介免疫およびその発生に必要とされる分子、液性免疫およびその発生に必要とされる分子、抗体依存細胞傷害性(ADCC)免疫およびその発生に必要とされる分子、補体媒介細胞傷害性(CDC)免疫およびその発生に必要とされる分子、ナチュラルキラー細胞、サイトカインおよびケモカイン並びにそれらの産生に必要とされる分子および細胞、抗体依存細胞傷害、補体依存細胞傷害、ナチュラルキラー細胞活性、および抗原増強細胞傷害。このタイプの代表的な例では、刺激または増大される免疫には炎症促進免疫応答が含まれる。
本発明のさらに別の特徴は、癌の発達、進行または再発を対象動物において阻害する方法を提供する。これらの方法は概して、上記および本明細書のいずれかの場所に広く記載された治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子の有効量を対象動物に投与し、それによって癌の発達、進行または再発を対象動物において阻害する工程を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。
関連する特徴では、本発明は対象動物において癌を治療する方法を提供する。これらの方法は概して、上記および本明細書のいずれかの場所に広く記載された治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子の有効量を対象動物に投与し、それによって当該対象動物において癌を治療する工程を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。
治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子の対象動物への投与を必要とする上記の特徴のいずれにおいても、対象動物は適切には免疫調節剤に対して低下または障害された応答性を有し、例えば、対象動物はICM分子アンタゴニスト(例えば抗PD-1または抗PD-L1免疫療法)に低下または障害された応答性を有する。
本発明の方法のいくつかで、有効量の補助抗癌剤は同時発生的に対象動物に投与される。いくつかの適切な補助抗癌剤には、化学療法剤、体外放射線照射、標的に誘導される放射性同位元素、およびシグナル伝達阻害剤が含まれる。しかしながら、他の公知の抗癌剤のいずれも、本発明の方法に関する使用で等しく適用可能である。
さらにまた別の特徴では、本発明は、対象動物において腫瘍に対する免疫抑制もしくは耐性の発達もしくは進行を阻害するためにまたは癌を治療するために、免疫を刺激または増大させるキットを提供する。これらのキットは、上記および本明細書のいずれかの場所に広く記載された治療薬組合せ、医薬組成物、およびマルチ特異性抗原結合分子のいずれか1つ以上を含む。
特段の規定がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語および学術用語は、本発明が属する業界の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等ないずれの方法および材料も本発明の実施または試験で用いることができるが、好ましい方法および材料を述べる。本発明の目的のために、以下の用語が下記に定義される。
冠詞“a”および“an”は、当該冠詞の文法的目的語の1つまたは2つ以上(すなわち少なくとも1つ)を指すために本明細書では用いられる。例示すれば、“an element(要素)”は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
“約”によって、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重さまたは長さが示され、前記は、参照数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重さまたは長さに対して15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2また1%ほど変動する。
“同時発生的投与”もしくは“同時発生的に投与する”または“共同投与”などという用語は、2つ以上の活性物質を含む1つの単一組成物の投与、或いは各活性物質が、単一組成物としてそれら全ての活性物質を投与されたときに得られる有効な結果と同等であるように十分に短い期間内で同時期にもしくは同時にまたは逐次的に、別々の組成物としておよび/または別々のルートで投与および/またはデリバリーされることを指す。“同時に”とは、活性薬剤が実質的に同じ時に、望ましくは同じ処方物で一緒に投与されることを意味する。“同時期に”とは、活性薬剤が時間的に接近して投与されること、例えばある薬剤が別の薬剤の約1分から約1日以内前または後に投与されること意味する。任意の同時期が有用である。しかしながら、同時に投与されないときには、薬剤は、たいてい約1分から約8時間以内に、適切には約1時間から約4時間未満内に投与されるであろう。同時期に投与されるときには、薬剤は適切には対象動物の同じ部位に投与される。“同じ部位”という用語は厳密な位置を含むが、約0.5から約15センチメートル以内、好ましくは約0.5から約5センチメートル以内であり得る。本明細書で用いられる“別々に”という用語は、薬剤が、ある間隔で、例えば約1日から数週間または数ヶ月の間隔で投与されることを意味する。活性物質はどちらの順序で投与されてもよい。本明細書で用いられる“逐次的に”という用語は、薬剤が、連続して、例えば数分、数時間、数日または数週間の1つの間隔もしくは複数の間隔で投与されることを意味する。適切な場合には、活性薬剤は規則的な反復サイクルで投与され得る。
“アンタゴニスト”という用語はもっとも広い意味で用いられ、RANKLまたはICMの1つ以上の生物学的活性もしくは機能(例えば結合、シグナリング、複合体形成、遊走、侵入、生存もしくは生存活性を含むがただし前記に限定されない)を、任意の環境で(in vitro、in situ、またはin vivoを含む)、部分的もしくは完全に遮断するか、阻害するか、停止するか、低下させるか、減少させるか、妨害するか、障害するか、または中和する任意の分子を含む。同様に、“拮抗する”、“拮抗”などという用語は、例えば上記および本明細書の別の場所で用いられるように、活性または機能の封鎖、阻害、停止、低下、減少、妨害、障害または中和を指すために互換的に用いられる。例示すれば、“拮抗する”は、活性または機能における約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%の低下を指すことができる。
抗体には任意のクラスの抗体、例えばIgG、IgA、またはIgM(またはそのサブクラス)が含まれ、いずれの特定のクラスも要求されない。免疫グロブリンは、その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列にしたがって種々のクラスに割り振ることができる。以下の5つの主要なクラスの免疫グロブリンが存在し(IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM)、それらのうちいくつかはさらにサブクラス(アイソタイプ)に分けることができる(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。免疫グロブリンの種々のクラスの三次元構造のサブユニット構造は周知である。
抗体の抗原結合フラグメントは典型的には少なくとも1つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは任意のサイズまたはアミノ酸組成が可能であり、概ね1つ以上のフレームワークと隣接するかまたはインフレームの関係にある少なくとも1つのCDRを含む。VHドメインがVLドメインと結合される抗原結合フラグメントでは、VHおよびVLドメインは互いに任意の適切な配置で位置する。例えば、可変領域はダイマーであり、VH-VH、VH-VLまたはVL-VLダイマーを含むことができる。また別には、抗体の抗原結合フラグメントはモノマーVHまたはVLドメインを含むことができる。
完全な抗体分子に関して、抗原結合フラグメントは一特異性またはマルチ特異性(例えば二重特異性)であり得る。抗体のマルチ特異性抗原結合フラグメントは典型的には少なくとも2つの異なる可変ドメインを含み、ここで、各可変ドメインは、別々の抗原とまたは同じ抗原の異なるエピトープと特異的に結合することができる。任意のマルチ特異性抗原結合分子様式(本明細書に開示する例示的な二重特異性抗原結合分子様式を含む)が、当業界で利用可能な日常的技術を用い本発明の抗体の抗原結合フラグメントの関係で使用するために応用され得る。
“抗原結合分子”とは、標的抗原に対して結合親和性を有する分子を意味する。この用語は、免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント、および抗原結合活性を示す非免疫グロブリン由来タンパク質フレームワークに及ぶことは理解されるであろう。本発明の実施に有用な代表的抗原結合分子には、抗体およびそれらの抗原結合フラグメントが含まれる。“抗原結合分子”という用語は、抗体および抗体の抗原結合フラグメントを含む。
“二重特異性抗原結合分子”という用語は、同じ抗原上の2つの別個のエピトープまたは2つの異なる抗原と結合する能力を有するマルチ特異性抗原結合分子を指す。二重特異性抗原結合分子は、二価、三価、または四価であり得る。本明細書で用いられるように、“価の(valent)”、“一価(valence)”、“複数価(valencies)”または前記語の他の文法的変形は、抗原結合分子の抗原結合部位の数を意味する。これらの抗原認識部位は、同じエピトープまたは異なるエピトープを認識することができる。二価および二重特異性分子は、例えば以下に記載される:Kostelny et al. J Immunol 148 (1992):1547;Pack and Pluckthun Biochemistry 31 (1992) 1579;Gruber et al. J lmmunol (1994) 5368;Zhu et al. Protein Sci 6 (1997):781;Hu et al. Cancer Res. 56 (1996):3055;Adams et al. Cancer Res. 53 (1993):4026;およびMcCartney, et al. Protein Eng. 8 (1995):301。三価二重特異性抗原結合分子および四価二重特異性抗原結合分子もまた当業界で公知である。例えば以下を参照されたい:Kontermann RE (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, pp. 199- 216, 2011。二重特異性抗原結合分子はまた4より高い価数を有することができ、それらもまた本発明の範囲内である。そのような抗原結合分子は、例えばドックアンドロック複合体化方法(Chang, C.-H. et al. In: Bispecific Antibodies. Kontermann RE, 2011(上掲書))によって作製することができる。
分子に関して用いられるとき、“キメラ”という用語は、当該分子が、2つ以上の異なる起原または供給源に由来するか、それらの起源または供給源から入手または単離されたか、またはそれらの起源または供給源を土台とする部分を含むことを意味する。したがって、ポリペプチドが異なる起原の2つ以上のアミノ酸配列を含み、かつ以下の(1)または(2)を含むとき、当該ポリペプチドはキメラである:(1)天然では一緒に見出されないポリペプチド配列(すなわち、アミノ酸配列の少なくとも1つは他方のアミノ酸配列の少なくとも1つに対して異種である)、または(2)天然では隣り合わないアミノ酸配列。
本明細書で用いられるように、“相補性決定領域”(CDR、すなわちCDR1、CDR2およびCDR3)という用語は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指し、その存在は抗原結合に必要である。各可変ドメインは典型的には3つの領域を有し、それらの領域はCDR1、CDR2およびCDR3として識別される。各相補性決定領域は以下のアミノ酸残基を含むことができる:例えばKabatによって規定される“相補性決定領域”のアミノ酸残基(すなわち、軽鎖可変ドメインのおよその残基24−34(L1)、50−56(L2)および89−97(L3)並びに重鎖可変ドメインのおよその残基31−35(H1)、50−65(H2)および95−102(H3);Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991)、および/または“超可変ループ”のそれら残基(すなわち、軽鎖可変ドメインのおよその残基26−32(L1)、50−52(L2)および91−96(L3)並びに重鎖可変ドメインのおよその残基26−32(H1)、53−55(H2)および96−101(H3);Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987)。いくつかの事例では、相補性決定領域は、Kabatが規定したCDR領域および超可変ループの両方のアミノ酸を含むことができる。
本明細書で用いられるように、“複合体”という用語は、互いに直接的におよび/または間接的に接触する分子(例えばペプチド、ポリペプチドなど)の集合物または凝集物を指す。具体的な実施態様では、“接触”またはより詳細には“直接的接触”は、強い非共有結合性相互作用(例えばファンデルワールス力、水素結合、イオン性および疎水性相互作用)が分子の相互作用の主流であり得るように2つ以上の分子が十分に接近していることを意味する。そのような実施態様では、分子(例えばペプチドおよびポリペプチド)複合体は、(例えばその構成要素分子の非凝集(または非複合体)状態と比較して)熱力学的に好ましい状態下で形成される。本明細書で用いられる、“ポリペプチド複合体”または“タンパク質複合体”という用語は、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマー、ウンデカマー、ドデカマー、またはより高順位のオリゴマーを指す。
本出願で用いられる“定常ドメイン”または“定常領域”という用語は、可変領域以外の抗体のドメインの全体を指す。定常領域は、抗原の結合に直接的に関与しないが、多様な免疫エフェクター機能を示す。
“対応する”または“対応”とは、参照核酸配列に対して実質的な配列同一性を示す核酸配列を意味するか(例えば、参照核酸配列の全部または部分に対して、少なくとも約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%または100%もの配列同一性)、または参照アミノ酸配列に対して実質的な配列類似性または同一性を示すアミノ酸配列を意味する(例えば、参照アミノ酸配列の全部または部分に対して、少なくとも約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%または100%もの配列類似性または同一性)。
“DART”(二親和性再標的誘導試薬(dual affinity retargeting reagent))は、少なくとも2つのポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子を指し、前記2つのポリペプチド鎖は結合して(特に共有結合的相互作用を介して)、少なくとも2つのエピトープ結合部位を形成する(前記部位は同じまたは異なるエピトープを認識できる)。DARTのポリペプチド鎖の各々は、免疫グロブリン軽鎖可変領域および免疫グロブリン重鎖可変領域を含むが、これらの領域は相互作用してエピトープ結合部位を形成することはない。むしろ、DARTポリペプチド鎖の一方の(例えば第一の)免疫グロブリン重鎖可変領域は、異なる(例えば第二の)DARTポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖可変領域と相互作用してエピトープ結合部位を形成する。同様に、DARTポリペプチド鎖の一方の(例えば第一の)免疫グロブリン軽鎖可変領域は、異なる(例えば第二の)DARTポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖可変領域と相互作用してエピトープ結合部位を形成する。DARTは、一特異性、二重特異性、三重特異性などであることができ、したがって同時に1つ、2つ、3つまたは4つを超える異なるエピトープ(前記は同じまたは異なる抗原であり得る)と結合することができる。加えて、DARTは、一価、二価、三価、四価、五価、六価などであることができ、したがって同時に1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つまたは7つを超える分子と結合できる。これら2つはDARTの属性を決定し、すなわち特異性の程度および価数は一緒になって、例えば四価(すなわち4セットのエピトープと結合できる)の二重特異性抗体(すなわち2つのエピトープと結合できる)を生成することができる。DART分子は以下でより詳細に開示される:国際PCT公開No. WO 2006/113665、WO 2008/157379、およびWO 2010/080538。
本明細書で用いられるように、“コードする”、“コードの”などの用語は、核酸が別の核酸またはポリペプチドを提供する能力を指す。例えば、核酸が転写されおよび/または翻訳されてポリペプチドを生成することができるならば、または転写および/または翻訳されてポリペプチドを生じ得る形態に核酸が処理されることが可能ならば、当該核酸配列は、ポリペプチドを“コードする”と称される。そのような核酸配列は、コード配列またはコード配列および非コード配列の両方を含むことができる。したがって、“コードする”、“コードの”などの用語は、DNA分子の転写から生じるRNA生成物、RNA分子の翻訳から生じるタンパク質、DNA分子が転写されてRNA生成物を形成し続いてRNA生成物の翻訳から生じるタンパク質、またはDNA分子が転写されてRNA生成物を提供しRNA生成物が処理されて処理RNA生成物(例えばmRNA)を提供し続いて処理RNA生成物の翻訳から生じるタンパク質を含む。
“フレームワーク領域”(FR)はCDR残基以外の可変ドメインである。典型的には、各可変ドメインは、FR1、FR2、FR3およびFR4として識別される4つのFRを有する。CDRがKabatにしたがって規定される場合、軽鎖FR残基は、残基およそ1−23(LCFR1)、35−49(LCFR2)、57−88(LCFR3)、および98−107(LCFR4)に位置し、重鎖FR残基は、重鎖残基内の残基およそ1−30(HCFR1)、36−49(HCFR2)、66−94(HCFR3)、および103−113(HCFR4)に位置する。CDRが超可変ループのアミノ酸残基を含む場合、軽鎖FR残基は、軽鎖内の残基およそ1−25(LCFR1)、33−49(LCFR2)、53−90(LCFR3)、および97−107(LCFR4)に位置し、重鎖FR残基は、重鎖残基内の残基およそ1−25(HCFR1)、33−52(HCFR2)、56−95(HCFR3)、および102−113(HCFR4)に位置する。いくつかの事例では、CDRが、Kabatに規定されるCDRおよび超可変ループのCDRの両方のアミノ酸を含むとき、FR残基はそれにしたがって調整されるであろう。例えば、CDRH1がアミノ酸H26−H35を含むとき、重鎖FR1残基は1−25位に存在し、FR2残基は36−49位に存在する。
本明細書で用いられるように、細胞マーカーまたはバイオマーカーの測定に関して“より低い”という用語は、参照レベルと比較して、バイオマーカー測定レベルにおける統計的に有意かつ測定可能な相違を指し、この場合バイオマーカー測定値は参照レベル未満である。相違は、適切には、少なくとも約10%、または少なくとも約20%、または少なくとも約30%、または少なくとも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または少なくとも約80%、または少なくとも約90%である。
“免疫チェックポイント分子”という用語は、免疫チェックポイントとして機能する受容体およびリガンドの両方を含む。免疫チェックポイントは、免疫系がそれ自身の身体を攻撃することを防ぐ免疫脱出メカニズムである。免疫チェックポイント受容体はT細胞上に存在し、抗原提示細胞上で発現される免疫チェックポイントリガンドと相互作用する。T細胞はMHC分子上に提示される抗原を認識して活性化され免疫反応を生じ、一方、上記と並行して発生する免疫チェックポイント受容体およびリガンド間の相互作用はT細胞の活性化を制御する。例示的な免疫チェックポイント分子には以下が含まれる:PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、A2AR、A2BR、B7-H3 CD276、VTCN1、BTLA、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA、CD73、CD96、CD155、DNAM-1、CD112、CRTAM、TNFRS4 (OX40, CD134)、TNFSF4 (OX40L)、CD244、CD160、GITR、GITRL、ICOS、GAL-9、4-1BBL (CD137L)、4-1BB (CD137)、CD70、CD27L、CD28、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、SIRP-1、IAP (CD47)、BLAST-1 (CD48)、CD244; CD40、CD40L、HVEM、TMIGD2、HHLA2、VEGI、TNFRS25、ICOLG (B7RP1)およびTIGIT(ただし前記に限定されない)。具体的な実施態様では、免疫チェックポイント分子はPD-1、PD-L1またはCTLA4である。
本発明の関係では、“免疫エフェクター機能”という用語は、免疫系の構成要素によって媒介される任意の機能を含み、前記機能は、例えば、ウイルス感染細胞または腫瘍細胞の殺滅、または腫瘍増殖阻害および/または腫瘍発達阻害(腫瘍播種および転移の阻害を含む)をもたらす。好ましくは、本発明の関係の免疫エフェクター機能はT細胞媒介エフェクター機能である。そのような機能は以下を含む:ヘルパーT細胞(CD4+ T細胞)に事例では、MHCクラスII分子に関係する抗原に由来する抗原または抗原ペプチドのT細胞受容体による認識、サイトカインの放出および/またはCD8+リンパ球(CTL)および/またはB細胞の活性化、並びにCTLの事例では、MHCクラスI分子に関係する抗原に由来する抗原または抗原ペプチドのT細胞受容体による認識、MHCクラスI分子の関係で提示される細胞の排除(すなわち、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介細胞溶解を介するクラスI MHCによる抗原提示を特徴とする細胞の排除)、サイトカイン(例えばIFN-γおよびTNF-α)の産生、および抗原発現標的細胞の特異的な細胞溶解性殺滅。
“リンカー”とは、2つの分子を接続し、しばしば所望の立体配置に2つの分子を配置するために役立つ分子または分子のグループ(例えばモノマーまたはポリマー)を意味する。具体的な実施態様では、“ペプチドリンカー”は、2つのタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、領域またはモチーフを接続するアミノ酸配列を指し、前記は、抗原結合フラグメントがそれらの同族エピトープと特異的に結合できるようにそれらの間隔に適合するスペーサー機能を提供することができる。ある種の実施態様では、リンカーは、約2から約35アミノ酸、例えば約4から約20アミノ酸、または約8から約15アミノ酸、または約15から約25アミノ酸で構成される。
“マルチ特異性抗原結合分子”という用語はそのもっとも広い意味で用いられ、特に少なくとも2つ(例えば2、3、4など)の異なるエピトープに対して特異性を有する抗原結合分子をカバーする(すなわち、1つの抗原の2つ以上の異なるエピトープと特異的に結合できるか、または2つ以上の異なる抗原のエピトープと特異的に結合できる)。
“医薬的に許容できる担体”とは、生物学的に或いは別の態様で望ましい物質、すなわち何らかのまたは実質的な有害反応を引き起こすことなく選択した活性薬剤とともに対象動物に投与できる物質で構成される医薬ビヒクルを意味する。担体は、賦形剤および他の添加物(例えば希釈剤、洗剤、着色剤、湿潤または乳化剤、pH緩衝剤、保存料など)を含む。
“プログラム死リガンド-1(PD-L1)”(CD274、B7-H、B7H1、PDCD1L1、PDCD1LG1、PDL1およびCD274分子としても知られている)は、PD-1に対する2つの細胞表面糖タンパク質の1つで(他はPD-L2である)、PD-L1は、PD-1との結合に際してT細胞活性化およびサイトカイン分泌をダウンレギュレートする。“PD-L1”という用語は、PD-L1のフラグメントとともに関連ペプチドを含み、前記には、対立遺伝子変種、スプライス変種、誘導変種、置換変種、欠失変種および/または挿入変種、融合ポリペプチド、および種間ホモログが含まれる(ただし前記に限定されない)。ある種の実施態様では、PD-1ポリペプチドは、末端残基、例えばリーダー配列残基、標的誘導残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基および/または融合タンパク質残基を含む(ただしこれらに限定されない)。好ましい実施態様では、本明細書で用いられる“PD-L1”には、ヒトPD-L1(hPD-L1)、変種、アイソフォーム、およびhPD-L1の種ホモログ、並びにhPD-L1と共通の少なくとも1つのエピトープを有するアナログが含まれる。完全なhPD-L1配列はGenBank Accession No. Q9NZQ7で見出され得る。
“NF-κBの活性化因子受容体リガンド(RANKL)”(腫瘍壊死因子リガンドスパーファミリーメンバー11(TNFSF11)、TNF関連活性化誘発サイトカイン(TRANCE)、オステオプロテグリンリガンド(OPGL)および破骨細胞分化因子(ODF)としても知られている)は、とりわけNF-κBの活性化因子受容体(RANK)との結合を介して破骨細胞形成を促進するポリペプチドを指す。“RANKL” という用語は、RANKLのフラグメントとともに関連ペプチドを含み、前記には、対立遺伝子変種、スプライス変種、誘導変種、置換変種、欠失変種および/または挿入変種、融合ポリペプチド、および種間ホモログが含まれる(ただし前記に限定されない)。ある種の実施態様では、RANKLポリペプチドは、末端残基、例えばリーダー配列残基、標的誘導残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基および/または融合タンパク質残基を含む(ただしこれらに限定されない)。RANKLという用語には、ヒトRANKL(hRANKL)、変種、アイソフォーム、およびhRANKLの種ホモログ、並びにhRANKLと共通の少なくとも1つのエピトープを有するアナログが含まれる。完全なhRANKL配列はUniProt Accession No. O14788で見出され得る。
本明細書で用いられるように、“調節性T細胞”または“Treg”は、他のT細胞(エフェクターT細胞を含む)とともに先天的免疫系細胞の活性化を負の方向に調節するT細胞を指す。Treg細胞は、エフェクターT細胞応答の持続的抑制を特徴とする。いくつかの特徴では、TregはCD4+CD25+Foxp3+ T細胞である。
本明細書で互換的に用いられる“対象動物”、“患者”、“宿主”または“個体”という用語は、治療または予防が所望される、任意の対象動物、特に脊椎を有する対象動物、より具体的には哺乳動物の対象動物を指す。本発明の範囲に含まれる適切な脊椎動物には霊長類を含む脊索動物亜門の以下の任意のメンバーが含まれる(ただし前記に限定されない)。例えば人間、猿、類人猿では、猿の種、例えばマカク(Macaca)属(例えばカニクイザル、例えばマカカ・ファシクラリス(Macaca fascicularis))、および/またはアカゲザル(マカカ・ムラッタ(Macaca mulatta))およびヒヒ(パピオ・ウルシヌス(Papio ursinus))、その他にマーモセット(カリスリクス(Callithrix)属由来の種)、リスザル(サイミリ(Saimiri)属由来の種)、およびタマリン(サギヌス(Saguinus)属由来の種)、とともに類人猿の種、例えばチンパンジー(パン・トログロディテス(Pan troglodytes));げっ歯類では、例えばマウス、ラット、モルモット;ウサギ類では、例えばウサギ、ノウサギ;ウシ類では例えば畜牛;ヒツジ類では例えばヒツジ;ヤギ類では例えばヤギ;ブタ類では例えばブタ;ウマ類では例えばウマ;イヌ類では例えばイヌ;ネコ類では例えばネコ;鳥類では例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、カモ、ペットの鳥類(例えばカナリア、セキセイインコなど);海洋哺乳動物では例えばイルカ、クジラ;爬虫類ではヘビ、カエル、トカゲなど;および魚類。好ましい対象動物は、癌に対する免疫応答を引き出す必要がある人間である。しかしながら、前述の用語は症状が存在すること暗示しないことは理解されるであろう。
本明細書で用いられるように、“治療薬組合せ(併用)”という用語は、1つ以上の活性な医薬物質の組合せ、すなわち同時発生的に投与されるときに(すなわち併用療法)治療有用性を示す化合物を指す。したがって、化合物は単一組成物の形態にあるか(適切には化合物の混合物を含み)、または別々の組成物の形態にあることが可能である。典型的には、本発明の治療薬組合せ中のそのような化合物の各々は、当該化合物および医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物として存在するであろう。本発明の治療薬組合せ中の化合物は、各治療薬化合物の有益な作用が対象動物によって所望の時期に認識される投薬形で提供される。
本明細書で用いられるように、“三重特異性抗体”という用語は、第一のエピトープに対する特異性を有する少なくとも1つの第一の抗原結合ドメイン、第二のエピトープに対する特異性を有する第二の抗原結合ドメイン、および第三のエピトープに対する特異性を有する第三の抗原結合ドメインを含む抗体を指す(例えばRANKL並びにCTLA4、PD-1およびPD-L1の任意の2つ)。第一、第二および第三のエピトープは同じではないが(すなわち前記は異なる標的(例えばタンパク質)である)、前記はいずれも単一細胞にまたは少なくとも2つの細胞に存在することができる。
本明細書に記載の各実施態様は、特段の規定がなければ実施態様の各々およびいずれの実施態様にも準用され得る。
以下の略語が本出願を通して用いられる:
aa=アミノ酸
CDR=相補性決定領域
CTLA4=細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4
Fc=定常領域
FR=フレームワーク
h=時間
ICM=免疫チェックポイント分子
Ig=免疫グロブリン
MAb=モノクローナル抗体
PD-1=プログラム死1
PD-L1=プログラム死リガンド1
RANKL=NF-κBの活性化因子受容体リガンド
s=秒
VH=重鎖可変ドメイン
VL=軽鎖可変ドメイン
本発明は治療薬組合せを提供し、前記組み合わせは、とりわけ癌に対する免疫応答を対象動物において刺激または増大させるために有用である。これらの組成物は、概ね(1)NF-κBの活性化因子受容体リガンド(RANKL)アンタゴニスト、および(2)少なくとも1つの免疫チェックポイント分子(ICM)アンタゴニストを利用する。当該組成物は、これら2つの経路間における新規に識別された相乗作用を利用し、前記相乗作用は、腫瘍または癌部位におけるCD8+ T細胞の局在化の増加をもたらす。有利には、前記相乗性組成物は適切にはエフェクター細胞機能の増強を刺激し、例えば、増強されるエフェクターT細胞機能にはTh1型サイトカイン(例えばIFN-γおよび/またはIL-2)の生成および多機能性T細胞の割合の増加が含まれる。
いくつかの好ましい実施態様では、本発明のアンタゴニスト(すなわち、RANKLアンタゴニストおよびICMアンタゴニスト)は抗原結合分子である。適切な抗原結合分子は、組換え抗体、モノクローナル抗体(MAb)、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、およびそのような抗体の抗原結合フラグメントを含む抗体およびそれらの抗原結合フラグメントから選択できる。
人間での適用のために、もともと他の種(例えばマウス)に由来する抗体の免疫原性を低下させることが所望される。これらは、キメラ抗体の構築によって、または“ヒト化”と呼ばれるプロセスによって実施できる。ここでは、“キメラ抗体”は、異なる種(例えばヒト)に由来するドメイン(例えば定常ドメイン)に融合した1つの種(例えばマウス)に由来するドメイン(例えば可変ドメイン)を含む抗体であると理解される。
本発明では、抗体は、抗原に対して少なくとも約105 mol-1、106 mol-1以上、好ましくは107 mol-1以上、より好ましくは108 mol-1以上、もっとも好ましくは109 mol-1以上の結合比活性(Ka)を有することを特徴とし得る。当業者は抗体の結合親和性を容易に、例えばスキャチャード分析によって決定できる(以下を参照されたい:Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949)。
3.1NF-κBの活性化因子受容体(RANK)リガンド(RANKL)のアンタゴニスト
本発明の治療薬剤における使用に適切なRANKLアンタゴニストには、RANKL(例えばヒトRANKL)と拮抗することができる任意の分子が含まれる。例示すれば、RANKLアンタゴニストはポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗原結合分子、炭水化物、または小分子であり得る。いくつかの好ましい実施態様では、RANKLアンタゴニストは、抗RANKL抗原結合分子(例えばMAbまたはその抗原結合フラグメント)である。そのような抗RANKL抗原結合分子は、自然のままのRANKL、例えば、以下のアミノ酸配列を有する自然のままのヒトRANKLの領域またはエピトープと特異的に結合する:
MRRASRDYTKYLRGSEEMGGGPGAPHEGPLHAPPPPAPHQPPAASRSMFVALLGLGLGQVVCSVALFFYFRAQMDPNRISEDGTHCIYRILRLHENADFQDTTLESQDTKLIPDSCRRIKQAFQGAVQKELQHIVGSQHIRAEKAMVDGSWLDLAKRSKLEAQPFAHLTINATDIPSGSHKVSLSSWYHDRGWAKISNMTFSNGKLIVNQDGFYYLYANICFRHHETSGDLATEYLQLMVYVTKTSIKIPSSHTLMKGGSTKYWSGNSEFHFYSINVGGFFKLRSGEEISIEVSNPSLLDPDQDATYFGAFKVRDID
(配列番号:2)
ヒトRANKLと特異的に結合する公知のMAbの例は、U.S. Patent Appl Pub No. 2016/0333101および2012/0087923に記載され、それらの内容は、参照によってその全体が本明細書に含まれる。
本発明に関する使用に適切なそのような抗RANKL MAbの1つはデノスマブである。したがって、いくつかの実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、完全なヒトのIgG2 MAbデノスマブまたはその抗原結合フラグメントを含む。同じ実施態様のいくつかまたは他の実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、表1に示すCDR配列を含む。
このタイプの限定的な例では、抗RANKL抗原結合分子は、下記に例示のために示すデノスマブの重鎖アミノ酸配列:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号:3)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、その例示的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るか、または本質的にそれから成る:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS(配列番号:25)。
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRGRYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:4)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、その例示的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るか、または本質的にそれから成る:
