JP2020514747A - Ｋｒａｓ陽性癌の診断法及び治療法 - Google Patents

Abstract

ＫＲＡＳ変異を有するがんの検出法及び測定法が提供され、ＫＲＡＳ変異は、がんにおいて腫瘍形成を駆動する可能性がある。実施形態にあっては、ＫＲＡＳ+癌は、肺腺癌である。

Description

がん患者の治療は、歴史的に見て、全身性細胞障害性化学療法、放射線療法、及び手術からなってきた。現在、悪性腫瘍を駆動する分子経路についての理解が深まることで、悪性腫瘍細胞の特定分子経路を標的とする作用剤が開発されるようになるとともに、特定の治療で効果が見込まれる患者を同定することもより可能になってきた。

確立された標的療法の多くでは、経口摂取可能な小分子キナーゼ阻害剤として投与されるが、標的療法は、モノクローナル抗体または小分子の形状で静脈内投与することも可能である。

いくつかの腫瘍における特定チロシンキナーゼの発がん性活性化、例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の変異または未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）遺伝子もしくはＲＯＳ１遺伝子の再配列などの同定は、パラダイムシフトを招き、患者に特異的な分子治療の開発をもたらした。そのうえ、こうした患者サブセットの同定から、患者の他のサブセットに利用可能なバイオマーカー及び治療を同定する努力が現在行われるようになった。

標的療法の有効性を予測するために最も有用なバイオマーカーは、「ドライバー変異」として知られる体細胞ゲノムの変化である。これらの変異は、がん細胞中の、細胞増殖及び生存に極めて重要なタンパク質をコードする遺伝子内で生じる。発がん表現型を維持するためにそれほど本質的ではない他の多くの再発性分子変化は、「パッセンジャー変異」と称することが多い。

ドライバー変異は、典型的には、変容させるものであり、これは、ドライバー変異が、非がん性細胞から悪性腫瘍への進化を開始させることを意味する。また、ドライバー変異は、形質転換細胞に、がん遺伝子依存的生態を付与することが多く、このことは、変異型タンパク質が、生存するために、がん細胞内でドライバーからシグナルを受け取ることに依存するようになることを意味する。がん遺伝子依存性により、ドライバー変異は、標的治療の患者を選択するための良好なバイオマーカーとなる。細胞における極めて重要な下流の成長及び生存経路が上流の単一経路に極度に依存していることにより、がんは、ドライバーを起源とするシグナルの下方制御に対して感受性を持つ。

肺腺癌においても、他の悪性腫瘍の場合と同様に、特定の標的薬物と、個々の患者について同定されたドライバー変異とをマッチングさせることにより、治療効果の大幅な改善がもたらされ、多くの場合この改善は毒性の低下を伴った。したがって、ドライバー変異に関してスクリーニングすることは、診断の精密検査の基本部分をますます占めるようになり、その結果得られる情報は、標的となり得るドライバー変異がない場合の標準化学療法と標的療法とのどちらを選択するかにおいて有用である。

患者をドライバー変異及び他の異常に関してスクリーニングする方法は、進化し続けており、検査のための標準プラットフォームは１つだけではない。プラットホームを臨床上有用にしている特長は、迅速な所要時間（２週間以下）、費用効率、臨床的に入手可能な試料で実行可能であること、及び１人の操作者に依存することを排除する半自動化である。臨床の場で共通して使用される技法として、変異の存在に関する遺伝子配列決定、所定の変異に関してＤＮＡを分析するアレル特異的検査、次世代配列決定、遺伝子の転座、増幅、及び他の再配列を検出する蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ法（ＦＩＳＨ）、免疫組織化学、ならびに循環腫瘍ＤＮＡの分析が挙げられる。

ＫＲＡＳ変異の活性化は、例えば結腸直腸癌、ＮＳＣＬＣ、及び膵管腺癌（ＰＤＡＣ）をはじめとする、複数の上皮癌で観察される。膜結合型細胞内ＧＴＰアーゼとして、ＲＡＳファミリーのタンパク質には、ＭＡＰＫの中心的なメディエーター、転写（ＳＴＡＴ）のシグナルトランスデューサー兼アクチベーター、及びホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）シグナル伝達経路があり、これらは一緒になって、細胞増殖及びアポトーシスを制御する。発がんＲＡＳ変異、最も一般的にはコドン１２、１３、または６１でのミスセンス置換に相当するものは、ＲＡＳ ＧＴＰアーゼの機能を障害することにより、上流シグナルから独立したＲＡＳの恒常的活性化を引き起こす。

ＫＲＡＳ変異の存在は、特定の治療に対する反応または耐性と関連付けられてきた。ＫＲＡＳ変異は、腫瘍を葉酸代謝拮抗剤に対して感作させる場合があるが、一方で、セツキシマブ及び他のＥＧＦＲ阻害剤などの作用剤に対する耐性を付与する。ＫＲＡＳ変異型肺癌の患者のための標的治療薬について現在の注目は、トラメチニブを用いたＭＥＫ阻害及びセルメチニブを用いたＭＥＫ阻害を含む、活性化ＫＲＡＳの下流エフェクターに向けられている。ＲＡＳを直接阻害する試みは、これまでのところ成功していない。

少数のがん細胞をスクリーニングし患者サブ集団を同定する改善された方法は、臨床的に非常に関心が持たれる。本発明は、この要求を満たすものである。

ＫＲＡＳ変異を有するがんの検出法及び治療法が提供され、このＫＲＡＳ変異は、がんにおいて腫瘍形成を駆動する可能性がある。そのようながんは、本明細書中、「ＫＲＡＳ⁺ 癌」と称する場合がある。実施形態によっては、ＫＲＡＳ⁺ 癌、肺腺癌である。

ＫＲＡＳ⁺ 癌細胞は、（ａ）脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）の遺伝子発現の上方制御の検出、（ｂ）ＥＲＫ１ホスホアイソフォームの変化の検出、及び（ｃ）独特の脂質シグネチャーの誘導の検出のうち１つまたは複数を通じて、ＫＲＡＳ陰性がん細胞から、ならびに正常なカウンターパート組織から識別可能であることが、本明細書中で示される。がん細胞のＫＲＡＳ⁺ 表現型を特定することにより、治療される個体を選択することができる。ＦＡＳＮの阻害によりＫＲＡＳ⁺ 肺腺癌細胞の増殖が抑制され、それにより標的療法を提供することができることが、さらに示される。

１つの実施形態において、ナノ流体プロテオーム免疫アッセイ（ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＮＩＡ）を用いて、ＫＲＡＳ⁺ 肺腺癌細胞を含むＫＲＡＳ⁺ 腫瘍であることが疑われる腫瘍由来の少量のライセートでＥＲＫ１ホスホアイソフォームを定量する。ＮＩＡにより、ＥＲＫ１対ＥＲＫ２タンパク質活性化から、臨床検体がＫＲＡＳ陽性腫瘍か陰性腫瘍かを識別することが可能になった。具体的には、ＫＲＡＳ⁺ 腫瘍では、合計ＥＲＫタンパク質レベルと比べた場合に、ならびに正常組織試料またはＫＲＡＳ陰性がんに対して、ｐｐＥＲＫ１及びｐＥＲＫ１のレベルの顕著な上昇が見つかる。ＮＩＡ用対象試料として、血液または固形腫瘍マイクロバイオプシー試料、例えば、微細針吸引試料（ＦＮＡ）または循環腫瘍細胞などが挙げられる。試料は、単一の時点で採取される場合もあるし、複数の時点で採取される場合もある。試料は、わずか１００，０００個の細胞、わずか５０００個の細胞、わずか１０００個の細胞、わずか１００個の細胞、わずか５０個の細胞、わずか２５個の細胞、またはそれ未満の場合がある。ＮＩＡ検出法は、ナノ流体系において等電点タンパク質電気泳動と抗体検出とを組み合わせたものである。本発明の実施形態によっては、ＮＩＡ検出は、凍結されていた試料で行われ、その試料では細胞は解凍後に溶解している。血球細胞は、変動性を抑えるために試料中に維持される場合がある。分析は、試料を得てから最長６０分間行われる場合があるが、ただし、試料が氷上に維持されることが条件である。ＮＩＡは最小量の検体しか必要としないため、分析は、侵襲性が最小限であり、これにより、例えば、治療の開始前後で系列タンパク質プロファイルを得て、治療を開始した患者におけるタンパク質活性の初期変化を定量することにより予測タンパク質バイオマーカーを決定することなどが可能になる。

１つの実施形態において、肺腺癌細胞を含む、ＫＲＡＳ⁺ 癌細胞であることが疑われるまたは既知であるがん細胞におけるＫＲＡＳ駆動型代謝を分析するために、質量分析法（脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ−ＭＳＩ）が挙げられるがこれに限定されない）が行われる。正常組織では、複数の脂質種の合計存在量及び相対存在量が、がん組織中よりも顕著に少ない。

がん細胞から抽出されたＮＩＡまたはＤＥＳＩ質量スペクトルにおける差異は、正常細胞、ＫＲＡＳ^- 癌細胞、既知ＫＲＡＳ⁺ 癌細胞の参照などと比較することができる。複数の試料を、がん治療のための治療レジメンで治療されている個体をはじめとする個体から経時的に得て分析することができる。複数の試料は、患者コホート群、例えば、臨床試験の文脈における群からも、得て分析することができる。

他の実施形態において、ＫＲＡＳ⁺ 肺腺癌の治療法が提供される。癌は、治療前に、ＫＲＡＳ⁺ 表現型か否かを判定するため、本明細書中に記載される方法により分析することができる。がんは、治療過程にわたり、ＫＲＡＳ駆動型腫瘍形成を示すマーカーに関して治療の有効性を判定するために、本明細書中に記載される方法により分析することができる。治療法は、脂肪酸シンターゼ活性、または脂肪酸シンターゼ発現の阻害剤を必要とする患者に、そのような阻害剤を、有効量で投与することを含む。本明細書に示すとおり、ＦＡＳＮの阻害は、ヒトＫＲＡＳ⁺ 肺癌細胞の増殖を抑制する。実施形態によっては、ＦＡＳＮ阻害剤は、第二の治療レジメン、例えば、１つまたは複数の手術、化学療法、放射線療法、癌免疫療法、標的指向型抗腫瘍抗体療法などとの併用療法で提供される。がん細胞との接触は、例えば治療目的でｉｎ ｖｉｖｏ、及び例えばスクリーニングアッセイのためｉｎ ｖｉｔｒｏなどで行うことができる。

態様によっては、本開示は、患者の腫瘍がＫＲＡＳ変異により駆動されている（ＫＲＡＳ⁺ ）か否かの判定法を提供し、本方法は、ＫＲＡＳ⁺ であることが疑われる腫瘍の試料を得ることと、ＥＲＫホスホアイソフォームに関するナノ流体プロテオーム免疫アッセイ（ＮＩＡ）、及びｍ／ｚ領域約７００〜１０００及び／またはｍ／ｚ約２００〜４００の領域の脂質種に関する脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ−ＭＳＩ）の一方または両方を行うことと、ＫＲＡＳ+ 腫瘍は、ＫＲＡＳ^- 腫瘍または正常組織と比べて変化したＥＲＫ１アイソフォーム及び／または変化した脂質種を示し、試料が、ＫＲＡＳ^- 腫瘍または正常組織と比べて変化したＥＲＫ１アイソフォーム及び／または変化した脂質種を示しているか否かを判定することと、患者に判定結果を提供することとを含む。

実施形態によっては、本方法は、さらに、判定結果に従って患者を治療することを含む。腫瘍は、肺腺癌の場合がある。実施形態によっては、試料は、バイオプシー試料である。実施形態によっては、バイオプシー試料は、１００，０００個未満の細胞の腫瘍細胞試料である。実施形態によっては、バイオプシー試料は、微細針吸引試料である。実施形態によっては、対照組織は、同一腫瘍から異なる時点で採取された試料である。単一腫瘍で複数の時点を比較することができる。実施形態によっては、細胞試料は、事前に凍結されていたものである。

実施形態によっては、ＮＩＡは、ＫＲＡＳ⁺ 腫瘍に関して、合計ＥＲＫタンパク質レベルと比較した場合にｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベルが顕著に上昇していることを検出する。実施形態によっては、ＤＥＳＩ−ＭＳＩは、ＫＲＡＳ⁺ 腫瘍に関して、複合グリセロリン脂質レベル及び遊離脂肪酸レベルが顕著に上昇していることを検出する。患者は、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）阻害剤で治療される場合がある。実施形態によっては、阻害剤は、第二治療レジメンと併用して投与される。例えば、ＦＡＳＮ阻害剤は、セルレニンの場合がある。

実施形態によっては、本方法は、さらに、ＫＲＡＳ駆動型腫瘍形成を示すマーカーに関して治療の有効性を決定するために、患者から採取した試料が、治療過程にわたり２つ以上の時点で、ＫＲＡＳ^- 腫瘍または正常組織に比べて変化したＥＲＫ１アイソフォーム及び／または変化した脂質種を示しているか否かを判定することを含む。

態様によっては、本開示は、ＫＲＡＳ⁺ 癌を持つ対象を同定する方法を提供し、本方法は、対象から得られた臨床試料でナノ流体プロテオーム免疫アッセイ（ＮＩＡ）及び／または脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ−ＭＳＩ）を行うことと、臨床試料中のＥＲＫ１ホスホアイソフォーム及び／または脂質種を測定することとを含む。

実施形態によっては、臨床試料は、合計ＥＲＫタンパク質レベルと比較した場合に、ｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベルが顕著に上昇している。実施形態によっては、臨床試料は、正常組織試料またはＫＲＡＳ^- 癌と比較した場合に、ｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベルが顕著に上昇している。実施形態によっては、ＤＥＳＩ−ＭＳＩを行うことは、ｍ／ｚ領域約７００〜１０００及び／またはｍ／ｚ約２００〜４００の範囲の領域で脂質種を検出することを含む。臨床試料は、正常組織試料またはＫＲＡＳ^- 癌に比べて変化した脂質種を示す場合がある。実施形態によっては、臨床試料は、ｍ／ｚ７４５．５０３４、ＰＧ（１８：１／１６：１）、ｍ／ｚ７４７．５１９０、ＰＧとして（１８：１／１６：０）、ｍ／ｚ７９３．５０２３、ＰＧ（１８：２／２０：４）、及びｍ／ｚ８６５．５０３４、ＰＧ（２２：６／２２：６）の相対及び／または合計存在量が増加している。実施形態によっては、ＤＥＳＩ−ＭＳＩは、ＫＲＡＳ⁺ 腫瘍に関して複合グリセロリン脂質レベル及び遊離脂肪酸レベルの顕著な上昇を検出する。

実施形態によっては、臨床試料は、血液試料である。実施形態によっては、臨床試料は、バイオプシー試料である。バイオプシー試料は、腫瘍から得られる場合がある。実施形態によっては、臨床試料は、１００，０００個未満の細胞を含む。臨床試料は、１，０００個未満の細胞を含む場合がある。臨床試料は、１００個未満の細胞を含む場合がある。

実施形態によっては、臨床試料は、微細針吸引により得られる。実施形態によっては、臨床試料は、ｉｎ ｖｉｖｏで採取された微細針吸引試料（ＦＮＡ）である。実施形態によっては、本方法は、さらに、ＦＮＡを、隣接する非腫瘍組織と比較することを含む。実施形態によっては、対象は、肺腺癌と診断される。実施形態によっては、対象は、腎臓癌と診断される。本方法は、さらに、異なる時点で同一腫瘍からの第二ＮＩＡ及び／または第二ＤＥＳＩ−ＭＳＩを行うことを含むことができる。

実施形態によっては、臨床試料は、事前に凍結されていたものである。臨床試料は、ＮＩＡ及び／またはＤＥＳＩ−ＭＳＩを行う前に、３０分間超、氷上に事前に維持されていた場合がある。

態様によっては、本開示は、ＫＲＡＳ⁺ 癌を治療するまたは減少させる必要がある対象について、ＫＲＡＳ⁺ 癌を治療するまたは減少させる方法を提供し、本方法は、対象の一部位から得られた臨床試料でナノ流体プロテオーム免疫アッセイ（ＮＩＡ）及び／または脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ−ＭＳＩ）を行うことと、第一の時点で、臨床試料中のＥＲＫ１ホスホアイソフォーム及び／または脂質種を測定することと、対象が有効量の抗がん剤で治療を受けた後、対象のほぼ同一の部位から得られた臨床試料で、第二のＮＩＡ及び／または第二のＤＥＳＩ−ＭＳＩを行うことと、対象が有効量の抗がん剤で治療を受けた後、第二の時点で、対象のほぼ同一の部位から得られた臨床試料中のＥＲＫ１ホスホアイソフォーム及び／または脂質種を測定することとを含む。

