JP2020522282A - 心臓前駆細胞の亜集団を単離する方法、及び医療分野における関連する使用 - Google Patents
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Abstract
Description
1)CD117抗原であるc-kitの表面発現を基に選択された心臓幹細胞(CSC)の集団、[1]、
2)マーカーによってではなく、球状集合体を形成する能力を有することを基に単離されたカーディオスフェア由来細胞(CDC)[2]、
3)CSC−ckit+細胞と骨髄間葉系幹細胞(MSC)との組み合わせを使用する、併用治療手法を用いる第I相試験及び第I相治験[3]。
a)心臓細胞の集団を含む心臓組織試料をミンチすること、
b)細胞懸濁液が得られるまで、酵素混合物を用いて前記心臓組織を4回、漸進的に消化し、そして30μm〜100μmの範囲内の大きさのフィルタにより濾過すること、
c)細胞懸濁液が得られるまで、酵素混合物を用いて、ステップb)で得られた残りの心臓組織を16時間さらに消化し、そして30μm〜100μmの範囲内の大きさのフィルタにより濾過すること、
d)心臓細胞を増殖させるのに適切な培地中で、ステップb)及びステップc)で得られた細胞懸濁液を培養すること、
e)心臓細胞を増殖させるのに適切な培地中において、ステップd)で得られた細胞懸濁液を酵素溶液又は非酵素溶液の存在下で予備的に増殖させること、
f)心臓細胞をさらに増殖させるのに適切な培地中において、ステップe)で得られた心臓細胞を酵素溶液又は非酵素溶液の存在下で二次的に増殖させること、
g)心臓前駆細胞の開始集団内で発現した1又は複数の表面抗原に対するモノクローナル抗体を使用して、陽性選択及び/又は陰性選択によって、心臓細胞の1又は複数の亜集団を単離すること。
MATERIALS AND METHODS
(初代培養)
36.8〜631.8mgの範囲内の重量のヒト心耳の試料(図1参照)を手術室で採取し、その脱水を防ぐため、直ちに少なくとも1種の殺菌した溶液(リン酸塩緩衝食塩水、PBS又は生理的溶液)、好ましくは前記組織の生存度も維持する溶液(例えば、任意の培地)を含む殺菌した容器内に移す
1.前記組織断片を含む(1又は複数の)前記チューブを、回転振動機内に移す。回転振動機により、前記溶液が前記断片自体の有効な消化により濁る(一般的には、30〜40分間又は最高4時間)まで、37℃の温度で前記チューブの内部で前記断片を動かすことができる。
2.前記(1又は複数の)チューブを回収する。まだ消化されていない断片をチューブの底部に堆積させることができる。(細胞を含む)「消化された」溶液を回収し、チューブ内に移し、PBSの添加後、チューブを遠心分離して細胞を底部に堆積させる(チューブは、4℃で、400g10分間又は800g5分間遠心分離する)。
3.前記上清を除去し、完全培地中で前記細胞を再懸濁し、氷中に置かれた前記細胞を含むチューブを移し、後に行われる消化を待つ。特定の場合において、前記完全培地は、10%のウシ胎児血清(FBS)、2mMのL−グルタチオン及び5×10−3U/mLのヒトエリスロポイエチン、10ng/mLの塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF又はFGF2)及び抗生物質(1000U/mL以下のペニシリン及び1000ug/mL以下のストレプトマイシン)を含むHam’s/F12からなる(F12H)。
4.培地を除去し、細胞がプレーティングされるペトリ皿の表面をPBSで洗浄し、プラスチックから細胞を剥離させる溶液を加える。ペトリ皿は、細胞懸濁液を得るために必要な時間、37℃に制御された温度でインキュベートされる。このプロセスのために、酵素溶液(トリプシン)又は非酵素溶液(Tryple Select、EDTA、細胞解離緩衝液又はセルストリッパ)を用いることが可能である。
5.FBS(酵素溶液を用いた場合)又はPBS(非酵素溶液を用いた場合)を含有する溶液の添加によって、前記反応を中断する。チューブ内の細胞を含む溶液を遠心分離する。
