CN110573878A - 用于kras阳性癌症的诊断和治疗方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于检测和治疗具有KRAS突变的癌症的方法，所述KRAS突变可驱动癌症中的肿瘤发生。在一些实施方案中，所述KRAS+癌症是肺腺癌。

Description

用于KRAS阳性癌症的诊断和治疗方法
交叉引用
本申请要求2017年3月16日提交的美国临时专利申请号62/472,447和2017年3月31日提交的美国临时专利申请号62/480,044的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
发明背景
癌症患者的治疗在历史上包括全身细胞毒性化学疗法、放射疗法和外科手术。现在，提高对驱动恶性肿瘤的分子途径的理解已经带来了靶向恶性细胞中的特定分子途径的剂的开发，以及提供鉴定将受益于特定疗法的患者的改进的能力。许多已确立的靶向疗法作为口服可用的小分子激酶抑制剂施用，但靶向疗法也可以单克隆抗体或小分子的形式静脉内施用。
鉴定一些肿瘤中的特定酪氨酸激酶的致癌活化，例如表皮生长因子受体(EGFR)中的突变或间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因或ROS1基因的重排已经带来范式转变以及用于患者的特定分子治疗的开发。此外，这些患者子集的鉴定已经产生鉴定可用于其他患者子集的生物标志物和治疗的持续努力。
用于预测靶向疗法的功效的最有用的生物标志物是称为“驱动突变”的体细胞基因组改变。这些突变发生在编码对细胞生长和存活至关重要的蛋白质的基因内的癌细胞中。对维持致癌表型不太重要的许多其他复发性分子改变通常被称为“乘客突变”。
驱动突变通常具有转化性，这意味着它们可起始非癌性细胞向恶性肿瘤的进化。此外，驱动突变通常赋予转化的细胞致癌基因成瘾的生物学，这意味着突变的蛋白质在癌细胞内产生依赖性以接收来自驱动因子(driver)的信号以便存活。致癌基因成瘾使驱动突变成为选择靶向疗法的患者的良好生物标志物。细胞中的关键下游生长和存活途径对单一上游信号的极度依赖性使得癌症易于下调源自驱动因子的信号。
在肺腺癌以及其他恶性肿瘤中，将特定靶向药物与个体患者的鉴定的驱动突变相匹配已经产生显著改善的治疗功效，通常与降低的毒性结合。筛选驱动突变因此已经成为诊断检查中越来越标准的部分，并且所得到的信息可用于在不存在可靶向驱动突变情况下的标准化学疗法与靶向疗法之间进行选择。
用于筛选患者的驱动突变和其他异常的方法正在不断发展，并且不存在测试的单一标准平台。使平台在临床上有用的特征是快速周转时间(两周或更短)；成本效率；能够在临床上可用的样品上进行；以及半自动化，从而消除对单个操作员的依赖性。在临床环境中常用的技术包括针对突变的存在的基因测序；用于分析DNA的预定义突变的等位基因特异性测试；下一代测序；用于检测基因易位、扩增和其他重排的荧光原位(FISH)；免疫组织化学；以及循环肿瘤DNA的分析。
在许多上皮癌，包括例如结肠直肠癌、NSCLC和胰腺导管腺癌(PDAC)中观察到活化的KRAS突变。作为膜结合的细胞内GTP酶，RAS蛋白家族是MAPK、信号转导因子和转录活化因子(STAT)以及磷酸肌醇3-激酶(PI3K)信号传导途径的中枢介质，所述信号传导途径共同控制细胞增殖和凋亡。致癌RAS突变、最常见的是对应于密码子12、13或61中的错义取代的那些突变通过损害RAS GTP酶的功能引起RAS独立于上游信号的组成型活性。
KRAS突变的存在一直与对特定疗法的响应或抗性相关。KRAS突变可使肿瘤对抗叶酸剂敏感，同时赋予对诸如西妥昔单抗和其他EGFR抑制剂的剂的抗性。针对患有KRAS突变的肺癌患者的靶向治疗剂的当前焦点是针对活化的KRAS的下游效应物，包括使用曲美替尼的MEK抑制和使用s司美替尼的MEK抑制。迄今为止，直接抑制RAS的努力尚未成功。
用于筛选少量癌细胞和鉴定患者亚群的改进的方法具有重要的临床意义。本发明解决了这种需要。
发明内容
提供了用于检测和治疗具有KRAS突变的癌症的方法，所述KRAS突变可驱动癌症中的肿瘤发生。此类癌症可在本文中称为“KRAS+癌症”。在一些实施方案中，所述KRAS+癌症是肺腺癌。
本文显示KRAS+癌细胞可通过以下中的一项或多项与KRAS阴性癌细胞以及正常对应组织区分开：(a)检测脂肪酸合酶(FASN)的上调的基因表达；(b)检测改变的ERK1磷酸同种型；以及(c)检测独特脂质特征的诱导。可通过确定癌细胞的KRAS+表型来选择个体进行治疗。进一步显示，通过抑制FASN来遏制KRAS+肺腺癌细胞的增殖，从而提供靶向疗法。
在一个实施方案中，应用纳米流体蛋白质组学免疫测定(NIA)来定量来自疑似为KRAS+肿瘤的肿瘤(包括KRAS+肺腺癌细胞)的少量溶解产物中的ERK1磷酸同种型。通过NIA，ERK1与ERK2蛋白活化允许区分临床样本中的KRAS阳性和阴性肿瘤。具体地，发现当与总ERK蛋白水平相比时并且相对于正常组织样品或KRAS阴性癌症，KRAS+肿瘤具有显著增加的ppERK1和pERK1水平。NIA的目标样品包括血液或实体瘤显微活检样品，如细针抽吸物(FNA)或循环肿瘤细胞。样品可在单个时间点取得，或者可在多个时间点取得。样品可小至100,000个细胞、小至5000个细胞、小至1000个细胞、小至100个细胞、小至50个细胞、小至25个细胞或更小。NIA检测方法将等电蛋白质聚焦和抗体检测组合在纳米流体系统中。在本发明的一些实施方案中，对已经冷冻的样品进行NIA检测，其中使细胞在解冻后溶解。血细胞可被保留在样品中以降低可变性。分析可在样品获得后进行长达60分钟，条件是所述样品被保持在冰上。因为NIA仅需要最少量的样本，所以分析是微创的，从而允许例如在开始治疗之前和之后获得连续蛋白质图谱，从而允许通过量化开始治疗的患者中蛋白质活性的早期变化来确定预测性蛋白质生物标志物；等等。
在一个实施方案中，进行质谱法，包括但不限于解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)，以分析疑似或已知为KRAS+癌细胞(包括肺腺癌细胞)的癌细胞中KRAS驱动的代谢。许多脂质种类的总丰度和相对丰度在正常组织中显著低于癌组织中。
可将从癌细胞提取的NIA或DESI质谱的差异与正常细胞、KRAS-癌细胞、已知KRAS+癌细胞的参考等进行比较。可随时间推移从个体(包括用治疗癌症的治疗方案治疗的个体)获得多个样品并进行分析。还可例如在临床试验的背景下在患者群组中获得多个样品并进行分析。
在其他实施方案中，提供了用于治疗KRAS+肺腺癌的方法。可通过本文所述的方法对癌症进行分析，以在治疗前确定KRAS+表型。可通过本文所述的方法在治疗过程中对癌症进行分析，以确定就指示KRAS驱动的肿瘤发生的标志物而言疗法的有效性。治疗方法提供向有需要的患者施用有效剂量的脂肪酸合酶活性或脂肪酸合酶表达的抑制剂。如此处所示，FASN的抑制遏制人KRAS+肺癌细胞的增殖。在一些实施方案中，FASN的抑制剂在与第二治疗方案的组合疗法中提供，所述第二治疗方案是例如外科手术、化学疗法、放射疗法、免疫肿瘤学疗法、靶向抗肿瘤抗体疗法等中的一种或多种。癌细胞的接触可在体内进行(例如用于治疗目的)和体外进行(例如用于筛选测定等)。
在一些方面，本公开提供了一种测定患者的肿瘤是否由KRAS突变(KRAS+)驱动的方法，所述方法包括：获得疑似为KRAS+的肿瘤的样品；以及进行以下中的一种或两种：针对ERK磷酸同种型的纳米流体蛋白质组学免疫测定(NIA)；和针对约m/z区域700-1000和/或约m/z 200-400的区域内的脂质种类的解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)；测定所述样品是否相对于KRAS-肿瘤或正常组织显示改变的ERK1同种型和/或改变的脂质种类；其中KRAS+肿瘤相对于KRAS-肿瘤或正常组织显示改变的ERK1同种型和/或改变的脂质种类；以及向所述患者提供所述测定。
在一些实施方案中，所述方法还包括根据所述测定来治疗所述患者。所述肿瘤可以是肺腺癌。在一些实施方案中，所述样品是活检样品。在一些实施方案中，所述活检样品是少于100,000个细胞的肿瘤细胞样品。在一些实施方案中，所述活检样品是细针抽吸物样品。在一些实施方案中，对照组织是在不同时间点来自同一肿瘤的样品。可比较来自单个肿瘤的多个时间点。在一些实施方案中，使细胞样品预先冷冻。