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRGRYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK(配列番号:26)。
デノスマブの重鎖および軽鎖の完全長配列はそれぞれ配列番号:7および8に示される:
MEFGLSWLFLVAILKGVOCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEOTAVYYCAKDPGTTVIMSWFOPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号:27)(ここでIgG2シグナルペプチドには下線が付されている);および
METPAOLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRGRYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:28)(ここでカッパシグナルペプチドには下線が付されている)。
これらの実施態様のいくつかでは、抗RANKL抗原結合分子は、下記に例示のために示す重鎖アミノ酸配列:
AQVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC(配列番号:35)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、その例示的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るか、または本質的にそれから成る:
QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS(配列番号:36)。
これらの実施態様および他の実施態様のいくつかでは、抗RANKL抗原結合分子は、下記に例示のために示す軽鎖アミノ酸配列:
SHSALEIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRYLNWYQLKPGKAPRLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPEDIATYYCQHTRAFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESATEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:37)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、その代表的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るか、または本質的にそれから成る:
EIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRYLNWYQLKPGKAPRLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPEDIATYYCQHTRAFGQGTKVEIK(配列番号:38)。
これらの実施態様のいくつかでは、抗RANKL抗原結合分子は、下記に例示のために示す重鎖アミノ酸配列:
AEVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC(配列番号:45)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、その例示的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るか、または本質的にそれから成る:
EVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS(配列番号:46)。
これらの実施態様および他の実施態様のいくつかでは、抗RANKL抗原結合分子は、下記に例示のために示す軽鎖アミノ酸配列:
SHSALEIVLTQSPATLSFSPGERATLSCRASQSVGSYLAWYQQRPGQAPRPLIYDATNRATGIPTRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQHRRTFGRGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:47)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、その代表的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るか、または本質的にそれから成る:
EIVLTQSPATLSFSPGERATLSCRASQSVGSYLAWYQQRPGQAPRPLIYDATNRATGIPTRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQHRRTFGRGTKLEIK(配列番号:48)。
CDR1(VL)は、RASQSISRYLN(配列番号:49)、RASQSVGSYLA(配列番号:50)、RASQSVSSSSLA(配列番号:51)およびSGDALPKQY(配列番号:52)から成る群から選択され、
CDR2(VL)は、GASSLQS(配列番号:53)、DATNRAT(配列番号:54)、GASSRAT(配列番号:55)、およびEDSERPS(配列番号:56)から成る群から選択され、
CDR3(VL)は、QHTRA(配列番号:57)、QHRRT(配列番号:58)、QQYGA(配列番号:59)、およびQSTDSSGTYVV(配列番号:60)から成る群から選択され、
ここで、CDR1(VL)、CDR2(VL)およびCDR3(VL)は互いにそれぞれ独立に選択され、
ここで、各VH鎖は、フレームワークアミノ酸配列によって分離されるCDR1(VH)、CDR2(VH)およびCDR3(VH)と称されるCDRアミノ酸配列を含み、
CDR1(VH)は、NYAIH(配列番号:61)、NYPMH(配列番号:62)、およびDXAMH(配列番号:63)から成る群から選択され、
CDR2(VH)は、WINAGNGNTKFSQKFQG(配列番号:64)、VISYDGNNKYYADSVKG(配列番号:65)、およびGISMNSGRIGYADSVKO(配列番号:66)から成る群から選択され、
CDR3(VH)は、DSSNMVRGIIIAYYFDY(配列番号:67)、GGGGFDY(配列番号:68)、およびGGSTSARYSSGWYY(配列番号:69)から成る群から選択され、
ここで、CDR1(VH)、CDR2(VH)およびCDR3(VH)は互いにそれぞれ独立に選択される。
具体的な実施態様では、抗RANKL抗原結合分子はVLおよびVH鎖を含み、ここで、
VL鎖は、配列RASQSISRYLN(配列番号:49)を有するCDR1、配列GASSLQS(配列番号:53)を有するCDR2、および配列QHTRA(配列番号:57)を有するCDR3を含み、
VH鎖は、配列NYAIH(配列番号:61)を有するCDR1、配列WINAGNGNTKFSQKFQG(配列番号:64)を有するCDR2、および配列DSSNMVRGIIIAYYFDY(配列番号:67)を有するCDR3を含み、
ここで、各VLおよびVH鎖のCDR1、CDR2およびCDR3はフレームワークアミノ酸配列によって分離される。
いくつかの実施態様では、RANKアンタゴニストは、RANKLと相互作用するRANKの領域に対応するアミノ酸配列を含むか、それらから成るか、または本質的に前記から成り、その代表的な例は、CDR2(すなわち残基44−85)およびCRD3(すなわち残基86−123)から選択される少なくとも1つのCRDを含む。このタイプの非限定的な例では、RANKアンタゴニストは、RANK CRD3に対応するアミノ酸配列を含むか、それらから成るか、または本質的に前記から成り、その代表的な例はYCWNSDCECCY(配列番号:5)、YCWSQYLCY(配列番号:6)を含む。
他の実施態様では、RANKアンタゴニストは、抗RANK抗原結合分子(例えばMAbまたはその抗原結合フラグメント)であり、前記は、自然のままのRANK、例えば自然のままのヒトRANK(UniProt accession no. Q9Y6Q6)(下記の代表的な完全長アミノ酸配列を有する)の領域またはエピトープと特異的に結合する:
MAPRARRRRPLFALLLLCALLARLQVALQIAPPCTSEKHYEHLGRCCNKCEPGKYMSSKCTTTSDSVCLPCGPDEYLDSWNEEDKCLLHKVCDTGKALVAVVAGNSTTPRRCACTAGYHWSQDCECCRRNTECAPGLGAQHPLQLNKDTVCKPCLAGYFSDAFSSTDKCRPWTNCTFLGKRVEHHGTEKSDAVCSSSLPARKPPNEPHVYLPGLIILLLFASVALVAAIIFGVCYRKKGKALTANLWHWINEACGRLSGDKESSGDSCVSTHTANFGQQGACEGVLLLTLEEKTFPEDMCYPDQGGVCQGTCVGGGPYAQGEDARMLSLVSKTEIEEDSFRQMPTEDEYMDRPSQPTDQLLFLTEPGSKSTPPFSEPLEVGENDSLSQCFTGTQSTVGSESCNCTEPLCRTDWTPMSSENYLQKEVDSGHCPHWAASPSPNWADVCTGCRNPPGEDCEPLVGSPKRGPLPQCAYGMGLPPEEEASRTEARDQPEDGADGRLPSSARAGAGSGSSPGGQSPASGNVTGNSNSTFISSGQVMNFKGDIIVVYVSQTSQEGAAAAAEPMGRPVQEETLARRDSFAGNGPRFPDPCGGPEGLREPEKASRPVQEQGGAKA(配列番号:8)。
いくつかの実施態様で、抗RANK抗原結合分子は、Newaら(2014、上掲書)による例示のために開示される短鎖Fv(scFv)抗原結合分子またはその抗原結合フラグメントである。このタイプの代表的な抗原結合分子は、表4に示すCDR配列を含むことができる。
より具体的な実施態様では、抗RANK抗原結合分子は、以下の重鎖アミノ酸配列:
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGDGYYTDYADSVGRFTISRDNSKNTLYLQNSLRAEDTAVYYCAKNAYSFDYWGQGTLVTVS(配列番号:76)もしくはMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGDGYYTDYADSVGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAYSFDYWGQGTLVTVS(配列番号:77)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGDGYYTDYADSVGRFTISRDNSKNTLYLQNSLRAEDTAVYYCAKNAYSFDYWGQGTLVTVS(配列番号:78)、またはEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGDGYYTDYADSVGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAYSFDYWGQGTLVTVS(配列番号:79)。
同じまたは他の実施態様のいくつかでは、抗RANK抗原結合分子は、以下の軽鎖アミノ酸配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGSSSPNTFGQGTKVEIKRAAA(配列番号:80)、
またはその抗原結合フラグメントを含むことができ、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGSSSPNTFGQGTKVEIK(配列番号:81)。
治療に用いることができる適切な任意のICMアンタゴニストが本発明の実施で使用するために意図される。例えば、適切なICMアンタゴニストは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、および小分子を含む。いくつかの好ましい実施態様では、ICMアンタゴニストは抗原結合分子である。
本発明の治療薬組合せと拮抗するICMには、以下から選択される阻害性ICMの任意の1つ以上が含まれる:PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、A2AR、A2BR、CD276、VTCN1、BTLA、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA、CD73、CD96、CD155、DNAM-1、CD112、CRTAM、OX40、OX40L、CD244、CD160、GITR、GITRL、ICOS、GAL-9、4-1BBL、4-1BB、CD27L、CD28、CD80、CD86、SIRP-1、CD47、CD48、CD244、CD40、CD40L、HVEM、TMIGD2、HHLA2、VEGI、TNFRS25およびICOLG。治療薬組合せがRANKLアンタゴニストおよびただ1つのICMアンタゴニストを含む実施態様では、ICMは適切にはCTLA-4以外である。
いくつかの好ましい実施態様では、治療薬組合せに含まれるICMアンタゴニストはPD-1アンタゴニストである。これに関して、“PD-1アンタゴニスト”には、任意の化学的化合物または生物学的分子が含まれ、前記は、PD-L1(例えば癌細胞表面で発現されるPD-L1)とPD-1(免疫細胞(例えばT細胞、B細胞、またはNKT細胞)で発現される)との結合を阻む。PD-1のまた別の名称または同義語には、PDCD1、PD1、CD279およびSLEB2が含まれる。ヒトPD-1の代表的な成熟アミノ酸配列(UniProt accession no. Q15116)は以下に示される:
PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL(配列番号:)。
本発明の抗PD-1抗原結合分子は、好ましくは、PD-1の細胞外ドメインの領域と結合する。例示すれば、抗PD-1抗原結合分子は、ヒトPD-1の細胞外ドメインの領域と特異的に結合でき、前記領域は、アミノ酸配列SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR(配列番号:9)(すなわち、配列番号:10に示す自然のままのPD-1配列の残基62から86)およびSGTYLCGAISLAPKAQIKE(配列番号:11)(すなわち、配列番号:10に示す自然のままのPD-1配列の残基118から136)の一方または両方を含む。別の例では、抗PD-1抗原結合分子は、ヒトPD-1の細胞外ドメインの領域と特異的に結合でき、前記領域は、アミノ酸配列NWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV(配列番号:12)(すなわち、配列番号:10に示す自然のままのヒトPD-1配列の残基66から97に対応する)を含む。
ある種の実施態様では、抗PD-1抗原結合分子は、完全にヒト化されたIgG4 MAbニボルマブ(米国特許8,008,449号(前記は参照によってその全体が本明細書に含まれる)に詳細に記載(“5C4”と称される))またはその抗原結合フラグメントを含む。このタイプの代表的な例では、抗PD-1抗原結合分子は表5に示すCDR配列を含む。
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号:88)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS(配列番号:89)。
同じおよび他の実施態様のいくつかでは、抗PD-1抗原結合分子は、例えば下記に示すニボルマブの軽鎖アミノ酸配列:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:90)、
またはその抗原結合フラグメントを含むことができ、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK(配列番号:91)。
いくつかの実施態様では、抗PD-1抗原結合分子は、PD-1との結合についてMAbペムブロリズマブと競合する。
追加の実施態様では、抗PD-1抗原結合分子は、例えば下記に示すペムブロリズマブの重鎖アミノ酸配列:
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号:98)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る:
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS(配列番号:99)。
同様に、抗PD-1抗原結合分子は、例えば下記に示すペムブロリズマブの軽鎖アミノ酸配列:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:100)、
またはその抗原結合フラグメントを含むことができ、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK(配列番号:101)。
より具体的な実施態様では、抗PD-1抗原結合分子は、下記に示すピジリズマブの重鎖アミノ酸配列:
QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLQWMGWINTDSGESTYAEEFKGRFVFSLDTSVNTAYLQITSLTAEDTGMYFCVRVGYDALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号:108)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る:
QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLQWMGWINTDSGESTYAEEFKGRFVFSLDTSVNTAYLQITSLTAEDTGMYFCVRVGYDALDYWGQGTLVTVSS(配列番号:109)。
同じおよび他の実施態様のいくつかでは、抗PD-1抗原結合分子は、下記に示すピジリズマブの軽鎖アミノ酸配列:
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCSARSSVSYMHWFQQKPGKAPKLWIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTSYCLTINSLQPEDFATYYCQQRSSFPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:110)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る:
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCSARSSVSYMHWFQQKPGKAPKLWIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTSYCLTINSLQPEDFATYYCQQRSSFPLTFGGGTKLEIK(配列番号:111)。
例示すれば、そのようなMAbは、(a)以下を含む重鎖可変領域:
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS(配列番号:124)またはその変種もしくは抗原結合フラグメント、および
以下から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK(配列番号:125)、
IVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRASKGVSTSGYSYLHWYLQKPGQSPQLLIYLASYLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQHSRDLPLTFGQGTKLEIK(配列番号:126)、もしくは
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRASKGVSTSGYSYLHWYLQKPGQSPQLLIYLASYLESGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGLYYCQHSRDLPLTFGQGTKLEIK(配列番号:127)、またはその変種もしくは抗原結合フラグメント。
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号:128)またはその変種もしくは抗原結合フラグメント、および
以下のいずれか1つを含む軽鎖を含む:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:129)、
EIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRASKGVSTSGYSYLHWYLQKPGQSPQLLIYLASYLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQHSRDLPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:130)、
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRASKGVSTSGYSYLHWYLQKPGQSPQLLIYLASYLESGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGLYYCQHSRDLPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:131)、またはその変種もしくは抗原結合フラグメン。
一般的に、PD-L1アンタゴニストは、下記に示すヒトPD-L1(UniProt accession no. Q9NZQ7)の自然のままのアミノ酸配列に特異的に結合する:
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET(配列番号:14)。
適切には、PD-L1アンタゴニストは抗PD-L1抗原結合分子である。例示すれば、本発明での使用に適切な抗PD-L1抗原結合分子には、抗PD-L1 MAbデュルバルマブ(MEDI4736)、アテゾリズマブ(Tecentriq)、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480、MPDL3280Aが含まれる。これらおよびその他の抗PD-L1抗体は以下に記載される:国際公開WO2007/005874およびWO2010/077634、並びに米国特許8,217,149号および8,779,108号(前記の各々の全体は参照によって本明細書に含まれる)。さらにまた、抗PD-L1 MAbは、国際PCT特許公開WO2016/007,235(その全内容はまた参照によって本明細書に含まれる)に記載される。
抗PD-L1抗原結合分子は、PD-L1の細胞外ドメインの領域と適切に結合する。例示すれば、抗PD-L1抗原結合分子は、アミノ酸配列SKKQSDTHLEET(配列番号:13)(すなわち配列14に示す自然のままのPD-L1配列の残基279から290)を含むヒトPD-L1の細胞外ドメインの領域と特異的に結合することができる。ある種の実施態様では、抗PD-L1抗原結合分子は、完全にヒト化されたIgG1 MAbデュルバルマブ(国際PCT公開WO2011/066389および米国特許公開2013/034559(参照によってその全体が本明細書に含まれる)で“MEDI4736”に関連して記載される)またはその抗原結合フラグメントを含む。このタイプの代表的な実施態様では、抗PD-L1抗原結合分子は表8に示すCDR配列を含む。
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(配列番号:138)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る:
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS(配列番号:139)。
同じおよび他の実施態様のいくつかでは、抗PD-L1抗原結合分子は、以下の軽鎖アミノ酸配列:
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:140)、
またはその抗原結合フラグメントを含むことができ、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る:
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIK(配列番号:141)。
また別には、抗PD-L1抗原結合分子は、PD-L1との結合についてMAbデュルバルマブと競合する。
より具体的な実施態様では、抗PD-L1抗原結合分子は、例えば下記に示すアテゾリズマブの重鎖アミノ酸配列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号:148)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(配列番号:149)。
同じおよび他の実施態様のいくつかでは、抗PD-L1抗原結合分子は、例えば以下に提供されるアテゾリズマブの軽鎖アミノ酸配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:150)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK(配列番号:151)。
また別に、抗PD-L1抗原結合分子は、PD-L1との結合についてMAbアテゾリズマブと競合する。
具体的な実施態様では、抗PD-L1抗原結合分子は、例えば以下に提供されるアベルマブの重鎖アミノ酸配列:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号:158)、
またはその抗原結合フラグメントを含ことができ、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS(配列番号:159)。
同じおよび他の実施態様のいくつかでは、抗PD-L1抗原結合分子は、例えば以下に示されるアベルマブの軽鎖アミノ酸配列:
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(配列番号:160)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る:
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL(配列番号:161)。
また別には、抗PD-L1抗原結合分子は、PD-L1との結合についてMAbアベルマブと競合する。
KAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN(配列番号:16)。
適切には、CTLA4アンタゴニストは抗CTLA4抗原結合分子である。例示すれば、本発明での使用に適切な抗CTLA4抗原結合分子には、抗CTLA4 MAbイピリムマブ(BMS-734016、MDX-010、MDX-101)およびトレメリムマブ(チシリムマブ、CP-675,206)が含まれる。
抗CTLA4抗原結合分子は、CTLA4の細胞外ドメインの領域と適切に結合する。例示すれば、抗CTLA4抗原結合分子は、以下のアミノ酸配列のいずれか1つ以上を含む、ヒトCTLA4の細胞外ドメインの領域と特異的に結合することができる:YASPGKATEVRVTVLRQA(配列番号:15)(すなわち、配列番号:16に示す自然のままのCTLA4配列の残基26から42)、DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD(配列番号:17)(すなわち、配列番号:16に示す自然のままのCTLA4配列の残基43から65)、およびVELMYPPPYYLGIG(配列番号:18)(すなわち、配列番号:16に示す自然のままのCTLA4配列の残基96から109)。また別に或いは加えるに、抗CTLA4抗原結合分子は、CTLA4の成熟形の以下の残基のいずれか1つ以上および好ましくは全てを含むヒトCTLA4の細胞外ドメインの領域と特異的に結合することができる:K1、A2、M3、E33、R35、Q41、S44、Q45、V46、E48、L91、I93、K95、E97、M99、P102、P103、Y104、Y105、L106、I108、N110。
ある種の実施態様では、抗CTLA4抗原結合分子は、ヒトIgG1 MAbイピリムマブ(例えば国際公開WO2014/209804および米国特許公開No 2015/0283234(参照によってその全体が本明細書に含まれる)に記載)またはその抗原結合フラグメントを含む。このタイプの代表的な実施態様では、抗CTLA4抗原結合分子は表11に示すCDR配列を含む。
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号:168)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS(配列番号:169)。
同じおよび他の実施態様のいくつかでは、抗CTLA4抗原結合分子は、例えば以下に示す軽鎖アミノ酸配列:
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:170)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る:
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK(配列番号:171)。
より具体的な実施態様では、抗CTLA4抗原結合分子は、例えば下記に示すトレメリムマブの重鎖アミノ酸配列:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYIQMNSLRAEDTAVYYCARDPRGATLYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号:178)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記の非限定的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS(配列番号:179)。
同じおよび他の実施態様のいくつかでは、抗CTLA4抗原結合分子は、例えば以下に示すトレメリムマブの軽鎖アミノ酸配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLDWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:180)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記の代表的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLDWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIK(配列番号:181)。
MLRRRGSPGMGVHVGAALGALWFCLTGALEVQVPEDPVVALVGTDATLCCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFAEGQDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYQGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSILRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHSSVTITPQRSPTGAVEVQVPEDPVVALVGTDATLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFTEGRDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYRGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSVLRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGQPMTFPPEALWVTVGLSVCLIALLVALAFVCWRKIKQSCEEENAGAEDQDGEGEGSKTALQPLKHSDSKEDDGQEIA(配列番号:182)
適切には、B7-H3アンタゴニストは抗B7-H3抗原結合分子である。例示すれば、本発明での使用に適切な抗B7-H3抗原結合分子は、MAbエノブリツズマブまたはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施態様では、抗B7-H3抗原結合分子は表13に示すCDR配列を含む。
より具体的な実施態様では、抗B7-H3抗原結合分子は、例えば下記に示すエノブリツズマブの重鎖アミノ酸配列:
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSDSSAIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCGRGRENIYYGSRLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELVGGPSVFLLPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTLRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号:189)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記の非限定的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る:
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSDSSAIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCGRGRENIYYGSRLDYWGQGTTVTVSS(配列番号:190)。
同じおよび他の実施態様のいくつかでは、抗B7-H3抗原結合分子は、例えば以下に提供するエノブリツズマブの軽鎖アミノ酸配列:
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:191)、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記の代表的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る:
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPFTFGQGTKLEIK(配列番号:192)。
いくつかのまた別の実施態様では、抗B7-H3抗原結合分子は、B7-H3との結合についてMAbエノブリツズマブと競合する。
MAHAMENSWTISKEYHIDEEVGFALPNPQENLPDFYNDWMFIAKHLPDLIESGQLRERVEKLNMLSIDHLTDHKSQRLARLVLGCITMAYVWGKGHGDVRKVLPRNIAVPYCQLSKKLELPPILVYADCVLANWKKKDPNKPLTYENMDVLFSFRDGDCSKGFFLVSLLVEIAAASAIKVIPTVFKAMQMQERDTLLKALLEIASCLEKALQVFHQIHDHVNPKAFFSVLRIYLSGWKGNPQLSDGLVYEGFWEDPKEFAGGSAGQSSVFQCFDVLLGIQQTAGGGHAAQFLQDMRRYMPPAHRNFLCSLESNPSVREFVLSKGDAGLREAYDACVKALVSLRSYHLQIVTKYILIPASQQPKENKTSEDPSKLEAKGTGGTDLMNFLKTVRSTTEKSLLKEG(配列番号:193)。
いずれのIDOアンタゴニストも本発明の治療薬での使用に適切である。これまでのところ、以下の3つの小分子IDO阻害剤が臨床使用のために開発されている:GDC-0919(1-シクロヘキシル-2-(5H-イミダゾ[5,1-a]イソインドール-5-イル)エタノール)、インドキシモド(1-メチル-D-トリプトファン)、およびエパカドスタット(1,2,5-オキサジアゾール-3-カルボキシミダミド, 4-((2-((アミノスルホニル)アミノ)エチル)アミノ)-N-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-N'-ヒドロキシ-, (C(Z))-)。これら分子の各々の分子構造は下記に提供される:
HEGVHRKPSLLAHPGPLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREGMFNDTLRLIGEHHDGVSKANFSISRMTQDLAGTYRCYGSVTHSPYQVSAPSDPLDIVIIGLYEKPSLSAQPGPTVLAGENVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRLPAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFHDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLHILIGTSVVIILFILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQESAGNRTANSEDSDEQDPQEVTYTQLNHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDIIVYTELPNAESRSKVVSCP(配列番号:194)。
本発明での使用に適切な抗KIR抗原結合分子は、当業界で周知の方法を用いて生成することができる。また別に、当業界で承認されているKIR抗原結合分子を用いてもよい。例えば、抗KIR抗原結合分子は、例えばWO2014/066532(その全内容は参照によってその全体が本明細書に含まれる)に記載される、完全にヒト化されたMAbリリルマブまたはその抗原結合フラグメントを含む。適切には、抗KIR抗原結合分子は表14に示すCDR領域を含む。
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSFYAISWVRQAPGQGLEWMGGFIPIFGAANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSDDTAVYYCARIPSGSYYYDYDMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号:201)、
またはその抗原結合フラグメントを含むことができ、前記の代表的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る:
MELSSLRSDDTAVYYCARIPSGSYYYDYDMDVWGQGTTVTVSS(配列番号:202)。
同じおよび他の実施態様のいくつかでは、抗KIR抗原結合分子は、例えば以下に示す、リリルマブの軽鎖可変ドメインアミノ酸配列:
EIVLTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWMYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:203)、
またはその抗原結合フラグメントを含むことができ、前記の代表的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る:
EIVLTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWMYTFGQGTKLEIKRT(配列番号:204)。
LQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLLLFLILGVLSLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL(配列番号:205)。
いくつかの実施態様では、LAG-3アンタゴニストは抗LAG-3抗原結合分子である。例示すれば、適切な抗LAG-3抗原結合分子は抗LAG-3ヒト化MAb BMS-986016である。他の抗LAG-3抗体は、米国特許公開No. 2011/0150892並びに国際PCT公開No. WO2010/019570およびWO2014/008218(前記の各々は参照によってその全体が本明細書に含まれる)に記載される。
いくつかの実施態様では、抗LAG-3抗原結合分子は表15に示すCDR配列を含む。
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号:212)、
またはその抗原結合フラグメントを有し、前記の代表的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る:
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSS(配列番号:213)。
同様に、抗LAG-3抗原結合分子は、配列番号:45に示され、さらに下記に提供されるBMS-986016の軽鎖アミノ酸配列:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:214)、
またはその抗原結合フラグメントを含むことができ、前記の代表的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIK(配列番号:215)。
本発明は、異なる特異性を有する抗原結合分子から形成されるマルチ特異性抗原結合分子を提供し、前記は、RANKLまたはRANKおよび少なくとも1つのICMと結合する。ある種の実施態様では、第一の抗原結合特異性を有する抗原結合分子は、1つ以上の他の分子実体、例えば第二の抗原結合特異性を有する別の抗原結合分子に機能的に連結されて(例えば化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合または他の態様によって)、二重特異性抗原結合分子を生成することができる。本発明の関係で使用できる具体的な例示的マルチ特異性様式には以下が含まれる(ただしそれらに限定されない):単鎖ジアボディ(scDb)、タンデムscDb(Tandab)、直鎖状ダイマーscDb(LD-scDb)、環状ダイマーscDb(CD-scDb)、二重特異性Tsaibouエンゲージャー(BiTE;タンデムdi-scFv)、ジスルフィド安定化Fvフラグメン(Brinkmann et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90: 7538-7542)、タンデムtri-scFv、トリボディ、二重特異性Fab2、二ミニ抗体、テトラボディ、scFv-Fc-scFv融合物、二ジアボディ、DVD-Ig、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合物、例えばbsAb(軽鎖C-末端に連結されたscFv)、Bs1Ab(軽鎖N-末端に連結されたscFv)、Bs2Ab(重鎖N-末端に連結されたscFv)、Bs3Ab(重鎖C-末端に連結されたscFv)、Ts1Ab(重鎖および軽鎖の両方のN-末端に連結されたscFv)、Ts2Ab(重鎖のC-末端に連結されたdsscFv)、およびノブイントゥホール(KiHs)(KiH技術によって調製された二重特異性IgG)、SEED技術(SEED-IgG)およびデュオボディ(デュオボディ技術によって調製された二重特異性IgG)、一VH一VLドメイン(KiHまたはデュオボディの2つの異なる重鎖の1つのC-末端に各々が融合して1つの機能的ドメインが形成される)。本明細書での使用に特に適切なものは、単鎖ジアボディ(scDb)、特に二重特異性モノマーscDbである。多様なマルチ特異性構築物を考察および提示する概論のためには、例えば以下を参照されたい:Chan Carter, Nature Reviews Immunology 10 (2010) 301-316;Klein et al., MAbs 4(2012) 1-11;Schubert et al., Antibodies 1 (2012) 2-18;Byrne et al., Trends in Biotechnology 31 (2013) 621;Metz et al., Protein Engineering Design & Selection 25(2012) 571-580;および前記に引用された参考文献。
例示すれば、第一の抗原結合分子はヒトRANKLの領域に特異的に結合することができ、第二の抗原結合分子は、ヒトPD-1の領域に、好ましくはヒトPD-1の細胞外ドメインの領域に特異的に結合することができる。
これらの実施態様の非限定的な例は、表1−3のいずれか1つに示されるCDR配列を含む第一の抗原結合分子を含む。このタイプの具体的な例では、第一の抗原結合分子は、MAbデノスマブの少なくとも1つの抗原結合フラグメントを含むことができる。
適切には、PD-1と特異的に結合する第二の抗原結合分子は、表4−6のいずれか1つに示されるCDR配列を含む。このタイプの具体的な例では、第二の抗原結合分子は、ニボルマブ、ペムブロリズマブおよびピジリズマブから選択されるMAbのいずれか1つの少なくとも1つの抗原結合フラグメントを含むことができる。
さらに他の実施態様では、第二の抗原結合分子はヒトCTLA4の領域と特異的に結合する。したがって、いくつかの実施態様では、第二の抗原結合分子はヒトCTLA4と特異的に結合し、表10−11のいずれか1つに示されるCDR配列を含む。このタイプの具体的な例では、第二の抗原結合分子は、イピリムマブおよびトレメリムマブから選択されるMAbのいずれか1つの少なくとも1つの抗原結合フラグメントを含む。
本発明はまた、RANKLまたはRANKに対して特異性を有するRANKアンタゴニスト抗原結合分子、および2つ以上のICMに対して特異性を有する複数のICMアンタゴニスト抗原結合分子を含むマルチ特異性構築物を提供する。非限定的な例では、複数のICMアンタゴニスト抗原結合分子は、以下から選択されるICM組合せに対して特異性を有する:(1)PD-1およびPD-L1、(2)PD-1およびCTLA4、(3)PD-L1およびCTLA4、並びに(4)PD-1、PD-L1およびCTLA4。マルチ特異性構築物は、特定のICM組合せに対して特異性を有する任意の適切な抗体または抗原結合フラグメント(本明細書に開示する抗体または抗原結合フラグメントを含む)を含むことができる。
本発明のマルチ特異性抗原結合分子は、当業界で周知の多数の方法によって生成できる。適切な方法には以下が含まれる:生物学的方法(例えば体細胞ハイブリダイゼーション)、遺伝学的方法(例えば所望の抗体構造をコードする自然のままではないDNA配列の生物での発現)、化学的方法(例えば2つの構造の化学的結合)、または前記の組合せ(以下を参照されたい:Kontermann R E (ed.), Bispecific Antibodies, Springer Heidelberg Dordrecht London New York, 1-28, 2011)。
化学的に結合させた二重特異性抗原結合分子は、2つの現存抗体または抗体フラグメント(例えば上記および本明細の他の場所に記載されたもの)の化学的カップリングから生じる。典型的なカップリングは、2つの異なる完全長抗体の架橋、2つの異なるFab’フラグメントの架橋による二重特異性F(ab’)2の生成、およびF(ab’)2フラグメントと異なるFab’フラグメントとの架橋による二重特異性F(ab’)3の生成を含む。化学的結合のためには、酸化的再結合手法を用いることができる。従来の方法は、ホモまたはヘテロ官能性架橋試薬の使用を含む(上掲書)。
ヘテロ二官能性架橋試薬は、2つの別個の反応基(例えば抗体分子上の)に対する反応性を有する。ヘテロ二官能性架橋試薬の例には以下が含まれる:SPDP(N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート)、SATA(スクシンイミジルアセチルチオアセテート)、SMCC(スクシンイミジルtrans-4-(マレイミジルエチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート)、EDAC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)、PEAS(N-((2-ピリジルジチオ)エチル)-4-アジドサリチルアミド)、ATFB-SE(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロ安息香酸、スクシンイミジルエステル)、ベンゾフェノン-4-マレイミド、ベンゾフェノン-4-イソチオシアネート、4-ベンゾイル安息香酸、スクシンイミジルエステル、アジ化ヨードアセトアミド、ヨードアセトアミドアルキン、Click-iTマレイミドDIBOアルキン、アジド(PEO)4プロピオン酸、スクシニミジルエステル、アルキン、スクシンイミジルエステル、Click_iTスクシンイミジルエステルDIBOアルキン、スルホ-SBED(スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドバンズアミド)-ヘキサノアミド)エチル-1,3’-ジチオプロピオネート)、光反応性アミノ酸(例えばL-photo-ロイシンおよびL-photo-メチオニン)、NHS-ハロアセチル架橋剤(例えばスルホ-SIAB)、SIAB、SBAP、SIA、NHS-マレイミド架橋剤(例えばスルホ-SMCC)、SM(PEG)nシリーズ架橋剤、SMCC、LC-SMCC、スルホ-EMCS、EMCS、スルホ-GMBS、GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、MBS、スルホ-SMPB、SMPB、AMAS、BMPS、SMPH、PEG12-SPDP、PEG4-SPDP、スルホ-LC-SPDP、LC-SPDP、SMPT、DCC(N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド)、EDC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)、NHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、スルホ-NHS(N-ヒドロキシスルホスクシンイミド)、BMPH、EMCH、KMUH、MPBH、PDPHおよびPMPI。
ホモ二官能性架橋試薬は、分子(例えば抗体)上の同じ反応基に対して反応性を有する。ホモ二官能性架橋試薬の例には以下が含まれる:DTNB(5,5’-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)、o-PDM(o-フェニレンジマレイミド)、DMA(ジメチルアジピミデート)、DMP(ジメチルピメリミデート)、DMS(ジメチルスベリミデート)、DTBP(ジチオビスプロピオンイミデート)、BS(PEG)5、BS(PEG)9、BS3、BSOCOES、DSG、DSP、DSS、DST、DTSSP、EGS、スルホ-EGS、TSAT、DFDNB、BM(PEG)n架橋リンカー、BMB、BMDB、BMH、BMOE、DTMEおよびTMEA。
体細胞ハイブリダイゼーションは、2つの別個のハイブリドーマ細胞株の融合(特異的抗体生成B細胞とミエローマ細胞の融合)であり、前記は、異なる抗体重鎖(すなわちVHAおよびVHB)および軽鎖(すなわちVLAおよびVLB)を生成することができるクアドローマを生じる(Kontermann(上掲書))。これらの重鎖および軽鎖は細胞内でランダムに組み合わされ、二重特異性抗原結合分子(例えばVLA鎖と組み合わされたVHA鎖およびVLB鎖と組み合わされたVHB鎖)とともに、いくつかの非機能性(例えば2つのVLB鎖と組み合わされた2つのVHA鎖)および一特異性(例えば2つのVHA鎖と組み合わされた2つのVHA鎖)抗原結合分子を生じる。続いて二重特異性抗原結合分子を、確立された方法(例えば2つの異なる親和性クロマトグラフィーカラム)を用いて精製することができる。
一特異性抗原結合分子と同様に、二重特異性抗原結合分子はまた、抗原結合の下流でFc媒介作用を引き出すFc領域を含むことができる。これらの作用は、例えばペプシン消化により二重特異性抗体からFc領域をタンパク分解切断することによって低下させて、二重特異性F(ab’)2分子を生成することができる(上掲書)。
4.3マルチ特異性抗原結合分子を作製する遺伝学的方法
マルチ特異性抗原結合分子はまた、当業界で確立された遺伝学的手段、例えば所望の抗体構造に対応するDNA配列を含むプラスミドのin vitro発現によって生成することができる(例えば上掲書(Kontermann)を参照されたい)。
いくつかの実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子はジアボディである。ジアボディは、例えばRANKLおよびICMと結合する抗体に由来する2つの別々のポリペプチド鎖で構成され、各鎖は2つの可変ドメイン(VHA-VLBおよびVHB-VLAまたはVLA-VHBおよびVLB-VHA)を有する。典型的には、可変ドメインを接合させるポリペプチドリンカーは短い(すなわち約2、3、4、5、6、7、8、8または10アミノ酸)。短いポリペプチドリンカーは、同じ鎖上のVHおよびVLドメインの結合を防ぎ、したがって異なる鎖上のVHおよびVLドメインの結合を促進する。形成されるヘテロダイマーは両標的抗原に対して機能性である(例えばVHB-VLAを有するVHA-VLBまたはVLB-VHAを有するVLA-VHB)。しかしながら、ホモダイマーもまた形成され(例えばVHA-VLBを有するVHA-VLB、VHB-VLAを有するVHB-VLAなど)、非機能性分子をもたらす。ホモダイマー化を防ぐいくつかの手法が当業界で公知であり、以下が含まれる:ジスルフィド結合を導入して2つのポリペプチド鎖を共有結合により接合する方法、一方の鎖に大きなアミノ酸を他方の鎖に小さなアミノ酸を含むようにポリペプチド鎖を改変する方法(上記および本明細書の他の場所で考察されるノブイントゥホール構造物)、およびC-末端伸長部にシステイン残基を付加する方法。別の手法は、2つのポリペプチド鎖をポリペプチドリンカー配列によって接合して、taFvよりもコンパクトな構造を示す単鎖ジアボディ分子(scDb)を生成する。scDbまたはジアボディをまたIgG1 CH3ドメインまたはFc領域に融合させて、二ジアボディを生成することができる。二ジアボディの例にはscDb-Fc、Db-Fc、scDb-CH3、およびDb-CH3が含まれるが、ただし前記に限定されない。加えて、scDbを用いて四価の二重特異性分子を作製することができる。scDbのポリペプチドリンカー配列を約15アミノ酸から約5アミノ酸に短くすることによって、ダイマー性単鎖ジアボディ分子を生じる。前記はTandAbとして知られる(Muller and Kontermann, Bispecific Antibodies Kontermann R E (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, 83-100, 2011)。
本発明のマルチ特異性抗原結合分子を生成する別の適切な手法は、ヘテロダイマー形成ペプチドを抗体分子(例えばscFvまたはFab)のC-末端に接合あるいは連結する工程を含む。
この手法の非限定的な例は、jun-fosロイシンジッパーに連結した抗体フラグメントの使用である(例えば、scFv-Jun/FosおよびFab’-Jun/Fos)。
二重特異性抗原結合分子を生成する追加の方法は、ビオチンを有する異なる抗原結合フラグメントを用いて2つの抗体を誘導し、続いて2つの抗体をストレプトアビジンを介して連結し、得られた二重特異性抗体をその後で精製および単離する。
本発明の二重特異性抗原結合分子の追加のタイプには、各抗原について2つ以上の抗原結合部位を含むものが含まれる。例えば、追加のVHおよびVLドメインを現存する抗体のVHおよびVLドメインのN-末端に融合させて、抗原結合部位をタンデムに効果的に並べることができる。これらのタイプの抗体は二重可変ドメイン抗体(DVD-Ig)として公知である(以下を参照されたい:Tarcsa, E. et al., in Bispecific Antibodies. Kontermann(上掲書、ページ171-185))。1つの抗原に対して2つ以上の抗原結合部位を含む抗体を生成する別の方法は、scFvフラグメントを重鎖のN-末端または軽鎖のC-末端に融合させることである(下記で詳細に考察される)。
抗体またはマルチ特異性抗原結合分子複合体もしくは構築物の抗原結合フラグメントは、IgM、IgG、IgD、IgA、IgE(前記はそれらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって互いに区別される)またはそのフラグメントから成る群からそれぞれ独立に選択される。これらIgクラスのいくつかはさらにまた、サブクラス(例えばIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4、IgA1およびIgA2)に分割される。抗体の種々のクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。5つの抗体クラスの全てに見出すことができる軽鎖定常領域(CL)は、κ(カッパ)およびλ(ラムダ)から選択される。抗原認識および結合能力を保持する抗体フラグメントは、Fab、Fab’、F(ab’)2およびFvフラグメントである。さらにまた、第一および第二の抗原結合フラグメントは直接的またはリンカー(例えばペプチドリンカー)によって接続される。
定常免疫グロブリンドメインを適切に用いて、2つのポリペプチド鎖のヘテロダイマー化(例えばIgG様抗体)を促進することができる。二重特異性抗体作製のためのこの手法には、2つのポリペプチドへのノブイントゥホール構造の導入およびCLおよびCH1ドメインの天然に存在するヘテロダイマー形成の利用が含まれる(以下を参照されたい:Kontermann, supra, pp. 1 -28, 2011;Ridgway et al., Protein Eng. 1996 Jul;9(7):617-21;Atwell et al., J Mol Biol.1997 Jul 4;270(1):26-35)。
本発明の組換え抗原結合分子の大半は操作されて、IgG様(それらはまたFcドメインを含むことを意味する)であることができる。操作されたポリペプチド鎖のヘテロダイマー化を必要とするジアボディと同様に、IgG様抗原結合分子もまた、異なる特異性を有する2つの抗体の類似の重鎖または重鎖および軽鎖の相互作用を防ぐためにヘテロダイマー化を必要とする(Jin, P. and Zhu, Z. In: Bispecific Antibodies. Kontermann RE (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, pp. 151-169, 2011)。
追加のヘテロダイマー化IgG様抗原結合分子には、ヘテロFc-scFvs、Fab-scFvs、IgG-scFv、およびscFv-IgGが含まれる(ただし前記に限定されない)。ヘテロFc-scFvsは2つの別個のscFvをヘテロダイマー化が可能なFcドメインに連結し、一方、Fab-scFvsは1つのエピトープに特異的なFabドメインを含み、前記Fabドメインは異なるエピトープに特異的なscFvに連結されている。IgG-scFvおよびscFv-IgGはIgG様抗体であり、前記はそれらのC-末端およびN-末端にそれぞれ連結されたscFvを有する(上掲書(Kontermann R E (ed.))の151−169ページ参照されたい)。
CrossMAbの別の例示的な例では、マルチ特異性抗原結合分子は、例えばWO2008119353およびWO 2011131746(その各々は参照によってその全体が本明細書に含まれる)に記載されたデュオボディプラットフォーム/cFAE(GenMAb)を土台にすることができ、前記では、二重特異性抗体は、2つの異なる宿主で別々の成分抗体の発現によって作出され、続いて精製および組立てられて、2つの一特異的抗体間での制御されたFabアームの交換により二特異的ヘテロダイマー抗体が得られる。2つの一特異性出発タンパク質のCH3領域に非対称性で適合する変異(例えばF405LおよびK409R(EU番号付与インデックスによる))を導入することによって、Fabアーム交換と同様な力が働いて、方向が定められた、したがって収量が安定したヘテロダイマー対が減数的条件下でもたらされ得る(例えば以下に記載される:Labrijn et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2013;110(13):5145-5150;Gramer et al. MAbs 2013;5(6): 962-973;Labrijn et al. Nature Protocols 2014;9(10):2450-63(前記文献は参照によってその全体が本明細書に含まれる))。実際、二重特異性ヒトIgG1 Abを2つの精製親抗体から作製することができる(親抗体の各々は対応するただ1つの相補的な変異(K409RまたはF405L)を有する)。この同じ手法をヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4骨格で実施することができる(上掲書(Labrijn 2013))。
他の実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は静電気的ステアリングに基づく(Amgen、前記では、CH3における荷電相補性が選択した変異により変更され、静電気的ステアリング効果を介して抗体Fcヘテロダイマー形成増強がもたらされる(Gunasekaran et al., J Biol Chem 2010;285(25):19637-46;WO 2009089004 A1(前記は参照によって本明細書に含まれる))。この同じ手法をヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4骨格で実施することができる(WO 2009089004 A1)。リンカー。
リンカーを用いて異なる抗原結合分子を共有結合させ、少なくとも2つの抗原結合分子を含むキメラ分子を形成することができる。抗原結合分子間の連結は空間的関係を提供して、個々の結合分子とそれらの対応する同族エピトープとの結合を可能にすることができる。これに関して、個々のリンカーは、2つの別個の機能的な抗原結合分子の結合のために機能する。リンカーのタイプには、化学リンカーおよびポリペプチドリンカーが含まれるが、ただし前記に限定されない。
リンカーは化学的リンカーであることができ、例えば以下が含まれる:アルキレン鎖、ポリエチレングリコール(PEG)鎖、ポリコハク酸無水物、ポリ-L-グルタミン酸、ポリ(エチレンイミン)、オリゴ糖、アミノ酸鎖、または他の任意の適切な連結。ある種の実施態様では、リンカーそのものは生理学的条件下で安定であることができ(例えばアルキレン鎖)、或いは、前記は、生理学的条件下で、例えば酵素によって(例えば結合はペプチダーゼのための基質であるペプチド配列を含む)、または加水分解によって(例えば結合は加水分解可能な基、例えばエステルまたはチオエステルを含む)切断可能であることができる。リンカーは生物学的に非活性であることができ(例えばPEG、ポリグリコール酸、またはポリ乳酸鎖)、或いは、前記は生物学的に活性であることができる(例えばオリゴもしくはポリペプチドなどで、前記は当該部分から切断されたとき、受容体と結合し酵素を不活化する)。リンカーは、第一および第二の抗体または抗原結合フラグメントと、任意の適切な結合または官能基(炭素-炭素結合、エステル、エーテル、アミド、アミン、カルボネート、カルバメート、スルホンアミドなどを含む)によって結合させることができる。
代表的なペプチドリンカーは、[AAA]n、[SGGGG]n、[GGGGS]n、[GGGGG]n、[GGGKGGGG]n、[GGGNGGGG]n、[GGGCGGGG]nから選択することができ、ここでnは1から10、適切には1から5、より適切には1から3の整数である。
本発明のある特徴は、異なる特異性を有する複数の抗原結合分子を含み、それらが直接的にまたはリンカーを介して一緒に融合或いは接合されているキメラ構築物に関する。
5.1抗RANKL-抗PD-1ジアボディ
本発明は、二重特異性で抗RANKL抗原結合分子および抗PD-1抗原結合分子を含むマルチ特異性構築物を意図し、その代表的な例は、以下から選択される配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る:
a)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqssnwprtfgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik(配列番号:216)
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
b)QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqssnwprtfgqgtkveik(配列番号:217)
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
d)QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqssnwprtfgqgtkveik(配列番号:219)
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
e)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscraskgvstsgysylhwyqqkpgqaprlliylasylesgvparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfgggtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik(配列番号:220)
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
g)QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscraskgvstsgysylhwyqqkpgqaprlliylasylesgvparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfgggtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik(配列番号:222)
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
h)QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscraskgvstsgysylhwyqqkpgqaprlliylasylesgvparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfgggtkveik(配列番号:223)
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
また別に、二重特異性構築物は、抗RANKL抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含み、その代表的な例は、以下から選択される配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る:
a)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqrvsssylawyqqkpgqaprlliydassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygslpwtfgqgtkveik [SGGGG]n VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik(配列番号:224)
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
b)VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqrvsssylawyqqkpgqaprlliydassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygslpwtfgqgtkveik(配列番号:225)
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
d)VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqrvsssylawyqqkpgqaprlliydassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygslpwtfgqgtkveik(配列番号:227)
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
f)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveik(配列番号:229)
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
h)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveik(配列番号:231)
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
また別に、二重特異性構築物は、抗RANKL抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子を含み、その代表的な例は、以下から選択される配列を含むか、前記から成るか、または本質的に前記から成る:
a)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvgssylawyqqkpgqaprlliygafsratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspwtfgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik(配列番号:232)
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
b)QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvgssylawyqqkpgqaprlliygafsratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspwtfgqgtkveik(配列番号:233)
ここで、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
d)QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvgssylawyqqkpgqaprlliygafsratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspwtfgqgtkveik(配列番号:235)
ここで、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
e)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsinsyldwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyystpftfgpgtkveik [SGGGG]n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik(配列番号:236)
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
f)QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsinsyldwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyystpftfgpgtkveik(配列番号:237)
ここで、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
h)QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsinsyldwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyystpftfgpgtkveik(配列番号:239)