6.細胞を計数し、1:10の希釈率で、又は、好ましくは1200〜1500個/cm2の濃度で、F12H培地内に再度プレーティングする。培地を換えるが、好ましくは2日毎に換える。
単離すべき集団を非酵素的方法を用いてペトリ皿から剥離し(「非選択集団の増幅」の項参照)、細胞を計数し、再懸濁する(好ましくは冷たい単離緩衝液(Wash Buffer、WB)中に再懸濁する)。特定の場合においては、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)及びウシ血清アルブミン(BSA又はHSA)を含有するPBSを用いる。細胞は、100μLあたり1×106個の濃度で再懸濁した。
磁気分離は、例えばMiltenyi社製のカラム及び磁石を用いて行うことができる。WB(好ましくは冷たいWB)(MSカラムについては500μL、またLSカラムについては1mL)を用いてカラムを活性化する。陰性集団はチューブ内に回収する(NEG)。前記細胞を前記磁気カラム内に移す(前記MSカラム内には1.5×106個以下の細胞、又は前記LSカラム内には15〜30×107個以下の細胞)。WB(好ましくは冷たいWB)を加えて(前記MSカラムに対しては500μL、前記LSカラムに対しては1mL)、前記カラムを3回洗浄する。陽性集団(POS)は、磁石からはがした後でカラムの内容物をチューブ内に絞り出し、WB(好ましくは冷たいWB)を加える(前記MSカラムに対しては1mL、また前記LSカラムに対しては2mL)ことによって回収する。選択純度を増加させるために、選択された陽性細胞(POS)を、予想される数に基づいて、新しいMS磁気カラム又はLS磁気カラムに通すことができる。選択された陽性細胞の数を増加させるために、開始数に基づいて、前記NEGチューブの細胞を新しいMS磁気カラム又はLS磁気カラムに通すことが可能である。前記陽性(POS)細胞及び前記陰性(NEG)細胞を遠心分離し、F12H培地中に再懸濁し、計数した。
選択前における、断片の消化ステップ、初代培養及び増殖は、実施例1の場合と同様である。
非酵素的方法(「非選択集団の増幅」の項参照)を用いて、単離すべき前記集団を前記ペトリ皿から剥離し、前記細胞を計数し、冷たい単離緩衝液(WB)中に再懸濁する。細胞を、100μLあたり1×107個の濃度で再懸濁した。
磁気分離は、Miltenyi社製のカラム及び磁石を用いて行うことができる。冷たいWB(LDカラムについては2mL)を用いてカラムを活性化する。細胞を磁気カラム内に移した(LDカラム一本に30×107個以下の細胞)。毎回冷たいWBを加えて(前記LDカラムに対して1mL)カラムを2回洗浄した。陰性集団はチューブ内に回収する(NEG)。選択純度を増加させるために、選択された陰性細胞(NEG)を、予想される数に基づいて、新しいMS磁気カラム又はLS磁気カラムに通した。この場合、細胞を、予め活性化されたカラムに(冷たいWBを用いて)通過させた後、続いてカラム自体を洗浄すること無しに陰性集団を回収した。陽性集団も回収する場合、それを磁石からはがして、冷たいWBを加え、その後に15mLのチューブ内にカラムの内容物を絞り出すことによって、陽性集団を回収する(POS)。選択純度を増加させるために、選択された陽性細胞(POS)を、予想される数に基づいて、新しいMS磁気カラム又はLS磁気カラムに通した。陽性(POS)細胞及び前記陰性(NEG)細胞を遠心分離し、F12H培地中に再懸濁し、計数した。
選択前における、断片の消化ステップ、初代培養及び増殖は、実施例1の場合と同様である。
非酵素的方法(「非選択集団の増幅」の項参照)を用いて、単離すべき集団をペトリ皿から剥離し、細胞を計数し、冷たい単離緩衝液(WB)中に再懸濁する。細胞は、100μLあたり1×107個の濃度では再懸濁しなかった。