在一些实施方案中，当与KRAS+肿瘤的总ERK蛋白质水平相比时，NIA检测到显著增加的ppERK1和pERK1水平。在一些实施方案中，DESI-MSI检测到KRAS+肿瘤的显著增加的复合甘油磷脂和游离脂肪酸水平。可用脂肪酸合酶(FASN)的抑制剂治疗患者。在一些实施方案中，所述抑制剂与第二治疗方案组合施用。例如，FASN的抑制剂可以是浅蓝菌素。
在一些实施方案中，所述方法还包括测定来自所述患者的样品在治疗过程内的两个或更多个时间点是否相对于KRAS-肿瘤或正常组织显示改变的ERK1同种型和/或改变的脂质种类以确定就指示KRAS驱动的肿瘤发生的标志物而言疗法的有效性。
在一些方面，本公开提供了一种用于鉴定患有KRAS+癌症的受试者的方法，所述方法包括：对从受试者获得的临床样品进行纳米流体蛋白质组学免疫测定(NIA)和/或解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)；以及测量所述临床样品中的ERK1磷酸同种型和/或脂质种类。
在一些实施方案中，当与总ERK蛋白质水平相比时，所述临床样品具有显著增加的ppERK1和pERK1水平。在一些实施方案中，当与正常组织样品或KRAS-癌症相比时，所述临床样品具有显著增加的ppERK1和pERK1水平。在一些实施方案中，进行DESI-MSI涉及检测在约m/z区域700-1000和/或约m/z 200-400范围内的区域中的脂质种类。所述临床样品可相对于正常组织样品或KRAS-癌症显示改变的脂质种类。在一些实施方案中，所述临床样品具有增加的m/z 745.5034，PG(18:1/16:1)；m/z 747.5190，as PG(18:1/16:0)；m/z 793.5023，PG(18:2/20:4)；以及m/z 865.5034，PG(22:6/22:6)相对丰度和/或总丰度。在一些实施方案中，DESI-MSI检测到KRAS+肿瘤的显著增加的复合甘油磷脂和游离脂肪酸水平。
在一些实施方案中，所述临床样品是血液样品。在一些实施方案中，所述临床样品是活检样品。所述活检样品可从肿瘤获得。在一些实施方案中，所述临床样品包含少于100,000个细胞。所述临床样品可包含少于1,000个细胞。所述临床样品可包含少于100个细胞。
在一些实施方案中，所述临床样品通过细针抽吸获得。在一些实施方案中，所述临床样品是在体内取样的细针抽吸物(FNA)。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述FNA与邻近的非肿瘤组织进行比较。在一些实施方案中，所述受试者被诊断患有肺腺癌。在一些实施方案中，所述受试者被诊断患有肾癌。所述方法还可包括在不同时间点从同一肿瘤进行第二NIA和/或第二DESI-MSI。
在一些实施方案中，使所述临床样品预先冷冻。在进行NIA和/或DESI-MSI之前，所述临床样品可能已经预先在冰上保持超过30分钟。
在一些方面，本公开提供了一种治疗或减轻有需要的受试者的KRAS+癌症的方法，所述方法包括：对从所述受试者上的部位获得的临床样品进行纳米流体蛋白质组学免疫测定(NIA)和/或解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)；在第一时间点测量所述临床样品中的ERK1磷酸同种型和/或脂质种类；对已经用有效量的抗癌剂治疗所述受试者后从所述受试者上的大约相同部位获得的临床样品进行第二NIA和/或第二DESI-MSI；以及在第二时间点测量已经用抗癌剂治疗所述受试者后从所述受试者上的大约相同部位获得的所述临床样品中的ERK1磷酸同种型和/或脂质种类。
在一些实施方案中，所述抗癌剂是脂肪酸合酶抑制剂。在一些实施方案中，所述抗癌剂是脂肪生成酶抑制剂。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述患者置于治疗方案中，其中所述治疗方案包括施用有效量的抗癌治疗剂至少1个月。在一些实施方案中，所述方法还包括基于已经用所述抗癌剂治疗所述受试者后从所述受试者上的大约相同部位获得的临床样品中的ERK1磷酸同种型和/或脂质种类而维持、调整或停止所述治疗方案，其中所述ERK1磷酸同种型和/或所述脂质种类的变化指示对所述治疗方案的响应。当在所述第一时间点与总ERK蛋白质水平相比时，所述临床样品可具有显著增加的ppERK1和pERK1水平。当在所述第一时间点与正常组织样品或KRAS-癌症相比时，所述临床样品可具有显著增加的ppERK1和pERK1水平。在一些实施方案中，ppERK1和pERK1的水平在所述第一时间点比所述第二时间点高。在一些实施方案中，进行DESI-MSI涉及检测在约m/z区域700-1000和/或约m/z 200-400范围内的区域中的脂质种类。所述临床样品可在所述第一时间点相对于正常组织样品或KRAS-癌症显示改变的脂质种类。所述临床样品可在所述第一时间点具有增加的m/z 745.5034，PG(18:1/16:1)；m/z 747.5190，as PG(18:1/16:0)；m/z 793.5023，PG(18:2/20:4)；以及m/z 865.5034，PG(22:6/22:6)相对丰度和/或总丰度。在一些实施方案中，DESI-MSI在所述第一时间点检测到KRAS+肿瘤的显著增加的复合甘油磷脂和游离脂肪酸水平。复合甘油磷脂和游离脂肪酸的水平可能在所述第一时间点比所述第二时间点高。
在一些实施方案中，所述临床样品是血液样品。在一些实施方案中，所述临床样品是活检样品。所述活检样品可从肿瘤获得。在一些实施方案中，所述临床样品包含少于100,000个细胞。所述临床样品可包含少于1,000个细胞。所述临床样品可包含少于100个细胞。在一些实施方案中，所述临床样品通过细针抽吸获得。所述临床样品可以是在体内取样的细针抽吸物(FNA)。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述FNA与邻近的非肿瘤组织进行比较。
在一些实施方案中，所述受试者被诊断患有肺腺癌。在一些实施方案中，所述受试者被诊断患有肾癌。在一些实施方案中，使所述临床样品预先冷冻。在进行NIA和/或DESI-MSI之前，所述临床样品可预先在冰上超过30分钟。
在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者是动物。例如，所述动物可以是小鼠。在一些实施方案中，所述方法还包括将癌细胞移植到动物中。
在一些方面，本公开提供了一种用于治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的抗癌剂，其中用所述抗癌剂治疗是基于从所述受试者获得的临床样品中的ppERK1和pERK1的水平和/或复合甘油磷脂和游离脂肪酸的水平，并且其中ppERK1和pERK1的水平和/或复合甘油磷脂和游离脂肪酸的水平与参考水平相比升高。在一些实施方案中，通过纳米流体蛋白质组学免疫测定(NIA)来测量ppERK1和pERK1的水平。在一些实施方案中，通过解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)来测量复合甘油磷脂和游离脂肪酸的水平，其中所述DESI-MSI涉及检测在约m/z区域700-1000和/或约m/z 200-400范围内的区域中的脂质种类。
在一些实施方案中，所述疾病或病症是KRAS+癌症。所述KRAS+癌症可以是肺癌。所述KRAS+癌症可以是肾癌。在一些实施方案中，所述抗癌剂是脂肪酸合酶抑制剂。所述抗癌剂可以是脂肪生成酶抑制剂。在一些实施方案中，参考水平是KRAS-肿瘤或正常组织中ppERK1和pERK1的水平和/或复合甘油磷脂和游离脂肪酸的水平。
在一些实施方案中，所述临床样品是血液样品。在一些实施方案中，所述临床样品是活检样品。所述活检样品可从肿瘤获得。在一些实施方案中，所述临床样品包含少于100,000个细胞。在一些实施方案中，所述临床样品包含少于1,000个细胞。所述临床样品可包含少于100个细胞。可通过细针抽吸获得所述临床样品。在一些实施方案中，使所述临床样品预先冷冻。在一些实施方案中，在进行NIA和/或DESI-MSI之前，使所述临床样品预先在冰上超过30分钟。
在一些方面，本公开提供了一种治疗或减轻有需要的受试者的癌症KRAS+癌症的方法，所述方法包括：将癌细胞移植到动物的部位中；从所述部位移除所述癌细胞的一部分；用有效量的抗癌剂离体治疗所述部分以产生经治疗的部分；对所述经治疗的部分进行纳米流体蛋白质组学免疫测定(NIA)和/或解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)；以及测量所述部分中的ERK1磷酸同种型和/或脂质种类。
