JP2020515512A - ナノ粒子 - Google Patents

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Abstract

本出願は、プラズマから誘導されたナノ粒子を含むナノ粒子、及びコンジュゲートの形成におけるそれらの使用に関する。当該ナノ粒子は、例えば治療的、診断的、及び実験的方法において使用することができるコンジュゲートを形成する、多種多様な第２の種に安定的にコンジュゲートすることができる。【選択図】図４０

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月２１日に出願されたオーストラリア特許仮出願第２０１６９０５３０６号の優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、プラズマから誘導されたナノ粒子を含むナノ粒子、及びコンジュゲートの形成におけるそれらの使用に関する。
同じ構造内に複数の分子カーゴ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃａｒｇｏ）を送達することができる多官能性ナノキャリアは、多数の疾患において治療的及び診断的結果の両方を大きく改善すると期待される。しかしながら、現在のナノ粒子ベースの治療法及び診断法は、本質的に生物活性ではなく、まず間違いなく医薬品との直接的かつ単純なコンジュゲーションを可能にしない材料を依然として利用している。ナノ粒子（例えば、金、酸化鉄、ポリマー、量子ドットなど）の官能化は通常複雑であり、一般に、ナノキャリア表面及び関連するカーゴとの間の強固なコンジュゲーションを達成するために時間のかかる多段階プロトコルに依存する。
最近のナノメディシン研究の急成長にも関わらず、改善された性能、機能性、及び患者に対する安全性を備えた新規な生成物を提供することができる新しいナノ加工戦略が必要とされている。例えば、ヒトにおけるドラッグデリバリーの分野では、現在商業的に承認されている医薬ナノキャリアは、パッシブターゲティングの概念に基づいている。パッシブターゲティングでは、キャリアは、腫瘍または炎症領域などの病理学的部位の異常な漏出性血管系を貫通するためにそれらの小さいサイズに頼っている。これらのナノ粒子−薬物系は治療の有効性を高めることもあるが、他の代替治療と比較して、薬物の体内分布及び部位の蓄積に不備が残る。薬物副作用の減少及び用量忍容性の増加という期待は達成されていない。これに関して、用量忍容性が増加したアクティブターゲティング的かつ選択的送達を潜在的に提供することができるナノキャリアプラットフォームを開発するためのかなりの努力がなされてきた。
様々な治療用途において特異的かつ標的化された送達を達成するために、ナノ粒子は、標的細胞上に発現される特定の表面の特徴を認識し、それに結合する異なるターゲットリガンドによって官能化することができる。がんのような多因子性疾患における異なるシグナル伝達経路が複雑であることから、治療抵抗性を回避することができる多剤阻害剤ベースの治療法の開発への道が開かれてきた。重要なことに、多剤アプローチの有効性は、異なる薬剤が同じナノキャリア内または上に組み合わされると向上する。さらに、医用イメージングによる治療の間にナノ粒子系に対して優れた制御及び監視を達成することもまた望ましく、このことは、ナノ粒子が適切な造影剤も組み込むことが有利であろうことを意味する。したがって、同じナノ構造内に標的治療・診断及びイメージングの両方を統合する、調整された様々な官能性の混在を実現する能力を有する多官能性ナノ粒子の開発が強く求められている。しかしながら、同じナノキャリア上での複数の分子カーゴを結合する能力は、この分野では特に達成が難しいものである。
加えて、疾患における異常なタンパク質発現を調節するためのＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡを含む核酸の治療的送達にはかなりの余地がある。このアプローチはｉｎ ｖｉｔｒｏで非常に有望であることを示しているが、臨床的に、すなわちｉｎ ｖｉｖｏ手順の場合は、うまく変換されなかった。いくつかの欠点があるが、全身投与すると、これらの分子は、血中で非常に不安定であり、腎臓及び肝臓により濾過され、そしてそれらの高荷電状態は細胞膜を越える素早い輸送を妨げる。さらに、一度細胞膜を越えると、ｍＲＮＡ及びｓｉＲＮＡは活性のために細胞質に到達するためにエンドソームを回避する必要がある一方、ＤＮＡは核に入る必要がある。リポソームナノ粒子を含むナノ粒子プラットフォームは、中程度成功した送達を促進するために使用されてきたが、それでもなお、細胞内の毒性及び長期持続性に関する問題によって阻まれている。優先的に細胞質または核に標的を定める方法で、細胞膜を越えて、この種のカーゴを運ぶ能力を有するナノ粒子プラットフォームは、当該分野にとって著しい進歩を示すであろう。
強固な化学的コンジュゲーション部位を提供することができる表面を有するナノ粒子は、当該分野における重要な打開策となり得る。現在のプラットフォームにおいて、単一の構築物でナノ粒子上の複数の機能を組み合わせることに対する制限の１つは、ナノ粒子の実際の表面の化学的性質である。ナノキャリアの様々な官能性に対して優れた制御を達成するには、化学結合による付着は、弱い非共有結合戦略よりも好ましい。この課題を克服するために、多くの商業的プラットフォームによって採用されている一般的な戦略は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリマーによってナノ粒子をグラフトすることである。しかしながら、これらのコーティング及び機能化戦略は、安全性または廃棄上の問題をもたらす溶媒を含むことが多い、多段階で時間がかかり複雑なプロトコルを含む。さらに、ＰＥＧの表面濃度及び厚さに対する最適化、再現性、及び制御は、これらのコンジュゲーションプロセスを用いて達成することは通常困難である。典型的には、コーティングリガンドの末端基もまた、固定化することができる生体分子の範囲を制限する。他のコンジュゲーション戦略は、自己集合プロセスにおける分子とナノ粒子材料とのプレコンジュゲーションを含む。しかしながら、これら後者のアプローチはまた、有機溶媒の使用、ならびに分子カーゴの本来の立体構造及び官能性を損なう複数の精製工程にも依存している。複数の合成工程の使用により、官能化ナノ粒子の最終収率もまた低下し得る。
したがって、治療用及び／またはイメージング部分とのコンジュゲーションのために活性化されたナノ粒子を生成するための改良されたプロセスが必要とされている。理想的には、活性化ナノ粒子は、生体分子を含む溶液との直接インキュベーションなどの単純な手法を用いて複数の官能性分子によって官能化することができなければならない。
本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、物品などのいかなる記述も、これらの事項のいずれかもしくは全てが先行技術の基礎の一部を形成すること、または本出願の各請求項の優先日より前に存在していた本開示に関連する分野における共通の一般常識であることを承認するものとして解釈されるべきではない。
第１の態様では、以下の特徴：
約３４７０Ｇ〜約３５２０Ｇの範囲内に中心があり、及び／または約２．００１〜約２．００５の範囲内のｇ因子に対応する広い電子常磁性共鳴ピーク、
約１０１９〜約１０１５スピン／ｃｍ３の範囲の合成後約０時間〜約２時間以内に電子常磁性共鳴により測定されたスピン密度、
合成後約０時間〜約２４０時間以内に電子常磁性共鳴により測定された約１０１７〜約１０１５スピン／ｃｍ３の範囲であるスピン密度、
−約３６８０〜約２７００ｃｍ−１の範囲内；
−約１８００〜約１２００ｃｍ−１の範囲内；
−約２３３０〜約２０２０ｃｍ−１の範囲内；
−約１２００〜約１０１０ｃｍ−１の範囲内；及び／または
−約１０１０〜約７００ｃｍ−１の範囲内；
に中心がある赤外スペクトルの１つ以上の吸収帯、
−約３６００〜３１００ｃｍ−１の範囲内；及び／または
−約３１００〜２７００ｃｍ−１の範囲内；
に中心がある赤外スペクトルの１つ以上の吸収帯、
約−１００ｍＶ〜約＋１００ｍＶの範囲内のゼータ電位；
約２〜約１０のｐＨ範囲内の溶液中で測定された約−８０ｍＶ〜約＋８０ｍＶの範囲内のゼータ電位；または、
窒素：炭素の元素比が約０．０１：１〜約２：３であること
のうちの１つ以上を特徴とするナノ粒子ポリマーが、本明細書にて開示される。
第２の態様では、第１の態様の２つ以上のナノ粒子ポリマーを含む凝集体が、本明細書にて開示される。
第３の態様では、
第１の態様のナノ粒子ポリマー、または第２の態様の凝集体、及び
少なくとも１つの第２の種
を含むコンジュゲートが、本明細書にて開示される。
第４の態様では、第１の態様のナノ粒子ポリマー、第２の態様の凝集体、または第３の態様のコンジュゲート、及び薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤、もしくは結合剤を含む医薬組成物が、本明細書にて開示される。
第５の態様では、第１の態様のナノ粒子ポリマー、第２の態様の凝集体、または第３の態様のコンジュゲートを含む基質が、本明細書にて開示される。
第６の態様では、
第１の態様のナノ粒子ポリマー、
第２の態様の凝集体、または
それらの混合物の、
コンジュゲートの形成における使用が、本明細書にて開示される。
第７の態様では、
ｉ）反応チャンバ内に少なくとも１種のガスを提供することと、
ｉｉ）前記反応チャンバ内にプラズマを発生させるように第１電極に電力を供給することと、
ｉｉｉ）前記反応チャンバ内の第２電極に電圧を印加することと、
ｉｖ）得られたナノ粒子ポリマーまたは凝集体を収集することと、を含み、
前記少なくとも１種のガスが有機ガスを含む、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体の調製方法が、本明細書にて開示される。
第８の態様では、
ｉ）反応チャンバ内に少なくとも１種のガスを提供することと、
ｉｉ）前記反応チャンバ内に容量結合プラズマを発生させるように前記反応チャンバ内の第１電極に高周波（ＲＦ）電力を供給することと、
ｉｉｉ）前記反応チャンバ内の第２電極に電圧を印加することと、
ｉｖ）得られたナノ粒子ポリマーまたは凝集体を収集することと、を含み、
前記少なくとも１種のガスが有機ガスを含む、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体の調製方法が、本明細書にて開示される。
第９の態様では、
ｉ）反応チャンバ内に少なくとも１種のガスを提供することと、
ｉｉ）前記反応チャンバ内に誘導結合プラズマを発生させるように高周波（ＲＦ）電力を供給することと、
ｉｉｉ）前記反応チャンバ内の第２電極に電圧を印加することと、
ｉｖ）得られたナノＰ３材料を収集することと、を含み、
前記少なくとも１種のガスが有機ガスを含む、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体の調製方法が、本明細書にて開示される。
第１０の態様では、第８または第９の態様に記載の方法によって作製されたナノ粒子ポリマーまたは凝集体が、本明細書にて開示される。
第１１の態様では、
ｉ）第１の態様のナノ粒子ポリマー、第２の態様の凝集体、または第１０の態様のナノ粒子ポリマーもしくは凝集体、及び
ｉｉ）少なくとも１つの第２の種
を提供することと、
ナノ粒子ポリマーまたは凝集体と少なくとも１つの第２の種とが物理的または化学的に互いに結び付くように、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体と少なくとも１つの第２の種とを接触させることと、
を含むコンジュゲートの形成方法が、本明細書にて開示される。
第１２の態様では、第１１の態様に記載の方法により作製されたコンジュゲートが、本明細書にて開示される。
第１３の態様では、第１の態様のナノ粒子ポリマー、第２の態様の凝集体、第３の態様もしくは第１２の態様のコンジュゲート、第４の態様の医薬組成物、または第１０の態様のナノ粒子ポリマーもしくは凝集体を、対象に投与する工程を含む、疾患、障害、または状態の１つ以上の症状に罹患している、罹患しやすい、またはそれを示す対象を治療する方法が、本明細書にて開示される。
第１４の態様では、対象における疾患、障害、または状態を治療するための医薬の形成における、第１の態様のナノ粒子ポリマー、第２の態様の凝集体、第３の態様もしくは第１２の態様のコンジュゲート、または第１０の態様のナノ粒子ポリマーもしくは凝集体の使用が、本明細書にて開示される。
第１５の態様では、少なくとも１つの第２の種が造影剤である、第３の態様もしくは第１２の態様のコンジュゲート、または第４の態様の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、対象内の領域のイメージング方法が、本明細書にて開示される。
第１６の態様では、対象における疾患、障害、または状態を治療における使用のための、第１の態様のナノ粒子ポリマー、第２の態様の凝集体、第３の態様もしくは第１２の態様のコンジュゲート、第４の態様の医薬組成物、または第１０の態様のナノ粒子ポリマーもしくは凝集体が、本明細書にて開示される。
第１７の態様では、薬剤を安定化させる方法であって、第１の態様のナノ粒子ポリマー、第２の態様の凝集体、第３の態様もしくは第１２の態様のコンジュゲート、または第１０の態様のナノ粒子ポリマーもしくは凝集体に該薬剤をコンジュゲートすることを含む方法が、本明細書にて開示される。薬剤は、本明細書に記載の第２の種と同じであってもよい。
本開示の各態様の実施形態は、必要な変更を加えて、他の各態様にも同様に適用され得ることが理解されよう。
本発明の様々な実施形態が利用され得ることが理解され得るが、以下、次の図面に基づいて本発明のいくつかの実施例を説明する。
ナノＰ３粒子のスケール化生産及び臨床用途の治療薬及び診断薬としてのその使用である。 プラズマ放電におけるナノＰ３粒子の形成、成長、及び収集を示す概略図である。 ナノＰ３材料を生成するために使用され得る装置の概略図である。 異なる収集容器を使用してナノＰ３材料を得るために使用され得る装置の概略図である。 コレクタウェルの外側及び内側のナノＰ３に作用する力を示す概略図である。 異なる寸法のコレクタウェルにおけるナノＰ３の形成を示す概略図である。 プラズマの発光スペクトル（Ａ）；分子発光帯の時間的プロファイル（Ｂ）；及び分子イオンと他の非荷電種に関連する発光強度間の比の時間的プロファイル（Ｃ）を示すスペクトルである。 コレクタの単位面積あたりのナノ粒子の数及びナノ粒子形成中の異なる時点で３８０ｎｍで測定された発光強度（Ａ）；ならびに動的光散乱法によって測定された放電中の異なる時点で収集されたナノ粒子のサイズ分布（Ｂ）を示すグラフである。 ナノ粒子コレクタに印加されたバイアスの関数としてのクラスタ凝集（段階２）及び粒子除去（段階３）の期間を示すグラフである（Ｂ）。 ナノ粒子及び凝集生成物のサイズ分析、ならびに得られた粒子材料の形態である。 ２ｓｃｃｍのアセチレン流速を使用してＸＰＳによって測定した場合に作製されたナノ粒子の典型的なＣ１ｓ（Ａ）ピーク及びＮ１ｓ（Ｂ）ピーク；ならびにナノ粒子のＦＴＩＲスペクトル（Ｃ）を示すグラフである。 ナノ粒子ポリマー及び凝集体のＥＰＲスペクトル（Ａ）、ならびに異なる媒体中のラジカルのキネティクス（Ｂ）である。 プラズマに結合された様々な動作圧力及び電力に対応する、生成物の形成中のＣＮラジカル分子及びＮ２ ＋分子イオンに関連する発光強度の時間的プロファイルを監視したものである。 図１３と同様にして時間的プロファイルを監視するが、放電に結合した固定５０Ｗでのアセチレン流速の種々の値についてのものである。 図１４と同様であるが放電に結合した固定７５Ｗでの時間的プロファイルを監視したものである。 図１４と同様であるが放電に結合した固定１００Ｗでの時間的プロファイルを監視したものである。 アセチレン流速の関数としての、５０、７５及び１００Ｗに対する振動の周期（Ａ及びＢ）ならびにナノ粒子の収率（Ｃ）である。 ５０、７５及び１００Ｗで１〜８ｓｃｃｍのモノマー流速範囲内でのナノ粒子ポリマー及び凝集体生成中のＣＮラジカル分子及びＮ２ ＋分子イオンの最大発光強度及び最小発光強度である。 様々な値の窒素流速に対するナノ粒子ポリマー及び凝集体形成中のＣＮラジカル分子及びＮ２ ＋分子イオンに関連する発光強度の時間的プロファイルである。 ナノ粒子ポリマー及び凝集体作製中の振動周期、サイズ、及びゼータ電位におけるＮ２の影響である。 ナノＰ３粒子を含有する溶液のｐＨの関数としてのナノＰ３粒子のゼータ電位である。 ナノ粒子サイズ（Ａ）及び収率（Ｂ）における放電への結合電力の効果である。 異なる結合電力及びモノマー流速で調製されたナノ粒子上の炭素、窒素、及び酸素分率である。 異なる保管期間でのナノ粒子のＦＴＩＲ測定値である。 アセチレン及びアルゴンのみの放電で作製されたナノ粒子のＦＴＩＲ測定値である。 ＵＶ−ＶＩＳ−ＮＩＲの範囲内のナノＰ３自己蛍光である。 ナノＰ３蛍光の強度は経時的に増加する。 様々なカーゴ分子量に対するナノＰ３の単位表面積あたりのカーゴ分子数である。 ナノＰ３に結合した総カーゴ質量は、インキュベーションプロセス中に溶液に加えられた質量と共に増加する。 インドシアニングリーン（ＩＣＧ）を用いた結合キネティクス実験である。 ＩＣＧによって例示されたナノＰ３の保管寿命である。 遊離インドシアニングリーン（ＩＣＧ）及びＩＣＧ結合ナノＰ３のキネティクスである。 ナノＰ３の結合能はｐＨを変えることによって調節され得る。 異なる媒体中の凝集したナノ粒子ポリマーの凝集挙動である。 段階希釈したナノ粒子ポリマー及び凝集体の存在下での細胞傷害性である。 抗体によるナノＰ３の単一官能化の概略図である。 薬物によるナノＰ３の単一官能化の概略図である。 抗体及び薬物によるナノＰ３の二重官能化を示す概略図である。 二次電子（Ａ）及び後方散乱モード（Ｂ）で金標識ＩｇＧ抗体と共にインキュベートしたナノ粒子ポリマーの走査型電子顕微鏡画像である。 走査型電子顕微鏡での二次電子の検出を使用して撮像されたナノＰ３及び異なるサイズの２つの金抗体（実線の矢印２０ｎｍ、縞矢印６ｎｍ）である。 蛍光イメージングの前に、ヒト冠動脈内皮細胞（ｈＣＡＥＣ，上段）及び乳癌細胞株ＭＣＦ７（下段）と共にインキュベートした抗体官能化ナノＰ３である。 ナノ粒子にコンジュゲートした場合のドキソルビシン（Ｄｏｘ）の蛍光損失（Ａ）；及び細胞生存率アッセイ（Ｂ）である。 ＩｇＧ−４８８及びＩｇＧ−５９４とのナノＰ３コンジュゲーションである。 抗体及び薬物によるナノＰ３の二重官能化を示す概略図である。 パクリタキセル−４８８及びＩｇＧ−５９４とのナノＰ３コンジュゲーションに関する細胞研究である。 ナノＰ３とのＩｇＧ−４８８、ＩｇＧ−Ｃｙ５、及びＩｇＧ−Ｃｙ７のコンジュゲーション、ならびにＭＣＦ７細胞を用いた細胞研究である。 ナノＰ３を用いたヒト冠動脈細胞におけるプラスミドの輸送の研究である。 異なるサイズのナノＰ３に結合したヒト胎児腎細胞におけるプラスミドの輸送の研究である。 ナノＰ３材料及びそのコンジュゲートを送達したマウスのｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳイメージング）である。 ナノＰ３材料にコンジュゲートしたインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を送達したマウスのｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳイメージング）である。 ナノＰ３材料及びそのコンジュゲートを送達したマウスのｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳイメージング）である。 ヒト冠動脈内皮細胞内のナノＰ３のＳＥＭ画像（Ａ）；及び切片の３Ｄ再構築は、細胞質内のナノＰ３の均一な分布を示す（Ｂ）。 ＨＣＡＥＣ（１）；ＭＣＦ−１０Ａ（２）；及びＭＣＦ−７（３）についてのナノＰ３の存在下での細胞生存率（Ｃ）；ならびにアクチン−ファロイジンによって染色された細胞の代表的な画像（Ｄ）である。 キャリアなし；金ナノ粒子キャリア；ポリスチレンビーズ；及びナノＰ３とのルシフェラーゼ結合の測定である。 ナノＰ３材料が複数の第２の種に結合する能力（Ａ）、及びナノＰ３抗体とＩｇＧ４８８抗体との間の結合能の計算（Ｂ）を示す概略図である。 高分解能ＳＥＭ画像は、サイズが４０ｎｍの１つのＩｇＧ−金二次抗体（破線の円形の囲いにて示される）；サイズが４０ｎｍ及び２０ｎｍの２つのＩｇＧ−金二次抗体（それぞれ破線の円形及び三角形の囲いにて示される）；ならびにサイズが４０ｎｍ、２０ｎｍ、及び６ｎｍの３つのＩｇＧ−金二次抗体（それぞれ破線の円形、三角形、及び長方形の囲いにて示される）を用いたナノＰ３の官能化を示す（Ｃ）；ならびにナノＰ３単独及び以下のパクリタキセル、ＩｇＧ−Ｃｙ５、及びＩｇＧ−Ｃｙ７による官能化のゼータ電位測定値（Ｄ）である。 ＭＣＦ１０Ａ細胞及び一重、二重及び三重官能化ナノＰ３材料を用いた細胞研究である。 ナノＰ３粒子及び核局在化配列を含むコンジュゲートによって処理した後の染色したヒト臍帯静脈内皮細胞である。 ＶＥＧＦに対するｓｉＲＮＡとコンジュゲートしたナノＰ３である。 ナノＰ３粒子及びＶＥＧＦに対するｓｉＲＮＡを含むコンジュゲートによって処理した後の染色したヒト臍帯静脈内皮細胞である。 ナノＰ３及び金ナノ粒子への西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のコンジュゲーションである。 初代マウス線維芽細胞におけるナノＰ３にコンジュゲートしたルシフェラーゼ（ｓｉＬｕｃｉ）に対する低分子干渉ＲＮＡの送達である。 ＩＰＳＣ由来ヒト内皮細胞におけるルシフェラーゼ（ｓｉＬｕｃｉ）ナノＰ３に対する低分子干渉ＲＮＡの送達である。 倍率を拡大した、電界紡糸ポリウレタン（画像ａ、ｂ及びｃ）及びナノＰ３が付着した電界紡糸ポリウレタン（画像ｄ、ｅ及びｆ）のＳＥＭ画像である。 ナノＰ３を含む様々な材料の存在下で免疫蛍光ＣＤ３１で処理し、１４日目に染色した内皮細胞（ａ）；及び該材料への曝露後のカプセル内の平均新生血管数（ｂ）である。 シルク電界紡糸足場上のナノＰ３のＳＥＭ画像である。
本発明者らは、「ナノＰ３（ｎａｎｏＰ３）」、「ナノＰ３（ＮａｎｏＰ３）」、「ナノＰ３（ｎａｎｏＰ３）材料」、または「ナノＰ３（ＮａｎｏＰ３）材料」と本明細書に記載されるナノ粒子材料の作製を示した。これらのナノＰ３材料は、容易に官能化し得る多機能かつ多官能性ナノキャリアの一種として機能することができる。ナノＰ３材料は、ナノＰ３材料の表面に拡散するナノＰ３材料内に埋め込まれたラジカルとの反応を通じて、及び／またはナノＰ３材料、またはそれらのコンジュゲートの表面に形成された部分／官能基との反応によって、広範囲の生体分子及び薬物に結合することができる。
本明細書に記載のナノＰ３材料の１つの重要な利点は、該ナノＰ３材料が長期間それらの中に埋め込まれたラジカルを保持できることである。時間の経過とともに、これらのラジカルは表面に拡散し、近接する種と反応する。該材料が適切な条件で保管される場合（例えば、不活性雰囲気下；収集直後に真空条件下でプラズマチャンバ内に該材料を含むバイアルを密封することにより；及び／または、より低温で）、ラジカルは、数週間、数ヶ月、または場合によっては数年間保持される可能性がある。ラジカルの寿命の延長とは、コンジュゲートが特定の診断試験または治療方法に必要とされるような時間までナノＰ３材料を保管することができることを意味する。このことは、ナノＰ３材料の作製が、特定の用途または治療レジメンにコンジュゲートが必要とされるのと同時に起こる必要がないことを意味する。
有利には、ナノＰ３と１つ以上の第２の種、例えば医薬品、造影剤、及び／またはペプチドとの間のコンジュゲートは、ワンポット反応で作製することができる。活性プラズマ−気相中に生成されたより小さな炭素系クラスタ（ナノ粒子ポリマー）が組み合わさって凝集体を形成する急速成長段階中に、ラジカルがナノ構造中に形成され保存されると考えられる。ナノＰ３は、その表面上に固定化された生体分子の生物活性を維持することができ、細胞傷害性を誘導することなく異なる細胞型によって容易に内在化され得る。逆に、ナノＰ３とコンジュゲートした場合、ドキソルビシンのような細胞傷害性薬剤は、がん細胞を殺すことができる。加えて、ナノＰ３は細胞内にサイレンシングＲＮＡを送達することができ、細胞取り込みの４８時間後、タンパク質発現において著しいノックダウンをもたらす。さらに、ナノＰ３の共有結合能及び固定化生体分子の生物活性は、凍結乾燥保存後少なくとも数ヶ月間維持される。
本明細書に開示されたプロセス、例えば記載されたプラズマベースのプロセスは、様々なナノメディシン用途のための複数の機能を統合することができる有利かつ調整可能な物理的、化学的、及び形態的特性を有するナノ粒子を効果的に製造及び収集するために使用できる。
定義
本明細書全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと」などの変形形態は、記載された要素、整数、もしくは工程、または要素、整数、もしくは工程のグループを包含することを意味するが、他の要素、整数、もしくは工程、または要素、整数、もしくは工程のグループを除外することを意味するものではないことが理解されよう。
本明細書全体を通じて、用語「から本質的になる」は、特許請求された組成物の特性に実質的に影響を与えるであろう要素を除外することを意図しているが、特性に実質的に影響を及ぼさない要素は含み得る。
本明細書の定義に関して、記載のない限り、または文脈から暗示されない限り、定義された用語及び語句は提供された意味を含む。特に記載のない限り、または文脈から明らかでない限り、以下の用語及び語句は、その用語または語句が当業者によって獲得されたという意味を排除するものではない。定義は、特定の実施形態を説明するのを助けるために提供され、特許請求された発明を限定することを意図したものではない。なぜなら、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ制限されるからである。さらに、文脈により特に要求されない限り、単数の用語は、複数を含み、複数の用語は、単数を含むものとする。
本明細書全体を通じて、本発明の様々な態様及び構成要素は範囲形式で提示することができる。範囲形式は便宜上含まれており、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は、具体的に示されていない限り、全ての可能な部分的範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１〜５のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜５、３〜５などのような具体的に開示された部分的範囲、ならびに整数が要求される場合または文脈から暗示される場合を除いて、列挙された範囲内の個々の数及び部分的な数、例えば１、２、３、４、５、５．５、及び６を有すると考えられるべきである。これは開示された範囲の広さを問わず適用される。特定の値が必要な場合、これらは当該明細書中に示される。
「約」
本明細書では、用語「約」は、その用語に関連する任意の値（複数可）における１０％の許容範囲を包含する。
「炭化水素」
本明細書に開示される炭化水素モノマーは、水素原子と炭素原子のみからなるモノマーであると理解される。炭化水素の例には、アルケン、アルキン、シクロアルケン、芳香族化合物、またはそれらの混合物が含まれる。
「凝集体」
本明細書で使用される場合、用語「凝集体」は、特に明記しない限り、またはそれが使用されている文脈から明らかでない限り、複数のナノ粒子ポリマーを含み、５ｎｍ〜１００μｍの範囲内のサイズ、例えば約５ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲内のサイズを有する粒子を意味するものとする。
「コンジュゲート」
本明細書では、用語「コンジュゲート」は、ナノ粒子ポリマー、またはナノ粒子ポリマーを含む凝集体への１つ以上の化合物の付着によって形成された分子を指す。「１つ以上の化合物」は、本明細書で定義されるような第２の種であり得る。付着は、共有結合または静電的相互作用を介したものであり得る。
「モノマー」
用語「モノマー」は、特に明記しない限り、プラズマ中でのフラグメンテーション及び反応プロセスによって生成され得る１つ以上の反応性官能基によって反応してポリマーを形成することができるモノマー化合物を意味すると理解されよう。
「ナノＰ３」
用語「ナノＰ３」は、特に明記しない限り、またはそれが使用されている文脈から明らかでない限り、１００ミクロン未満のサイズを有するナノ粒子材料を指し、例えば、ナノＰ３は約５〜５００ｎｍのサイズを有し得る。記載のない限り、または文脈から暗示されない限り、用語「ナノＰ３」は、特に明記しない限り、またはそれが使用されている文脈から明らかでない限り、本明細書で定義されるような「ナノ粒子ポリマー」及び「凝集体」の両方を包含する。用語「ナノＰ３」は、「ナノ粒子材料」と互換的に使用され得る。好ましい一実施形態では、ナノ粒子材料はプラズマポリマーを含む。プラズマポリマーは、プラズマ中でのフラグメントの凝縮によって形成され得、該材料は、１つ以上の化合物、例えば有機種または有機金属種を含む１つ以上の「第２の種」を共有結合することができる。
「ナノ粒子ポリマー」
本明細書では、用語「ナノ粒子ポリマー」は、本明細書で定義されるモノマーによって形成されたポリマーを指し、該ナノ粒子ポリマーは、約１ｎｍ〜約５０ｎｍの範囲の粒径を有する。好ましい一実施形態では、ナノ粒子ポリマーは、プラズマ中でのフラグメントの凝縮によって形成され、該材料は、有機種または有機金属種を含む１つ以上の化合物を共有結合することができる。
「ポリマー」
用語「ポリマー」は、重合の過程を通じて生成される、不均一であり得る、及び／または無秩序構造に配置され得る繰り返し構造単位からなる化合物または化合物の混合物を指す。本発明において有用な好適なポリマーは全体を通して記載されている。一実施形態では、ポリマーは、繰り返し単位が比較的無秩序な構造に集合したプラズマポリマーである。
「プラズマ」
用語「プラズマ」は、一般に、イオン、電子、中性種、及び放射線の混合物を含む（部分的に）イオン化されたガス様集合体を指す。本明細書で言及するプラズマは少なくとも１つのモノマーを含む。
「プラズマポリマー」
本明細書において「プラズマポリマー」は、１つ以上のモノマーを含むプラズマから誘導されたポリマーである。
モノマー
本明細書に記載のナノＰ３材料は、１つ以上のモノマーから誘導される。
一実施形態では、１つ以上のモノマーは、ナノＰ３材料を形成するために気体形態で使用される。