磁気分離は、Miltenyi社製のカラム及び磁石を用いて行うことができる。冷たいWB(LDカラムについては2mL)を用いて前記カラムを活性化する。細胞を磁気カラム内に移す(LDカラム内に30×107個以下の細胞)。毎回冷たいWBを加えて(LDカラムに対して1mL)、カラムを2回洗浄した。陰性集団はチューブ内に回収する(NEG)。選択純度を増加させるために、選択された陰性細胞(POS)を、予想される数に基づいて、新しいMS磁気カラム又はLS磁気カラムに通した。この場合、細胞を、予め活性化されたカラムに(冷たいWBを用いて)通過させた後、続いてカラム自体を洗浄すること無しに陰性集団を回収した。陽性集団も回収する場合、それを磁石からはがして、冷たいWBを加え、その後にチューブ内にカラムの内容物を絞り出すことによって、陽性集団を回収する(POS)。選択純度を増加させるために、選択された陽性細胞(POS)を、予想される数に基づいて、新しいMS磁気カラム又はLS磁気カラムに通すことができる。
磁気分離は、Miltenyi社製のカラム及び磁石を用いて行うことができる。冷たいWB(MSカラムについては500μL、及びLSカラムについては1mL)を用いてカラムを活性化する。陰性集団をチューブ内に回収する(NEG−NEG)。細胞を磁気カラム内に移す(MSカラム内には1.5×106個以下の細胞、またLSカラム内には30×107個以下の細胞)。毎回冷たいWBを加えて(前記MSカラムに対しては500μL、前記LSカラムに対しては1mL)、カラムを3回洗浄する。陽性集団を磁石からはがした後で、カラムの内容物をチューブ内に絞り出し、冷たいWBを加える(前記MSカラムに対しては1mL、及び前記LSカラムに対しては2mL)ことによって陽性集団を回収した(POS)。選択純度を増加させるために、選択された陽性細胞(NEG−POS)を、予想される数に基づいて、新しいMS磁気カラム又はLS磁気カラムに通した。選択された陽性細胞の数を増加させるために、開始数に基づいて、NEG−NEGチューブの細胞を新しいMS磁気カラム又はLS磁気カラム内に通した。陽性(NEG−POS)細胞及び陰性(NEG−NEG)細胞を遠心分離し、F12H培地中に再懸濁し、計数した。
MATERIALS AND METHODS
(初代培養)
ヒト心耳の試料(36.8〜631.8mgの範囲内の重量)を手術室で採取し、その脱水を防ぐため、直ちに、殺菌した溶液(リン酸塩緩衝食塩水、PBS、生理的溶液)、好ましくは前記組織の生存度も維持する溶液(すなわち、任意の培地)を含む殺菌した容器内に移す。
次いで、コラゲナーゼNB−6(GMPグレード)を用いて、すでに基礎研究のために開発されている方法を採用して、ミンチされた組織を消化する(図2)。
1.前記組織断片を含む(1又は複数の)前記チューブを、回転振動機内に移す。回転振動機により、前記溶液が前記断片自体の有効な消化により濁る(一般的には、30〜40分間又は最高4時間)まで、37℃の温度で前記チューブの内部で前記断片を動かすことができる。
2.前記(1又は複数の)チューブを回収する。まだ消化されていない断片をチューブの底部に堆積させることができる。(細胞を含む)「消化された」溶液を回収し、チューブ内に移し、PBSの添加後、チューブを4℃で遠心分離して、細胞を底部に沈降させる。
3.前記上清を除去し、完全培地中で前記細胞を再懸濁する。特定の場合において、10%のGMPグレードウシ胎児血清(FBS)、2mMのL−グルタチオン及び5×10−3U/mLのヒトエリスロポイエチン、10ng/mLの塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF又はFGF2)及び抗生物質(1000U/mL以下のペニシリン及び1000ug/mL以下のストレプトマイシン)を含むHam’s/F12培地(F12G)を用い、氷中に置かれた前記細胞を含むチューブを移し、後に行われる消化を待つ。
4.培地を除去し、細胞がプレーティングされるペトリ皿の表面をPBSで洗浄し、プラスチックから前記細胞を剥離することができる非酵素溶液(TrypLE Select、Life Technologies)を加える。前記非酵素溶液を、細胞懸濁液を得るために必要な時間(約3〜10分間)、約37℃に制御された温度で細胞と共にインキュベートする。