実施形態によっては、抗がん剤は、脂肪酸シンターゼ阻害剤である。実施形態によっては、抗がん剤は、脂質生合成酵素阻害剤である。実施形態によっては、本方法は、さらに、患者に治療レジメンを受けさせることを含み、治療レジメンは、少なくとも１ヶ月間、有効量の抗がん治療薬を投与することを含む。実施形態によっては、本方法は、さらに、対象が有効量の抗がん剤で治療を受けた後、対象のほぼ同一の部位から得られた臨床試料中の、ＥＲＫ１ホスホアイソフォーム及び／または脂質種に基づき、治療レジメンを維持、調整、または中止することを含み、ＥＲＫ１ホスホアイソフォーム及び／または脂質種の変化は、治療レジメンに対する反応を示す。臨床試料は、最初の時点の合計ＥＲＫタンパク質レベルと比較した場合に、ｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベルが顕著に上昇している場合がある。臨床試料は、最初の時点の正常組織試料またはＫＲＡＳ^- 癌と比較した場合に、ｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベルが顕著に上昇している場合がある。実施形態によっては、ｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベルは、第一の時点で第二の時点よりも高い。実施形態によっては、ＤＥＳＩ−ＭＳＩを行うことは、ｍ／ｚ領域約７００〜１０００及び／またはｍ／ｚ約２００〜４００の範囲の領域で脂質種を検出することを含む。臨床試料は、第一の時点で、正常組織試料またはＫＲＡＳ^- 癌と比べて変化した脂質種を示す場合がある。臨床試料は、第一の時点で、ｍ／ｚ７４５．５０３４、ＰＧ（１８：１／１６：１）、ｍ／ｚ７４７．５１９０、ＰＧとして（１８：１／１６：０）、ｍ／ｚ７９３．５０２３、ＰＧ（１８：２／２０：４）、及びｍ／ｚ８６５．５０３４、ＰＧ（２２：６／２２：６）の相対及び／または合計存在量が増加している。実施形態によっては、ＤＥＳＩ−ＭＳＩは、第一の時点で、ＫＲＡＳ⁺ 腫瘍に関して複合グリセロリン脂質レベル及び遊離脂肪酸レベルの顕著な上昇を検出する。複合グリセロリン脂質レベル及び遊離脂肪酸レベルは、第一の時点で第二の時点よりも高い場合がある。

実施形態によっては、臨床試料は、血液試料である。実施形態によっては、臨床試料は、バイオプシー試料である。バイオプシー試料は、腫瘍から得られる場合がある。実施形態によっては、臨床試料は、１００，０００個未満の細胞を含む。臨床試料は、１，０００個未満の細胞を含む場合がある。臨床試料は、１００個未満の細胞を含む場合がある。実施形態によっては、臨床試料は、微細針吸引により得られる。臨床試料は、ｉｎ ｖｉｖｏで採取された微細針吸引試料（ＦＮＡ）の場合がある。実施形態によっては、本方法は、さらに、ＦＮＡを、隣接する非腫瘍組織と比較することを含む。

実施形態によっては、対象は、肺腺癌と診断される。実施形態によっては、対象は、腎臓癌と診断される。実施形態によっては、臨床試料は、事前に凍結されていたものである。臨床試料は、ＮＩＡ及び／またはＤＥＳＩ−ＭＳＩを行う前に、３０分間超、氷上に事前に維持されていた場合がある。

実施形態によっては、対象は、ヒトである。実施形態によっては、対象は、動物である。例えば、動物は、マウスの場合がある。実施形態によっては、本方法は、さらに、がん細胞を動物に移植することを含む。

態様によっては、本開示は、対象の疾患または障害の治療法を提供し、本方法は、対象に、有効量の抗がん剤を投与することを含み、抗がん剤を用いた治療は、対象から得られた臨床試料中のｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベル、及び／または複合グリセロリン脂質レベル及び遊離脂肪酸レベルに基づき、ならびにｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベル、及び／または複合グリセロリン脂質レベル及び遊離脂肪酸レベルは、参照レベルに比べて上昇している。実施形態によっては、ｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベルは、ナノ流体プロテオーム免疫アッセイ（ＮＩＡ）により測定される。実施形態によっては、複合グリセロリン脂質レベル及び遊離脂肪酸レベルは、脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ−ＭＳＩ）により測定され、ＤＥＳＩ−ＭＳＩは、ｍ／ｚ領域約７００〜１０００及び／またはｍ／ｚ約２００〜４００の範囲の領域で脂質種を検出することを含む。

実施形態によっては、疾患または障害は、ＫＲＡＳ⁺ 癌である。ＫＲＡＳ⁺ 癌は、肺癌の場合がある。ＫＲＡＳ⁺ 癌は、腎臓癌の場合がある。実施形態によっては、抗がん剤は、脂肪酸シンターゼ阻害剤である。抗がん剤は、脂質生合成酵素阻害剤の場合がある。実施形態によっては、参照レベルは、ＫＲＡＳ^- 腫瘍または正常組織中のｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベル、及び／または複合グリセロリン脂質レベル及び遊離脂肪酸レベルである。

実施形態によっては、臨床試料は、血液試料である。実施形態によっては、臨床試料は、バイオプシー試料である。バイオプシー試料は、腫瘍から得られる場合がある。実施形態によっては、臨床試料は、１００，０００個未満の細胞を含む。実施形態によっては、臨床試料は、１，０００個未満の細胞を含む。臨床試料は、１００個未満の細胞を含む場合がある。臨床試料は、微細針吸引により得られる場合がある。実施形態によっては、臨床試料は、事前に凍結されていたものである。実施形態によっては、臨床試料は、ＮＩＡ及び／またはＤＥＳＩ−ＭＳＩを行う前に、３０分間超、氷上に事前に維持されていたものである。

態様によっては、本開示は、がん、ＫＲＡＳ⁺ 癌を治療するまたは減少させる必要がある対象について、ＫＲＡＳ⁺ 癌を治療するまたは減少させる方法を提供し、本方法は、がん細胞を動物のある部位に移植することと、その部位からがん細胞の一部を取り出すことと、その一部をｅｘ ｖｉｖｏで有効量の抗がん剤で処理し、処理部位を作成することと、処理部位で、ナノ流体プロテオーム免疫アッセイ（ＮＩＡ）及び／または脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ−ＭＳＩ）を行うことと、その部位のＥＲＫ１ホスホアイソフォーム及び／または脂質種を測定することとを含む。

実施形態によっては、動物は、マウスである。実施形態によっては、本方法は、さらに、その部位でナノ流体プロテオーム免疫アッセイ（ＮＩＡ）及び／または脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ−ＭＳＩ）を行うことと、抗がん剤で処置する前に、その部位のＥＲＫ１ホスホアイソフォーム及び／または脂質種を測定することとを含む。

本発明は、以下の詳細な説明を、添付の図面と合わせて読むことにより、最も深く理解される。強調しておくが、慣習に従って、図面の様々な特長は正確な縮尺ではない。反対に、様々な特長の寸法は、明白にするため任意に拡大縮小されている。図面に含まれているのは、以下の図である。

Ａ〜Ｃは、ＫＲＡＳ誘導型マウス肺癌における脂質生合成である。１Ａは、肺癌における脂肪酸合成遺伝子の上方制御を示すマイクロアレイ分析である。１Ｂは、正常及びＫＲＡＳ活性化マウス肺組織間で示された１５の最大の統計上有意差である。１Ｃは、正常（ｎ＝２）及びＫＲＡＳ活性化マウス肺組織（ｎ＝５）における遺伝子発現である。ｔ検定による統計上有意性は、ｐ値＜０．０１の場合に^**で示した。 Ａ及びＢは相対的ｍＲＮＡ発現を示す。２Ａは、正常対ヒトＫＲＡＳ関連肺癌（ｎ＝１２）であり、２Ｂは、正常対ヒト非ＫＲＡＳ肺癌（ｎ＝１４）である。ｔ検定による統計上有意性は、ｐ値＜０．０５の場合に^* 、ｐ値＜０．０１の場合に^**、ｐ値＜０．００１の場合に^*** で示した。 Ａ及Ｂは、ＮＩＡによるＥＲＫタンパク質シグネチャーである。３Ａは、正常対ヒトＫＲＡＳ関連肺癌組織（ｎ＝６）、３Ｂは、正常対ヒト非ＫＲＡＳ肺癌組織（ｎ＝６）である。 Ｃ及Ｄは、ＮＩＡによるＥＲＫタンパク質シグネチャーである。３Ｃは、ＫＲＡＳ腫瘍において合計ＥＲＫに占めるパーセンテージ、３Ｄは、非ＫＲＡＳ腫瘍において合計ＥＲＫに占めるパーセンテージである。ｔ検定による統計上有意性は、ｐ値＜０．０５の場合に^* 、ｐ値＜０．０１の場合に^**、ｐ値＜０．００１の場合に^*** で示した。 脂質のＤＥＳＩ質量スペクトルである。画像は、複数の脂質種の過剰発現について、マウス腫瘍病巣（上段パネル）を正常マウス肺組織（下段パネル）及び該当する代表的質量スペクトルと比較したものである。 Ａ及びＢは、ＦＡＳＮ及びＳＣＤの相対的ｍＲＮＡ発現であり、５Ａは、ＳＣＨ７７２９８４によるＥＲＫ阻害（ｎ＝３）、５Ｂは、ヒト肺癌細胞株におけるＦＴＳによるＫＲＡＳ阻害である（ｎ＝３）。エラーバーは、ステューデントのｔ分布による９５％信頼区間を表す。対応のない２標本のｔ検定による統計上有意性は、ｐ値＜０．０５の場合に^* 、ｐ値＜０．０１の場合に^**で示した。 Ａ及びＢは、ヒト肺癌細胞株における、セルレニンによりＦＡＳＮが阻害された際の増殖抑制であり、６Ａは、Ａ５４９であり、６Ｂは、Ｈ１２９９である（各細胞株についてｎ＝３）。４日目に対照と比較した場合のｔ検定による統計上有意性は、ｐ値＜０．０５の場合に^* 、ｐ値＜０．０１の場合に^**、ｐ値＜０．００１の場合に^*** で示した。 マイクロアレイ分析で使用した代謝遺伝子全種のリストであり、図１Ａの補足である。 ＤＥＳＩ−ＭＳＩ機器設定である。 テトラサイクリンに基づく条件的がん遺伝子活性化である。ドキシサイクリン（ｄｏｘ）の不在下では、可逆的テトラサイクリントランス活性化因子（ｒｔＴＡ）は、ｔｅｔＯ配列に結合することができず、したがって、がん遺伝子発現は起こらない。ｄｏｘが添加されると、ｒｔＴＡはｄｏｘに結合して立体構造変化を起こし、この変化により、ｒｔＴＡはｔｅｔＯ配列に結合できるようになり、がん遺伝子発現を活性化する。このシステムは、遺伝子導入マウスモデルでがん遺伝子発現を条件的に活性化するために使用される。 充実性パターン腺腫病巣のＤＥＳＩ−ＭＳＩ画像及び代表的な質量スペクトルである。撮影した組織のＨ＆Ｅ染色により、腺腫を伴う部分が複数確認され、それらは、赤で示される。 分子イオンの同定に使用されるタンデム質量分析データである。脂質生合成経路を阻害する。 脂肪酸産生が、阻害剤であるセルレニンにより抑制可能であることを示し、セルレニンは、酵素、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）を阻害する。 ヒト肺腺癌試料である。 リアルタイムＰＣＲに使用されるプライマーである。 ＥＲＫアイソフォームの患者内及び患者間での変動性である。３９人の患者それぞれから、腎臓腫瘍の２〜３箇所で微細針吸引により試料を採取した。各ＦＮＡにおけるＥＲＫアイソフォームを、ＮＩＡで測定した。各円は、腫瘍ＦＮＡ（Ｎ＝９１のＦＮＡ）であり、技術的反復にまたがり平均した。患者ごとの試料を、鉛直線で結ぶ。患者は、ＥＲＫ２の試料にまたがる平均により並べられている。アイソフォームにまたがり、技術的反復にまたがる変動性は、平均の標準偏差が１％である。同一腫瘍の異なる領域から得た試料では、試料間の変動性は、平均の標準偏差が６％である。反対に、異なる患者にまたがり測定された割合の標準偏差は、アイソフォームにまたがり５％〜２２％の範囲である。 ＥＲＫ２が、肺癌ＣＴＣにおいて高度にホスホリル化されることを示す、代表的な図である。 ファルネシルチオサリチル酸（ＦＴＳ）が、形質膜でのＲａｓ結合を遮断することを示す。 ＦＴＳ処理が、ｉｎ ｖｉｖｏでＥＲＫ活性化を阻害することを示す（ＮＩＡ分析）。 ＢＣＬ２＋のＲａｓ不活化が、ｉｎ ｖｉｖｏでＢＣＬ２リンパ腫のアポトーシスを誘導することを示す（系列ＦＮＡ）。 ＢＣＬ２及びｒａｓの不活化が、いずれかのがん遺伝子を単独で不活化するよりも有効に腫瘍成長を阻害することを示す。 ＤＯＸによるＢＣＬ２不活性化及びＦＴＳによるＲＡＳ不活性化が、いずれかのがん遺伝子を単独で不活化するよりも有効に腫瘍成長を阻害することを示す。 遺伝子導入リンパ腫由来のＦＮＡにおけるＥＲＫアイソフォームのＮＩＡ分析を示す。 遺伝子導入リンパ腫由来のＦＮＡにおけるＥＲＫアイソフォームのＮＩＡ分析を示す。 ＥＲＫデータ（アトルバスタチン処理前及び後）を示す。 ＭＥＫデータ（アトルバスタチン処理前及び後）を示す。 アトルバスタチンが、ＮＨＬ患者９人中４人で、トリ−ホスホ−ＭＥＫ１に有意な変化を引き起こしたことを示す。 アトルバスタチンが、ＮＨＬ患者９人中４人で、ジ−ホスホ−ＭＥＫ１に有意な変化を引き起こしたことを示す。 アトルバスタチンが、ＮＨＬ患者９人中１人で、モノ−ホスホ−ＭＥＫ１に有意な変化を引き起こしたことを示す。 リゴセルチブ処置に対する治療反応におけるＥｒｋ活性を示す。 リゴセルチブの作用機序を示す。 リゴセルチブ処置の過程を示す。 リゴセルチブが、頭頚部扁平上皮癌のＥｒｋ経路を低下させることを示す。

ＫＲＡＳ変異を有するがんの検出法及び治療法が提供され、このＫＲＡＳ変異は、がんにおいて腫瘍形成を駆動する可能性がある。ＫＲＡＳ⁺ 癌細胞は、（ａ）脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）の遺伝子発現の上方制御の検出、（ｂ）ＥＲＫ１ホスホアイソフォームの変化の検出、及び（ｃ）独特の脂質シグネチャーの誘導の検出の１つまたは複数を通じて、ＫＲＡＳ^- 癌細胞から、ならびに正常なカウンターパート組織から識別可能である。がん細胞のＫＲＡＳ⁺ 表現型を判定することにより、治療される個体を選択することができる。そのような治療は、ＦＡＳＮ発現または酵素活性の阻害を含む場合がある。

当然のことながら、本発明は、記載される特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物の種または属、及び試薬に限定されず、したがって、変更可能である。同じく当然のことながら、本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図しない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになる。

本明細書中で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈から明白にそうではないと示されない限り、複数の指示対象も含む。したがって、例えば、「ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ（１つの化合物）」という言及は、その化合物が複数である場合も含み、「ｔｈｅ ａｇｅｎｔ（１つの作用剤）」という言及は、１つまたは複数の作用剤及び当業者に既知のそれらの等価物についての言及を含む、といった具合である。本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、明白にそうではないと示されない限り、本発明が属する当該分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。

ＫＲＡＳ。ＫＲＡＳのコドン１２及び１３での変異は、ＮＳＣＬＣ患者の約１５〜５０％で生じる。結腸直腸腫瘍の約３０％〜５０％は、変異型ＫＲＡＳ遺伝子を有することが知られている。本明細書中に提供される方法は、概して、がんのＫＲＡＳドライバーの表現効果に向けられている。しかしながら、代替方法は、例えば、これら遺伝子の遺伝子型の分析を含む。変異を検出する従来方法は、腫瘍組織の直接ＤＮＡ配列決定によるスクリーニングが関与していた。サンガー配列決定技法は、大部分の分子診断検査所で利用可能であり、新規変異体を含む遺伝子にわたって変化を検出する特異な利点を有する。近年の方法は、より迅速、堅実、及び高感度な検査を達成するために変異の標的スクリーニングに注目してきた。分子診断検査所は、現在、様々な方法を利用しており、そのような方法として、数例をあげると、増幅不応性変異システム（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）、パイロシーケンス法、スマート増幅プロセス（ｓｍａｒｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）、高分解溶融分析、及び制限断片長多型がある。これらの方法は全て、関心対象の領域内で変異型ＤＮＡと野生型ＤＮＡとを識別する。

この目的で市販されている検査手段は、ｔｈｅｒａｓｃｒｅｅｎ ＫＲＡＳ ＲＧＱ（Ｒｏｔｏｒ−ＧｅｎｅＱ）ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）キットである。ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２または１３の変異についての検査は、原発性または転移性腫瘍由来の組織をホルマリン固定しパラフィン包埋したもので行うことができる。