ここで、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
本発明はまたCrossMAbマルチ特異性抗原結合分子を意図する。CrossMAb構築の第一の工程では、操作された突起が、第一のIgG様ポリペプチドの境界面に、そのCH3ドメイン内の当該ポリペプチドの少なくとも1つの接触残基を置き換えることによって作出される。具体的には、第一のポリペプチド上で置き換えられるべき接触残基は366位のIgG残基(残基の番号付与はFc結晶構造による(Deisenhofer, Biochem. 20:2361, 1981))に対応し、ここで、操作される突起は、最初の残基をコードする核酸を最初の残基よりも大きな側鎖体積を有する持込み残基をコードする核酸で置き換える工程を含む。具体的には、366位のスレオニン(T)残基がトリプトファン(W)に変異させられる。第二の工程では、操作された窪みが、第二のポリペプチドの境界面に、そのCH3ドメイン内の当該ポリペプチドの少なくとも1つの接触残基を置き換えることによって作出され、ここで、操作される窪みは、最初の残基をコードする核酸を最初の残基よりも小さな側鎖体積を有する持込み残基をコードする核酸で置き換える工程を含む。具体的には、第二のポリペプチド上で置き換えられるべき接触残基は407位のIgG残基に対応する。具体的には、407位のチロシン(Y)残基がアラニン(A)に変異させられる。この操作手順は、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3およびIgG4から成る群から選択される、種々のIgGサブタイプで実施することができる。
続く工程では、ヘテロダイマー二重特異性IgGで起こり得る2つの軽鎖/重鎖相互作用間の識別を促進するために、所望される軽鎖/重鎖対の結合を、二重特異性抗体の1つのFab(Fab領域)を改変することによって誘発し、軽鎖および重鎖間で定常領域または定常領域と可変領域を“交換”することができる(例えば上掲書(Schaefer et al., 2011)参照)。したがって、改変Fabドメインではそれぞれ、重鎖は例えばCL-VHまたはCL-VLドメインを含み、軽鎖はCHI-VLまたはCHI-VHドメインを含むことになろう。これは、改変鎖の重鎖/軽鎖Fab部分(すなわち改変軽鎖または重鎖)と標準/非改変アームの重鎖/軽鎖Fab部分との相互作用を防ぐ。解説すれば、改変アームのFabドメインの重鎖(CLドメインを含む)は、好ましくは、非改変アーム/Fabドメインの軽鎖(前記もまたCLドメインを含む)と相互作用しない(重鎖/軽鎖の“不適切な”または望ましくない対形成を防ぐ)。“不適切な”軽鎖/重鎖の結合を防ぐこの技術は、“CrossMAb”技術と称され、KiH技術と併用されるときには、所望の二重特異性分子の目覚ましく増強された発現をもたらす(例えば上掲書(Schaefer et al.)を参照されたい)。
ヘテロダイマー二重特異性IgG抗体の作製は、第一に、二重特異性IgGの4鎖をコードする抗体遺伝子を哺乳動物系発現ベクターでクローニングし、哺乳動物細胞(例えばHEK293)での分泌性発現を可能にする。抗体鎖cDNAの各々を一緒に等モル比で、HEK293細胞に293フェクチンまたは同様な技術を用いてトランスフェクトし、抗体含有細胞培養上清を採集し、タンパク質Aセファロースを用いて抗体を上清から精製する。
いくつかの実施態様では、抗RANKL抗原結合分子および抗PD-1抗原結合分子の両方を含む二重特異性ヘテロダイマーIgGは、2重鎖2軽鎖構築物を用いて構築することができ、この場合、重鎖CH3ドメインの一方は366位で改変され(T366W)(“ノブ”と称される)、他方の重鎖CH3ドメインは407位で改変されて(Y407A)(“ホール”と称される)、重鎖のKiHヘテロダイマー化を促進する。
例示的デノスマブCrossMAbはIgG2に由来する重鎖配列を含むことができ、所望の軽鎖/重鎖対形成は、Ig鎖間でCH1およびCLドメインが交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを改変することによって誘導され得る。この構築のために、以下の4つの構築物が用いられる。
構築物1
デノスマブCrossMAb CH1-CL huIgG2ノブ(KNOB)変異、重鎖
ここで、IgG2シグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVHは通常大文字で表示され、デノスマブCLは太字の小文字で表示され、ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、デノスマブCH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、T366W置換は太字の大文字で表示される。
構築物2
デノスマブCrossMAb CH1-CL軽鎖
ここで、カッパシグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVLは通常大文字で表示され、デノスマブCH1ドメインは太字の小文字で表示される。
構築物3
ニボルマブIgG2ホール変異、重鎖
ここで、ニボルマブVHは通常大文字で表示され、ニボルマブCH1は太字の小文字で表示され、HuIgG2ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、HuIgG2CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、Y407A置換は太字の大文字で表示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:243)。
デノスマブCrossMAbのための別の実施態様では、所望の軽鎖/重鎖対形成は、Ig鎖間でVHおよびVLドメインが交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを改変することによって誘導され得る。ある実施態様では、前記は、IgG2に由来する重鎖配列を含み、重鎖のヘテロダイマー化はKiH改変によって促進される。この構築のために、以下の4つの構築物が用いられる。
構築物1
デノスマブCrossMAb VH-VL huIgG2ノブ変異、重鎖
ここで、IgG2シグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVLは通常大文字で表示され、デノスマブCH1ドメインは太字の小文字で表示され、ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、デノスマブCH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、T366W置換は太字の大文字で表示される。
構築物2
デノスマブCrossMAb VH-VL軽鎖
ここで、カッパシグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVHは通常大文字で表示され、デノスマブCLドメインは太字の小文字で表示される。
構築物3
ニボルマブIgG2ホール変異、重鎖
ここで、ニボルマブVHは通常大文字で表示され、ニボルマブCH1は太字の小文字で表示され、HuIgG2ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、HuIgG2CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、Y407A置換は太字の大文字で表示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:247)
デノスマブCrossMAbのさらに別の実施態様では、所望の軽鎖/重鎖対形成は、Ig鎖間でFabドメインが交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを改変することによって誘導され得る。この実施態様では、前記は、IgG2に由来する重鎖配列を含み、重鎖のヘテロダイマー化はKiH改変によって促進される。この構築のために、以下の4つの構築物が用いられる。
構築物1
デノスマブCrossMAb Fab huIgG2ノブ変異、重鎖
ここで、IgG2シグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVLは通常大文字で表示され、デノスマブCLドメインは太字の小文字で表示され、ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、デノスマブCH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、T366W置換は太字の大文字で表示される。
構築物2
デノスマブCrossMAb Fab軽鎖
ここで、カッパシグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVHは通常大文字で表示され、デノスマブCH1ドメインは太字の小文字で表示される。
構築物3
ニボルマブIgG2ホール変異、重鎖
ここで、ニボルマブVHは通常大文字で表示され、ニボルマブCH1ドメインは太字の小文字で表示され、HuIgG2ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、HuIgG2CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、Y407A置換は太字の大文字で表示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:251)。
デノスマブCrossMAbのさらに別の実施態様では、デノスマブCrossMAbはIgG4に由来する重鎖配列を含む。この実施態様では、所望の軽鎖/重鎖対形成は、Ig鎖間でCH1およびCLドメインが交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを改変することによって誘導され得る。この構築のために、以下の4つの構築物が用いられる。
構築物1
デノスマブCrossMAb CH1-CL huIgG4ノブ変異、重鎖
ここで、IgG2シグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVHは通常大文字で表示され、デノスマブCLドメインは太字の小文字で表示され、IgG4ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IgG4 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、T366W置換は太字の大文字で表示される。
構築物2
デノスマブCrossMAb CH1-CL軽鎖
ここで、カッパシグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVLは通常大文字で表示され、デノスマブCH1ドメインは太字の小文字で表示される。
構築物3
ニボルマブIgG4ホール変異、重鎖
ここで、ニボルマブVHは通常大文字で表示され、ニボルマブCH1ドメインは太字の小文字で表示され、IgG4ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IgG4 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、Y407A置換は太字の大文字で表示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:255)。
デノスマブCrossMAbのさらに別の実施態様では、所望の軽鎖/重鎖対形成は、Ig鎖間でVHおよびVLドメインが交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを改変することによって誘導され得る。この実施態様では、前記は、IgG4に由来する重鎖配列を含み、重鎖のヘテロダイマー化はKiH改変によって促進される。この構築のために、以下の4つの構築物が用いられる。
構築物1
デノスマブCrossMAb VH-VL huIgG4ノブ変異、重鎖
ここで、IgG2シグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVLは通常大文字で表示され、デノスマブCH1ドメインは太字の小文字で表示され、IgG4ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IgG4 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、T366W置換は太字の大文字で表示される。
構築物2
デノスマブCrossMAb VH-VL軽鎖
ここで、カッパシグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVHは通常大文字で表示され、デノスマブCLドメインは太字の小文字で表示される。
構築物3
ニボルマブIgG4ホール変異、重鎖
ここで、ニボルマブVHは通常大文字で表示され、ニボルマブCH1ドメインは太字の小文字で表示され、IgG4ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IgG4 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、Y407A置換は太字の大文字で表示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:259)。
デノスマブCrossMAbの別の実施態様では、所望の軽鎖/重鎖対形成は、Ig鎖間でFabドメインが交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを改変することによって誘導され得る。この実施態様では、前記は、IgG4に由来する重鎖配列を含み、重鎖のヘテロダイマー化はKiH改変によって促進される。この構築のために、以下の4つの構築物が用いられる。
構築物1
デノスマブCrossMAb Fab huIgG4ノブ変異、重鎖
ここで、IgG2シグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVLは通常大文字で表示され、デノスマブCLドメインは太字の小文字で表示され、IgG4ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IgG4 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、T366W置換は太字の大文字で表示される。
構築物2
デノスマブCrossMAb Fab軽鎖
ここで、カッパシグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVHは通常大文字で表示され、デノスマブCH1ドメインは太字の小文字で表示される。
構築物3
ニボルマブIgG4ホール変異、重鎖
ここで、ニボルマブVHは通常大文字で表示され、ニボルマブCH1は太字の小文字で表示され、IgG4ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IgG4 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、Y407A置換は太字の大文字で表示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:263)。
デノスマブCrossMAbのさらに別の実施態様はIgG1に由来する重鎖配列を含む。この実施態様では、所望の軽鎖/重鎖対形成は、Ig鎖間でCH1およびCLドメインが交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを改変することによって誘導され得る。この構築のために、以下の4つの構築物が用いられる。
構築物1
デノスマブCrossMAb CH1-CL huIgG1ノブ変異、重鎖
ここで、IgG2シグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVHは通常大文字で表示され、デノスマブCLドメインは太字の小文字で表示され、IgG1ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IgG1 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、T366W置換は太字の大文字で表示される。
構築物2
デノスマブCrossMAb CH1-CL軽鎖
ここで、カッパシグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVLは通常大文字で表示され、デノスマブCH1ドメインは太字の小文字で表示される。
構築物3
ニボルマブIgG1ホール変異、重鎖
ここで、ニボルマブVHは通常大文字で表示され、ニボルマブCH1ドメインは太字の小文字で表示され、IgG1ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IgG1 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、Y407A置換は太字の大文字で表示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:267)。
デノスマブCrossMAbの別の実施態様では、所望の軽鎖/重鎖対形成は、Ig鎖間でVHおよびVLドメインが交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを改変することによって誘導され得る。ある実施態様では、前記は、IgG1に由来する重鎖配列を含み、重鎖のヘテロダイマー化はKiH改変によって促進される。この構築のために、以下の4つの構築物が用いられる。
構築物1
デノスマブCrossMAb VH-VL huIgG1ノブ変異、重鎖
ここで、IgG2シグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVLは通常大文字で表示され、デノスマブCH1ドメインは太字の小文字で表示され、IgG1ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IgG1 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、T366W置換は太字の大文字で表示される。
構築物2
デノスマブCrossMAb VH-VL軽鎖
ここで、カッパシグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVHは通常大文字で表示され、デノスマブCLドメインは太字の小文字で表示される。
構築物3
ニボルマブIgG1ホール変異、重鎖
ここで、ニボルマブVHは通常大文字で表示され、ニボルマブCH1ドメインは太字の小文字で表示され、IgG1ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IgG1 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、Y407A置換は太字の大文字で表示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:271)。
デノスマブCrossMAbの別の実施態様では、所望の軽鎖/重鎖対形成は、Ig鎖間でFabドメインが交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを改変することによって誘導され得る。ある実施態様では、前記は、IgG1に由来する重鎖配列を含み、重鎖のヘテロダイマー化はKiH改変によって促進される。この構築のために、以下の4つの構築物が用いられる。
構築物1
デノスマブCrossMAb Fab huIgG1ノブ変異、重鎖
ここで、IgG2シグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVLは通常大文字で表示され、デノスマブCLドメインは太字の小文字で表示され、IgG1ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IgG1 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、T366W置換は太字の大文字で表示される。
構築物2
デノスマブCrossMAb Fab軽鎖
ここで、カッパシグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVHは通常大文字で表示され、デノスマブCH1ドメインは太字の小文字で表示される。
構築物3
ニボルマブIgG1ホール変異、重鎖
ここで、ニボルマブVHは通常大文字で表示され、ニボルマブCH1ドメインは太字の小文字で表示され、IgG1ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IgG1 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、Y407A置換は太字の大文字で表示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号:275].
多様な実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、FabドメインがIg鎖間で交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを含み、配列番号:272(デノスマブCrossMAb Fab huIgG1ノブ変異、重鎖)および配列番号:273(デノスマブCrossMAb Fab軽鎖)を含む。
他の実施態様では、抗RANKL抗原結合分子のFabドメインは、VHおよびVLドメインがIg鎖間で交換されるように改変されて、配列番号:268(デノスマブCrossMAb VH-VL huIgG1ノブ変異、重鎖)および配列番号:269(デノスマブCrossMAb VH-VL軽鎖)を含む。
本発明の医薬組成物は概して、上記および本明細書の他の場所に記載の治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子を含み、前記は1つ以上の医薬的に許容できる担体とともに処方される。場合によって、医薬組成物は1つ以上の他の化合物、薬剤、成分および/または物質を含む。選択される投与経路に関係なく、本発明の治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子は、当業者に公知の通常的方法によって医薬的に許容できる剤形に処方される(例えば以下を参照されたい:Remington, The Science and Practice of Pharmacy;21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, Pa.)。
本発明の医薬組成物は、所望される効果的な任意の方法で対象動物に投与することができる。例えば、医薬組成物は、経口摂取のために、または眼への局所投与のための軟膏もしくは点眼液として、または非経口もしくは任意の適切な他の投与(例えば腹腔内、皮下、外用、皮内、吸入、肺内、直腸、膣、舌下、筋肉内、静脈内、動脈内、またはリンパ内投与)のために処方され得る。さらにまた、本発明の医薬組成物は、下記に詳細に記載する1つ以上の補助的治療と一緒に投与され得る。所望の場合には、本発明の医薬組成物を被包化するか、さもなければ胃または他の分泌物に対して保護することができる。
本発明の医薬組成物は1つ以上の活性成分を含むことができ、前記は、1つ以上の医薬的に許容できる担体、場合によって1つ以上の他の化合物、薬剤、成分および/または物質と混合物されてある。選択される投与経路に関係なく、本発明の二重特異性抗体は、当業者に公知の通常的方法によって医薬的に許容できる剤形に処方される(例えば以下を参照されたい:Remington, The Science and Practice of Pharmacy;21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, Pa.)。
経口投与用の固体剤形(カプセル、錠剤、ピル、糖衣錠、散剤、顆粒など)は、例えば活性成分を以下と混合することによって調製できる:1つ以上の医薬的に許容できる担体、および場合によって1つ以上の充填剤、増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸収促進剤、湿潤剤、吸収剤、滑沢剤および/または着色剤。同様なタイプの固体組成物は、適切な賦形剤を用い充填軟質および硬質ゼラチンカプセルとして利用され得る。錠剤は、打錠または成形によって、場合により1つ以上の付属成分とともに製造できる。打錠錠剤は、適切な結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存料、崩壊剤、界面活性または分散剤を用いて調製できる。成形錠剤は適切な機械で成形することによって製造できる。錠剤および他の固体剤形(例えば糖衣錠、カプセル、ピルおよび顆粒)は、場合によって刻み目をつけるか、またはコーティングおよび殻(例えば腸溶皮および製薬業界で周知の他のコーティング)を用いて調製できる。それらはまた、その中の活性成分の徐放出または制御放出を提供するために処方され得る。それらは、例えば細菌保持フィルターでろ過することによって滅菌することができる。これらの組成物はまた場合によって乳白剤を含むことができ、さらに、活性成分のみを好ましくは胃腸管の一定の部分で場合によって遅延態様で放出する組成物であってもよい。活性成分はまたマイクロカプセル化された形態であってもよい。
経口投与用の液体剤形には、医薬的に許容できるエマルジョン、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが含まれる。液体剤形は、当業界で普通に用いられる適切な不活性希釈剤を含む。不活性希釈剤の他に、経口組成物はまた、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、風味剤、着色剤、香料、および保存料を含むことができる。懸濁液は懸濁剤を含むことができる。
非経口投与に適切な本発明の医薬組成物は、1つ以上の薬剤/化合物/抗原結合分子を含み、それらは、1つ以上の医薬的に許容できる無菌的な等張の水性もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョン、或いは無菌的散剤(使用直前に無菌的注射可能溶液または分散液に再構成される)と組合される。前記は、適切な抗酸化剤、緩衝剤、処方物を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁もしくは膨張剤を含む。適切な流動性は、例えばコーティング物質の使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持できる。これら組成物はまた、適切なアジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤および分散剤を含むことができる。前記はまた等張剤を含むことが所望され得る。加えて、注射可能医薬形の吸収延長は、吸収を遅延させる薬剤の含有によって達成され得る。
いくつかの事例では、医薬組成物の効果を延長させるために、皮下注射または筋肉内注射の吸収速度を遅くすることが所望される。これは、水への溶解性が低い結晶または非晶質物質を液体懸濁物に混合することによって達成できる。
活性薬剤(例えば治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子)の吸収速度はその分解速度に左右され、前記は順に結晶サイズおよび結晶形に左右され得る。また別には、非経口投与薬剤または抗体の吸収遅延は、活性薬剤または抗体を油性ビヒクルに溶解または懸濁することによって達成できる。注射可能なデポ剤は、活性成分のミクロ被包化マトリックスを生物分解性ポリマーで形成することによって製造できる。活性成分対ポリマー比および利用される具体的なポリマーの性質に応じて、活性成分放出速度を制御することができる。注射可能なデポ剤処方物はまた、身体組織に適合するリポソームまたはミクロエマルジョンに薬剤を閉じ込めることによって調製できる。注射可能な物質は、例えば細菌保持フィルターでろ過することによって滅菌することができる。
処方物は、単位用量またはマルチ用量封入容器(例えばアンプルおよびバイアル)で提供でき、凍結乾燥状態で保存することができる(前記は、使用直前に無菌的な液状担体、例えば注射水の添加のみを必要とする)。上記に記載したタイプの無菌的散剤、顆粒および錠剤から即席の注射溶液および懸濁液を調製することができる。
上記および本明細書の他の場所で開示する治療薬組合せ、マルチ特異性抗原結合分子、および医薬組成物は、1つ以上の追加の治療薬剤(例えば、抗ガン剤、細胞傷害性または細胞増殖抑制剤、ホルモン治療、ワクチン、および/または免疫治療)と共同投与することができる。また別に或いは加えるに、治療薬剤、二重特異性抗体、および医薬組成物は、他の治療用式(外科手術、放射線照射、冷凍外科手術および/または温熱療法を含む)と併用して投与される。そのような併用療法は、有利には、投与される治療薬剤のより低い投薬量の使用を可能にし、したがって生じ得る毒性または合併症を回避する。
例えば、本明細書で開示する併用療法はまた標準的癌治療と組合わせることができる。例えば、PD-1単一療法は、化学療法レジメンと効果的に併用されることが知られている。これらの例では、投与される化学療法剤の用量を減少させることが可能である(Mokyr, M. et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。ある種の実施態様では、本明細書に記載の方法および組成物は、1つ以上の他の抗体分子、化学療法、他の抗癌療法(例えば標的誘導抗癌療法、または腫瘍溶解薬剤)、細胞傷害薬剤、免疫系療法(例えばサイトカイン)、外科的および/または放射線照射工程と併用して投与される。併用投与できる例示的な細胞傷害剤には、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、抗代謝剤、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、インターカレーション剤、シグナル伝達経路に干渉できる薬剤、アポトーシス促進薬剤、プロテアソーム阻害剤および放射線照射(例えば局所または全身照射)が含まれる。
上記および本明細書の他の場所で開示する薬剤、抗体および方法で組合わせて用いることができる、例示的なビンカアルカロイドには以下が含まれる:ビノレルビン酒石酸塩(NAVELBINE)、ビンクリスチン(ONCOVIN)、ビンデシン(ELDISINE)、およびビンブラスチン(ビンブラスチン硫酸塩、ビンカロイコブラスチン、VLB、ALKABAN-AQおよびVELBAN)(ただしこれらに限定されない)。
本発明で用いることができる例示的なプロテアソーム阻害剤には以下が含まれる:ボルテゾミブ(VELCADE)、カルフィルゾミブ(PX-171-007)、マリゾミブ(NPI-0052)、イキサゾミブクエン酸塩(MLN-9708)、デランゾミブ(CEP-18770)、O-メチル-N-[(2-メチル-5-チアゾリル)カルボニル]-L-セリル-O-メチル-N-[(1S)-2-[(2R)-2-メチル-2-オキシラニル]-2-オキソ-1-(フェニルメチル)エチル]-L-セリナミド(ONX-0912);ダノプレビル(RG7227、CAS 850876-88-9)、イキサゾミブ(MLN2238、CAS 1072833-77-2)、および(S)-N-[(フェニルメトキシ)カルボニル]-L-ロイシル-N-(1-ホルミル-3-メチルブチル)-L-ロイシンアミド(MG-132、CAS 133407-82-6)(ただしこれらに限定されない)。
いくつかの実施態様では、薬剤(例えば治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子)は、チロシンキナーゼ阻害剤(例えば受容体チロシンキナーゼ(RTK)阻害剤)と組合わせて用いることができる、例示的なチロシンキナーゼ阻害剤には以下が含まれる:上皮増殖因子(EGF)経路阻害剤(例えば上皮増殖因子受容体(EGFR)阻害剤)、血管内皮増殖因子(VEGF)経路阻害剤(例えば血管内皮増殖因子受容体(VRGFR)阻害剤(例えば阻害剤、VEGFR-2阻害剤、VEGFR-3阻害剤))、血小板由来増殖因子(PDGF)経路阻害剤(例えば血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)阻害剤(例えばPDGFR-β阻害剤))、RAF-1阻害剤、KIT阻害剤およびRET阻害剤(ただしこれらに限定されない)。
さらに他の実施態様では、本発明の組成物は、ワクチン(例えば樹状細胞腎癌(DC-RCC)ワクチン)と併用して投与される。ある種の実施態様では、医薬組成物とDC-RCCワクチンとの組合せを用いて、癌、例えば本明細書に記載する癌(例えば腎癌、例えば転移腎細胞癌腫(RCC)または明細胞腎細胞癌腫(CCRCC))が治療される。
いくつかの実施態様では、本発明の組成物を化学療法と組合わせて用い、肺癌(例えば非小細胞肺癌)を治療する。いくつかの実施態様では、肺癌を治療するために、当該医薬組成物は白金ダブレット療法と一緒に用いられる。
さらに別の実施態様では、本明細書に開示する医薬組成物を用いて、腎癌、例えば腎細胞癌腫(RCC)(例えば明細胞腎細胞癌腫(CCRCC)または転移RCC)を治療することができる。抗PD-1またはPD-L1抗体分子は以下の1つ以上と併用して投与することができる:免疫系手法(例えばインターロイキン-2またはインターフェロン-γ)、標的誘導薬剤(例えばVEGF阻害剤、例えばVEGFに対するモノクローナル抗体;VEGFチロシンキナーゼ阻害剤(例えばスニチニブ、ソラフェニブ、アキシチニブおよびパゾパニブ);RNAi阻害剤;またはVEGFシグナリングの下流媒介因子の阻害剤、例えばラパマイシンの哺乳動物標的(mTOR)の阻害剤、例えばエベロリムスおよびテムシロリムス。
慢性リンパ球性白血病(CLL)の治療に本発明の組成物とともに用いられる適切な治療の例には以下が含まれる:化学療法剤(例えばフルダラビン、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、クロラムブシル、ベンダムスチン、クロラムブシル、ブスルファン、ゲムシタビン、メルファラン、ペントスタチン、ミトキサントロン、5-アザシチジン、ペメトレキセド二ナトリウム)、チロシンキナーゼ阻害剤、例えばEGFR阻害剤(例えばエルロチニブ)、BTK阻害剤(例えばPCI-32765)、マルチキナーゼ阻害剤(例えばMGCD265、RGB-286638)、CD-20標的薬剤(例えばリツキシマブ、オファツムマブ、RO5072759、LFB-R603)、CD52標的薬剤(例えばアレムツズマブ)、プレドニゾロン、ダルベポエチンアルファ、レナリドミド、Bcl-2阻害剤(例えばABT-263)、免疫療法(例えばアロジェニックCD4+メモリーTh1様T細胞/微粒子結合抗CD3/抗CD28、自家サイトカイン誘導キラー細胞(CIK))、HDAC阻害剤(例えばボリノスタット、バルプロ酸、LBH589、JNJ-26481585、AR-42)、XIAP阻害剤(例えばAEG35156)、CD-74標的薬剤(例えばミラツズマブ)、mTOR阻害剤(例えばエベロリムス)、AT-101、イムノトキシン(例えばCAT-8015、抗Tac(Fv)-PE38(LMB-2))、CD37標的薬剤(例えばTRU-016)、放射性免疫療法(例えば131-トシツモマブ)、ヒドロキシクロロキン、ペリフォシン、SRC阻害剤(例えばダサチニブ)、サリドマイド、PI3Kデルタ阻害剤(例えばCAL-101)、レチノイド(例えばフェンレチノイド)、MDM2アンタゴニスト(例えばRO5045337)、プレリキサホル、オーロラキナーゼ阻害剤(例えばMLN8237、TAK-901)、プロテアソーム阻害剤(例えばボルテゾミブ)、CD-19標的薬剤(例えばMEDI-551、MOR208)、MEK阻害剤(例えばABT-348)、JAK-2阻害剤(例えばINCB018424)、低酸素活性化プロドラッグ(例えばTH-302)、パクリタキセルまたはパクリタキセル系薬剤、HSP90阻害剤、AKT阻害剤(例えばMK2206)、HMG-CoA阻害剤(例えばシムバスタチン)、GNKG186、放射線療法、骨髄移植、幹細胞移植、および前記の組合せ(ただし前記に限定されない)。