5.PBSを加えることによって前記溶液を不活性化する。チューブ内の細胞を含む溶液を遠心分離する。
6.細胞を計数し、1:10の希釈率で、又は、好ましくは1200〜1500個/cm2の濃度で、F12G培地内に再度プレーティングする。培地を換えるが、好ましくは2日毎に換える。
前記非酵素的方法を用いて(「非選択集団の増幅」の項参照)、単離すべき集団を前記マルチフラスコ/セルスタックから剥離し、細胞を計数し、好ましくは冷たい単離緩衝液(WB)(好ましくは冷たい単離緩衝液(WB))中に再懸濁する。特定の場合においては、EDTA及びHSAを含有するPBSを用いる。細胞は、100μLあたり1×106個の濃度で再懸濁した。
臨床用を意図した磁気選択用機器を用いて磁気分離を行う。Miltenyi社製CliniMACS Plusを用いた。陰性細胞の場合と同様に、関連プログラムを用いて、陽性細胞を使用し、当初の集団から分離し、関連バッグ内に回収した。
MATERIALS AND METHODS
選択前における、断片の消化ステップ、初代培養及び増殖は、実施例1の場合と同様である。
本発明に係る方法によって得られた細胞集団の細胞数、純度及び細胞生存度を、従来技術[4]と比較した。
MATERIALS AND METHODS
(患者及び組織試料)
待機的心臓外科手術を受けている患者からヒト右心耳試料を得た。前もって地域の倫理委員会によって承認されたインフォームドコンセントを、ヘルシンキ宣言に従って各患者について得た。
hCPC−CD90−細胞に対する多色フローサイトメトリーを用いて、間葉マーカー、造血マーカー及び炎症マーカーの免疫表現型分析を行った。非酵素溶液を用いた剥離の後、細胞を、0.1%のBSA(Gibco、米国)及び2mMのEDTA(Gibco、米国)を含むPBS中に再懸濁し、以下のモノクローナル抗体又は対応するアイソタイプ(CD29−PE、CD44−PE、CD73−PE、CD105−APC、CD14 FITC、CD34−FITC、CD45−PE、HLA−DR−FITC、CD146−FITC(BD Pharmingen、イタリア)、CD200−FITC、KDR−PE(R&D Systems、米国)及びCD144−Alexa700(16B1クローン;eBioscience))の適切な組み合わせと共に、15分間、暗所でインキュベートした。次いで、該試料を1mLのウオッシュバッファーで洗浄し、4℃で400×gで10分間遠心分離して、非結合抗体を除去した。細胞を250μLのウオッシュバッファー中に再懸濁し、前記フローサイトメーターで分析した。
hCPC−ns細胞及びそこから誘導された異なる亜集団がインビトロで血管構造を形成する能力を評価するために、Cultrex(Trevigen、米国)の基底膜上に前記細胞を播種した。Cultrexを、37℃、5%CO2で30分間、48ウェルプレート上で重合させた。細胞を非酵素溶液を用いて剥離し、計数し、完全内皮成長培地−2(EGM−2、Lonza、イタリア)中で8×104個/mLに希釈し、cultrexマトリックスを含んでいる各ウェルに播種した。前記プレートを、37℃、5%CO2で4時間インキュベートした後、毛細管構造の数及びそれらの分岐点の数を計数した。これらの実験における陽性対照として、同じ培養条件下でHUVEC細胞(Lonza、イタリア)を用いた。EGM−2中において、3週間、hCPC−ns及びそこから誘導された異なる亜集団(hCPC−CD117+、hCPC−CD90−)を培養することにより、内皮へのコミットメントを分析した後、フローサイトメトリーによって免疫表現型を決定した。