肺腺癌。肺腺癌は、非小細胞肺癌のサブセットであり、肺癌全体の約３５〜４０％を占める。症候として、咳、胸部の不快感または疼痛、体重減少、及び頻度は下がるが、喀血を挙げることができる。しかしながら、多くの患者は、どの臨床症候も伴わない転移性疾患を示す。診断は、典型的には、胸部Ｘ線またはＣＴにより下され、バイオプシーにより確定される。

呼吸上皮細胞は、腫瘍性になるまでに、がん促進剤への長期間曝露及び複数の遺伝変異の蓄積（発がん素地と呼ばれる効果）を必要とする。肺癌患者によっては、細胞増殖を刺激する遺伝子（Ｋ−ｒａｓ、ＭＹＣ）における二次または追加変異が、増殖因子受容体シグナル伝達（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ）に異常を引き起こし、アポトーシスを阻害して、異常細胞の増殖に寄与する。また、腫瘍抑制遺伝子（ｐ５３、ＡＰＣ）を阻害する変異は、がんを招く可能性がある。原因となり得る他の変異として、ＲＯＳ−１、ＢＲＡＦ、及びＰＩ３ＫＣＡにおけるＥＭＬ−４−ＡＬＫ転座及び変異が挙げられる。

発がん性ドライバー変異は、喫煙者の中で肺癌を引き起こすまたはそれに寄与する可能性があるものの、これらの変異は、非喫煙者の中でも肺癌の原因である可能性が特に高く、腺癌で主に同定されてきた。２０１４年、肺癌遺伝子変異コンソーシアム（ＬＣＭＣ）は、喫煙者及び非喫煙者の中で、肺癌７３３例のうち６４％にドライバー変異があることを明らかにした（２５％にＫ−ｒａｓ変異、１７％にＥＧＦＲ変異、８％にＥＭＬ−４−ＡＬＫ、及び２％にＢＲＡＦ変異）。

ＮＳＣＬＣの臨床的挙動は、より多様的であり、組織学的型に依存するが、患者の約４０％は、診断時に、胸部外に転移性疾患を有する可能性がある。発がん性ドライバー変異は、主に腺癌で同定されてきたものの、扁平上皮癌で同様な変異を同定する努力がなされている。

ステージＩ及びＩＩの従来の治療は、術後補助化学療法を伴うまたは伴わない手術であり、ステージＩＩＩＡでは、術後補助化学療法または同時化学療法もしくは放射線療法を伴うまたは伴わない手術、化学療法＋放射線療法及び手術、手術を伴う化学療法、あるいは化学療法＋放射線療法であり、ステージＩＩＩＢでは化学療法を伴うまたは伴わない放射線療法であり、ステージＩＶでは全身性標的療法あるいは対症的放射線療法を伴うまたは伴わない化学療法である。

術後補助化学療法は、現在、ステージＩＩまたはステージＩＩＩ疾患の患者の標準医療行為であり、ステージＩＢ疾患及び＞４ｃｍの腫瘍の患者についてもおそらくそうである。一般的に使用される化学療法レジメンは、シスプラチンに基づく二重投薬（シスプラチンと別の化学療法薬、例えば、ビノレルビン、ドセタキセル、パクリタキセルなどとの併用）である。初期ステージＮＳＣＬＣのネオアジュバント（手術前）化学療法も、一般的に使用されており、これは、シスプラチン二重投薬サイクル４回からなる。シスプラチンの投与不可である患者には、カルボプラチンで置き換えることができる。

５年生存率は、ステージによって変わり、ステージＩ疾患の患者では６０〜７０％であるが、ステージＩＶ疾患の患者では＜１％である。平均で、転移性ＮＳＣＬＣの未治療患者は、生存期間が６ヶ月であるが、治療患者の生存期間中央値は、約９ヶ月である。近年、患者の生存期間は、初期及び後期ステージＮＳＣＬＣ両方で、改善されてきている。初期ステージ疾患（ステージＩＢ〜ＩＩＩＢ）で、外科切除後に白金系化学療法レジメンを使用した場合、生存期間が改善されることをエビデンスは示している。また、標的療法は、ステージＩＶ疾患の患者、特にＥＧＦＲ変異、ＥＭＬ−４−ＡＬＫ転座、及びＲＯＳ−１転座を有する患者で、生存期間を改善した。

発がんドライバー変異を有する腫瘍の場合、阻害剤が最初に使用される。感受性ＥＧＦＲ変異（すなわち、エキソン１９の欠失変異、エキソン２１のＬ８５８変異）があるステージＩＶ患者では、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）が、第一選択療法として投与される場合がある。奏効率及び無増悪生存期間は、標準化学療法を用いて得られるものよりも良好である。ＥＧＦＲ ＴＫＩとして、ゲフィチニブ及びエルロチニブが挙げられる。ＥＭＬ−４−ＡＬＫ転座を有する患者には、ＡＬＫ及びＲＯＳ−１阻害剤であるクリゾチニブを投与しなければならない。ＡＬＫ変異がある患者には、アレクチニブまたはセリチニブを投与することができる。ＲＯＳ−１変異がある患者には、クリゾチニブまたはエルロチニブを投与することができる。ＢＲＡＦ変異がある患者には、ＢＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ）が有効である可能性がある。同様に、ＰＩ３Ｋ変異がある患者は、ＰＩ３Ｋ阻害剤が奏功することが予想できるが、そのような阻害剤は開発中である。本明細書中に記載される方法のいずれも、肺癌の治療または低減に利用可能である。

腎臓癌。腎臓癌は、腎臓の細胞で始まる種類の癌である。腎臓癌で最も一般的なのは、腎盂の腎細胞癌（ＲＣＣ）及び移行上皮癌（ＴＣＣ）（尿路上皮細胞癌としても知られる）という２種類である。腎臓癌の種類が異なれば（例えば、ＲＣＣ及びＴＣＣ）、発達の仕方も異なり、このことは、疾患によって長期成績が異なり、異なるやり方でステージ分類及び治療も行う必要があることを意味する。ＲＣＣは、原発性腎癌の約８０％を占め、ＴＣＣは、残りの大部分を占める。

腎臓癌の最も一般的な兆候及び症候は、腹部の腫瘤及び／または血液を含む尿（すなわち血尿）である。他の症候として、疲労感、食欲不振、体重減少、高体温及び激しい発汗、ならびに腹部の持続性疼痛を挙げることができる。しかしながら、これらの症候の多くは、他の症状によっても生じる可能性があり、腎臓癌、特にこの疾患の初期段階の人物では、兆候または症候がない場合もある。

腎臓癌の治療は、疾患の種類及びステージに依存する。手術は最も一般的な治療法である。なぜなら、腎臓癌は化学療法及び放射線治療に反応しない場合が多いからである。他の治療選択肢として、エベロリムス、トーリセル、ネクサバール、スーテント、及びアキシチニブなどの生物学的療法、インターフェロン及びインターロイキン−２を含む免疫療法の使用が挙げられる。本明細書中に記載される方法のいずれも、腎臓癌の治療または低減に利用可能である。

ＦＡＳＮ阻害剤。セルレニン及びＣ７５は、どちらも初期の小分子ＦＡＳＮ阻害剤であり、顕著な抗腫瘍活性が実証されている。セルレニンは、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｅｒｕｌｅｎｓから単離された。セルレニンは、ＦＡＳＮのケトアシルシンターゼドメインと反応するエポキシ基を有する。セルレニンは、乳癌細胞株においてＦＡＳＮを阻害して、プログラム細胞死を誘導すること、及び卵巣癌の異種移植片モデルにおいて病勢進行を遅らせることが発見された最初の化合物の一種である。セルレニンの細胞毒性効果は、ＦＡＳＮ活性レベルに依存する。Ｃ７５は、セルレニンの化学的安定性を克服するために、セルレニンを元に設計された。Ｃ７５は、β−ケトアシルシンターゼドメイン、エノイルリダクターゼドメイン、及びチオエステラーゼドメインと相互作用する、弱く可逆的なＦＡＳＮ阻害剤である。近年、Ｃ７５のより強力な類似体が、ＦＡＳＮ阻害剤として設計された。

複数の天然植物由来ポリフェノールでＦＡＳＮが阻害されることが示されており、そのようなポリフェノールとして、エピガロカテキン−３−ガラート（ＥＧＣＧ）、ならびにフラボノイド類のルテオリン、タキシフォリン、ケンフェロール、ケルセチン、及びアピゲニンが挙げられる。最も特性決定が行われているポリフェノールＦＡＳＮ阻害剤の一種は、緑茶の天然成分であるＥＧＣＧである。ＥＧＣＧは、ＦＡＳＮケトアシルリダクターゼドメインの高マイクロモル濃度時間依存性阻害剤である。ＥＧＣＧは、複数のシグナル伝達経路を標的とする乱交雑阻害剤であるものの、そのアポトーシス誘導効果は、ＦＡＳＮにおけるＥＧＣＧの活性と相関するように思われる。別の化合物であるルテオリンは、ポリフェノールの脂質生合成に最も大きな効果を有し、ＦＡＳＮを直接阻害する。ルテオリンは、ＰＩ３Ｋ阻害剤と構造的相同性を有し、強力な抗酸化剤活性を有する。近年、ＥＧＣＧのより強力な類似体が開発されてきている。

オルリスタットは、米国のＦＤＡ承認済み膵臓リパーゼ阻害剤であり、元々は、抗肥満薬として開発されたもので、ＦＡＳＮの強力な阻害剤である。オルリスタットは、ＦＡＳＮチオエステラーゼドメインの活性セリンと共有結合付加体を形成する非可逆的阻害剤である。

Ｃ９３（またはＦＡＳ９３）は、細菌性ＦａｂＢ阻害剤チオラクトマイシンを元に設計された合成ＦＡＳＮ阻害剤であり、Ｃ７５の効力不足及び副作用を克服する努力の一環として最近開発された。Ｃ２４７は、Ｃ９３と同じ化合物クラスに属し、同じく、乳癌の遺伝子導入モデルにおいて体重減少副作用を伴わずに有効性を実証した。経口利用可能な新規ＦＡＳＮ阻害剤、ＦＡＳ３１も、開発されてきている。

高い効力のＦＡＳＮ阻害剤は、高処理スクリーニングまたは医薬化学プログラムを通じて同定されてきた。例えば、Ｍｅｒｃｋの研究グループは、一連の３−アリール−４−ヒドロキシキノリン−２（１Ｈ）−オン誘導体を開発したが、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａの別の研究グループは、ＦＡＳＮ阻害剤として一連のビスアミド誘導体を開発した。ジベンゼンスルホンアミド尿素ＧＳＫ８３７１４９Ａは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅで高処理スクリーニングにより低ナノモルＦＡＳＮ阻害剤として同定された。天然産物抽出物の系統的スクリーニングの結果、広域グラム陽性抗菌活性を持つ細菌性ＦａｂＦ／Ｂの強力な阻害剤としてのプラテンシマイシンが単離された。

ＮＩＡ。実施形態によっては、がんの系列分析を含むナノ流体プロテオーム免疫アッセイ（ＮＩＡ）のための方法が提供される。ＮＩＡ検出は、限られた臨床検体中の腫瘍性タンパク質、特にリン酸化が異なるＥＲＫアイソフォームの発現及び活性化を、正確に測定する。ＮＩＡ検出法は、ナノ流体系での等電点タンパク質電気泳動法及び抗体検出を組み合わせたものである。実施形態によっては、ｐｐＥＲＫ１及びｐＥＲＫ１アイソフォームの存在の検出は、ＫＲＡＳ⁺ 癌の指標である。アイソフォームは、ＮＩＡによって検出する場合もあるし、試料が限られない場合には従来方法による場合もある。

試料は、単一の時点で採取される場合も、複数の時点で採取される場合もある。試料は、わずか１００，０００個の細胞、わずか５０００個の細胞、わずか１０００個の細胞、わずか５００個の細胞、わずか１００個の細胞、わずか５０個の細胞、またはそれより少ない場合がある。実施形態によっては、試料は微細針吸引試料（ＦＮＡ）である。ＦＮＡは、医師の指示で行われる。この手技は、小ゲージ針、通常は、２１〜２５ゲージ針を、腫瘤に挿入し、微視的評価用の細胞試料を取り出すことを必要とする。この手技は、最小限の陰圧をかけながら、ミシン様運動を用いることにより行われなければならない（０．５ｃｃ以下の吸引が要求される）。

バイオプシー試料。詳細には、微細針吸引試料（ＦＮＡ）は、患者から採取した後、３０分間超、または６０分間超、通常は約１２０分間以下、氷上に維持することが可能である。本明細書中に記載される方法のいずれであっても、腫瘍細胞試料などの臨床試料は、ＮＩＡ及び／またはＤＥＳＩ−ＭＳＩを行ってＥＲＫ１ホスホアイソフォーム及び／または脂質種のレベル及び／または比を測定する前に、３０分間超、または６０分間超、通常は約１２０分間以下、氷上に維持することが可能である。試料は、通常、細胞または赤血球細胞を溶解させずに維持される。試料、またはそのライセートは、約−８０度で凍結貯蔵した場合、長期間安定である。したがって、本発明の実施形態によっては、分析は、事前に凍結されていた試料で行われる。

細胞は、関心対象の作用剤または条件に曝露された後の細胞の場合があるが、これは、分析前に溶解される。溶解方法は、当該分野で既知であり、そのような方法として、超音波処理、非イオン性界面活性剤などが挙げられる。非イオン性界面活性剤として、界面活性剤のトリトン（商標）ファミリー、例えばトリトン（商標）Ｘ−１５、トリトン（商標）Ｘ−３５、トリトン（商標）Ｘ−４５、トリトン（商標）Ｘ−１００、トリトン（商標）Ｘ−１０２、トリトン（商標）Ｘ−１１４、トリトン（商標）Ｘ−１６５などが挙げられる。Ｂｒｉｊ（商標）界面活性剤も、疎水性鎖と結合したポリオキシエチレン鎖の長さが様々であるという点で、トリトン（商標）Ｘ界面活性剤と構造が類似している。Ｔｗｅｅｎ（商標）界面活性剤は、非変性、非イオン性界面活性剤であり、これらは、脂肪酸のポリオキシエチレンソルビタンエステルである。Ｔｗｅｅｎ（商標）８０は、Ｃ₁₈鎖を有するオレイン酸に由来するが、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０は、Ｃ₁₂鎖を有するラウリン酸に由来する。双性イオン性界面活性剤ＣＨＡＰＳは、コール酸のスルホベタイン誘導体である。ＢＩＣＩＮＥ（ジエチロールグリシン）は、ＣＨＡＰＳと共に配合可能な双性イオン性アミノ酸緩衝剤である。この双性イオン性界面活性剤及び緩衝剤は、タンパク質活性が重要な場合の膜タンパク質可溶化に有用である。界面活性剤は、細胞を溶解させるために十分な長さの時間、細胞と接触させ、そして余分な付着細胞を系から取り除く。

細胞分画の方法も、当該分野で既知である。サブ細胞分画は、主要な２つの工程、細胞組織を破壊（溶解）すること、及び、ホモジネートを分画して、異なるオルガネラの集団を分離することからなる。次いでそのようなホモジネートを、分画遠心法により、主に（１）核、ヘビーミトコンドリア、細胞骨格ネットワーク、及び形質膜、（２）ライトミトコンドリア、リソソーム、及びペルオキシソーム、（３）ゴルジ装置、エンドソーム及びミクロソーム、及び小胞体（ＥＲ）、ならびに（４）細胞質を含有する複数の画分へと分解することができる。オルガネラの各集団を、大きさ、密度、電荷、及び分離の根拠となる他の特性により特性決定する。

等電点電気泳動したタンパク質は、特異的結合様式で結合している。相対比測定の場合、タンパク質の全てのアイソフォームを認識する単一汎特異性（ｐａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、例えば、汎特異性ＥＲＫ抗体などを使用することができる。タンパク質、例えばＥＲＫ２、Ｅｒｋ１などの合計量を測定し、ＮＩＡを用いて、ホスホリル化されているパーセントを計算する。ＮＩＡはピークを作成するが、各ピークの面積は、ピークの始点及び終点で垂線をベースラインに下ろし、始点と終点との間の面積を合計することにより計算した。正規化値の測定については、同様なプロセスを用いるが、それだけでなく、アッセイは、関心対象のタンパク質に対する抗体、例えば汎特異性ＥＲＫ抗体、及び正規化のためのロード対照抗体、例えばＨＳＰ−７０抗体などを利用する。ＮＩＡは、異なるアイソフォームを識別するために利用される。

腫瘍組織であることが疑われる組織と、対になる正常または腫瘍上対照組織とで、例えば肺腺癌が疑われる試料対隣接する非腫瘍皮膚試料などで、比較することができる。比較は、参照腫瘍組織を用いて、時系列試料を用いて、例えば治療前後などで行うこともできる。比は、非腫瘍／腫瘍の場合も、腫瘍／非腫瘍の場合もある。実施形態によっては、比は、腫瘍または正常（試料）の１回測定よりも高い予測性または診断性バイオマーカーを提供する。