在一些实施方案中，所述动物是小鼠。在一些实施方案中，所述方法还包括对所述部分进行纳米流体蛋白质组学免疫测定(NIA)和/或解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)；以及在用所述抗癌剂治疗之前，测量所述部分中的ERK1磷酸同种型和/或脂质种类。
附图说明
结合附图阅读以下详细描述时可最透彻地理解本发明。要强调的是，根据惯例，附图的各种特征不是按比例的。相反，为清楚起见，各种特征的尺寸任意地放大或缩小。附图中包括以下各图。
图1A-1C KRAS诱导的小鼠肺癌中的脂肪生成。图1A示出肺癌中脂肪酸合成基因的上调的微阵列分析。图1B正常小鼠肺组织与KRAS活化的小鼠肺组织之间统计学上最显著差异表达的15种。图1C正常小鼠肺组织(n＝2)与KRAS活化的小鼠肺组织(n＝5)中的基因表达。通过t检验的统计显著性指示**p值<0.01。
图2A-2B相对mRNA表达：图2A正常对比人KRAS相关的肺癌(n＝12)，以及图2B正常对比人非KRAS肺癌(n＝14)。通过t检验的统计显著性指示*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001。
图3A-3D NIA ERK蛋白质特征(signature)：图3A正常对比人KRAS相关的肺癌组织(n＝6)；图3B正常对比人非KRAS肺癌组织(n＝6)；以及图3C KRAS肿瘤中和图3D非KRAS肿瘤中总ERK的百分比。通过t检验的统计显著性指示*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001。
图4脂质的DESI质谱：与正常小鼠肺组织(下图)和相应的代表性质谱相比，在小鼠肿瘤病灶(上图)中过表达的若干脂质种类的图像。
图5A-5B在人肺癌细胞系(n＝3)中在图5A通过SCH772984进行ERK抑制(n＝3)和图5B通过FTS进行KRAS抑制后FASN和SCD的相对mRNA表达。误差条代表来自学生t分布的95％置信区间。通过未配对双样品t检验的统计显著性由*指示p值<0.05；**指示p值<0.01。
图6A-6B在人肺癌细胞系图6A A549和图6B H1299(对于每种细胞系n＝3)中通过浅蓝菌素抑制FASN后增殖的遏制。当与对照相比时在第4天通过t-检验的统计显著性由*指示p值<0.05；**指示p值<0.01；***指示p值<0.001。
图7在微阵列分析中使用的所有代谢基因的列表。对图1A的补充。
图8DESI-MSI仪器设置。
图9基于四环素的条件性致癌基因活化。在不存在多西环素(dox)的情况下，可逆四环素反式活化因子(rtTA)不能结合tetO序列，因此不会发生致癌基因表达。当添加dox时，rtTA结合dox并经历构象变化，这允许其结合tetO序列并活化致癌基因表达。这种系统用于在转基因小鼠模型中条件性地活化致癌基因表达。
图10实体型腺瘤病灶的DESI-MSI图像和代表性质谱。成像的组织的H&E染色证实若干具有腺瘤的区域，所述区域以红色标记。
图11用于鉴定分子离子的串联质谱数据。抑制脂肪生成途径。
图12脂肪酸的产生可通过抑制酶脂肪酸合酶(FASN)的抑制剂浅蓝菌素进行遏制。
图13人肺腺癌样品。
图14用于实时PCR的引物。
图15ERK同种型的患者内和患者间变异性。39名患者各自具有通过细针抽吸取样的其肾脏肿瘤的2-3个区域。使用NIA测量每个FNA中的ERK同种型。每个圆圈是在技术重复中平均的肿瘤FNA(N＝91个FNA)。来自每个患者的样品通过垂直线连接。患者按ERK2样品内的平均值排序。在同种型中，技术重复内的变化具有1％的平均标准偏差。在来自同一肿瘤的不同区域的样品中，样品之间的变化具有6％的平均标准偏差。相比之下，跨不同患者的测量的比例的标准偏差在同种型中在5％至22％的范围内。
图16是示出ERK2在肺癌CTC中高度磷酸化的图形表示。
图17示出法呢基硫代水杨酸(FTS)阻断质膜处的Ras结合。
图18示出FTS治疗抑制体内ERK活化(NIA分析)。
图19示出BCL2+Ras失活在体内诱导BCL2淋巴瘤中的细胞凋亡(连续FNA)。
图20示出BCL2和ras的失活比单独使任一致癌基因失活更有效地抑制肿瘤生长。
图21示出通过DOX使BCL2失活并且通过FTS使RAS失活比单独使任一致癌基因失活更有效地抑制肿瘤生长。
图22示出来自转基因淋巴瘤的FNA中的ERK同种型的NIA分析。
图23示出来自转基因淋巴瘤的FNA中的ERK同种型的NIA分析。
图24示出ERK数据(阿托伐他汀治疗之前和之后)。
图25示出MEK数据(阿托伐他汀治疗之前和之后)。
图26示出阿托伐他汀引起九名NHL患者中的四名中三磷酸-MEK1的显著变化。
图27示出阿托伐他汀引起九名NHL患者中的四名中二磷酸-MEK1的显著变化。
图28示出阿托伐他汀引起九名NHL患者中的四名中单磷酸-MEK1的显著变化。
图29示出对利戈舍替(Rigosertib)治疗的治疗性响应中的Erk活性。
图30示出利戈舍替的作用机制。
图31示出利戈舍替治疗的过程。
图32示出利戈舍替减少头颈部鳞状细胞癌中的Erk途径。
具体实施方式
提供了用于检测和治疗具有KRAS突变的癌症的方法，所述KRAS突变可驱动癌症中的肿瘤发生。KRAS+癌细胞可通过以下中的一项或多项与KRAS-癌细胞以及正常对应组织区分开：(a)检测脂肪酸合酶(FASN)的上调的基因表达；(b)检测改变的ERK1磷酸同种型；以及(c)检测独特脂质特征的诱导。可通过确定癌细胞的KRAS+表型来选择个体进行治疗。这种治疗可包括抑制FASN表达或酶活性。
定义
应了解本发明不限于本身可能变化的所述特定方法、方案、细胞系、动物物种或属类和试剂。还应了解本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，且不意图限制本发明的范围，本发明的范围将仅由随附权利要求限定。
除非上下文另外明确规定，否则如本文所用，单数形式“一个\一种”和“所述”包括复数个指示物。因此，例如，对“一种化合物”的提及包括多种此类化合物并且对“所述剂”的提及包括提及一种或多种剂和本领域技术人员已知的其等效物，等等。除非另外明确指示，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解相同的含义。
KRAS。密码子12和13处KRAS的突变在约15％-50％的NSCLC患者中发生。已知大约30％至50％的结肠直肠肿瘤具有突变的KRAS基因。本文提供的方法通常涉及KRAS驱动因子在癌症中的表型效应。然而，替代方法包括例如这些基因的基因型的分析。用于检测突变的传统方法涉及通过肿瘤组织的直接DNA测序进行筛选。桑格(Sanger)测序技术可用于大多数分子诊断实验室中，并且它具有检测跨基因的改变(包括新型变体)的独特优势。最近的方法集中于突变的靶向筛选，以实现更快速、稳健和敏感的测试。分子诊断实验室目前使用多种方法，包括扩增受阻突变系统、焦磷酸测序、智能扩增方法、高分辨率熔解分析和限制性片段长度多态性，仅举几例。这些方法都区分目标区域内的突变体和野生型DNA。
用于此目的的市售测试是therascreen KRAS RGQ(Rotor-Gene Q)PCR(聚合酶链式反应)试剂盒。可对来自原发性肿瘤或转移的福尔马林固定的、石蜡包埋的组织进行针对KRAS基因的密码子12或13中的的突变的测试。
肺腺癌。肺腺癌是非小细胞肺癌的子集并且占所有肺癌的约35％-40％。症状可包括咳嗽、胸部不适或疼痛、体重减轻以及不太常见的咯血；然而，许多患者存在转移性疾病而没有任何临床症状。诊断通常通过胸部x射线或CT进行并通过活检确认。
呼吸道上皮细胞需要在变得赘生性(称为区域性致癌的效应)之前长时间暴露于癌症促进剂以及累积多种基因突变。在一些患有肺癌的患者中，刺激细胞生长(K-ras，MYC)、引起生长因子受体信号传导(EGFR，HER2/neu)的异常并抑制细胞凋亡的基因中的继发性或另外突变促成异常细胞的增殖。此外，抑制肿瘤遏制基因(p53，APC)的突变可导致癌症。可能负责的其他突变包括EML-4-ALK易位以及ROS-1、BRAF和PI3KCA中的突变。
虽然致癌驱动突变可导致或促成吸烟者中的肺癌，但这些突变特别可能是非吸烟者中肺癌的原因，并且主要在腺癌中鉴定。在2014年，肺癌突变联盟(LCMC)在吸烟者和非吸烟者中发现了733例肺癌中64％中的驱动突变(25％K-ras突变，17％EGFR突变，8％EML-4-ALK以及2％BRAF突变)。