前立腺癌の治療に本発明の組成物とともに用いられる適切な治療の例には以下が含まれる:化学療法剤(例えばドセタキセル、カルボプラチン、フルダラビン)、アビラテロン、ホルモン療法(例えばフルタミド、ビカルタミド、ニルタミド、シプロテロン酢酸塩、ケトコナゾール、アミノグルテチミド、アバレリクス、デガレリクス、リュプロリド、ゴセレリン、トリプトレリン、ブセレリン)、チロシンキナーゼ阻害剤(例えば二重キナーゼ阻害剤(例えばラパタニブ)、マルチキナーゼ阻害剤(例えばソラフィニブ))、VEGF阻害剤(例えばベバシズマブ)、TAK-700、癌ワクチン(例えばBPX-101、PEP223)、レナリドミド、TOK-001、IGF-1受容体阻害剤(例えばシクスツムマブ)、TRC105、オーロラAキナーゼ阻害剤(例えばMLN8237)、プロテアソーム阻害剤(例えばボルテゾミブ)、OGX-011、放射性免疫療法(例えばHuJ591-GS)、HDAC阻害剤(例えばバルプロ酸、SB939、LBH589)、ヒドロキシクロロキン、mTOR阻害剤(例えばエベロリムス)、ドビチニブ乳酸、ジインドリルメタン、エファビレンズ、OGX-427、ゲニステイン、IMC-3G3、バフェチニブ、CP-675,206、放射線療法もしくは外科手術、または前記の組合せ(ただしこれらに限定されない)。
放射線療法は、いくつかの方法の1つまたは複数の方法の1つの組合せを介して実施され得る。前記方法には、外部ビーム療法、内部放射線療法、インプラント放射線、定位放射線手術、全身性放射線療法、照射療法および永続的または一過性組織内小線源療法が含まれる。“小線源療法”という用語は、腫瘍または他の増殖組織の疾患部位の近くで体内に挿入される空間的に閉じ込められた放射性物質を介してデリバリーされる放射線療法を指す。前記用語は、放射性同位元素(例えばAt-211、I-131、I-125、Y-90、Re-186、Re-188、Sm-153、Bi-212、P-32、およびLuの放射性同位元素)(ただし前記に限定されない)への暴露を含むことが意図される。本開示の細胞コンディショナーとして使用される適切な放射線源には固体および液体の両方が含まれる。非限定的に例示すれば、放射線源は、放射性核種、例えば固体源としてI-125、I-131、Yb-169、Ir-192、固体源としてI-125、またはフォトン、ベータ粒子、ガンマ放射線、また他の治療線を放出する他の放射性核種であり得る。放射性物質はまた、放射性核種の任意の溶液で作製された液体(例えばI-125またはI-131の溶液)でもよい。或いは、放射性の液体は、固体の放射性核種(例えばAu-198、Y-90)の小粒子を含む適切な液体のスラリーを用いて生成することができる。さらにまた、放射性核種はゲルまたは放射性微小球として具体化され得る。
対象動物において癌を治療する方法はまた本発明によって要約される。前記方法は、上記および本明細書の他の場所で広範囲にに記載した薬剤(例えば治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子)の有効量を対象動物に投与する工程を含む。
本発明にしたがえば、RANKLに拮抗しかつ少なくとも1つのICMに拮抗する本発明の薬剤(例えば治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子)は、癌または腫瘍と診断された後で治療的に用いられ得るか、或いは、対象動物が癌または腫瘍を発達させる前に予防的に用いられ得る。本発明は、したがって以下の(a)−(d)で使用される、RANKLおよび少なくとも1つのICMに拮抗する治療薬組合せ、マルチ特異性抗原結合分子、および医薬組成物を提供する:(a)癌の治療、(b)癌の進行の遅延、(c)癌罹患患者の生存延長、または(d)癌に対する細胞媒介免疫応答の刺激。したがって、本発明はまた以下の(a)−(d)のための方法を提供する:(a)癌の治療、(b)癌の進行の遅延、(c)癌罹患患者の生存延長、または(d)癌に対する細胞媒介免疫応答の刺激。本発明の実施により適切に治療され得る癌には、メラノーマ、乳癌、結腸癌、卵巣癌、子宮内膜および子宮の癌、胃に関する(gastric)または胃の癌、膵臓癌、前立腺癌、唾液腺癌、肺癌、肝細胞癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、肝臓癌(liver cancer)、膀胱癌、ヘパトーマ、直腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛門癌腫、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆管の腫瘍、頭頸部癌、扁平上皮癌が含まれる。
本発明の更なる実施態様は対象動物の癌を治療するキットである。このキットは本明細書で開示する任意の医薬組成物を含む。
本発明のキットで使用するために、医薬組成物は、適切な治療薬組合せおよび/またはマルチ特異性抗原結合分子、および場合によって癌治療のための指示を含む。キットはまた、対象動物に医薬組成物を投与する際に使用するために、各医薬組成物および同封の他の試薬のための適切な貯蔵容器(例えばアンプル、バイアル、チューブなど)を含む。医薬組成物および他の試薬は、任意の都合の良い形態で(例えば医薬組成物の溶液または散剤で)存在し得る。キットはさらにまた包装容器を含むことができ、場合によって前記は、医薬組成物および他の随意の試薬を収納する1つ以上の仕切りを有する。
本発明を容易に理解し実行するために、個々の好ましい実施態様が、非限定的な以下の例によってこれから記述されるであろう。
実験的B16F10メラノーマ肺転移を有するマウスで、ハムスター抗CTLA4(UC10-4F10)および抗RANKL(IK22/5)MAbの組合せで治療された野生型(WT)マウスは、いずれかの抗体だけまたはコントロール免疫グロブリン(cIg)で治療されたマウスと比較して転移に対して優れた転移耐性を示した(図1A)。抗CTLA4および抗RANKL併用療法の作用メカニズムを、CD8+もしくはNK細胞を枯渇させた野生型マウスまたはパーフォリンもしくはIFNγ欠損マウスで決定した。図1Bに示すように、併用の有効性はNK細胞の存在を必要としたがCD8+ T細胞を必要とせず、さらにIFNγは重要でありパーフォリンの重要度はIFNγよりも低かった(図1C)。NK細胞に対する同様な依存性は、前記と同じ動物を抗CTLA4および抗RANKL併用療法で治療後に前立腺癌腫RM-1の実験的肺転移の効果的な制御で示された(図1D)。
抗CTLA4の免疫グロブリン定常領域が抗腫瘍活性に影響すると報告されたので(Selby et al., 2013, Cancer Immunol. Res., 1(1):32-42)、次に本発明者らは、実験的B16F10肺転移の抑制における抗RANKLとの相乗作用に種々の抗CTLA4抗体アイソタイプがどのように影響するかを評価した(図2)9D9は、多数のアイソタイプ(IgG1、IgG2aおよびIgG2bを含む)として生成された抗CTLAクローンであり、一方、別のアイソタイプ(IgG1-D265A)は、全てのFcγ受容体(FcγR)との結合を排除する変異を含んでいた(上掲書(Selby et al., 2013)。図2Aに示すように、抗CTLA4のIgG2aアイソタイプ(黒丸)単独は、抗CTLA4のハムスタークローン(黒逆三角形)と比較して肺転移のより強い抑制をもたらし、この抑制はどちらかの抗CTLA4クローンへの抗RANKLの添加によりさらに増加した。同様に、RM-1およびLWT1肺転移の有意な抑制がまた、マウスIgG2a抗CTLA4および抗RANKL併用療法で認められた(図2C)。
興味深いことに、他の3つの抗CTLA4アイソタイプ単独(IgG2b(黒ダイアモンド)、IgG1(黒四角)またはIgG1-D265A(黒六角形))は、抗CTLA4-IgG2aアイソタイプ(黒丸)と比較して肺転移抑制で有効ではなく、それらは、cIg治療グループ(黒三角)と比較して有意な肺転移抑制をもたらさなかった(図2B)。しかしながら、抗CTLA4のハムスター(白逆三角形)またはマウスIgG2b(白ダイアモンド)アイソタイプへの抗RANKLの添加は、cIg(黒三角形)と比較して有意な肺転移抑制をもたらした。それにもかかわらず、抗RANKLおよび抗CTLA4-IgG2aクローン(白丸)で治療されたグループは、抗RANKLと抗CTLA4-IgG2bとの併用よりも顕著に優れていた(図2B)。全体的に見れば、抗RANKL治療単独は有意には転移を抑制しなかったが、特定の抗CTLA4アイソタイプ(もっとも目覚ましくはIgG2aのそれ)と組合わせて用いられたとき転移制御を顕著に改善させた(図2A、B)。
次に、RANKLおよびCTLA4の二重封鎖の有効性を、皮下B16F10メラノーマ(概して免疫原性が低い)を有するマウスで評価した(図3)。肺転移モデルと同様に、併用療法は単一療法と比較してより強い増殖抑制を再び示したが、抗CTLA4ハムスタータイプとの併用効果は有意ではなかった。
肺転移モデルと同様に、併用療法は再び抗体アイソタイプに依存し、ハムスターアイソタイプ(図3)ではなくて抗CTLA4-IgG2aアイソタイプのときに有意な増殖抑制が観察された(図4)。7つのそれぞれ別個のプール実験の縦断的分析を実施し、抗CTLA4-IgG2aまたは抗CTLA4(IgG1-D265A)および/または抗RANKLのFcR非嵌合クローンをコントロールIgと比較した(図4C)。全体的に見れば、データは、抗CTLA4-IgG2aと抗RANKLの組合せは、単一療法またはcIgと比較して腫瘍増殖を有意に抑制することを示した(図4C)。対照的に、抗CTLA4-IgG1-D265Aおよび抗RANKLの組合せはcIg治療グループより優れていたが、単一療法としてのどちらの治療にも劣っていた(図4C)。同様に、抗CTLA4-IgG2aアイソタイプを含む併用療法で治療されたマウスの終了時点における腫瘍質量もまた、対応する単一療法治療グループと比較して有意に減少した。しかしながらこの利点は、抗CTLA4-IgG1-D265Aアイソタイプを含む併用療法で理療されたグループでは、抗CTLA4-IgG1-D265A単独で治療されたマウスと比較して観察されなかった(図4B)。
次に、B16F10腫瘍のミクロ環境(TME)におけるRANKLおよびRRANKの発現を明確にした(図5)。腫瘍内RANKLの大半はT細胞の小部分によって発現され、発現はより早い時点(9日目)で高く、脾臓よりも腫瘍で高く、CD4+ T細胞と比較してより多くのCD8+ T細胞が腫瘍内でRANKLを発現した(図5A)。全体的に見れば、腫瘍浸潤白血球(TIL)の約20%がRANKを発現し(ただしその幅は極めて広い)、CD11bの染色より90%多く(データは示していない)、腫瘍内RANKは腫瘍浸潤骨髄性細胞によってほぼ独占的に発現されることを示唆している。腫瘍浸潤マクロファージ(TAM)の約40%、MDSCの60%、およびDCの低いが変動し得る割合(5−20%)がRANKを発現した(図4B)。抗RANKLによる治療は、これらの細胞タイプにおける骨髄性RANK発現を有意には変化させなかった(図5B)。最近、Ly6ClowMHCIIhigh腫瘍内マクロファージは、炎症性M1サブタイプと一致するRNA発現プロフィールを有することがB16メラノーマモデルで報告され、一方、MHCIIlow/negative発現を有するものは、免疫抑制M2表限型を有すると考えられた(De Henau et al., 2016, Nature, 539(7629):443-7)。特に、本発明者らのB16F10モデルでは、RANKを発現するLy6C/Ly6G (GR-1)low TAMのより大きな割合が、RANKを発現しないものと比較して陰性または低いMHCII発現を有し、RANK発現TAM集団は、RANKを発現しないTAMよりも強い抑制性を有する可能性があることを示唆する(データは示していない)。しかしながら、抗RANKL治療は、B16F10またはRM-1皮下腫瘍で、CD11b+骨髄性TILの割合、CD206(M2マーカー)発現TAMの割合を変化させなかった(データは示していない)。RANKL発現またはRANK発現細胞の1%未満がCD45.2陰性であり(どちらのin vivo腫瘍内発現レベルも無視できることを示す)、加えてこの試験で用いられた全ての腫瘍株はフローサイトメトリーで評価したとき、RANKLまたはRANK発現について陰性であった(データは示していない)。
次に、本発明者らは、皮下B16F10腫瘍モデルにおけるエフェクターリンパ球の存在および機能と同様に、抗RANKLと抗CTLA4-IgG2aとの併用の有効性のFc受容体に対する依存を評価した(図6)。抗CTLA4-IgG2aの公知の作用メカニズムと一致して、B16F10に対する抗RANKLとのその併用活性は、FcγRIVまたはFcEγRを欠くマウスでは停止したが、FcγRIIIでは停止しなかった(図6A)。抗CTLA4 MAbはFcγRIV依存性であるが、RANKLの封鎖が同様な要求を有するか否かは明確ではなかった。次に、抗CTLA4-mIgG2aおよび抗RANKLによるB16F10腫瘍増殖の制御におけるCD8+ T細胞およびNK細胞の役割を、各サブセットの選択的枯渇によって評価した(図6B)。CD8+ T細胞を枯渇させたとき、併用療法の抗腫瘍有効性はほぼ完全に停止した。対照的に、NK細胞枯渇は影響がなく、この併用療法のCD8+ T細胞に対する依存を示した(図6B)。転移環境で観察された結果と同様に、この併用療法はIFNγ依存性であったが、パーフォリン依存性ではなかった。(図6C)。この併用療法における、クロスプレゼンテーション機能を有するCD8α+の通常のDCに対する本質的役割はまた、転写因子Batf3に欠損を有するマウスを使用することによっ明示示された。併用療法の有効性はWT治療マウスと比較してこれらのマウスで停止した(図6D)。
併用療法のメカニズムおよびCD8+ T細胞の役割の更なる理解のために、抗CTLA4(IgG2a)および抗RANKLの最適な併用療法で治療した皮下B16F10腫瘍でTILの組成を評価した(図7)。終了時点の腫瘍で評価したとき、CD45+ TILの割合は、cIgまたは単一療法治療グループと比較して併用療法で有意に増加した(図7A)。対照的に、この増加は、抗CTLA4-IgG1-D265Aアイソタイプを含む併用療法で治療したマウスでは観察されなかった(データは示していない)。併用療法治療グループにおけるCD45+ TILにおける増加は、CD8+ T細胞の目覚ましい増加(割合(図7B)および絶対数(図7C)の両方)によってほとんど説明された。繰り返せば、これらの変化は、9D9-IgG1-D265Aアイソタイプを含む併用療法では見られなかった(データは示していない)。
Treg(CD4+Foxp3+)の割合(腫瘍中のCD4+ T細胞のパーセンテージとして)は、抗CTLA4-IgG2a単一療法で減少した(このアイソタイプの作用の報告メカニズムと一致する(Selby et al., 2013, Cancer Immunol. Res., 1(1):32-42))が、しかしながら、抗RANKL抗体の添加によりさらにまた減少した。加えて、CD11b+細胞でのFcγ-IV発現は、腫瘍で併用療法を用いてもさらに増加することはなく(データは示していない)、TMEにおけるTreg枯渇の増強はこの併用の作用メカニズムを説明できないことを示唆する。脾臓では、Tregの割合または数に有意な変化は治療グループ間で検出されなかった(データは示していない)。全体的に見れば、本発明者らには、これらのモデルにおける併用療法の作用メカニズムはより効率的なTregの枯渇によるものとは思われない。
抗RANKLの別の潜在的な作用メカニズムはT細胞増殖の増強であり得よう。しかしながら、本発明者らは、抗CTLA4単一療法と比較して、併用治療群でのKi-67発現CD8+ T細胞の更なる増加を全く観察しなかった(図7E)。このことは、併用治療後の腫瘍で観察される追加のCD8+ T細胞は選択的なCD8+ T細胞補充の結果の可能性を示唆している。したがって、併用療法によるCD8+ T細胞の流入は、抑制性免疫細胞(例えばTregまたは骨髄性細胞)の増加の欠如と相俟って、抗腫瘍活性に有利となるようにTMEを変化させることができる。実際、CD8+ 対Treg比の有意な増加が、早い時点(9日目)で測定したときに認められた(図7F)。加えて、MDSCに対するCD8+ T細胞の比は、併用療法で有意に増加した(図7H)。重要なことに、観察されたこれらの変化は腫瘍に特異的であった。なぜならば、白血球サブセットの割合における有意な変化は、これら腫瘍を有するマウスの脾臓では観察されなかったからである(データは示していない)。
本発明者らはまた、この併用免疫療法が、実験終了点(16日目)のB16F10腫瘍でCD8 およびCD4+ T細胞のTh1サイトカイン産生(IFNγ、TNF、IL-2)に対してどのような影響を有するかを評価した(図8)。TNFαは刺激後ex vivoでもっとも一般的に産生されるサイトカインであったが、有意な相違は、cIgまたは単一療法と比較して、併用療法後のCD8+ T細胞によるIFNγ(図8A)およびIL-2(データは示していない)の産生で認められた。さらにまた、IFNγおよびIL-2(図8B)またはIFNγ、IL-2およびTNFα(図8C)を共同発現するCD8+ T細胞もまた併用療法で増加した。同様な発見がCD4+ T細胞で、特にIFNγを産生した割合で観察された(図8D)。cIg治療グループのCD8+ T細胞の大半は刺激後にサイトカインを産生せず、一方、併用療法は最大の多機能性を有するT細胞を産生し、単一療法グループは中間の表現型を示した(図8E)。サイトカイン多機能性に対する併用療法の効果は腫瘍特異的であった。なぜならばこれらの相違は、腫瘍を有するマウスの脾臓T細胞では観察されなかったからである(データは示していない)。
細胞培養
マウスメラノーマ細胞株B16F10(ATCC)およびLWT1並びに前立腺癌腫細胞株RM-1は、以前の記載にしたがって維持、注射およびモニターした(Ferrari de Andrade et al., 2014, Cancer Res, 74:7298-7308)。線維肉腫細胞株MCA1956(MCA接種C57BL/6野生型マウスに由来)は、Robert Schreiber(Washington University School of Medicine, St Louis, MO, USA)から寄贈された。前立腺癌細胞株Tramp-C1は記載にしたがって(Dalezis et al., 2012, In Vivo, 26:75-86)維持したが、ただしデヒドロイソアンドロステロンは用いなかった。全ての細胞株はマイコプラズマ陰性について日常的に検査したが、細胞株信頼性は日常的には実施しなかった。
マウス
C57BL/6野生型(WT)マウスは所内交配されるか、または業者(Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research)から購入した。C57BL/6パーフォリン欠損(pfp-/-)、インターフェロン欠損(IFNγ-/-)、Fc受容体欠損(FcγRIII、FcγRIVおよびFcεγR)、Batf3転写因子欠損(Batf3-/-)(以下に記載:Hildner et al., 2008, Science, 322:1097-1100)およびFoxP3-DTR(以下に記載:Teng et al., 2010, Cancer Res, 70:7800-7809)マウスは、QIMRB(QIMR Berghofer Medical Research Institute)で所内交配された。全マウスを6から16週齢で用いた。5から13匹のマウスのグループを実験的腫瘍転移アッセイおよび皮下(s.c.)腫瘍増殖に用いた。全ての実験がQIMRB動物倫理委員会で承認された。
抗体
精製抗マウス抗RANKL(IK22/5; rat IgG2a(Kamijo S. et al., 2006, Biochem Biophys Resh Commun, 347:124-132))、抗CTLA4(UC10-4F10、ハムスターIgG)、およびコントロール抗体(ハムスターIg、1-1またはIgG2a、2A3)は所内で作製するかまたは業者(BioXcell(West Lebanon, NH))から購入した。抗CTLA4クローン9D9(表示の多様なアイソタイプ)およびコントロール抗体1D12(マウスIgG2a)は業者(Bristol-Myers Squibb(San Francisco, CA))から供給された。NK細胞を枯渇させるための抗体(抗asialoGM1(Wako))または抗CD8β(53.5.8(BioXcell))は表示のように投与された。
皮下腫瘍モデル
B16F10(1x105)、RM-1(5x104)、MCA1956(1x106)またはTRAMP-C1(1x106)の腫瘍形成のために、雌(B16F10, MCA1956)または雄(RM-1, TRAMP-C1)マウスの脇腹の皮下に細胞を接種した。治療抗体の処置は表示のように腫瘍接種後3−12日目に開始し2−4日毎に最大4用量まで投与した。腫瘍はデジタルカリパーを用いて二次元で測定し、腫瘍サイズを平均±SEMとして提示する。
実験的肺転移モデル
B16F10、RM-1またはLWT1の単一細胞懸濁物を表示のマウス株の尾静脈に静脈内注射した。14日目に肺を採集し、解剖顕微鏡下で表面の腫瘍結節をカウントした。腫瘍接種に対し-1日目、0日目および2日目に、表示の抗体治療を抗CTLA4および/または抗RANKL MAbを用いて実施した。CD8+ T細胞またはNK細胞を枯渇させる抗体は、腫瘍接種に対し-1日目、0日目および7日目に表示のように投与した。
腫瘍を有するマウスを2つの時点(9日目または終了点(腫瘍が倫理的終点サイズに達したために実験を終了させる時点))で犠牲にした。腫瘍、流入領域リンパ節(鼠径部)および脾臓を収集し、湿潤重量を記録した。以前に記載されたように(上掲書(Teng et al., 2010))、表示の器官から単一細胞懸濁物を作成した。
以下の抗体(Biolegend、eBioscience、BD)を用いた:CD4-BV605(RM4-5)、CD8-BV711(53-6.7)、CD11b-BV650(M1/70)、CD11b-PE(M1/70)、CD11c-PE(N418)、精製CD16.2(9E9)その後にヤギ抗ハムスターFITC、CD206-AF647およびCD206-PECy7(C068C2)、およびZombie Aqua生存/死染料;TCRβ-PerCP-Cy5.5(H57-597)、CD45.2-A780(104)、Ly6C/Ly6G(GR-1)-EF450(RB6-8C5)、MHCII-APC(M5/114.15.2)、CD265 (RANK)-PE (R12-31);RANKL-AF647(IK22/5)。細胞内サイトカイン染色(ICS)のためには、細胞を4時間細胞刺激カクテル(1/1000)(eBioscience)で刺激した。続いて、Cytofix/Cytoperm(BD)による固定/透過処理の前に、上記に記載したように細胞を表面染色し、さらにIFNγ-AF488(Biolegend)、TNFα-PE(BD)、およびIL-2-パシフィックブルー(Biolegend)で染色した。
細胞内転写因子染色のためには、固定する前に、上記に記載したように細胞を表面染色し、さらにFoxp3/転写因子染色緩衝液セット(eBioscience)を用い製造業者のプロトコルにしたがって透過処理し、FoxP3-EF450またはFoxP3-AF488(FJK-16s)およびKi67-EF450(Sol185)(eBioscience)で染色した。全ての免疫細胞分析は最初に生存単一CD45.2+でゲート分類した。T細胞はTCRβ+NK1.1-と規定された。NK細胞はTCRβ-NK1+と規定された。DCはCD11c+MHCIIhigh細胞と規定された。腫瘍関連マクロファージ(TAM)はCD11b+F4/80+ non-DC細胞と規定された。MDSCはCD11b+, Ly6C/Ly6G (GR-1)hi, non-TAM, non-DC細胞と規定された。サンプルの絶対カウントを決定するために、サンプルをフローサイトメトリーにかける直前に、流体カウントビーズ(BD Biosciences)を添加した。全てのデータをフォルテッサ(Fortessa)4(BD)フローサイトメーターで収集し、FlowJo v10ソフトウェア(Tree Star, Inc.)を用いて分析した。
統計分析
グラフパッドプリズム(GraphPad Prism)ソフトウェアを統計分析に用いた。カラム分析のためには、ブラウン-フォーサイス検定を用いて等分散を評価した。有意でない場合、ダンの多重比較による一元配置分散分析を用いた。グループ間で不等分散の場合には、シダックまたはダネットの多重比較によるクルスカル-ウォリス分析を適切なように用いた。縦断的腫瘍増殖分析のためには、実験内マウスのみについて治療グループランダム効果モデルを用いた。P値が0.05未満である場合、データは統計的に有意であるとみなした。
抗RANKLと抗PD-1(図9A−B)または抗RANKLと抗PD-L1(図9C−D)の併用は、メラノーマ(B16F10)または前立腺癌(RM1)の肺転移モデルで転移に対する優れた耐性をもたらす。
実験的転移モデルのこれらの結果を広げるために、次に、皮下腫瘍を有するマウスでRANKLおよびPD-1の二重封鎖の有効性を評価した。PD-1感受性細胞株MC38およびPD-1中間応答細胞株CT26(ともに結腸癌モデル)で、抗RANKLの添加は抗PD-1有効性を増強した(図10A−B)。樹立がより進んだ腫瘍に対してより遅い時点で当該療法が開始されたときに、CT26に対する組合せの有効性は維持された(データは示していない)。
いくつかの免疫調整抗体の有効性には、抗体依存細胞傷害性による抗原発現細胞の枯渇(Dahan et al., 2015, Cancer Cell, 28(3):285-295)、或いは標的抗原のアゴニスト活性の枯渇(Dahan et al., 2016, Cancer Cell, 29(6):820-831)が算入されている。これらプロセスはともに腫瘍ミクロ環境内でのFc受容体の嵌合を必要とする。加えて、ある種の抗体(例えば抗CD137、抗PD-L1)は、CD103+ Batf3-依存樹状細胞の存在を要求する(Sanchez-Paulete et al., 2016, Cancer Discov. 6(1):71-9)。したがって、抗RANKLの作用メカニズムの理解のために、Fc受容体またBatF3依存樹状細胞に対する抗RANKL有効性の依存を遺伝子標的マウスで試験した。C57Bl/6または遺伝子標的マウスのグループにMCA1956線維肉腫細胞(1x106)を皮下注射した。腫瘍接種に対して3、7、11および15日目に、抗RANKL(IK22/5、200μg i.p.)またはcIg(1-1, 200μg i.p.)でマウスを処理した。抗RANKL MAb IK22/5は、MCA1956皮下腫瘍で単一療法として有効性を示した(図11)。抗RANKLの抗腫瘍有効性はFcεRγを欠くマウスで温存された。このことは、RANKLのその受容体、RANKに対する封鎖により生じ、RANKL発現細胞の枯渇を介して機能するものではない抗RANKLの作用メカニズムと一致する。対照的に、抗RANKL IK22/5の抗腫瘍有効性はBatF3を欠くマウスで停止し、CD103+ DC媒介クロスプレゼンテーションに関する本質的な役割を示唆した。これらのデータは、RANK発現骨髄性細胞(例えば樹状細胞、MDSCまたはマクロファージ)とRANKL発現細胞(例えばリンパ球、リンパ節細胞または他の間質成分)との間の免疫抑制性または免疫寛容原性機軸を腫瘍ミクロ環境において抗RANKLが破壊する作用メカニズムと一致する。
上記に記載したMCA1956腫瘍における抗RANKLのメカニズムに関するデータが与えられたことを考慮すると、腫瘍ミクロ環境内のRANKLの潜在的役割は、RANKL受容体(RANK)を発現し得るBatF3依存樹状細胞における作用を介するものである。2つの免疫抑制経路を封鎖する二重特異性抗体の場合、同じ細胞タイプ上の複数の標的抗原の共同発現は、機能性が標的細胞そのものとなるので有利となろう。単一細胞タイプ上での複数標的抗原の共同発現もまた、腫瘍ミクロ環境内での二重特異性様式のより細胞特異的または組織特異的作用、およびより強い細胞選択性によるより低い周辺毒性を危険なものとして排斥し得る。また別に或いは付け加えて、2つの別個の細胞でトランス態様で発現される2つの免疫抑制経路を封鎖する二重特異性抗体もまた有益である。なぜなら、2つの別個の免疫抑制メカニズムを同時に阻害できるからである。
要約すれば、抗RANKL IK22/5 MAbの抗腫瘍有効性はBatF3を欠くマウスで停止し、このことはCD103+樹状細胞(DC)媒介クロスプレゼンテーションに関する本質的役割を示唆する。これらのデータは、RANK発現骨髄性細胞(例えば樹状細胞またはマクロファージ)とRANKL発現細胞(例えばリンパ球、リンパ節細胞または他の間質成分)との間の免疫抑制性または免疫寛容原性機軸を腫瘍ミクロ環境で抗RANKLが破壊する作用メカニズムと一致する。腫瘍由来のCD11c+/MHCII+ DCのフローサイトメトリー分析は、RANK陽性DCの100%がまたPD-L1およびCD103を発現することを示した。同様な分析は、RANK陽性腫瘍浸潤マクロファージにおけるCD206発現の有意な豊富さを示した。2つの免疫抑制経路を封鎖する二重特異性抗体の場合、同じ細胞タイプ上の標的抗原共同発現は、機能性が標的細胞固有であるので有利となろう。単一細胞タイプ上での標的抗原の共同発現はまた、腫瘍ミクロ環境内での二重特異性様式のより細胞特異的または組織特異的作用およびより強い細胞選択性のためにより低い周辺毒性を排斥することができる。また別に或いは付け加えれば、2つの別個の細胞でin trans発現される2つの免疫抑制経路を封鎖する二重特異性抗体もまた有益である。なぜなら、2つの別個の免疫抑制メカニズムを同時に阻害できるからである。
総合すれば、これらの観察は、腫瘍内のRANK陽性DCにおけるPD-L1発現の顕著な豊富さを示し、cis状態のこれら2つの抗原の二重特異性標的誘導のための更なる理論的根拠を提供する。PD-L1を標的とする様式は腫瘍におけるチェックポイント阻害剤として確実に実証され、抗RANK二重特異性の合理的なパートナーを提供する。加えて、RANKに付随するCD103およびCD206の高度な共同発現は、RANKを標的とする二重特異性様式のための追加の抗原パートナーを提唱する。
二重特異性単鎖ジアボディを以下および図13Aに示すように構築する。具体的には、抗RANKL抗体(例えばデノスマブ)の可変重鎖を、抗PD-1抗体の可変軽鎖に5アミノ酸リンカーを介して連結し、前記を続いて抗PD-1抗体の可変重鎖に15アミノ酸リンカーを介して連結し、前記を抗RANKL抗体の可変軽鎖に別の5アミノ酸リンカーを介して連結する。
二重特異性単鎖ジアボディの例示的構築物では、RANKL抗体の可変重鎖(以下のアミノ酸配列を有するデノスマブVH:EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS(配列番号:3))が、第一のリンカー(SG4)を介して抗PD-1抗体の可変軽鎖(以下のアミノ酸配列を有するニボルマブVL:EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK(配列番号:91))に連結され、前記は、続いて第二のリンカー((SG4)3)を介して、抗PD-1抗体の可変重鎖(以下の配列を有するニボルマブVH:QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS(配列番号:88))に連結され、その後第三のリンカー(SG4)を介して、抗RANKL抗体の可変軽鎖(以下のアミノ酸配列を有するデノスマブVL:EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRGRYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK(配列番号:4))に連結される。
二重特異性抗体をコードするDNAを発現ベクター(例えばpSecTag2/HygroA(Invitrogen))でクローニングする。続いて、得られた二重特異性抗体コードプラスミドを標準的プロトコルを用いて増幅、抽出および精製する。
発現プラスミドをヒト腎細胞株293Tに、LipfectAMINE-plus(Invitrogen)を用いて一過性にトランスフェクトし培養する。上清を0.22μmのPVDFフィルターで滅菌し、40%のPEG20,000溶液を用いて濃縮する。HiTrapキレーティHPカラム(GE Healthcare)を用いて前記濃縮上清を精製する。
図13Bに示すように、二重特異性トリボディの生成のために1対のプラスミドが要求される。具体的には、ヒトκ軽鎖の定常領域に融合した抗PD-1抗体の可変軽鎖を含む単鎖ポリペプチドをコードする第一の構築物が調製され、前記は抗RANKL抗体の可変重鎖にアミノ酸リンカーを介して連結される。精製を容易にするために、タグ(例えばhisタグ(His6))を単鎖ポリペプチドのC-末端に付加することができる。ヒトIgG2の定常領域1に融合した抗PD-1抗体の可変重鎖を含む単鎖ポリペプチドをコードする第二の構築物もまた調製され、前記は抗RANKL抗体の可変重鎖に第一のアミノ酸リンカーを介して連結され、前記は次に、抗RANKL抗体の可変軽鎖に第二のアミノ酸リンカーを介して連結される。精製を容易にするために、タグ(例えばhisタグ(His6))がまた当該単鎖ポリペプチドのC-末端に付加され得る。
2つの構築物を2つの別々の発現ベクターでクローニングする。前記は典型的にはプラスミド、例えばpCAGGSの形態であり得る(De Sutter et al., 1992, Gene 113, 223-230)。得られた二重特異性トリボディをコードするプラスミド対(pCAGGS-FabL-scFv-His6およびpCAGGS-FabFd-scFv-His6)を続いて増幅、抽出および精製する。
また別のプラスミド対が図13Cに示される。この実施態様では、ヒトκ軽鎖の定常領域に融合した抗RANKL抗体の可変軽鎖を含む単鎖ポリペプチドをコードする第一の構築物が調製され、前記は抗PD-1抗体の可変重鎖にアミノ酸リンカーを介して連結される。精製を容易にするために、タグ(例えばhisタグ(His6))がまた当該単鎖ポリペプチドのC-末端に付加され得る。ヒトIgG2の定常領域1に融合した抗RANKL抗体の可変重鎖を含む単鎖ポリペプチドをコードする第二の構築物が調製され、前記は抗PD-1抗体の可変重鎖に第一のアミノ酸リンカーを介して連結され、前記は次に、抗PD-1抗体の可変軽鎖に第二のアミノ酸リンカーを介して連結される。このタイプの例示的トリボディは図14に示される。
RANKLおよびRANKリガンド-受容体対はヒトおよびマウスタンパク質間で交差反応性を有し、等しい結合活性および機能活性が検出される(Bossen et al., 2006, J Biol Chem., 281(20):13964-71)。抗原およびアッセイ調製物のために市場で入手できるRANKLおよびRANKの多様な組換え型が存在する。RANKLおよび抗RANK抗体はともに、RANKのCRD2およびCRD3または完全長RANK(すなわちCRD1、2、3、4を含む)と選択的に結合するであろう。
TNFスーパーファミリーリガンド/受容体相互作用はELISAによって評価でき(例えば以下を参照されたい:Schneider et al., 2014, Methods Enzymol., 545:103-25; Kostenuik et al., 2009, J. Bone Miner Res., 24(2):182-95)、RANKLまたはRANKアンタゴニストのための単純明快なスクリーニングを提供する。RANKLおよびRANK阻害剤の生物学的活性は、以前に記載されたように、ネズミRAW264.7マクロファージ(破骨細胞の前駆細胞として機能する)の培養での破骨細胞形成(および条件付け培地でのTRAP5bの生成)を用いてELISAでモニターすることができる(Kostenuik et al., 2009(上掲書);Xu et al., 2000, J. Bone Miner Res., 15(11):2178-86)。
抗RANK抗体の交差反応性はTNFスーパーファミリーの他の関連メンバーに対してスクリーニングすることができる。フローサイトメトリーまたはELISAによるスクリーニングをこれに関して用いることができる。
RANKLまたはRANKアンタゴニストに対するアンタゴニスト活性の決定では、RANK受容体においてアゴニスト活性もまた有し得るいずれのRANKLまたはRANKアンタゴニストも排除することが好ましい。抗RANK抗体のアゴニスト活性のin vitroスクリーニングは、例えば以下の研究者によって記載されたように(Schneider et al., 2014(上掲書);およびChypre et al., 2016, Immunol. Lett., 171:5-14)、RANK-Fas Jurkatアッセイで二価または一価抗体型を用いて実施することができる。関連するTNFRメンバー、EDARに対する抗体の分析は、アゴニスト活性との相関性は抗体の親和性ではなくいったん結合したものをゆっくりと切り離すそれらの能力(小さなkoff)であることを示した(Kowalczyk-Quintas et al., 2011, J. Biol. Chem., 286(35):30769-79)。同様に、TNFRメンバー、FASに対する抗体の分析は、受容体親和性と(アゴニスト)潜在能力との間の逆の相関性を示した(Chodorge et al., 2012, Cell Death Differ., 19(7):1187-95)。注目すべきことには、ファージスクリーンは、他のTNFRメンバー(例えばTRAILR)に対してアゴニスト活性を有するscFvを識別した(Dobson et al., 2009, MAbs, 1(6):552-62)。