実施形態によっては、ＮＩＡは、リン酸化の変化をモニタリングするために使用される。リン酸化の大部分は、タンパク質の生物活性を調節する機構として生じ、そのため一過性である。動物細胞では、セリン、トレオニン、及びチロシンが、リン酸化を受けるアミノ酸である。キナーゼの最も大きな群は、セリンまたはトレオニンをホスホリル化するものの群であり、そのためセリン／トレオニンキナーゼと呼ばれる。三種の異なるアミノ酸のリン酸化比は、セリン／トレオニン／チロシンで約１０００／１００／１である。チロシンリン酸化のレベルは低いものの、このアミノ酸のリン酸化の重要性は、高い。例として、多数の成長因子受容体の活性は、チロシンリン酸化により制御されている。

ＤＥＳＩ−ＭＳＩ。１つの実施形態において、脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ−ＭＳＩ）は、肺腺癌細胞をはじめとするＫＲＡＳ⁺ 癌細胞であることが疑われるまたは既知であるがん細胞中のＫＲＡＳ駆動型代謝を分析するために行われる。ＤＥＳＩ−ＭＳＩは、組織代謝をリアルタイムでｉｎ ｓｉｔｕ分析するための確立された技法である。組織切片に、ジメチルホルムアミドとアセトニトリルの１：１混合物を含有する荷電微小液滴（これはエレクトロスプレーにより生成させる）で衝撃を与え、組織試料中の脂質及び代謝産物の溶解及び抽出を引き起こす。試料にスプレーで連続的に衝撃を与えることにより、溶解した分析物を含有する二次微小液滴の飛沫を生成させ、この飛沫を質量分析器により捕獲する。組織切片の二次元化学マップを、質量分析に基づいて作成する。

ほとんどの複合グリセロリン脂質が観察されるｍ／ｚ領域７００〜１０００では、ｍ／ｚ７４５．５０３４、ＰＧ（１８：１／１６：１）、ｍ／ｚ７４７．５１９０、ＰＧとして（１８：１／１６：０）、ｍ／ｚ７９３．５０２３、ＰＧ（１８：２／２０：４）、及びｍ／ｚ８６５．５０３４、ＰＧ（２２：６／２２：６）の相対及び合計存在量の増加が、ＫＲＡＳ⁺ 癌細胞で検出される。ｍ／ｚ２００〜４００での遊離脂肪酸の相対及び合計存在量の変化も観察され、観察されるものとして、ｍ／ｚ２５５．２３３９、パルミチン酸ＦＡ（１６：０）、ｍ／ｚ２８１．２４９０、オレイン酸ＦＡ（１８：１）、ｍ／ｚ３０３．２３３３、アラキドン酸ＦＡ（２０：４）、及びｍ／ｚ３２７．２３３４、ドコサヘキサエン酸、ＦＡ（２２：６）が挙げられる。これらの種の合計及び相対存在量は、正常組織では、がん組織よりも顕著に低い。

分析用組織を提供する哺乳類種として、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、ヒツジ科など、及び霊長類、特にヒトが挙げられる。動物モデル、特に小型哺乳類、例えばマウス、ウサギ目などは、実験的調査のために使用される場合がある。関心対象の動物モデルとして、腫瘍、免疫応答性などのモデル用のものが挙げられる。

本発明の１つの実施形態において、ＮＩＡは、がんがＫＲＡＳ⁺ 癌であるか否かを判定することにより患者の治療に適した作用剤を選択する指針として使用される。本発明の特別な利点は、経時的ながんの発現パターンを評価する試料サイズが少量であることを生かして、個別化診断を提供できることである。

ＮＩＡまたはＤＥＳＩ−ＭＳＩから得られる情報を用いて、治療をモニタリング、治療レジメンを修飾、及び治療薬の選択のさらなる最適化を行う。このアプローチを用いて、治療過程にわたり異なる時点で得られたデータに従って治療及び／または診断レジメンを個別化及びテーラーメード化することができる。

本発明の目的に関して「患者」にはヒト及び他の動物、特に哺乳類の両方が含まれ、他の動物にはペット及び実験動物、例えば、マウス、ラット、ウサギなどが含まれる。したがって、本方法は、ヒトの治療及び獣医学用途の両方に応用可能である。１つの実施形態において、患者は、哺乳類、好ましくは霊長類である。他の実施形態において、患者は、ヒトである。

「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書中に同義で使用され、治療のため評価されている及び／または治療されている哺乳類を示す。ある実施形態において、哺乳類は、ヒトである。「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、制限なく、がんを有する個体を包含する。対象は、ヒトの場合もあるが、他の哺乳類、特にヒト疾患の実験動物として有用な哺乳類、例えばマウス、ラットなどを含む場合もある。

「がん」、「新生物」、及び「腫瘍」という用語は、本明細書中に同義で使用され、細胞増殖の制御の明らかな損失を特徴とする異常増殖表現型をそれらが表すように、自律的で制御不能な増殖を示す細胞を示す。本出願における検出、分析、または治療の関心対象の細胞として、前がん性（例えば、良性）、悪性、前転移性、転移性、及び非転移性の細胞が挙げられる。事実上全ての組織のがんが知られている。「がん負荷」という語句は、対象中のがん細胞の数量またはがん体積を示す。がん負荷の低減は、従って、対象中のがん細胞の数またはがん体積を低減させることを示す。「がん細胞」という用語は、本明細書中で使用される場合、がん細胞である、またはがん細胞に由来する、例えば、がん細胞のクローンである任意の細胞を示す。多くの種類のがんが当業者に知られており、がんとして、細胞腫、肉腫、神経膠芽細胞腫、黒色腫、リンパ腫、骨髄腫などの固形腫瘍、及び白血病などの循環癌が挙げられる。がんの例として、卵巣癌、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎癌、細胞腫、黒色腫、頭頚部癌、及び脳癌が挙げられるが、これらに限定されない。

がんの「病態」には、患者の健康を構成する全ての現象が含まれる。病態として、制限なく、異常または制御不能な細胞増殖、転移、隣接細胞の正常機能への干渉、サイトカインまたは他の分泌産物の異常なレベルでの放出、炎症または免疫反応の抑制または悪化、新生物、前悪性、悪性腫瘍、周囲または遠隔の組織または臓器、例えばリンパ節への浸潤などが挙げられる。

本明細書中で使用される場合、「がん再発」及び「腫瘍再発」という用語、ならびにそれらの文法的活用形は、がんの診断後、新生物またはがん性細胞がさらに増殖することを示す。特に、再発は、がん性組織でさらなるがん性細胞増殖が起こる場合に、起こる可能性がある。同様に、「腫瘍拡散」は、腫瘍細胞が、局所または遠隔組織及び臓器へと広がるときに生じる。したがって、腫瘍拡散は、腫瘍転移を包含する。「腫瘍浸潤」は、腫瘍成長が局所的に広がって、正常臓器機能の圧迫、破壊、または阻止により関与組織の機能が損なわれる場合に生じる。

本明細書中で使用される場合、「転移」という用語は、元来のがん性腫瘍の臓器と直接関連していない臓器または身体部分における、がん性腫瘍の増殖を示す。転移は、当然ながら、微小転移を含むことになり、微小転移とは、元来のがん性腫瘍の臓器と直接関連していない臓器または身体部分における、検出不可能な量のがん性細胞の存在である。転移は、がん細胞の元来の腫瘍部位からの脱離、及び身体の他の部位へのがん細胞の遊走及び／または浸潤など、複数工程のプロセスとして定義することも可能である。

患者に関して「試料」という用語は、血液及び生体起源の他の液体試料、充実組織試料、例えばバイオプシー検体または組織培養物、またはそれらに由来する細胞及びそれらの子孫を包含する。この定義は、調達後に何らかの方法で操作された試料、例えば、試薬処理された、洗浄された、またがん細胞など特定の細胞集団が増幅された試料も包含する。この定義は、特定種類の分子、例えば、核酸、ポリペプチドなどが濃縮された試料も包含する。「生物学的試料」という用語は、臨床試料を包含し、外科切除により得られた組織、バイオプシーにより得られた組織、培養物中の細胞、細胞上清、細胞ライセート、組織試料、臓器、骨髄、血液、血漿、血清なども包含する。「生物学的試料」は、患者のがん細胞から得られた試料、例えば、患者のがん細胞から得られたポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドを含む試料（例えば、ポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドを含む細胞ライセートまたは他の細胞抽出物）、及び患者由来のがん細胞を含む試料を包含する。患者由来のがん細胞を含む生物学的試料には、非がん性細胞も含まれる可能性がある。

「診断」という用語は、本明細書中、分子または病理学的状態、疾患もしくは症状の同定、例えば、乳癌、前立腺癌、もしくは他の種類のがんの分子サブタイプの同定などを示すために使用される。

「予後」という用語は、本明細書中、がん起因性の死亡または増悪の起こりやすさの予測を示すために使用され、増悪として、腫瘍性疾患、例えば卵巣癌などの再発、転移性拡散、及び薬剤耐性が挙げられる。「予測」という用語は、本明細書中、観察、経験、または科学的推論に基づく、予想または推定の行為を示すために使用される。１つの例において、医師は、原発腫瘍の外科除去及び／または化学療法後、ある一定期間がんの再発がない場合の、患者が生存する見込みを予測する場合がある。

本明細書中で使用される場合、「治療」、「治療する」などの用語は、効果を得る目的で、作用剤を投与するまたは手技を実行することを示す。効果は、疾患またはその症候の完全または部分的阻止という点で予防的である場合もあるし、及び／または疾患及び／または疾患の症候の部分的または完全な治癒をもたらすという点で治療的である場合もある。「治療」は、本明細書中で使用される場合、哺乳類、特にヒトの腫瘍の治療を含む場合があり、治療として、（ａ）ある疾患になりやすい可能性があるが、その疾患であると診断されたことがまだない対象で、その疾患または疾患の症候が生じることを防ぐこと（例えば、原発性疾患と関連するまたはそれにより引き起こされる可能性がある疾患を含む）、（ｂ）疾患を阻害する、すなわち、その発症を停止させること、及び（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすことが挙げられる。

「治療する」は、がんの治療または寛解または予防における成功の任意の兆候を示し、そのような兆候として、任意の客観的または主観的パラメーター、例えば、低減、緩解、症候の減少または疾患症状を患者にとってより忍容可能にすること、変性または減退の速度を遅くすること、あるいは変性の最終点での衰弱性をましにすることが挙げられる。症候の治療または寛解は、客観的または主観的パラメーターに基づくことが可能であり、パラメーターには、医師による検査結果が含まれる。したがって、「治療する」という用語は、がんまたは他の疾患と関連した症候または症状の発生を、防ぐもしくは遅らせる、軽減する、または停止もしくは阻害するために、本発明の化合物または作用剤を投与することを含む。「治療効果」という用語は、対象における、疾患、疾患の症候、または疾患の副作用の低減、消失、あるいは予防を示す。

「併用して」、「併用療法」、及び「併用製品」は、ある特定の実施形態において、本明細書中で使用されるとおりの患者への第一治療薬及び化合物の同時投与を示す。併用して投与される場合、各成分は、同一時点で、または任意の順序で異なる時点で順次投与することができる。したがって、各成分は、別々に投与可能であるが、ただし所望の治療効果をもたらすように十分に近接している。

がん治療薬、がん免疫療法剤、腫瘍指向性抗体などを、ＦＡＳＮ阻害剤と併用して「随伴投与」することは、薬物、抗体、及び本発明の組成物の両方が治療効果を有することになるような時間でＦＡＳＮ阻害剤を投与することを意味する。そのような随伴投与は、本発明の化合物の投与に関して、薬物または抗体の投与と同時進行（すなわち同時点）、投与前、または引き続いての投与を含む場合がある。当業者なら、特定の薬物と本発明の組成物との投与の適切なタイミング、順序、及び投与量を決定することは難しくないと思われる。

本明細書中で使用される場合、治療の終点は、当該分野で既知であるとおり及び食品医薬品局により使用されるとおりの意味が与えられることになる。

全生存期間は、無作為割り付け開始から原因を問わず死亡するまでの時間と定義され、解析対象集団で測定される。生存は、最も信頼性が高いがん終点とみなされており、治験が行われて生存が適切に評価できる場合、生存は、通常、好適な終点である。この終点は、測定が正確かつ簡単であり、死亡日で報告される。偏りは、終点測定において因子ではない。生存の改善は、臨床的有用性を評価するためにリスクベネフィット分析として分析されなければならない。全生存期間は、無作為化比較試験で評価することが可能である。全生存期間における統計上有意な改善の実証は、毒性プロファイルが許容可能であるならば臨床上有意義であるとみなすことができ、多くの場合新薬の承認の裏付けとなってきた。本発明の方法の有益性は、患者の全生存期間の延長を含む可能性がある。

腫瘍評価に基づく終点として、ＤＦＳ、ＯＲＲ、ＴＴＰ、ＰＦＳ、及び治療成功期間（ＴＴＦ）が挙げられる。これらの時間依存終点データの収集及び分析は、間接的評価、計算、及び概算（例えば、腫瘍測定）に基づいている。無病生存率（ＤＦＳ）は、無作為割り付け開始から腫瘍再発までまたは原因を問わず死亡するまでの時間と定義される。この終点がもっとも頻繁に使用されるのは、根治手術または放射線治療後の補助療法設定においてである。ＤＦＳは、患者の大きなパーセンテージで、化学療法を用いて完全奏功が達成された場合にも、重要な終点となり得る。

客観的奏効率。ＯＲＲは、最小限の期間で、所定の量の腫瘍サイズ減少があった患者の割合と定義される。奏功期間は、通常、最初の反応から腫瘍増悪が報告されるまでの時間として測定される。概して、ＦＤＡは、ＯＲＲを部分奏功及び完全奏功の合計と定義してきた。この様式で定義した場合、ＯＲＲは、薬物抗腫瘍活性の直接の測定値であり、単群臨床試験で評価可能である。

無増悪期間及び無増悪生存期間。ＴＴＰ及びＰＦＳは、薬の承認のための主要評価項目としての役割を果たしてきた。ＴＴＰは、無作為割り付け開始から客観的腫瘍増悪までの時間と定義される。ＴＴＰは、死亡を含まない。ＰＦＳは、無作為割り付け開始から客観的腫瘍増悪または死亡までの時間と定義される。腫瘍増悪の正確な定義は重要であり、プロトコルにおいて入念に詳細が決められていなければならない。

本明細書中で使用される場合、「ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ（相関する）」または「ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ（と相関する）」などの用語は、２つの事象の事例間の統計的関連性を示し、事象は、数字、データセットなどを含む。例えば、事象が数字に関する場合、正の相関（本明細書中「正相関」とも称する）は、一方が増加すれば、他方も増加することを意味する。負の相関（「逆相関」とも称する）は、一方が増加すれば、他方が減少することを意味する。

「投薬単位」は、治療を予定する特定個体の単位投薬に適した物理的に離散した単位を示す。各単位は、所望の治療効果（複数可）を生成するように計算された所定量の活性化合物（複数可）を、必要とされる薬学的キャリアと合わせて含有することができる。単位投薬剤形についての仕様は、（ａ）活性化合物（複数可）の独自の特性及び達成しようとする特定の治療効果（複数可）、ならびに（ｂ）そのような活性化合物（複数可）の配合分野に内在する制限により決定される可能性がある。

「薬学上許容される賦形剤」は、医薬組成物の調製において有用な、概して安全、無毒、かつ望ましい賦形剤を意味し、そのようなものとして、ヒトの医薬用途だけでなく獣医学的用途にも許容可能な賦形剤が挙げられる。そのような賦形剤は。固体、液体、半固体、またはエーロゾル組成物の場合には気体であることが可能である。

「薬学上許容される塩及びエステル」は、薬学上許容され、かつ所望の薬学的特性を有する塩及びエステルを意味する。そのような塩として、化合物に存在する酸性プロトンが無機塩基または有機塩基と反応することができる場合に形成される可能性がある塩が挙げられる。適切な無機塩として、アルカリ金属、例えばナトリウム及びカリウム、マグネシウム、カルシウム、ならびにアルミニウムで形成されるものが挙げられる。適切な有機塩として、有機塩基、例えば、アミン塩基、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎメチルグルカミンなどで形成されるものが挙げられる。そのような塩として、無機酸（例えば、塩酸及び臭化水素酸）及び有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、ならびにアルカン−及びアレン−スルホン酸、例えば、メタンスルホン酸及びベンゼンスルホン酸）で形成される酸付加塩も挙げられる。薬学上許容されるエステルとして、化合物に存在するカルボキシ基、スルホニルオキシ基、及びホスホノオキシ基から形成されるエステル、例えば、Ｃ_1-6 アルキルエステルが挙げられる。２つの酸性基が存在する場合、薬学上許容される塩またはエステルは、モノ−酸−モノ−塩もしくはエステルまたは、ジ−塩もしくはエステルであることが可能であり、同様に、２つより多く酸性基が存在する場合、それら基の一部または全部が塩形成またはエステル化していることが可能である。本発明で指名される化合物は、塩形成していないまたはエステル化していない形で存在することも、塩形成及び／またはエステル化した形で存在することも可能であり、そうした化合物の呼称は、元来の（塩形成しておらずエステル化していない）化合物及びその薬学上許容される塩及びエステルの両方を含むことを意図する。同じく、本発明で指名されるある特定の化合物は、１つより多い立体異性体形で存在する場合があり、そうした化合物の呼称は、全ての立体異性体の単一種及びそのような立体異性体の全ての混合物（ラセミ体またはその他を問わず）を含むことを意図する。

