CN106309375A - 一种纳米粒制剂、其制备方法及应用 - Google Patents

一种纳米粒制剂、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医用材料及药物控制释放领域，具体涉及一种纳米粒制剂、其制备方法及应用，所述纳米粒制剂由以下组分组成：(1)寡肽和/或寡肽衍生物；(2)金属离子。所述纳米粒制剂粒径大小均匀可控、载药率高、血液中稳定性好，在癌组织内中可通过pH/酶/谷胱甘肽/金属硫蛋白多重刺激响应快速释放药物等特性，且其制备方法简单，易于大规模生产。

Description

一种纳米粒制剂、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料及药物控制释放领域，涉及纳米载体在生物技术领域的应用，具体涉及一种纳米粒制剂、其制备方法及应用。
背景技术
近年来，纳米组装技术在人类重大疾病的预防、诊断和治疗等方面的飞速发展，引起了广泛的关注和研究。与“裸”药相比，利用纳米组装技术制备纳米药物载体可以改变给药途径和药物在体内的分布，并具有靶组织选择性，提高药物的生物利用度，实现安全有效的靶向药物输送和治疗。
这些有利的治疗效果是基于肿瘤部位特异的微环境性质所实现的。人体的肿瘤胞外环境(pH为5.7-6.8)比正常血液或组织的(pH约为7.4)显酸性，而细胞内的内涵体和溶酶体的pH为5.0-5.5。
金属配位键是一种键能仅次于静电作用的非共价键作用(28-123kJ/mol)。它与静电作用相比，具有方向性。在生物体内，广泛存在于蛋白的特异性识别作用。金属硫蛋白(Metallothioneins，简称MTs)是一类低分子量、富含半胱氨酸的非酶类金属结合蛋白，它与金属离子具有高度亲和性。因此，利用金属配位作用，设计制备纳米药物，可有效增加纳米药物体系的稳定性，特别是结合氢键、π-π相互作用和疏水作用等协同组装得到的纳米药物，既可提高纳米药物的稳定性，又可赋予其多重响应性。寡肽分子由于其结构简单明确、容易获得、无免疫原性、生物相容及生物可降解等优势，在生物医药领域有着广泛的应用前景。
CN105288647 A公开了一种功能化白蛋白及其纳米制剂的制备方法，所制备纳米制剂可实现较好的pH响应性药物释放。还原性谷胱甘肽在细胞外的浓度约为2-10uM，而在胞质内，其浓度约为0.5-10mM，二者相差3个数量级。利用该特性设计的纳米药物，可提高给药的靶向释放。
CN104356196 A公开了一类基于寡肽的还原敏感脂质衍生物，其可在胞质谷胱甘肽还原环境中发生二硫键的断裂，导致脂质体结构的不稳定，实现靶部位的药物释放。但目前纳米组装药物载体仍存在1)在血液中的稳定性差；2)响应性不足；3)靶向性不足；4)生物安全性差等问题亟需解决。
因此，开发寡肽与金属离子配位构建的纳米粒制剂在生物医药等领域尤其是抗肿瘤领域具有广泛的应用前景。
发明内容
针对已有技术的问题，本发明提供了一种纳米粒制剂、其制备方法及应用，所述纳米粒药物制剂对体内靶点的特异微环境特性：低pH值、酶、谷胱甘肽和金属硫蛋白等有响应性。
为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种纳米粒制剂，其特征在于，所述纳米粒制剂由以下组分组成：(1)寡肽和/或寡肽衍生物；(2)金属离子；
所述寡肽和/或寡肽衍生物的通式为Yn、YnZm或ZmYn，
当n＝1，m＝1时，所述Y为组氨酸、谷氨酸、赖氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸中的任意一种或至少两种的组合，所述Z为苯丙氨酸、亮氨酸或络氨酸中的任意一种或至少两种的组合；
当n为2-4中任意整数，m为2-3中任意整数时，所述Y为组氨酸、谷氨酸、赖氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸中的任意一种，所述Z为苯丙氨酸、亮氨酸或络氨酸中的任意一种；
所述金属离子为锌离子、亚铁离子、铁离子、铜离子、银离子、铝离子、钴离子、钙离子、钛离子、铕离子或铽离子中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述组氨酸、谷氨酸、赖氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸都可以与金属离子配位，其中谷氨酸和天冬氨酸的羧基，组氨酸的咪唑基团，半胱氨酸的巯基，赖氨酸的氨基都可以与金属离子进行配位，诱导形成纳米粒制剂，所述纳米粒制剂具有pH/酶/谷胱甘肽/金属硫蛋白多重响应性。