NSCLC的临床表现更加可变并且取决于组织学类型，但是在诊断时约40％的患者将在胸部以外具有转移性疾病。已经主要在腺癌中鉴定了致癌驱动突变，尽管正在尝试鉴定鳞状细胞癌中的类似突变。
I期和II期的常规治疗是有或无辅助化学疗法的外科手术；在IIIA期有或无辅助化学疗法或同时化学疗法或放射疗法的外科手术、化学疗法加放射疗法和外科手术、化学疗法与手术或化学疗法加放射疗法；在IIIB期：有或无化学疗法的放射疗法；并且在IV期：有或无姑息性放射疗法的系统性靶向疗法或化学疗法。
外科手术后的辅助化学疗法现在是用于II期或III期疾病患者并且可能也是用于IB期疾病且肿瘤>4cm的患者的标准实践。常用的化学疗法方案是基于顺铂的双联体(顺铂与另一种化学疗法药物如长春瑞滨、多西他赛、紫杉醇的组合)。早期NSCLC的新辅助(术前)化学疗法也是常用的并且由4个周期的顺铂-双联体组成。在不能接受顺铂的患者中，可用卡铂代替。
5年存活率随着分期不同而不同，从对于患有I期疾病的患者60％至70％至对于患有IV期疾病的患者<1％。平均而言，未经治疗的患有转移性NSCLC的患者存活6个月，而经治疗患者的中值存活期为约9个月。最近，患者存活率在早期和晚期NSCLC中均有所提高。证据显示在手术切除后使用基于铂的化学疗法方案时早期疾病(IB至IIIB期)的存活率提高。此外，靶向疗法改善了患有IV期疾病的患者，特别是具有EGFR突变、EML-4-ALK和ROS-1易位的患者的存活。
对于携带致癌驱动突变的肿瘤，首先使用抑制剂。在具有敏感性EGFR突变(即缺失外显子19、外显子21L858突变)的IV期患者中，EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)可作为一线疗法给予；响应率和无进展存活率优于使用标准化学疗法获得的响应率和无进展存活率。EGFR TKI包括吉非替尼和埃罗替尼。具有EML-4-ALK易位的患者应接受克唑替尼(一种ALK和ROS-1抑制剂)。可向具有ALK突变的患者给予艾乐替尼或色瑞替尼。可向具有ROS-1突变的患者给予克唑替尼或埃罗替尼。具有BRAF突变的患者可受益于BRAF抑制剂(例如，威罗菲尼)。类似地，具有PI3K突变的患者可预期对正在开发的PI3K抑制剂有响应。本文描述的任何方法可用于治疗或减轻肺癌。
肾癌。肾癌是在肾脏中的细胞中开始的一种类型的癌症。两种最常见类型的肾癌是肾盂的肾细胞癌(RCC)和移行细胞癌(TCC)(也称为尿路上皮细胞癌)。不同类型的肾癌(如RCC和TCC)以不同的方式发展，这意味着疾病具有不同的长期结果，并且需要以不同的方式进行分期和治疗。RCC是大约80％的原发性肾癌的原因，并且TCC占其余部分的大部分。
肾癌的最常见病征和症状是腹部中的肿块和/或尿液中的血液(或血尿)。其他症状可包括疲倦、食欲不振、体重减轻、高温和大量出汗以及腹部的持续疼痛。然而，许多这些症状可由其他疾患引起，并且患有肾癌的人中也可能没有任何病征或症状，尤其是在疾病的早期阶段。
肾癌的治疗取决于疾病的类型和分期。外科手术是最常见的治疗方法，因为肾癌通常不对化学疗法和放射疗法有响应。其他治疗选择包括生物疗法，如依维莫司、驮瑞塞尔(torisel)、蕾莎瓦(nexavar)、索坦(sutent)和阿西替尼(axitinib)、免疫疗法(包括干扰素和白细胞介素-2)的使用。本文描述的任何方法可用于治疗或减轻肾癌。
FASN抑制剂。均为早期小分子FASN抑制剂的浅蓝菌素和C75已经证明显著抗肿瘤活性。浅蓝菌素是从Cephalosporium caerulens分离的；它含有与FASN的酮酰基合酶结构域反应的环氧基。它是据发现抑制乳腺癌细胞系中的FASN、诱导程序性细胞死亡并且延迟卵巢癌异种移植物模型中的疾病进展的首批化合物之一；其细胞毒性作用取决于FASN活性水平。C75是在浅蓝菌素之后设计的，以克服其化学不稳定性。C75是一种弱的、不可逆的FASN抑制剂，其与β-酮酰基合酶、烯酰基还原酶和硫酯酶结构域相互作用。最近，更有效的C75类似物已被设计为FASN抑制剂。
若干天然植物来源的多酚已经显示抑制FASN，包括表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)和类黄酮木犀草素、紫杉叶素、山柰酚、槲皮素和芹菜素。最佳表征的多酚FASN抑制剂之一是EGCG(绿茶的一种天然成分)。EGCG是FASN酮酰基还原酶结构域的高微摩尔时间依赖性抑制剂。虽然EGCG是一种靶向多种信号传导途径的混杂抑制剂，但其诱导细胞凋亡的作用似乎与其在FASN处的活性相关。另一种化合物木犀草素对多酚的脂肪生成具有最大作用并且直接抑制FASN。它与PI3K抑制剂具有结构同源性并且具有强抗氧化活性。最近，已开发出更有效的EGCG类似物。
奥利司他是最初作为抗肥胖药物开发的US FDA批准的胰脂肪酶抑制剂，并且是FASN的有效抑制剂。奥利司他是与FASN硫酯酶结构域的活性丝氨酸形成共价加合物的一种不可逆的抑制剂。
最近开发了C93(或FAS93)(一种在细菌FabB抑制剂硫代乳霉素后设计的合成FASN抑制剂)作为克服C75的效力缺乏和副作用的努力的一部分。C247属于与C93相同类别的化合物，并且也在乳腺癌的转基因模型中显示出功效且没有体重减轻的副作用。还开发了一种新的口服可用的FASN抑制剂FAS31。
已经通过高通量筛选或药物化学程序鉴定了高效FASN抑制剂。例如，默克(Merck)的一个研究小组开发了一系列3-芳基-4-羟基喹啉-2(1H)-酮衍生物，而阿斯利康(AstraZeneca)的另一个研究小组开发了一系列双酰胺衍生物作为FASN抑制剂。通过葛兰素史克(GlaxoSmithKline)的高通量筛选，二苯磺酰胺脲GSK837149A被鉴定为低纳摩尔FASN抑制剂。对天然产物提取物的系统筛选导致分离出具有广谱革兰氏阳性抗菌活性的作为细菌FabF/B的有效抑制剂的平板霉素。
NIA。在一些实施方案中，提供了用于纳米流体蛋白质组学免疫测定(NIA)(包括癌症的系列分析)的方法。NIA检测准确地测量有限临床样本中的癌蛋白表达和活化，包括特别是在磷酸化方面不同的ERK同种型。NIA检测方法将等电蛋白质聚焦和抗体检测组合在纳米流体系统中。在一些实施方案中，检测ppERK1和pERK1同种型的存在指示KRAS+癌症。如果样品不是限制性的，则可通过NIA或通过常规方法检测同种型。
样品可在单个时间点取得，或者可在多个时间点取得。样品可小至100,000个细胞、小至5000个细胞、小至1000个细胞、小至500个细胞、小至100个细胞、小至50个细胞或更小。在一些实施方案中，所述样品是细针抽吸物(FNA)。FNA在医师判断下进行。此程序需要将小规格针头(通常是21至25号针头)插入肿块中以移除细胞样品进行显微镜评估。所述程序应使用缝纫机般的偏移进行，同时施加最小的负压(需要不超过0.5cc的吸力。)
活检样品。特别是细针抽吸物(FNA)可在从患者获得后在冰上保持超过30分钟、或超过60分钟、通常不超过约120分钟。对于本文所述的任何方法，临床样品如肿瘤细胞样品可在冰上保持超过30分钟或超过60分钟、通常不超过约120分钟，然后进行NIA和/或DESI-MSI以测定ERK1磷酸同种型和/或脂质种类的水平和/或比例。通常维持样品而不溶解细胞或红细胞。当在约-80℃下冷冻储存长时间段时，样品或其溶解产物是稳定的。因此，在本发明的一些实施方案中，对先前冷冻的样品进行分析。
在分析之前使细胞溶解，所述细胞可以是暴露于目标剂或条件后的细胞。溶解方法是本领域已知的，包括超声处理、非离子表面活性剂等。非离子表面活性剂包括TritonTM家族的洗涤剂，例如TritonTM X-15；TritonTM X-35；TritonTM X-45；TritonTM X-100；TritonTM X-102；TritonTM X-114；TritonTM X-165等。BrijTM洗涤剂在结构上也与TritonTMX洗涤剂相似，在于它们具有与疏水链附接的不同长度的聚氧乙烯链。TweenTM洗涤剂是非变性非离子洗涤剂，所述洗涤剂是脂肪酸的聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯。TweenTM 80源自具有C18链的油酸，而TweenTM 20源自具有C12链的月桂酸。两性离子洗涤剂CHAPS是胆酸的磺基甜菜碱衍生物。BICINE(二羟乙基甘氨酸)是可用CHAPS配制的两性离子氨基酸缓冲液。当蛋白质活性重要时，这种两性离子洗涤剂和缓冲剂可用于膜蛋白溶解。使表面活性剂与细胞接触足以溶解细胞并从系统中除去另外的粘附细胞的一段时间。