抗RANKまたは抗RANKL抗体(RANKLアンタゴニスト)のin vivo活性は、二価または一価抗体型を用いて調べて、破骨細胞アンタゴニスト機能をマウス試験で調べることができる。抗RANKまたは抗RANKL抗体でチャレンジしたマウスの骨密度の分析(x-線またはDEXAによる)もまた実施できる。また別には、ヒトRANKLの皮下注射でチャレンジした正常マウスの高カルシウム血症に対する抗RANKまたは抗RANKL抗体の影響を、血中イオン化カルシウムまたは血清TRAP5bを毎日4日間モニターすることによって評価することができる。抗RANKまたは抗RANKL抗体(RANKLアンタゴニスト)はまた、腫瘍応答について(陽性コントロール抗RANKL MAbについて本明細書の図9に示すように)MCA1956腫瘍モデルで試験することができよう。RANKL刺激(例えばRANKLの組換え型)および阻害(例えば組換えOPG-Fc)のための陽性コントロールはin vitroおよびin vivo試験のために容易に入手できる(Lacey et al., 2012, Nat Rev Drug Discov., 11(5):401-19)。
以前の発表で、RANK発現乳癌のマウスモデルの転移促進におけるRANK発現Tregの役割(Tan et al., Nature 470 (2011), 548-553)、またはUV誘発皮膚炎症の抑制における皮膚RANKL-RANK相互作用を介する全身性Treg制御の役割(Loser et al., Nat. Med 12(2006), 1372-1379)が報告された。免疫療法の抗RANKL併用有効性におけるあらゆるTregの本質的役割をさらに評価するために、FoxP3-DTRマウスモデルを用いた。これらのマウスでは、ジフテリア毒素受容体(DTR)がfoxp3遺伝子座の制御下で発現され、ジフテリア毒素(DT)の投与を介してTregの条件性およびほぼ完全な枯渇を可能にし、抗腫瘍免疫増強がもたらされる(Teng et al., 2010(上掲書))。より強いB16F10メラノーマ皮下腫瘍増殖抑制の傾向が観察され(図15A−C)、DTと併用して抗RANKL(IK22.5)が投与されたときにDT単独と比較してより大きな割合のマウスが治癒した(図15A−C)。加えて、DTおよび抗RANKLで治療されたFoxP3-DTRマウスで、皮下RM-1前立腺癌の増殖抑制増強の同様な傾向もまた観察された(図15D)。終末点におけるRM-1腫瘍のFACS分析は、DT単独によるほぼ完全なTreg枯渇を示し、抗RANKLがDTと併用されたときにTregの更なる枯渇は認められなかった(図15E)。総合すれば、これらのモデルにおける併用療法の作用メカニズムは、より効果的なTreg枯渇が原因であるとは思われず、ほぼ完全な腫瘍内Treg枯渇の環境で抗RANKL mAbの有効性は損なわれない。実際、抗RANKLとDT誘発Treg枯渇との併用で追加される有効性は、DT単独と比較してFoxP3-DTRマウスで観察され、この場合、両DT含有アームは、終末点のcIgと比較して95%を超えるTreg枯渇を示し、したがって、抗RANKLの作用メカニズムはTregに関して直接的ではないことを示している。
前臨床の結果は、抗RANKL封鎖が、抗CTLA4またはPD-1/PD-L1封鎖の抗腫瘍有効性を高めることを示したが、これは別個のメカニズムを介して生じるという証拠が存在し、前記は、報告されたCTLA4対PD-1封鎖の非オーバーラップ作用メカニズムと一致する。例えば、マウスのCT26腫瘍から単離されたT細胞で、ほとんど全てのCD8+RANKL+ T細胞TIL(>90%)がPD-1を共同発現し、対照的にCD8+RANKL-T細胞TILの40%未満がPD-1陽性であった(図16A)。さらにまた、PD-1のMFIは、CD8+ RANKL-T細胞と比較してCD8+RANKL+で少なくとも3倍高く、前者はPD-1hi細胞と識別された(図16B)。発現分析では、CTLA4発現は、RANKL+ CD8+ T細胞でそのRANKL-対応細胞と比較して有意に高いことが示された(図16C)。RANKL-発現細胞が一般的により増殖性で別の免疫チェックポイント(CTLA4)を低発現することを考慮すれば、PD-1共発現の豊富さにもかかわらず、CT26モデルにおけるRANKL+ CD8+ T細胞TILの特徴は疲弊表現型ではなく活性化表現型により一致する。
PD-1およびCTLA4の組合せ免疫チェックポイント封鎖(ICB)がある種の臨床環境(例えば進行メラノーマ)で新興の標準治療であるので、抗RANKLの付加が、抗CTLA4および抗PD-1/抗PD-L1併用療法の抗腫瘍有効性をさらに改善できるか否かを評価した(図17)。まず初めに樹立されたCT26腫瘍を有するWTマウスの抑制において、低用量抗PD-1(100μg)を用いる組合せで抗RANKLを評価した(図17A)。抗PD-1への抗RANKLの付加は腫瘍増殖を有意に抑制したが、三重併用療法は、いずれの二重併用療法と比較してもCT26腫瘍マウスの腫瘍増殖を有意に抑制し、重要なことに、抗CTLAプラス抗PD-1組合せへの抗RANKLの付加は腫瘍拒絶率を改善した(図17A)。次に、抗RANKLと併用された抗PD-1の抗CTLA4存在下または非存在下におけるCT26皮下腫瘍増殖抑制有効性を評価した(図17B)。抗PD-1単独と比較して、前記は(抗RANKLおよび抗PD-1単一療法と同様に)最少有効性を有し、抗PD-1および抗RANKLの組合せが腫瘍増殖を有意に抑制した(図17B)。加えて、抗PD-1および抗RANKLの抗CTLA4との三重併用が、CT26皮下増殖の抑制に最も有効で、この三重併用を特に二重ICB(抗PD-L1および抗CTLA4)と比較したとき、小さいが有意な相違が明白であった(図17B)。最後に、三重併用療法(抗PD-1+抗CTLA4+抗RANKL)の腫瘍増殖制御能力を自発性TRAMPトランスジェニックマウス(皮下Tramp-C1前立腺癌腫を有する)でも評価した。内因性腫瘍特異的T細胞が免疫寛容化され得る環境設定で、三重併用療法は、皮下腫瘍増殖の制御で再びもっとも有効であり、選択した二重療法およびcIgと比較して16匹のマウスうち15匹がそれらの腫瘍を完全に拒絶した(図17C)。三重併用療法で観察された腫瘍制御の増加は、抗CTLA4プラス抗PD-1二重併用療法と比較してIFNγおよびTFNαの共同発現に反映されるように、腫瘍浸潤CD8+およびCD4+ T細胞のTh1型サイトカイン多機能性の有意な増加と相関関係があった。TILエフェクター機能におけるこの増加は腫瘍でのみ観察され、三重併用療法で治療されたマウスの脾臓では観察されなかった。
CT26モデルで抗RANKLが免疫チェックポイント封鎖(ICB)療法を改善するメカニズムを調べるために、RANKLを発現するCD8+ T細胞の割合を評価した(図18A)。cIg処置マウスで、約5%がRANKLを発現したが、これは抗PD-1単一療法後に10%以上増加した。さらにまた、RANKL発現は、gp70反応性CD8+ T細胞TILのサブセットの間で増え(cIg処置マウスでほぼ15%)、抗PD-1単一療法、抗CTLA4単一療法またはcIgと比較して、二重ICBを受けた腫瘍で有意に増加した(図18B)。CD8+ T細胞TILと比較して、より小さな割合のCD4+ T細胞TILがRANKLを発現するが、抗PD-1は同様にRANKL発現を増加させた(図18C)。RANKL発現の主要な腫瘍内供給源のアップレギュレーションを介して、抗PD-1の投与はおそらくTMEをプライミングしてRANKL封鎖に応答し(図18A−C)、一方、抗CTLA4単一療法は、CD4+またはCD8+ T細胞TILでRANKLレベルを有意には変化させなかった。抗PD-1単独(または抗PD-1+抗CTLA4併用)はそれ自体RANKL発現を腫瘍浸潤T細胞によって増加させ、一方、RANKL増加は抗CTLA4単独後にTILで観察されないという観察は、抗RANKL+抗PD-1/PD-L1併用を介して達成される抗腫瘍効能は、抗RANKL+抗CTLA4併用と比較して別個のメカニズムを介して生じることを提唱する。この実験で抗CTLA4治療単独もまたRANKL発現レベルを変化させなかった理由は不明である。1つの説明は、RANKLは一般的に、T細胞活性化後初期に(特に免疫寛容環境下で)アップレギュレートされるという観察に基づく(Hochweller et al., 2005. Eur J Immunol 35:1086-96)。
総合すれば、これらのデータは、抗RANKLが抗PD-1/PD-L1有効性を増強するメカニズムは、抗RANKL封鎖による抗CTLA4有効性の増強とは別個であることを提唱する。第一に、これらのデータは、抗PD-1および抗CTLA4の抗腫瘍有効性はRANKL封鎖によってさらに改善され得ること、およびこの三重併用療法の抗腫瘍有効性はいずれの二重併用よりも優れていること示した。第二に、抗RANKLと異なる併用療法との固有メカニズムによる相互作用は、RANKL阻害時のTMEの変化によって説明できるかもしれない(前記メカニズムはある種の併用療法と固有に交差調整するであろう)。抗CTLA4による治療はT細胞TILでのRANKLレベルを変化させなかった。したがって、通常、RANKLの低発現を示す腫瘍(例えばメラノーマ)では、交差調整仮説は、抗PD-1投与はTMEにおいてRANKLのアップレギュレーションをもたらし、したがってRANKシグナリングの増加を生じ、同時発生的かまたはその後に続くRANKL封鎖への応答に対して腫瘍をプライミグし得ることを予測する。閾レベルを超えるT細胞TILによるPD-1発現は抗PD-1抗体に対する耐性をもたらし、このレベル以下に発現を低下させる手法(例えばまた別の免疫療法との併用)は治療利益をもたらすことが、以前に前臨床モデルで示された(Selby et al., 2013. Cancer Immunol Res 1:32-42;Ngiow et al., 2015(上掲書))。記載したこのCT26の分析では、二重抗RANKLおよび抗PD-1治療の治療感受性は、腫瘍ミクロ環境における有利な変化(T細胞によるPD-1発現の低下およびPD-L1発現の低下の両方を含む)と密接に関係していた。腫瘍ミクロ環境におけるこれらの変化は、抗CTLA4 mAb単独による治療時には観察されず、CTLA-4およびPD-1は、非オーバーラップ作用メカニズムを調節することを示唆し、同時発生的抗RANKLとの併用療法は、別個の阻害性経路および別個のメカニズムを介して生じることを提唱する。
二重免疫チェックポイント封鎖(ICB)療法(抗PD-1および抗CTLA4治療の併用)に対する抗RANKL抗体の最適な順序を評価した。結腸癌腫CT26の皮下増殖抑制で、同時発生的抗体療法(腫瘍接種後8、12、16、20日目に抗体治療)を逐次療法(8、12、または16、20日目に等しい抗体総用量)と比較した。有意に優れた増殖抑制が、二重ICB療法と同時発生的か、または前記療法の後で抗RANKL MAbを投与したときに達成された(図20)。同時発生的抗RANKL単一療法と比較して、二重ICB療法後の逐次抗RANKLは腫瘍増殖を有意に抑制した。しかしながら、この順序は同時発生的な二重ICB単独療法よりも有効性は低かった(図20)。
マウス3LL肺腺癌モデルで抗RANKLおよび抗PD-1併用の抗腫瘍効能もまた試験し、mAbの最適な順序を調べた。同時発生的なmAb療法の腫瘍増殖抑制活性を逐次療法として与えられるmAbの等しい総用量と比較した。前臨床データは、抗RANKLおよび抗PD-1 mAb併用は、療法が同時発生的に与えられるかまたは逐次的に与えられるかにかかわらず、単一療法またはコントロールIgと有効性において優れていた(図21)。抗RANKL治療前の逐次抗PD-1療法は、抗PD-1療法前の抗RANKL治療と比較して有意に大きな腫瘍体積減少をもたらした(p<0.01)(図21)。抗PD-1が後に続く逐次抗RANKLは有意に腫瘍増殖を抑制したが、しかしながらこの順序は抗RANKLおよび抗PD-1の同時発生的な治療よりも有効性は低かった。
総合すれば、これらのデータは、前臨床モデルで観察される抗腫瘍効能は、順序に関係なくRANKL封鎖および抗PD-1抗体の併用時に(各抗体単独と比較して)増強されることを示す。しかしながら、データは、二重ICB(抗PD-1および抗CTLA4)または抗PD-1単独が後に続く逐次抗RANKLは、同時発生的な治療よりも有効性が有意に低いことを確かに示した。したがって、これらのデータは、抗RANKL療法の実施は、抗PD-1/PD-L1または抗CTLA4(または両方)との併用治療と同時発生的か(またはその後で)生じるべきであることを提唱する。さらにまた、抗PD-1/PD-L1または抗CTLA4(または両方)との併用で、抗RANKLによる同時発生的な治療は、その後に連続する抗RANKLによる治療よりも優れた抗腫瘍応答を達成することを示すデータは、マルチ特異性(例えば二特異異性)抗体(前記は同時にRANKLおよびPD-1、PD-L1および/またはCTLA4を封鎖するであろう)の潜在的な活性を支持する。
2つの免疫抑制経路を封鎖する二重特異性抗体の場合、同じ細胞タイプ上での複数の標的抗原の共働発現は、機能が標的細胞そのものとなるために有利であろう。単一細胞タイプ上の複数の標的抗原の共同発現もまた、腫瘍ミクロ環境内の二重特異性様式のより細胞特異的または組織特異的作用、および腫瘍内のより強い細胞選択性によるより低い周辺毒性を危険なものとして排斥し得る。また別に或いは付け加えて、2つの別個の細胞でトランス態様で発現される2つの免疫抑制経路を封鎖する二重特異性抗体もまた有益である。なぜなら、2つの別個の免疫抑制メカニズムを同時に阻害できるからである。
したがって、TMEにおけるRANKおよびPD-1のマルチ特異性標的誘導のための理論的根拠として、腫瘍浸潤免疫細胞上でのこれらの因子の共同発現は斟酌されるべきである。CT26腫瘍モデルにおける抗PD-1併用抗RANKLの抗腫瘍有効性およびメカニズムに関するデータは既に述べ、上記に記載したように、T細胞TIL上でのRANKLおよびPD-1の共同発現はこのモデルで特徴づけた。例えば、マウスのCT26腫瘍から単離したT細胞では、ほとんど全てのCD8+RANKL+ T細胞TIL(>90%)がPD-1を共同発現し、比較して、CD8+RANKL- T細胞TILの40%未満がPD-1陽性であった(図16)。さらにまた、PD-1のMFIは、CD8+RANKL- T細胞と比較してCD8+RANKL+で3倍高く、前者をPD1hi細胞として識別した(図16)。一例として、腫瘍浸潤CD8+RANKL+ T細胞の98.5%がPD-1を発現し、一方、CD8+RANKL- T細胞の44%がPD-1を発現し(図22)、TILにおける非常に高レベルのRANKL/PD-1共同発現を提示した。
RANKLおよび少なくとも1つのICMと拮抗するマルチ特異性抗体の一例は、2つの抗体(その1つはRANKLと結合し(mAb A)、その1つはPD-1と結合する(mAb B))から構築されるマルチ特異性FIT-Ig抗体として構築することができる。例示すれば、第一の抗原結合分子はヒトRANKLの領域と特異的に結合でき、第二の抗原結合分子はヒトPD-1の領域に(好ましくはヒトPD-1の細胞外ドメインの領域に)特異的に結合できる。本発明で使用される適切な1つのそのような抗RANKL mAbはデノスマブである。したがって、いくつかの実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、完全にヒトのIgG2 mAbデノスマブ、またはその抗原結合フラグメントを含む。同じ実施態様のいくつかおよび他の実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、本明細書の表1に示すCDR配列を含む。マルチ特異性FIT-Ig抗体の具体的な例では、第二の抗原結合分子は、ニボルマブ、ペムブロリズマブおよびピジリズマブから選択されるmAbの任意の1つの少なくとも1つの抗原結合フラグメントを含むことができる。本発明で使用される適切な1つの抗PD-1 mAbはニボルマブである。
RANKLおよびPD-1の両方と結合しそれらと拮抗する三価マルチ特異性FIT-Ig分子を構築するために、デノスマブの軽鎖(VL-CL)ドメインをニボルマブの重鎖(VH-CH1-CH2-CH3)とそのNH2-末端でタンデムに直接融合させる。第二の構築物はデノスマブのVH-CH1であり、第三の構築物はニボルマブのVL-CLである。抗RANKL/PD-1 FIT-Ig分子の模式図は図23Aに示され、抗RANKL/PD-1 FIT-IgのDNA構築設計は図23Bに示される。3つのDNA構築物の全てを哺乳動物発現ベクターでサブクローニングし、タンパク質の産生は、3つのDNA構築物の全ての哺乳動物発現ベクターへ(HEK-293)の一過性トランスフェクション時に達成することができる。RANKL/PD-1 FIT-Ig分子の精製はタンパク質A精製によって達成することができる。
ここで、抗RANKL抗体(デノスマブ)軽鎖(US 7,364,736 B2)可変領域(VL)の成熟アミノ酸は列は大文字で示され、定常領域(CL)は小文字で示され、抗PD-1抗体(ニボルマブ、WO2006/121 168)重鎖(VH-CH1-CH2-CH3)は太字の大文字で示される。
RANKL/PD-1 FIT-Ig構築物#2:V H -C H1 (デノスマブ)のアミノ酸配列(218aa):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEOTAVYYCAKDPGTTVIMSWFOPWGQGTLVTVSSastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktv(配列番号:277)、
ここで、抗RANKL抗体(デノスマブ)重鎖(US 7,364,736 B2)可変領域(VH)の成熟アミノ酸配列は大文字で示され、定常領域(CH1)は小文字で示される。
RANKL/PD-1 FIT-Ig構築物#3:V L -C L (ニボルマブ)のアミノ酸配列(214aa):
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(配列番号:278)、
ここで、抗PD-1抗体軽鎖(ニボルマブ、WO2006/121 168)可変領域(VL)の成熟アミノ酸配列は大文字で示され、定常領域(CL)は小文字で示される。
RANKLおよび少なくとも1つのICMと拮抗するマルチ特異性抗体の1つの例は、2つの抗体(その1つはRANKLと結合し(mAb A)、その1つはCTLA4と結合する(mAb B))から構築されるマルチ特異性FIT-Ig抗体として構築することができる。例示すれば、第一の抗原結合分子はヒトRANKLの領域と特異的に結合でき、第二の抗原結合分子はヒトCTLA4の領域に(好ましくはヒトCTLA4の細胞外ドメインの領域に)特異的に結合できる。本発明で使用される適切な1つのそのような抗RANKL mAbはデノスマブである。したがって、いくつかの実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、完全にヒトのIgG2 mAbデノスマブ、またはその抗原結合フラグメントを含む。同じ実施態様のいくつかおよび他の実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、本明細書の表1に示すCDR配列を含む。マルチ特異性FIT-Ig抗体の具体的な例では、第二の抗原結合分子は、イピリムマブおよびトレメリムマブから選択されるmAbの任意の1つの少なくとも1つの抗原結合フラグメントを含む。本発明で使用される適切な1つのそのような抗CTLA4 mAbはイピリムマブである。
RANKLおよびCTLA4の両方と結合しそれらと拮抗する三価マルチ特異性FIT-Ig分子を構築するために、デノスマブの軽鎖(VL-CL)ドメインをイピリムマブの重鎖(VH-CH1-CH2-CH3)とそのNH2-末端でタンデムに直接融合させる。第二の構築物はデノスマブのVH-CH1であり、第三の構築物はイピリムマブのVL-CLである。抗RANKL/CTLA4 FIT-Ig分子の模式図は図24Aに示され、抗RANKL/CTLA4 FIT-IgのDNA構築設計は図24Bに示される。3つのDNA構築物の全てを哺乳動物発現ベクターでサブクローニングし、タンパク質の産生は、3つのDNA構築物の全ての哺乳動物発現ベクターへ(HEK-293)の一過性トランスフェクション時に達成することができる。RANKL/CTLA4 FIT-Ig分子の精製はタンパク質A精製によって達成することができる。
RANKL/CTLA4 FIT-Ig構築物#1:VL(デノスマブ)-C L (デノスマブ)-V H -C H1 -C H2 -C H3 (イピリムマブ)のアミノ酸配列(663aa):
ここで、抗RANKL抗体(デノスマブ)軽鎖(US 7,364,736 B2)可変領域(VL)の成熟アミノ酸は列は大文字で示され、定常領域(CL)は小文字で示され、抗CTLA4抗体(イピリムマブ、US20150283234)重鎖(VH-CH1-CH2-CH3)は太字の大文字で示される。
RANKL/CTLA4 FIT-Ig構築物#2:V H -C H1 (デノスマブ)のアミノ酸配列(214aa):
本配列は、上記のRANKL/PD-1 FIT-Ig構築物#2のために用いられたVH-CH1デノスマブ構築物(配列番号:277)と同じものである。
RANKL/CTLA4 FIT-Ig構築物#3:V L -C L (イピリムマブ)のアミノ酸配列(215aa):
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(配列番号:280)、
ここで、抗CTLA4抗体軽鎖(イピリムマブ、US20150283234)可変領域(VL)の成熟アミノ酸配列は大文字で示され、定常領域(CL)は小文字で示される。
RANKLおよび少なくとも1つのICMと拮抗するマルチ特異性抗体の1つの例は、2つの抗体(その1つはRANKLと結合し(mAb A)、その1つはPD-L1と結合する(mAb B))から構築されるマルチ特異性FIT-Ig抗体として構築することができる。例示すれば、第一の抗原結合分子はヒトRANKLの領域と特異的に結合でき、第二の抗原結合分子はヒトPD-L1の領域に(好ましくはヒトPD-L1の細胞外ドメインの領域に)特異的に結合できる。本発明で使用される適切な1つのそのような抗RANKL mAbはデノスマブである。したがって、いくつかの実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、完全にヒトのIgG2 mAbデノスマブ、またはその抗原結合フラグメントを含む。同じ実施態様のいくつかおよび他の実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、本明細書の表1に示すCDR配列を含む。マルチ特異性FIT-Ig抗体の具体的な例では、第二の抗原結合分子は、デュルバルマブ(MED14736)、アテゾリズマブ(Tecentriq)、アベルマブ、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480およびMPDL3280Aから選択されるmAbの任意の1つの少なくとも1つの抗原結合フラグメント、またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明で使用される適切な1つのそのような抗PD-L1 mAbはアテゾリズマブである。
RANKLおよびPD-L1の両方と結合しそれらと拮抗する三価マルチ特異性FIT-Ig分子を構築するために、デノスマブの軽鎖(VL-CL)ドメインをアテゾリズの重鎖(VH-CH1-CH2-CH3)とそのNH2-末端でタンデムに直接融合させる。第二の構築物はデノスマブのVH-CH1であり、第三の構築物はアテゾリズのVL-CLである。抗RANKL/PD-L1 FIT-Ig分子の模式図は図25Aに示され、抗RANKL/PD-L1 FIT-Ig分子のDNA構築設計は図25Bに示される。3つのDNA構築物の全てを哺乳動物発現ベクターでサブクローニングし、タンパク質の産生は、3つのDNA構築物の全ての哺乳動物発現ベクターへのHEK-293での一過性トランスフェクション時に達成することができる。RANKL/PD-L1 FIT-Ig分子の精製はタンパク質A精製によって達成することができる。
RANKL/PD-L1 FIT-Ig構築物#1:VL(デノスマブ)-C L (デノスマブ)-V H -C H1 -C H2 -C H3 (アテゾリズマブ)のアミノ酸配列(663aa):
ここで、抗RANKL抗体(デノスマブ)軽鎖(US 7,364,736 B2)可変領域(VL)の成熟アミノ酸は列は大文字で示され、定常領域(CL)は小文字で示され、抗PD-L1抗体(アテゾリズマブ、米国特許8,217148号)重鎖(VH-CH1-CH2-CH3)は太字の大文字で示される。
RANKL/PD-L1 FIT-Ig構築物#2:V H -C H1 (デノスマブ)のアミノ酸配列:
本配列は、上記のRANKL/PD-1 FIT-Ig構築物#2のために用いられるVH-CH1デノスマブ構築物(配列番号:277)と同じものである。
RANKL/PD-L1 FIT-Ig構築物#3:V L -C L (アテゾリズマブ)のアミノ酸配列(214aa):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(配列番号:282)、
ここで、抗PD-L1抗体(アテゾリズマブ、米国特許8,217148号)軽鎖可変領域(VL)の成熟アミノ酸配列は大文字で示され、定常領域(CL)は小文字で示される。
マウスRANKLおよびマウスPD-1の両方に結合するヘテロダイマー(二重特異性)抗体を、Fabコード配列をヒトIgG1骨格に融合させることによって作製した。ヘテロダイマー二重特異性IgG抗体の組立ては、IgG重鎖へ相補性KIH変異をまず初めに導入することによって達成された。所望の軽鎖/重鎖対の結合は、“CrossMab”アプローチ(例えば以下を参照されたい:Schaefer et al., 2011. Proc Natl Acad Sci U S A 108: 11187-11192)によって促進された(前記アプローチでは、二重特異性抗体の1つのFab(Fab領域)の改変は、軽鎖と重鎖間の定常領域または定常および可変領域の“交換”である)。D265A変異もまたヒトIgG1 Fcドメインに導入し、Fc受容体との結合を低下させさらにエフェクター機能を低下させた。これらの技術を用いて、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体(RMP1-14 CH-CL X IK22/5 WT二重特異性とも呼ばれる)を構築し、標準的技術によって生成および精製した。さらにまた、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体は両方の標的と結合でき、in vitroおよびin vivoでRANKLおよびPD-1に対してアンタゴニスト活性を有する。
mAb cDNA配列は、抗RANKL IK22-5(Kamijo et al., 2006. Biochem Biophys Res Commun. 347(1):124-32)および抗PD-1 RMP1-14(Curran et al., 2010. Proc Natl Acad Sci U S A 107(9):4275-80)をコードするラットハイブリドーマから得られた。全RNAは、市販試薬(TRIzol(商標)試薬(Ambion, Cat. No. : 15596-026))の技術マニュアルにしたがって当該ハイブリドーマ細胞から単離した。続いて、全RNAをcDNAに逆転写した。アイソタイプ特異的アンチセンスプライマーまたはユニバーサルプライマーを市販のcDNA合成キット(PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara, Cat. No. 6110A))の技術マニュアルにしたがって用いた。VHおよびVLの抗体フラグメントを、cDNA末端迅速増幅(RACE)の標準的操作手順にしたがって標準的技術により増幅した。増幅抗体フラグメントを別々に標準的クローニングベクターでクローニングし、さらにDNA配列決定を実施した。抗RANKL mAb IK22-5並びに抗PD-1 mAb RMP1-14の可変ドメインおよびリーダー配列のアミノ酸配列が提供される(下記参照)。免疫グロブリン可変領域の配列分析並びにフレームワーク(FR)およびCDRの決定は、NCBIヌクレオチドBLAST、IMGT/V QuestプログラムおよびNCBI IgBLASTアルゴリズムを用いて達成された。
重鎖IK22-5:アミノ酸配列(135aa)
重鎖RMP1-14:アミノ酸配列(138aa)
二重特異性抗RANKL/PD-1抗体のCrossMab型を作製するために、RMP1-14(抗PD-1抗体)配列を操作し、CH1およびCL配列が交換された“CrossMabCH1-CL”とした(RMP1-14 CH-CL-huIgG1Fcと称される)。抗RANKL抗体(IK22-5)のFab領域は無変化であった(IK22-5-huIgG1Fc WTと称される)。ポリペプチド鎖のヘテロダイマー化は、大きなアミノ酸(ノブ)を所望のヘテロダイマーの一方の鎖に導入し、小さなアミノ酸(ホール)を所望のヘテロダイマーの他方の鎖に導入することによって促進された(“ノブインホール”(KiH)構造と呼ばれる)(例えば以下を参照されたい:Ridgeway et al., Protein Eng. 9(1996), 617-621;およびAtwell et al., J. Mol. Biol. 270(1997), 677-681)。具体的には、“ノブ”変異(T366W)がIK22-5-huIgG1Fc WTのCH3ドメインに導入され、3つのホール変異(T366S、L368A、およびY407V)がRMP1-14 CH-CL-huIgG1Fcの重鎖に導入された。加えて、2つのCys残基が導入され(S354Cが“ノブ”(knob)側に、Y349Cが“ホール”(hole)側に)、安定的なジスルフィド結合を形成し、さらにヘテロダイマー化を増強した。さらにまた、D265A変異もまた、IK22-5-huIgG1Fc WTおよびRMP1-14 CH-CL-huIgG1Fcの両方のヒトIgG1 Fcドメインに導入された。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の模式図は図26に示される。
IK22-5-huIgG1Fc WT重鎖(465aa):
分子量、収量および純度の決定のために、続いて精製タンパク質を標準的プロトコルを用いSDS-PAGE、ウェスタンブロットおよびHPLCによって分析した。非還元状態のSDS-PAGEおよびウェスタンブロットに基づいて、〜80kDa、〜100kDa、および150kDa(計算M.W.は145kDa)の概算分子量の標的タンパク質が検出された(図27に示される)。提示したSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析から、〜55kDaおよび〜25kDaの概算分子量を有する抗体重鎖および軽鎖が検出された。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の純度は85.86%(SEC-HPLCで概算)であり、濃度は3.69mg/mLであった(A280で測定(透過係数:1,494))。
二重特異性抗RANKL/PD-1抗体は、懸濁ExpiCHO-S細胞培養での発現後に、追加のin vitro実証およびin vivo試験のための標準的タンパク質A親和性クロマトグラフィーにより高純度で得られた。
HEK-293上のmuRANKLと結合する二重特異性抗RANKL/PD-1抗体(IK22-5/RMP1-14)
二重特異性抗RANKL/PD-1抗体が細胞上で発現されるRANKLと結合する能力を特徴付けるために、フローサイトメトリー分析を実施した。muRANKLをコードするcDNAで一過性にトランスフェクトされたHEK-293細胞で測定したシグナル強度を、トランスフェクトされなかったHEK-293細胞で得られたシグナル強度と比較することによって、相互作用の特異性を決定した。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体は非トランスフェクトHEK-293細胞を認識できなかったが、muRANKL発現細胞には結合した(図28)。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体とmuRANKLとの結合は、陽性コントロール、muRANK-Fcで観察されたものと非常に類似していた(図28)。したがって、RANKL/PD-1抗体は、細胞表面で発現されたmuRANKLの細胞外ドメインを高親和性で認識した。
リガンド結合を封鎖する二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の能力を、組換えmuRANKL-Fc(RANKLの高親和性受容体)との競合アッセイで試験した。HEK-293細胞をmuRANKLで一過性にトランスフェクトし、アイソタイプコントロール抗体(ラットIgG2aおよびhuIgG1)、陽性コントロール抗muRANKL抗体(IK22-5ラットIgG2a)および二重特異性抗RANKL/PD-1の存在下でRANK-Fcの結合を試験した。抗RANKL/PD-1二重特異性抗体は、RANK-FcのmuRANKL結合を、陽性コントロール抗RANKL抗体IK22-5と同様に完全に封鎖することができた(図29)。抗RANKL/PD-1二重特異性抗体はアンタゴニスト活性を示し、抗RANKL mAb IK22-5で観察されたIC50(1.1μg/mL)に対して2.6μg/mLのIC50でRANK-FcのmuRANKL結合を封鎖した。ラットIgG2aもヒトIgG1アイソタイプコントロールもRANK-FcのRANKL結合を封鎖しなかった。
細胞上で発現されるPD-1と結合する二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の能力を特徴付けるために、フローサイトメトリー分析を実施した。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体は、muPD-1トランスフェクトHEK-293細胞と特異的に結合したが、非トランスフェクトHEK-293細胞とは結合しなかった(図30)。したがって、RANKL/PD-1抗体は、細胞表面で発現されるmuPD-1の細胞外ドメインを高い親和性で特異的に認識した。
リガンド結合を封鎖する二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の能力を、組換えmuPD-L1-Fc(PD-1の高親和性リガンド)との競合アッセイで試験した。HEK-293細胞をmuPD-1で一過性にトランスフェクトし、アイソタイプコントロール抗体(ラットIgG2aおよびhuIgG1)、陽性コントロール抗muPD-1抗体(RMP1-14ラットIgG2a)および二重特異性抗RANKL/PD-1の存在下でPD-L1-Fcの結合を試験した。抗RANKL/PD-1二重特異性抗体は、PD-L1-FcのmuPD-1結合を陽性コントロール抗PD-1抗体RMP1-14と同様に封鎖することができた(図31)。抗RANKL/PD-1二重特異性抗体は、コントロール抗PD-1 mAb RMP1-14で観察されたものと比較してPD-L1-FcのPD-1結合の封鎖でアンタゴニスト活性を示した。ラットIgG2aもヒトIgG1アイソタイプコントロールもPD-L1-FcのPD-1結合を封鎖しなかった。