「薬学上許容される」、「生理学的に忍容性である」という用語、及びそれらの文法的活用形は、それらの用語が組成物、キャリア、希釈剤、及び試薬を示す場合、同義で使用され、組成物の投与が禁止になると思われる度合いで望ましくない生理学的効果を生成することなく、その材料がヒトに投与可能であることを表す。

「治療上有効量」は、疾患治療のために対象に投与された場合、その疾患の治療をもたらすために十分な量を意味する。

方法
原発性がんまたは転移性がんの増殖の診断方法及び治療または低減方法が提供され、がんとして具体的には、ＫＲＡＳ駆動型上皮癌、例えば肺腺癌、結腸直腸癌など、特に肺腺癌が挙げられる。

ＫＲＡＳ⁺ 癌細胞は、変化したＥＲＫ１ホスホアイソフォームの検出及び／または独自の脂質シグネチャーの誘導の検出を通じて、正常なカウンターパート組織だけでなくＫＲＡＳ陰性癌細胞からも識別可能である。がん細胞のＫＲＡＳ⁺ 表現型を判定することにより、個体に合った治療、例えば、脂肪酸シンターゼ阻害剤または、脂質生合成酵素の他の阻害剤を用いた治療を選択することができる。

１つの実施形態において、ナノ流体プロテオーム免疫アッセイ（ＮＩＡ）を用いて、ＫＲＡＳ⁺ 肺腺癌細胞を含む、ＫＲＡＳ⁺ 腫瘍であることが疑われる腫瘍由来のライセート少量中のＥＲＫ１ホスホアイソフォームを定量する。ＮＩＡにより、臨床検体において、ＥＲＫ１対ＥＲＫ２タンパク質活性化から、ＫＲＡＳ陽性腫瘍とＫＲＡＳ陰性腫瘍とを識別することが可能になった。具体的には、ＫＲＡＳ⁺ 腫瘍は、合計ＥＲＫタンパク質レベルと比較した場合に、及び正常組織試料またはＫＲＡＳ陰性癌に比べて、ｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベルが顕著に上昇していることが分かる。

１つの実施形態において、肺腺癌細胞を含むＫＲＡＳ⁺ 癌細胞であることが疑われるまたは既知であるがん細胞におけるＫＲＡＳ駆動型代謝を分析するために、脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ−ＭＳＩ）が行われる。複数の脂質種の合計及び相対存在量が、正常組織では、がん組織よりも顕著に少ない。具体的には、ほとんどの複合グリセロリン脂質が観察されるｍ／ｚ領域７００〜１０００において、ｍ／ｚ７４５．５０３４、ＰＧ（１８：１／１６：１）、ｍ／ｚ７４７．５１９０、ＰＧとして（１８：１／１６：０）、ｍ／ｚ７９３．５０２３、ＰＧ（１８：２／２０：４）、及びｍ／ｚ８６５．５０３４、ＰＧ（２２：６／２２：６）の相対及び合計存在量の増加が、ＫＲＡＳ⁺ 癌細胞で検出される。ｍ／ｚ２００〜４００における遊離脂肪酸の相対及び合計存在量の変化も観察され、そのような変化には、ｍ／ｚ２５５．２３３９、パルミチン酸ＦＡ（１６：０）、ｍ／ｚ２８１．２４９０、オレイン酸ＦＡ（１８：１）、ｍ／ｚ３０３．２３３３、アラキドン酸ＦＡ（２０：４）、及びｍ／ｚ３２７．２３３４、ドコサヘキサエン酸、ＦＡ（２２：６）が含まれる。これらの種の合計及び相対存在量は、正常組織では、がん組織よりも顕著に少ない。

がん細胞から抽出されたＮＩＡまたはＤＥＳＩ質量スペクトルにおける差異は、正常細胞、ＫＲＡＳ^- 癌細胞、既知ＫＲＡＳ⁺ 癌細胞の参照などと比較することができる。がん治療の治療レジメンで治療されている個体をはじめとする個体から経時的に複数の試料を得ることができる。例えば、臨床試験の文脈において、患者コホート群にわたり複数の試料を得て分析することもできる。

他の実施形態において、ＫＲＡＳ⁺ 肺腺癌の治療法が提供される。癌は、治療前に、ＫＲＡＳ⁺ 表現型を判定するため、本明細書中で記載される方法により分析することができる。癌は、ＫＲＡＳ駆動型腫瘍形成を示すマーカーに関して治療有効性を判定するため、本明細書中で記載される方法により治療過程にわたり分析することができる。治療法は、脂肪酸シンターゼ活性、または脂肪酸シンターゼ発現の阻害剤を必要としている患者に、その阻害剤を有効量で投与することを提供する。本明細書で示されるとおり、ＦＡＳＮの阻害は、ヒトＫＲＡＳ⁺ 肺癌細胞の増殖を抑制する。実施形態によっては、ＦＡＳＮ阻害剤は、１つまたは複数の、手術、化学療法、放射線療法、がん免疫療法、標的指向抗腫瘍抗体療法などとの併用療法で提供される。がん細胞との接触は、例えば治療目的でｉｎ ｖｉｖｏ、及び例えばスクリーニングアッセイのためｉｎ ｖｉｔｒｏなどで行うことができる。

がん治療のための本発明の作用剤（複数可）の有効量は、多数の異なる要因に依存して変化し、そのような要因として、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるのか動物であるのか、投与される他の医薬、及び治療が予防的なのか治療的なのかが挙げられる。通常、患者はヒトであるが、非ヒト哺乳類も治療される場合があり、例えば、伴侶動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマなど、実験用哺乳類、例えば、ウサギ、マウス、ラットなどの場合がある。治療投薬量は、安全性及び有効性を最適化するように用量を決定することができる。

実施形態によっては、各作用剤の治療投薬量は、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の場合がある。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重あるいは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲が可能である。治療レジメンの例は、２週間ごとに１回、または１ヶ月に１回、または３〜６ヶ月ごとに１回の投与を必然的に伴う。本発明の治療薬実体は、通常、複数回投与される。各投薬間の間隔は、週単位、月単位、または年単位が可能である。間隔は、患者の治療薬実体の血中レベルを測定することにより示される結果により、不定期であることも可能である。あるいは、本発明の治療薬実体は、徐放性配合物として投与することが可能であり、その場合、必要とされる投与頻度が少なくなる。投薬量及び頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期に依存して変化する。

予防的用途では、長期間にわたり、比較的低用量が比較的低頻度の間隔で投与される。患者によっては、残りの人生の間、治療を受け続ける。他の治療用途では、疾患の増悪が低減するまたは終了するまで、及び好ましくは患者が疾患症候の部分または完全寛解を示すまで、比較的高用量が比較的短い間隔で必要とされる場合がある。その後、患者に、予防的レジメンを投与することが可能である。

さらに他の実施形態において、本発明の方法は、細胞腫、神経膠腫などをはじめとするがんの腫瘍成長、腫瘍転移、または腫瘍浸潤を治療すること、低減すること、または予防することを含む。予防的用途の場合、医薬組成物または医薬を、疾患になりやすい、または何かしら疾患のリスクがある患者に、リスクを排除もしくは低減する、重篤度を軽減する、または疾患の発症を遅らせるために十分な量で投与し、疾患には、疾患の生化学的、組織学的、及び／または行動症候、疾患の発生中に現れるその病理学的複合及び中間表現型が含まれる。

がん治療用組成物は、非経口、外用、静脈内、腫瘍内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、または筋肉内手段により投与することができる。典型的な投与経路は、静脈内または腫瘍内であるが、他の経路も等しく有効となり得る。

典型的には、組成物は、液状の液剤または懸濁剤いずれかで注射剤として調製されるが、注射前に液体ビヒクルに加えて液剤または懸濁剤とするために適した固形も調製可能である。製剤は、上記のとおり、アジュバント効果を向上させるため、リポソームまたは微粒子、例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド、または共重合体などに乳化させるまたは封入することもできる。Ｌａｎｇｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９： １５２７， １９９０、及びＨａｎｅｓ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８： ９７−１１９， １９９７を参照のこと。本発明の作用剤は、デポ剤注射またはインプラント製剤の形状で投与することが可能であり、これらの製剤は、活性成分の持続したまたは拍動性放出を可能にするような様式で配合することができる。医薬組成物は、一般に、滅菌、実質的に等張性、かつ米国食品医薬品局の製造管理及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）全てに完全準拠しているように配合される。

本明細書中で記載される併用される作用剤の毒性は、細胞培養物または実験動物での標準医薬業務手順により、例えば、ＬＤ₅₀（集団の５０％致死量）またはＬＤ₁₀₀ （集団の１００％致死量）を測定することにより、特定することができる。毒性と治療効果の間の用量比が、治療指数である。こうした細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータを使用して、ヒトで使用するために毒性ではない投薬量範囲で配合することができる。本明細書中で記載されるタンパク質の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどまたはまったくない有効用量を含む循環濃度範囲内にある。投薬量は、採用した剤形及び利用する投与経路に応じて、この範囲内で変更可能である。正確な配合、投与経路、及び投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択可能である。

医薬組成物は、投与方法に応じて、様々な単位剤形で投与することができる。例えば、経口投与に適した単位剤形として、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、及びロゼンジ剤が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物は、経口投与される場合、消化から保護されなければならないことが認められる。これは、典型的には、分子を組成物と複合させて、それらを酸性または酵素加水分解に耐えられるようにすることにより、あるいは分子を適切な耐性キャリア、例えばリポソームまたは保護バリアで包むことにより、達成される。作用剤を消化から保護する手段は、当該分野で周知である。

投与用組成物は、一般的に、薬学上許容されるキャリア、好ましくは水性キャリアに溶解した抗体または他の切除剤を含む。様々な水性キャリア、例えば、緩衝生理食塩水などが使用可能である。こうした溶液は、滅菌されており、一般に、望ましくない物質を含まない。こうした組成物は、従来の周知の滅菌技法により滅菌することができる。組成物は、生理的条件を近似するために必要に応じて薬学上許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節及び緩衝剤、毒性調節剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有することができる。こうした配合物中の活性作用剤の濃度は、広く変化する可能性があり、選択された特定の投与様式及び患者の要求に従って、流体体積、粘度、重量などに主に基づき選択されることになる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１５ｔｈ ｅｄ．，１９８０）及びＧｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｌｍａｎ， Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ （Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ．， １９９６））。

組成物は、治療的処置のために投与することができる。組成物は、上記のとおり、標的細胞を実質的に除去するために十分な量で、患者に投与される。これを達成するために適切な量は、「治療上有効量」と定義され、この量は、全生存率の改善をもたらす可能性がある。患者によって必要とされる及び忍容される投薬量及び頻度に応じて、組成物の１回または複数回の投与を行うことができる。治療に必要とされる特定の用量は、哺乳類の医学的状態及び病歴、ならびに年齢、体重、性別、投与経路、有効性などの他の要因に依存することになる。

実験
以下の実施例は、当業者に、本発明をいかに実行及び利用するかについての完全な開示及び説明を提供するために提示されるものであり、本発明として見なされる範囲を限定することを意図しない。使用される数字（例えば量、温度、濃度など）に関しては正確性を確実にする努力がなされたものの、ある程度の実験誤差及び偏差は許されるべきである。特に記載がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧は、大気圧または大気圧付近である。

実施例１
ＫＲＡＳは、脂肪酸シンターゼを活性化し、肺腺癌と関連した特異的ＥＲＫ及び脂質シグネチャーをもたらす。
ＫＲＡＳ遺伝子変異は、肺腺癌を引き起こす。ＫＲＡＳ活性化は、変化したグルコース及びグルタミン代謝と関連するとされてきた。本明細書にて、本発明者らは、ＫＲＡＳが、脂質生合成を活性化し、これにより、特徴的なプロテオーム及び脂質シグネチャーがもたらされることを示す。遺伝子発現分析により、ＫＲＡＳは、脂質生合成遺伝子シグネチャー及び脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）の特異的誘導と関連することが示される。脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ−ＭＳＩ）を通じて、脂質生合成における特異的変化及び特異的脂質が同定される。ナノ免疫アッセイ（ＮＩＡ）により、ＫＲＡＳは、タンパク質ＥＲＫ２を活性化することが見出され、一方でＥＲＫ１活性化は、非ＫＲＡＳ関連ヒト肺腫瘍で見出される。小分子抗生物質であるセルレニンによるＦＡＳＮ阻害は、ＫＲＡＳ関連肺癌細胞の細胞増殖を遮断した。したがって、ＫＲＡＳは、ＥＲＫ２の活性化、ＦＡＳＮの誘導、及び脂質生合成の促進と関連する。ＦＡＳＮは、ＫＲＡＳ関連肺の新規標的となる可能性がある。

本発明者らは、遺伝子導入マウス及びヒト肺検体を用いて、ＫＲＡＳ遺伝子変異により誘導された肺腫瘍を調べた。遺伝子発現分析は、ＫＲＡＳが脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）を誘導し、脂質生合成を促進することを示す。脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ−ＭＳＩ）を通じて、本発明者らは、ＫＲＡＳ肺腺癌における特異的脂質修飾を見出した。ナノ免疫アッセイ（ＮＩＡ）は、特異的ＫＲＡＳ関連ホスホタンパク質シグネチャーを同定した。本発明者らは、ＫＲＡＳがＥＲＫ２タンパク質を活性化し、一方で非ＫＲＡＳ肺腺癌はＥＲＫ１の上昇を示すことを示した。本発明者らが、小分子、セルレニンによりＦＡＳＮを阻害したところ、これによりＫＲＡＳ駆動型肺癌細胞の細胞増殖が遮断された。したがって、ＦＡＳＮ阻害剤は、ＫＲＡＳ関連肺腺癌の治療のための有望な治療薬となる可能性がある。

ＫＲＡＳは、肺腺癌をはじめとするヒト癌で一般的に変異するＲＡＳ遺伝子サブファミリーの一員である。ＲＡＳ遺伝子は、Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達経路を含む複数のシグナル伝達カスケードの構成要素である膜局在Ｇタンパク質をコードする。がんにおける大部分のＲＡＳ変異は、ＧＴＰアーゼの恒常的活性化を招き、細胞増殖がもたらされる。

ＫＲＡＳ活性化は、グルコース及びグルタミン代謝を改変することが示されてきた。ＫＲＡＳは、解糖系流量を増加させ、酸化的ＴＣＡ回路流量を低下させ、タンパク質同化経路用のグルタミン利用を促進する。ヒト膵管腺癌（ＰＤＡＣ）細胞では、ＫＲＡＳは、グルタミン由来グルタミン酸をα−ケトグルタル酸に変換してＴＣＡサイクルを活発にするグルタミン酸デヒドロゲナーゼを阻害する。ＫＲＡＳは、ＧＯＴ１の発現も増加させるが、ＧＯＴ１は、ＮＡＤＰＨを生成する経路において、グルタミン由来アスパラギン酸をオキサロ酢酸に変換する。ＴＣＡサイクルを活発にするためのグルタミン使用から、非標準ＮＡＤＰＨ生成経路におけるグルタミン使用への移行は、ＰＤＡＣ細胞の増殖に必須である。この結果、酸化還元バランスを維持したままＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ⁺ 比が上昇する。ＫＲＡＳにより引き起こされる代謝変化は、がんの増殖及び生存において本質的な役割を果たすと思われる。本研究の以前に、ＫＲＡＳによる肺腺癌の脂質生合成の調節が確立されたことはなかった。

空間分解型無標識イメージング技法である質量分析イメージング（ＭＳＩ）は、関心対象の組織内の多数の既知及び未知分子イオン種の分布を、分子を予め同定することなく視覚化する魅力的な方法を提供する。ＭＳＩは、がん性組織を、それらの正常カウンターパートと比較して描写することを可能にし、様々な腫瘍を分類する道具として広く研究されてきた。複数のＭＳＩ法が、肺新生物を描写及び分類するために採用されてきている。組織マイクロアレイでのマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）イメージングが、最近、非小細胞肺癌を腺癌及び扁平上皮癌というサブタイプへと組織病理学的に分けるために提案された。気流支援脱離エレクトロスプレーイオン化（ａｉｒ ｆｌｏｗ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚｔｉｏｎ， ＡＦＡＤＥＳＩ）ＭＳＩは、最近、術後ヒト肺癌検体を分子的に視覚化するために利用された。