细胞分级分离的方法也是本领域已知的。亚细胞分级分离由两个主要步骤组成，细胞组构的破坏(溶解)和匀浆的分级分离以分离不同的细胞器群体。然后可通过差速离心将这种匀浆分解成主要含有以下的若干级分：(1)细胞核、重线粒体、细胞骨架网络和质膜；(2)轻线粒体、溶酶体和过氧化物酶体；(3)高尔基体、内体和微粒体以及内质网(ER)；以及(4)细胞溶质。每个细胞器群体通过分离所依赖的大小、密度、电荷和其他性质进行表征。
等电聚焦蛋白质与特异性结合成员结合。对于相对比率测量，可使用识别蛋白质的所有同种型的单一泛特异性抗体，例如泛特异性ERK抗体等。测定蛋白质(例如，ERK2、Erk1等)的总量，并使用NIA来计算磷酸化的百分比。NIA产生峰，并且通过在峰开始和结束时将垂直线下降到基线并且将起点与终点之间的面积相加来计算每个峰的面积。对于标准化值测量，使用类似的方法，但另外所述测定使用针对目标蛋白质的抗体(例如泛特异性ERK抗体)和负载对照抗体(例如HSP-70抗体)等用于标准化。NIA用于区分不同的同种型。
可在疑似为肿瘤组织的组织与配对的正常或肿瘤上对照组织(例如疑似肺腺癌样品对比邻近的非肿瘤皮肤样品等)之间进行比较。还可使用时间序列的样品(例如在治疗之前和之后等)与参考肿瘤组织进行比较。比率可以是非肿瘤/肿瘤或肿瘤/非肿瘤。在一些实施方案中，比率提供比肿瘤或正常的单次测量更具预测性或诊断性的生物标志物。
在一些实施方案中，NIA用于监测磷酸化的变化。绝大多数磷酸化作为调控蛋白质的生物活性的机制发生，并且因此是短暂的。在动物细胞中，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸是遭受磷酸化的氨基酸。最大的激酶组是使丝氨酸或苏氨酸磷酸化的那些，并且因此被称为丝氨酸/苏氨酸激酶。对于丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸，三种不同氨基酸的磷酸化的比率是大约1000/100/1。尽管酪氨酸磷酸化的水平较小，但这种氨基酸的磷酸化的重要性是深远的。作为实例，许多生长因子受体的活性受酪氨酸磷酸化控制。
DESI-MSI。在一个实施方案中，进行解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)，以分析疑似或已知为KRAS+癌细胞(包括肺腺癌细胞)的癌细胞中KRAS驱动的代谢。DESI-MSI是用于组织代谢的实时原位分析的成熟技术。用含有二甲基甲酰胺和乙腈的1:1混合物的带电微滴(其通过电喷雾产生)轰击组织切片，从而使组织样品中的脂质和代谢物被溶解和提取。喷雾对样品的持续影响然后产生含有溶解的分析物的二次微滴的飞溅，所述二次微滴被质谱仪捕获。基于质谱分析创建组织切片的二维化学图谱。
在观察到大多数复合甘油磷脂的m/z区700-1000中，在KRAS+癌细胞中检测到m/z745.5034,PG(18:1/16:1)；m/z 747.5190,as PG(18:1/16:0)；m/z 793.5023,PG(18:2/20:4)；以及m/z 865.5034,PG(22:6/22:6)的相对丰度和总丰度的增加。还观察到m/z 200-400中游离脂肪酸的相对丰度和总丰度的变化，包括m/z 255.2339，棕榈酸FA(16:0)；m/z281.2490，油酸FA(18:1)；m/z 303.2333，花生四烯酸FA(20:4)；以及m/z 327.2334；二十二碳六烯酸FA(22:6)。这些种类的总丰度和相对丰度在正常组织中显著低于癌组织。
提供组织用于分析的哺乳动物物种包括犬科动物；猫科动物；马；牛；绵羊等以及灵长类动物，特别是人。动物模型，特别是小型哺乳动物，例如鼠科动物、兔类等可用于实验研究。目标动物模型包括用于肿瘤模型、免疫响应性等的动物模型。
在本发明的一个实施方案中，NIA用于通过确定癌症是否是KRAS+癌症来指导用于治疗的患者适当剂的选择。本发明的一个特别的优点是能够提供个体化诊断，从而利用小样品大小来评估随时间推移的癌症表达模式。
从NIA或DESI-MSI获得的信息用于监测治疗、修改治疗方案并进一步优化治疗剂的选择。使用这种方法，治疗和/或诊断方案可根据在治疗过程内的不同时间获得的数据进行个体化和定制。
出于本发明的目的，“患者”包括人和其他动物，特别是哺乳动物，包括宠物和实验室动物，例如小鼠、大鼠、兔等。因此，所述方法可适用于人疗法和兽医学应用。在一个实施方案中，患者是哺乳动物，优选灵长类动物。在其他实施方案中，患者是人。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用来指正在评估治疗和/或正在治疗的哺乳动物。在一个实施方案中，哺乳动物是人。术语“受试者”、“个体”和“患者”包括但不限于患有癌症的个体。受试者可以是人，而且还包括其他哺乳动物，特别是适用作人疾病的实验室模型的那些哺乳动物，例如小鼠、大鼠等。
术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”在本文中可互换使用来指表现出自主的不受调控的生长、这样使得它们表现出异常生长表型的细胞，所述异常生长表型的特征在于对细胞增殖的控制的显著丧失。本申请中用于检测或治疗的目标细胞包括癌前细胞(例如，良性细胞)、恶性细胞、转移前细胞、转移细胞和非转移细胞。几乎每种组织的癌症都是已知的。短语“癌症负担”是指受试者中癌细胞的量或癌症体积。因此，减轻癌症负担是指减少受试者中癌细胞的数量或癌症体积。如本文所用的术语“癌细胞”是指为癌细胞或源自癌细胞的任何细胞，例如癌细胞的克隆。许多类型的癌症是本领域技术人员已知的，包括实体瘤如癌、肉瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、淋巴瘤、骨髓瘤等；以及循环癌症如白血病。癌症的实例包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲状腺癌、肾癌、癌、黑素瘤、头颈部癌和脑癌。
癌症的“病理学”包括损害患者健康的所有现象。这包括但不限于异常或不可控制的细胞生长、转移、干扰邻近细胞的正常功能、细胞因子或其他分泌产物以异常水平释放、遏制或加剧炎症或免疫响应、瘤形成、癌前病变、恶性肿瘤、侵袭周围或远处组织或器官如淋巴结等。
如本文所用，术语“癌症复发”和“肿瘤复发”及其语法变体是指在诊断癌症后赘生性细胞或癌细胞的进一步生长。特别地，当在癌组织中发生进一步的癌细胞生长时可发生复发。类似地，“肿瘤扩散”在肿瘤细胞播散到局部或远处组织和器官中时发生；因此，肿瘤扩散包括肿瘤转移。当肿瘤生长局部扩散以通过压迫、破坏或阻止正常器官功能来损害所涉及组织的功能时，发生“肿瘤侵袭”。
如本文所用，术语“转移”是指器官或身体部分中的癌性肿瘤的生长，其不直接连接至原始癌性肿瘤的器官。转移将被理解为包括微转移，其是在器官或身体部分中存在不可检测量的癌细胞，其不直接连接至原始癌性肿瘤的器官。转移也可被定义为过程的若干步骤，如癌细胞从原始肿瘤部位离开以及癌细胞迁移和/或侵入身体的其他部分。
关于患者的术语“样品”包括生物起源的血液和其他液体样品、固体组织样品如活检样本或源自其的组织培养物或细胞及其子代。所述定义还包括在其取得之后以任何方式操作的样品，如用试剂处理、洗涤或针对某些细胞群体如癌细胞来加以富集。所述定义还包括已经富集特定类型的分子(例如核酸、多肽等)的样品。术语“生物样品”涵盖临床样品，并且还包括通过手术切除获得的组织、通过活检获得的组织、培养物中的细胞、细胞上清液、细胞溶解产物、组织样品、器官、骨髓、血液、血浆、血清等。“生物样品”包括从患者的癌细胞获得的样品，例如，包含从患者的癌细胞获得的多核苷酸和/或多肽的样品(例如，细胞溶解产物或包含多核苷酸和/或多肽的其他细胞提取物)；以及包含来自患者的癌细胞的样品。包含来自患者的癌细胞的生物样品也可包括非癌性细胞。
术语“诊断”在本文用于指分子或病理状态、疾病或疾患的鉴定，如乳腺癌、前列腺癌或其他类型的癌症的分子亚型的鉴定。