細胞ベース機能アッセイにおける二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の機能阻害効果を評価するために、in vitro破骨細胞形成におけるこの抗体の効果を試験した。in vitro TRAP+破骨細胞アッセイの方法は本質的に文献に記載された通りであった(Simonet et al., 1997. Cell 89(2): 309-19)。正常BL/6マウスの骨髄(BM)細胞を96ウェル平底プレートに25000細胞/ウェルの密度で、ヒト組換えCSF-1(Preprotech)(50ng/mL)補充完全DMEM(10%FCS+PS+Glu)(総体積200μL/ウェル)に播種した。48時間培養後、培地をヒト組換えCSF-1(50ng/mL)および可溶性muRANKL(Miltenyi)(200ng/mL)を補充した完全DMEMに置き換えた。細胞をCSF-1およびRANKLとともに(抗体阻害剤存在下および非存在下で)4日間培養し、続いて、TRAP+の多核(3核を超える)破骨細胞をカウントした。破骨細胞形成は、以前に記載された(Simonet et al., 1997(上掲書))TRAP細胞化学染色によって評価した。陽性コントロール抗体IK22-5の効果と同様に、抗RANKL/PD-1二重特異性抗体の添加は用量依存態様でTRAP+多核細胞の形成を阻害したが、コントロールヒトIgGの添加は阻害しなかった(図32)。100ng/mLの濃度では、抗RANKL mAb IK22-5および二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の両方が、破骨細胞形成を完全に封鎖した。これらの結果は、抗RANKL/PD-1二重特異性抗体は、RANKLおよびin vitro破骨細胞分化に対するアンタゴニスト活性を維持することを示した。
二重特異性抗RANKL/PD-1抗体によるRANKLおよびPD-1の共同標的化は実験的肺転移の抑制において抗RANKLまたは抗PD-1単一療法よりも優れている
転移を制御する二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の効果を試験するために、実験的B16F10メラノーマ肺転移を有する野生型(WT)マウスを用いた。マウスを-1、0および2日目に(腫瘍接種に対応)以下で処置した:cIg(200μg i.p.、組換えMac4-ヒトIgG1 D265A)、抗RANKL(100μg i.p.、組換えIK22.5-ヒトIgG1 D265A)、抗PD-1(100μg i.p.、組換えRMP1-14-ヒトIgG1 D265A)、抗RANKL+抗PD-1(各々100μg i.p.)、および表示の用量力価の抗RANKL/PD-1二重特異性抗体(50から200μg i.p.、ヒトIgG1 D265A)。抗RANKLまたは抗PD-1単独は、コントロール免疫グロブリン(cIg)処置グループと比較して控えめな有効性を示し、一方、2抗体(抗RANKLおよび抗PD-1)による併用治療または二重特異性抗RANKL/PD-1抗体による治療は転移制御を有意に改善した(図33)。
二重特異性抗体による治療は、どちらかの抗体単独または抗PD-1抗体および抗RANKL抗体の併用よりも強いin vivo肺転移阻害効果を有すると期待される。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体は肺転移量で用量依存減少を示し、100および200μg用量グループは、抗PD-1単独と比較して優れた肺転移減少をもたらした(それぞれ*p<0.05、***p<0.001)。抗PD-1抗体および抗RANKL抗体の併用治療と比較して(各抗体は100μgで投与され、すなわち合計抗体は200μg)、等しい抗体用量(200μgの二重特異性抗RANKL/PD-1)での二重特異性抗RANKL/PD-1抗体による治療は、転移制御で少なくとも等しい改善を達成した(図33)。
二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の同様な効果が、実験的PM1前立腺癌肺転移を有するWTマウスで観察された(図34)。-1、0および2日目に(腫瘍接種に対応)に、cIg(200μg i.p.、ヒトIgG1 D265A)、抗RANKL(100μg i.p.、IK22.5ヒトIgG1 D265A)、抗PD-1(100μg i.p.、ヒトIgG1 D265A)、抗RANKL+抗PD-1(それぞれ100μg i.p.)、表示したとおりの抗RANKL-PD-1二重特異性抗体(100または200μg i.p.、ヒトIgG1 D265A)でマウスを処置した。抗RANKLまたは抗PD-1単独は、コントロール免疫グロブリン(cIg)処置グループと比較して控えめな有効性を示し、一方、2抗体(抗RANKLおよび抗PD-1)による併用治療または二重特異性抗RANKL/PD-1抗体による治療は転移制御を有意に改善した(図34)。
二重特異性抗体による治療は、どちらかの抗体単独または抗PD-1抗体および抗RANKL抗体併用よりも強いin vivo肺転移阻害効果を有すると期待される。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体は肺転移量で用量依存減少を示し、200μg用量グループは、抗PD-1単独と比較して優れた肺転移減少をもたらした(*****p<0.0001)。抗PD-1抗体および抗RANKL抗体の併用治療と比較して(各抗体は100μgで投与され、すなわち合計抗体は200μg)、等しい全体的抗体用量(200μgの二重特異性抗RANKL/PD-1)での二重特異性抗RANKL/PD-1抗体による治療は、転移制御で等価の改善を達成した(図34)。これらの結果は、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体は、等しい用量で治療された抗PD-1および抗RANKL MAb併用グループと比較して等価の転移制御を達成することを提示し、二重特異性抗RANKL/PD-1は優れた有効性を有することを示す。
皮下腫瘍の増殖における抗RANKL/PD-1二重特異性抗体の活性を試験するために、マウス3LL肺腺癌腫モデルを利用した。マウスを8、12、16および20日目に(腫瘍接種に対応)以下で処置した:cIg(400μg i.p.、ラットIgG2a)、抗RANKL(100μg i.p.、IK22-5ラットIgG2a)、抗PD-1(100μg i.p.、RMP1-14ラットIgG2a)、抗RANKL+抗PD-1(100μg i.p.、それぞれIK22-5およびRMP1-14)、および表示の用量力価の抗RANKL/PD-1二重特異性(100から400μg i.p.、ヒトIgG1 D265A)。抗RANKL mAb IK22-5単独の治療は3LL皮下腫瘍増殖に全く効果はなく、一方、抗PD-1単独は、コントロール免疫グロブリン(cIg)処置グループと比較して控えめな有効性を提示した。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の全ての用量が、cIgまたはコントロール抗RANKL処置単独と比較して、3LLの皮下腫瘍増殖を軽減する活性を明確に有した。抗RANKL/PD-1抗体の200μg用量の抗腫瘍効果は、2抗体(抗RANKLおよび抗PD-1、各々100μg)による併用治療の等価の総用量(200μg)で観察されたものと同様であった。これらのデータは、皮下腫瘍モデルにおける二重特異性抗RANKL/PD-1抗体のin vivo有効性を確認した。
二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の有効性を、皮下CT26結腸腫瘍を有するマウスで抗RANKLおよび抗PD-1抗体による併用治療と比較した(図36)。CT26腫瘍を有するマウスでは、抗RANKLまたは抗PD-1(100μg)のどちらも単一療法として最小限の効果を有したが、併用療法(抗RANKLプラス抗PD-1、各々100μg)が用いられたとき、樹立腫瘍の増殖抑制が観察された(図2A)。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の100μgおよび200μg用量は、cIg、抗PD-1治療単独、またはコントロール抗RANKL治療単独と比較して、CT26の皮下腫瘍増殖を明確に軽減した。抗PD-1単一療法に対する応答の欠如は、この腫瘍がこの免疫療法および単一薬剤による治療に対していくらかの耐性を提示することを示し、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体はこの耐性を克服する。二重特異性抗体による治療はCT26腫瘍制御でin vivo阻害効果を有することが期待され、前記阻害効果は、単独抗体または抗PD-1抗体および抗RANKL抗体の併用よりも強い。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の200μg用量の抗腫瘍効果は、2抗体(抗RANKLおよび抗PD-1、各々100μg)による併用治療の等価の総用量(200μg)で観察されたものと同様であった(図36)。これらのデータは、皮下腫瘍モデルにおける二重特異性抗RANKL/PD-1抗体のin vivo有効性を確認した。
本明細書に提示した結果は、抗PD-1/PD-L1および抗CTLA4療法の併用、抗PD-1/PD-L1単一療法、または抗CTLA4単一療法の抗腫瘍有効性は、RANKL封鎖を加えることによってさらに改善され得ることを示す。さらにまた、この三重併用療法(抗RANKLプラス抗PD-1プラス抗CTLA4)の抗腫瘍有効性はいずれの二重併用よりも優れていた。これらのデータは、抗RANKLが抗PD-1/PD-L1有効性を増強するメカニズムは、抗RANKL封鎖による抗CTLA4有効性増強のメカニズムとは別個であることを提唱する。
抗RANKL/PD-1二重特異性抗体が(単一薬剤治療として)、抗CTLA4 mAbの抗腫瘍有効性を増強し得るか否かを調べるために、皮下CT26結腸腫瘍を有するマウスで、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の有効性を(単独または抗CTLA4と併用して)以下と比較した:抗CTLA4治療単独、抗CTLA4プラス抗PD-1の併用治療、または抗RANKLプラス抗PD-1プラス抗CTLA4(三重治療療法)。このモデルでは、抗CTLA4による治療は、腫瘍増殖で控えめな減少をもたらし、前記減少は抗PD-1の添加に際して(抗CTLA4プラス抗PD-1組合せで)改善された(図37)。抗CTLA4プラス抗PD-1組合せへの抗RANKL mAbの添加(三重治療療法)は腫瘍制御をさらに改善した。抗RANKL/PD-1二重特異性抗体の抗CTLA4 mAbへの添加は、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体または抗CTLA4治療単独のどちらで観察されたものよりも強い程度で腫瘍増殖を確かに減少させ、三重療法(抗RANKLプラス抗PD-1プラス抗CTLA4)と比較して腫瘍制御を改善した(図37)。これらのデータは、抗CTLA4の皮下抗腫瘍有効性を増強する抗RANKL/PD-1(単一薬剤治療として)の能力を示す。
AT3OVA乳房腫瘍を有するマウスで、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体を抗RANKLおよび抗PD-1抗体による併用治療と比較した(図38)。AT3OVA腫瘍を有するマウスで、抗RANKLまたは抗PD-1(100μg)は単一療法として最小限の効果を有したが、併用療法(抗RANKLプラス抗PD-1、各々100μg)が用いられたときは樹立腫瘍の抑制が観察された(図38)。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の100μgおよび200μg用量は、cIg、抗PD-1治療単独またはコントロール抗RANKL治療単独と比較して、AT3OVAの皮下腫瘍増殖を明確に減少させた。抗PD-1単一療法に対する応答の欠如は、この腫瘍がこの免疫療法および単一薬剤による治療に対していくらかの耐性を提示することを示し、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体はこの耐性を克服する。二重特異性抗体による治療はAT3OVA腫瘍制御でin vivo阻害効果を有することが期待され、前記阻害効果は、単独抗体または抗PD-1抗体および抗RANKL抗体の併用よりも強い。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の200μg用量の抗腫瘍効果は、2抗体(抗RANKLおよび抗PD-1、各々100μg)による併用治療の等価の総用量(200μg)で観察されたものと同様であった(図38)。これらのデータは、皮下乳房腫瘍モデルにおける二重特異性抗RANKL/PD-1抗体のin vivo有効性を確認する。
本明細書のいずれの参考文献の引用も、そのような参考文献が本出願の“先行技術”として利用可能であることを容認するものと解されるべきではない。
本明細書を通してその目的は本発明の好ましい実施態様を記載することであり、いずれか1つの実施態様または特定の特徴収集物に本発明を限定しない。したがって、本開示に照らし、多様な改変および変更を本発明の範囲から外れることなく個々の実施態様で実行し得ることは当業者には理解されるであろう。そのような改変および変更は全て添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
本発明のある特徴は、異なる特異性を有する複数の抗原結合分子を含み、それらが直接的にまたはリンカーを介して一緒に融合或いは接合されているキメラ構築物に関する。
5.1抗RANKL-抗PD-1ジアボディ
本発明は、二重特異性で抗RANKL抗原結合分子および抗PD-1抗原結合分子を含むマルチ特異性構築物を意図し、その代表的な例は、以下から選択される配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る:
a)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqssnwprtfgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:216)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:291)に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:292)に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:293)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
b)QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqssnwprtfgqgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:217)に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:294)に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:295)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:296)対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:218)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:297)に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:298)に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:299)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
d)QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqssnwprtfgqgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:219)に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:300)に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:301)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:302)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
e)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscraskgvstsgysylhwyqqkpgqaprlliylasylesgvparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfgggtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:220)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:303)に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:304)に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:305)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:221)に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:306)に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:307)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:308)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
g)QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscraskgvstsgysylhwyqqkpgqaprlliylasylesgvparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfgggtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:222)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:309)に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:310)に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:311)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
h)QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscraskgvstsgysylhwyqqkpgqaprlliylasylesgvparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfgggtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:223)に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:312)に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:313)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:314)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
また別に、二重特異性構築物は、抗RANKL抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含み、その代表的な例は、以下から選択される配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る:
a)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqrvsssylawyqqkpgqaprlliydassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygslpwtfgqgtkveik [SGGGG]n VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:224)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:315)に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:316)に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:317)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
b)VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqrvsssylawyqqkpgqaprlliydassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygslpwtfgqgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:225)に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:318)に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:319)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:320)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:226)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:321)に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:322)に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:323)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
d)VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqrvsssylawyqqkpgqaprlliydassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygslpwtfgqgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:227)に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:324)に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:2325)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:326)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:228)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:327)に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:328)に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:329)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
f)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:229)に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:330)に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:331)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:332)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:230)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:333)に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:334)に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:335)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
h)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:231)に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:336)に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:337)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:338)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
また別に、二重特異性構築物は、抗RANKL抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子を含み、その代表的な例は、以下から選択される配列を含むか、前記から成るか、または本質的に前記から成る:
a)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvgssylawyqqkpgqaprlliygafsratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspwtfgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:232)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:339)に対応し、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:340)に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:341)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
b)QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvgssylawyqqkpgqaprlliygafsratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspwtfgqgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:233)に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:342)に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:343)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:344)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:234)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:345)に対応し、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:346)に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:347)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
d)QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvgssylawyqqkpgqaprlliygafsratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspwtfgqgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:235)に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:348)に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:349)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:350)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
e)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsinsyldwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyystpftfgpgtkveik [SGGGG]n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:236)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:351)に対応し、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:352)に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:353)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
f)QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsinsyldwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyystpftfgpgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:237)に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:354)に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:355)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:356)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:238)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:357)に対応し、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:358)に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:359)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
h)QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsinsyldwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyystpftfgpgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:239)に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:360)に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列(配列番号:361)に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列(配列番号:362)に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n=1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn=1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn=3である。
Claims (124)
- NF-κB(RANK)リガンド(RANKL)アンタゴニストおよび少なくとも1つの免疫チェックポイント分子(ICM)アンタゴニストを含む、それらから成る、または本質的にそれらから成る治療薬組合せ。
- 少なくとも1つのICMアンタゴニストが、適切には以下から成る群から選択されるICMと拮抗する、請求項1に記載の治療薬組合せ:プログラム死1受容体(PD-1)、プログラム死リガンド1(PD-L1)、プログラム死リガンド2(PD-L2)、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA-4)、A2Aアデノシン受容体(A2AR)、A2Bアデノシン受容体(A2BR)、B7-H3(CD276)、V-セットドメイン含有T細胞活性化阻害因子1(VTCN1)、BおよびTリンパ球減弱化因子(BTLA)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)、T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン3(TIM-3)、T細胞活性化のV-ドメインIgサプレッサー(VISTA)、5'-ヌクレオチダーゼ(CD73)、タクチル(CD96)、ポリオウイルス受容体(CD155)、DNAX付属分子-1(DNAM-1)、ポリオウイルス受容体関連2(CD112)、細胞傷害性調節性T細胞分子(CRTAM)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー4(TNFRS4;OX40;CD134)、腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリー、メンバー4(TNFSF4;OX40リガンド(OX40L))、ナチュラルキラー細胞受容体2B4(CD244)、CD160、グルココルチコイド誘発TNFR関連タンパク質(GITR)、グルココルチコイド誘発TNFR関連タンパク質リガンド(GITRL)、誘発性共同刺激因子(ICOS)、ガレクチン9(GAL-9)、4-1BBリガンド(4-1BBL;CD137L)、4-1BB(4-1BB;CD137)、CD70(CD27リガンド(CD27L))、CD28、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、シグナル調節タンパク質(SIRP-1)、インテグリン関連タンパク質(IAP;CD47);Bリンパ球活性化マーカー(BLAST-1;CD48)、ナチュラルキラー細胞受容体2B4(CD244);CD40、CD40リガンド(CD40L)、ヘルペスウイルス侵入媒介因子(HVEM)、トランスメンブレンおよび免疫グロブリンドメイン含有2(TMIGD2)、HERV-H LTR-関連2(HHLA2)、血管内皮増殖阻害因子(VEGI)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー25(TNFRS25)、誘発性T細胞共同刺激因子リガンド(ICOLG;B7RP1)並びにIgおよびITIM(免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ)ドメインを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)。
- 少なくとも1つのICMアンタゴニストが、PD-1アンタゴニスト、PD-L1アンタゴニストおよびCTLA4アンタゴニストから選択される、請求項1に記載の治療薬組合せ。
- 少なくとも1つのICMアンタゴニストが、CTLA-4アンタゴニスト以外であるかまたはCTLA-4アンタゴニストを除く、請求項1に記載の治療薬組合せ.