モノマーは炭化水素であり得る。炭化水素の例には、アルケン、アルキン、シクロアルケン、及びシクロアルキンが挙げられる。
適切なアルケンモノマーの例としては、エチレン、プロペン、１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン、１−ヘプテン、１−オクテン、１−ノネン、１−デセン、これらの異性体、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
適切なアルキンモノマーの例としては、エチン（アセチレン）、プロピン、１−ブチン、１−ペンチン、１−ヘキシン、１−ヘプチン、１−オクチン、１−ノニン １−デシン、これらの異性体、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
適切なシクロアルケンモノマーの例としては、シクロプロペン、シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテン、１，３−シクロヘキサジエン、１，４−シクロヘキサジエン、１，５−シクロオクタジエン、これらの異性体、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
適切なシクロアルキンモノマーの例としては、シクロヘプチン、シクロオクチン、シクロノニン、これらの異性体、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、アルケンはモノマーとして使用される。アルケンは、ナノ粒子ポリマーの形成に利用される唯一のモノマーであり得るか、またはアルケンは、コポリマー、例えば別のアルケン及び／またはアルキン、シクロアルケンもしくはシクロアルキンを形成するために少なくとも１種の他のモノマーの存在下で使用され得る。
一実施形態では、アルキンはモノマーとして使用される。アルキンは、ナノ粒子ポリマーの形成に利用される唯一のモノマーであり得るか、またはアルキンは、コポリマー、例えば別のアルキン及び／またはアルケン、シクロアルケンもしくはシクロアルキンを形成するために少なくとも１種の他のモノマーの存在下で使用され得る。さらなる実施形態では、アセチレンは、それ自体で、または少なくとも１種の他のモノマーの存在下で、モノマーとして使用される。
別の実施形態では、アセチレンは、少なくとも１種の他のモノマー、例えばアルケン、アルキン、シクロアルケンまたはシクロアルキンである少なくとも１種の他のモノマーと組み合わせてモノマーとして使用される。
一実施形態では、シクロアルケンはモノマーとして使用される。シクロアルケンは、ナノ粒子ポリマーの形成に利用される唯一のモノマーであり得るか、またはコポリマー、例えば別のシクロアルケン及び／またはアルケン、アルキンもしくはシクロアルキンを形成するために少なくとも１種の他のモノマーの存在下で使用され得る。
一実施形態では、シクロアルキンはモノマーとして使用される。シクロアルキンは、ナノ粒子ポリマーの形成に利用される唯一のモノマーであり得るか、またはコポリマー、例えば別のシクロアルキン及び／またはアルケン、アルキンもしくはシクロアルケンを形成するために少なくとも１種の他のモノマーの存在下で使用され得る。
ナノＰ３を形成するために使用され得る他のモノマーとしては、ペルフルオロカーボン、エーテル、エステル、アミン、アルコールまたはカルボン酸が挙げられる。
適切なペルフルオロカーボンの例としては、ペルフルオロアリルベンゼンが挙げられるが、これらに限定されない。
適切なエーテルの例としては、ジエチレングリコールビニルエーテル、ジエチレングリコールジビニルエーテル、ジエチレングリコールモノアリルエーテル、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
適切なアミンの例としては、アリルアミン、シクロプロピルアミン、ポリ（ビニルアミン）、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
適切なアルコールの例としては、ポリ（ビニルアルコール）、アリルアルコール、エタノール、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
適切なカルボン酸の例としては、アクリル酸が挙げられるが、これに限定されない。
ナノＰ３
ナノＰ３材料は、ホモポリマーまたはコポリマーであり得る。一実施形態では、ナノＰ３材料は、ホモポリマーである。別の実施形態では、ナノＰ３材料は、コポリマーである。
一実施形態では、ナノＰ３は、本明細書に記載の１つ以上のモノマーを含むプラズマから誘導され、最初は気体形態で存在している。１種以上の不活性ガス、例えばヘリウム、ネオンまたはアルゴンが、１つ以上のモノマーと共に任意に存在し得る。
ナノ粒子ポリマーは、窒素のような周期表の１５、１６または１７族のガスの存在下で形成され得る。このガスのフラグメントは、ナノ粒子ポリマーに導入されてもよい。例えば、窒素の存在は、ナノ粒子ポリマーまたはナノＰ３材料中でアミン、イミンもしくはニトリル基、またはこれらの混合物の存在下で生じ得る。したがって、本明細書に開示されるナノ粒子ポリマーは窒素を含み得る。
窒素は、キャリアとしてだけでなく、反応性の非重合性ガスとしても適していることが判明した。このことは、窒素もまたナノ粒子材料に取り込まれ得、得られた官能化ナノ粒子材料に特定の物理化学的特性を付与することを意味する。さらに、窒素は、窒素が使用されない場合には不可能であろう異なる様式のナノ粒子形成を可能にするとも考えられている。窒素と同じ族に含まれるもののような他のガスを含むこともまた、ナノ粒子形成メカニズム及び物理化学的特性を調整する上でさらなる自由度を提供することが予期される。
一実施形態では、ナノＰ３材料は、本明細書に記載の少なくとも１つのモノマーを含むプラズマから誘導される。必要に応じて、ナノＰ３材料は、ガス、例えば窒素の存在下で形成され、ガスのフラグメントはナノ粒子ポリマーに組み込まれる。
ナノＰ３材料は、約０．０１：１〜約２：３の窒素：炭素の元素比を有し得る。例えば、ナノ粒子ポリマーは、約０．０５〜約１、または約０．１〜約１、または約０．１５〜約１、または約０．２〜約１、または約０．２５〜約１、または約０．３〜約１、または約０．３５〜約１、または約０．４〜約１、または約０．４５〜約１、または約０．５〜約１、または約０．５５〜約１、または約０．６〜約１、または約０．６５〜約１の窒素：炭素の元素比を有し得る。あるいは、ナノ粒子ポリマーは、約０．１〜約１：２の窒素：炭素の元素比を有し得る。
本明細書に記載のナノＰ３材料は、好ましくは、１つ以上の化合物、例えば有機化合物もしくは有機金属化合物、または本明細書で定義されるような第２の種を結合することができる少なくとも１つの結合部位を含む。
一実施形態では、本明細書に記載のナノＰ３材料は、少なくとも、１つ以上の化合物を結合することができる結合部位を含み、該結合部位は、有機化合物もしくは有機金属化合物、または本明細書で定義されるような第２の種を結合することができる不対電子を含む。
ナノＰ３材料は、ポリマー中に不対電子を含み得る。これらの不対電子は、ナノ粒子の表面上または表面近くにあり得る。不対電子は、ナノ粒子材料の粒子内で４０ｎｍ以下、または表面の約３０、２０もしくは１０ｎｍ以内、または表面から約１０〜約４０ｎｍの間、または表面から約１０〜３０、２０〜４０、もしくは２０〜３０ｎｍの間、または表面から約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、もしくは４０ｎｍの深さにあり得る。不対電子は、約０〜約４０ｎｍの様々な深さにあり得る。場合によっては、不対電子は、４０ｎｍを超える深さにあり得る。不対電子は、ナノ粒子材料の体積中にあり得る。これにより、該材料を有機種または有機金属種などの第２の種と反応させて、該種をナノ粒子ポリマーに共有結合させてコンジュゲートを形成させることができる。
一実施形態では、ナノＰ３材料、平均直径が約５ｎｍ〜約５００ｎｍであるナノＰ３材料の粒子、有機プラズマポリマーを含む該ナノＰ３材料、及びこれにより有機種または有機金属種と共有結合することができる不対電子を含む該ナノＰ３（ナノ粒子ポリマーまたはその凝集体）が提供される。
別の実施形態では、ナノ粒子材料またはナノＰ３材料は、第２の種を化学的または物理的に結合することができる少なくとも１つの官能性部分を含む。
ナノＰ３材料は、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍ未満の平均直径を有し得る。例えば、ナノＰ３材料は、約５ｎｍ〜約５００ｎｍ、もしくは約５〜５００、５０〜５００、１００〜５００、２００〜５００、５〜２００、５〜１００、５〜５０、５〜２０、２０〜１００、１００〜３００もしくは２００〜４００ｎｍ、例えば、約５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０もしくは５００ｎｍ、または約５〜約４００ｎｍ、もしくは約５〜約３００ｎｍ、もしくは約５〜約２００ｎｍ、もしくは約５〜約１００ｎｍ、もしくは約１００〜約５００ｎｍ、もしくは約１００〜約４００ｎｍ、もしくは約１００〜約３００ｎｍ、もしくは約１００〜約２００ｎｍ、もしくは約２００〜約４００ｎｍ、もしくは約２００ｎｍ〜約３００ｎｍの範囲内、またはこれらの混合物の平均直径を有し得る。
ナノＰ３材料のサイズは、走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡、低角度レーザー光散乱、光子相関分光法、微分型移動度分析、または他の適切な技術によって測定され得る。ナノＰ３材料の粒子は、狭い粒度分布または広い粒度分布を有し得る。粒度分布の標準偏差は、平均粒径の約１％〜約５００％の間、または約１〜２００、１〜１００、１〜５０、１〜２０、１〜１０、１〜５、１〜２、１０〜５００、２０〜５００、５０〜５００、１００〜５００、２００〜５００、１０〜１００、１０〜５０または５０〜１００％の間、例えば、約１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００％であり得る。場合によっては、ナノＰ３材料の粒子は、ほぼ単分散性であり得る、すなわち、全ての粒子はほぼ同じサイズ（例えば、約１０％、または約５％、または約２％以内の同様の直径）であり得る。
ナノＰ３材料は有機プラズマポリマーを含み得る。プラズマポリマーは、不均一で、高密度な、高度に架橋されたネットワークを特徴とする。プラズマポリマーは非晶質であり得る。このプラズマポリマーは、ガス混合物中の有機ガス及び他の反応性ガスからプラズマ中に生成された活性種の反応（例えば、イオン化及びフラグメンテーション）によって、またはガス混合物中のイオン化及びフラグメンテーションから生じるプラズマ／ガス混合物中の反応種によって生成され得る。
ナノＰ３材料は、これらに限定されないが、電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法、赤外分光法（例えばフーリエ変換赤外分光法）、ラマン分光法、ＵＶ−ＶＩＳ分光法、元素分析（例えばＸ線光電子分光法）、軟Ｘ線分光法、ゼータ電位の決定、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、質量分析法、ゲル浸透クロマトグラフィー、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、低角度レーザー光散乱、光子相関分光法、微分型移動度分析、弾性反跳検出分析（ＥＲＤＡ）、または中性子散乱を含む多くの方法によって特徴付けることができる。
ナノＰ３材料（例えば、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体）は、以下の特徴：
約３４７０Ｇ〜約３５２０Ｇの範囲内に中心があり、及び／または約２．００１〜約２．００５の範囲内のｇ因子に対応する広い電子常磁性共鳴ピーク、
約１０１９〜約１０１５スピン／ｃｍ３の範囲の合成後約０時間〜約２時間以内に電子常磁性共鳴により測定されたスピン密度、
合成後約０時間〜約２４０時間以内に電子常磁性共鳴により測定された約１０１７〜約１０１５スピン／ｃｍ３の範囲であるスピン密度、
−約３６８０〜約２７００ｃｍ−１の範囲内；
−約１８００〜約１２００ｃｍ−１の範囲内；
−約２３３０〜約２０２０ｃｍ−１の範囲内；
−約１２００〜約１０１０ｃｍ−１の範囲内；及び／または
−約１０１０〜約７００ｃｍ−１の範囲内；
に中心がある赤外スペクトルの１つ以上の吸収帯、
−約３６００〜３１００ｃｍ−１の範囲内；及び／または
−約３１００〜２７００ｃｍ−１の範囲内；
に中心がある赤外スペクトルの１つ以上の吸収帯、
約−１００ｍＶ〜約＋１００ｍＶの範囲内のゼータ電位；
約２〜約１０のｐＨ範囲内の溶液中で測定された約−８０ｍＶ〜約＋８０ｍＶの範囲内のゼータ電位；または
窒素：炭素の元素比が約０．０１：１〜約２：３であること、
のうちの１つ以上を特徴とし得る。
一実施形態では、ナノＰ３材料、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体は、ＥＰＲ分光法を用いて特徴付けられる。ナノ粒子ポリマーまたは凝集体は、約３４７０Ｇ〜約３５２０Ｇの範囲内に中心があり、及び／または約２．００１〜約２．００５の範囲内のｇ因子に対応する広い電子常磁性共鳴ピークを示し得る。
一実施形態では、ナノＰ３材料、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体は、合成後約０時間〜約２時間以内にＥＰＲ分光法により測定されたスピン密度が約１０１９〜約１０１５スピン／ｃｍ３の範囲を有する。測定は、合成後約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、または約１２０分に実施され得る。
一実施形態では、ナノＰ３材料、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体は、合成後約０時間〜約２４０時間以内に電子常磁性共鳴により測定された約１０１７〜約１０１５スピン／ｃｍ３の範囲のスピン密度を有する。測定は、合成後約０．５、約１、約２、約４、約５、約６、約８、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０時間、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、または約２４０時間に実施され得る。
別の実施形態では、ナノＰ３材料、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体は、赤外分光法（例えばフーリエ変換赤外分光法）を用いて特徴付けられる。例えば、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体は、
−約３６８０〜約２７００ｃｍ−１の範囲内；
−約１８００〜約１２００ｃｍ−１の範囲内；
−約２３３０〜約２０２０ｃｍ−１の範囲内；
−約１２００〜約１０１０ｃｍ−１の範囲内；
−約１０１０〜約７００ｃｍ−１の範囲内；
−約３６００〜３１００ｃｍ−１の範囲内；
−約３１００〜２７００ｃｍ−１の範囲内；及び／または
これらの混合物
に中心がある赤外スペクトルの１つ以上の吸収帯を示し得る。
別の実施形態では、ナノＰ３材料、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体は、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体のゼータ電位を用いて特徴付けられる。例えば、ナノＰ３材料、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体は、約−１００ｍＶ〜約＋１００ｍＶの範囲内のゼータ電位を持ち得る。例えば、ゼータ電位は、約−５０ｍＶ〜約６０ｍＶの範囲内であり得る。
さらなる実施形態において、ナノＰ３材料、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体は、約２〜約１０のｐＨ範囲内の溶液中で測定された約−８０ｍＶ〜約＋８０ｍＶの範囲内のゼータ電位を有する。
ナノＰ３材料は、粗いカリフラワーのような表面形態を持ち得る。このことは、ナノ粒子ポリマーの凝集によるそれらの形成に起因し得る。したがって、ナノＰ３材料は、ナノ粒子ポリマーの凝集体であり得る。ナノＰ３材料及び凝集体は、球形、またはほぼ球形であり得る。ナノ粒子ポリマーは、約１〜約５０ｎｍ、または約５〜１０、５〜１０、１０〜５０、２０〜５０もしくは１０〜３０ｎｍ、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０ｎｍの直径を有し得る。凝集体（及び関連するナノ粒子ポリマー）は、経時的に量が減少する高反応性ラジカルを埋め込み得る。ナノＰ３材料はまた、炭素クラスタの非局在化軌道に長寿命かつ安定なラジカルを埋め込み得る。安定なラジカル（二次ラジカル）は、反応性の高いラジカル（一次ラジカル）が関与する反応に起因し得る。ナノＰ３材料は、親水性の表面を有してもよい。したがって、その表面により水中でナノＰ３材料が素早く分散することを可能とし得る。それは、表面固定化生物活性分子の生物活性の保持を可能にし得る。親水性表面は、形成中または表面の空気への曝露による形成後のラジカルの酸化の結果であり得る。１つ以上の第２の種とのコンジュゲーション後、ナノＰ３材料コンジュゲートは、親水性または疎水性であり得る。あるいは、ナノＰ３材料コンジュゲートは、両親媒性を示し得る。
使用されるモノマーまたは重合中に適用される条件に応じて、ナノＰ３材料は架橋されていてもよい。本明細書では、用語「架橋」は、分子内及び／または分子間結合を含むポリマー組成物を指す。これらの架橋結合は、本質的に共有結合でも非共有結合でもよい。非共有結合には、水素結合、静電結合、及びイオン結合が含まれる。
架橋から得られる１つの潜在的な利点は、得られたナノＰ３材料及び場合によりそのような材料から形成されたコンジュゲートの安定性である。例えば、架橋は、架橋されていない同様の組成物と比較して、ナノＰ３材料（または得られるコンジュゲート）の溶解度を低下させる可能性がある。加えて、架橋されたナノＰ３材料（またはその形成されたコンジュゲート）の性質は、ナノ粒子材料または得られたコンジュゲートの耐薬品性を高める可能性がある。
ナノＰ３は、医用イメージング技術において画像造影増強剤として作用する追加の無機元素もしくは化合物、または有機金属化合物でドープされていてもよい。ナノＰ３は、酸化鉄またはガドリニウム化合物などの磁気共鳴画像（ＭＲＩ）造影剤でドープされてもよい。画像造影増強剤の例には以下が挙げられる：蛍光色素（例えば、Ａｌｅｘａ ６８０、インドシアニングリーン、及びＣｙ５．５）；１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、３２Ｐ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７３Ｓｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４Ｇｄ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５７Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、及び２２３Ｒａなどの同位体及び放射性核種；クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、またはエルビウム（ＩＩＩ）などの常磁性イオン；ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、及びビスマス（ＩＩＩ）などの金属；クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、またはエルビウム（ＩＩＩ）の酸化物；酸化鉄及び酸化ガドリニウムを含む、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、及びビスマス（ＩＩＩ）などの金属；リポソームなどの超音波造影増強剤；ならびに、バリウム、ガリウム、及びタリウム化合物などの放射線不透過剤。画像造影増強剤は、ナノＰ３材料上に直接組み込まれてもよく、またはキレート剤などの中間官能基を使用することによって間接的に組み込まれてもよい。
凝集体
ナノＰ３材料の作製中に、本明細書に記載のナノ粒子ポリマーから凝集体が形成され得る。
一実施形態では、凝集体は、約５ｎｍ〜約１００μｍ、例えば約５ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲のサイズを有する。
コンジュゲート
本明細書に記載のナノ粒子ポリマー、凝集体、またはナノＰ３材料は、コンジュゲートを形成するために、１つ以上の化合物、例えば有機化合物、有機金属化合物、または本明細書に定義された第２の種に結合し得る。第２の種が表面電荷を帯びていると、ナノＰ３への荷電した第２の種の結合は、コンジュゲーションプロセス中において反応条件のｐＨを変えることによって調節され得る。溶液のｐＨは、アミン及びカルボン酸基などの表面官能基のプロトン化または脱プロトン化を通じてナノＰ３の電荷を調節する。例えば、ナノＰ３材料及び第２の種を含有する溶液のｐＨを上昇させることによって、ナノＰ３材料への正電荷を帯びたコンジュゲートの結合が改善され得る。アルカリ性の高い媒体では、ナノＰ３は、脱プロトン化カルボキシル表面基を介して負電荷を帯びるようになり、これはまた、負電荷を帯びた粒子間の反発力のためにナノ粒子を安定化させる。あるいは、ナノＰ３材料及び第２の種を含有する溶液のｐＨを低下させることによって、ナノＰ３材料への負電荷を帯びたコンジュゲートの結合が改善され得る。本明細書に示されるように、第２の種の表面電荷に関係なく、反応条件のｐＨを変えることなく、多くの第２の種が、本明細書に記載のナノＰ３材料にコンジュゲートすることができる。
コンジュゲートの形成におけるナノＰ３材料（例えば、ナノ粒子ポリマー、凝集体、またはこれらの混合物）の使用が本明細書にて開示される。
コンジュゲートは、単一の第２の種のみを含んでもよい。あるいは、コンジュゲートは、２つ以上の異なる第２の種、例えば２つ、３つまたは４つの第２の種を含んでもよい。
ナノＰ３材料は一般に、例えば共有結合またはイオン結合によって、有機種または有機金属種などの第２の種に直接結合することができる。ナノ粒子ポリマーまたは凝集体がプラズマポリマーである場合、結合プロセスは一般に迅速であり、穏やかな条件下で進行することができる。結合は、ポリマー構造中の不対電子（すなわち、ラジカル部位）によるものであり得るか、またはナノＰ３材料上に生成された、もしくは適切な第２の種の添加を介して、もしくは空気（または他の気体）もしくはナノＰ３材料が曝露される他の流体との反応によって得られるコンジュゲートに組み込まれる官能基によるものであり得る。ナノＰ３材料は、第２の種を化学的に結合することができる官能性部分を含むモノマー単位を含み得る。１つ以上の第２の種とナノＰ３材料のコンジュゲーションは、得られるコンジュゲート上またはコンジュゲート中に官能基を導入し得、これは、さらなる化学反応のために使用され得るか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏ条件で行われる生化学的／生物学的プロセスなどのプロセスのための結合部位として使用することができる。
本明細書では、官能性部分（または「官能基」）は、モノマー、ナノＰ３材料、またはナノＰ３材料を含むコンジュゲート上に存在する原子の群を指し、これは他の相補的官能基、例えば第２の種に存在する他の官能基と反応することができる。官能基としては、以下の部分：カルボン酸（−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ）、カルボニル、一級もしくは二級アミン（−ＮＨ２、−ＮＨ−）、一酸化窒素、マレイミド、チオール（−ＳＨ）、スルホン酸（−（Ｏ＝Ｓ＝Ｏ）ＯＨ）、カーボネート、カルバメート（−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｎ＜）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、アルデヒド（−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ）、ケトン（−（Ｃ＝Ｏ）−）、ヒドラジン（＞Ｎ−Ｎ＜）、イソシアネート、イソチオシアネート、リン酸（−Ｏ（Ｐ＝Ｏ）ＯＨＯＨ）、ホスホン酸（−Ｏ（Ｐ＝Ｏ）ＯＨＨ）、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アクリロイル、フッ化アリール、ヒドロキシルアミン、ジスルフィド、ビニルスルホン、ビニルケトン、ジアゾアルカン、オキシラン、及びアジリジン、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において、「第２の種」は、ナノＰ３材料（すなわち、ナノ粒子ポリマーまたはその凝集体）に物理的に吸着するかまたは化学的に結合してコンジュゲートを形成することができる化合物である。
第２の種は、イメージング試薬、生体分子、薬物、酵素、抗体、ターゲティングリガンド、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ構築物、ＤＮＡ、ＤＮＡ構築物、ベクター、プラスミド、炭水化物、触媒、及びこれらの混合物からなる群から選択され得る。加えて、全細胞、細胞フラグメント、ミセル、リポソーム、ハイドロゲル、タンパク質（シルクのような電界紡糸タンパク質）及びポリマー、半導体、セラミックまたは金属粒子のような種は、このようにナノＰ３材料に共有結合的に付着し得る。一例において、第２の種は、蛍光色素である。例えば、蛍光色素はインドシアニングリーン（ナトリウム４−［２−［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｚ）−７−［１，１−ジメチル−３−（４−スルホナトブチル）ベンゾ［ｅ］インドール−２イリデン］ヘプタ−１，３，５−トリエニル］−１，１−ジメチルベンゾ［ｅ］インドール−３−イウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート；ＣＡＳ番号３５９９−３２−４）であり得る。
本明細書で使用される「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、１つ以上の免疫グロブリン鎖から構成される可変領域を含むタンパク質、例えばＶＬを含むポリペプチド及びＶＨを含むポリペプチドを包含すると解釈される。抗体はまた定常ドメインを含んでもよく、そのうちのいくつかは定常領域または定常フラグメントまたは結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）に配置され得る。ＶＨ及びＶＬは相互作用して、１つまたは少数の密接に関連した抗原に特異的に結合することができる抗原結合領域を含むＦｖを形成する。一般に、哺乳動物由来の軽鎖はκ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかであり、哺乳動物由来の重鎖はα、δ、ε、γ、またはμである。抗体は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。用語「抗体」は、ヒト化抗体、脱免疫化抗体、非除去（ｎｏｎ−ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）抗体、非活性化抗体、霊長類化抗体、ヒト抗体、及びキメラ抗体もまた包含する。本明細書で使用される場合、用語「抗体」はまた、エピトープ決定基に結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖのような、完全長抗体分子、インタクトな抗体分子、または全抗体分子以外の形式を含むことが意図される。これらの形式は、抗体「フラグメント」と呼ばれることがある。これらの抗体形式は、標的タンパク質に選択的に結合するいくつかの能力を保持しており、その例としては、限定されないが、以下が挙げられる：
（１）Ｆａｂ、抗体分子の一価の結合フラグメントを含み、酵素パパインにより抗体全体を消化し、インタクトな軽鎖及び１つの重鎖の一部が生じることによって生成することができるフラグメント；
（２）Ｆａｂ’、抗体全体をペプシンで処理し、続いて還元してインタクトな軽鎖及び重鎖の一部が生じることによって得ることができる抗体分子のフラグメント；抗体分子あたり２つのＦａｂ’フラグメントが得られる；
（３）（Ｆａｂ’）２、抗体全体を酵素ペプシンにより処理し、その後還元せずに得ることができる抗体のフラグメント；Ｆ（ａｂ）２は２つのジスルフィド結合によって一緒に保持された２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である；
（４）Ｆｖ、２本の鎖として発現される軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含む遺伝子組換えされたフラグメントとして定義される；
（５）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）、遺伝的に融合した一本鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子組換え分子として定義される；このような一本鎖抗体は、多特異性であってもなくてもよいダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディなどの多量体の形態であり得る；ならびに
（６）単一ドメイン抗体、典型的には軽鎖を含まない可変重鎖ドメイン。
したがって、本明細書に記載の抗体は、別々の重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、いかなる重鎖も含まない可変軽鎖ドメイン、軽鎖及びＦｖを含まない可変重鎖ドメインを含み得る。そのようなフラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離によって生成され得る。本明細書に記載され、そうでなければ当技術分野において公知の任意の抗体またはそのフラグメントは、本明細書に開示されるナノＰ３粒子にコンジュゲートされ得る。