术语“预后”在本文用于指预测肿瘤性疾病(如卵巢癌)的癌症可归因的死亡或进展(包括复发、转移性扩散和耐药性)的可能性。术语“预测”在本文用于指基于观察结果、经验或科学推理的预言或估计行为。在一个实例中，医生可预测在手术切除原发性肿瘤和/或化学疗法一定时间段之后患者将存活而无癌症复发的可能性。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等是指为了获得作用而施用剂或进行手术。作用就完全或部分预防疾病或其症状而言可为预防性的和/或就实现部分或完全治愈疾病和/或疾病的症状而言可为治疗性的。如本文所用，“治疗”可包括对哺乳动物，特别是人的肿瘤的任何治疗，并且包括：(a)预防所述疾病或疾病的症状在可易患所述疾病但尚未诊断为患有所述疾病的受试者中发生(例如，包括可与原发性疾病相关或由原发性疾病引起)；(b)抑制所述疾病，即遏止其发展；以及(c)减轻所述疾病，即导致所述疾病消退。
治疗可指成功治疗或改善或预防癌症的任何征候，包括任何客观或主观参数，如减轻；缓解；削弱症状或使疾病病状更可被患者耐受；减缓退化或衰退的速率；或使退化终点的致虚弱性较小。症状的治疗或改善可基于客观或主观参数；包括医生检查的结果。因此，术语“治疗”包括施用本发明的化合物或剂以预防或延迟、减轻或遏止或抑制与癌症或其他疾病相关的症状或病状的发展。术语“治疗作用”是指减轻、消除或预防受试者的疾病、疾病的症状或疾病的副作用。
“与......组合”、“组合疗法”和“组合产物”在某些实施方案中是指向患者同时施用第一治疗剂和如本文所用的化合物。当组合施用时，每种组分可同时施用或在不同时间点以任何顺序依次施用。因此，每种组分可分开施用，但在时间上足够接近以提供所需的治疗作用。
癌症治疗药物、免疫肿瘤学剂、肿瘤定向抗体等与FASN抑制剂组合的“伴随施用”意指在使得所述药物、抗体和本发明的组合物将具有治疗作用的这种时间与FASN抑制剂一起施用。这种伴随施用可涉及相对于施用本发明化合物，所述药物或抗体的同时(即同时)、之前或之后施用。本领域普通技术人员将毫无困难地确定本发明的特定药物和组合物的适当施用时机、顺序和剂量。
如本文所用，治疗的终点将给予本领域已知以及食品和药品管理局所使用的含义。
总体存活期被定义为从任何原因随机化直至死亡的时间，并在意向治疗群体中进行测量。存活被认为是最可靠的癌症终点，并且当可进行研究以充分评估存活时，它通常是优选的终点。此终点精确且易于测量，由死亡日期记录。偏差不是终点测量的因素。应将存活改善分析为评估临床益处的风险-效益分析。可在随机化受控研究中评价总体存活率。如果毒性概况是可接受的，并且通常支持新药物批准，则可认为总体存活率的统计上显著的改善的证明具有临床意义。本发明方法的益处可包括患者的总体存活增加。
基于肿瘤评估的终点包括DFS、ORR、TTP、PFS和治疗失败时间(TTF)。关于这些时间依赖性终点的数据的收集和分析是基于间接评估、计算和估计(例如，肿瘤测量值)。无疾病存活(DFS)被定义为从随机化直到肿瘤复发或因任何原因死亡的时间。这种终点的最频繁使用是在确定性手术或放射疗法后的辅助治疗中。当大部分患者通过化学疗法实现完全响应时，DFS也可能是重要的终点。
客观响应率。ORR被定义为肿瘤大小减小预定量且持续最小时间段的患者的比例。响应持续时间通常从初始响应直到记录的肿瘤进展的时间进行测量。通常，FDA已将ORR定义为部分响应加完全响应的总和。当以这种方式定义时，ORR是药物抗肿瘤活性的直接量度，其可在单臂研究中评价。
进展时间和无进展存活。TTP和PFS已成为药物批准的主要终点。TTP被定义为从随机化直到客观肿瘤进展的时间；TTP不包括死亡。PFS被定义为从随机化直到客观肿瘤进展或死亡的时间。肿瘤进展的准确定义是重要的并且应在方案中仔细详述。
如本文所用，术语“相关”或“与......相关”和类似术语是指两个事件的实例之间的统计关联，其中事件包括数字、数据集等。例如，当事件涉及数字时，正相关(本文也称为“直接相关”)意指当一个增加时，另一个也增加。负相关(本文也称为“逆相关”)意指当一个增加时，另一个减少。
“剂量单位”是指适合作为待治疗的特定个体的单一剂量的物理上离散的单位。每个单位都可含有与需要的药物载体结合的经计算产生所需治疗作用的预定量的活性化合物。剂量单位形式的规格可通过(a)所述活性化合物的独特特性和要获得的特定治疗效果，和(b)在合成这些活性化合物的领域中固有的限制来规定。
“药学上可接受的赋形剂”是指适用于制备药物组合物的通常安全、无毒且合乎需要的赋形剂，并且包括可为兽医学用途以及人医药用途所接受的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体，或在气雾剂组合物的情况下可为气体。
“药学上可接受的盐和酯”是指药学上可接受的并具有所需药理学特性的盐和酯。此类盐包括可以形成的盐，其中存在于化合物中的酸性质子能够与无机碱或有机碱反应。适合的无机盐包括用碱金属形成的那些，所述碱金属例如钠和钾、镁、钙以及铝。适合的有机盐包括用有机碱形成的那些，所述有机碱诸如胺碱，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N甲基葡糖胺等。此类盐还包括用无机酸(例如，盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如，乙酸、柠檬酸、马来酸、以及烷烃-和芳烃-磺酸诸如甲烷磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。药学上可接受的酯包括由存在于化合物中的羧基、磺酰基和膦酰基形成的酯，例如，C1-6烷基酯。当存在两个酸性基团时，药学上可接受的盐或酯可以是单酸单盐或酯或二盐或酯；并且类似地在存在超过两个酸性基团时，一些或所有此类基团可以被盐化或酸化。本发明中命名的化合物可以未盐化或未酯化形式、或以盐化和/或酯化形式存在，并且此类化合物的命名意图包括初始(未盐化和未酯化)化合物及其药学上可接受的盐和酯。此外，本发明中命名的某些化合物可以超过一种立体异构形式存在，并且此类化合物的命名意图包括所有单一立体异构体和此类立体异构体的所有混合物(外消旋的或其它的)。
术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”以及其语法变型当是指组合物、载体、稀释剂和试剂时可互换使用并且表示材料能够施用至或施用于人类而不会产生将禁止施用该组合物的程度的不期望的生理作用。
“治疗有效量”意指在向受试者施用以用于治疗疾病时，足以实现对所述疾病的治疗的量。
方法
提供了用于诊断和治疗原发性或转移性癌症或减少原发性或转移性癌症的生长的方法，所述原发性或转移性癌症尤其包括KRAS驱动的上皮癌，例如肺腺癌、结直肠癌等，特别是肺腺癌。
KRAS+癌细胞可通过检测改变的ERK1磷酸同种型和/或检测独特脂质特征的诱导而与KRAS阴性癌细胞以及正常对应组织区分开。可通过确定癌细胞的KRAS+表型来选择个体进行治疗，例如通过用脂肪酸合成酶的抑制剂或脂肪生成酶的其他抑制剂治疗。
在一个实施方案中，应用纳米流体蛋白质组学免疫测定(NIA)来定量来自疑似为KRAS+肿瘤的肿瘤(包括KRAS+肺腺癌细胞)的少量溶解产物中的ERK1磷酸同种型。通过NIA，ERK1与ERK2蛋白活化允许区分临床样本中的KRAS阳性和阴性肿瘤。具体地，发现当与总ERK蛋白水平相比时并且相对于正常组织样品或KRAS阴性癌症，KRAS+肿瘤具有显著增加的ppERK1和pERK1水平。
在一个实施方案中，进行解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)，以分析疑似或已知为KRAS+癌细胞(包括肺腺癌细胞)的癌细胞中KRAS驱动的代谢。许多脂质种类的总丰度和相对丰度在正常组织中显著低于癌组织中。具体地，在观察到大多数复合甘油磷脂的m/z区700-1000中，在KRAS+癌细胞中检测到m/z 745.5034,PG(18:1/16:1)；m/z747.5190,asPG(18:1/16:0)；m/z 793.5023,PG(18:2/20:4)；以及m/z 865.5034,PG(22:6/22:6)的相对丰度和总丰度的增加。还观察到m/z 200-400中游离脂肪酸的相对丰度和总丰度的变化，包括m/z 255.2339，棕榈酸FA(16:0)；m/z 281.2490，油酸FA(18:1)；m/z 303.2333，花生四烯酸FA(20:4)；以及m/z 327.2334；二十二碳六烯酸FA(22:6)。这些种类的总丰度和相对丰度在正常组织中显著低于癌组织。
可将从癌细胞提取的NIA或DESI质谱的差异与正常细胞、KRAS-癌细胞、已知KRAS+癌细胞的参考等进行比较。可随时间推移从个体(包括用治疗癌症的治疗方案治疗的个体)获得多个样品并进行分析。还可例如在临床试验的背景下在患者群组中获得多个样品并进行分析。