本研究において、本発明者らは、肺におけるＫＲＡＳ駆動型代謝を分析するためにＤＥＳＩ−ＭＳＩを使用した。ＤＥＳＩ−ＭＳＩは、組織代謝をリアルタイムでｉｎ ｓｉｔｕ分析する、確立された強力な技法である。組織切片に、ジメチルホルムアミドとアセトニトリルとの１：１混合物を含有する荷電微小液滴（これはエレクトロスプレーにより生成させる）で衝撃を与え、組織試料中の脂質及び代謝産物の溶解及び抽出を引き起こす。試料にスプレーで連続的に衝撃を与えることにより、溶解した分析物を含有する二次微小液滴の飛沫を生成させ、この飛沫を質量分析器により捕獲する。そうすると、組織切片の二次元化学マップを、質量分析に基づいて作成することができる。ＤＥＳＩ−ＭＳＩは、リンパ腫、腎細胞癌、甲状腺癌、膵癌、乳癌、脳癌、及び他のがん性組織の脂質プロファイルを調べるために幅広く使用されてきている。

今回、本発明者らは、遺伝子発現分析、ナノスケールプロテオーム、及び質量分析イメージングアッセイを組み合わせて、肺癌におけるＫＲＡＳ変異と脂質シグネチャーとの間の関係性を研究した。ヒト患者試料でのＮＩＡ分析を用いて、ＫＲＡＳ対非ＫＲＡＳ肺腺癌で試験し、ＫＲＡＳがホスホ−ＥＲＫ２誘導と関連することを示した。マウスＫＲＡＳ肺モデルの遺伝子発現分析及びＤＥＳＩ−ＭＳＩは、ＫＲＡＳが、ステロール調節結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ１）、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）、及びステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ）の脂質生合成に関与する複数の遺伝子を誘導することを示す。脂肪酸合成の主要な調節部位はＦＡＳＮにあるため、本発明者らは、ＦＡＳＮを、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞においてＦＡＳＮの阻害に有効性を示した他のものと併せて阻害することにした。顕著なことに、本発明者らの結果は、ＦＡＳＮを治療薬で遮断すると、ＫＲＡＳ関連肺癌細胞の増殖が阻止されることを示した。すなわち、ＦＡＳＮの遮断は、ＫＲＡＳ誘導型肺癌を治療する新規治療経路を提供する。

ＫＲＡＳは、マウス及びヒト肺腺癌で脂質生合成を誘導する。マウス肺上皮で変異型ＫＲＡＳ遺伝子を条件的に発現させて肺腺癌をもたらすためにＴｅｔ系を使用した。本発明者らは、１３個の代謝経路を試験した。これらは、１６９のマイクロアレイプローブにより同定された（図７）。結果は、色分け地図にプロットする（図１Ａ）。これらの腫瘍の遺伝子発現分析は、多くの代謝遺伝子の発現の増加を示した。本発明者らは、脂肪酸合成経路の遺伝子の大部分が、上位１５位までの最も異なった形で発現した遺伝子にあったことを見出した（図１Ｂ）。誘導されることが示された脂質生合成遺伝子の中でも、本発明者らは、特に重要な遺伝子を３つ挙げておく。ＦＡＳＮは、脂肪酸合成の制御部位であり、ＳＣＤは、経路の最後の酵素である（図１Ｃ）。ＳＲＥＢＰは、脂肪酸、メバロン酸、及びコレステロール合成に関与する遺伝子を誘導する転写因子である。ＦＡＳＮ、ＳＣＤ、及びＳＲＥＢＰの誘導は、ｑＰＣＲにより確認された（図１Ｃ）。このように、ＫＲＡＳは、マウス肺腺癌において脂質生合成経路を誘導する。

次に、脂質生合成関連遺伝子を、ＫＲＡＳ陽性または陰性であることが明らかなヒト肺腺癌で試験した。ＫＲＡＳ陽性及び陰性腫瘍のどちらも、脂質生合成遺伝子を過剰発現する（図２Ａ、Ｂ）。これは、高度増殖中の細胞に脂肪酸合成が必要であることを反映している可能性がある。ＳＲＥＢＰは、ＫＲＡＳ陰性細胞のほうがより多く増加しているが、ＳＣＤは、ＫＲＡＳ陽性細胞のほうがより多く増加している。ＦＡＳＮは、両方で非常に増加している。このように、脂質生合成遺伝子の誘導は、ヒトＫＲＡＳ関連肺腺癌で観察された。

ＫＲＡＳ陽性腫瘍とＫＲＡＳ陰性腫瘍とを比較することで、独特のＥＲＫタンパク質シグネチャーが示された。ＫＲＡＳは、ＥＲＫシグナル伝達を活性化する。ＫＲＡＳ陽性とＫＲＡＳ陰性腫瘍との比較は、ＥＲＫ２とＥＲＫ１の活性化の比較を示すことが見出された（図３Ａ、Ｂ）。一致する正常肺組織と比較して、ＫＲＡＳ陽性腫瘍は、ｐＥＲＫ２ａ、ｐＥＲＫ２ｂ、及びＥＲＫ２の増加を示し、ＫＲＡＳ陰性腫瘍はｐｐＥＲＫ１の増加及びＥＲＫ１レベルの低下を示した（図３Ｃ、Ｄ）。ＮＩＡを用いることで、ＫＲＡＳによる様々なＥＲＫホスホアイソフォームの異なる活性化を識別することに成功したが、これは、ＫＲＡＳによるＥＲＫ誘導の先の観察を裏付ける。

ＫＲＡＳ陽性腫瘍は、独自の脂質プロファイルを示す。ＫＲＡＳ陽性のマウス及びヒト肺腺癌でＤＥＳＩ−ＭＳＩを行った（図８を参照）。条件的にＫＲＡＳを発現する系を抱える遺伝子導入マウスモデルから組織を収穫した（図９を参照）。ＫＲＡＳ誘導型肺腺癌の組織試料及び対照の正常肺組織の組織試料由来の代表的な質量スペクトル及び選択した二次元イオン画像を示す（図４、図１０）。ＫＲＡＳ誘導型肺腺癌試料の２Ｄイオン画像に表示されるとおり（図４Ａ）、癌組織切片の特定領域で高い相対強度の脂質イオンが観察された。Ｈ＆Ｅ染色した隣接組織切片の病理組織学的評価から、高い脂質強度の領域は、腫瘍細胞の蓄積領域と強く相関することが確認された（図１０）。

これらの癌領域から抽出されたＤＥＳＩ質量スペクトルにおける差異は、正常肺組織からのスペクトルと比較した場合に見られた（図４Ｂ）。例えば、大部分の複合グリセロリン脂質が観察されるｍ／ｚ領域７００〜１０００において、ｍ／ｚ７４５．５０３４、ＰＧ（１８：１／１６：１）、ｍ／ｚ７４７．５１９０、ＰＧとして（１８：１／１６：０）、ｍ／ｚ７９３．５０２３、ＰＧ（１８：２／２０：４）、及びｍ／ｚ８６５．５０３４、ＰＧ（２２：６／２２：６）の相対及び合計存在量の増加が検出された。ｍ／ｚ２００〜４００における遊離脂肪酸の相対及び合計存在量の変化も観測され、観測されたものには、ｍ／ｚ２５５．２３３９、パルミチン酸ＦＡ（１６：０）、ｍ／ｚ２８１．２４９０、オレイン酸ＦＡ（１８：１）、ｍ／ｚ３０３．２３３３、アラキドン酸ＦＡ（２０：４）、及びｍ／ｚ３２７．２３３４、ドコサヘキサエン酸、ＦＡ（２２：６）が含まれる。全ての同定は、タンデム質量分析により行われた（図１１）。これらの脂質種の大部分は、隣接正常組織及び正常肺対照組織の両方に共通するものの、これらの脂肪腫の合計及び相対存在量は、正常組織では、癌組織よりも大幅に少ない。これらの結果は、ＫＲＡＳ誘導型肺癌の他の試料及び他のマウス由来の正常肺試料でも同様に観察された。本発明者らの結果は、ＫＲＡＳが、脂肪酸及びリン脂質を含む脂質の過剰発現を誘導し、正常肺組織とは識別される脂質プロファイルと関連することを示唆する。

ＦＡＳＮのＫＲＡＳ関連型誘導は、肺癌細胞増殖に必要である。ヒト肺腺癌関連細胞株Ａ５４９細胞及びＨ１２９９細胞は、ＫＲＡＳ陽性である。本発明者らは、すでに、ＫＲＡＳがＥＲＫ及び脂肪合成遺伝子を活性化することを明らかにしたので、ＥＲＫ阻害剤ＳＣＨ７７２９８４を、両方の細胞株に投与してみたところ、ＦＡＳＮ及びＳＣＤが抑制されることを見出した（図５Ａ）。そのうえ、Ｓ−ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ファルネシルチオサリチル酸（ＦＴＳ）を用いたＫＲＡＳ阻害は、ｑＰＣＲにより測定したところ、用量依存的様式でＦＡＳＮ及びＳＣＤの遺伝子発現を抑制した（図５Ｂ）。したがって、ＫＲＡＳ阻害は、脂質生合成関連遺伝子の発現を妨害する。脂肪酸合成を阻害するため、本発明者らは、複数の理由から、ＦＡＳＮを阻害することを選択した（図１１）。第一に、ＳＲＥＢＰの阻害は、脂肪酸合成経路だけでなく、様々な脂質生合成経路の抑制を招くと考えられる。第二に、ＳＣＤの阻害は、不飽和脂肪酸のみの合成を低下させ、飽和脂肪酸の合成は低下させないと考えられる。第３に、ＦＡＳＮ阻害は、脂肪酸合成経路に特異的と考えられ、これは、不飽和及び飽和脂肪酸産生の両方を枯渇させると考えられる。

セルレニンは、ＦＡＳＮの阻害剤である（図１２）。変異型ＫＲＡＳヒト肺腺癌細胞株Ａ５４９及びＨ１２９９のセルレニン処置は、ＰＩアッセイ及び血球計数器により測定したところ、増殖の減少をもたらした（図６Ａ、Ｂ）。すなわち、ＦＡＳＮの阻害は、ＫＲＡＳ関連肺腫瘍の治療を提供する。

本発明者らは、以下を通じて、ＫＲＡＳ陽性及び陰性肺腺癌の間で、ならびに腫瘍性及び正常肺組織の間で、（ａ）ｑＰＣＲにより測定されるＦＡＳＮの遺伝子発現、（ｂ）ＮＩＡにより同定されるＥＲＫ１ホスホアイソフォームの存在、及び（ｃ）ＤＥＳＩ−ＭＳＩにより検出される独自の脂質シグネチャーの誘導に関して、区別をつけることが可能であることを見出した。ＦＴＳを用いたＫＲＡＳ阻害は、ＦＡＳＮ発現を遮断し、脂質生合成の減少をもたらした。そのうえ、セルレニンによるＦＡＳＮ阻害は、ヒトＫＲＡＳ陽性肺癌細胞の増殖を抑制した。よって、本発明者らは、ＫＲＡＳ陽性肺腺癌について独特の遺伝子発現、ならびにプロテオーム及び脂質シグネチャーを同定した。

先行研究は、ＲＡＳファミリーメンバーが、グルコース及びグルタミン代謝を制御できることを実証している。本研究に基づき、本発明者らは、ＫＲＡＳ遺伝子が、原因となって、脂質生合成を制御することを示唆する。ＫＲＡＳシグナル伝達は、一般的に、ＥＲＫ及びＭＡＰＫ経路を活性化することがよく知られている。本発明者らの結果は、このシグナル伝達が、ＦＡＳＮの誘導を通じて脂質生合成を誘導すること、及びこれにＥＲＫが介在することを示す。先の観察は、ヒト腫瘍が脂質代謝における変化を示すことを示唆した。これの基本メカニズムの１つは、ＫＲＡＳ及びＥＲＫ活性化を通じたものである。

本発明者らは、ＫＲＡＳ肺腺癌の独自のプロテオーム及び脂質シグネチャーを同定した。ＮＩＡにより、ＥＲＫ１とＥＲＫ２とのタンパク質活性化の比較から、臨床検体においてＫＲＡＳ陽性腫瘍と陰性腫瘍を識別することが可能になった。ＮＩＡは、高感度のナノ流体アプローチであり、わずか２０個しかない細胞に由来するピコグラムのタンパク質の検査にさえも非常に使いやすくてタンパク質及びそれらのリン酸化部位を測定することができる。このように、ＥＲＫのＮＩＡ測定は、肺腺癌の診断に有用である可能性がある。

同様に、本発明者らは、ＤＥＳＩ−ＭＳＩにより、ＫＲＡＳ陽性腫瘍と関連する特徴的な脂質シグネチャーを同定した。この技法が持つ、ｉｎ ｓｉｔｕで代謝変化を検査する前例がない能力は、ＤＥＳＩ−ＭＳＩが、腫瘍性と正常肺組織とを識別する、肺癌の特徴的な遺伝子サブタイプを同定する、及び肺腫瘍における代謝改変を検出するために使用可能であることを示唆する。

今日のところ、肺腺癌は、従来の化学療法に免疫療法及びＥＧＦＲ受容体標的療法の両方を加えたとしても治療不可能であるように思われる。本発明者らの結果は、ＫＲＡＳ誘導型肺腺癌が、ＦＡＳＮの標的治療的阻害に特に感受性がある可能性があることを示唆する。

材料及び方法
脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ−ＭＳＩ）。ＤＥＳＩ−ＭＳＩは、組織の脂質プロファイルを評価する目的で、厚さ１６μｍの組織切片の二次元化学マップを作成するために使用した。肺試料を液体窒素に入れて瞬間凍結し、処理するまで−８０℃で貯蔵した。凍結試料を、凍結ミクロトームを用いて−２１℃で１６μｍ切片に切断し、顕微鏡スライドに解凍マウント（ｔｈａｗ−ｍｏｕｎｔｅｄ）した。スライドを−８０℃で貯蔵した。分析の前に、スライドを、デシケーター中、真空で約２０分間乾燥させた。研究室組立のＤＥＳＩ−ＭＳＩ源をＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ−ＸＬ質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と連結させて用い、ネガティブイオンモードで、ｍ／ｚ９０〜１，０００に空間分解能２００μｍで、ＤＥＳＩ−ＭＳＩを行った（図７）。Ｏｒｂｉｔｒａｐを、質量分析器として、分解力６０，０００に設定して使用した。ジメチルホルムアミド及びアセトニトリル（１：１）を溶媒系として、流速０．５μＬ／分で使用して、この方法によりマウス組織試料を撮影した。Ｎ₂ 圧は、１７５ｐｓｉに設定した。ＤＥＳＩ−ＭＳＩでは、荷電した溶媒を組織に噴霧し、分子、例えば、代謝産物及び脂質などを、溶解させて組織表面から抽出し、そして質量対電荷（ｍ／ｚ）比を測定するため質量分析器に移した。生ファイルを２Ｄ画像に変換するためにソフトウェアＩｍｇＧｅｎｅｒａｔｏｒを用いた。空間的に正確なイオン画像を、ＢｉｏＭａｐソフトウェアを用いて組立てた。ＤＥＳＩ−ＭＳＩ後、同一組織切片を、光学顕微鏡を用いた病理組織検査のため、標準Ｈ＆Ｅ染色に供した。腫瘍病巣を描写するため、ＤＥＳＩ−ＭＳイオン画像を、同一組織のＨ＆Ｅ染色組織切片の光学顕微鏡画像と比較した。脂質同一性を裏付けるため、質量分析にＯｒｂｉｔｒａｐ及びリニアイオントラップの両方を用いてタンデムＭＳ分析を行った。脂質同定を補助するため、脂質マップデータベースも利用した。

患者組織試料。ヒト肺腺癌試料及びそれに一致する正常組織対照を、承認されたＩＲＢ手順の下で、Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ組織バンクから得た。この試験に使用した患者試料を、それらのＫＲＡＳ変異状態と合わせて示す（図１３を参照）。

テトラサイクリン系条件的マウスモデル。Ｔｅｔ−Ｏｎ系を使用して、遺伝子導入マウスの肺組織中で、ＫＲＡＳスプライスバリアントの発がん性型であるＫＲＡＳ４ｂ^G12Dを条件的に活性化した。この系では、可逆的テトラサイクリントランス活性化因子（ｒｔＴＡ）をコードする遺伝子は、クララ細胞分泌タンパク質（ＣＣＳＰ）プロモーターの制御下に置かれ、ＣＣＳＰプロモーターは、肺クララ細胞及びＩＩ型肺細胞におけるその恒常的発現を駆動する。ＫＲＡＳ４ｂ^G12DｃＤＮＡは、テトラサイクリン反応性ミニマルプロモーター（ＴｅｔＯ−ＫＲＡＳ４ｂ^G12D）の制御下に置かれている。テトラサイクリン不在下では、ｒｔＴＡはＴｅｔＯ配列に結合して、がん遺伝子の転写を抑制する。テトラサイクリン存在下では、ドキシサイクリンがｒｔＴＡに結合することで、ｒｔＴＡはＴｅｔＯ配列に結合不能になり、その結果、がん遺伝子転写が活性化される。変異型ＫＲＡＳは、４週齢から、飲料水にドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ）を添加（１００ｍｇ／ｍＬ）開始して投与することにより、活性化させる。２４週目に、４匹のマウスからＫＲＡＳ誘導型肺腫瘍を、及び３匹のマウスから正常肺組織を収穫し、次いでそれらをＤＥＳＩ−ＭＳＩにより分析した。全ての動物実験は、スタンフォード大学実験動物保護管理委員会（ＡＰＬＡＣ）により承認された。ＣＣＳＰ−ｒｔＴＡ／ＴｅｔＯ−ＫＲＡＳ４ｂ^G12D２遺伝子組換えマウスを使用した。これらの遺伝子導入マウスに存在するＴｅｔ−Ｏｎ制御システムの図を示す（図８）。