第２の種はポリヌクレオチドであり得る。本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及び当技術分野において公知の他の任意のポリヌクレオチドを包含すると解釈するものとする。ポリヌクレオチドは、タンパク質または機能性ＲＮＡ（例えば干渉ＲＮＡ）をコードし得る。したがって、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドベクターまたはプラスミドであり得る。したがって、本明細書に開示されるナノＰ３材料は、対象における目的の標的部位にポリヌクレオチドを輸送するために使用され得、このポリヌクレオチドは、それ自体が機能的効果を発揮するか、または対象の細胞において次いで機能的効果を有するタンパク質または機能性ＲＮＡの発現をもたらす。
第２の種の例には、ターゲティングリガンド、医薬品、造影剤、アミノ酸、ペプチド、天然生物活性分子の合成類似体、合成ペプチド模倣物、タンパク質（酵素または抗体など）、受容体ターゲティングリガンド、遺伝子標的化剤、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ、感光性色素、ｐＨ感受性リンカーなどの切断可能な連結分子、炭化水素、全細胞、細胞フラグメント、ミセル、リポソーム、ハイドロゲル、ポリマー粒子、半導体粒子、セラミック粒子、金属粒子、成長因子、サイトカイン、抗血栓剤及び／または線維素溶解剤、またはそれらの混合物が挙げられる。
例えば、抗体は、ナノ粒子を特定の細胞型に標的化するためにナノＰ３材料に付着され得、治療用分子は、それらの細胞に治療効果をもたらすために同じナノ粒子ポリマーに付着し得る。イメージング分子は、細胞型のイメージングを可能にするために、これに加えてまたはこれに代えてナノＰ３材料に付着し得る。
本発明のナノＰ３は様々な分子の固定化を可能にするだけでなく、付着種は固定化後にそれらの官能性及び活性を維持する。本発明者らは、ナノＰ３材料に同時に付着した２つ以上の種類の生体分子を用いてこの特徴を明らかにした。
ナノＰ３材料（ナノ粒子ポリマー及び／またはその凝集体）は、２つ以上の種類の第２の種と反応することが可能であり得る。異なる種類の分子及びそれらの異なる分子内の置換は、ナノＰ３材料中またはナノＰ３材料上で、同時にまたは順次に反応及び固定化され得る。結合種は、ナノＰ３材料及び得られたコンジュゲート上に固定化後、それらの未結合の活性、例えば生物活性及び官能性が維持され得る。
ナノＰ３材料に結合し得る第２の種の例は、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５の１２６２〜１７３９頁に示されている。
第２の種の例としては、診断薬及び試薬；局所薬；消化管及び肝臓薬；血液、体液、電解質、及び血液作用薬；心血管薬；呼吸器薬；交感神経作動薬；コリン様作用薬；アドレナリン拮抗薬及びアドレナリン作動薬；ニューロン遮断薬；抗ムスカリン薬及び鎮痙薬；骨格筋弛緩薬；利尿薬；子宮及び抗片頭痛薬；ホルモン及びホルモン拮抗薬；全身麻酔薬；局所麻酔薬；抗不安薬及び睡眠薬；抗てんかん薬；精神薬理学的薬；鎮痛薬、解熱薬、及び抗炎症薬；ヒスタミン薬及び抗ヒスタミン薬；中枢神経刺激薬；抗腫瘍薬；免疫活性薬；寄生虫駆除薬；免疫剤及びアレルゲン抽出物；抗感染薬；酵素；栄養素及び関連物質、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書では、用語「ターゲティングリガンド」は、標的分子に結合するか、またはそれと相互作用する分子を指す。通常、相互作用または結合の性質は、例えば、水素、静電、またはファンデルワールス相互作用によるものなどの非共有結合であるが、結合は共有結合であってもよい。
本明細書で使用される「リガンド」という用語は、生物学的マーカーを標的とする化合物を指す。リガンドの例としては、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、糖類、炭水化物、グリカン、サイトカイン、ケモカイン、ヌクレオチド、レクチン、脂質、受容体、ステロイド、神経伝達物質、クラスタ指定／分化（ＣＤ）マーカー、インプリントポリマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。
ターゲティングリガンドの例としては、核局在化シグナル（例えばＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ）、ＲＧＤ、ＮＧＲ、葉酸塩、トランスフェリン、ＧＭ−ＣＳＦ、ガラクトサミン、抗ＶＥＧＦＲ、抗ＥＲＢＢ２、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ２５、抗テネイシン、抗ＣＥＡ、抗ＭＵＣ１、抗ＴＡＧ７２、抗ＨＬＡ−ＤＲ１０、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
医薬品の例としては、抗がん剤（例：ドキソルビシン、パクリタキセル、ビンクリスチン、シクロホスファミド及びトポテカン）；喘息薬（例えば、フルチカゾン及びサルメテロール−ステロイド及び気管支拡張薬を含む）；抗ＨＩＶレトロウイルス（例えば、アバカビル（Ｚｉａｇｅｎ）、エファビレンツ／エムトリアシタビン／テノホビルジソプロキシルフマル酸塩（Ａｔｒｉｐｌａ）、ラミブジン／ジドブジン（Ｃｏｍｂｉｖｉｒ）、エムトリアシタビン／リルピビリン／テノホビルジソプロキシルフマル酸塩（Ｃｏｍｐｌｅｒａ）、エムトリシタビン（Ｅｍｔｒｉｖａ）、ラミブジン（Ｅｐｉｖｉｒ）、アバカビル／ラミブジン（Ｅｐｚｉｃｏｍ）、ジドブジン（Ｒｅｔｒｏｖｉｒ））；細胞複製／増殖を調節する薬剤：ラパマイシン（ＴＯＲ）阻害剤（シロリムス、エベロリムス及びＡＢＴ−５７８を含む）の標的；パクリタキセル及び抗腫瘍薬（アルキル化剤、例えばシクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン、ロムスチン、イホスファミド、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、アルトレタミン、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンを含む）；抗腫瘍抗生物質（ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、エトポシド、テニポシド、アムサクリン、トポテカン、イリノテカン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、及びミトキサントロン）；代謝拮抗剤（デオキシコホルマイシン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２−クロロデオキシアデノシン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、カペシタビン、シトシンアラビノシド、アザシチジン、ゲムシタビン、フルダラビンホスフェート、及びアスパラギナーゼを含む）；抗有糸分裂剤（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ドセタキセル、エストラムスチンを含む）；分子標的薬（イマチニブ、トレチノイン、ベキサロテン、ベバシズマブ、ゲムツズマブオゴマイシン、及びデニロイキンジフチトックスを含む）；抗炎症薬；コルチコステロイド；エストロゲン；アンドロゲン；プロゲストゲン、及び副腎アンドロゲン；抗生物質、鎮痛剤；オポイド、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
造影剤の例としては、ルシフェラーゼ；蛍光標識された色素及び抗体、造影剤（イオパミドール、イオヘキソール、及びイオキシランを含む）；硫酸バリウム；ＭＲＩ造影剤（例えば、ガドリニウム、酸化鉄、及びマンガンベースの造影剤）；インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、ならびにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸を含む任意のポリマーを意味することを意図している。用語「ペプチド」は、リボソームを用いて集合したポリマー、及び酵素によって集合したポリマー（すなわち、非リボソームペプチド）、及び合成的に集合したポリマーを含むことを意図している。各種実施形態では、用語「ペプチド」は、「タンパク質」または「ポリペプチド」と同義と見なされ得る。各種実施形態では、用語「ペプチド」は、５０個を超えるアミノ酸、あるいは５０個以下のアミノ酸のポリマーに限定され得る。各種実施形態では、用語「ペプチド」は、ポリマーのモノマー単位としてアミノ酸のみを含むことを意図しているが、各種実施形態では、用語「ペプチド」は、アミノ酸骨格へのさらなる成分及び／または修飾を含む。例えば、各種実施形態では、用語「ペプチド」は、ペンダント型ポリエチレングリコール基を有するコアポリマーまたはアミノ酸鎖のアミノ末端もしくはカルボキシ末端にアミド基を有するコアポリマーなどの、アミノ酸のコアポリマー及び該コアポリマーの誘導体に適用され得る。
アミノ酸の例としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンが挙げられるが、これらに限定されない。
ペプチドの例としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンから選択される２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０アミノ酸を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
「ペプチド模倣物」は、ペプチド、修飾ペプチド、またはホルモンの活性リガンド、サイトカイン、酵素基質、ウイルスもしくは他の生体分子を生物学的に模倣する任意の他の分子などの分子であり得る。このペプチド模倣物は、天然リガンドの生理学的活性に拮抗するか、刺激するか、またはそうでなければ調節し得る。１４〜２０アミノ酸長を有するペプチドは、治療上有効な薬剤を開発するためのリード化合物として機能することができる。該ペプチドは通常、親分子よりかなり小さいため、それらが、より低い副作用を示し得、標的への送達がより簡単であるという可能性が高い。ペプチド模倣物を合成するための主な重点は、ペプチドまたは受容体のタンパク質リガンドを模倣することである。しかしながら、この技術は酵素阻害にも有用である。「ペプチド模倣体」という用語は比較的幅広いため、天然オピエートアルカロイドなどの天然化合物もペプチド模倣薬の例である。実際、小さなペプチドは、オピオイドと同様に、場合によっては同じ受容体を標的とすることができる。
本明細書では、「タンパク質」という用語は、鎖長が、より高レベルな三次構造及び／または四次構造を生成するのに十分であるアミノ酸の配列を指す。タンパク質は、約３００Ｄａ〜約１５０ｋＤａの範囲内の分子量を有し得る。タンパク質は、１５０ｋＤａより大きい分子量、または３００Ｄａより小さい分子量を有し得る。
本明細書の定義内に包含されるタンパク質の例には、例えばヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；サポリンのようなリボソーム不活性化タンパク質；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、因子、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子のような凝固因子；プロテインＣのような抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼ型または組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）のようなプラスミノーゲン活性化因子；ボンバジン；トロンビン；腫瘍壊死因子−α及び−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に制御され、正常Ｔ細胞で発現及び分泌）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミンのような血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ＤＮアーゼ；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子の受容体；インテグリン；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）のような神経栄養因子、またはＮＧＦ−βのような神経成長因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦのような線維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−α、及びＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４もしくはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−βのようなトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）；インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０のようなＣＤタンパク質；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β、及び−γのようなインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子（ＤＡＦ）；例えばＡＩＤＳエンベロープの一部などのウイルス性抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；イムノアドヘシン；抗体；及び上記のポリペプチドのいずれかの生物学的に活性なフラグメントまたは変異体などの哺乳動物タンパク質が含まれる。
遺伝子標的化剤の例としては、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ（センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ＳｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ＳｎｏＲＮＡ、核内低分子（ｓｎＲＮＡ））リボザイム、アプタマー、ＤＮＡザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ベクター、プラスミド、他のリボヌクレアーゼ型複合体、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
感光性色素の例としては、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。
ｐＨ感受性リンカーのような切断可能な連結分子の例は、Ｌｅｒｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０，５７１−５８２，２０１２に見出すことができ、その内容は参照により含まれる。リンカー及び化合物の例示的な群としては、ｐＨ切断可能な、光切断可能な（例えば、レーザーまたは赤外光を介して切断可能）、レーザー切断可能な、熱切断可能な、及びプロテアーゼ切断可能な（カレクレイン及びトロンビンのような血液プロテアーゼの作用を介するものを含む）リンカー及び化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
細胞の例としては、前駆細胞（血管内皮前駆細胞、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＫＤＲ＋、またはＶＣＡＭ−１＋単球、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞を含む）、分化細胞（内皮細胞、線維芽細胞、及び平滑筋細胞を含む）、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
ハイドロゲルの例としては、アルギネートの多価金属塩、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、ヘパリン、ヒアルロン酸塩、ならびにキチン、キトサン、プルラン、ジェラン、キサンタン及びヒドロキシプロピルメチルセルロースのような共有結合性または音波架橋性多糖系ハイドロゲルが挙げられるが、これらに限定されない。
ポリマー粒子、半導体粒子、セラミック粒子、金属粒子の例としては、半導体量子ドット、蛍光ナノ粒子、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、酸化鉄、他の磁性粒子、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
成長因子の例としては、血管内皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、結合組織増殖因子、胎盤由来増殖因子、アンジオポエチン−１、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子が挙げられるが、これらに限定されない。
サイトカインの例としては、インターロイキン−１、インターロイキン−４、インターロイキン−１０のようなインターロイキン；ＧＭ−ＣＳＦ；ＴＮＦ−α；インターフェロン−ガンマ；ＴＧＦ−β；またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
抗血栓剤及び線維素溶解剤の例としては、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、直接トロンビン阻害剤、ヘパリン、低分子量ヘパリン、血小板アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体阻害剤、線維素溶解剤（ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子、レテプラーゼ、及びテネクテプラーゼを含む）、酵素（ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、及びプラスミンを含む）、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、コンジュゲートは、１つのみの第２の種を含む。
別の実施形態では、コンジュゲートは、２つの第２の種を含む。
別の実施形態では、コンジュゲートは、３つの第２の種を含む。
別の実施形態では、コンジュゲートは、３つ以上の第２の種を含む。
第２の種は、ナノＰ３材料に物理的または化学的に直接結合していてもよく、または第２の種は連結部分を介して付着していてもよい。第２の種は、この連結部分を含むように修飾され得る。連結分子は、第２の種を放出するためのｐＨ、熱または光などの環境変数の変化により、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで分解してもよい。あるいは、リンカーは、細胞内で天然に生じる酵素によって切断可能であり得る。例えば、ｐＨ分解性リンカーのような切断可能な連結分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで薬物分子である第２の種を放出し得る。
コンジュゲートのサイズは、透過性及び滞留性の向上（ＥＰＲ）効果を介した腫瘍細胞または腫瘍組織のパッシブターゲティングを可能にし得る。このＥＰＲ効果を通じて、不連続な内皮を有する血管形成性腫瘍血管系の無秩序な病状の結果としてコンジュゲートが固形腫瘍に受動的に蓄積し得、このことは大きな巨大分子への透過性亢進、及び有効な腫瘍リンパ排液の欠如をもたらす。
薬学的組成物
本明細書で定義されるようなナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲート、及び薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤、または結合剤を含む医薬組成物が本明細書に開示される。一実施形態では、ナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲートは、薬学的に許容可能である。本明細書に開示の医薬組成物において、第２の種は治療薬または診断薬であり得る。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤、または結合剤」は、生理学的に適合性があり、本明細書に記載される化合物に対して有害ではない溶媒、希釈剤、分散媒体、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤などの賦形剤もしくは薬剤、またはそれらの使用を含む。薬学的活性物質の組成物を調製するためのそのようなキャリア及び薬剤の使用は、当技術分野において周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔＥｄｉｔｉｏｎ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５を参照のこと）。
薬学的に許容可能な組成物は、使用前に希釈してもよい。適切な希釈剤は、例えば、リンゲル液、ハルトマン液、デキストロース溶液、食塩水、及び注射用滅菌水から選択され得る。
本明細書で使用される「組成物」という用語は、特定量の特定成分を含む生成物、ならびに特定量の特定成分の組み合わせから直接的または間接的に生じる任意の生成物を包含することを意図している。
本明細書において、「薬学的に許容可能な」とは、キャリア、希釈剤、または賦形剤と共にナノＰ３材料（すなわち、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体）またはそのコンジュゲートが、医薬組成物の他の成分に適合性がなければならず、そのレシピエントに対して有害であってはならないことを意味する。ナノＰ３材料（すなわち、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体）、またはそのコンジュゲートは、熟練した医療専門家または獣医師によって特定された合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の潜在的な合併症なしにレシピエントの組織と接触することができなければならない。加えて、ナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲートは、個体、例えば動物またはヒトへの医薬として送達されるべき任意の組成物中のキャリア及び／または賦形剤と適合性がなければならない。
場合によっては、ナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲートは、薬学的に許容可能ではないが、これらは本発明の範囲内にあることが理解されよう。しかしながら、いくつかの実施形態では、医薬製剤に使用するために、ナノＰ３材料（すなわち、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体）またはそのコンジュゲートは、薬学的に許容可能な化合物である。薬学的に許容可能でないナノＰ３材料（すなわち、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体）またはそのコンジュゲートは、薬学的に許容可能なナノＰ３材料（すなわち、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体）またはそのコンジュゲートの調製において有用であり得る。
本発明の組成物は、下記の他の治療薬を含有してもよく、例えば、従来の固体もしくは液体ビヒクルまたは希釈剤、及び所望の投与方法に適した種類の医薬添加剤を使用することによって（例えば賦形剤、結合剤、防腐剤、安定剤、香味剤など）、医薬製剤の分野で周知の技術にしたがって製剤化され得る。
本明細書で定義されるナノＰ３材料（すなわち、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体）またはそのコンジュゲートは、任意の適切な手段、例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または槽内注射もしくは注入技術によるものなどの非経口投与によって投与され得る（例えば、無菌注射用水溶液もしくは非水溶液または懸濁液として）。
医薬製剤は、経口、直腸、経鼻、局所（バッカル及び舌下を含む）、非経口投与（筋肉内、腹腔内、皮下、及び静脈内を含む）、または吸入もしくは吹送による投与に適した形態のものを含む。したがって、ナノＰ３材料（すなわち、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体）またはそのコンジュゲートは、従来のアジュバント、キャリアまたは希釈剤と共に、医薬組成物及びその単位投与の形態へと入れることができ、そのような形態では、全て経口使用のための、錠剤もしくは充填カプセルなどの固体、または溶液、懸濁液、エマルジョン、エリキシル剤もしくは同じもので充填されたカプセル剤としての液体として使用され得るか、または非経口（皮下を含む）使用のための無菌注射液の形態で使用され得る。
一実施形態では、コンジュゲートは徐放用途のために設計されてもよい。例えば、コンジュゲートは、第２の種（医薬品または診断薬など）を含んでもよく、これは、分解性リンカーを介してナノ粒子ポリマーまたは凝集体に付着している。連結分子は、第２の種を放出するためのｐＨまたは熱などの環境変数の変化により、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで分解されることがある。例えば、分解性リンカーは、感光性であり得、適切な波長の光で、例えば、赤外線またはレーザー照射を介して、第２の種（薬物、ｓｉＲＮＡ、またはＲＮＡなど）の放出を可能にし得る。あるいは、リンカーは、細胞内で天然に生じる酵素によって切断可能であり得る。リンカーの分解は、医薬品の安定した放出または定常的な放出をもたらし得、状態の長期的及び／または比較的定常的な治療；または対象内でｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏでトラッキングされる診断薬を可能にする。
あるいは、コンジュゲートに組み込まれる第２の種は、ナノ粒子ポリマーもしくは凝集体に直接結合するか；または分解性リンカーによってナノ粒子ポリマーもしくは凝集体に付着する、プロドラッグであってもよい。本明細書では、プロドラッグは、コンジュゲート中で、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体に結合した化合物の不活性形態である（リンカーの使用の有無に関わらず）。対象に投与されると、プロドラッグが依然としてナノ粒子ポリマーもしくは凝集体に付着している間、または一度プロドラッグがナノ粒子ポリマーもしくは凝集体から放出されるいずれかにおいて、該不活性形態は薬学的に活性な形態に代謝され得る。
あるいは、ナノ粒子ポリマー、凝集体またはそのコンジュゲートは、局所的に使用される材料に組み込まれてもよい。例えば、ナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲートは包帯に組み込まれてもよい。
ナノ粒子ポリマー、凝集体、またはそのコンジュゲートは、切り傷／創傷またはｐｓｉｏｒａｓｅもしくは湿疹などの状態の皮膚治療ための適切な足場に組み込むことができる。
ナノ粒子ポリマー、そのコンジュゲートの凝集体は、心臓パッチ、血管移植片、骨及び他の組織欠損の治癒を促進するための埋没物のような埋没物上または埋没物内で使用され得る。
本発明の化合物を投与するための医薬組成物は、投与単位形態で都合よく提供されてもよく、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製されてもよい。全ての方法は、活性成分、例えば本明細書で定義されるようなコンジュゲートを、１つ以上の副成分を構成するキャリアと結び付ける工程を含む。概して、医薬組成物は、活性成分、例えばコンジュゲートを、液体キャリアまたは微細固体キャリアまたはその両方と均一かつ密接に結び付け、次いで必要に応じて、生成物を所望の製剤に成形することにより調製される。医薬組成物において、活性目的化合物は、疾患の進行または状態に対して所望の効果を生じるのに十分な量で含まれる。
医薬組成物は、無菌注射用水溶液または油性懸濁液の形態であり得る。この懸濁液は、上記の適切な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤を使用して、既知の技術にしたがって製剤化され得る。無菌注射用製剤は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射液または懸濁液であってもよい。使用され得る許容可能なビヒクル及び溶媒は、水、リンゲル液、及び等張食塩水である。加えて、無菌の不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として従来から使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激な不揮発性油を使用してもよい。加えて、オレイン酸などの脂肪酸は、注射用製剤の調製に用いられている。
本明細書に開示されている医薬組成物及び方法は、開示されている障害または状態の治療に通常適用される他の治療活性化合物をさらに含んでもよい。併用療法における使用のための適切な薬剤の選択は、従来の薬学的原則に応じて、当業者によってなされ得る。治療薬の組み合わせは相乗的に作用して、本明細書に開示される様々な障害または状態の治療または予防をもたらし得る。このアプローチを使用すると、より少ない用量の各薬剤で治療効果を達成することができ、それにより有害な副作用の可能性を減らすことができる。
他の治療薬をナノ粒子ポリマー、凝集体、またはそのコンジュゲートと組み合わせて使用する場合、それらは、例えば米医薬品便覧（ＰＤＲ）に記載されているような量、またはそうでなければ当業者によって決定される量で使用され得る。