优选地，所述氨基酸的N末端被N末端保护基团保护。
优选地，所述保护基团为苯基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、β-萘酰胺基、N-(3-吲哚乙酰基)或N-芴甲氧羰基中的任意一种或至少两种的混合。
本发明中，所述纳米粒制剂为芴甲氧羰基-L-组氨酸、芴甲氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸、芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸-L-组氨酸、芴甲氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸、芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸-L-组氨酸、N-苄氧羰基-L-组氨酸、N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸、N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸、β-萘酰胺基-L-苯丙氨酸-L-组氨酸、N-(3-吲哚乙酰基)-L-苯丙氨酸-L-组氨酸、N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸-L-组氨酸、叔丁氧羰基-L-组氨酸、叔丁氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸、叔丁氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸、叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸-L-组氨酸、芴甲氧羰基-L-谷氨酸、芴甲氧羰基-L-谷氨酸-L-苯丙氨酸、芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸-L-谷氨酸、芴甲氧羰基-L-谷氨酸-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸、芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸-L-谷氨酸、N-苄氧羰基-L-谷氨酸、N-苄氧羰基-L-谷氨酸-L-苯丙氨酸、N-苄氧羰基-L-谷氨酸-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸、β-萘酰胺基-L-苯丙氨酸-L-谷氨酸、N-(3-吲哚乙酰基)-L-苯丙氨酸-L-谷氨酸、N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸-L-谷氨酸、叔丁氧羰基-L-谷氨酸、叔丁氧羰基-L-谷氨酸-L-苯丙氨酸、叔丁氧羰基-L-谷氨酸-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸、叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸-L-谷氨酸中的一种或至少两种的组合；
优选为芴甲氧羰基-L-组氨酸、芴甲氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸、芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸-L-组氨酸、芴甲氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸、N-苄氧羰基-L-组氨酸、N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸、N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸、β-萘酰胺基-L-苯丙氨酸-L-组氨酸、叔丁氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸、叔丁氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸、芴甲氧羰基-L-谷氨酸、芴甲氧羰基-L-谷氨酸-L-苯丙氨酸、芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸-L-谷氨酸、芴甲氧羰基-L-谷氨酸-