- 少なくとも1つのICMアンタゴニストがPD-1アンタゴニストを含む、請求項1から4のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- 少なくとも1つのICMアンタゴニストがPD-L1アンタゴニストを含む、請求項1から5のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- 少なくとも1つのICMアンタゴニストが、PD-1アンタゴニストおよびPD-L1アンタゴニストを含む、請求項1から4のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- 少なくとも1つのICMアンタゴニストが、PD-1アンタゴニストおよびCTLA4アンタゴニストを含む、請求項1から3のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- 少なくとも1つのICMアンタゴニストが、PD-L1アンタゴニストおよびCTLA4アンタゴニストを含む、請求項1から3のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- RANKLアンタゴニストが、RANKLと特異的に結合する直接的RANKLアンタゴニストである、請求項1から9のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- RANKLアンタゴニストがRANKと特異的に結合する間接的RANKLアンタゴニストである、請求項1から9のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- RANKLアンタゴニストが抗原結合分子である、請求項1から11のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- 個々のICMアンタゴニストが抗原結合分子である、請求項1から12のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- 抗RANKL抗原結合分子が、アミノ酸配列TEYLQLMVY(配列番号:1)(すなわち、配列番号:2で示される自然のままのRANKL配列の残基233−241)を含むRANKLの領域と特異的に結合する、請求項10に記載の治療薬組合せ。
- 抗RANKL抗原結合分子がモノクローナル抗体(MAb)である、請求項10または請求項14に記載の治療薬組合せ。
- 抗RANKL抗原結合分子がMAbデノスマブまたはその抗原結合フラグメントである、請求項15に記載の治療薬組合せ。
- 抗RANK抗原結合分子が、配列番号:3に示される重鎖アミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項16に記載の治療薬組合せ。
- 抗RANK抗原結合分子が配列番号:4に示される軽鎖アミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項16または請求項17に記載の治療薬組合せ。
- 抗RANKL抗原結合分子がRANKLとの結合についてデノスマブと競合する、請求項14から18のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- RANKアンタゴニスト(例えば抗RANK抗原結合分子またはアンタゴニストペプチド)が、CDR2(すなわち残基44−85)およびCRD3(すなわち残基86−123)から選択されるシステイン富裕ドメイン(CRD)の少なくとも一部分に対応するアミノ酸配列と特異的に結合するか、または前記配列を含むか、前記配列から成るかもしくは本質的に前記配列から成る、請求項12に記載の治療薬組合せ。
- RANKアンタゴニスト(例えば抗RANK抗原結合分子またはアンタゴニストペプチド)が、RANK CRD3の少なくとも一部分に対応するアミノ酸配列と特異的に結合するか、または前記配列を含むか、前記配列から成るかもしくは本質的に前記配列から成り、その代表的な例にYCWNSDCECCY(配列番号:5)、YCWSQYLCY(配列番号:6)が含まれる、請求項20に記載の治療薬組合せ。
- RANKアンタゴニストが、アミノ酸配列VSKTEIEEDSFRQMPTEDEYMDRPSQPTDQLLFLTEPGSKSTPPFSEPLEVGENDSLSQCFTGTQSTVGSESCNCTEPLCRTDWTPMS(配列番号:7)(すなわち、配列番号:8に示される自然のままのRANK配列の残基330−417)の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する、請求項12に記載の治療薬組合せ。
- 抗RANK抗原結合分子がモノクローナル抗体(MAb)である、請求項12または請求項22に記載の治療薬組合せ。
- 抗RANK抗原結合分子が、MAb N-1H8、N-2B10、若しくはMAb 64C1385またはそれらの抗原結合フラグメントから選択される、請求項12に記載の治療薬組合せ。
- 抗RANK抗原結合分子が、RANKとの結合についてモノクローナル抗体64C1385、N-1H8またはN-2B10と競合する、請求項12および20から24のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- 抗RANK抗原結合分子が、例えばNewaら(Newa et al., Mol Pharm. 11(1):81-9, 2014)によって開示される短鎖Fv(scFv)抗原結合分子またはその抗原結合フラグメントである、請求項12のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- それぞれのICMアンタゴニストが抗ICM抗原結合分子である、請求項1から26のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- 抗ICM抗原結合分子が、抗PD-1抗原結合分子、抗PD-L1抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子から選択される、請求項27に記載の治療薬組合せ。
- 抗PD-1抗原結合分子がMAbであり、その非限定的な例に、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、およびMEDI-0680(AMP-514)、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、およびBGB-317またはその抗原結合フラグメントが含まれる、請求項28に記載の治療薬組合せ。
- 抗PD-1抗原結合分子が、PD-1との結合についてニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、、BGB-317またはMEDI-0680と競合する、請求項28に記載の治療薬組合せ。
- 抗PD-1抗原結合分子が、アミノ酸配列SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR(配列番号:9)(すなわち、配列番号:10に示される自然のままのPD-1配列の残基62から86)、および/またはアミノ酸配列SGTYLCGAISLAPKAQIKE(配列番号:11)(すなわち、配列番号:10に示される自然のままのPD-1配列の残基118から136)の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する、請求項28から30のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- 抗PD-1抗原結合分子が、アミノ酸配列NWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV(配列番号:12)(すなわち、配列番号:10に示される自然のままのPD-1配列の残基66から97に対応する)の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する、請求項28から30のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- 抗PD-L1抗原結合分子がMAbであり、その非限定的な例に、デュルバルマブ(MEDI4736)、アテゾリズマブ(Tecentriq)、アベルマブ、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480およびMPDL3280A、またはその抗原結合フラグメントが含まれる、請求項28に記載の治療薬組合せ。
- 抗PD-L1抗原結合分子が、アミノ酸配列SKKQSDTHLEET(配列番号:13)(すなわち、配列番号:14に示される完全長の自然のままのPD-L1アミノ酸配列の残基279から290)の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する、請求項28または請求項33に記載の治療薬組合せ。
- 抗PD-L1抗原結合分子が、PD-L1との結合についてデュルバルマブ(MEDI4736)、アテゾリズマブ(Tecentriq)、アベルマブ、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480およびMPDL3280Aのいずれか1つと競合する、請求項28または請求項33に記載の治療薬組合せ。
- 抗CTLA4抗原結合分子がMAbであり、その代表的な例にイピリムマブおよびトレメリムマブまたはその抗原結合フラグメントが含まれる、請求28に記載の治療薬組合せ。
- 抗CTLA4抗原結合分子が、CTLA4との結合についてイピリムマブまたはトレメリムマブと競合する、請求項28に記載の治療薬組合せ。
- 抗CTLA4抗原結合分子が、YASPGKATEVRVTVLRQA(配列番号:15)(すなわち配列番号:16に示される完全長の自然のままのCTLA4アミノ酸配列の残基26から42)、DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD(配列番号:17)(すなわち配列番号:16に示される自然のままのCTLA4アミノ酸配列の残基43から65)、およびVELMYPPPYYLGIG(配列番号:18)(すなわち配列番号:16に示される自然のままのCTLA4アミノ酸配列の残基96から109)から選択されるアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する、請求項28、36および37のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- RANKLアンタゴニストおよびICMアンタゴニストの一方または両方が抗原結合分子であり、当該抗原結合分子が免疫グロブリン定常鎖(例えばIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3またはIgG4定常鎖)に連結した、請求項1から38のいずれかに記載の治療薬組合せ。
- 免疫グロブリン定常鎖が、κ軽鎖またはλ軽鎖から選択される軽鎖、並びにγ1重鎖、γ2重鎖、γ3重鎖およびγ4重鎖から選択される重鎖を含む、請求項39に記載の治療薬組合せ。
- RANKLアンタゴニストおよび2つ以上の異なるICMアンタゴニストを含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る、請求項1から40のいずれかに記載の治療薬組合せ。
- 治療薬組合せが、RANKLアンタゴニスト並びにCTLA4アンタゴニスト、PD-1アンタゴニストおよびPD-L1アンタゴニストの少なくとも2つを含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る、請求項41に記載の治療薬組合せ。
- 個々のアンタゴニスト成分が別個の構成要素の形態で存在する、請求項1から42のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- 個々のアンタゴニスト成分が互いに融合しているか、そうでなければ(直接的または間接的に)互いに複合体化される、請求項1から42のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- 治療薬組合せがマルチ特異性アンタゴニスト薬剤の形態であり、RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストを含む、請求項44に記載の治療薬組合せ。
- マルチ特異性薬剤が2つ以上のポリペプチドの複合体である、請求項45に記載の治療薬組合せ。
- マルチ特異性薬剤が単一鎖ポリペプチドである、請求項45に記載の治療薬組合せ。
- RANKLアンタゴニストが、それぞれのICMアンタゴニストのN-末端で複合体化される、請求項47に記載の治療薬組合せ。
- RANKLアンタゴニストが、それぞれのICMアンタゴニストのC-末端で複合体化される、請求項47に記載の治療薬組合せ。
- RANKLアンタゴニストおよびICMアンタゴニストが直接的に結合される、請求項48または請求項49に記載の治療薬組合せ。
- RANKLアンタゴニストおよびICMアンタゴニストが、介在リンカー(例えばポリペプチドリンカー)によって結合される、請求項48または請求項49に記載の治療薬組合せ。
- マルチ特異性アンタゴニスト薬剤が少なくとも2つの抗原結合分子を含む、請求項45から51のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
- マルチ特異性抗原結合分子が組換え分子の形態で存在し、前記分子が、キメラ、ヒト化およびヒト抗原結合分子を含む、請求項52に記載の治療薬組合せ。
- RANKLおよび少なくとも1つのICMに拮抗するマルチ特異性抗原結合分子であって、RANKLまたはRANKと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを、さらにそれぞれのICMについては当該ICMと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含むか、それらのフラグメントから成るか、または本質的にそれらのフラグメントから成る、前記マルチ特異性抗原結合分子。
- 抗体および/または抗原結合フラグメントが直接的に結合される、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- 抗体および/または抗原結合フラグメントが、介在リンカー(例えば化学的リンカーまたはポリペプチドリンカー)によって結合される、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- 抗体または抗原結合フラグメントが作動できるように結合される単鎖ポリペプチドの形態である、請求項54から56のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- 互いに連結されるか、そうでなければ互いに会合して複合体を形成する、複数の別個のポリペプチドの形態にある、請求項54から56のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- 二価、三価、または四価である、請求項54から58のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- 少なくとも1つのICMが、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、A2AR、A2BR、CD276、VTCN1、BTLA、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA、CD73、CD96、CD155、DNAM-1、CD112、CRTAM、OX40、OX40L、CD244、CD160、GITR、GITRL、ICOS、GAL-9、4-1BBL、4-1BB、CD27L、CD28、CD80、CD86、SIRP-1、CD47、CD48、CD244、CD40、CD40L、HVEM、TMIGD2、HHLA2、VEGI、TNFRS25、ICOLGおよびTIGITから選択される、請求項54から59のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- 二重特異性であり、抗ICM抗体またはその抗原結合フラグメントが、抗CTLA4抗体またはその抗原結合フラグメント以外である、請求項54から60のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- Fab、Fab’、F(ab’)2およびFv分子並びに相補性決定領域(CDR)から選択される抗原結合フラグメントを含む、請求項54から61のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- 個々の抗体またはその抗原結合フラグメントが、IgG、IgM、IgD、IgA、およびIgEから成る群からそれぞれ独立に選択される定常ドメインを含む、請求項54から62のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- マルチ特異性抗原結合分子が、タンデムscFv(taFvまたはscFv2)、ジアボディ、dAb2/VHH2、ノブインホール誘導体、シードコッド-IgG、ヘテロFc-scFv、Fab-scFv、scFv-Jun/Fos、Fab’-Jun/Fos、トリボディ、DNL-F(ab)3、scFv3-CH1/CL、Fab-scFv2、IgG-scFab、IgG-scFv、scFv-IgG、scFv2-Fc、F(ab’)2-scFv2、scDB-Fc、scDb-CH3、Db-Fc、scFv2-H/L、DVD-Ig、tandAb、scFv-dhlx-scFv、dAb2-IgG、dAb-IgG、dAb-Fc-dAb、tandab、DART、BiKE、TriKE、mFc-VH、架橋MAb、CrossMAb、MAb2、静電気的に適合した抗体、対称性IgG様抗体、LUZ-Y、Fab-交換抗体、FIT-Ig、またはそれらの組合せから選択される、請求項54から61のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- 免疫グロブリン定常鎖(例えばIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、およびIgG4)に連結した抗原結合フラグメントを含む、請求項54から64のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- 免疫グロブリン定常鎖が、κ軽鎖およびλ軽鎖から選択される軽鎖、および/またはγ1重鎖、γ2重鎖、γ3重鎖、およびγ4重鎖から選択される重鎖を含む、請求項65に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- アミノ酸配列TEYLQLMVY(配列番号:1)(すなわち、配列番号:2に示される自然のままのRANKL配列の残基233−241)の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する、抗RANKL抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項54から66のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- RANKの細胞外領域(すなわち、配列番号:8に示されるヒトRANK配列の残基30から212に対応する)と特異的に結合する、抗RANK抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項54から66のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- マルチ特異性抗原結合分子がPD-1と拮抗し、さらにSFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR(配列番号:9)(すなわち、配列番号:10に示される自然のままのヒトPD-1配列の残基62から86)、SGTYLCGAISLAPKAQIKE(配列番号:11)(すなわち、配列番号:10に示される自然のままのヒトPD-1配列の残基118から136)、およびNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV(配列番号:12)(すなわち、配列番号:10に示される自然のままのヒトPD-1配列の残基66から97)から選択されるアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項54から68のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- 抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントが、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、およびMEDI-0680(AMP-514)、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、BGB-317またはその抗原結合フラグメントから選択されるMAbの重鎖および軽鎖を含む、請求項54から69のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- マルチ特異性抗原結合分子がPD-L1と拮抗し、さらにSKKQSDTHLEET(配列番号:13)(すなわち、配列番号:14に示される自然のままのヒトPD-L1アミノ酸配列の残基279から290)と特異的に結合する抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項54から68のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- 抗PD-LD1抗体またはその抗原結合フラグメントが、デュルバルマブ(MEDI4736)、アテゾリズマブ(Tecentriq)、アベルマブ、BMS-936559/MDX-1105、およびMPDL3280A、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480またはその抗原結合フラグメントから選択されるMAbの重鎖および軽鎖を含む、請求項54から68および71のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- CTLA4と拮抗し、さらに抗CTLA4抗体またはその抗原結合フラグメントが、YASPGKATEVRVTVLRQA(配列番号:15)(すなわち、配列番号:16に示される完全長の自然のままのPD-CTLA4アミノ酸配列の残基26から42)、DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD(配列番号:17)(すなわち、配列番号:16に示される自然のままのCTLA4配列の残基43から65)、およびVELMYPPPYYLGIG(配列番号:18)(すなわち、配列番号:16に示される自然のままのCTLA4配列の残基96から109)から選択されるアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する、請求項54から68のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- 抗CTLA4抗体またはその抗原結合フラグメントが、イピリムマブおよびトレメリムマブ、またはその抗原結合フラグメントから選択されるMAbの重鎖および軽鎖を含む、請求項54から68および73のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- マルチ特異性抗原結合分子がCrossMAb様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:240に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:241に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:242に対応するアミノ酸配列を含み、当該第四のポリペプチドが配列番号:244に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- マルチ特異性抗原結合分子がCrossMAb様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:244に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:245に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:246に対応するアミノ酸配列を含み、当該第四のポリペプチドが配列番号:247に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- マルチ特異性抗原結合分子がCrossMAb様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:248に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:249に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:250に対応するアミノ酸配列を含み、当該第四のポリペプチドが配列番号:251に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- マルチ特異性抗原結合分子がCrossMAb様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:252に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:253に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:254に対応するアミノ酸配列を含み、当該第四のポリペプチドが配列番号:254に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- マルチ特異性抗原結合分子がCrossMAb様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:256に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:257に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:258に対応するアミノ酸配列を含み、当該第四のポリペプチドが配列番号:259に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- マルチ特異性抗原結合分子がCrossMAb様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:260に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:261に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:262に対応するアミノ酸配列を含み、当該第四のポリペプチドが配列番号:263に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- マルチ特異性抗原結合分子がCrossMAb様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:264に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:265に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:266に対応するアミノ酸配列を含み、当該第四のポリペプチドが配列番号:267に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- マルチ特異性抗原結合分子がCrossMAb様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:268に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:269に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:270に対応するアミノ酸配列を含み、当該第四のポリペプチドが配列番号:271に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- マルチ特異性抗原結合分子がCrossMAb様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:272に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:273に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:274に対応するアミノ酸配列を含み、当該第四のポリペプチドが配列番号:275に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- マルチ特異性抗原結合分子がFIT-Ig様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、および第三のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:276に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:277に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:278に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- マルチ特異性抗原結合分子がFIT-Ig様式にあり、かつRANKLおよびCTLA4と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、および第三のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:279に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:277に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:280に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- マルチ特異性抗原結合分子がFIT-Ig様式にあり、かつRANKLおよびPD-L1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、および第三のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:281に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:277に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:282に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
- デリバリービヒクル(例えばリポソーム、ナノ粒子、ミクロ粒子、デンドリマーまたはシクロデキストリン)に収納される、請求項1から86のいずれかに記載の治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子。
- RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストの各々を含む単一組成物の形態にある、請求項1から87のいずれかに記載の治療薬組合せ。
- 単一組成物が、RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストの混合物を含む、請求項87に記載の治療薬組合せ。
- RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストが、別々の組成物中の別個の構成要素として提供される、請求項1から89のいずれかに記載の治療薬組合せ。
- 個々のアンタゴニストが抗原結合分子である、請求項1から90のいずれかに記載の治療薬組合せ。
- ICMアンタゴニストが、調節性T(Treg)細胞が発現を欠くかまたは低レベルで発現するICMと拮抗する、請求項1から91のいずれかに記載の治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子。
- 少なくとも1つのICMアンタゴニストが、PD-1およびPD-L1の一方または両方から選択されるICMと拮抗する、請求項92に記載の治療薬組合せ。
- 抗RANKL抗原結合分子および抗PD-1抗原結合分子を含むか、それらの分子から成るか、または本質的にそれらの分子から成る、請求項1から93のいずれかに記載の治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子。
- 抗RANKL抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含むか、それらの分子から成るか、または本質的にそれらの分子から成る、請求項1から94のいずれかに記載の治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子。
- 抗RANKL抗原結合分子、抗PD-1抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含むか、それらの分子から成るか、または本質的にそれらの分子から成る、請求項1から95のいずれかに記載の治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子。
- 抗RANKL抗原結合分子、抗PD-1抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子を含むか、それらの分子から成るか、または本質的にそれらの分子から成る、請求項1から96のいずれかに記載の治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子。
- 1つ以上の制御配列と作動できるように結合している請求項1から97のいずれかに記載のマルチ特異性抗原結合分子をコードする核酸配列を含む、1つの構築物または複数の構築物。
- 請求項98に規定する構築物を含む、宿主細胞。
- 請求項1から99のいずれかで規定される治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子、および医薬的に許容できる担体または希釈剤を含む医薬組成物。
- さらにまた、化学療法剤(例えば抗増殖/抗新形成薬、細胞増殖抑制剤、癌細胞侵襲阻害剤、増殖因子機能阻害剤、抗血管形成剤、血管損傷剤などから選択される)または免疫療法剤(例えばサイトカイン、サイトカイン発現細胞、抗体など)から選択される少なくとも1つの補助剤を含む、請求項100に記載の組成物。
- 対象動物において免疫を刺激するかまたは増大させる方法であって、請求項1から101のいずれかで規定される治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子の有効量を対象動物に投与し、それによって当該対象動物において免疫を刺激するかまたは増大させる工程を含むか、前記工程から成る、または本質的に前記工程から成る、前記方法。
- 刺激または増大される免疫が有益な宿主免疫応答を含み、その例示的な例に、腫瘍サイズの減少、腫瘍量の減少、疾患の安定化、内因性または外因性抗原に対する抗体の産生、免疫系の誘発、免疫系の1つ以上の構成要素の誘発、細胞媒介免疫およびその発生に必要とされる分子、液性免疫およびその発生に必要とされる分子、抗体依存細胞傷害性(ADCC)免疫およびその発生に必要とされる分子、補体媒介細胞傷害性(CDC)免疫およびその発生に必要とされる分子、ナチュラルキラー細胞、サイトカインおよびケモカイン並びにそれらの産生に必要とされる分子および細胞、抗体依存細胞傷害、補体依存細胞傷害、ナチュラルキラー細胞活性、および抗原増強細胞傷害のいずれか1つ以上が含まれる、請求項102に記載の方法。
- 刺激または増大される免疫が炎症促進免疫応答を含む、請求項102または請求項103に記載の方法。
- 対象動物における腫瘍に対する免疫抑制または耐性の発達もしくは進行を阻害する方法であって、腫瘍を請求項1から104のいずれかで規定される治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子と接触させ、それによって対象動物における腫瘍に対する免疫抑制または耐性の発達もしくは進行を阻害する工程を含むか、前記工程から成るか、または本質的に前記工程から成る、前記方法。
- 治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子がまた、免疫系に腫瘍抗原を提示する抗原提示細胞(例えば樹状細胞)と接触する、請求項105に記載の方法。
- 癌の発達、進行または再発を対象動物において阻害する方法であって、請求項1から106のいずれかで規定される治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子の有効量を対象動物に投与し、それによって癌の発達、進行または再発を対象動物において阻害する工程を含むか、前記工程から成るか、または本質的に前記工程から成る、前記方法。
- 対象動物において癌を治療する方法であって、請求項1から106のいずれかで規定される治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子の有効量を対象動物に投与し、それによって当該対象動物において癌を治療する工程を含むか、前記工程から成るか、または本質的に前記工程から成る、前記方法。
- 癌が、メラノーマ、乳癌、結腸癌、卵巣癌、子宮内膜および子宮癌、胃関連または胃の癌、膵臓癌、前立腺癌、唾液腺癌、肺癌、肝細胞癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、直腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓関連癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、精巣癌、食道癌、胆管の腫瘍、頭頸部癌、および扁平上皮細胞癌腫から選択される、請求項107または請求項108に記載の方法。
- 癌が転移癌である、請求項107から109のいずれか1項に記載の方法。
- 対象動物が免疫調節剤に対して低下または障害された応答性を有する、請求項102から110のいずれか1項に記載の方法。
- 免疫調節剤が抗ICM抗原結合分子(例えば抗PD-1または抗PD-L1抗原結合分子)である、請求項111に記載の方法。
- さらにまた有効量の補助抗癌剤を同時発生的に投与する工程を含む、請求項102から112のいずれか1項に記載の方法。
- 補助抗癌剤が、化学療法剤、体外放射線照射、標的に誘導される放射性同位元素、およびシグナル伝達阻害剤から選択される、請求項113に記載の方法。
- RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストを同時発生的に対象動物に投与する工程を含む、請求項102から114のいずれか1項に記載の方法。
- 治療薬組合せが単一組成物の形態にある、請求項115に記載の方法。
- 単一組成物が、RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストの混合物を含む、請求項116に記載の方法。
- 個々のアンタゴニストが抗原結合分子である、請求項117に記載の方法。
- 治療薬組合せのRANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストが、別々の組成物中で別個の構成要素として提供される、請求項115に記載の方法。
- RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストが同時に投与される、請求項119に記載の方法。
- RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストが逐次的に投与される、請求項119に記載の方法。
- RANKLアンタゴニストが、少なくとも1つのICMアンタゴニストの投与の前に投与される、請求項121に記載の方法。
- RANKLアンタゴニストが、少なくとも1つのICMアンタゴニストの投与の後で投与される、請求項121に記載の方法。
- 免疫を刺激もしくは増大させるか、腫瘍に対する免疫抑制もしくは耐性の発達または進行を阻害するか、または対象動物において癌を治療するためのキットであって、請求項1から123のいずれかに記載の治療薬組合せ、医薬組成物、およびマルチ特異性抗原結合分子のいずれか1つ以上を含む、前記キット。
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