しかしながら、任意の特定の患者に対する特定の用量レベル及び用量の頻度は変動し得、使用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用の長さ、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与方法及び投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、特定の状態の重症度、ならびに治療を受けている宿主を含む様々な要因に依存するであろうことが理解されよう。
治療方法
疾患、障害、または状態の１つ以上の症状に罹患している、罹患しやすい、またはそれを示す対象を治療する方法が本明細書に開示され、該方法は、本明細書で定義されるようなナノ粒子ポリマー、凝集体もしくはそのコンジュゲート、または本明細書で定義されるような医薬組成物を対象に投与する工程を含む。用語「処置すること」は、本明細書において、治療的処置及び予防的処置の両方を包含するために使用される。したがって、本明細書に開示される処置方法は、疾患、障害、または状態の１つ以上の症状を予防する方法を包含し得る。「処置すること」は、疾患、障害、または状態の任意の１つ以上の症状の軽減をもたらすと解釈され得ることが理解されよう。また、対象の状態を治療または予防するための医薬の製造における、本明細書で定義されるようなナノ粒子ポリマー、凝集体またはコンジュゲートの使用が本明細書に開示される。
さらに、少なくとも１つの第２の種が造影剤である、本明細書で定義されるようなナノ粒子ポリマー、凝集体、コンジュゲート、または医薬組成物を対象に投与する工程を含む、対象内の領域のイメージング方法もまた本明細書に開示される。例えば、コンジュゲートまたは医薬組成物は、限定されるものではないが、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、Ｘ線、超音波、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）または光音響イメージングのような診断技術によって検出され得る造影剤を含み得る。
一実施形態では、本明細書で定義されるナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲートは、医薬品として使用されるか、または医薬品の形態で利用される。
ナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲートは、例えば適切な化合物が医薬組成物に添加される場合、「有効量」にて提供され得る。「有効量」という語句は、化合物を含む組成物の化合物を投与する研究者、獣医、医師、または他の臨床医によって探求されている組織、系、動物またはヒトの所望の生物学的または医学的応答を誘発するナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲートの量を意味すると解釈される。
「有効量」は、特定のナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲートの有効性を含む、いくつかの要因に依存するものである。対象が与えられる化合物の濃度を決定する際には、対象の体重及び年齢もまた当業者にとっての因子であり得る。
化合物「の投与」及び／または化合物「を投与すること」という語句は、治療を必要とする対象に、本明細書で定義されるナノ粒子、凝集体もしくはコンジュゲートを含むナノ粒子、凝集体もしくはコンジュゲート、または医薬組成物を提供することを意味すると理解されるべきである。
ナノ粒子、凝集体もしくはコンジュゲート、またはナノ粒子、凝集体もしくはコンジュゲートを含む医薬組成物のレシピエントは、ヒト、男性または女性であり得る。
あるいは、ナノ粒子、凝集体もしくはコンジュゲート、またはナノ粒子、凝集体もしくはコンジュゲートを含む医薬組成物のレシピエントはまた、非ヒト動物であり得る。「非ヒト動物」は、動物界を対象とし、ヒトを除き、雄または雌の脊椎動物及び無脊椎動物の両方が含まれ、そして以下のものが含まれる：哺乳類（霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラット、モルモット、ウマ、または他のウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、げっ歯類またはネズミ種を含むがこれらに限定されない）を含む温血動物、鳥類、昆虫類、爬虫類、魚類、及び両生類。
化合物及び薬学的に許容可能な組成物のレシピエントは、本明細書では互換的な用語「患者」、「レシピエント」、「個体」、及び「対象」と呼ばれる。これらの４つの用語は互換的に使用され、本明細書で定義されるような任意のヒトまたは動物（他に示されない限り）を指す。
ナノＰ３またはそのコンジュゲートを使用して治療することができる疾患、障害または症状には、急性冠症候群、加齢性疾患もしくは障害；アレルギー性疾患もしくは関連状態；アルツハイマー病、ｓｉＲＮＡ送達、喘息、ＨＩＶ、抗生物質耐性、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患；細菌感染症、がん；認知症、うつ病もしくは関連状態；糖尿病；脂質異常症、高脂血症、高血圧、魚鱗癬、免疫疾患；代謝性疾患もしくは障害；神経学的疾患もしくは障害；肥満症；パーキンソン病；疼痛、関節リウマチ、またはがんを含む増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。がんの種類には、肛門癌、アスベスト及び肺疾患（中皮腫）、胆管癌、膀胱癌、骨癌（肉腫）、腸癌（大腸）、脳及び脊髄腫瘍、乳癌、カルチノイド腫瘍（神経内分泌）、子宮頸癌、内分泌癌（甲状腺）、眼癌、胆嚢癌、頭頸部癌（口、鼻及び喉）、カポジ肉腫、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫（非ホジキン及びホジキン）、黒色腫、多発性骨髄腫、食道癌、卵巣癌、膵臓癌、ペニス癌、腹膜癌、腹膜中皮腫、胸膜中皮腫、前立腺癌、皮膚癌（非黒色腫）、軟部組織癌、脊髄腫瘍、胃及び食道癌、精巣癌、甲状腺癌、胸腺癌、子宮癌（子宮内膜癌）、ならびに外陰及び膣癌が挙げられる。
本明細書に記載のナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲートは、診断試験に使用され得る。例えば、コンジュゲートは、ｓｓＤＮＡのプローブ配列または他のハイブリダイズ可能な分子、抗体、蛍光剤、磁性粒子、酵素、または特定の診断試験の検出工程に関与し、それによりハイブリダイゼーションパートナーの存在を同定し得る他の検出可能なマーカーを含み得る。
本明細書に記載のプラズマ技術は、治療／診断薬もしくは官能化剤としてのその後の臨床使用、または非臨床使用のために、十分に制御可能な方法でナノＰ３を作製及び収集することを可能にする（例えば：遺伝材料の送達のための研究ツールとして；酵素では官能化されたナノＰ３はまた、食物または化学処理のための反応器を通る流動床式の流れにおいても使用され得る；他のアプリケーションの中では、細胞コンパートメントのイメージング、組織学的スループットを高めるための一次抗体及び二次抗体の組み合わせ、動物モデルにおける細胞／薬物のトラッキング）。確立されたプロセスパラメータウィンドウは、ナノ粒子の収率、サイズ、表面形態、及び化学的性質を定義する。ナノ粒子は活性プラズマ−気相で作製され、無菌の臨床バイアルへの直接収集を可能にする（図１）。プラズマ処理は、滅菌のために広く使われている方法であり、したがって、プラズマ放電は、ナノ粒子ポリマー及び凝集体の形成ならびに粒子含有バイアルの滅菌という二重の役割を果たすことができる。得られたナノＰ３含有バイアルは、その後、容易に入手可能な方法で臨床で入手可能となり得る。各バイアル中のナノＰ３の濃度は、プラズマ堆積パラメータによって安定して容易に制御することができる。単純な１段階プロセスでは、臨床医は、患者の状態に応じて、オーダーメイドの治療法及び／または診断法を容易に準備することができる。各バイアル中のナノＰ３の濃度はまた、適切な第２の種への結合及び送達を最適化するように選択され得る。
基質
本明細書で定義されるようなナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲートを含む基質が本明細書にて開示される。
基質は、ガラス、ポリマー、金属、及び複合材料から選択されるがこれらに限定されない材料から形成され得る。基質は、天然材料または合成材料に由来し得る。
基質は、生分解性材料を含み得る。
ナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲートは、基質の形成中に基質に組み込まれてもよい。例えば、ポリマー形成物（例えばポリウレタン）またはタンパク質（例えばシルク）及びコンジュゲートを含む組成物は、電界紡糸により、足場の形態での基質の形成に利用され得る。
ナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲートは、基質の形成中に、または基質が形成された後の修飾後プロセスにおいて、基質中または基質上に組み込まれ得る。
本明細書で定義されるようなコンジュゲートは、基質またはハイドロゲルに組み込まれてもよい（例えば、創傷部位、または組織／骨欠損）。コンジュゲートは、基質と共有結合を形成してもよく、これにより基質の修飾の必要性が無くなる。
基質は、非分解性または生分解性であり得る。足場が基質である場合、コンジュゲートに付着した第２の種は徐放されて、１つ以上の第２の種の制御送達を可能にし得る。
ナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲートは、基質内に物理的に閉じ込められていてもよく、または基質に化学的に結合されていてもよい。例えば、ナノ粒子ポリマー、凝集体またはコンジュゲートの表面上の化学的部分は、基質上に存在する相補的部分（例えば、アルコール、アミン、カルボン酸及び／またはアルデヒド基）と組み合わされ得るか、または、該結合は、基質の表面上の基とのナノ粒子ポリマー、凝集体、もしくはコンジュゲート中もしくは上でのラジカルの反応を通じて、直接的にもしくは中間反応を介してのいずれかによって、共有結合によって起こり得る。
あるいは、ナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲートは、少なくとも１種の基質表面上に存在し得る。例えば、ナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲートを含むコーティングを基質に適用され得る。
ナノＰ３材料の作製
ｉ）反応チャンバ内に少なくとも１種のガスを提供することと、
ｉｉ）前記反応チャンバ内にプラズマを発生させるように第１電極に電力を供給することと、
ｉｉｉ）前記反応チャンバ内の第２電極に電圧を印加することと、
ｉｖ）得られたナノＰ３材料を収集することと、を含み、
前記少なくとも１種のガスが有機ガスを含む、ナノＰ３材料（ナノ粒子ポリマー及びそれらの凝集体を含む）の調製方法が、本明細書にて開示される。存在するガスの少なくとも１種はモノマーとして作用する。
ｉ）反応チャンバ内に少なくとも１種のガスを提供することと、
ｉｉ）前記反応チャンバ内に容量結合プラズマを発生させるように前記反応チャンバ内の第１電極に高周波（ＲＦ）電力を供給することと、
ｉｉｉ）前記反応チャンバ内の第２電極に電圧を印加することと、
ｉｖ）得られたナノＰ３材料を収集することと、を含み、
前記少なくとも１種のガスが有機ガスを含む、ナノＰ３材料（ナノ粒子ポリマー及びそれらの凝集体を含む）の調製方法もまた、本明細書にて開示される。存在するガスの少なくとも１種はモノマーとして作用する。
ｉ）反応チャンバ内に少なくとも１種のガスを提供することと、
ｉｉ）前記反応チャンバ内に誘導結合プラズマを発生させるように高周波（ＲＦ）電力を供給することと、
ｉｉｉ）前記反応チャンバ内の第２電極に電圧を印加することと、
ｉｖ）得られたナノＰ３材料を収集することと、を含み、
前記少なくとも１種のガスが有機ガスを含む、ナノＰ３材料（ナノ粒子ポリマー及びそれらの凝集体を含む）の調製方法もまた、本明細書にて開示される。存在するガスの少なくとも１種はモノマーとして作用する。
本明細書に記載の方法によって作製されたナノ粒子ポリマーまたは凝集体もまた本明細書に開示される。
図１は、本明細書で定義されるようなナノ粒子ポリマーまたは凝集体のスケールアップ生産、ならびに臨床使用のための治療薬及び診断薬の製造におけるそれらの使用の例を示す。パート１では、このプロセスは、ナノ粒子ポリマー及び凝集体の数及びサイズを制御して、明確に定義された、かつ調整可能な表面の化学的性質及び活性を可能にすることができる。ナノ粒子ポリマー及び凝集体は、それらの作製中に無菌環境が存在するために臨床バイアルへと直接収集することができる。工程２及び３では、１段階の直接的かつ迅速な官能化が起こり得るため、洗浄または精製段階に加えて複雑な湿式化学工程の必要性が無くなる。有利には、第２の種の選択は、生成物が多くの治療法及び／または診断法に合わせて調整できることを意味する。さらなる利点は、プロセス（第２の種（複数可）とのナノ粒子ポリマー、凝集体、及び／またはコンジュゲートの作製）をスケールアップする能力である。
本明細書で定義された方法によって作製されたナノＰ３材料もまた本明細書で開示される。
有機ガスは、炭化水素を含み得る。炭化水素は、不飽和炭化水素であり得るか、またはそれを含み得る。
ナノＰ３は、不活性ガスの存在下で作製してもよい。本明細書において「不活性ガス」とは、本明細書に記載のナノ粒子ポリマーまたはその凝集体を調製するために使用されるものなどの一連の所与の条件下で化学反応を受けないガスを指す。不活性ガスには、ヘリウム、ネオン、及びアルゴンが含まれる。
一実施形態では、工程ｉ）における少なくとも１種のガスは２種以上のガスの混合物である。一方のガスは、ナノ粒子ポリマーまたはその凝集体に組み込まれていない不活性ガスであり得る。
工程ｉ）における少なくとも１種のガスは、周期表の１５、１６または１７族の元素、例えば窒素を含み得る。このガスのフラグメントは、ナノＰ３材料に組み込まれてもよい。例えば、窒素の存在は、ナノＰ３材料中でアミン、イミン、もしくはニトリル基、またはこれらの混合物の存在下で生じ得る。
ガスは、絶対圧約１〜約１５００Ｐａ、例えば約６Ｐａ〜約６７Ｐａの範囲内の圧力であり得る。
反応チャンバは接地されていてもよい。ＲＦ周波数は、約１〜約５０ＭＨｚであり得る。ＲＦ電力は、約５Ｗ〜約５００Ｗであり得る。ＲＦ電力は、第１の電極、第２の電極、または両方の電極に印加され得る。第１の電極に印加されるＲＦ電力は、パルス方式または連続方式であり得る。第２の電極に印加されるパルス状バイアス電圧は、約−１０００Ｖ〜約１０００Ｖであり得る。これは反応チャンバに対するものであり得る。第２の電極に印加されるパルス状バイアス電圧は、約１Ｈｚ〜約５０ｋＨｚの周波数を有し得る。それはパルス状ＲＦバイアス電圧であり得る。パルス状バイアス電圧は、約１〜約１５０マイクロ秒のパルス幅を有し得る。それはＡＣでもＤＣでもよい。第２の電極は接地されていてもよく、または電気的に絶縁されていてもよく、放電中に電極の帯電によって定まる浮遊電位を獲得することを可能にし得る。
第１電極と第２電極との間の距離は、約５〜約６０ｃｍであり得る。
工程ｉ）は、反応チャンバを排気することを含み得る。それは、反応チャンバを通じてガスまたはその個々のガスを流すことを含み得る。排気工程は、工程ｉｉ）及びｉｉｉ）が行われる圧力より低い圧力であり得る。
このプロセスは、ナノ粒子ポリマー及び／または凝集体をコレクタに収集することを含み得る。コレクタは、第１電極と第２電極との間に配置され得る。このコレクタは、第２の電極に極めて近接していてもよい。コレクタは、密封可能なバイアルであり得る。導電性物質でも非導電性物質でできていてもよい。
このプロセスは、ナノ粒子ポリマー及び／または凝集体をガスに曝露することを含み得る。ガスは、窒素、酸素、及び水蒸気のうちの１種以上を含み得るか、またはそれらから本質的に構成され得る。ガスは、空気であり得る。ガスは、窒素であり得る。ガスは、ナノ粒子材料に反応性のあるガスであり得る。
一実施形態では、
ｉ）絶対圧力約１〜約１５００Ｐａの圧力で反応チャンバ内にガスを提供することと、
ｉｉ）反応チャンバ内にプラズマを発生させるために、前記反応チャンバ内の第１電極に約１〜約５０ＭＨｚかつ５〜５００Ｗで高周波（ＲＦ）電力を供給することと、
ｉｉｉ）約１Ｈｚ〜約５０ｋＨｚの周波数及び約１〜約１５０マイクロ秒のパルス幅で、パルス状の負のバイアス電圧を前記反応チャンバ内の第２の電極に印加すること（前記第２電極は前記第１電極から約５〜約２０ｃｍ離れている）と、
ｉｖ）得られたナノ粒子材料を収集することとを含み、
前記ガスが炭化水素ガス、窒素及び希ガスを含む、ナノＰ３材料を調製するためのプロセスが提供される。
一実施形態では、工程ｉｉｉ）における電圧は、前記電極がプラズマからの電荷の蓄積によって浮遊電位を獲得する自己バイアスである。
一実施形態では、工程ｉｉｉ）における電圧は、パルス状バイアス電圧である。
別の実施形態では、
ｉ）絶対圧力約６Ｐａ〜約６７Ｐａの圧力で反応チャンバ内にガスを提供することと、
ｉｉ）反応チャンバ内にプラズマを発生させるために、前記反応チャンバ内の第１電極に約６０〜約２０ＭＨｚかつ５〜２００Ｗで高周波（ＲＦ）電力を供給することと、
ｉｉｉ）約１〜約５ｋＨｚの周波数及び約１０〜約３０マイクロ秒のパルス幅でパルス状の負のバイアス電圧を前記反応チャンバ内の第２の電極に印加すること（前記第２電極は前記第１の電極から約５〜約２０ｃｍ離れている）と、
ｉｖ）第１電極と第２電極との間であるかつ第２電極に極めて近接して配置された密封可能なバイアル内にナノ粒子材料を収集することと、
ｖ）有機種をナノ粒子材料に共有結合させ、それにより官能化ナノ粒子材料を作製するために、密封可能なバイアル内のナノ粒子材料を有機種に曝露することとを含み、
前記ガスが炭化水素ガス、窒素及び希ガスを含む、ナノＰ３材料を調製するためのプロセスが提供される。
別の実施形態では、
ｉ）絶対圧力約６Ｐａ〜約６７Ｐａの圧力で反応チャンバ内にガスを提供することと、
ｉｉ）反応チャンバ内にプラズマを発生させるために、前記反応チャンバ内の第１電極に約１０〜約１５ＭＨｚかつ５〜２００Ｗで高周波（ＲＦ）及び電力を供給することと、
ｉｉｉ）第２の電気的に絶縁された電極が、前記反応チャンバ内で放電中に電極の帯電によって定まる浮遊電位を獲得することを可能にすること（前記第２電極は前記第１電極から約５〜約２０ｃｍ離れている）と、
ｉｖ）第１電極と第２電極との間であるかつ第２電極に極めて近接して配置された密封可能なバイアル内にナノ粒子材料を収集することと、
ｖ）有機種をナノ粒子材料に共有結合させ、それにより官能化ナノ粒子材料を作製するために、密封可能なバイアル内のナノ粒子材料を有機種に曝露することとを含み、
前記ガスが炭化水素ガス、窒素及び希ガスを含むナノＰ３材料を調製するためのプロセスが提供される。
排気可能な反応チャンバ、前記反応チャンバ内に配置されており、ＲＦ電源に接続されている第１電極、前記反応チャンバ内に配置されており、パルス発生器に結合するか、またはチャンバから電気的に絶縁した第２電極、前記チャンバを少なくとも部分的に排気するように前記反応チャンバに結合した真空ポンプ、及び１種以上のガスまたはそれらの混合物を反応チャンバに供給するための少なくとも１つのガス導入口を含む、ナノＰ３材料を作製するための装置も本明細書に開示されている。パルス発生器は、ＤＣでもＡＣでもよい。
装置は、ナノＰ３材料を収集するためのコレクタをさらに含んでもよい。コレクタは、第１電極と第２電極との間に配置されてもよい。第１電極及び第２電極は、約５〜約６０ｃｍ離れていてもよい。
図４は、ナノＰ３材料を収集するために使用され得る装置の概略図を概説する。この概略図は、Ｃ２Ｈ２、Ｎ２及びＡｒの気体混合物中で維持される容量結合高周波プラズマにおけるナノ粒子の収集メカニズムを例示している。左側では、負に帯電したナノ粒子が正のプラズマ電位に留まり、イオン抗力、及びプラズマシースに沿った電位降下によって基板からはじかれる。本実施形態では、薄膜プラズマコーティングが、ナノ粒子の形跡なしに下部電極によって支持された平坦な基板上に堆積される（下の挿入図を参照）。右側では、下部電極に結合したウェル型ナノ粒子コレクタがプラズマ電位を修正する。正のプラズマ電位がコレクタに浸透し、ナノ粒子をウェル内に閉じ込めることができる（下の挿入図を参照）。一実施形態では、ナノＰ３材料は、本明細書に記載されるような装置内に、例えば図４に示されるようなコレクタを利用して収集される。
本明細書で定義されるようなナノＰ３材料を作製するための本明細書で定義された装置の使用もまた本明細書に開示される。
ナノＰ３材料を調製するプロセスの一実施形態では、反応チャンバ内でプラズマを発生させるために第１電極にＲＦ（高周波）電力が供給され、第２電極が、前記反応チャンバ内で放電中に自発的な帯電によって定まる浮遊電位に浮遊して達することが可能となる。第１電極に印加されるＲＦ電力は、プラズマ放電を発生させ維持するのに十分であるべきである。それは、ガス、例えば炭化水素ガス、反応性の非重合性ガス、及び窒素のような追加のガスの混合物をフラグメント化、解離またはイオン化するのに十分でなければならず、それらのフラグメントは、得られるポリマー材料に組み込まれ得る。それは、ガスの解離及びフラグメント化から生じるプラズマ放電中のラジカル種を生成するのに十分であるべきである。それは、反応チャンバ内でナノ粒子材料を形成する間、反応チャンバ内でプラズマ放電を持続させるのに十分であるべきである。
図３は、ナノＰ３材料の形成に利用することができる装置を概説する。この図は、下部電極（１）、電極支持体（２）、下部電極用高圧電源接続部（３）、ウェル型ナノ粒子コレクタ（４）、上部電極（５）、及び上部電極用高圧電源接続部（６）を示す。本明細書では、（３）及び（６）の組み合わせを使用してもよい。一実施形態では、（３）は、パルス状の高圧電源に接続されるか、または浮遊電位にあり得（すなわち電源に接続されていない）、そして（６）は高周波電源に接続され得る。
ＲＦ周波数は、約１〜約２００ＭＨｚ、または約１〜２５、１〜５０、１〜７５、１〜１００、１〜１２５、１〜１５０、または１〜１７５ＭＨｚ、例えば、約１、約２、約３、約４、約５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、または約２００ＭＨｚであり得る。
それは約５〜約５００Ｗ、または約５〜１００、５〜２００、５〜３００、または５〜４００Ｗ、例えば、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００Ｗの電力を有し得る。
パルス状バイアス電圧は、約１Ｈｚ〜約５０ｋＨｚ、または約１Ｈｚ〜２０ｋＨｚ、１Ｈｚ〜１０ｋＨｚ、１Ｈｚ〜５ｋＨｚ、５Ｈｚ〜５０ｋＨｚ、１０Ｈｚ〜５０ｋＨｚ、２０Ｈｚ〜５０ｋＨｚ、１０Ｈｚ〜２０ｋＨｚ、または２０Ｈｚ〜３０ｋＨｚの周波数を有し得る。
バイアス電圧は、約−１０００Ｖ〜約１０００Ｖ、または−５００〜５００、−２００〜２００、−１００〜１００、−５０〜５０、−１０００〜０、−５００〜０、−２００〜０、−１００〜０、−５０〜０、０〜５０、０〜１００、０〜２００、０〜５００、または０〜１０００Ｖ、例えば、約−１０００、−９００、−８００、−７００、−６００、−５００、−４００、−３００、−２００、−１００、−５０、０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００Ｖであり得る。
いくつかの実施形態では、バイアス電圧はゼロ以外である。したがって、バイアス電圧は、正または負のいずれかであり得、それぞれの場合において、１０〜１０００、または２０〜１００、５０〜１０００、１００〜１０００、２００〜１０００、５００〜１０００、または１００〜５００Ｖの絶対値を有し得る。パルス電圧はチャンバに対するものであり得る。
チャンバは接地されていてもよい。第２電極は接地されていてもよい。あるいは、電圧は、プラズマシース全体にわたる電位の降下によって定められる浮遊電極の帯電の結果として生じる自己バイアスであり得る。パルス持続時間は、約１〜約１５０マイクロ秒、または約１〜１００、１〜５０、１〜２０、１〜１０、１０〜１５０、２０〜１５０、５０〜１５０、１００〜１５０、１０〜１００、１０〜５０、または５０〜１００マイクロ秒、例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０マイクロ秒であり得る。
パルスのオフ時間とオン時間との間の比は、約１０（すなわち１０：１）〜約２０、または約１０〜１５、１５〜２０、または１３〜１７、例えば、約１０、１３、１５、１７、または２０であり得る。場合によっては、それは１０より大きくてもよく、必要に応じて、最大１００、または最大９０、８０、７０、６０、５０、４０、または３０であってもよい。
第１電極及び第２電極は、例えば約５〜約６０ｃｍ、または約５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１０、１０〜６０、２０〜６０、３０〜６０、４０〜６０、１０〜３０、または２０〜４０ｃｍ、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０ｃｍの距離で適切に隔地される。一般に、第１電極は、第２電極の上に配置される。
プラズマ発生中、反応容器内の圧力は、通常、絶対圧力約１〜約１５００Ｐａ（約７．５ｍＴｏｒｒ〜約１１５Ｔｏｒｒ）、または約１０〜１５００、１００〜１５００、２００〜１５００、５００〜１５００、６００〜１５００、７００〜１５００、８００〜１５００、９００〜１５００、１０００〜１５００、１１００〜１５００、１２００〜１５００、１３００〜１５００、１４００〜１５００Ｐａ、例えば約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、または１５００Ｐａの間である。通常、この圧力を達成するために、反応容器を最初にこの圧力未満、例えば約１０ｍＰａ未満、または約５、２、１、０．５、０．２または０．１ｍＰａ未満に排気する。次に、ガスまたはその個々の成分ガスを十分な速度でチャンバ内に逃がすことによって所望の圧力が達成され、これは排気速度と一緒に調節され、チャンバ内で所望の圧力及び所望のモノマー滞留時間を達成する。チャンバ内のガス分子の滞留時間は、プラズマ中のモノマー及び他のガス分子のフラグメント化の程度を決定する。必要な流速は、反応チャンバのサイズに依存することが理解されよう。しかしながら、反応チャンバ内の圧力を監視することによって（例えば、チャンバの内部空間と連結した圧力計によって）、流速（複数可）及び排気速度を調節し、所望の圧力及びガス滞留時間を達成することは簡単なことである。ガスは、チャンバに導入される前に個々の成分ガスから調製されてもよく、またはガスの個々の成分ガスがチャンバに別々に導入されてもよい。後者の場合、ガス中の成分ガスの比率は、異なる成分の異なる流速を制御することによって制御され得る。ガスが３種以上の個々の成分を含む場合には、チャンバ内に導入されるガスのうちの少なくとも１種は、それ自体が混合物であり得るか、または別々の各成分ガスが個別に導入され得る。成分ガスは有機ガスを含み、１種以上のキャリアガス、１種以上の非重合性ガス、及び任意に他の成分ガスをさらに含んでもよい。
ガスは有機、すなわち炭素を含み二酸化炭素ではない少なくとも１種のガスを含む。少なくとも１種のガスは、本明細書で定義されたようなモノマーである。それは、炭素−炭素二重結合及び／または炭素−炭素三重結合を含み得る。それは、アルケンまたはアルキンであり得る。それは、そのようなガスの混合物であり得る。有機ガスは、本プロセスの条件下で重合可能であり得る。ガスは、２種以上の有機ガスを含み得る。この文脈では、ガスは、反応チャンバ内のその時点で優勢である温度及び圧力でガス状態にある物質であると見なされる。したがって、例えば、標準温度及び圧力のペンタンは液体であるが、本プロセスの減圧下ではそれは気体と見なされる。場合によっては、ガスはまた、標準温度及び圧力のガス、例えばアセチレン（エチン）でもよい。
有機ガスの流速（または全ての有機ガスの流速の合計）は、約０．１〜約４０００ｓｃｃｍ（標準立方センチメートル／分）、または約１〜４０００、１０〜４０００、５０〜４０００、１００〜４０００、５００〜４０００、１０００〜４０００、２０００〜４０００、０．１〜２０００、０．１〜１０００、０．１〜５００、０．１〜２００、０．１〜１００、０．１〜５０、０．１〜１０、０．１〜１０００、０．１〜１００、０．１〜１０、または０．１〜１ｓｃｃｍ、例えば約０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、または４０００ｓｃｃｍであり得る。次いで、キャリア及び反応性非重合性ガス（複数可）の流速を調節し、反応チャンバ内で所望の圧力及び滞留時間を達成することができる。収集時間は、１分未満〜約３０分、もしくは１〜２０、１〜１０、１〜５０、５〜３０、１０〜３０、２０〜３０、５〜２０、５〜１０、もしくは１０〜２０分、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５もしくは３０分、または３０分よりも長くてもよい。収集時間は、約３０秒〜約１分の範囲であり得る。
作製されるナノＰ３材料の特に望ましい特性に応じて、流速、圧力及び電力のいずれも変えることができることが理解されよう。したがって、流速、圧力及び電力のそれぞれについて本明細書に例示されている数値または範囲のいずれも、任意の組み合わせで一緒に使用され得る。例えば、一実施形態では、約０．５〜約１０ｓｃｃｍの流速、約２０Ｐａの圧力、及び約５０Ｗ〜約１００Ｗの電力が使用され得る。本明細書では、他の全ての可能な組み合わせが想定される。
一実施形態では、方法は、工程ｉ）における有機金属化合物への導入をさらに含む。有機金属化合物の例には、酸化鉄及びガドリニウム化合物が含まれる。
一実施形態では、上述のようにプラズマから作製されたナノＰ３材料は、１つ以上のコレクタ、例えば図４に記載されるようなコレクタに収集され得る。コレクタ（複数可）は、第２電極に近接して配置されてもよい。それ（それら）は、第１電極の下に配置されてもよい。それ（それら）は、第１電極と第２電極との間の第１電極の垂直下に配置されてもよい。それ（それら）は、活性プラズマ領域におけるナノ粒子材料の捕捉を可能にし得る。これは、粒子のアグロメレーションを制御するため重要である。コレクタ（複数可）は、活性グロープラズマ領域内のナノ粒子材料の収集を可能にし得る。一実施形態では、コレクタ（複数可）は、バイアルまたは複数のバイアルであるか、またはそれらを含む。あるいは、または加えて、コレクタ（複数可）は１つ以上のウェルであるか、またはそれを含む。複数のバイアルは、プレート内のウェルの形態であり得る。別の実施形態では、バイアルまたはウェルは、約２〜約２０ｍｍ、または約２〜１０、２〜５、５〜２０、１０〜２０、または５〜１０、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｍｍの深さを有し得る。場合によっては、バイアル（複数可）は、２０ｍｍより深い場合がある。