培地中でのサイトカインの発現を決定するために、hCPC−ns細胞及びそこから誘導される異なる亜集団(hCPC−CD117+、hCPC−CD90+、hCPC−CD90−)の馴化培地を回収して、48時間以内に前記培地中に放出された可溶性因子の量を測定した。続いて、マイクロスフェアに基づいた多重イムノアッセイ(Bio−Plexアッセイ、Bio−Rad Laboratories)を用いて、培地中に放出されたサイトカイン、ケモカイン及び成長因子を比較した。培地を、10分間、4000gで遠心分離した。上清を回収し、使用まで80℃で凍結した。Luminex technology(Bio−Plex、Bio−Rad)を使用説明書に従って用いて、以下の血管新生因子(間質細胞由来因子(SDF−1)、GRO(成長調節癌遺伝子)−α(GRO−α)、幹細胞因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)、インターロイキン−6(IL−6)、IL−8、IL−10、単球走化性タンパク質1(MCP−1)、マクロファージ炎症性タンパク質1β(MIP−1b)、Regulated on Activation Normal T Cell Expressed and Secreted(RANTES)、血管内皮成長因子(VEGF)及び肝細胞成長因子(HGF))の存在について、前記試料を二連で評価した。
iPSから誘導される心筋細胞(CM−d−hiPSCs)内のcTnIの濃度を決定するため、transwell(登録商標)(0.4μm孔)内における共培養をCM−d−hiPSCs細胞とhCPC−ns細胞(並びにそれらから誘導された異なる亜集団である、hCPC−CD117+、hCPC−CD90+、hCPC−CD90−)との間で行った。共培養の開始から7日後、馴化培地を回収し、心筋トロポニンELISAアッセイのために用いた。前記馴化培地を、4000gで10分間遠心分離し、化学発光ELISAキット(Calbiotech)を、キットに含まれる説明書に従って使用して、上清をcTnI濃度の決定のために用いた。
iPSから誘導される心筋細胞(CM−d−hiPSCs)内のTNF−α濃度を決定するため、transwell(登録商標)(0.4μm孔)内で、
CM−d−hiPSCs細胞とhCPC−ns細胞(並びにそこから誘導された異なる亜集団である、hCPC−CD117+、hCPC−CD90+、hCPC−CD90−)との間で共培養を行った。共培養の開始から3日後及び7日後、馴化培地を回収し、遠心分離(10分、4000g)の後、キット内に含まれる説明書に従ってELISA(Invitrogen)アッセイに用いた。ELISAアッセイに用いられる同じ馴化培地における各試料のタンパク質濃度に対してTNF含有量を標準化するために、540nmにおける吸光度を測定するBCA(Pierce)を用いてタンパク質定量を行った。
TGF−β1で5日間処置されたhCPC−ns及びそこから誘導される異なる亜集団であるhCPC−CD117+、hCPC−CD90+、hCPC−CD90−、の細胞溶解物及び上清中の総可溶性コラーゲンの含有量を、製造業者のプロトコルの記載に従って、sircolアッセイ(Biocolor)を用いて測定した。標準曲線によりコラーゲンの量を算出した。
定量的結果は、平均±標準偏差(SD)又は標準誤差(SE)として表される。スチューデントt検定によって変数を分析した。GraphPad Prism5によって統計的有意性を評価し、P値≦0.05を統計的有意と考えた。
最近、細胞治療において用いられる幹細胞及び/又は前駆細胞が、心臓保護作用及び抗アポトーシス作用を発揮し、血管形成を増加させ、炎症プロセスを調節する可溶性因子の産生を通じて、損傷を受けた心筋に対して良い効果を及ぼすという概念が明らかになってきた。ゆえに、これらのプロセスを効率的に調節することが可能な細胞集団を見出すことが重要である。
以前の報告[4]と合致するように、hCPC−CD90−細胞の亜集団は、典型的な間葉マーカー(例えば、CD29、CD44、CD73及びCD200)を発現するが造血マーカー(例えば、CD14及びCD34)や免疫系マーカー(HLA−DR)を発現しない間葉系細胞の表現型特性を同様に維持する。表3は、フローサイトメトリーにおけるhCPC−CD90−の特性決定を示し、間葉マーカー(CD29、CD44、CD73、CD105及びCD200)、免疫系マーカー(HLA−DR)及び造血マーカー(CD34、CD45及びCD14)の発現を示す。データは、平均±SE(n=9)として表される。