マイクロアレイ。マイクロアレイ分析は、スタンフォード機能ゲノム科学分析室でＩｌｌｕｍｉｎａ ＷＧ６マウスマイクロアレイプラットフォームを用いて行った。全ゲノム遺伝子発現プロファイリングを行い、ＫＲＡＳがオンになった遺伝子導入マウスの肺組織とＫＲＡＳがオフのものとで遺伝子発現を比較した。データをｌｏｇ２変換し、分位点を正規化した。

細胞培養物。ヒト非小細胞肺癌細胞株、Ａ５４９及びＨ１２９９を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験に使用した。Ａ５４９細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸、及び抗生物質抗菌剤を補充した中で維持した。Ｈ１２９９細胞は、ＲＰＭＩ １６４０培地に１０％ＦＢＳ、５０μΜのβ−メルカプトエタノール、及び抗生物質抗菌剤を補充した中で維持した。Ａ５４９細胞及びＨ１２９９細胞のどちらも、継代培養するためにトリプシン−ＥＤＴＡを使用した。全ての細胞培養試薬は、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）から購入した。

小分子阻害剤。小分子、ＳＣＨ７７２９８４（Ｃａｙｍａｎ）を１２５ｎｇ／ｍＬで、ファルネシルチオサリチル酸（ＦＴＳ）（Ｓｉｇｍａ）を５〜２０ｎｇ／ｍＬで、及びセルレニン（Ｓｉｇｍａ）を１〜１０μｇ／ｍＬで、細胞培養培地に添加して、それぞれ、ＥＲＫ、ＫＲＡＳ、及び脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）の阻害を達成した。ＦＴＳは、ＫＲＡＳが形質膜に付着することを妨害する合成ファルネシルシステイン模倣物である。セルレニンは、酵素と共有結合することにより、不可逆的にＦＡＳＮを阻害する。用量反応関連性を評価する目的で、これらの薬物を様々なレベルで経時的に培地中の細胞に投与した。

細胞計数。培養培地からある体積の細胞を取り出し、等体積の０．４％トリパンブルー染料と混合した。次いで、１０μＬを取り出し、細胞計数のため血球計数器に入れた。細胞増殖の尺度として、生細胞数を用いた。

ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成。ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを用いて、全ＲＮＡを、細胞及び肺組織から単離した。ＲＮＡの純度及び濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）分光光度計により評価した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ合成システム（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＲＮＡからｃＤＮＡに逆転写した。全ての手順は、製造元によるプロトコルに従って行った。

リアルタイムＰＣＲ。リアルタイムＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）１２Ｋ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステムにて、３８４ウェルプレートで行った。増幅は、フルオロフォアとしてＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ色素を用いて検出した。反応は、１μＬのｃＤＮＡ、０．５μΜのフォワードプライマー及びリバースプライマー、ならびにＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する２０μＬ体積分で行った。増幅サイクルは、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間、７２℃で３０分間のサイクルを４０回と設定した。増幅段階後、溶融曲線を行い、あらゆる非特異的増幅を同定した。各遺伝子について、閾値到達サイクル数（Ｃｔ）を求めた。Ｃｔは、蛍光閾値に達するために必要なサイクル数を表す。統計分析のため、Ｃｔ値をＥｘｃｅｌにエクスポートした。ユビキチン（ＵＢＣ）を、ハウスキーピング（参照）遺伝子として用いた。２^{−ΔΔＣＴ}法を用いて、相対ｍＲＮＡ発現レベルを求めた。図１４は、この試験で用いたリアルタイムＰＣＲプライマーの一覧である。

ナノ免疫アッセイ（ＮＩＡ）。肺腫瘍組織から作製したライセート中のＥＲＫ１及びＥＲＫ２のリン酸化状態を検出するため、Ｎａｎｏｐｒｏ １０００（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）を用いてＮＩＡを行った。ＮＩＡは、高感度の毛細管利用等電点電気泳動法であり、この方法は、抗体検出を利用して、タンパク質アイソフォームを定量するとともにリン酸化などの翻訳後タンパク質修飾を特性決定する。Ｎａｎｏｐｒｏ １０００の各毛細管にロードされた最終タンパク質濃度は、０．１μｇ／μＬであった。ＥＲＫ１／２のための一次ウサギ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１：３００に希釈し、ローディングコントロール用の一次マウス抗体、Ｈｓｐ７０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１：５００に希釈した。西洋ワサビペルオキシダーゼと複合体形成した抗マウス及び抗ウサギ二次抗体を、１：１００に希釈した。ルミノール及び過酸化物検出試薬の添加に続いて化学発光シグナルを記録した。ＮＩＡデータの分析は、Ｃｏｍｐａｓｓソフトウェア（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）で行った。

統計分析。エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）計算値に基づいて構築した。エラーバーは、平均±ＳＤを表す。適宜、ステューデントのｔ検定を用いて、統計上有意性を評価した。ｔ検定による統計上有意性は、ｐ値＜０．０５の場合は^* 、ｐ値＜０．０１の場合は^**、ｐ値＜０．００１の場合は^*** で示す。

実施例２
ナノスケールタンパク質測定は、固形腫瘍の腫瘍内不均一性と患者内不均一性とを比較評価するために使用可能である。ナノ免疫アッセイ（ＮＩＡ）を用いて、腎臓癌の患者から得た微細針吸引バイオプシー（ＦＮＡ）におけるＥＲＫシグナル伝達を分析した。３９人の患者それぞれから、腎臓腫瘍の２〜３箇所からＦＮＡにより試料を採取した。図１５に示すとおり、各円は、腫瘍ＦＮＡであり（Ｎ＝９１のＦＮＡ）、技術的反復にわたり平均した。各患者からの試料は、鉛直線で結んである。ＥＲＫ２の試料にわたる平均により患者を順位付けてある。アイソフォームにまたがり、技術的反復にまたがる変動性は、１％という平均標準偏差を有する。

同一腫瘍の異なる領域から得た試料では、試料間の変動は、６％という平均標準偏差を有する。反対に、異なる患者にまたがる測定割合の標準偏差は、アイソフォームにまたがり５％〜２２％の範囲である。

これらのデータは、重要なシグナル伝達タンパク質であるＥＲＫについて、腫瘍内不均一性（６％）は、患者内不均一性よりも小さい（ホスホ−アイソフォームｐＥＲＫ２ｂについて２２％）ことを実証する。この知見は、腫瘍から得た単一のＦＮＡにおけるＥＲＫアイソフォーム分析が、腫瘍全体を代表し得ることを実証する。

実施例３
ＮＩＡは、腎細胞癌（ＲＣＣ）及び肺癌の患者から得た臨床検体でタンパク質を測定するために使用可能である
本明細書中に記載されるとおり、ＮＩＡ電荷分離は、多くの検体種類及び異なる悪性腫瘍において新規タンパク質を測定するために使用されてきた。例えば、検体種類として、瞬間凍結腫瘍、ＯＴＣに包埋された凍結切片、微細針吸引試料、骨髄、血液、ＣＴＣ、及び血漿が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト腫瘍臨床検体として、リンパ腫、ＣＭＬ、ＭＤＳ、腎臓癌、肺癌、及び頭頚部癌が挙げられるが、これらに限定されない。使用される薬物として、アトルバスタチン、リゴセルチブ、ＦＴＳ、及び抗ＥＰＨＡ３が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に提示されるデータは、ＮＩＡが診断に使用可能であることを実証する。腎臓癌の場合、グルタミナーゼレベルを測定する。肺癌の場合、ＲＡＳ⁺ 対ＲＡＳ^- を識別する。同じく、腎臓癌、頭頸部癌などの間で、異なる種類のがんを、互いに識別する。提示されるデータは、ＮＩＡが治療のためのモニタリング及び薬物開発に使用可能であることを実証する。ＦＴＳ（前臨床）、リゴセルチブ（臨床試験）、及びアトルバスタチン（臨床試験）などの薬物が使用されてきた。

本明細書中に提示されるデータは、異なる種類の腫瘍を識別するＮＩＡシグナル伝達測定の能力、肺癌患者から得たＣＴＣにおけるＥＲＫシグナル伝達を測定するＮＩＡの能力、及びＫＲＡＳ⁺ 肺腫瘍をＫＲＡＳ^- 肺腫瘍から区別するＮＩＡの能力を通じて分かるとおり、ＮＩＡが診断道具として使用可能であることを示す。そのうえさらに、本明細書中に提示されるデータは、ＦＴＳ処置した腫瘍でのＥＲＫレベルのモニタリング、及び頭頚部癌（ＨＮＳＣＣ）のリゴセルチブ処置前対後のＮＩＡによる差別化を通じて分かるとおり、ＮＩＡが治療効力のモニタリングに使用可能であることを示す。

ＮＩＡは、ＲＣＣ及び肺癌の患者から得た臨床検体中のタンパク質を測定するために使用可能である。

図１６に示すとおり、循環腫瘍細胞を、Ｍａｇ−Ｓｉｆｔｅｒ技術を用いて、１０人の患者から単離した。各患者から得た細胞をペレットにして凍結した。各患者から得た細胞ペレットを、ＮＩＡを用いて分析し、ＥＲＫアイソフォームを測定した。

実施例４
ＮＩＡは、ＲＡＳのＦＴＳ阻害による変化を検出する。
本明細書中に提示されるデータは、ＦＴＳ処置した腫瘍でのＡｋｔレベル及びＥＲＫレベルのモニタリング、ならびに頭頚部癌（ＨＮＳＣＣ）のリゴセルチブ処置前対後のＮＩＡによる差別化を通じて分かるとおり、ＮＩＡが治療効力のモニタリングに使用可能であることを示す。

ＮＩＡは、ＲＡＳのＦＴＳ阻害による変化を検出する。図１７に示すとおり、ファルネシルチオサリチル酸（ＦＴＳ）は、形質膜でＲａｓ結合を遮断する。

図１８に示すとおり、ＦＴＳ処置は、ｉｎ ｖｉｖｏでＥＲＫ活性化を阻害する（ＮＩＡ分析）。ＭＹＣ誘導型リンパ腫を持つマウスを、ＦＴＳで処置した。未処置または処置４日後のマウスの腫瘍から、微細針吸引により試料採取した。ＦＮＡを週間凍結し、バッチ分析した。ＮＩＡを使用して、ＥＲＫアイソフォームを分析した。合計ＥＲＫ１／２レベルは変化しなかった一方で、全ホスホ−ＥＲＫアイソフォームは４日目に減少した。

図１９に示すとおり、ＢＣＬ２＋Ｒａｓの不活化は、ｉｎ ｖｉｖｏで、ＢＣＬ２リンパ腫のアポトーシスを誘導する（系列ＦＮＡ）。ＢＣＬ２誘導型リンパ腫を持つマウスを、未処置（ＢＣＬ２ Ｕｎｔｘ）、処置してＢＣＬ２を不活化する（ＢＣＬ２ Ｄｏｘ）、ＦＴＳ単独で処置してＲａｓを阻害する（ＢＣＬ２ ＦＴＳ）、または処置してＢＣＬ２及びＲａｓの両方を不活化する（ＢＣＬ２ Ｄｏｘ ＦＴＳ）、いずれかに供した。未処置または処置１、２、３、もしくは４日後のマウスの腫瘍から、微細針吸引により試料採取した。ＦＮＡを週間凍結し、バッチ分析した。ＮＩＡを使用して、ＥＲＫアイソフォームを分析した。

図２０は、ＢＣＬ２及びｒａｓの不活化が、いずれかのがん遺伝子を単独で不活化するよりも有効に腫瘍成長を阻害することを示す。ＢＣＬ２及びＲａｓ両方の不活化は、いずれかのがん遺伝子単独よりも有効に腫瘍成長を阻害する。ＢＣＬ２−誘導型リンパ腫を持つマウスについて、未処置（ＵｎＴｘ）、ＢＣＬ２を不活化（ＢＣＬ２オフ）、Ｒａｓ不活化（Ｒａｓオフ）、またはＢＣＬ２及びＲａｓ両方を不活化（ＢＣＬ２オフ、Ｒａｓオフ）でのマウスコホートにおける経時的な腫瘍面積プロットを示す。

図２１に示すとおり、ＤＯＸによるＢＣＬ２不活化及びＦＴＳによるＲＡＳ不活化は、いずれかのがん遺伝子を単独で不活化するよりも有効に腫瘍成長を阻害する。

図２２は、遺伝子導入リンパ腫から得たＦＮＡ中のＥＲＫアイソフォームのＮＩＡ分析を示す。ＮＩＡは、ＦＴＳが、４日目に、ＥＲＫ１／２リン酸化を３５％減少させたことを明らかにする。腫瘍から、処置前（ＵｎＴｘ）、及びＦＴＳを用いた処置の１〜８日後に、微細針吸引により試料採取した。

図２３は、遺伝子導入リンパ腫から得たＦＮＡ中のＥＲＫアイソフォームのＮＩＡ分析を示す。ｄｏｘとの比較を示す。マウスは、ＦＴＳ（ＢＣ２ＦＴＳ）またはＢＣＬ２不活化（ＢＣＬ２Ｄｏｘ）いずれかで処置した。腫瘍から、処置前（ＵｎＴｘ）、及びＦＴＳを用いた処置の１〜８日後に、微細針吸引により試料採取した。

実施例５
ＮＩＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼのアトルバスタチン阻害による変化を検出する。
図２４は、ＥＲＫデータを示す（アトルバスタチン処置の前及び後）。２人の患者は、ＨＭＧ ｃｏ−Ａリダクターゼ阻害剤アトルバスタチンの臨床試験で治療を受けた。ＮＩＡを用いて、治療の前後８日間に試料採取した腫瘍細胞中のＥＲＫアイソフォームの変化を測定した。患者Ａの場合、腫瘍負荷は減少した。患者Ｂの場合、腫瘍負荷の変化は見られなかった。

図２５は、ＭＥＫデータを示す（アトルバスタチン処置の前及び後）。２人の患者は、ＨＭＧ ｃｏ−Ａリダクターゼ阻害剤アトルバスタチンの臨床試験で治療を受けた。ＮＩＡを用いて、治療の前後８日間に試料採取した腫瘍細胞中のＭＥＫアイソフォームの変化を測定した。患者Ａの場合、腫瘍負荷は減少した。患者Ｂの場合、腫瘍負荷の変化は見られなかった。

図２６に示すとおり、アトルバスタチンは、ＮＨＬ患者９人中４人で、トリ−ホスホ−ＭＥＫ１の有意な変化を引き起こす。９人の患者は、ＨＭＧ ｃｏ−Ａリダクターゼ阻害剤アトルバスタチンの臨床試験で治療を受けた。ＮＩＡを用いて、治療前（１日目）及び８日後にＭＥＫアイソフォームの変化を測定した。

図２７は、アトルバスタチンが、ＮＨＬ患者９人中４人で、ジ−ホスホ−ＭＥＫ１の有意な変化を引き起こすことを示す。９人の患者は、ＨＭＧ ｃｏ−Ａリダクターゼ阻害剤アトルバスタチンの臨床試験で治療を受けた。ＮＩＡを用いて、治療前（１日目）及び８日後にＭＥＫアイソフォームの変化を測定した。

図２８は、アトルバスタチンが、ＮＨＬ患者９人中１人で、モノ−ホスホ−ＭＥＫ１の有意な変化を引き起こすことを示す。９人の患者は、ＨＭＧ ｃｏ−Ａリダクターゼ阻害剤アトルバスタチンの臨床試験で治療を受けた。ＮＩＡを用いて、治療前（１日目）及び８日後にＭＥＫアイソフォームの変化を測定した。

実施例６
ＮＩＡは、Ｐ１３Ｋのリゴセルチブ阻害による変化を検出する。
今回、固形腫瘍におけるＮＩＡによる治療評価としてのＥｒｋシグネチャーが再検討された。図２９に示すとおり、白金抵抗性、再発性、または転移性Ｈ＆Ｎ ＳＣＣの患者におけるリゴセルチブ処置に対する治療反応についての強力なバイオマーカーとしてＮＩＡによるＥｒｋ活性が評価された。