コレクタの基部は完全に平面でも実質的に平面でもよい（例えば、基部の縁部はコレクタの側壁との接触点で丸みを帯びていてもよいし、またはコレクタの側壁を形成するために丸められていてもよい）。コレクタの基部の表面積は、好ましい幾何学的形状のナノＰ３材料を収集するために所望に応じて調整してもよい。同様に、コレクタの側壁の高さ（すなわち、コレクタの基部からのそれらの距離）は、好ましい幾何学的形状のナノＰ３材料を収集するために所望に応じて調整してもよい。
一例において、コレクタの側壁の高さは、１ｍｍ〜５０ｍｍ、例えば１ｍｍ〜４０ｍｍ、例えば１ｍｍ〜３０ｍｍ、例えば１ｍｍ〜２０ｍｍであり得る。したがって、コレクタの側壁の高さは、３ｍｍ〜１７ｍｍであり得る。あるいは、コレクタの側壁の高さは、２ｍｍ〜２０ｍｍ、または５ｍｍ〜１５ｍｍ、または７ｍｍ〜１２ｍｍ、または任意の他の適切な範囲であり得る。別の例では、コレクタの壁の高さは、約３ｍｍ、約４ｍｍ、約５ｍｍ、約６ｍｍ、約７ｍｍ、約８ｍｍ、約９ｍｍ、約１０ｍｍ、約１１ｍｍ、約１２ｍｍ、約１３ｍｍ、約１４ｍｍ、約１５ｍｍ、約１６ｍｍ、約１７ｍｍ、約１８ｍｍ、約１９ｍｍまたは約２０ｍｍであり得る。一つの好ましい実施形態では、コレクタの側壁の高さは約１７ｍｍである。他の高さは、ナノＰ３材料の所望の幾何学的特性に応じて選択することができる。側壁の高さは、ナノＰ３材料を合成するのに使用されるモノマー（複数可）に応じて選択することができる。
ナノＰ３材料の所望の幾何学的特性に応じて、ウェル型コレクタの周囲の形状もまた調整してもよい。ナノＰ３材料を合成するのに使用されるモノマー（複数可）に応じて、ウェル型コレクタの周囲の形状を調整してもよい。例示のみのために、ウェル型コレクタの周囲の形状は、円形、正方形、楕円形、長方形、三角形、五角形、六角形など、またはほぼ円形、ほぼ正方形、ほぼ楕円形、ほぼ長方形、ほぼ三角形、ほぼ五角形、ほぼ六角形などであってよい。
コレクタの基部が一般に円形の場合、半径は、目的のナノＰ３の所望のサイズ及び収率に基づいて選択されてもよい。一例では、半径は、１ｍｍ〜５０ｍｍ、例えば１ｍｍ〜４０ｍｍ、または１ｍｍ〜３０ｍｍ、または１ｍｍ〜２０ｍｍ、または１ｍｍ〜１０ｍｍ、または２ｍｍ〜８ｍｍ、または３ｍｍ〜７ｍｍ、または４ｍｍ〜６ｍｍであり得る。あるいは、半径は、約３ｍｍ、約４ｍｍ、約５ｍｍ、約６ｍｍ、約７ｍｍ、約８ｍｍ、約９ｍｍ、約１０ｍｍ、約１１ｍｍ、約１２ｍｍ、約１３ｍｍ、約１４ｍｍ、約１５ｍｍ、約１６ｍｍ、約１７ｍｍ、約１８ｍｍ、約１９ｍｍ、約２０ｍｍであり得る。
コレクタの側壁の高さ対コレクタの半径の比は、ナノ粒子材料の所望のサイズ及び収率に応じて調整してもよい。一例では、コレクタの側壁の高さ対コレクタの半径の比は、約５：１〜０．１：１である。例えば、コレクタの側壁対コレクタの半径の比は、約３：１〜１：１、または約１．８：１〜１：１、または約１．６：１〜１：１であり得る。コレクタの側壁対コレクタの半径の比は、約５：１、または約４：１、または約３：１、または約２：１、または約１：１、または約０．８：１、または約０．６：１、または約０．４：１、または約０．２：１であり得る。
コレクタは密封可能であり得る。したがって、バイアル（複数可）またはウェル（複数可）は密封可能であり得る。バイアルまたはウェルをプラズマに曝すと効果的に滅菌されるため、バイアルまたはウェル内に直接ナノ粒子材料を収集することは、単一工程でバイアルまたはウェルを収集する、かつ滅菌するための便利な方法を提供する。本明細書の他の場所で説明されるように、ナノ粒子材料は治療目的のために、または治療用途のためのコンジュゲート及び医薬組成物の形成において使用され得るため、滅菌はそれらの最終用途において重要であり得る。コレクタは、非導電性材料でできていてもよく、または導電性材料でできていてもよい。それはプラズマに耐えることができる材料でできていてもよい。それは例えばガラス製であり得る。
ナノＰ３材料が生成及び収集されると、反応チャンバは窒素で通気され得る（すなわち、ほぼ周囲圧力にする）。次いで、ナノＰ３材料を反応性ガスに曝すことができる。これは、それらをプラズマチャンバから取り除くことによるか、または反応性ガスをチャンバに入れることを可能にすることによりなされ得る。ナノＰ３材料、一般にナノ粒子材料中のラジカル部位は、次いで反応性ガスと反応し得る。これにより、ナノＰ３材料を本明細書で定義されるような第２の種などの有機種と反応させて、それらの有機種をナノＰ３材料に付着させるために使用することができる官能基が形成され得る。通常、ガスは空気または窒素であるが、他のガスを使用してもよい。ガスは、酸素含有ガスであり得る。それは、ガスを含有する水蒸気でもよい。それは、水蒸気と酸素の両方を含有してもよい。あるいは、または加えて、ナノＰ３材料は、有機種または有機金属種などの第２の種、例えばイメージング試薬、タンパク質、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡ、生体分子、触媒、薬物、全細胞、細胞フラグメント、ミセル、リポソーム、ハイドロゲル、ポリマー粒子、半導体粒子、セラミック粒子、金属粒子、またはそれらの任意の２つの混合物と反応し得、第２の種をナノＰ３材料に付着させる（例えば共有結合的に付着させる）ようにする。
本開示は、様々な官能化ナノ粒子を利用するための便利な手段を提供する。ナノ粒子のサイズ、及び官能基密度は、それらが生成される条件を調節することによって調整してもよい。例えば、プラズマチャンバ内でナノＰ３材料を生成し収集することによって、粒子を滅菌容器内に密封することができる。それらは、次いで、必要に応じて使用直前に、有機種を含有する適切な試薬を密封バイアルに注入することによって、有機種などの適切な第２の種によって自由に官能化することができる。
ナノＰ３材料の粒子が真空チャンバ内で合成される場合、少なくとも１つの炭化水素前駆体及び少なくとも１つのバッファ（またはキャリア）ガスを含有するガスの反応性混合物が低圧及び低温プラズマ放電を発生させるために使用される。プラズマ放電は、高周波（ＲＦ）発生器、ＤＣ電源、またはパルスＤＣ電源などの電源または電源の組み合わせによって生成されてシステムに送達される電力を誘導的または容量的のいずれかで結合することによって生成される。バッファガスの高エネルギー励起閾値と相まってプラズマガス放電内の並外れた電力伝達は、プラズマ中に存在する後の種と他の種（電子及びイオンなどの荷電種、またはバッファガスから得られる原子及び分子を含む中性種のいずれか）との間の衝突を介して炭化水素前駆体分子をイオン化及び解離する非常に効率的なメカニズムを提供する。前駆体分子と他の種との間の相互作用により、一連の化学反応が開始され、ラジカル及び高次炭化水素の形成、及び最終的には核生成及び凝集プロセスによるナノ粒子の形成がもたらされる。炭化水素含有プラズマ放電を使用した炭素系ナノ粒子の作製は、ナノ粒子のサイズ、作製速度、表面の化学的性質、形態、及びラジカル濃度が、様々なプロセスパラメータ（印加電力、プラズマ励起周波数、ガス混合物、前駆体滞留時間、システム圧力、及び放電時間）を調整することによって定義される明確に制御可能であるかつスケーラブルなプロセスウィンドウを可能にする。加えて、窒素などのガスを含むことは、ナノ粒子表面の化学的性質の調整を可能にするだけでなく、水溶液中での粒子の分散及び凝集も調節する。
本発明者らは、ナノＰ３材料が、プラズマ放電中のモノマー（例えば炭化水素）及び他のガス（窒素など）の解離及びフラグメント化から生じると考えている。そのような解離メカニズムから生じるラジカル種は、プラズマ体積内で再結合し、不対電子を含有するナノＰ３材料を形成する。次いで、ナノ粒子構造中に捕捉された不対電子を用いて、生体分子を共有結合的に固定化することができる。
本開示は、ナノ粒子の成長段階及び除去段階、収集収率、ならびにサイズ単分散性を厳密に制御することができる、パルスバイアスナノ粒子コレクタを利用する収集プロセスを含む。ナノ粒子コレクタに提供される電気パルスは、様々な時間的プロファイルならびに様々な負及び正の印加電圧によって調節することができる。パルス時間プロファイルは矩形波を含む。これらは少なくとも１％のデューティーサイクルを有し得る。それらは１Ｈｚ〜３ｋＨｚの範囲の周波数、及び−１０００Ｖ〜１０００Ｖの範囲の印加電圧を有し得る。加えて、コレクタは、活性グロープラズマ領域において効率的かつ高収率のナノ粒子の回収を容易に可能にするウェル型形状を特徴とする。異なるウェル間の形状、深さ、及び間隔は、ナノ粒子の収集収率及び凝集を決定する。特に、１４．４ｇ／ｈｒ ｍ２のナノ粒子収率は、０．８ｃｍのウェル半径を有する２４個の円形ウェルを特徴とするコレクタを使用するか、または０．６３５ｃｍのウェル半径を有する９６個の円形ウェルを特徴とするコレクタを使用して達成され得る。他の適切なウェルプレートを必要に応じて選択してもよい。
図２は、ナノ粒子の形成及び成長に関与する提案されたメカニズムを簡単に示す。製造プロセス中、異なる成長段階で、異なるサイズ範囲を有する２つの群の粒子が形成される：最大約１０ｎｍまでのサイズを有する粒子の第１群と、約１００ｎｍ〜最大約５００ｎｍまでの範囲の直径を有する粒子を含む第２群。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）イメージングによる粒子の形態の分析（図２の挿入図を参照）は、第２群の粒子（より大きな球状粒子）が第１群のナノ粒子ポリマーの凝集体であることを示唆する。ナノ粒子ポリマーは初期段階で形成され、それらの成長はプラズマ化学によって左右される（段階１）。後者は、放電を生成するのに使用されるモノマー及び存在する他のガスの種類、ならびに種の滞留時間及びプラズマ放電へのエネルギー入力によって規定されるそれらのフラグメント化の程度に本質的に依存する。これらの初期のナノ粒子ポリマーの形成メカニズムは、異なる経路を辿ることができ、中性ラジカルまたは陰イオンもしくは陽イオンのいずれかを含む成長反応が支配的となり得る。プラズマ中のこれらの初期ナノ粒子ポリマーの数密度は、通常、電子密度及びイオン密度を超える。準中性の原理によれば、これは、ナノ粒子ポリマーの平均電荷がゼロに近いことを示している可能性がある。
ナノ粒子ポリマーがプラズマ中で臨界サイズ（約５ｎｍ〜最大約１０ｎｍまで）に達すると、負電荷と正電荷を帯びたクラスタが集まり始め、第２群のより大きな粒子群である凝集体が形成される（段階２）。この段階では、全ての成長粒子はプラズマ中に存在する電子及びイオンのシンクとして振る舞い、該成長粒子への荷電種の拡散はプラズマシースダイナミクスによって支配される。この現象は図５（画像Ｂ及びＣ）で確認され、そこでは分子イオン及び他の非荷電種に関連する発光帯の間の比率の時間発展は全体のプラズマスペクトルと逆位相にあることが示される。特に、凝集及び成長段階中のイオン集団の急速な減少が観察され、このことはイオン種が第２段階中でさらに消費され得ることを示している。凝集及び急速な成長段階中に、球状のシースが、成長粒子の周りに形成される。この球状のシースの発達は、図２に示すような球状の凝集体の形成をもたらす可能性が最も高い要因である。それらのより高い移動度のために、陽イオンと比較して電子は粒子に向かってより急速に拡散する。その結果として、成長粒子は負に帯電し、該成長粒子の成長は、より正の電荷を帯びたクラスタ及び正イオンを引き付けることによって強化される。臨界サイズ（これはプラズマパラメータに依存する）及び臨界密度に達した後、粒子表面上に集合した負電荷はさらなるナノ粒子ポリマーの凝集を抑制する。
粒子は負に帯電しているため、粒子は静電力により正のプラズマ電位領域に閉じ込められている。粒子が臨界サイズ及び質量に達すると、粒子に作用する他の力がより支配的になり（例えば、イオン抗力、熱泳動力、ガス粘性力、及び重力）、そして静電力に勝り、粒子がそれらの生成及び成長領域から遠ざけられる。粒子の除去は、粒子を含まない領域の形成をもたらし、新たな形成及び成長サイクルならびに新たに形成された粒子のその後の除去及び収集のための空間をもたらす（段階３）。この段階では、放電の全体的な放射強度は減少する。加えて、プラズマ中の相対イオン分率は再び増加し、イオンが粒子に向かって拡散するためにもはや消費されないことを示している。
ナノＰ３コレクタに印加された電圧は、粒子形成及び除去段階のダイナミクスを調節し得る。バイアスが印加されていない場合、凝集段階及び除去段階は同じ期間であるが、−５００Ｖまでの負電圧の増加は、より長いナノ粒子除去段階を促進する。バイアスを大きくすると、成長ナノ粒子に印加される電気力が強まる。したがって、ナノ粒子の質量をさらに増加させることは、持続する電気力に重力が勝り、粒子を放電から遠ざけるために必要である。その結果として、より長い凝集段階は、ナノ粒子ポリマーのさらなる凝集、その結果として、それらの消費をもたらし、より大きなナノＰ３材料を形成する。ナノ粒子コレクタの制御されたバイアスは、コレクタから離れたより小さなナノ粒子ポリマーを濾過する方法を提供し、その結果収集されたナノＰ３材料のサイズ単分散性が高まる。印加バイアスをさらに増加させると、凝集段階及び除去段階の急激な減少によって、ならびにナノ粒子収率の減少によって示されるように、ナノ粒子ポリマーの凝集及びそれに続く粒子形成が妨げられる。
ナノＰ３の形成は、同じ特性を有する連続した粒子が生成されることができ、単独運転中に連続的に収集されることができる周期的プロセスであることが示され得る。粒子形成のこの周期的な振る舞いは、例えば、図５に示すように、プラズマによって放出された放射線を収集し、それを発光分光法（ＯＥＳ）によって分析することによって直接観察することができる。
本明細書に開示される方法は、０．８ｃｍのウェル半径を有する２４個の円形ウェルを特徴とするコレクタを使用して、１４．４ｇ／ｈｒ ｍ２のナノ粒子収率を戻すことができる。
コンジュゲートの作製
ｉ）ナノ粒子ポリマー、凝集体、またはそれらの混合物、及び
ｉｉ）少なくとも１つの第２の種
を提供することと、
該ナノ粒子ポリマーまたは凝集体と該少なくとも１つの第２の種とが物理的または化学的に互いに結び付くように、該ナノ粒子ポリマーまたは凝集体と該少なくとも１つの第２の種とを接触させることと、
を含むコンジュゲートの形成方法が、本明細書にて開示される。
ナノ粒子及び／または凝集体は、本明細書に記載の方法によって作製してもよい。
コンジュゲート形成中、少なくとも１つの第２の種は、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体に共有結合的または静電的に結合し得る。
コンジュゲートを形成するプロセスは、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体を有機種または有機金属種などの少なくとも１つの第２の種と反応させ、前記第２の種を前記ナノ粒子ポリマーまたは凝集体に結合、例えば共有結合させることを含み得、これにより官能化ナノＰ３材料の形態でのコンジュゲートが作製される。ナノ粒子ポリマーまたは凝集体を反応させる工程は、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体を０〜約３０℃の温度で前記第２の種に曝すことを含み得る。該プロセスは、約１分〜約２４時間の範囲の時間にわたってナノ粒子材料を前記第２の種に曝すことを含み得る。ナノ粒子材料はコレクタに収集されてもよく、その場合、反応工程は第２の種をコレクタに導入することを含み得る。第２の種は、溶液中または分散液中または懸濁液中であり得る。
一実施形態では、ナノＰ３材料及び少なくとも１つの第２の種を含むコンジュゲートが、ワンポット反応で形成される。
２つ以上の第２の種をナノＰ３材料と組み合わせてコンジュゲートを形成することができる。ナノＰ３材料への２つ以上の第２の種の添加は、単一のワンポット反応または連続した別々の反応で起こり得る。一実施形態では、ワンポット反応においてナノＰ３材料と少なくとも２つの第２の種との間にコンジュゲートが形成される。別の実施形態では、連続していてもよい２つの別々の反応において、ナノＰ３材料と少なくとも２つの第２の種との間でコンジュゲートが形成される。
コンジュゲートの形成に続いて、１つ以上のさらなる第２の種に結合することができる追加の部位は、例えば、第２の種の付着を介してコンジュゲート上に導入されていてもよい未結合電子または官能性部分の形態でコンジュゲート上に残ってもよい。これは、異なる溶解度プロファイルなどの異なる化学的性質のために２つの第２の種が単一工程で導入できない場合、または保護基の化学的性質が特定の部分を保持するのに必要とされる場合に有利である。
コンジュゲートが形成されると、ナノ粒子のモノマーに組み込まれた官能基、またはコンジュゲートの形成後に導入された第２の種に存在する官能基は、さらなる第２の種を付着するためのその後の工程で使用することができる。
第２の種へのナノ粒子ポリマーまたは凝集体の結合は、迅速であり得、温和な条件下で行われ得る。結合条件は、荷電種の結合を容易にするために一時的に変えてもよい。したがって、反応は、３０分以内、または２０、２５、１０、５分、１分以下以内に実質的に完了（例えば、９０、９５または９９％完了）し得る。反応は周囲条件で、または約０〜約５０℃、または約０〜３０、０〜２０、１０〜５０、２０〜５０、３０〜５０、１０〜３０、または２０〜３０℃、例えば、約０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０℃の温度で実施することができる。より高い温度ではより迅速な反応が促進され得ることが理解されよう；しかしながら、反応は、生体分子のような有機種については第２の種が安定である温度で行われるべきである。この温度は、第２の種、またはコンジュゲーションプロセスにおいて利用される第２の種の混合物の性質によって異なる。
したがって、特定の用途の機能要件に合わせて調整された、様々な異なる分子カーゴの化学的コンジュゲーションを可能にするナノ粒子ベースの技術が本明細書に記載されている。ナノＰ３材料の官能化は、分子カーゴを粒子内に埋め込まれたラジカル及び／または官能性部分に直接結合することによって容易に達成され得る。ナノＰ３材料上への生体分子の固定化は、有機分子または他の化学的中間体による中間コーティング、予備官能化（ｐｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓａｔｉｏｎ）及びパッシベーション工程を必要とせずに、単純なインキュベーションによって達成される１段階プロセスであり得る。したがって、本明細書に開示されるナノＰ３材料の作製方法は、いかなるコーティング、予備官能化、パッシベーション工程、またはこれらの工程のいかなる組み合わせを含まなくてもよい。ナノＰ３材料の好ましい表面の化学的性質は、放電体積中での形成及び成長段階中の成長粒子上へのモノマーラジカル及び官能基の拡散及び凝集を含む、プラズマ放電による製造プロセスの結果である。さらに、提案された製造及び収集プロセスは、ナノＰ３材料特性の制御を可能にし、特にそれらのサイズ、ラジカル含有量、形態、表面の化学的性質、凝集、及び作製収率は、プラズマパラメータを調節することによって制御され得る。
本明細書に開示されるプロセス及び方法は、ナノＰ３材料の所望の特性または特性の組み合わせが得られるようにプラズマパラメータ（ガス圧力、電力、周波数、パルス長、電圧など）を設定する工程を含み得る。
固定化生体分子は、ナノＰ３材料の表面上に固定化された後にそれらの生物活性を維持することができる。裸の（ｂａｒｅ）ナノ粒子及び生体分子コンジュゲート型ナノ粒子の両方は、様々な細胞型によって容易に内在化させることができ、試験する全ての濃度において細胞に細胞毒性が誘発されることはない。加えて、薬物コンジュゲート型ナノ粒子は、がん細胞による内在化後に細胞毒性能力を維持し得る。重要なことに、ナノ粒子の共有結合固定化能力及び生体分子コンジュゲート型ナノＰ３材料の生物活性は、例えば少なくとも約１ヶ月間、または少なくとも約２、３または６ヶ月間、もしくは少なくとも約１、２、５、もしくは１０年間の長期間の凍結乾燥貯蔵後に維持されることが示されている。本明細書に開示されるプロセス及び方法は、ナノメディシン用途のための新たな種類の多官能性かつ多機能性ナノキャリアとして、プラズマナノ粒子を作製及び使用する便利な方法である。
現在のナノ粒子官能化戦略は、主に非イオン性ポリマー及び標的薬物送達用の特異的ターゲティングリガンドからなる、活性な表面の化学的性質を付加するための表面修飾のいくつかの方法に依存している。しかしながら、これは製造プロセスにおける追加の中間的で、複雑で、時間がかかり、かつコスト高な工程を表す。さらに、現在ナノキャリアに使用されているコーティングは、非常に低い薬物担持容量しか提供しない。本明細書に記載のナノＰ３材料の独特な表面の化学的性質は、中間官能化戦略を必要とせずにカーゴとの強力な共有結合を可能にする。これは、定義されたナノＰ３材料が、現在利用可能なプラットフォームの主要な限界の１つを克服する大きな可能性を秘めていることを意味する。本明細書に列挙された方法によって作製された粒子は、製造直後に単純な１段階プロセスで官能化され得、治療、イメージング、及び診断における特定の用途に適する調整された機能と共に販売され得る。
ナノＰ３は、分子の生物活性を維持しながら、ラジカル付着及び／または官能性部分を介して異なる分子カーゴを共有結合的に固定化できることが示されている。様々な種類の細胞による取り込みを評価するために、さらなるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが行われてきた。結果は、任意の特定の細胞透過剤を必要とせずに、ナノＰ３が細胞によって容易に取り込まれ得ることを示す。ナノＰ３材料は生体適合性があり、忍容性が良好であり、取り込み後最大４日後までは細胞毒性の徴候が見られないが、薬物コンジュゲート型ナノＰ３は、がん細胞において細胞毒性を誘導するのに有効である。加えて、ナノＰ３は細胞内にｓｉＲＮＡを送達することができ、細胞取り込みの４８時間後にタンパク質発現を著しく減少させる。
分子混合物を含むコンジュゲートは、疾患組織を標的とするための抗体もしくはタンパク質などのターゲティングリガンド；標的組織への粒子のリアルタイムトラッキングを可能にする造影剤、及び／または多官能性ナノキャリアの形成を可能にする薬物などの治療用タンパク質もしくは小分子を含み得る。本明細書に開示されるナノＰ３材料のラジカル媒介性結合容量は、全てのリガンドがナノ粒子に結合し、遊離のタンパク質または薬物が残らないように、ナノＰ３材料のバイアルに注入するタンパク質及び薬物の濃度を決定する。５分間の急速なインキュベーションの後、得られた薬物担持コンジュゲートの溶液は、時間のかかる湿式化学、予備コンジュゲーション、洗浄、または精製工程なしに患者に注射してもよい。これは病院での臨床使用のための技術のアップスケーリング及び変換を容易にする。
本発明者らは、ナノ粒子製造後少なくとも２ヶ月間、空気中に（室温で）保存されたナノ粒子に生体分子をうまくコンジュゲートさせることが可能であること、及びナノＰ３がカーゴを固定化する能力は、室温で空気中で保管してからの最初の６ヶ月間は実質的に一定のままであることを示した。１６ヶ月まで保存されたナノＰ３試料もまた、かなりの量のカーゴを結合する能力を保持しており、その保管期間後に観察された結合効率のわずかな減少は、単に溶液中のカーゴの濃度を増やすことによって克服できた。水中保存（室温）の場合、ナノ粒子中のラジカル密度は製造後１〜２週間で７０％減少する。ナノＰ３材料を製造後１〜２週間室温で空気中に保管すると、ナノ粒子中のラジカル密度は４４％しか減少しない。収集直後の真空条件下でプラズマチャンバ内のバイアルを密封することによって、そしてより低い温度でナノ粒子を保存することによって、コンジュゲーション前保管寿命を数ヶ月または数年まで著しく改善することができた。
本開示は、以下の非限定的な実施例においてさらに説明される。
材料及び方法：
ナノＰ３の合成
図２に概説した手順を用いてナノ粒子を合成した。
ナノＰ３粒子は、円筒形ステンレス鋼容量結合型高周波（ＲＦ）反応器中で合成した。Ｅｂａｒａ ＰＤＶ２５０及びターボ分子ポンプ（Ｅｄｗａｒｄｓ ＮＥＸＴ４００）からなる二重ドライ真空ポンプシステムを使用して、該反応器を約１０−６Ｔｏｒｒのベース圧力まで排気した。アルゴン、窒素、及びアセチレンの反応性ガス混合物がプラズマ放電を持続させるために使用され、チャンバの上部に位置するシャワーヘッド様装置を通して導入された。各ガスの流速は、Ａｌｌｉｃａｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃマスフローコントローラーによって個別に制御され、プラズマ生成前のフルレンジゲージ（ＰＦＥＩＦＦＥＲ ＰＫＲ２５１）によって測定された作動圧力は、特に明記しない限り、１５０ｍＴｏｒｒで一定に維持された。チャンバとポンプシステムとの間にバタフライ型バルブを配置し、排気効率、したがって活性プラズマ中の種の滞留時間を制御するように調節した。１３．５６ＭＨｚ（Ｅｎｉ ＯＥＭ−６）周波数発生器によって供給されるＲＦ電力を専用の整合回路を用いて上部電極に結合することによってプラズマ放電を発生させ維持した。ナノ粒子コレクタを、ＤＣ高電圧パルス発生器（ＲＵＰ ６−２５）に電気的に接続された第２の電極（ＲＦ電極から１０ｃｍ離れている）に配置して、−１０００Ｖ〜０Ｖの範囲の特定のバイアス電圧を提供した。パルス周波数及び時間幅は、それぞれ３ｋＨｚ及び２０μｓになるように選択した。
発光分光法
プラズマによって放出された放射線は、ナノ粒子コレクタの真上のプラズマ領域と見通し線内に配置された光ファイバによって得られた。放電スペクトルは、ＵＶ−ＶＩＳ−ＮＩＲ分光計（約０．２ｎｍのスペクトル分解能を有するＯｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ ＨＲ ４０００）によってモニターされ、２００〜１０００ｎｍの波長範囲をカバーするパーソナルコンピュータによって記録された。シグナルノイズ比の改善のため、積分時間を１０スキャンで３００ｍｓに設定し、各取得について平均化した。高分解能スペクトルが、１２００溝ｍｍ−１回折格子を備えたＡｃｔｏｎ ＳｐｅｃｔｒａＰｒｏ ２７５０分光計（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＳＡ）を使用して得られ、５０μｍで開いた入口スリットに対して０．０１４ｎｍの公称解像度をもたらす。放電発光スペクトルは、分光計の出射面と光学的に結合された１０２４×１０２４ピクセルアレイを有するＰＩ−ＭＡＸ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＳＡ）強化型電荷結合素子（ＩＣＣＤ）によって得た。ＩＣＣＤ露光時間は３００μｓであり、平均取得数は２５〜１５０の間で変動した。実験を通して全光学的設定を変えないようにした。プラズマ中のいくつかの種が関与する特定の放射遷移に関連した強度の時間的プロファイルを得るために、特定の測定を実施した（図２）。
Ｘ線光電子分光法
ナノ粒子の化学的特性評価は、半球形分析器及びＡｌ Ｋα単色Ｘ線源を備えたＳＰＥＣＳ−ＸＰＳ（Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）により研究した。システムを、２００Ｗの電力で９０°の取り出し角で、約１０−９Ｔｏｒｒの一定圧力で運転した。試料の調査スペクトルを、１ｅＶのエネルギーステップ及び３０ｅＶのエネルギーパスを使用して、５０ｅＶ〜１４００ｅＶのエネルギー範囲でスキャンした。Ｃ１ｓ、Ｎ１ｓ、及びＯ１ｓに関する高解像度スキャンを、０．０３ｅＶのエネルギーステップ及び２３ｅＶのエネルギーパスで記録した。ＣａｓａＸＰＳソフトウェアを用いてピーク分析を行った。粒子中のこれらの元素の原子分率は、Ｃ１ｓ、Ｎ１ｓ、及びＯ１ｓピークの積分面積を計算し、それらが合計１００％になる（すなわち、水素及び微量の他の元素を無視して）と仮定することにより決定された。ピークフィッティングは、各成分についてシャーリーバックグラウンド、及び同一の半値全幅を有する混合（ｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）ローレンツ（３０％）−ガウス（７０％）線形状を採用することによって実施した。電荷補償は、約２８５ｅＶの結合エネルギーでＣ１ｓピークにおいてＣ−Ｃ／Ｃ−Ｈ成分を割り当てることによって全てのスペクトルに適用した。
フーリエ変換分光法
Ｖｅｒｔｅｘ ｖ７０システムに統合され、ゲルマニウム結晶による２０ｘＡＴＲ対物レンズを備えたＢｒｕｋｅｒ Ｈｙｐｅｒｉｏｎ ＦＴＩＲ顕微鏡を用いて、減衰全反射モード（ＦＴＩＲ−ＡＴＲ）でフーリエ変換分光法によって赤外スペクトルを記録した。各スペクトルは、４０００ｃｍ−１〜７５０ｃｍ−１の範囲の波数で４ｃｍ−１のスペクトル分解能で合計５００スキャンを平均することによって得られた。下にある基板からのバックグラウンドシグナルを排除するために、スペクトルサブトラクション及びベースラインを適用した。
走査型電子顕微鏡及びエネルギー分散型Ｘ線分光法
ナノ粒子を３ｋＶ〜１０ｋＶの範囲の加速電圧で４〜８．５ｍｍの作動距離でＺｅｉｓｓ ＵＬＴＲＡ ＰＬＵＳ走査型電子顕微鏡を用いて画像化した。
電子スピン共鳴分光法
ナノ粒子中の不対電子の検出は、Ｂｒｕｋｅｒ ＥＭＸｐｌｕｓ Ｘバンドスペクトロメーターを用いたＥＳＲ分光法によって実施した。スペクトルは、３４９０Ｇの中心磁場、９０ｍｓのサンプリング時間、３Ｇの変調振幅、１０５Ｈｚの変調周波数、ならびにそれぞれ９．８ＧＨｚ及び２５ｍＷのマイクロ波周波数及び電力で収集した。ナノＰ３材料を超純水に懸濁し、１５０μＬの試料容積の石英ガラス製Ｓｕｐｒａｓｉｌフラットセル内に移した。定量的ＥＰＲ分析は、ナノ粒子の二重積分スペクトルを既知のスピン線密度（約１０１３スピン／ｃｍ）の標準試料と比較することによって実施した。
ゼータ電位
ナノＰ３及びコンジュゲート型ナノＰ３材料の表面電荷は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、使い捨て折り畳みキャピラリーセル（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＤＴＳ１０７０）中のゼータ電位を測定することによって決定した。平均値及び対応する標準偏差が計算された；ｎ＝３。