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸、芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸-L-谷氨酸、N-苄氧羰基-L-谷氨酸-L-苯丙氨酸、N-苄氧羰基-L-谷氨酸-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸、β-萘酰胺基-L-苯丙氨酸-L-谷氨酸、N-(3-吲哚乙酰基)-L-苯丙氨酸-L-谷氨酸、N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸-L-谷氨酸、叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸-L-谷氨酸中的一种或至少两种的组合。
优选地，所述金属离子为锌离子、铜离子、亚铁离子、银离子、钙离子、铕离子或铽离子中的任意一种或至少两种的混合。
优选地，所述纳米粒制剂的直径为10-1000nm，例如可以是10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm或1000nm，优选为20-200nm。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的纳米粒制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将寡肽和/或寡肽衍生物分散于水溶液中，充分溶解得到寡肽和/或寡肽衍生物水溶液；
(2)将金属盐溶解在水中，得到金属离子水溶液；
(3)将步骤(1)得到的寡肽和/或寡肽衍生物水溶液与步骤(2)得到的金属离子水溶液进行混合，形成稳定的纳米粒制剂。
优选地，步骤(1)所述溶液的pH值调节为8-12，例如可以是8、9、10、11或12。
优选地，步骤(1)所述寡肽和/或寡肽衍生物水溶液的摩尔浓度为1-100mM，例如可以是1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM，优选为1-40mM。
优选地，步骤(2)所述溶液的pH值调节为2-6，例如可以是2、3、4、5或6。
优选地，步骤(2)所述金属离子水溶液的摩尔浓度为10-1000mM，例如可以是10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、150mM、160mM、180mM、190mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、550mM、600mM、650mM、700mM、750mM、800mM、850mM、900mM、950mM或1000mM，优选为10-200mM。
优选地，步骤(3)所述将步骤(1)得到的寡肽和/或寡肽衍生物水溶液与步骤(2)得到的金属离子水溶液进行混合，其中，寡肽和/或寡肽衍生物水溶液和金属离子水溶液的摩尔比为0.2-10，例如可以是0.2、0.3、0.5、0.6、0.8、1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
优选地，步骤(3)所述混合后得到的溶液的pH值调节为6.5-7.4，例如可以是6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3或7.4。
优选地，所述pH值调节通过加入碱性物质或酸性物质。
优选地，所述碱性物质为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地，所述酸性物质为盐酸、磷酸、硫酸或硝酸中的任意一种或至少两种的混合物。
第三方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物包括如第一方面所述的纳米粒制剂和药物。
优选地，所述药物为抗肿瘤药物。
优选地，所述药物为姜黄素、培美曲塞、吉非替尼、阿霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、卡铂、奥沙利铂、硼替佐米、喜树碱、三氧化二砷、羟基喜树碱、替莫泊芬、5-氨基酮戊酸、原卟啉IX、原卟啉IX二钠盐、维替泊芬、单天冬胺酰基二氢卟吩、四苯基卟啉或紫草素中的任意一种或至少两种的混合。
第四方面，本发明提供一种如第三方面所述的药物组合物的制备方法，包括如下步骤：
将配制的药物溶液加入到如第一方面所述的纳米粒制剂或如第二方面所述的方法制备的纳米粒制剂中，得到稳定的药物组合物。
优选地，所述药物溶液的溶剂为水、乙醇、二甲基亚砜、丙酮中的一种或任意两种以上的组合。