機能的アッセイ及びフローサイトメトリーによってhCPC−CD90−細胞の分化を評価した。増殖後、cultrex合成マトリックス上で管構造を形成する能力について細胞を試験したが、他の分析された集団((hCPC−CD117+、hCPC−CD90+、hCPC−CD90−)に対して4時間後における新しい管構造分岐の数の有意な増加を示した(図18)。
異なるhCPC亜集団の血管新生促進能を、hCPC−ns、hCPC−CD117+、hCPC−CD90+及びhCPC−CD90−の上清中におけるサイトカイン含有量を比較することによって、多重分析の使用により試験した。表4に示されるように、hCPC及びそれらから誘導された亜集団の上清中に、多くの血管形成サイトカイン(SDF−1、Gro−α、SCF、LIF、IL−6、IL−8、IL−10、MCP−1、MIP−1b、RANTES、HGF及びVEGF)が見出された。
ジストロフィー患者(DMD)(Duchenne型ジストロフィー及びBecker型ジストロフィー)のiPS由来心筋細胞は、他の心筋疾患について記載されている[6]のと同様に心筋細胞死の増加及び腫瘍壊死因子(TNF)−αなどの炎症誘発性サイトカイン放出を含む、筋ジストロフィーにおいて典型的な一連の表現型欠陥を示す。複数のDMD病態生理学的経路と拮抗する細胞集団を発見することは、細胞治療における開発の可能性の観点において重要である。このために、ジストロフィー患者のiPS由来心筋細胞の存在下で、hCPCのいくつかの集団を培養した。共培養の開始から3日後及び7日後に上清を回収し、該上清を用いてジストロフィー障害において生じる心臓損傷の指標(培地中への心筋トロポニンI及びTNF−αの放出)を評価した。
異なるhCPC集団の心臓保護効果を評価するために、Duchenne型患者及びBecker型患者に由来するCM−d−hiPSCの存在下で、それらを共培養した。結果として、分析されたものの中では、hCPC−CD90−の亜集団が、培養の7日後における(培養におけるcTnIの放出で測定された)Duchenne型患者及びBecker型患者のCM−d−hiPSCの死滅を有意に減少させることが可能な唯一のものであることが示された(図21)。
異なるhCPC集団の抗炎症効果を評価するために、Duchenne型患者及びBecker型患者のCM−d−hiPSCの存在下で、細胞を共培養した。結果として、分析されたものの中では、hCPC−CD90−亜集団が、培養の3日後にDuchenne型患者のCM−d−hiPSCにおいて生じる損傷を有意に軽減すること(培地中におけるTNF−αの放出の減少によって示される)が可能な唯一のものであることが示された。表現型が損傷を受ける程度がより低いBecker型患者のCM−d−hiPSCに関して、それらは、考察された種々の亜集団(hCPC−CD117+、hCPC−CD90−及びhCPC−CD117+/CD90−)に対してポジティブに応答し、培地中におけるTNF−α放出の有意な減少を示した。これらの条件において、より著しい効果を誘発すると見受けられる細胞集団は、hCPC−CD117+/CD90−亜集団であり、続いてhCPC CD90−亜集団である(図22)。
間葉由来の前駆細胞を用いた細胞治療の枠組においては、これらの細胞が、コラーゲンを産生する筋線維芽細胞に分化する能力に目を向けることが必要である。なぜなら、この望ましくない現象が、損傷を受けた心筋の回復を損なう可能性があるからである。
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[4]Gambini E,Pompilio G,Biondi A,Alamanni F,Capogrossi MC,Agrifoglio M,Pesce M.Cardiovasc Res.Febbraio 2011.Vol.89(2):362−73.
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[6]Diwan A.,Tran T,Misra A MD.Curr Mol Med 2003;3:161−182.