Ｉｎ ｖｉｖｏイメージング
ナノＰ３を、ヌクレアーゼ不含水中で２．５μｇ／ｍｌのＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼ（ａｂｃａｍ，Ｌ９５０６）に４℃で１時間コンジュゲートし、Ｂｉｏ ＲＳ−２４ミニローテーターを用いて穏やかに撹拌した。２００ｎｍの金ナノ粒子（Ｃｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｇ−２００）へのルシフェラーゼのコンジュゲーションも同様に実施した。インキュベーション後、ナノＰ３試料を、ヌクレアーゼ不含水中で１回の洗浄あたり５分間、１６，１００ｇでの遠心分離によって３回洗浄したが、金ナノ粒子は製造元の指示にしたがって３回均等に洗浄した。次に各試料を１００μｌの生理食塩水に再懸濁し、１ｍＬのシリンジに移した。
動物を４つの異なるグループに分けた：
（１）介入なし；
（２）ナノＰ３のみ；
（３）金ナノ粒子とルシフェラーゼ、及び
（４）ナノＰ３とルシフェラーゼ。
次いで尾静脈注射の前にマウスの背部に創傷を作った。ルシフェラーゼの検出のために、それぞれの決められた時点で、Ｄ−ルシフェリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ａ１８８８）を各動物に皮下注射した。次いで、ＩＶＩＳシステムを介して創傷側で生物発光を検出した（露光時間：３分）。
コンジュゲートを合成するための一般的な方法
ナノＰ３は、ＲＴ−ＰＣＲグレードの水（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，４３８７９３６）を含む組織培養フード内で無菌条件下でナノ粒子コレクタから収集した。ナノＰ３の濃度はＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００によって測定した。ナノＰ３を所望の第２の種とインキュベートして４℃で１時間コンジュゲートを形成させ、Ｂｉｏ ＲＳ−２４ミニローテーターを用いて穏やかに撹拌した。インキュベーション後、試料を１６，１００ｇで５分間の遠心分離により洗浄した。
実施例１−ナノＰ３の合成
ナノ粒子ポリマー及び凝集体は、上記の「ナノＰ３の合成」のセクションで概説した方法を用いて調製した。アセチレン以外の他のモノマーから他のナノ粒子ポリマー及び凝集体を形成することができることが理解されよう。
例えばアルキンの放出を用いてプラズマ体積中の炭化水素モノマーの重合を制御することによって、本発明者らは、官能性ナノ粒子ポリマー及び凝集体を設計及び収集し、それらの固定化能力を実証することができ、多官能性ナノキャリアが促進された。ナノ粒子ポリマー及び凝集体は、一例では、プラズマポリマー薄膜を堆積させるために以前に開発されたプラズマ重合反応器内で合成することができる（Ｍ．Ｓａｎｔｏｓ，ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，８，９６３５−９６５０，２０１６；Ｇ．Ｙｅｏ，ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．，２（４），６６２−６７６，２０１６；その内容は参考として本明細書に組み込まれる）。ナノ粒子ポリマー及び凝集体の形成は、非侵襲性のｉｎ−ｓｉｔｕ発光分光法を用いてリアルタイムでモニターすることができる（図２）。小さなナノ粒子ポリマー（約１０ｎｍ）の形成は、最初に全体のプラズマ発光強度が３２％増加することによって明らかになった（図２「クラスタ凝集前」）。放電中に静電的に浮遊している間、ナノ粒子ポリマーは、次いで急速に凝縮して高度に球形の凝集体（約１００ｎｍ）を形成した。凝集段階は、放電放出の急激な増加及び収集された凝集体の密度の５倍の増加と同時に起こる（図２「クラスタ凝集中」）。粒子に作用する正味の力が該粒子をプラズマから押し出すと、放電放出が成長サイクルの始めに記録されたベースライン値に戻る。この除去段階の間に、落下する粒子は、ウェル型のパルスバイアスコレクタへと引きつけられる。これにより明確に定義された単分散サイズのナノＰ３の制御された収集が可能になる。これまでに報告されているアルキンの放出の振動は、時間とともに減衰することを特徴とするが（Ｊ．Ｗｉｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍａ Ｓｏｕｒｃｅｓ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１８ ０３４０１０（８ｐｐ），２００９）、本発明者らは、反応器にＮ２を添加することによりナノ粒子形成を安定化し（方法参照）、ナノ粒子の中断のない形成及び収集を可能にした。
図２は、プラズマ／気相におけるナノ粒子ポリマー及び凝集体の形成、成長、及び収集を示す概略図を表す。挿入図は、ナノクラスタ凝集の前及び間のプラズマの画像、ならびに収集された凝集体のＳＥＭ顕微鏡写真を示す。
ナノ粒子ポリマー及び凝集体の特性を調節し、収集収率を最適化するために、プラズマを一連の異なるガスフロー、ＲＦ電力、及び圧力の条件で維持した。本発明者らは、以下を調節することによって、ナノ粒子ポリマー及び凝集体の収率を最大化した：
（ｉ）放電に結合した電力；
（ｉｉ）放電圧力；
（ｉｉｉ）モノマー流速；及び／または
（ｉｖ）コレクタ寸法。
ナノ粒子ポリマー及び凝集体の表面積／体積比は、凝縮して球状、固体状、及び非晶質の凝集体を形成する最初に形成されたナノ粒子ポリマーのサイズの減少により、より速いモノマー流速で最大となった。ＲＦ電力の増加により、低い多分散指数を維持しながら、より高い収率のナノ粒子及びより小さな凝集体の作製もまた可能となった。ナノＰ３合成中にコレクタウェルの外側及び内側でナノＰ３に作用すると理解されている力を図５に示す。左側の粒子の概略図は、基板ホルダーの上に形成されたプラズマシースの近くの垂直な平衡位置を想定している。この位置は、静電力、及び重力、中性抗力（ｎｅｕｔｒａｌ ｄｒａｇ）、及びイオン抗力の垂直成分との間のバランスによって定義される。反応器の側壁へのイオンの流束によるイオン抗力の水平成分は、最終的にはナノ粒子が基板表面に到達し得る前にナノ粒子を活性プラズマから引っ張り出す。反対に、正のプラズマ電位がウェルにかかると、右側の粒子が捕捉される。粒子のサイズが大きくなるにつれて、重力及び抗力が静電気力に勝り、該粒子がウェルの下部に向かって引っ張られる。イオン抗力の水平成分は、ウェル内部で互いに打ち消し合う。
粒子凝集は、ウェルの高さ（ｈ）及び半径（ｒ）によって調節され得る。図６パートＡは、プラズマ陽性電位がウェル全体に向かって完全に浸透することができないことを示す。粒子はクーロン反発力を介して活性プラズマ内で互いに反発するが、ウェル内のアフターグロー領域の進行は、それらが下部に達する前に粒子凝集を引き起こす。挿入図は、ｈ１＝１７ｍｍ及びｒ１＝７．８ｍｍのウェルに収集されたナノＰ３凝集体のＳＥＭ画像を示す。図６のパートＢは、アフターグロー領域の広がりがｈ１＝１１ｍｍ及びｒ１＝３．４ｍｍのウェル内では減少し、最小限の凝集でナノＰ３の収集を可能にすることを示す。したがって、コレクタの寸法は、好ましいサイズのナノ粒子及び凝集体を生成するために変えることができる。
図７の画像Ａは、ナノＰ３の製造中に取得したプラズマの全体的な発光スペクトルを示す。本明細書では、粒子を、容量結合型高周波反応器内で、励起周波数１３．５６ＭＨｚ、印加電力５０Ｗ、及び全ガス圧力８０ｍＴｏｒｒのアセチレン（炭素前駆体）、窒素、及びアルゴンの反応性混合物を用いて作製した。粒子コレクタは、−５００Ｖの電圧及び３ｋＨｚの周波数で２０μｓのパルスを用いてバイアスをかけた。
放電中のいくつかの放射遷移に関連する分子発光帯及び原子線の時間プロファイルは、図７の画像Ｂに示される。プラズマスペクトルの時間発展は、定常状態の振る舞いに従わないが、明確に定義された長い時間スケールでの変動を示す。観察された振動は、ナノ粒子の形成及び成長のサイクル、ならびにそれらのその後のプラズマ体積からの除去に関連している（数字は、図２に示された異なる段階に対応する）。分子イオン及び他の非荷電種に関連した発光強度の比の時間的プロファイルは、プラズマスペクトルの時間的プロファイルと逆位相にあることが示される（図７，画像Ｃ）。このことは、イオンがクラスタ凝集及び急速成長段階の間にさらに消費され得ることを示している。
図８の画像Ａは、コレクタの単位面積あたりのナノ粒子の数、ならびに放電体積中でのナノ粒子形成及び成長中の異なる時点で３８０ｎｍで測定された発光強度を示す。ナノ粒子密度及び発光強度の両方における７６秒〜８５秒の間の急激な増加（図２の段階２）は、小さなクラスタが核を形成し、より大きな球形のナノ粒子を形成する急速な凝集段階を示す。放出強度は、除去段階（３）の間に減少し、そこでは収集されたナノ粒子の数が変化しないことによって示唆されるように、さらなる粒子が生成されない。図８の画像Ｂは、動的光散乱法によって測定された放電中の異なる時点で収集されたナノ粒子の粒度分布を示す。急速凝集段階（≧７６秒）の間及び後に収集されたナノ粒子は、より小さいクラスタの完全な核生成のために、より狭い粒度分布を特徴とする。
図９はまた、ナノ粒子コレクタに印加されたバイアスの関数としてクラスタ凝集（段階２；成長段階）及び粒子除去（段階３；除去段階）の期間を示す。
本明細書に記載の方法を使用したナノ粒子の作製は、１つ以上のプロセスパラメータ及びプラズマが点火された後に粒子が収集される時間に応じて、粒子成長速度の微調整を可能にする。図１０の画像Ａは、モノマー流速の関数としてＳＥＭによって測定された粒径を示す。したがって、本明細書に開示されるナノ粒子ポリマー及び凝集体のサイズは、それらが作製されるプロセスの１つ以上のパラメータを変えることによって調節することができる。例えば、本明細書に開示されるナノ粒子ポリマー及び凝集体のサイズは、流速を低下させることによって増大させることができる。逆に、本明細書に開示されるナノ粒子ポリマー及び凝集体のサイズは、流速を増加させることによって減少させることができる。本明細書に開示されるナノ粒子ポリマー及び凝集体のサイズは、それらが作製されるプロセスの１つ以上の他のパラメータを変えることによって調節することができることが理解されよう。例えば、本明細書に開示されるナノ粒子ポリマー及び凝集体のサイズは、高周波電力を減少させることによって増大させることができる。逆に、本明細書に開示されるナノ粒子ポリマー及び凝集体のサイズは、高周波電力を増加させることによって減少させることができる。
ナノ粒子サイズを制御することは、異なるナノメディシン用途における特定の調整に重要である。例えば、粒子注入後の生体内分布及び薬物動態は、ナノ粒子のサイズに依存することが知られている。収集したナノ粒子の粒度分布においてパルスバイアス粒子コレクタを使用することの重要性は、図１０の画像Ｂにさらに例示されている。コレクタにバイアスをかけること(図１０，画像Ｂ)は、バイアスをかけられていないコレクタ（図１０，画像Ｃ）で回収されたより多分散したサイズのナノ粒子と比較して、収集されたナノ粒子のサイズ選択性を改善することが判明した。本明細書で定義される生成物の別の有益な特徴は、ナノ粒子材料の粒度分布を厳密に調整する能力である。ＳＥＭ画像は、ナノ粒子が非常に狭い粒度分布を有し、全てがほぼ同じ直径を有することを示している（図１０，画像Ｄ）。粒子の単分散性粒度分布は、本明細書中に記載する方法によって作製されたナノ粒子の固有の特徴である。
加えて、ナノ粒子は、現在入手可能な球状のナノ粒子プラットフォーム（例えば、球状の金ナノ粒子及び他の球状の金属またはポリマーのプラットフォーム）と比較して、大きな表面積対体積の比を特徴とする。表面積の増加は、滑らかな球形表面と比較して、小さなクラスタが凝集し、より大きな球形のカリフラワー様粒子が形成されることを伴う製造プロセスに直接起因する。プラズマパラメータを調節することによって、ナノ粒子の表面積を調整することが可能である。図１０の画像Ｄは、異なる炭素前駆体の流速を使用した異なるプラズマの運転で合成されたナノ粒子を示す。この実験では、他の全てのプラズマパラメータ（例えば、圧力、電力、及びバッファガスの流速）は一定のままであった。モノマー流速を増加させると（左から右へ）、より粗い表面を有するナノ粒子、すなわちより大きな表面積を有する粒子が生成された。したがって、本明細書に開示されるナノ粒子ポリマー及び凝集体の表面粗さは、それらが作製されるプロセスの１つ以上のパラメータを変えることによって調節することができる。例えば、本明細書に開示されるナノ粒子ポリマー及び凝集体の表面粗さは、モノマー流速を増加させることによって増加させることができる。逆に、本明細書に開示されるナノ粒子ポリマー及び凝集体の表面粗さは、モノマー流速を減少させることによって減少させることができる。
炭素源分子の流速を増加させると、それらの密度が増加し、その結果クラスタをプラズマから引き離す、より大きな中性抗力が生じる。加えて、これらの炭素種の解離及びイオン化の減少もまた、プラズマ中でのそれらの滞留時間の減少により予期される。その結果として、初期クラスタの成長は、それらが凝集してより大きな粒子を形成することが可能になる前の早い段階で抑制される。したがって、より速い流速領域は、クラスタのさらに急速な凝集を引き起こし、より小さいサイズであるがより量の多いクラスタを特徴とするナノ粒子を形成する。本明細書に開示されるようなより小さいナノ粒子もしくは凝集体、及び／またはより粗い表面を有するナノ粒子もしくは凝集体は、ナノ粒子及び／または凝集体の表面積／体積比を増大させることができることが理解されよう。したがって、本明細書に開示されるナノ粒子及び／または凝集体の表面積／体積比は、それらが作製されるプロセスの１つ以上のパラメータを変えることによって調節することができる。例えば、本明細書に開示されるナノ粒子及び／または凝集体の表面積／体積比は、モノマー流速を変えることによって調節することができる。
大きな表面対体積比は、特に治療用途におけるナノ粒子にとって望ましい特徴であり、ナノ粒子あたりのより高い薬物担持容量を可能にし、薬物効率を高め、これにより毒性を減らす。ナノ粒子の有効表面の改善はまた、標的細胞の認識のためのターゲティングリガンド、制御送達のための刺激感受性剤（ｓｔｉｍｕｌｕｓ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ）、造影剤及び治療剤、またはさらには単一の安定な構築物中の複数の薬物によるさらなる表面官能化（薬物担持を損なうことなく）のための余地を残す。例えば医用イメージングの分野では、マルチモダリティイメージングに対する需要が高まっている。マルチモーダルイメージング技術は、解剖学的イメージング技術（構造の詳細用）と機能的イメージング技術（機能及び形態の詳細用）を、時間及び空間における同期画像取得のための独特なプラットフォームへとまとめることを目的とする。したがって、単一のプラットフォームに全ての必要な画像造影剤を組み込む必要がある。ナノ粒子ポリマーまたは凝集体の表面は、いくつかの造影剤で官能化することができ、そのより大きな表面積に起因して、シグナル及び解像度の増強を実現することができる。最後に、除去及び収集段階中のナノ粒子のアグロメレーションは、適切なコレクタ形状を選択することによって制御することができる。ウェル深さが１７ｍｍのコレクタを使用するとミクロンサイズの凝集体が形成されることが判明し（図１０，画像Ｅ，右側）、ウェル深さがわずか３ｍｍのものを使用すると凝集体のない試料が収集される（図１０，画像Ｅ，左側）。
表面の化学的性質及び化学的コンジュゲーション能力の分析
アセチレン／窒素／アルゴンプラズマ放電で作製されたナノ粒子の場合、窒素の存在下でアセチレンを使用して作製されたナノ粒子及び凝集体は、主に炭素及び窒素で構成されている（図１１）。水素も存在すると予想されるが、この方法では検出できない。ナノ粒子の表面元素組成及び結合配置は、Ｘ線光電子分光法を用いてより詳細に分析した。結果は、それぞれ６５．６％、２７．６％、及び６．８％の相対濃度での炭素、窒素、及び酸素の存在を明らかにする。したがって、本明細書に開示されるナノ粒子及び／または凝集体は、それぞれ６０〜７０％、２０〜３０％、及び５〜１０％の相対濃度で炭素、窒素、及び酸素を含み得る（例えば、Ｘ線光電子分光法によって決定されるように）。
図１１の画像Ａ及びＢは、それぞれ高解像度ＸＰＳのＣ１ｓ及びＮ１ｓのコアレベルとそれに対応するデコンボリューションの詳細を示す。２８４．９ｅＶ、２８６．３ｅＶ、２８７．８ｅＶ、及び２８９．４ｅＶに位置するＣ１ｓピークに４つの成分を割り当てることができる。最も低いエネルギーの電子結合エネルギーに対応する第１のピークは、Ｃ−Ｈ結合と同様に非晶質ネットワークにおける純粋な炭素配置に対応し、第２及び第３のピークは、種々の環境におけるＣ−Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｃ−Ｎ、Ｃ＝Ｎ、ならびにニトリル基などの窒素及び酸素原子との異なる炭素混成に対応し、第４のピークは種々のＣＯＯ化合物に対応する。ＸＰＳ Ｎ１ｓのピーク（図１１Ｂ）もまた４つの異なる成分にデコンボリューションすることができる。第１のピークは３９８ｅＶに位置し、ピリジン−Ｎ型化合物に見られるような２個の炭素原子に結合した窒素；またはｓｐ３混成炭素原子に結合したｓｐ３窒素原子が割り当てられる。３９９．２ｅＶを中心とするピークを有する第２の成分はニトリル基及びアミン基の両方が割り当てられる。４００．４ｅＶを中心とする第３のピークは、グラファイト−Ｎ構造の場合のように３個のｓｐ２炭素原子に三角形結合した窒素、または非晶質ＣＮネットワークの２個のｓｐ２及び１個のｓｐ３炭素原子に結合した窒素原子に起因する。４０２．０ｅＶの第４のピークは一酸化窒素化合物に起因する。
減衰全反射モード（ＦＴＩＲ−ＡＴＲ）で測定されたフーリエ変換赤外分光法は、ＸＰＳによって得られた結果を裏付ける。図１１の画像Ｃは、３７５０ｃｍ−１〜７５０ｃｍ−１の波数範囲で得られた典型的な赤外スペクトルを示す。スペクトルは、３６００ｃｍ−１〜２８００ｃｍ−１ならびに１７５０ｃｍ−１〜１０５０ｃｍ−１との間に位置する２つの広い吸収帯を特徴とする。最初の帯は、Ｏ−Ｈ（約３５００ｃｍ−１）、ＮＨ（約３３００ｃｍ−１及び約３２００ｃｍ−１）、及びＣ−Ｈ（約２８８０ｃｍ−１、約２９３５ｃｍ−１〜約２９７０ｃｍ−１）の伸縮振動に起因する一方、第２のより広いバンドは、Ｃ＝Ｏ（約１７１５ｃｍ−１）、Ｃ＝Ｃ（１６４０ｃｍ−１〜１６８０ｃｍ−１）、Ｃ＝Ｎ（１６４０ｃｍ−１〜１６９０ｃｍ−１）の伸縮振動、及びＮＨ（約１５００ｃｍ−１）及びＣ−Ｈ（約１４５０ｃｍ−１〜約１３８０ｃｍ−１）の曲げ振動、芳香環中のＣ−Ｃ伸縮振動（約１４５０ｃｍ−１）、及びＮ−Ｏ（約１３４０ｃｍ−１）、Ｃ−Ｎ（約１２５０ｃｍ−１）、及びＣ−Ｏ（１２００ｃｍ−１〜１０００ｃｍ−１）の伸縮振動に起因する。約２１７０ｃｍ−１に位置するピークは、ニトリル基の伸縮振動に起因し、約９００ｃｍ−１のピークは、不飽和炭素集合体の面外振動に起因する。
ナノ粒子について測定されたＸＰＳ及びＦＴＩＲスペクトルは、金属基板上に堆積及び成長した、同様のプロセス条件で調製された炭素系薄膜において測定されたスペクトルに似ている。これらの薄膜は、様々な埋め込み型の生物医学的装置上に堆積され、異物を覆い隠すために使用され、このようにして被覆された埋没物の生体適合性を高める。さらに、これらの膜は、埋め込まれたラジカルによって生物活性タンパク質及び他の生体分子の共有結合的固定化が可能であることもまた示された。
粒子成長は、プラズマ中に形成されたイオン、モノマーラジカル、及び官能基の流入によって促進される。さらに、ＣＯ、ＮＯ及びＯＨ基の存在は、ナノ粒子が真空から除去され、実験室の雰囲気に曝されるとすぐに、大気中の酸素が活性ラジカルと反応していることを示す。したがって、本発明者らは、ナノ粒子のＣＮ：Ｈ非晶質構造中に不対電子が存在すると仮定している。図１２の画像Ａは、２ｓｃｃｍのアセチレン流速を使用した場合に製造されたナノ粒子の典型的なＥＰＲスペクトルを示す。約３４９５Ｇ（２．００４のｇ因子）を中心とする広い共鳴ピークは、ナノ粒子内の不対電子（ラジカル）の存在を裏付ける。図１２の画像Ｂは、異なる周囲条件で保存されたナノ粒子のラジカルキネティクスを示す。２４℃の水中に保存されたナノ粒子は、プラズマから収集された後、最初の２４時間以内に５０％のラジカル減衰を示した。水中に４℃で保存した場合は、同じ５０％のラジカル減衰は１５０時間後に初めて観察された。結果は、初期ラジカル密度がプラズマから収集されてから２４０時間後に半分にしかならなかった周囲温度においてさえも、ナノ粒子が空気中に保存された際にラジカル安定性がより高いことを示唆する。したがって、本明細書に開示されたナノ粒子及び凝集体は、液体中での保管に特に適している。
結果は、凝集体の表面の化学的性質がラジカル及び／または部分媒介反応によって変換され得ることを示唆する。ラジカル拡散は温度活性的であり、酸素との反応で最高潮に達する。表面酸化は、プラズマチャンバ内でより高いベース圧力でナノ粒子を生成することによって、または空気中でナノ粒子を曝露してその後保存することによって引き起こされる。凝集体表面は、Ｃ２Ｈ２／Ａｒプラズマ中のＮ２を単純に添加することによってさらに官能化することができる。窒素は、ＣＮ混成の形態、プラズマ／気相に見られるラジカル分子、及び表面アミン官能基の形態でナノ粒子に組み込まれる。
不対電子の存在は、コンジュゲーションを得るために化学リンカー分子及び多段階湿式化学を使用する必要なく、活性形態の様々な生体分子との強固な共有結合的コンジュゲーションを可能にすることによって、ナノＰ３材料を多機能かつ生体適合性のナノキャリアとして使用するための道を開く。これは、商業的な文脈において、重要なプロセスの簡略化、環境への影響の低減、及び大幅なコスト削減を意味する。興味深いことに、ナノ粒子ポリマー及び凝集体中の不対電子は、超偏極技術による磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）の観点から調査することができる固有の角運動量源である。超偏極は、それらの角運動量を特定の核に移動させることによって高度にスピン偏極された不対電子を活用し、化合物をＭＲＩ造影剤として使用するのに適したものにする。したがって、本明細書に開示されるナノＰ３材料は、任意の追加の造影剤をそれにさらにコンジュゲートすることなく造影剤として使用され得る。加えて、プラズマ放電による本発明の作製方法の多様性は、種々の炭化水素前駆体の容易な導入を可能にし、これは、特定用途に応じて、ナノ粒子にさらなる磁性元素または他の戦略上重要な元素を導入するために使用することができる。
ナノ粒子ポリマー及び凝集体の特性を調整するために、多くの変数を変更することができ、結果として得られる材料への影響が調査される。
図１３では、プラズマに結合した様々な動作圧力及び電力に対応する、ナノ粒子形成中のＣＮラジカル分子及びＮ２ ＋分子イオンに関連する発光強度の時間的プロファイルが示されている。他の全てのパラメータは、この一連の実験内で固定された。凝集は、Ｎ２ ＋分子イオンの最大発光強度及びＣＮ集団の最小発光強度に対して生じた。結果は、ＣＮラジカル分子がナノ粒子形成中にさらに消費されることを示唆する。概して、振動の周波数は、電力及び圧力の増加と共に増加し、これはナノ粒子がより速い速度で作製されることを示している。さらなる試験において類似の条件を利用したが、以下：使用される様々な値のアセチレン流速（１〜８ｓｃｃｍ）、１５０ｍＴｏｒｒ、ならびにＡｒ及びＮ２ガスの固定流速３〜１０ｓｃｃｍ、ならびに各ｓｃｃｍで放電に結合した固定された５０Ｗ、７５Ｗ、または１００Ｗ（それぞれ図１４、１５及び１６）も利用した。
図１７は、５０、７５、及び１００Ｗの結合型高周波電力について、アセチレン流速（画像Ａ）及び圧力（画像Ｂ）の関数としての振動の周期を示す。他の全てのプラズマパラメータは一定に保たれた。各合成運転の期間は、窒素分子イオンの発光強度の３つの連続する最大値間の時間差を平均することによって計算した。より低いアセチレン流速では、振動の周期は結合型電力によって高度に調節される。ナノ粒子作製速度の差は、モノマー流速の増加にとってさほど重要ではなく、モノマーがさらに過剰になることはナノ粒子作製に寄与しないことを示している。
概して、結果は、ナノ粒子作製について記述する関連する巨視的パラメータが、∝Ｗ／Ｆ（式中、Ｗは放電に結合した電力であり、Ｆはモノマー流速である）であることを示している。加えて、より速いモノマー流速では、プラズマ中の前駆体分子の滞留時間が減少し、その結果、より低い割合のフラグメント化モノマー分子も生じる。粒子がプラズマからより急速に押し出されるので、流速の増加に伴うガス抵抗力の増加も急速な成長サイクルの原因となるであろう。振動の周期は、ナノ粒子合成中に放電が維持される圧力を変えることによってさらに調節することができる。ナノ粒子収率は、モノマー流速及びプラズマに結合したＲＦ電力の関数として図１７（画像Ｃ）に示される。概して、結果は、収率が、印加されたＲＦ電力と共に増加し、１００Ｗ及び６ｓｃｃｍに対して１４．４ｇ／ｈｒ ｍ２で最大になることを示す。研究された全てのＲＦ電力に対して、より速いモノマー流速においてより低い値に減少する前に、収率プロファイルは最大値をとることを特徴とする。より速いモノマー流速において収集されたナノ粒子の数の減少は、体積重合が表面重合に抑制される放電中の遷移に関連している。この遷移に影響を与える重要なパラメータは、放電体積中のモノマーの滞留時間である。最大収率点を下回る流速において、供給される全てのモノマーを効果的にフラグメント化するのに十分なモノマーあたりのエネルギーがあり、増加するガス流は放電体積内で利用可能な反応性フラグメントの数を増加させる。しかしながら、最大収率点を超える流速では、電力は、もはや効果的なフラグメント化には十分ではないため、放電体積中にナノ粒子を形成するのに十分反応性であるフラグメント集団の割合が減少し、増加する非反応性フラグメント集団の存在が、体積中の粒子形成速度を減少させる。
図１８は、５０、７５、及び１００Ｗで１〜８ｓｃｃｍのモノマー流速範囲内でのナノ粒子作製中のＣＮラジカル分子及びＮ２ ＋分子イオンの最大及び最小発光強度を示す。全体として振動の振幅は流速の増加と共に減少する。
図１９は、様々な値の窒素流速についてのナノ粒子形成中のＣＮラジカル分子及びＮ２ ＋分子イオンに関連する発光強度の時間的プロファイルを示す。他の全てのパラメータは、この一連の実験内で固定された。
図２０の画像Ａは、ナノ粒子ポリマー及び凝集体作製中の振動周期におけるＮ２の影響を示す。振動周期は、Ｎ２含有量と共に著しく減少し、ＣＮラジカルがナノ粒子成長において重要な役割を果たすことを示唆している。画像Ｂは、プラズマ反応器内のナノ粒子に作用する、より高いガス抵抗力の結果として、窒素流速の増加と共にナノ粒子サイズが減少することを示す。したがって、本明細書に開示されるナノ粒子及び凝集体のサイズは、窒素などのキャリアガスの流速を変えることによって調節することができる。また、画像Ｃは、ナノ粒子ゼータ電位がプラズマ反応器内のより高い窒素分率と共に増加することを示す。窒素分率が高いと、ナノ粒子構造内に（ＣＮ結合またはアミン官能基のいずれかの形態で）組み込まれた全体的な窒素が増加する。正電荷を帯びたアミン表面官能基（例えば、図２４に示されるように）は、より高い窒素分率で観察される増加したゼータ電位の原因とすべきである。ナノ粒子サイズ（上部）及び収率（下部）における放電への結合電力の影響も図２２に示されている。
図２１は、粒子を含む溶液のｐＨの関数としてのナノＰ３粒子のゼータ電位を示す。結果は、溶液中の陽イオン及び陰イオンの濃度を調整することによって、ナノＰ３材料を囲む電荷を容易に調節することができることを示している。この特徴は、ナノＰ３材料と高電荷の第２の種との間で、または強い双極子モーメントによってコンジュゲートを作製するときに特に有用である。等電点は、異なるプラズマパラメータの下でナノＰ３材料を作製することによっても調整することができる。したがって、本明細書で開示される方法は、本明細書に開示されるように第２の種をナノ粒子または凝集体にコンジュゲートするときにｐＨを調節することを含み得る。ｐＨは、コンジュゲートされる第２の種の電荷に応じて増減させることができる。
図２３は、異なる結合電力及びモノマー流速によって調製されたナノ粒子上の炭素、窒素、及び酸素の割合を示す。画像Ａは、固定アセチレン流速（例えば２ｓｃｃｍ）で１００Ｗ及び７５Ｗで調製されたナノ粒子が実質的に同じ元素分率を有することを示す。結果は、同じ化学構造を持つナノ粒子が、１２．５％のサイズ変動範囲で、異なる収率で製造できることを示唆している（図２０）。結果は、ナノ粒子内の炭素／窒素比がより速いモノマー流速において増加することも示している。画像Ｂ〜Ｇは、それらの合成後の異なる期間におけるナノ粒子元素分率を示す。概して、結果は、保管期間と共に窒素含有量が減少すること（例えば、図２３画像Ｃでは１日目に最大３８．２％〜９日目に３４．２％）及び炭素酸素分率の増加を示し、後者は表面酸化によるものである（図２５）。
図２４は、異なる保管期間でのナノ粒子ポリマー及び凝集体に関するＦＴＩＲ測定値を示し、ＸＰＳで観察された窒素の減少がニトリル（Ｃ≡Ｎ）結合での減少によって主に引き起こされることを明らかにしている。約３２５０ｃｍ−１の広いピークは、表面アミン官能基の存在を示す。
アセチレン及びアルゴンのみの放電（窒素なし）で作製されたナノ粒子のさらなるＦＴＩＲ測定値を図２５に示す。測定により保管期間と共にＣＯ結合が著しく増加したことが確認され、ナノ粒子ラジカル密度の減衰とも一致する。
実施例２−ナノＰ３の蛍光特性
定常状態発光分光法を使用して、本発明者らは、水溶液（または細胞培地）中に分散したナノＰ３がＵＶ−ＶＩＳ−ＮＩＲ範囲内で自己蛍光性であることを見出した。マイクロプレートリーダーを使用して、乾燥（合成されたまま（ａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ））及び再懸濁した（ＰＣＲグレードの水または細胞培地）ナノＰ３の両方の蛍光発光／励起スペクトルを測定した。図２６の画像Ａは発光プロファイルが励起エネルギーに依存することを示し、図２６の画像Ｂは強度が溶液中のナノＰ３濃度と共に著しく増加することを示す。図２６の画像Ｃは、ウェルコレクタにおける合成されたままの乾燥ナノＰ３の蛍光分布を示す。マッピングモードで各ウェルをスキャンすることによって、ウェル内のナノＰ３の分布を測定した。３０×３０マトリックスを使用し、９００ポイント／ウェル分解能を得た。励起モノクロメーター及び発光モノクロメーターをそれぞれ３６０ｎｍ及び４３０ｎｍに設定し、ゲインを２２００に、焦点重量を９ｍｍに設定した。図２６の画像Ｄは、ナノＰ３の蛍光特性が、青色、緑色、黄色、及び赤色のチャネルで測定された共焦点蛍光顕微鏡によって確認されたことを示す。この実験では、合成パラメータは、アセチレン、窒素、及びアルゴンに対してＱ＝３、１０、及び３ｓｃｃｍ、作動圧力１５０ｍＴｏｒｒ、ならびに高周波電力５０Ｗに設定した。