本发明中，所述药物组合物的制备方法还可以在制备所述纳米粒制剂的同时加入药物，包括如下步骤：
(1)将寡肽和/或寡肽衍生物分散于水溶液中，调节溶液pH值为8-12，充分溶解得到寡肽和/或寡肽衍生物水溶液；；
(2)配置药物的溶液，所述药物溶液的溶剂为水、乙醇、二甲基亚砜、丙酮中的一种或至少两种的混合；
(3)将金属盐溶解在水中，得到金属离子水溶液，调节溶液的pH值为2-6；
(4)向步骤(1)所配置的溶液中分别加入步骤(2)所配置的药物溶液和步骤(3)中所配置的金属离子溶液，调节混合溶液的pH值为6.5-7.4，形成稳定的药物组合物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明制备的纳米粒及纳米药物制剂，具有良好的生物相容性和生物降解性，降解得到的产物主要为氨基酸，所用金属离子也为人体必需的金属元素；
(2)本发明所述纳米药物制剂具有体内特异性蛋白和/或酶响应性，对肿瘤组织过表达的金属硫蛋白的响应性，能够选择性释放药物，提高药物的治疗效果，降低毒副作用；
(3)本发明所述的纳米药物制剂还具有pH和谷胱甘肽的多重响应性，能够快速释放药物，为光动力治疗争取最佳的治疗时间，提高治疗效果；
(4)本发明实验条件温和，操作简单，不需要使用任何的毒性溶剂和添加剂，无需复杂的合成和制备过程；制备时间短，效率高，尺寸均匀可调且易于控制，适合产业化生产。
图说明
图1(A)为本发明中实施例1中所制备纳米粒的粒径分布图，图1(B)为本发明中实施例1中所制备纳米粒的傅立叶红外光谱图；
图2为本发明中实施例2中所制备纳米粒的粒径分布图；
图3(A)为本发明中实施例2中所制备纳米粒的扫描电子显微镜照片，图3(B)为本发明中实施例2中所制备纳米粒的透射电子显微镜照片；
图4(A)为不同pH值下，实施例2所制备纳米粒溶液的浊度变化曲线，图4(B)为实施例2所制备纳米粒(曲线1)和分别加入2mg/mL胰酶(曲线2)、10mM谷胱甘肽(曲线3)或1mM金属硫蛋白(曲线4)后，纳米粒溶液浊度随时间的变化曲线；
图5(A)为本发明中实施例3所制备纳米粒的扫描电子显微镜照片，图5(B)为本发明中实施例4所制备纳米粒的扫描电子显微镜照片，图5(C)为本发明中实施例5所制备纳米粒的扫描电子显微镜照片，图5(D)为本发明中实施例6所制备纳米粒的扫描电子显微镜照片；
图6(A)为本发明中实施例7所制备姜黄素纳米药物制剂的紫外可见光谱图，图6(B)为本发明中实施例8所制备二氢卟吩e6纳米药物制剂的紫外可见光谱图；
图7为实施例9所制备含有二氢卟吩e6的纳米药物制剂的多重响应性药物释放曲线；
图8(A)为实施例8所制备二氢卟吩e6纳米药物制剂的光动力治疗细胞暗毒性评价，图8(B)为实施例8所制备二氢卟吩e6纳米药物制剂的光动力治疗细胞光毒性评价。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1：
配制摩尔浓度为2mM的芴甲氧羰基-L-组氨酸水溶液(pH值为6)和摩尔浓度为10mM的氯化铜溶液(pH值为5)；取1mL氯化铜溶液加入到9mL芴甲氧羰基-L-组氨酸水溶液，混合均匀；调节混合溶液的pH值至6.5-7.4，得到纳米粒制剂。
所得纳米粒制剂的粒径分布如图1(A)，显示其粒径在120nm，PDI为0.12；测到纳米粒制剂的Zeta电势为-22.8eV，表明其带负电荷。所得纳米粒制剂的红外光谱如图1(B)，曲线1为芴甲氧羰基-L-组氨酸，曲线2为纳米粒制剂。
实施例2：
将N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸分散于水中，调节溶液pH值至9-11，使其完全溶解，最终N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸水溶液的摩尔浓度为10mM。配制摩尔浓度为1000mM的氯化锌溶液，调节溶液pH值为3-5；取上述0.45mL氯化锌溶液加入到9mL N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸水溶液，混合均匀；调节混合溶液的pH值至6.5-7.4，得到纳米粒制剂。
所得纳米粒制剂的粒径分布如图2，显示其粒径在80nm，PDI为0.06；；测到纳米粒制剂的Zeta电势为-24.9eV。所得纳米粒制剂的扫描电子显微镜照片如图3(A)；透射电子显微镜图片如图3(B)；结果显示，所制备纳米粒制剂尺寸均一，具有良好的分散性。