在其他实施方案中，提供了用于治疗KRAS+肺腺癌的方法。可通过本文所述的方法对癌症进行分析，以在治疗前确定KRAS+表型。可通过本文所述的方法在治疗过程中对癌症进行分析，以确定就指示KRAS驱动的肿瘤发生的标志物而言疗法的有效性。治疗方法提供向有需要的患者施用有效剂量的脂肪酸合酶活性或脂肪酸合酶表达的抑制剂。如此处所示，FASN的抑制遏制人KRAS+肺癌细胞的增殖。在一些实施方案中，FASN的抑制剂在与外科手术、化学疗法、放射疗法、免疫肿瘤学疗法、靶向抗肿瘤抗体疗法等中的一种或多种的组合疗法中提供。癌细胞的接触可在体内进行(例如用于治疗目的)和体外进行(例如用于筛选测定等)。
用于治疗癌症的本发明的剂的有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者为人还是动物、所施用的其他药物和治疗为预防性还是治疗性。通常，患者是人，但也可治疗非人哺乳动物，例如伴侣动物如狗、猫、马等，实验室哺乳动物如兔、小鼠、大鼠等。可滴定治疗剂量以使安全性和功效最优化。
在一些实施方案中，每种剂的治疗剂量可在宿主体重的约0.0001至100mg/kg、并且更通常0.01至5mg/kg的范围内。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用一次。通常多次施用本发明的治疗性实体。单个剂量之间的间隔可为每周、每月或每年。间隔也可以是无规律的，如通过在患者中测量治疗性实体的血液水平所指示。或者，本发明的治疗性实体可作为缓释制剂施用，在此情况下要求不太频繁的施用。剂量和频率取决于患者中多肽的半衰期而变化。
在预防性应用中，可在长时间段内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生继续接受治疗。在其它治疗性应用中，有时要求相对较短间隔下的相对较高剂量直到疾病进展减少或终止为止，并且优选地直到患者显示疾病症状的部分或完全改善为止。此后，可以预防性的方式施用本专利品。
在仍然其他实施方案中，本发明的方法包括治疗、减少或预防癌症(包括癌、神经胶质瘤等)的肿瘤生长、肿瘤转移或肿瘤侵袭。对于预防性应用，将药物组合物或药物以足以消除或降低风险、减轻疾病的严重程度或延迟疾病的发作(包括所述疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在所述疾病的发展期间存在的中间病理学表型)的量施用于易患或否则处于疾病风险中的患者。
用于治疗癌症的组合物可通过肠胃外、局部、静脉内、肿瘤内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌内方式施用。典型施用途径是静脉内或肿瘤内，但其他途径可同样有效。
通常，组合物被制备为呈液体溶液或悬浮液形式的可注射物；也可制备适于在注射之前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。如上文所论述，制剂也可乳化或包封在脂质体或微粒如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物中以增强佐剂作用。Langer,Science 249:1527,1990和Hanes,Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119,1997。本发明的剂可呈可允许活性成分持续或脉动释放的方式配制的储库注射液或植入制剂的形式施用。药物组合物通常被配制为无菌、大致上等渗并且完全遵循美国食品药品管理局的所有药品生产质量管理规范(GMP)条例。
可通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中，例如通过测定LD50(对50％群体致死的剂量)或LD100(对100％群体致死的剂量)来确定本文所述的组合剂的毒性。毒性与治疗作用之间的剂量比是治疗指数。从这些细胞培养物测定和动物研究中获得的数据可用于配制对于在人种使用五毒的剂量范围。本文所述的蛋白质的剂量优选处于包括具有极小或无毒性的有效剂量的循环浓度的范围内。所述剂量可根据所采用的剂型和利用的施用路径而在此范围内变化。可由个体医师鉴于患者的病状来选择确切制剂、施用途径以及剂量。
药物组合物可取决于施用方法以各种单位剂型施用。例如，适用于口服施用的固体剂型包括但不限于粉末、片剂、丸剂、胶囊和锭剂。应认识到，当口服施用时，应保护本发明的组合物免于消化。这通常通过将分子与组合物络合以使所述分子对酸性和酶水解具有抗性，或通过将分子包装在适当的抗性载体(如脂质体或保护屏障)中来实现。保护蛋白质免于消化的方法在本领域中是熟知的。
用于施用的组合物通常将包含溶解于药学上可接受的载体，优选水性载体中的抗体或其它清除剂。可使用多种水性载体，例如，缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常不含不合需要的物质。这些组合物可通过常规的、众所周知的灭菌技术进行灭菌。所述组合物可含有接近生理条件所需要的药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的活性剂的浓度可广泛地变化，并且将根据所选的特定施用模式和患者的需求主要基于流体体积、粘度、患者体重等来选择(例如，Remington's Pharmaceutical Science(第15版,1980)和Goodman&Gillman,The Pharmacological Basis of Therapeutics(Hardman等人,编辑,1996))。
可施用所述组合物用于治疗性治疗。如上所述，组合物以足以基本上消除靶向细胞的量施用于患者。足以实现此目的的量被定义为“治疗有效剂量”，所述量可提供总体存活率的改善。可根据患者所需药和耐受的剂量和频率施用组合物的单次或多次给药。治疗所需的特定剂量将取决于哺乳动物的医学病状和病史以及其它因素，如年龄、体重、性别、施用途径、效率等。
实验
提供以下实施例以便向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完全公开和描述，并且以下实施例并非意图限制被视为本发明的事物的范围。已经努力确保关于所用数值(例如，量、温度、浓度等)的准确性，但应允许一些实验误差和偏差。除非另外指示，否则份是重量份，分子量是平均分子量，温度是以摄氏度计；并且压力是大气压或接近大气压。
实施例1
KRAS活化脂肪酸合酶，从而导致与肺腺癌相关的特异性ERK和脂质特征
KRAS基因突变导致肺腺癌。KRAS活化一直与改变的葡萄糖和谷氨酰胺代谢相关。在此，显示KRAS活化脂肪生成，并且这产生不同的蛋白质组和脂质特征。通过基因表达分析，显示KRAS与脂肪生成基因特征和脂肪酸合成酶(FASN)的特异性诱导相关。通过解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)，鉴定了脂肪生成和特定脂质的特定变化。通过纳米免疫测定(NIA)，发现KRAS活化蛋白质ERK2，而在非KRAS相关的人肺肿瘤中发现ERK1活化。浅蓝菌素(一种小分子抗生素)对FASN的抑制阻断了KRAS相关肺癌细胞的细胞增殖。因此，KRAS与ERK2的活化、FASN的诱导和脂肪生成的促进相关。FASN可能是KRAS相关肺的新靶点
使用转基因小鼠和人肺样本研究了由KRAS基因突变诱导的肺肿瘤。基因表达分析显示KRAS诱导脂肪酸合酶(FASN)，从而促进脂肪生成。通过解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)，在KRAS肺腺癌中发现了特异性脂质修饰。纳米免疫测定(NIA)鉴定了特异性KRAS相关的磷蛋白特征。显示KRAS活化ERK2蛋白，而非KRAS肺腺癌显示升高的ERK1。通过小分子浅蓝菌素抑制FASN，并且这阻断了KRAS驱动的肺癌细胞的细胞增殖。因此FASN抑制剂可提供用于治疗KRAS相关肺腺癌的有希望的治疗剂。
KRAS是RAS基因亚家族的成员，其通常在人癌症(包括肺腺癌)中发生突变。RAS基因编码膜定位的G蛋白，所述蛋白是若干信号传导级联(包括Raf-MEK-ERK信号转导途径)的组分。癌症中的大多数RAS突变导致GTP酶的组成型活化，从而导致细胞增殖。