実施例３−ナノＰ３の蛍光特性パート２
マイクロプレートリーダーを使用して、乾燥（合成されたまま）及び再懸濁した（ＰＣＲグレードの水または細胞培地）ナノＰ３の両方の蛍光発光／励起スペクトルを測定した。図２７の画像Ａは、最大ストークスシフトが３６０ｎｍの励起波長で８０ｎｍ、６００ｎｍの励起で２５ｎｍに減少したことを示す。ストークスシフトは、励起波長を対応する発光波長から差し引くことによって計算された。図２７の画像Ｂは、ナノＰ３蛍光の強度が溶液中で経時的に増加することを示し、これは、粒子表面へのラジカル拡散によって引き起こされる連続的な表面酸化と相関していた。この実験では、合成パラメータは、アセチレン、窒素、及びアルゴンに対してＱ＝３、１０、及び３ｓｃｃｍ、作動圧力１５０ｍＴｏｒｒ、ならびに高周波電力５０Ｗに設定した。
実施例４−ナノＰ３に結合した分子カーゴの定量化
本発明のナノＰ３は多くの利点を提供する。ナノＰ３によって与えられる利点の一例は、有効担持量を保持するために使用される凝集体の数によって有効担持量を適合または最適化することができることである。本発明者らは、ナノＰ３表面に結合した分子の総数が最終的にはナノＰ３表面積及びカーゴの分子量との比率に依存することを見出した（図２８）。インキュベーション後にナノＰ３に結合した分子カーゴの量を、ナノＰ３の吸光度及び／または蛍光測定を用いて計算した−カーゴ試料及びそれらの対応する洗浄液（カーゴ＝２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、パクリタキセル−Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８（パクリタキセル）、ＣＹ５−ＣＰＫＫＫＲＫＶ−ＮＨ２（ｓｉＲＮＡ）、及びヤギ抗ラットＩｇＧ−Ａｌｅｘａ６４７（ＩｇＧ））。全体的に見て、分子量の増加とともに、ナノＰ３に結合した分子の数は著しく減少した。この実験では、プラズマパラメータは、アセチレン、窒素、及びアルゴンについてＱ＝３、１０、及び３ｓｃｃｍ、１５０ｍＴｏｒｒ、ならびに５０Ｗに設定した。ナノＰ３（１０９ナノＰ３／ｍＬ）とカーゴとのインキュベーションは、室温でＲＴ−ＰＣＲグレード水（ｐＨ＝７）中で１時間実施した。
実施例５−ナノＰ３に結合した分子カーゴの定量化
図２９は、結合カーゴの量が溶液中のそれらの濃度と共に増加することを示す。薬物（パクリタキセル）、造影剤（インドシアニングリーン；「ＩＣＧ」）、及びターゲティングリガンド（ＩｇＧ）による例示は、それぞれ２．３μｇ、２．９μｇ、及び０．８μｇで表面飽和を示した。この実験では、プラズマパラメータは、アセチレン、窒素、及びアルゴンについてＱ＝３、１０、及び３ｓｃｃｍ、１５０ｍＴｏｒｒ、ならびに５０Ｗに設定した。ナノＰ３（１０９ナノＰ３／ｍＬ）とカーゴとのインキュベーションは、室温でＲＴ−ＰＣＲグレード水（ｐＨ＝７）中で１時間実施した。
実施例６−ナノＰ３の結合キネティクス
単純なナノＰ３コンジュゲーションプロセスに関連する結合キネティクスは、異なるインキュベーション時点及び温度で結合カーゴの量を測定することによって評価することができる。ナノＰ３材料を、実施例５で計算された正確な量のインドシアニングリーン（ＩＣＧ）とコンジュゲートさせて、単層、すなわち単一のナノＰ３粒子（半径９９ｎｍ）上の１．９×１０６のＩＣＧ分子においてナノ粒子表面を飽和させた。図３０は、総カーゴの９０％が２４℃でのインキュベーション後の最初の３０秒以内にナノＰ３の表面に固定化された一方、より低い温度（４℃）でのインキュベーションは同じ時点で６０％の結合をもたらしたことを示す。両方の条件に対して、インキュベーション後５分以内に表面飽和が達成された。この実験では、プラズマパラメータは、アセチレン、窒素、及びアルゴンについてＱ＝３、１０、及び３ｓｃｃｍ、１５０ｍＴｏｒｒ、ならびに５０Ｗに設定した。ナノＰ３（１０９ナノＰ３／ｍＬ）とＩＣＧとのインキュベーションは、室温でＲＴ−ＰＣＲグレード水（ｐＨ＝７）中で１時間実施した。
実施例７−ナノＰ３の保管寿命
ナノ粒子プラットフォームが臨床用途に適用可能であるためには、長い保管寿命及び官能化への容易な経路が必要条件である。ナノＰ３は、リンカー化学または長いインキュベーション期間を必要としない、費用及び時間効果の高いナノ粒子プラットフォームをもたらす。テンプレート分子としてインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を用いて、長期間保管したナノＰ３の結合効率を測定した。図３１は、ナノＰ３がカーゴを固定化する能力が、室温で空気中に保存されてから最初の６ヶ月間は実質的に一定のままであることを示す（図３１）。最大１６ヶ月まで保存された試料については、結合効率において２８％の減少（有意ではない）が観察された。しかしながら、溶液中のＩＣＧの濃度を増加させることによって、ナノＰ３の表面を完全に飽和させることは依然として可能であった。低温、真空、または他の非反応性環境を含む、代替的な保管方法を採用することによって、場合により長期の保管寿命が実現する。プラズマパラメータは、アセチレン、窒素、及びアルゴンについてＱ＝３、１０、及び３ｓｃｃｍ、１５０ｍＴｏｒｒ、ならびに５０Ｗに設定した。ナノＰ３（１０９ナノＰ３／ｍＬ）とＩＣＧとのインキュベーションは、室温でＲＴ−ＰＣＲグレード水（ｐＨ＝７）中で１時間実施した。
実施例８−ナノＰ３に結合したカーゴはその活性を保持
インドシアニングリーン（ＩＣＧ）は、それぞれ８０５ｎｍ及び８３０ｎｍでの発光波長及び励起波長を有する蛍光色素である。このスペクトルウィンドウにおける組織の吸光度特性が低いために、ＩＣＧは医療診断のために臨床で広く使われている。しかしながら、ＩＣＧは、ｉｎ ｖｉｖｏでの短い半減期循環を特徴とする。
図３２は、ＩＣＧが、ナノＰ３に結合した場合、水溶液中で著しく長期間にわたってその活性を保持することを示す。ナノＰ３表面へのＩＣＧの結合は、溶液中の遊離ＩＣＧと比較して、７８０ｎｍ〜８４０ｎｍの吸光度ピークの６０ｎｍのレッドシフトによって確認された。遊離ＩＣＧ及びＩＣＧコンジュゲート型ナノＰ３のＶＩＳ／ＮＩＲプロファイルは、小型カーゴ（＜１０００Ｄａ）の分解がナノＰ３に固定化されると著しく遅延することを確認した。プラズマパラメータは、アセチレン、窒素、及びアルゴンについてＱ＝３、１０、及び３ｓｃｃｍ、１５０ｍＴｏｒｒ、ならびに５０Ｗに設定した。ナノＰ３（１０９ナノＰ３／ｍＬ）とＩＣＧとのインキュベーションは、室温でＲＴ−ＰＣＲグレード水（ｐＨ＝７）中で１時間実施した。
実施例９−ナノＰ３へのカーゴの結合はｐＨを変えることによって調節することができる
検出のためにＣｙ−５蛍光標識に結合した正荷電を帯びたペプチド配列（Ｃｙ−５−ＣＰＫＫＫＲＫＶ−ＮＨ２）を用いて、高荷電カーゴへのナノＰ３の結合も調べた。
このペプチド配列は、細胞核を標的とすることができる核局在化配列として使用されることが多い。この核標的化能力は、リジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）を含む複数の極性（カチオン性）アミノ酸の存在によって主に推進される。図３３は、中性ｐＨでのナノＰ３とペプチドの最初のインキュベーションが、より中性のカーゴについて観察された予期された強固なコンジュゲーションをもたらさなかったことを示す。高度に正荷電を帯びたペプチドへの結合には、溶液のｐＨを１０に上げることが必要であった。ｐＨが上がると、ナノ粒子の表面基は、ｐＨ＞８で徐々に脱プロトン化され、溶液が高アルカリ性媒体へと移ると、粒子はそれらの等電点に到達し、徐々に負に帯電するようになる。そのような状況では、ペプチドはナノＰ３の表面に引き寄せられ、続いて物理的接触により固定化される。結合ペプチドを含む溶液のｐＨが中性に戻ったとき、ペプチドは結合したままであった。これらの結果は、一般に溶液ｐＨの操作を用いて荷電リガンドの結合を高め、該荷電リガンドが双極子モーメントを有する場合には、場合によりそれらを表面上に配向させることができることを実証する。
実施例１０−ナノ粒子ポリマーの凝集及び溶解度
ナノ粒子ポリマー凝集体は、以下のように異なるｐＨでリン酸緩衝液（ＰＢ）中で試験された。
ナノ粒子材料を、ｐＨ２．５〜ｐＨ１２の範囲の異なるｐＨで濾過したＰＢ（０．２μＭシリンジフィルター）を用いて、組織培養フード内の無菌条件下で粒子コレクタから収集した。濾過水を用いて対照ナノ粒子材料を収集した。フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ）を使用して、試料を３分間、または合計イベント数が１０，０００に達するまで分析した。ナノ粒子ポリマーの凝集は、前方及び側方光散乱の観察を介して、別々に検証された非凝集ナノ粒子ポリマーの試料に対して適切なフィールドをゲートすることによって定量した。各測定値は、ナノ粒子の全集団１００％に正規化した。
ナノ粒子の溶解度及び溶出性は、ｐＨ２．５〜ｐＨ１２の範囲の異なるｐＨ値で水及び様々な緩衝液中で試験した。個別に確認した単分散のナノ粒子の集団を水中の１０％ＳＤＳに再懸濁したものに基づいて、「凝集なし」から「主要な凝集」までの集団をゲートするフローサイトメトリーによって分析を行った。異なるナノ粒子懸濁液の分析は、水がナノ粒子の単分散性にとって最適な溶液であることを明らかにした（図３４，画像Ａ）。試験した全ての塩含有溶液は、ｐＨ２．５で良好な単分散性が観察される著しく高い凝集を示した（図３４，画像Ａ）。理論に拘束されることを望むものではないが、この挙動を推進する特定のメカニズムは、ナノ粒子の電荷及びそれらが緩衝溶液中のイオン性塩と相互作用することによる可能性が高い。一度溶液中のナノ粒子の安定性についての分析も実施した。
水中のナノ粒子材料の結果は、溶液に入れて２６日後であっても単分散性のナノ粒子集団を示す（図３４，画像Ｂ）。
実施例１１−細胞毒性試験
最初の研究では、３つの異なる細胞型について細胞毒性を評価した：
１）ヒト冠動脈内皮細胞（ｈＣＡＥＣ，４継代，Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，３００−０５ａ）；
２）ヒト冠動脈平滑筋細胞（ｈＣＡＳＭＣ，５継代，Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，３５０−０５ａ）及び；
３）乳癌細胞（ＭＣＦ７，１５継代，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，８６０１２８０３）。
約５，０００細胞／ｃｍ２を数え、平底９６ウェル培養プレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後、次いで、５００万個の粒子／ウェル〜９，７６６個の粒子／ウェルのナノ粒子ポリマーの段階希釈液を、各濃度のナノ粒子ポリマーに対してｎ＝５の反復で培地に添加した。７２時間のインキュベーション後、細胞傷害性評価は、ＭＴＳ細胞増殖及び細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ３５８０）を用いて実施した。ＭＴＳ試薬を製造元の指示にしたがって各ウェルに添加し、さらに２時間インキュベートした。生細胞によって生成されたホルマザン色素は、４９０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量した。未処理細胞（ナノＰ３なし）及びラパマイシン（１００ｎＭ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｒ８７８１）で処理した細胞を対照として使用した。
図３５は、ヒト冠動脈内皮細胞（画像Ａ）、ヒト冠動脈平滑筋細胞（画像Ｂ）、及び乳癌細胞株ＭＣＦ−７（画像Ｃ）の存在下で段階希釈したナノ粒子ポリマー及び凝集体の存在下での細胞毒性試験の結果を示す。
粒子を含まない細胞対照と比較して、５００万ナノ粒子／ウェルの存在下であっても、ヒト冠動脈内皮細胞は、生存率の有意な減少を示さなかった。これはヒト冠動脈平滑筋細胞についての結果に反映された。乳癌細胞株ＭＣＦ−７の場合、全ての濃度のナノＰ３は、全体的な細胞生存率を中程度に低下させたが、ラパマイシン陽性対照の範囲までではなかった。
実施例１２−コンジュゲーション研究パート１
図３６は、抗体によるナノＰ３の単一官能化の概略図を示す。図３７は、薬物によるナノＰ３の単一官能化の概略図を示す。図３８は、抗体及び薬物によるナノＰ３の官能化の概略図を概説する。
とりわけ、本発明者らは、蛍光標識（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ ５９４、Ｃｙ５、Ｃｙ７）及び金属標識抗体（例えば、金及び銀）を本明細書に開示されたナノＰ３にうまく共有結合させた。
二次抗体、薬物、及び／またはタンパク質へのナノＰ３のコンジュゲーションは、以下の手順を用いて評価した：
ナノＰ３を、ＲＴ−ＰＣＲグレードの水を用いて組織培養フード内で無菌条件下でナノ粒子コレクタから収集した。ナノ粒子の濃度は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０によって測定した。次いで、ナノ粒子を、光から保護して４℃で最大１６時間まで、所望の抗体（ヤギ抗ラットＩｇＧ−Ｃｙ５；ａｂｃａｍ ａｂ６５６５；及びヤギ抗ウサギＩｇＧ；１：１００希釈でのａｂｃａｍ ａｂ１５００８９）、薬物（ドキソルビシン：１００μｇ／ｍｌでのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄ１５１５、及び５μｇ／ｍＬでのパクリタキセル−Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐ２２３１０）またはタンパク質（０．５μｇ／ｍＬでの西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＨＲＰ；Ｐ６７８２）にコンジュゲートさせた。１５０ｎｍの金ナノ粒子へのＨＲＰのコンジュゲーションを同じ方法で実施した（Ｃｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｇ−１５０）。試料をＢｉｏ ＲＳ−２４ミニローテーターを用いて穏やかに撹拌した。インキュベーション後、試験試料及び適切な対照を、最初の４回の洗浄については５分間１６，０００ｇで遠心分離し、５回目の洗浄については１５分間洗浄することによって５回均等に洗浄した。プレートリーダーを用いて蛍光強度を測定し、Ｅｘ／Ｅｍは各抗体または薬物上の蛍光色素標識にしたがって設定した。例えば、Ａｌｅｘａ ４８８及びＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ４８８のＥｘ／Ｅｍが４９４／５１７であるのに対し、Ｃｙ５のＥｘ／Ｅｍは６５０／６６７ｎｍである。ドキソルビシンのＥｘ／Ｅｍは、４７０／５８５である。ＨＲＰの検出では、コンジュゲート型ナノ粒子及び各対照を、色が視認されるまでＡＢＴＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ａ１８８８）及び過酸化水素（Ｍｅｒｃｋ；３８６７９０）と共にインキュベートし、４０５ｎｍで測定した。
予備試験を実施し、ナノ粒子と接触したときの細胞の挙動を評価した。二次ＦＩＴＣコンジュゲート抗体をナノ粒子と共に２時間インキュベートし、コンジュゲーションを可能にした。抗体コンジュゲート型ナノ粒子を水中で徹底的に洗浄した後、この材料を単層の内皮細胞（ｈＣＡＥＣ）、平滑筋細胞、単球（Ｊ７７４Ａ）、及び肺癌細胞（ＬＬＣ）に加え、２４時間インキュベートした。細胞形態を得るために明視野で、ナノ粒子の検出のために緑色蛍光フィルターで、生細胞イメージング装置上で５分間隔で画像を撮影した。結果は、実験の最初の２時間以内に全ての細胞型によるナノ粒子の明らかな取り込みを示した。本発明者らの細胞毒性研究で以前に確認されたように、ストレスまたは毒性の明らかな徴候を示すことなく、蛍光標識ナノ粒子の取り込み後、細胞は実験の２４時間全体にわたって活性を維持した。さらに、細胞核の周囲及び細胞質内に大量のナノ粒子が含まれているにも関わらず、細胞は容易に分裂した。染色体の凝縮及び分離、細胞質分裂、ならびにその後の細胞の組織培養プレートへの再付着は全て妨げられず、試験した細胞型を有するナノ粒子の良性の性質を示していた。
図３９は、金標識ＩｇＧ抗体とインキュベートし、走査型電子顕微鏡を用いて撮像したナノ粒子ポリマーの走査型電子顕微鏡画像を示す。画像では、それぞれ最大の円はナノ粒子材料である一方、抗体は二次電子（画像Ａ）及び後方散乱電子（画像Ｂ）モードで示されているようにずっと小さい（矢印）。
実施例１３−コンジュゲーション研究パート２
方法及び材料
アクチン染色
固定後、実施例１１に列挙した細胞型をＰＢＳ中０．１％のｘ−ｔｒｉｔｏｎ １００で５分間透過処理した。次に試料をＰＢＳ中で３回洗浄した。次いで、細胞をＡｃｔｉｎ Ｒｅｄ ５５５ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ試薬（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒ３７１１２）中で３０分間、５００μｌのＰＢＳに対して２０μｌの試薬を希釈してインキュベートした。
ＤＡＰＩ染色
固定後、細胞をＤＡＰＩ溶液（ＰＢＳ中１：１０００希釈，ＳＡＰＢＩＯ，ＮＢＰ２−３４４２２Ｒ）と共に室温で５分間インキュベートした。試料をＰＢＳ中で３回洗浄した後、水性蛍光シールド封入剤で封入した。カバースリップをかけた後、画像を蛍光顕微鏡下で２４時間以内に撮影した。
蛍光クエンチングを計算するためのドキソルビシンへのナノ粒子のコンジュゲーション
ＲＴ−ＰＣＲグレードの水を用いて組織培養フード内の無菌条件下で粒子コレクタからナノ粒子を収集した。ドキソルビシンを含まないナノ粒子対照の場合、ドキソルビシンの代わりに等量の水をウェルに加えた。同様に、ドキソルビシン対照ウェルでは、ナノ粒子の代わりとして水を加えた。５０μｇ／ｍＬのドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄ１５１５）を含むウェルにナノ粒子を添加した場合、時間経過測定は、０分から開始して５分まで３０秒毎に、プレートリーダー（Ｅｘ／Ｅｍ：４７０／５８５）を介して直ちに開始された。ドキソルビシンの蛍光損失を時間０に対して計算した。
実験の前日に、ＭＣＦ７細胞を９６ウェルプレートに８，０００細胞／ｃｍ２で播種した。播種の２４時間後、ドキソルビシンコンジュゲート型ナノ粒子（前述のように調製した）をウェルに添加し、さらに２４時間インキュベートした。細胞の生存率は、ＭＴＳ細胞増殖アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｇ３５８０）を用いて測定した。ＭＴＳ試薬を製造元の指示にしたがって各ウェルに添加し、さらに２時間インキュベートした。生細胞によって生成されたホルマザン色素は、４９０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量した。未処理細胞及びドキソルビシンで処理した未洗浄細胞を対照として使用した。
結果
実験では、細胞透過剤を必要とせずに、試験した全ての細胞型においてナノ粒子が細胞壁を透過することが確かめられた。さらに、最大１５００万ナノ粒子／ｍＬまでの濃度の非コンジュゲート型ナノ粒子は、内皮細胞及び平滑筋細胞に対して無毒であることが示されたが、乳癌細胞の増殖に対しては穏やかに阻害性であった。
ナノ粒子の薬物コンジュゲーション能を評価するために、２つの一般的に使用されている化学療法薬、パクリタキセル及びドキソルビシンとのインキュベーションを行った。ナノ粒子が抗体にコンジュゲートする能力も試験した。抗体へのコンジュゲーションは、治療用途ならびに粒子トラッキング及びイメージングの両方にとって重要な面を意味する。
パクリタキセルとのコンジュゲーションの場合、ナノ粒子を蛍光標識パクリタキセルと共に４℃で一晩インキュベートした。全ての遊離パクリタキセルを確実に除去するためにナノ粒子を洗浄した後、粒子を乳癌細胞の上清に添加した。２４時間のインキュベーション後、細胞を固定し、細胞骨格を可視化するためにファロイジンで対比染色した。興味深いことに、この実験は、いかなるコンジュゲートも存在しない状態で、粒子が緑色チャネル内で自己蛍光性であることを強調している。
別の実験では、Ｃｙ５二次抗体をナノ粒子にコンジュゲートし、単層の乳癌細胞（ＭＣＦ−７）に２４時間添加した。
画像を得るための細胞培養に適したＬａｂ−Ｔｅｋガラスチャンバスライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ，１５４５３４，及び１５５３８０）上にＭＣＦ７細胞を５，０００〜８，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。細胞播種の２４時間後、試験ナノ粒子試料及び対照をＭＣＦ７と共にインキュベートし、さらに２４時間インキュベートした。次いで、細胞を３．７％パラホルムアルデヒドによって室温で１０分間固定した。次いで、細胞染色の前に試料をＰＢＳで３回洗浄した。
続いて細胞を固定し、細胞核を視覚化するためにＤＡＰＩで対比染色して、細胞内のナノ粒子の分布を観察した。分布は細胞質内で均一であるように見えるが、わずかに細胞核の周囲に集中している。核内に視認できるナノ粒子はない。Ｃｙ５抗体対照は、細胞内のいずれの場所でも蛍光を示さず、その細胞透過を可能にするためのナノ粒子コンジュゲーションの必要性が確認された。凍結乾燥したナノＰ３及びＣｙ５抗体を用いてこの実験を繰り返したが、結果は同様にＣｙ５コンジュゲート型ナノ粒子の素早い取り込みを示す。この実験は、凍結乾燥を用いて、ナノ粒子を単独で、または生物活性分子とのコンジュゲーション後に長期間保存する可能性を示している。
図４１は、蛍光イメージングの前に、ヒト冠動脈内皮細胞（ｈＣＡＥＣ，上段）及び乳癌細胞株ＭＣＦ７（下段）とインキュベートした抗体官能化ナノＰ３を示す。細胞核はＤＡＰＩによって青く染色し（明確にするため、特定の細胞核は円形の枠で囲まれている）、抗体はＡｌｅｘａ４８８によって緑色で標識した（明確にするため、これらの抗体のいくつかは三角形の枠で囲まれている）。アクチン繊維は赤く染色した（明確にするため、これらの繊維のいくつかは長方形の枠で囲まれている）。ナノＰ３及びＡｌｅｘａ４８８抗体コンジュゲートからの蛍光は、両方の細胞型において核の周囲に集中した細胞質において観察された。
図４０は、ＳＥＭでの二次電子の検出を使用して撮像されたナノＰ３及び２つの異なるサイズの金抗体（実線の矢印が２０ｎｍＩｇＧ−金二次抗体、縞矢印が６ｎｍの１つのＩｇＧ−金二次抗体）のＳＥＭ画像を提供する。
ナノ粒子に対するコンジュゲート分子の生物活性を確認するために、本発明者らは、固定化された際に構造変化に特に敏感であることが知られているヘム含有酵素である西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートした。この場合、ナノ粒子を０．５μｇ／ｍＬのＨＲＰ溶液と共にインキュベートし、４時間ホモジナイズした。等濃度のナノ粒子単独及びＨＲＰ単独の対照も実施し、後者はバックグラウンドレベル未満の活性を示す。ナノ粒子の現在の至適基準と比較するために、市販の金ナノ粒子もまたＨＲＰとインキュベートし、ナノ粒子試験群として処理した。ナノ粒子（及び対照）を徹底的に洗浄して全ての遊離ＨＲＰを除去した後、試料を、触媒作用を受けて緑色の生成物を生成する、よく記述されたＨＲＰの基質であるＡＢＴＳと共にインキュベートした。４０５ｎｍでの吸光度の測定は、ＨＲＰ生成物形成の明確なシグナルを示し、ナノ粒子コンジュゲート型ＨＲＰの維持された生物活性を証明する。市販の金ナノ粒子はまた、かなり低いレベルではあるが、ある程度のＨＲＰ活性を示した。これは、金ナノ粒子へのコンジュゲーション後のＨＲＰ活性の損失が十分に証明されているため、金ナノ粒子と比較してナノ粒子へのＨＲＰ担持量がより高いことに起因し得るか、あるいはナノ粒子コンジュゲート型ＨＲＰの活性がより高いことに起因し得る。
ドキソルビシンの可視化のために、本発明者らは、別のフルオロフォアコンジュゲートを必要とせずに、薬物の固有の自己蛍光を観察することを予期していた。
しかしながら、ドキソルビシンの自己蛍光は、ナノ粒子と共にインキュベートされた場合に消光することが判明した（この薬物が他の粒子に、またはそれ自体にさえもコンジュゲートされる場合にこの現象はよくある）。したがって、ナノ粒子とのドキソルビシンコンジュゲーションの検出は、薬物がナノ粒子とインキュベートされた際の自己蛍光の損失を測定することによって達成された（図４２，画像Ａ）。ドキソルビシンをナノ粒子とインキュベートした場合、結果は蛍光の漸進的な損失を示し、これは約３分で徐々に増加してプラトーに達し、信じられないほど急速なコンジュゲーションを示した。ドキソルビシン対照は、蛍光を減少させなかった。これは、この損失が薬物の凝集及びその結果としての消光によるものではないことを裏付けている。興味深いことに、ドキソルビシン自己蛍光の増加が観察された。これは、元の原液中のドキソルビシンの初期凝集（及びその結果としての消光）によるものと考えられる。水中で５０μｇ／ｍＬに希釈した後、凝集したドキソルビシンは脱凝集し始め、したがって蛍光が一時的に増加した。薬物なしのナノ粒子対照もまた蛍光の減少を示さなかった。別の実験では、ドキソルビシンコンジュゲート型ナノ粒子を水中で徹底的に洗浄して全ての遊離ドキソルビシンを除去し、続いて単層の乳癌細胞に添加し、２４時間インキュベートした。ＭＴＳアッセイの結果は、ドキソルビシンコンジュゲート型ナノ粒子との２４時間のインキュベーション後に細胞生存率の著しい減少を示し、薬物コンジュゲーション、及びその後の細胞死を誘導するための薬物のバイオアベイラビリティーが確認された（図４２，画像Ｂ）。ナノＰ３材料及びドキソルビシン（Ｄｏｘ）は、培地に添加された遊離ドキソルビシン（２５μｇ／ｍｌ）と同程度にＭＣＦ−７細胞を死滅させることが示されたが、ナノ粒子は細胞生存率に影響を及ぼさなかった。この実験は、細胞傷害性薬物であるドキソルビシンが単純なインキュベーション後にナノ粒子に結合され得、ＭＣＦ−７乳癌細胞を効果的に死滅させ得ることを示す。
コンジュゲートの担持能力は、ナノＰ３材料上に複数の生物活性基を導入することによって実証された。図４３は、ｈＣＡＥＣ細胞を用いた研究におけるＩｇＣ−４８８とＩｇＧ−５９４の両方のコンジュゲーションを示す。細胞核はＤＡＰＩで示されている（明確にするため、図４３の核は円形の枠でマークされている）。両方のコンジュゲートは、ナノＰ３及びＡｌｅｘａ ４８８抗体；ならびにナノＰ３及びＡｌｅｘａ ５９４抗体から検出された。ナノＰ３、Ａｌｅｘａ ４８８、及びＡｌｅｘａ ５９４は、ヒト冠動脈内皮細胞（ｈＣＡＥＣ）の細胞質内、主に核周辺に共局在しているように見える。
異なる種類の第２の種がコンジュゲート上に配置されてもよく、例えば薬物及び抗体が利用され得る（図４４）。図４５では、パクリタキセル−４８８及びＩｇＧ−５９４のコンジュゲーションがＭＣＦ７細胞による細胞研究において示され；細胞核がＤＡＰＩにより示されている（明確にするため、図４５の核のいくつかは円形の枠でマークされている）。両コンジュゲートは、ナノＰ３及びパクリタキセル−４８８；ならびにナノＰ３及びＡｌｅｘａ ５９４抗体から検出された。ナノＰ３、パクリタキセル−４８８、及びＡｌｅｘａ ５９４は、ＭＣＦ７乳癌細胞の細胞質に共局在しているように見える。
図４６では、ＩｇＧ−４８８、ＩｇＧ−Ｃｙ５、及びＩｇＧ−Ｃｙ７とナノＰ３とのコンジュゲーションがＭＣＦ７細胞を用いた細胞研究において示され；細胞核がＤＡＰＩにより示されている（明確にするため、図４６の核は円形枠でマークされている）。３つ全てのコンジュゲートは、ナノＰ３及びＡｌｅｘａ ４８８；ならびにナノＰ３、Ａｌｅｘａ Ｃｙ ５、及びＡｌｅｘａ Ｃｙ ７抗体から検出された。ナノＰ３及び３つ全てのコンジュゲートは、ＭＣＦ７乳癌細胞の細胞質に共局在しているように見える。
従来の方法を用いてプラスミドを含む二本鎖ＤＮＡを細胞内に運搬するには、細胞透過法（例えばエレクトロポレーション）または試薬（例えばリポフェクタミン）が必要である。一実験において、本発明者らは、緑色蛍光タンパク質を生成するためにプラスミドを使用し、うまくトランスフェクトした細胞が蛍光緑色を発するようにした。ヒト冠動脈細胞（ｈＣＡＥＣ）を使用して、本発明者らは、追加の細胞透過工程なしに、プラスミド、ナノＰ３のみ、またはプラスミドを有するナノＰ３を添加した（図４７）。プラスミドのみ、またはナノＰ３のみとのインキュベーションは効果がなかった。著しく対照的に、ナノＰ３及びプラスミド条件は、２４時間にわたって多くのトランスフェクションに成功した細胞を示した。
別の実験では、本発明者らは、４０、１００または２００ｎｍのナノＰ３に結合した緑色蛍光タンパク質を生成するためのプラスミドをヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）にうまく送達した。トランスフェクションの７２時間後、トランスフェクト細胞は蛍光顕微鏡下で観察され（緑色）（図４８）、本明細書に開示されるナノＰ３材料によって実現した、細胞の成功したトランスフェクション及びカーゴ（例えばＤＮＡプラスミド）の保持機能を示す。これらの結果は、ナノＰ３が細胞膜を越えてＤＮＡを運び、その活性を保持することができることを実証している。
予備的な動物実験では、マウスの背中に小さな切開（すなわち創傷）を施した。次いで、４つの群を割り当てた：
１）介入なし；
２）ナノＰ３のみ；
３）市販の金ナノ粒子及びルシフェラーゼ；または
４）尾静脈注射によるナノＰ３及びルシフェラーゼ。
群４（ナノＰ３及びルシフェラーゼ）のみが、ＩＶＩＳイメージングにより創傷領域での陽性シグナルを示した（図４９）。これは、ナノＰ３のみがルシフェラーゼを生物活性的方法で共有結合的に保持すること、及びナノＰ３が損傷部位にホーミングしている可能性があることを示唆した（このことはｉｎ ｖｉｖｏイメージング及び治療にとって重要な意味を持つ）。