本发明对本实施例2制备得到的纳米粒的多重响应性进行了测试。测试结果如图4。其中(A)为不同pH值下，纳米粒溶液的浊度变化曲线。(B)为纳米粒(曲线1)和分别加入2mg/mL胰酶(曲线2)、10mM谷胱甘肽(曲线3)或1mM金属硫蛋白(曲线4)后，溶液浊度随时间的变化曲线。图4(B)的插图为加入金属硫蛋白前(上)后(下)纳米粒制剂的照片。从图中可以看出，该纳米粒具有多重响应性，可在体内肿瘤处低pH环境、高谷胱甘肽、金属硫蛋白和酶浓度条件下快速发生解离。
实施例3：
将β-萘酰胺基-L-苯丙氨酸-L-谷氨酸分散于水中，调节溶液pH值调至9-10，使其完全溶解，最终β-萘酰胺基-L-苯丙氨酸-L-谷氨酸水溶液的摩尔浓度为100mM。配制摩尔浓度为10mM的硝酸锌溶液，调节溶液pH值为3-5；取上述5mL硝酸锌溶液加入到5mLβ-萘酰胺基-L-苯丙氨酸-L-谷氨酸水溶液，混合均匀；调节混合溶液的pH值至6.5-7.4，得到纳米粒制剂。所得纳米粒制剂的扫描电子显微镜照片如图5(A)。
实施例4：
将N-(3-吲哚乙酰基)-L-苯丙氨酸-L-组氨酸分散于水中，调节溶液pH值调至8-9，使其完全溶解，最终N-(3-吲哚乙酰基)-L-苯丙氨酸-L-组氨酸水溶液的摩尔浓度为1mM。配制摩尔浓度为10mM的氯化铁溶液，调节溶液pH值为5-6；取上述1mL氯化铁溶液加入到9mLN-(3-吲哚乙酰基)-L-苯丙氨酸-L-组氨酸水溶液，混合均匀；调节混合溶液的pH值至6.5-7.4，得到纳米粒制剂。所得纳米粒制剂的扫描电子显微镜照片如图5(B)。
实施例5：
将N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸分散于水中，调节溶液pH值调至9-10，使其完全溶解，最终N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸水溶液的摩尔浓度为1mM。配制摩尔浓度为10mM的氯化亚铁溶液，调节溶液pH值为4-5；取上述0.5mL氯化亚铁溶液加入到9.5mL N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸水溶液，混合均匀；调节混合溶液的pH值至6.5-7.4，得到纳米粒制剂。所得纳米粒制剂的扫描电子显微镜照片如图5(C)。
实施例6：
将N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸分散于水中，调节溶液pH值至9-11，使其完全溶解，最终N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸水溶液的摩尔浓度为1mM。配制摩尔浓度为20mM的氯化锌溶液，调节溶液pH值为3-5；配制摩尔浓度为50mM的紫杉醇乙醇溶液；分别取0.05mL紫杉醇乙醇溶液和0.45mL氯化锌溶液加入到9mL N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸水溶液，混合均匀；调节混合溶液的pH值至6.5-7.4，得到紫杉醇的纳米药物制剂。所得紫杉醇纳米药物制剂的扫描电子显微镜照片如图5(D)。
实施例7：
配制摩尔浓度为2mM的芴甲氧羰基-L-组氨酸水溶液(pH值为6)、摩尔浓度为10mM的氯化铜溶液(pH值为5)和摩尔浓度为10mM的姜黄素乙醇溶液；分别取0.1mL姜黄素乙醇溶液和1mL氯化铜溶液加入到9mL芴甲氧羰基-L-组氨酸水溶液，混合均匀；调节混合溶液的pH值至6.5-7.4，得到含有姜黄素纳米药物制剂。将所得姜黄的纳米药物制剂，测试紫外可见吸收光谱，在430nm处出现姜黄素的特征吸收峰，说明姜黄素被负载于纳米粒中。紫外可见吸收光谱如图6(A)。
实施例8：
配制摩尔浓度为5mM的二氢卟吩e6水溶液。二氢卟吩e6在纯水中的溶解度低，用1M的NaOH水溶液调节溶液pH值12，以提高二氢卟吩e6在水中的溶解度；取0.2mL上述二氢卟吩e6溶液加入到10mL实施例2制备的纳米粒制剂中，混合均匀；得到载有二氢卟吩e6的纳米药物制剂。将所得二氢卟吩e6的纳米药物制剂，测试紫外可见吸收光谱，在400nm和630nm处出现二氢卟吩e6的特征吸收峰，说明二氢卟吩e6被负载于纳米粒中。紫外可见吸收光谱如图6(B)。
实施例9：
将N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸分散于水中，调节溶液pH值至9-11，使其完全溶解，最终N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸水溶液的摩尔浓度为1mM。配制摩尔浓度为20mM的氯化锌溶液，调节溶液pH值为3-5；配制摩尔浓度为10mM的二氢卟吩e6乙醇溶液；分别取0.05mL二氢卟吩e6乙醇溶液和0.45mL氯化锌溶液加入到9mL N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸水溶液，混合均匀；调节混合溶液的pH值至6.5-7.4，得到二氢卟吩e6的纳米药物制剂。