図３０は、リゴセルチブの作用機序を示す。リゴセルチブは、タンパク質キナーゼ活性のアロステリック阻害剤である。これは、ＣＭＬ及びＭＤＳにおいてＰＩ３Ｋ経路及びＰｌｋ１経路両方を阻害することが知られている。

図３１に示すとおり、リゴセルチブ処置のため、患者は、２１日サイクルのうち１４日間連続で（２週間治療し、１週間休むレジメン）、リゴセルチブ５６０ｍｇをＢＩＤで投与される。患者は、２週間の治療及び１週間休むレジメンのサイクルを２回受ける。サイクル１の１４日目にのみ、リゴセルチブにより阻害される経路の合計タンパク質及びホスホ−タンパク質、ＥＲＫ、ならびにローディング対照のナノプロテオームプロファイリングのため、ＨＮＳＣＣの患者５人でバイオプシーまたはＦＮＡを行うことになる。サイクル１の１４日目及びサイクル２の１４日目、血液薬物動態分析を行う。

図３２は、リゴセルチブが、頭頚部扁平上皮癌のＥｒｋ経路を減少させることを示す。リゴセルチブの臨床試験で治療を受けた頭頚部癌の患者から、治療前（プレ治療）及び治療後（ポスト治療）に腫瘍試料を採取した。ＮＩＡを用いて、ＥＲＫアイソフォームを測定した。

本明細書中に言及される刊行物は全て、刊行物に記載されており、本明細書中で説明される発明に関連して使用される可能性があるもの、例えば、化合物及び方法を説明及び開示する目的で、本明細書中に参照として援用される。上記及び文書全体を通じて記載される刊行物は、本出願の出願日前にそれらの開示があったことを提示するにすぎない。本明細書中には何１つとして、本発明者らが先行発明を理由にそのような開示に先行する資格がないとすることの了承として見なされるものはない。

相互参照
本出願は、２０１７年 ３月１６日出願の米国仮特許出願番号第６２／４７２，４４７号及び２０１７年 ３月３１日出願の米国仮特許出願番号第６２／４８０，０４４号の優先権を主張し、これらの出願はそのまま全体が本明細書中に参照として援用される。

Claims (87)

1. 患者の腫瘍がＫＲＡＳ変異により駆動されている（ＫＲＡＳ⁺ ）か否かを判定する方法であって、
   ＫＲＡＳ⁺ であることが疑われる腫瘍の試料を得ることと、
   ＥＲＫホスホアイソフォームに関してのナノ流体プロテオーム免疫アッセイ（ＮＩＡ）、ならびに、ｍ／ｚ領域約７００〜１０００及び／またはｍ／ｚ約２００〜４００の領域における脂質種に関しての脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ−ＭＳＩ）のうち一方または両方を行うことと、
   ＫＲＡＳ⁺ 腫瘍は、ＫＲＡＳ^- 腫瘍または正常組織と比べて変化したＥＲＫ１アイソフォーム及び／または変化した脂質種を示しており、前記試料が、ＫＲＡＳ^- 腫瘍または正常組織と比べて変化したＥＲＫ１アイソフォーム及び／または変化した脂質種を示しているか否かを判定することと、
   前記患者に判定結果を提供することと
   を含む、方法。
2. さらに、判定に従って前記患者を治療することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記腫瘍は、肺腺癌である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記試料は、バイオプシー試料である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記バイオプシー試料は、１００，０００個未満の細胞の腫瘍細胞試料である、請求項４に記載の方法。
6. 前記バイオプシー試料は、微細針吸引試料である、請求項４に記載の方法。
7. 対照組織は、同一組織から異なる時点で採取された試料である、請求項４に記載の方法。
8. 単一の腫瘍で複数の時点を比較する、請求項７に記載の方法。
9. 細胞試料は、事前に凍結されていたものである、請求項１に記載の方法。
10. 前記ＮＩＡは、ＫＲＡＳ⁺ 腫瘍に関して、合計ＥＲＫタンパク質レベルと比較した場合にｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベルの顕著な上昇を検出する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記ＤＥＳＩ−ＭＳＩは、ＫＲＡＳ⁺ 腫瘍に関して、複合グリセロリン脂質レベル及び遊離脂肪酸レベルの顕著な上昇を検出する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記患者は、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）の阻害剤で治療される、請求項２に記載の方法。
13. 前記阻害剤は、第二の治療レジメンと併用して投与される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ＦＡＳＮの阻害剤は、セルレニンである、請求項１２または１３に記載の方法。
15. さらに、ＫＲＡＳ駆動型腫瘍形成を示すマーカーに関して治療の有効性を判定するために、前記患者から得た試料が、治療過程にわたり２つ以上の時点で、ＫＲＡＳ^- 腫瘍または正常組織に比べて変化したＥＲＫ１アイソフォーム及び／または変化した脂質種を示しているか否かを判定することを含む、請求項２に記載の方法。
16. ＫＲＡＳ⁺ 癌を持つ対象を同定する方法であって、
    対象から得られた臨床試料でナノ流体プロテオーム免疫アッセイ（ＮＩＡ）及び／または脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ−ＭＳＩ）を行うことと、
    前記臨床試料中のＥＲＫ１ホスホアイソフォーム及び／または脂質種を測定することと
    を含む、方法。
17. 前記臨床試料は、合計ＥＲＫタンパク質レベルと比較した場合に、ｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベルが顕著に上昇している、請求項１６に記載の方法。
18. 前記臨床試料は、正常組織試料またはＫＲＡＳ^- 癌と比較した場合に、ｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベルが顕著に上昇している、請求項１６または１７に記載の方法。
19. 前記ＤＥＳＩ−ＭＳＩを行うことは、ｍ／ｚ領域約７００〜１０００及び／またはｍ／ｚ約２００〜４００の範囲の領域で脂質種を検出することを含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記臨床試料は、正常組織試料またはＫＲＡＳ^- 癌と比べて変化した脂質種を示す、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記臨床試料は、ｍ／ｚ７４５．５０３４、ＰＧ（１８：１／１６：１）、ｍ／ｚ７４７．５１９０、ＰＧとして（１８：１／１６：０）、ｍ／ｚ７９３．５０２３、ＰＧ（１８：２／２０：４）、及びｍ／ｚ８６５．５０３４、ＰＧ（２２：６／２２：６）の相対及び／または合計存在量が増加している、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記ＤＥＳＩ−ＭＳＩは、ＫＲＡＳ⁺ 腫瘍に関して、複合グリセロリン脂質及び遊離脂肪酸のレベルの顕著な上昇を検出する、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記臨床試料は、血液試料である、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記臨床試料は、バイオプシー試料である、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記バイオプシー試料は、腫瘍から得られる、請求項２４に記載の方法。
26. 前記臨床試料は、１００，０００個未満の細胞を含む、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記臨床試料は、１，０００個未満の細胞を含む、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記臨床試料は、１００個未満の細胞を含む、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記臨床試料は、微細針吸引により得られる、請求項１６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記臨床試料は、ｉｎ ｖｉｖｏで採取された微細針吸引試料（ＦＮＡ）である、請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記ＦＮＡを、隣接する非腫瘍組織と比較することを含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記対象は、肺腺癌と診断される、請求項１６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記対象は、腎臓癌と診断される、請求項１６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
34. さらに、異なる時点で同一腫瘍から第二ＮＩＡ及び／または第二ＤＥＳＩ−ＭＳＩを行うことを含む、請求項１６〜３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記臨床試料は、事前に凍結されていたものである、請求項１６〜３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記臨床試料は、前記ＮＩＡ及び／または前記ＤＥＳＩ−ＭＳＩを行う前に、３０分間超、氷上に事前に維持されていたものである、請求項１６〜３５のいずれか一項に記載の方法。
37. ＫＲＡＳ⁺ 癌を治療するまたは減少させる必要がある対象について、ＫＲＡＳ⁺ 癌を治療するまたは減少させる方法であって、
    前記対象のある部位から得られた臨床試料でナノ流体プロテオーム免疫アッセイ（ＮＩＡ）及び／または脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ−ＭＳＩ）を行うことと、
    第一の時点で、前記臨床試料中のＥＲＫ１ホスホアイソフォーム及び／または脂質種を測定することと、
    前記対象が有効量の抗がん剤で治療を受けた後、前記対象のほぼ同一の部位から得られた臨床試料で、第二のＮＩＡ及び／または第二のＤＥＳＩ−ＭＳＩを行うことと、
    前記対象が有効量の抗がん剤で治療を受けた後、第二の時点で、前記対象のほぼ同一の部位から得られた前記臨床試料中のＥＲＫ１ホスホアイソフォーム及び／または脂質種を測定することと
    を含む、方法。
38. 前記抗がん剤は、脂肪酸シンターゼ阻害剤である、請求項３７に記載の方法。
39. 前記抗がん剤は、脂質生合成酵素阻害剤である、請求項３７に記載の方法。
40. さらに、前記対象に治療レジメンを受けさせることを含み、前記治療レジメンは、少なくとも１ヶ月間、有効量の抗がん治療薬を投与することを含む、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
41. さらに、前記対象が前記抗がん剤で治療を受けた後、前記対象のほぼ同一の部位から得られた前記臨床試料中の、前記ＥＲＫ１ホスホアイソフォーム及び／または前記脂質種に基づき、治療レジメンを維持、調整、または中止することを含み、前記ＥＲＫ１ホスホアイソフォーム及び／または前記脂質種の変化は、前記治療レジメンに対する反応を示すものである、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記臨床試料は、前記第一の時点の合計ＥＲＫタンパク質レベルと比較した場合に、ｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベルが顕著に上昇している、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 前記臨床試料は、前記第一の時点で、正常組織試料またはＫＲＡＳ^- 癌と比較した場合に、ｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベルが顕著に上昇している、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の方法。
44. ｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベルは、前記第一の時点で、前記第二の時点よりも高い、請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記ＤＥＳＩ−ＭＳＩを行うことは、ｍ／ｚ領域約７００〜１０００及び／またはｍ／ｚ約２００〜４００の範囲の領域で脂質種を検出することを含む、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記臨床試料は、前記第一の時点で、正常組織試料またはＫＲＡＳ^- 癌と比べて変化した脂質種を示す、請求項３７〜４５のいずれか一項に記載の方法。
47. 前記臨床試料は、前記第一の時点で、ｍ／ｚ７４５．５０３４、ＰＧ（１８：１／１６：１）、ｍ／ｚ７４７．５１９０、ＰＧとして（１８：１／１６：０）、ｍ／ｚ７９３．５０２３、ＰＧ（１８：２／２０：４）、及びｍ／ｚ８６５．５０３４、ＰＧ（２２：６／２２：６）の相対及び／または合計存在量が増加している、請求項３７〜４６のいずれか一項に記載の方法。
48. 前記ＤＥＳＩ−ＭＳＩは、前記第一の時点で、ＫＲＡＳ⁺ 腫瘍に関して複合グリセロリン脂質及び遊離脂肪酸のレベルの顕著な上昇を検出する、請求項３７〜４７のいずれか一項に記載の方法。
49. 複合グリセロリン脂質レベル及び遊離脂肪酸レベルは、前記第一の時点で、前記第二の時点よりも高い、請求項３７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
50. 前記臨床試料は、血液試料である、請求項３７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記臨床試料は、バイオプシー試料である、請求項３７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
52. 前記バイオプシー試料は、腫瘍から得られる、請求項５１に記載の方法。
53. 前記臨床試料は、１００，０００個未満の細胞を含む、請求項３７〜５２のいずれか一項に記載の方法。
54. 前記臨床試料は、１，０００個未満の細胞を含む、請求項３７〜５３のいずれか一項に記載の方法。
55. 前記臨床試料は、１００個未満の細胞を含む、請求項３７〜５３のいずれか一項に記載の方法。
56. 前記臨床試料は、微細針吸引により得られる、請求項３７〜５５のいずれか一項に記載の方法。
57. 前記臨床試料は、ｉｎ ｖｉｖｏで採取された微細針吸引試料（ＦＮＡ）である、請求項３７〜５６のいずれか一項に記載の方法。
58. さらに、前記ＦＮＡを、隣接する非腫瘍組織と比較することを含む、請求項５７に記載の方法。
59. 前記対象は、肺腺癌と診断される、請求項３７〜５８のいずれか一項に記載の方法。
60. 前記対象は、腎臓癌と診断される、請求項３７〜５８のいずれか一項に記載の方法。
61. 前記臨床試料は、事前に凍結されていたものである、請求項３７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
62. 前記臨床試料は、前記ＮＩＡ及び／または前記ＤＥＳＩ−ＭＳＩを行う前に、３０分間超、氷上に事前に維持されていたものである、請求項３７〜６１のいずれか一項に記載の方法。
63. 前記対象は、ヒトである、請求項３７〜６２のいずれか一項に記載の方法。
64. 前記対象は、動物である、請求項３７〜６２のいずれか一項に記載の方法。
65. 前記動物は、マウスである、請求項６４に記載の方法。
66. さらに、がん細胞を前記動物に移植することを含む、請求項６４または６５に記載の方法。
67. 対象の疾患または障害を治療する方法であって、
    前記対象に、有効量の抗がん剤を投与することを含み、
    前記抗がん剤を用いた治療は、前記対象から得られた臨床試料中のｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベル、及び／または複合グリセロリン脂質レベル及び遊離脂肪酸レベルに基づき、かつ前記ｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベル、及び／または前記複合グリセロリン脂質レベル及び遊離脂肪酸レベルは、参照レベルに比べて上昇している、方法。
68. 前記ｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベルは、ナノ流体プロテオーム免疫アッセイ（ＮＩＡ）により測定される、請求項６７に記載の方法。
69. 前記複合グリセロリン脂質レベル及び遊離脂肪酸レベルは、脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ−ＭＳＩ）により測定され、前記ＤＥＳＩ−ＭＳＩは、ｍ／ｚ領域約７００〜１０００及び／またはｍ／ｚ約２００〜４００の範囲の領域で脂質種を検出することを含む、請求項６７または６８に記載の方法。
70. 前記疾患または障害は、ＫＲＡＳ⁺ 癌である、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載の方法。
71. 前記ＫＲＡＳ⁺ 癌は、肺癌である、請求項７０に記載の方法。
72. 前記ＫＲＡＳ⁺ 癌は、腎臓癌である、請求項７０に記載の方法。
73. 前記抗がん剤は、脂肪酸シンターゼ阻害剤である、請求項６７〜７２のいずれか一項に記載の方法。
74. 前記抗がん剤は、脂質生合成酵素阻害剤である、請求項６７〜７３のいずれか一項に記載の方法。
75. 前記参照レベルは、ＫＲＡＳ^- 腫瘍または正常組織中のｐｐＥＲＫ１レベル及びｐＥＲＫ１レベル、及び／または複合グリセロリン脂質レベル及び遊離脂肪酸レベルである、請求項６７〜７４のいずれか一項に記載の方法。
76. 前記臨床試料は、血液試料である、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載の方法。
77. 前記臨床試料は、バイオプシー試料である、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載の方法。
78. 前記バイオプシー試料は、腫瘍から得られる、請求項７７に記載の方法。
79. 前記臨床試料は、１００，０００個未満の細胞を含む、請求項６７〜７８のいずれか一項に記載の方法。
80. 前記臨床試料は、１，０００個未満の細胞を含む、請求項６７〜７８のいずれか一項に記載の方法。
81. 前記臨床試料は、１００個未満の細胞を含む、請求項６７〜７８のいずれか一項に記載の方法。
82. 前記臨床試料は、微細針吸引により得られる、請求項６７〜８１のいずれか一項に記載の方法。
83. 前記臨床試料は、事前に凍結されていたものである、請求項６７〜８２のいずれか一項に記載の方法。
84. 前記臨床試料は、前記ＮＩＡ及び／または前記ＤＥＳＩ−ＭＳＩを行う前に、３０分間超、氷上に事前に維持されていたものである、請求項６７〜８３のいずれか一項に記載の方法。
85. ＫＲＡＳ⁺ 癌を治療するまたは減少させる必要がある対象について、ＫＲＡＳ⁺ 癌を治療するまたは減少させる方法であって、
    がん細胞を動物のある部位に移植することと、
    前記部位から前記がん細胞の一部を取り出すことと、
    ｅｘ ｖｉｖｏで前記一部を有効量の抗がん剤で処理し、処理部位を作成することと、
    前記処理部位で、ナノ流体プロテオーム免疫アッセイ（ＮＩＡ）及び／または脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ−ＭＳＩ）を行うことと、
    前記部位のＥＲＫ１ホスホアイソフォーム及び／または脂質種を測定することと
    を含む、方法。
86. 前記動物は、マウスである、請求項８５に記載の方法。
87. さらに、前記部位でナノ流体プロテオーム免疫アッセイ（ＮＩＡ）及び／または脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ−ＭＳＩ）を行うことと、前記抗がん剤で処理する前に、前記部位でＥＲＫ１ホスホアイソフォーム及び／または脂質種を測定することとを含む、請求項８５または８６に記載の方法。