Claims (17)
- 以下のステップを含む、ヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法:
a)心臓細胞の集団を含む心臓組織試料をミンチすること、
b)細胞懸濁液が得られるまで、酵素混合物を用いて前記心臓組織を4回、漸進的に消化し、そして30μm〜100μmの範囲内の大きさのフィルタにより濾過すること、
c)細胞懸濁液が得られるまで、酵素混合物を用いて、ステップb)で得られた残りの心臓組織を16時間さらに消化し、そして30μm〜100μmの範囲内の大きさのフィルタにより濾過すること、
d)心臓細胞を増殖させるのに適切な培地中で、ステップb)及びステップc)で得られた細胞懸濁液を培養すること、
e)心臓細胞を増殖させるのに適切な培地中において、ステップd)で得られた細胞懸濁液を酵素溶液又は非酵素溶液の存在下で予備的に増殖させること、
f)心臓細胞をさらに増殖させるのに適切な培地中において、ステップe)で得られた心臓細胞を酵素溶液又は非酵素溶液の存在下で二次的に増殖させること、
g)心臓前駆細胞の開始集団内で発現した1又は複数の表面抗原に対するモノクローナル抗体を使用して、陽性選択及び/又は陰性選択によって、心臓細胞の1又は複数の亜集団を単離すること。 - ステップa)の前記心臓組織試料が、右心耳生検、左心耳生検、中隔生検、心尖生検、及び心室生検からなる群から選択される、請求項1に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
- ステップa)を前記ミンチすることが手動又は自動で行われる、請求項1〜請求項2のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
- ステップb)及びステップc)の酵素混合物が基礎培地及び酵素溶液を含む、請求項1〜請求項3のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
- 前記酵素溶液がコラゲナーゼ及び/又はプロテアーゼの混合物を含む、請求項4に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
- 前記コラゲナーゼ及び/又はプロテアーゼ混合物が、コラゲナーゼI、コラゲナーゼII、コラゲナーゼIV、トリプシン、EDTA、アクターゼ(accutase)、コラゲナーゼA、ディスパーゼ(dispase)及びリベラーゼ(liberase)からなる群から選択される1又は複数の酵素を含む、請求項4〜請求項5のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団の単離のために方法。
- 前記基礎培地がHam’s/F12である、請求項4〜請求項6のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
- 前記コラゲナーゼ混合物が0.1〜3mg/mLの範囲内の濃度で存在する、請求項4〜請求項7のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
- ステップd)、ステップe)及びステップf)の前記心臓細胞を増殖させ、かつ拡大するのに適切な培地が、10%のウシ胎児血清、2mMのL−グルタチオン、5×10−3U/mLのヒトエリスロポイエチン、10ng/mLの塩基性線維芽細胞成長因子及び抗生物質が補充されたHam’s/F12培地である、請求項1〜請求項8のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
- 細胞増殖のためのステップe)及びステップf)の酵素溶液又は非酵素溶液が、Tryple(登録商標)Select、トリプシン及び/又はEDTAの混合物、細胞解離緩衝液、セルストリッパ、アクターゼ及びディスパーゼからなる群から選択される、請求項1〜請求項9のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
- ステップg)のモノクローナル抗体が、ビオチン又は蛍光分子(好ましくはFITC若しくはAPCから選択される蛍光分子)で標識されている、請求項1〜請求項10のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
- ステップg)の抗体が、
からなる群から選択される1又は複数の抗原に対するモノクローナル抗体である、請求項1〜請求項11のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。 - ステップg)の選択が免疫磁気分離によって行われる、請求項1〜請求項12のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
- ステップg)のモノクローナル抗体が、抗CD117及び/又は抗CD90である、請求項11〜請求項13のいずれか一項に記載のヒト心臓前駆細胞亜集団を単離する方法。
- CD90−及びCD117++/CD90−から選択される表面マーカープロファイルを特徴とする、請求項14に記載の単離方法によって得られるヒト心臓前駆細胞の亜集団。
- 単独で、又は、ヒト心臓前駆細胞の別の亜集団と組み合わせて、医療分野において使用するための請求項15に記載のヒト心臓前駆細胞の亜集団。
- 心臓血管細胞治療、又は心臓細胞移植及び/又は心臓組織移植の分野における使用のための、請求項16に記載のヒト心臓前駆細胞の亜集団。
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