本发明对本实施例9制备得到的含有二氢卟吩e6的纳米药物制剂多重响应性药物释放曲线进行了测试。测试结果如图7。其中曲线1为含有二氢卟吩e6的纳米药物制剂在pH值为7.4的磷酸缓冲溶液中二氢卟吩e6的释放曲线，曲线2为含有二氢卟吩e6的纳米药物制剂在pH值为5.5的磷酸缓冲溶液中二氢卟吩e6的释放曲线，曲线3为含有二氢卟吩e6的纳米药物制剂在含有10mM谷胱甘肽pH值为7.4的磷酸缓冲溶液中二氢卟吩e6的释放曲线，曲线4为含有二氢卟吩e6的纳米药物制剂在含有1mM金属硫蛋白pH值为7.4的磷酸缓冲溶液中二氢卟吩e6的释放曲线，曲线5为含有二氢卟吩e6的纳米药物制剂在含有10mM谷胱甘肽，1mM金属硫蛋白pH值为5.5的磷酸缓冲溶液中二氢卟吩e6的释放曲线。从图中可以看出，该纳米药物制剂具有多重响应性，可在体内肿瘤处，低pH环境、高谷胱甘肽、金属硫蛋白和酶浓度条件下快速发生解离，快速释放出包载的药物。
实施例10-15：
将N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸分散于水中，调节溶液pH值至9-11，使其完全溶解，最终N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸水溶液的摩尔浓度为10mM。配制摩尔浓度为1000mM的氯化铜溶液，调节溶液pH值为3-5；配制摩尔浓度为10mM的阿霉素水溶液，5mM的原卟啉IX二钠盐水溶液，5mM的酞菁镍四磺酸四钠盐水溶液，5mM的顺铂水溶液，5mM的培美曲塞水溶液和5mM的吉非替尼水溶液。分别取0.1mL上述药物溶液和0.45mL氯化铜溶液加入到9mL N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸水溶液，混合均匀；调节混合溶液的pH值至6.5-7.4，混合24h后，离心，真空干燥，得到负载药物的纳米药物制剂。
实施例16-21：
取6份9.45mL实施例2中制备的纳米粒，分别向其中加入0.1mL摩尔浓度为10mM的阿霉素水溶液，5mM的原卟啉IX二钠盐水溶液，5mM的酞菁镍四磺酸四钠盐水溶液，5mM的顺铂水溶液，5mM的培美曲塞水溶液和5mM的吉非替尼水溶液。混合24h后，离心，真空干燥，得到负载药物的纳米药物制剂。
通过实施例10-15与实施例16-21对比发现：通过与药物共组装，或者药物直接与预制备纳米共混均能有效的负载药物，各组药物的包封率如下表1所示：
表1
实施例22：体外细胞毒性实验
以实施例6中所得的紫杉醇纳米药物制剂为例，与实施例2中的空白纳米粒及临床制剂Taxol为对照，进行体外细胞毒性实验。步骤如下：MCF-7细胞按照每孔10000个接种于96孔板中，37℃下孵育24h后，添加不同浓度上述待测制剂。48h后，用MTT试剂测定不同给药浓度对细胞的杀伤毒性的影响，结果如图8(A)所示，紫杉醇纳米药物制剂的细胞杀伤效率高于临床制剂Taxol，且空白纳米粒对细胞无明显的杀伤毒性，展示出良好的生物相容性，因此本发明的纳米药物制剂具有更优的应用价值。
实施例23：光动力治疗细胞评价实验
以实施例8中所得的二氢卟吩e6纳米药物制剂为例，与实施例2中的空白纳米粒及无载体的二氢卟吩e6为对照，进行细胞光动力治疗评价实验，包括细胞暗毒性和光毒性实验。
细胞暗毒性测试步骤如下：人乳腺癌细胞MCF-7按照10000个每孔的密度接种于96孔板中，37℃下孵育24h后，添加一系列不同浓度上述待测制剂。48h后，用MTT试剂测定不同给药浓度对细胞的杀伤程度，结果如图8(B)所示，含有二氢卟吩e6的纳米药物制剂与空白纳米粒对细胞无明显的毒性，说明材料本身具有高生物相容性。
细胞光毒性测试步骤如下：人乳腺癌细胞MCF-7按照10000个每孔的密度接种于96孔板中，37℃下孵育24h后，添加一系列不同浓度上述待测制剂。24h后，用PBS洗去未摄取的待测制剂，然后加入新鲜的培养基后，以波长为635nm的激光，100mW/cm2的强度照射1min。然后继续培养24h后，用MTT试剂测定不同给药浓度对细胞的杀伤程度，结果如图7所示，随着二氢卟吩e6浓度的增加，其细胞杀伤率逐渐增加，且同等浓度下，二氢卟吩e6纳米药物制剂的光毒性要高于对照组，说明二氢卟吩e6纳米药物制剂可提高光动力的治疗效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种纳米粒制剂，其特征在于，所述纳米粒制剂由以下组分组成：(1)寡肽和/或寡肽衍生物；(2)金属离子；