ナノ治療薬に使用される典型的な材料は生物活性的に不活性であり、通常、医薬品とナノ粒子表面との間の安定したコンジュゲーションを得るために、ＰＥＧなどのオリゴマーによるさらなる官能化戦略を必要とする。この研究において、本発明者らは、固定化生体分子の生物活性を損なうことなく、様々な生体分子の直接的なラジカル媒介コンジュゲーションを提供する新規なプラズマ活性化ナノキャリアを報告する。ナノ粒子の合成及び収集は、ナノサイズの炭素系クラスタの急速な凝集を含む、活性プラズマ−気相で行われる。ナノ粒子作製収率及び物理化学的特性は、用途の要件に応じて、プロセスパラメータの適切なウィンドウを選択することによって容易に調整される。ナノ粒子の非毒性の性質は、様々な細胞型及び粒子濃度で実証されている。本明細書で作製されたナノ粒子はさらに受動的に細胞に入ることが示され、薬物、抗体、及びポリヌクレオチドなどの分子カーゴの移動を促進した。プラズマ放電は、ナノ粒子ベースの治療法及び診断法における現在の成果を潜在的に推進することができる新たな種類の真に多官能性のナノキャリアの合成及び設計のための強固なプラットフォームを提供することが実証されている。
実施例１４−コンジュゲーション研究パート３
別の動物実験では、マウスを無作為に３つの群に分けた：
１）ナノＰ３のみ；
２）ナノＰ３及びＩＣＧ；または
３）ＩＣＧのみ。
各群について、図５０に示すように、マウスの背中に小さな切開（５ｍｍ）を施した。シルク縫合糸で切開部を閉じると、各マウスに尾静脈注射を介して１００μＬの対応する試料群を投与した：ナノＰ３対照（９×１０９ナノＰ３）、ナノＰ３−ＩＣＧ（９×１０９ナノＰ３と２．５μｇのＩＣＧ／１０９ナノＰ３）またはＩＣＧ対照（２２．５μｇ）。Ｅｘ／Ｅｍ＝７８０ｎｍ／８２０ｎｍでの蛍光の検出のためにＩＶＩＳを用いた非侵襲的イメージングを実施した。調べた全ての時点で、ナノＰ３のみ、及びＩＣＧのみの対照群の両方において蛍光が存在せず、ＩＣＧがｉｎ ｖｉｖｏでの循環時に活性を著しく損失することが示された。逆に、ナノＰ３−ＩＣＧ群においては全ての時点でシグナルが検出され、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩＣＧ活性は一度ナノＰ３に結合すると著しく延長される（３００倍の半減期の延長）ことが実証された。
実施例１５−コンジュゲーション研究パート４
別の動物実験では、図５１の画像Ａに示すように、様々な試料群：生理食塩水対照（切開１）、ナノＰ３のみ（切開２）、ナノＰ３−ＶＥＧＦ−ＩＣＧ（切開３）、及びナノＰ３−ＶＥＧＦ（切開４）の局所送達のために各マウスの背中に合計４つの切開（５ｍｍ）を施した。創傷あたりの総投与試料容量は５μＬであった。ナノＰ３を含有する群では、投与量は以下の通りであった。切開２：５×１０９ナノＰ３；切開３：５×１０９ナノＰ３と０．０５８μｇのＶＥＧＦ／１０９ナノＰ３及び１．２５μｇのＩＣＧ／１０９ナノＰ３；切開４：５×１０９ナノＰ３と０．１１５μｇのＶＥＧＦ／１０９ナノＰ３。図５１の画像Ｂは、ＩＣＧで官能化されたナノＰ３を含有する試料群のみが陽性蛍光シグナルを生じたことを示す。蛍光強度は経時的に減少し（切開後１４日目まで定量化）、創傷部位に限定されたままであった。図５１の画像Ｃに示すように、免疫組織化学による創傷組織のさらなる分析により、生理食塩水及びナノＰ３のみの対照と比較して、ナノＰ３−ＶＥＧＦ−ＩＣＧ及びナノＰ３−ＶＥＧＦ群における内皮化の促進（後者は有意）が明らかになった。これらの結果は、宿主組織におけるナノＰ３の分布の同時イメージングを可能にしながら、ナノＰ３に固定化された官能性カーゴをｉｎ ｖｉｖｏで送達することができることを実証している。
実施例１６−コンジュゲーション研究パート５
方法及び材料
細胞生存率アッセイ
３つの異なる細胞型について細胞毒性を評価した：
１）ヒト冠動脈内皮細胞（ｈＣＡＥＣ，４継代，Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，３００−０５ａ）；
２）ヒト乳細胞株（ＭＣＦ１０Ａ，２０継代）；及び
３）乳癌細胞（ＭＣＦ７，１５継代，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，８６０１２８０３）。
約５，０００細胞／ｃｍ２を数え、平底２４ウェル培養プレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で４時間インキュベートした。細胞播種の４時間後、次いで、１０００万個の粒子／ウェル〜１００個の粒子／ウェルのナノＰ３の１０倍希釈液を、各濃度のナノＰ３に対してｎ＝３の反復で培地に添加した。３〜５日のインキュベーション後細胞毒性評価は、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ細胞生存率及び細胞毒性アッセイキット（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＤＡＬ１１００）を用いて実施した。製造元の指示にしたがって、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬を各ウェルに添加し、さらに２時間（ｈＣＡＥＣ及びＭＣＦ１０Ａの場合）及び３時間（ＭＣＦ７の場合）インキュベートした。生細胞によって生成されたレゾアズリン色素を、Ｅｘ／Ｅｍ５３０〜５６０／５９０ｎｍで蛍光を測定することによって定量した。未処理細胞（ナノＰ３なし）、及びドキソルビシン（５００ｎＭ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，４４５８３）で処理した細胞を対照として使用した。
金ナノ粒子コンジュゲート二次抗体へのナノＰ３のコンジュゲーション
ナノＰ３を所望の抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−４０ｎｍ金；ａｂｃａｍ，ａｂ１１９１８０、ヤギ抗マウスＩｇＧ−２０ｎｍ金；ａｂｃａｍ，ａｂ２７２４２、及び／またはヤギ抗ラットＩｇＧ−１０ｎｍ金；ａｂｃａｍ，ａｂ４１５１２）と共に４℃で１時間インキュベートし、Ｂｉｏ ＲＳ−２４ミニローテーターを用いて穏やかに撹拌した。インキュベーション後、試料を１６，１００ｇで５分間の遠心分離により洗浄した。次に試料を収集し、３００メッシュ銅（Ｐｒｏｓｃｉｔｅｃｈ，ＧＳＣｕ３００Ｃ）上の組織培養フード内で風乾させ、Ｚｅｉｓｓ Ｓｉｇｍａ ＨＤ ＦＥＧ ＳＥＭ（ＳＭＭ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ，Ｓｙｄｎｅｙ）を使用して可視化した。
二次抗体及び／または薬物へのナノＰ３のコンジュゲーション
ナノＰ３を二次抗体（ロバ抗ヤギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８；ａｂｃａｍ，ａｂ６８８１；ヤギ抗ラットＩｇＧ−Ａｌｅｘａ６４７；ａｂｃａｍ，ａｂ１５０１５９、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−７５０；ａｂｃａｍ，ａｂ１７５７３３）及び／または薬物（パクリタキセル−Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐ２２３１０）に４℃で１時間コンジュゲートし、光から保護してＢｉｏ ＲＳ−２４ミニローテーターを用いて穏やかに撹拌した。インキュベーション後、試験試料及び適切な対照を、１回の洗浄につき５分間、１６，１００ｇでの遠心分離を介して３回均等に洗浄した。プレートリーダーを用いて蛍光強度を測定し、Ｅｘ／Ｅｍを各抗体または薬物上の蛍光色素標識にしたがって設定した。
細胞内の抗体コンジュゲート型ナノＰ３
ｈＣＡＥＣ、ＭＣＦ１０Ａ、及びＭＣＦ７細胞を、画像を得るための細胞培養に適したＬａｂ−Ｔｅｋガラスチャンバスライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ，１５４５３４、及び１５５３８０）上に１０，０００〜１５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。細胞播種から４時間後、試験ナノＰ３試料及び対照を２４時間全細胞型と共にインキュベートした。次に、細胞を室温で１０分間３．７％パラホルムアルデヒドで固定した。次いで、細胞染色の前に試料をＰＢＳで３回洗浄した。
アクチン及びＤＡＰＩ染色
固定後、細胞をＰＢＳ中０．１％のｘ−トリトン１００で５分間透過処理した。次に試料をＰＢＳ中で３回洗浄した。次いで、細胞をＡｃｔｉｎ Ｒｅｄ ５５５ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ試薬（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒ３７１１２）中で１５分間、１０００μｌのＰＢＳに対して２０μｌの試薬を希釈してインキュベートした。次に試料をＰＢＳ中で３回洗浄した。細胞をＤＡＰＩ溶液（ＰＢＳ中１：１０００希釈，ＳＡＰＢＩＯ，ＮＢＰ２−３４４２２Ｒ）と共に室温で５分間インキュベートした。試料をＰＢＳ中で３回洗浄した後、水性蛍光シールド封入剤（Ｃａｔ．）で封入した。カバースリップをかけた後、画像は蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）下で２４時間以内に撮影された。
官能化アッセイ：ルシフェラーゼへのナノＰ３のコンジュゲーション
ナノＰ３を、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼに２．５μｇ／ｍｌ（ａｂｃａｍ，Ｌ９５０６）で４℃で１時間コンジュゲートし、Ｂｉｏ ＲＳ−２４ミニローテーターを用いて穏やかに撹拌した。２００ｎｍポリスチレン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｒ２００）及び２００ｎｍ金ナノ粒子（Ｃｙｔｏｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ；Ｇ−１５０）へのルシフェラーゼのコンジュゲーションを同一の様式で実施した。インキュベーション後、ナノＰ３試料は、１回の洗浄につき５分間、１６，１００ｇでの遠心分離を介して３回洗浄した一方、適切な対照は、製造元の指示にしたがって３回均等に洗浄した。全ての洗浄液を収集した。ルシフェラーゼの検出の場合、コンジュゲート型ナノ粒子及び各対照、ならびにそれらの全ての洗浄液を、７０ｍＭ ＡＴＰ−Ｍｇ２＋を含有するＤ−ルシフェリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ａ１８８８）と共にインキュベートした。次いで、ＩＶＩＳシステムを介して生物発光を検出した（露光時間：３０秒）。
結果
ナノＰ３中の遊離ラジカルの存在は、単純なインキュベーションによる生体分子の直接的な共有結合的固定化の可能性を示唆しており、競合するプラットフォームを超える本質的な利点をもたらす。非官能化ナノＰ３は、ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）の膜を透過し、細胞質内に蓄積し、３Ｖｉｅｗ断面ＳＥＭを用いて観察した（図５２，画像Ａ）。これらの画像の３Ｄレンダリングは、核の外側（長円形の枠で囲まれている）の細胞膜内（長方形の枠で囲まれている）に分布したナノＰ３（これらの一部は三角形の枠で囲まれている）を示す（図５２，画像Ｂ）。ＨＣＡＥＣ、線維芽細胞（ＭＣＦ１０Ａ）、またはヒト乳腺癌細胞（ＭＣ７）とのナノＰ３インキュベーションは、細胞生存率に有意な影響を及ぼさず、１ウェルあたり最大１×１０８粒子であった（図５３，画像Ｃ）。細胞形態はまた、培養液中で３日または５日後にも影響を受けなかった（図５３，画像Ｄ）。追加の化学的リンカーの非存在下でのルシフェラーゼとのインキュベーション、その後の３回の遠心洗浄工程（Ｗ１〜Ｗ３）は、ナノＰ３の生体分子固定化能力を示した。生物発光酵素ルシフェラーゼは、アンフォールドすると立体構造的に影響を受けやすく、かつ不活性であるので官能的活性の同時研究を可能にするように選択された。アッセイは、粒子なしで、または市販の金（ＧＮＰ）もしくはポリスチレンナノ粒子を用いても行い、ナノＰ３と比較した（図５４）。全ての洗浄工程を通じて、不可逆的な固定化及びルシフェラーゼ活性の保存をもたらしたのはナノＰ３のみであった。実験は、金及びポリスチレンナノ粒子について本明細書に示される他の全ての市販のプラットフォームが、官能性分子の強固な結合のために化学結合中間体を必要とすることを強調している。
ターゲティングリガンド、造影剤、及び化学中間体のない薬物（図５５，画像Ａ）を含む、複数の共有結合カーゴを保持する可能性は、ナノＰ３の重要な側面である。蛍光標識抗体（ＩｇＧ４８８）を用いた例示は、高密度表面単層と一致する結合濃度が達成され得ることを示した（図５５，画像Ｂ）。ＳＥＭによって可視化されたナノＰ３に結合する金標識抗体は、抗体濃度及びインキュベーション時間及び順序を含む溶液パラメータによって制御される表面密度を有する、１、２または３個のリガンドによる官能化を示す（図５６，画像Ｃ）。図５６の画像Ｃにおいて、３つのＩｇＧ−金二次抗体は、サイズが４０ｎｍ、２０ｎｍ、及び６ｎｍである（それぞれ破線の円形、三角形及び長方形の囲いにて示される）。ＭＣＦ１０Ａ中の単一、二重または三重官能化ナノＰ３として、パクリタキセル−４８８、ＩｇＧ−Ｃｙ５、及びＩｇＧ−Ｃｙ７を用いて、細胞内への複数のカーゴの機能的移動が示された（図５７）。３つの比較的大きな官能性について例示したが、ナノＰ３の結合容量は、カーゴのサイズに関係するため、表面積によってのみ制限される。
実施例１７−コンジュゲーション研究パート６
ナノＰ３を核局在化配列（ＮＬＳ）とコンジュゲートし、特にＨ−ＣＰＫＫＫＲＫＶ−ＯＨのＮＬＳを使用した。得られたコンジュゲートは、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の核膜を透過した（図５８）。ナノＰ３−ＮＬＳコンジュゲートの大部分は、ナノ粒子を細胞とインキュベートしたときに一般的に観察されるように、インキュベーションの２４時間後に核の周囲に蓄積する。しかしながら、４８時間後、陽性の蛍光シグナルが細胞の核領域に存在し、この細胞小器官へのナノ粒子−ＮＬＳトラッキングを示す。この実験は、異なる細胞小器官が適切なコンジュゲートを形成することによって標的化され得ることを示す。
実施例１８−コンジュゲーション研究パート７
ＶＥＧＦに対するｓｉＲＮＡとコンジュゲートしたナノ粒子（上記の実施例１２に概して記載したようにコンジュゲートした）は、ウエスタンブロット分析によって確認されるように、４８時間後にＨＵＶＥＣＳにおけるＶＥＧＦ発現を最大４０％まで有意に減少させることに成功した（図５９）。ＨＵＶＥＣ細胞におけるナノ粒子−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの送達は、Ｃｙ−５によって標識したｓｉＲＮＡ−ＶＥＧＦを使用する蛍光顕微鏡法によって確認した（図６０）。この実験は、本明細書に開示されるナノＰ３材料が、ｓｉＲＮＡの生物学的活性を維持しながらｓｉＲＮＡ分子を細胞内にうまく運搬することができることを示す。
実施例１９−コンジュゲーション研究パート８
ナノＰ３及び金（ＧＮＰ）のナノ粒子を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした。これらは、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）とのインキュベーションによって検出された。生成物の検出は４０５ｎｍで実施され（図６１）、ナノＰ３材料にコンジュゲートした相当量のＨＲＰが示された。この実験は、本明細書に開示されているナノＰ３材料への生物活性タンパク質の成功したコンジュゲーションの別の例を提供する。
実施例２０−ナノＰ３を用いたｓｉＲＮＡノックダウン
初代マウス線維芽細胞における（ａ）１００ｎｍ及び（ｂ）２００ｎｍ（直径）ナノＰ３に結合したルシフェラーゼ（ｓｉＬｕｃｉ）に対する低分子干渉ＲＮＡの送達の効果を調べた。図６２では、ウェルあたり１０１０粒子の濃度で１００ｎｍのナノＰ３と共にｓｉＬｕｃｉを送達することによって、未処理細胞対照と比較して、ルシフェラーゼの発現は、７２時間で３９．７４±６．４２％へと有意に減少した。スクランブルｓｉＲＮＡ及び非官能化ナノＰ３の送達は有意な効果を及ぼさなかった。全てのナノＰ３試験群において細胞生存率の有意な減少は観察されなかった。ＩＰＳＣ由来ヒト内皮細胞における（ａ）１００ｎｍ及び（ｂ）２００ｎｍ（直径）ナノＰ３に結合したルシフェラーゼ（ｓｉＬｕｃｉ）に対する低分子干渉ＲＮＡの送達の効果を調べた。図６３では、ウェルあたり１０７粒子の濃度で２００ｎｍのナノＰ３と共にｓｉＬｕｃｉを送達することによって、未処理細胞対照と比較して、ルシフェラーゼの発現は、７２時間で４８．９６±１．２４％へと有意に減少した。スクランブルｓｉＲＮＡ及び非官能化ナノＰ３の送達は有意な効果を及ぼさなかった。全てのナノＰ３試験群において細胞生存率の有意な減少は観察されなかった（図６３）。
実施例２１−ナノ粒子を保持するための足場の合成
本発明者らは、本明細書で定義したようなナノＰ３材料を保持するために電界紡糸ポリウレタン足場を利用した。
ポリウレタン（Ｅｌａｓｔ−Ｅｏｎ Ｅ２Ａ；ヘキサフルオロイソプロパノール中９％（ｖ／ｗ））を１５ｋＶを用いて１ｍＬ／時で総体積２．５ｍＬまで電界紡糸し、回転コレクタ（５００ｒｐｍ）を使用して収集した。
次いで、６×４ｃｍのシートを１００個の３ｍｍディスクへと切断し、続いて紫外線光を用いて滅菌した（各側１５分）。ディスクを４つの処理群（各２５ディスク）に分け、撹拌しながら３７℃で一晩溶液中でインキュベートした：
群１−ポリウレタン（未処理）
群２−ポリウレタン及びナノ粒子（１×１０９ｍＬ−１）
群３：ポリウレタン、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を有するナノ粒子（１．５μｇ／ｍＬ、４℃で４時間担持）
群４−ポリウレタン、及びデキサメタゾン（ＤＥＸ）を有するナノ粒子（１０μｇ／ｍＬ、４℃で４時間担持）。
インキュベーション後、ディスクを３回十分に洗浄した。
図６４は、電界紡糸ポリウレタン繊維のＳＥＭ画像（画像ａ、ｂ及びｃ）を提供する。画像ｄ、ｅ及びｆは、ナノＰ３及びＶＥＧＦのコンジュゲートの組み込みを示す。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究の結果は図６５に示されており、それは画像ａ）における内皮細胞の新血管の生成を示す。結果の定量化は、画像ｂ）に示される。有意性は、一元配置分散分析を用いて計算した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図６５では、ＰＵ＝ポリウレタンプラットフォーム単独（群１）；ＮＰ＝ナノ粒子が付着したポリウレタン足場（群２）；ＶＥＧＦ＝ポリウレタン足場＋ＶＥＧＦで官能化したナノ粒子（群３）；及びＤＥＸ＝ポリウレタン足場＋ＤＥＸで官能化したナノ粒子（群４）。
ナノＰ３材料は様々な異なる基質に適用することができる。例えば、本発明者らはシルク足場を利用し、ナノＰ３の均一な分布が得られ得ることを示すことができた（図６６）。
当業者は、広く記載された本発明の範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されるように、本発明に対して多数の変形及び／または修正がなされ得ることが理解されよう。したがって、本実施形態は、あらゆる点で例示的であり限定的ではないと見なされるべきである。

Claims (38)

  1. 以下の特徴：
    約３４７０Ｇ〜約３５２０Ｇの範囲内に中心があり、及び／または約２．００１〜約２．００５の範囲内のｇ因子に対応する広い電子常磁性共鳴ピーク、
    約１０１９〜約１０１５スピン／ｃｍ３の範囲の合成後約０時間〜約２時間以内に電子常磁性共鳴により測定されたスピン密度、
    合成後約０時間〜約２４０時間以内に電子常磁性共鳴により測定された約１０１７〜約１０１５スピン／ｃｍ３の範囲であるスピン密度、
    −約３６８０〜約２７００ｃｍ−１の範囲内；
    −約１８００〜約１２００ｃｍ−１の範囲内；
    −約２３３０〜約２０２０ｃｍ−１の範囲内；
    −約１２００〜約１０１０ｃｍ−１の範囲内；及び／または
    −約１０１０〜約７００ｃｍ−１の範囲内；
    に中心がある赤外スペクトルの１つ以上の吸収帯、
    −約３６００〜３１００ｃｍ−１の範囲内；及び／または
    −約３１００〜２７００ｃｍ−１の範囲内；
    に中心がある赤外スペクトルの１つ以上の吸収帯、
    約−１００ｍＶ〜約＋１００ｍＶの範囲内のゼータ電位；
    約２〜約１０のｐＨ範囲内の溶液中で測定された約−８０ｍＶ〜約＋８０ｍＶの範囲内のゼータ電位；または
    窒素：炭素の元素比が約０．０１：１〜約２：３
    のうちの１つ以上を特徴とするナノ粒子ポリマー。
  2. 前記ポリマーが架橋している、請求項１に記載のナノ粒子ポリマー。
  3. 前記ポリマーが、炭化水素、ペルフルオロカーボン、エーテル、エステル、アミン、アルコール、またはカルボン酸モノマー類、またはそれらの混合物から誘導されたモノマー単位を含む、請求項１または請求項２に記載のナノ粒子ポリマー。
  4. 前記炭化水素が、アルケン、アルキン、シクロアルケン、シクロアルキン、またはそれらの混合物から選択される、請求項３に記載のナノ粒子ポリマー。
  5. 前記炭化水素がアルキンである、請求項３または請求項４に記載のナノ粒子ポリマー。
  6. 前記ポリマーが、第２の種に結合することができる少なくとも１つの結合部位を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ粒子ポリマー。
  7. 前記ポリマーが、
    第２の種に共有結合することができる不対電子を含む結合部位、及び
    化学的または物理的に第２の種に結合することができる少なくとも１つの官能基
    のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノ粒子ポリマー。
  8. 前記ポリマーが、不対電子を含む前記結合部位を含む、請求項６または請求項７に記載のナノ粒子ポリマー。
  9. 前記第２の種が、ターゲティングリガンド、医薬品、造影剤、アミノ酸、ペプチド、天然生物活性分子の合成類似体、合成ペプチド模倣物、タンパク質、受容体ターゲティングリガンド、遺伝子標的化剤、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ、感光性色素、切断可能な連結分子、炭化水素、全細胞、細胞フラグメント、ミセル、リポソーム、ハイドロゲル、ポリマー粒子、半導体粒子、セラミック粒子、金属粒子、またはそれらの混合物から選択される、請求項６〜８のいずれか一項に記載のナノ粒子ポリマー。
  10. 前記ポリマーが、少なくとも１つのアミン基、イミン基、一酸化窒素基、またはニトリル基、またはそれらの混合物を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノ粒子ポリマー。
  11. 前記ポリマーの粒子が、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍの平均直径を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノ粒子ポリマー。
  12. 前記ナノ粒子ポリマーが、少なくとも１つのモノマーを含むプラズマから形成される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のナノ粒子ポリマー。
  13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の２つ以上のナノ粒子ポリマーを含む凝集体。
  14. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子ポリマーまたは請求項１３に記載の凝集体、及び
    少なくとも１つの第２の種
    を含むコンジュゲート。
  15. ２つ以上の第２の種が前記ナノ粒子ポリマーまたは凝集体に結合している、請求項１４に記載のコンジュゲート。
  16. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子ポリマー、請求項１３に記載の凝集体、または請求項１４もしくは請求項１５に記載のコンジュゲート、及び薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤、もしくは結合剤を含む医薬組成物。
  17. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子ポリマー、請求項１３に記載の凝集体、または請求項１４もしくは請求項１５に記載のコンジュゲートを含む基質。
  18. 前記ナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲートが、前記基質の少なくとも１つの表面上に存在する、請求項１７に記載の基質。
  19. 前記ナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲートが、前記基質内に組み込まれる、請求項１７に記載の基質。
  20. 前記ナノ粒子ポリマー、凝集体、またはコンジュゲートが、前記基質に共有結合している、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の基質。
  21. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子ポリマー、
    請求項１３に記載の凝集体、または
    それらの混合物の、
    コンジュゲートの形成における使用。
  22. ｉ）反応チャンバ内に少なくとも１種のガスを提供することと、
    ｉｉ）前記反応チャンバ内に容量結合プラズマを発生させるように第１の電極に電力を供給することと、
    ｉｉｉ）前記反応チャンバ内の第２の電極に電圧を印加することと、
    ｉｖ）得られたナノ粒子ポリマーまたは凝集体を収集することと、を含み、
    前記少なくとも１種のガスが有機ガスを含む、ナノ粒子ポリマーまたは凝集体の調製方法。
  23. 工程ｉｉｉ）における前記電圧がパルス状バイアス電圧である、請求項２２に記載の方法。
  24. 工程ｉｉｉ）における前記電圧が、前記電極が前記プラズマからの電荷の蓄積によって浮遊電位を獲得する自己バイアスである、請求項２２に記載の方法。
  25. 工程ｉ）における前記ガスが、２種以上のガスの混合物である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記２種以上のガスの混合物が、不活性ガスを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記２種以上のガスの混合物が、周期表の１５、１６または１７族から選択される元素を含むガスを含む、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
  28. 前記２種以上のガスの混合物が、窒素を含む、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 工程ｉ）において有機金属化合物を導入することをさらに含む、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の方法によって作製されたナノ粒子ポリマー。
  31. ｉ）請求項１〜１１、もしくは３０のいずれか一項に記載のナノ粒子ポリマー；または請求項１２に記載の凝集体、及び
    ｉｉ）少なくとも１つの第２の種
    を提供することと、
    前記ナノ粒子ポリマーまたは凝集体と前記少なくとも１つの第２の種とが物理的または化学的に互いに結び付くように、前記ナノ粒子ポリマーまたは凝集体と前記少なくとも１つの第２の種とを接触させることと、
    を含む、コンジュゲートの形成方法。
  32. 前記少なくとも１つの第２の種が、前記ナノ粒子ポリマーまたは凝集体に共有結合する、請求項３１に記載の方法。
  33. 請求項３１または請求項３２に記載の方法によって作製されたコンジュゲート。
  34. 疾患、障害、または状態の１つ以上の症状に罹患している、罹患しやすい、またはそれを示す対象を治療する方法であって、前記方法が、請求項１〜１２もしくは３０のいずれか一項に記載のナノ粒子ポリマー、請求項１３に記載の凝集体、請求項１４、１５もしくは３３のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または請求項１６に記載の医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
  35. 前記疾患、障害、または状態が、急性冠症候群、加齢性疾患もしくは障害、アレルギー性疾患もしくは関連状態、アルツハイマー病、喘息、ＨＩＶ、抗生物質耐性、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、細菌感染、がん、認知症、うつ病もしくは関連状態、糖尿病、脂質異常症、高脂血症、高血圧、魚鱗癬、免疫疾患、代謝性疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、肥満症、パーキンソン病、疼痛、関節リウマチ、または増殖性疾患から選択される、請求項３４に記載の方法。
  36. 対象における疾患、障害、または状態を治療するための医薬の形成における、請求項１〜１２もしくは３０のいずれか一項に記載のナノ粒子ポリマー、請求項１３に記載の凝集体、または請求項１４、１５もしくは３３のいずれか一項に記載のコンジュゲートの使用。
  37. 前記疾患、障害、または状態が、急性冠症候群、加齢性疾患もしくは障害、アレルギー性疾患もしくは関連状態、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、細菌感染、がん、認知症、うつ病もしくは関連状態、糖尿病、脂質異常症、高脂血症、高血圧、魚鱗癬、免疫疾患、代謝性疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、肥満症、パーキンソン病、疼痛、関節リウマチ、または増殖性疾患から選択される、請求項３６に記載の使用。
  38. 少なくとも１つの第２の種が造影剤である、請求項１４、１５もしくは３３のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは請求項１６に記載の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、前記対象内の領域のイメージング方法。
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