所述寡肽和/或寡肽衍生物的通式为Yn、YnZm或ZmYn，
当n＝1，m＝1时，所述Y为组氨酸、谷氨酸、赖氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸中的任意一种或至少两种的组合，所述Z为苯丙氨酸、亮氨酸或络氨酸中的任意一种或至少两种的组合；
当n为2-4中任意整数，m为2-3中任意整数时，所述Y为组氨酸、谷氨酸、赖氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸中的任意一种，所述Z为苯丙氨酸、亮氨酸或络氨酸中的任意一种；
所述金属离子为锌离子、亚铁离子、铁离子、铜离子、银离子、铝离子、钴离子、钙离子、钛离子、铕离子或铽离子中的任意一种或至少两种的组合。
2.根据权利要求1所述的纳米粒制剂，其特征在于，所述氨基酸的N末端被N末端保护基团保护；
优选地，所述保护基团为苯基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、β-萘酰胺基、N-(3-吲哚乙酰基)或N-芴甲氧羰基中的任意一种或至少两种的混合。
3.根据权利要求1或2所述的纳米粒制剂，其特征在于，所述金属离子为锌离子、铜离子、亚铁离子、银离子、钙离子、铕离子或铽离子中的任意一种或至少两种的混合；
优选地，所述纳米粒制剂的直径为10-1000nm，优选为20-200nm。
4.一种如根据权利要求1-3中任一项所述的纳米粒制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将寡肽和/或寡肽衍生物分散于水溶液中，充分溶解得到寡肽和/或寡肽衍生物水溶液；
(2)将金属盐溶解在水中，得到金属离子水溶液；
(3)将步骤(1)得到的寡肽和/或寡肽衍生物水溶液与步骤(2)得到的金属离子水溶液进行混合，形成稳定的纳米粒制剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述溶液的pH值调节为8-12；
优选地，步骤(1)所述寡肽和/或寡肽衍生物水溶液的摩尔浓度为1-100mM，优选为1-40mM。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述溶液的pH值调节为2-6；
优选地，步骤(2)所述金属离子水溶液的摩尔浓度为10-1000mM，优选为10-200mM。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述将步骤(1)得到的寡肽和/或寡肽衍生物水溶液与步骤(2)得到的金属离子水溶液进行混合，其中，寡肽和/或寡肽衍生物水溶液和金属离子水溶液的摩尔比为0.2-10；
优选地，步骤(3)所述混合后得到的溶液的pH值调节为6.5-7.4。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述pH值调节通过加入碱性物质或酸性物质；
优选地，所述碱性物质为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾中的任意一种或至少两种的混合物；
优选地，所述酸性物质为盐酸、磷酸、硫酸或硝酸中的任意一种或至少两种的混合物。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物包括如权利要求1-3中任一项所述的纳米粒制剂和药物；
优选地，所述药物为抗肿瘤药物；
优选地，所述药物为姜黄素、培美曲塞、吉非替尼、阿霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、卡铂、奥沙利铂、硼替佐米、喜树碱、三氧化二砷、羟基喜树碱、替莫泊芬、5-氨基酮戊酸、原卟啉IX、原卟啉IX二钠盐、维替泊芬、单天冬胺酰基二氢卟吩、四苯基卟啉或紫草素中的任意一种或至少两种的混合。
10.一种如权利要求9所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将配制的药物溶液加入到如权利要求1-3中任一项所述的纳米粒制剂或如权利要求4-7中任一项所述的方法制备的纳米粒制剂中，得到稳定的药物组合物；
优选地，所述药物溶液的溶剂为水、乙醇、二甲基亚砜、丙酮中的一种或任意两种以上的组合。
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