已经显示KRAS活化改变葡萄糖和谷氨酰胺代谢。KRAS增加糖酵解通量，减少氧化性TCA循环通量，并且促进谷氨酰胺用于合成代谢途径。在人胰腺导管腺癌(PDAC)细胞中，KRAS抑制谷氨酸脱氢酶，所述谷氨酸脱氢酶将谷氨酰胺衍生的谷氨酸转化为α-酮戊二酸来为TCA循环提供燃料。KRAS还增加GOT1的表达，所述GOT1在产生NADPH的途径中将谷氨酰胺衍生的天冬氨酸转化为草酰乙酸。从使用谷氨酰胺来为TCA循环提供燃料到在非经典NADPH产生途径中使用谷氨酰胺的转变对于PDAC细胞的生长是必不可少的。这导致增加的NADPH/NADP+比率，从而维持氧化还原平衡。由KRAS引起的代谢变化被认为在癌症的增殖和存活中起重要作用。在这项研究之前，尚未确立KRAS对肺腺癌中的脂肪生成的调控。
质谱成像(MSI)(一种空间分辨的无标签成像技术)提供一种有吸引力的方式来可视化目标组织内众多已知和未知分子离子种类的分布，而无需分子预先鉴定。MSI作为能够从其正常对应物描绘出癌组织并对各种肿瘤进行分类的工具进行了广泛的研究。已经采用了若干MSI方法来描绘和分类肺瘤形成。最近提出了组织微阵列上的基质辅助激光解吸/电离(MALDI)成像用于将非小细胞肺癌的组织病理学亚分型为腺癌和鳞状细胞癌。气流辅助解吸电喷雾电离(AFADESI)MSI最近用于分子可视化术后人肺癌样本。
在这项研究中，使用了DESI-MSI用于分析KRAS驱动的肺部代谢。DESI-MSI是用于组织代谢的实时原位分析的成熟的、强大的技术。用含有二甲基甲酰胺和乙腈的1:1混合物的带电微滴(其通过电喷雾产生)轰击组织切片，从而使组织样品中的脂质和代谢物被溶解和提取。喷雾对样品的持续影响然后产生含有溶解的分析物的二次微滴的飞溅，所述二次微滴被质谱仪捕获。然后可基于质谱分析创建组织切片的二维化学图谱。DESI-MSI已被广泛用于探询淋巴瘤、肾细胞癌、甲状腺癌、胰腺癌、乳腺癌、脑癌和其他癌组织的脂质谱。
在此，组合了基因表达分析、纳米级蛋白质组学和质谱成像测定来研究KRAS突变与肺癌中的脂质特征之间的关系。对人患者样品的NIA分析用于检查KRAS对比非KRAS肺腺癌，以显示KRAS与磷酸-ERK2诱导相关。鼠KRAS肺模型的基因表达分析和DESI-MSI显示KRAS诱导参与脂肪生成的若干基因：固醇调控结合蛋白(SREBP1)、脂肪酸合酶(FASN)和硬脂酰辅酶A脱饱和酶(SCD)。由于脂肪酸合成的主要调控位点是在FASN上，所以决定抑制FASN以及已经显示出在抑制非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中的FASN方面的功效的其他酶。值得注意的是，结果显示用治疗剂阻断FASN预防KRAS相关的肺癌细胞增殖。因此，阻断FASN为治疗KRAS诱导的肺癌提供了新的治疗途径。
KRAS在小鼠和人肺腺癌中诱导脂肪生成。Tet系统用于在小鼠肺上皮中条件性地表达突变型KRAS基因，从而导致肺腺癌。检查了通过169个微阵列探针鉴定的13种代谢途径(图7)，并将结果绘制在热图中(图1A)。这些肿瘤的基因表达分析显示许多代谢基因的表达增加。发现脂肪酸合成途径中的大多数基因位于前15种最差异表达的基因中(图1B)。在显示被诱导的脂肪生成基因中，注意到三种特别重要的基因。FASN是脂肪酸合成的调控位点，并且SCD是所述途径中的最后一种酶(图1C)。SREBP是诱导参与脂肪酸、甲羟戊酸和胆固醇合成的基因的转录因子。通过qPCR证实了FASN、SCD和SREBP的诱导(图1C)。因此，KRAS诱导鼠肺腺癌中的脂肪生成途径。
接下来，在已知为KRAS阳性或阴性的人肺腺癌中检查了脂肪生成相关基因。KRAS阳性和阴性肿瘤均过表达脂肪生成基因(图2A，2B)。这可能反映了高增殖细胞中脂肪酸合成的必要性。SREBP在KRAS阴性肿瘤中升高更多，而SCD在KRAS阳性肿瘤中升高更多。FASN在两者中均高度上调。因此，在人KRAS相关肺腺癌中观察到脂肪生成基因的诱导。
KRAS阳性与阴性肿瘤均表现出独特的ERK蛋白质特征。KRAS活化ERK信号。发现KRAS阳性与阴性肺肿瘤均表现出ERK2与ERK1活化(图3A，3B)。与匹配的正常肺组织相比，KRAS阳性肿瘤表现出增加的pERK2a、pERK2b和ERK2，并且KRAS阴性肿瘤表现出增加的ppERK1和降低的ERK1水平(图3C和3D)。使用NIA，实现了KRAS对各种ERK磷酸同种型的不同活化之间的区分，这证实了通过KRAS诱导ERK的先前观察结果。
KRAS阳性肿瘤表现出独特的脂质谱。DESI-MSI在KRAS阳性小鼠和人肺腺癌上进行(参见图8)。从携带条件性KRAS活化系统的转基因小鼠模型中收获组织(参见图9)。显示来自KRAS诱导的肺腺癌的组织样品和对照正常肺组织的组织样品的代表性质谱和选择的二维离子图像(图4，图10)。如在KRAS诱导的肺腺癌样品的2D离子图像中所示(图4A)，在癌组织切片的特定区域中观察到脂质离子的高相对强度。H&E染色的邻近组织切片的组织病理学评价证实，高脂质强度区域与肿瘤细胞累积的区域强烈相关(图10)。
当与来自正常肺组织的光谱比较时，观察到从这些癌症区域提取的DESI质谱的差异(图4B)。例如，在观察到大多数复合甘油磷脂的m/z区700-1000中，检测到m/z 745.5034,PG(18:1/16:1)；m/z 747.5190,as PG(18:1/16:0)；m/z 793.5023,PG(18:2/20:4)；以及m/z865.5034,PG(22:6/22:6)的相对丰度和总丰度的增加。还观察到m/z 200-400中游离脂肪酸的相对丰度和总丰度的变化，包括m/z 255.2339，棕榈酸FA(16:0)；m/z 281.2490，油酸FA(18:1)；m/z 303.2333，花生四烯酸FA(20:4)；以及m/z 327.2334；二十二碳六烯酸FA(22:6)。所有鉴定均通过串联质谱法进行(图11)。虽然大多数这些脂质种类在邻近的正常组织和正常肺对照组织两者中都是常见的，但这些种类的总体和相对丰度在正常组织中显著低于癌组织中。这些结果在KRAS诱导的肺癌的其他样品和来自其他小鼠的正常肺样品中一致地观察到。结果表明，KRAS诱导包括脂肪酸和磷脂在内的脂质的过表达，并且与不同于正常肺组织的脂质谱相关。
KRAS相关的FASN诱导是肺癌细胞增殖所需的。人肺腺癌相关细胞系A549和H1299细胞是KRAS阳性的。由于先前显示KRAS活化ERK和脂肪合成基因，所以将ERK抑制剂SCH772984施用至两种细胞系，并且发现了对FASN和SCD的遏制(图5A)。此外，如通过qPCR所测量，使用S-反式、反式-法呢基硫代水杨酸(FTS)的KRAS抑制以剂量依赖性方式降低FASN和SCD的基因表达(图5B)。因此，KRAS抑制阻碍脂肪生成相关基因的表达。为抑制脂肪酸合成，出于若干原因选择抑制FASN(图11)。首先，抑制SREBP将导致各种脂肪生成途径、而不仅仅是脂肪酸合成途径的遏制。其次，抑制SCD将降低仅去饱和脂肪酸的合成，但不会降低饱和脂肪酸的合成。第三，FASN抑制将特异于脂肪酸合成途径，所述途径将消减去饱和脂肪酸和饱和脂肪酸产生。
浅蓝菌素是FASN的抑制剂(图12)。如通过PI测定和血细胞计数器所测量，对突变的KRAS人肺腺癌细胞系A549和H1299的浅蓝菌素处理导致增殖减少(图6A和6B)。因此，FASN的抑制为KRAS相关肺肿瘤提供治疗。
发现可通过以下方式区分KRAS阳性和阴性肺腺癌以及赘生性组织与正常肺组织：(a)通过qPCR测量的FASN基因表达，(b)通过NIA鉴定的ERK1磷酸同种型的存在，以及(c)通过DESI-MSI检测的独特脂质特征的诱导。用FTS抑制KRAS阻断FASN表达并导致脂肪生成减少。此外，浅蓝菌素对FASN的抑制遏制了人KRAS阳性肺癌细胞的增殖。因此，已经鉴定了KRAS阳性肺腺癌的独特基因表达以及蛋白质组和脂质特征。
以前的工作证明RAS家族成员可调控葡萄糖和谷氨酰胺代谢。基于目前的工作，提出KRAS基因有原因地控制脂肪生成。众所周知，KRAS信号传导通常活化ERK和MAPK途径。结果表明，这种信号传导通过诱导FASN而诱导脂肪生成并且它由ERK介导。先前的观察结果表明人肿瘤表现出脂质代谢的变化。此方面的一种机制基础是通过KRAS和ERK活化。
鉴定了KRAS肺腺癌的独特蛋白质组和脂质特征。通过NIA，ERK1与ERK2蛋白活化允许区分临床样本中的KRAS阳性和阴性肿瘤。NIA是高度敏感的纳米流体方法，所述方法对于检查源自少至20个细胞的甚至皮克蛋白质以测量蛋白质及其磷酸化状态非常容易处理。因此，ERK的NIA测量可用于肺腺癌的诊断。
类似地，通过DESI-MSI鉴定了与KRAS阳性肿瘤相关的不同脂质特征。这种技术用于检查原位代谢变化的前所未有的能力表明，DESI-MSI可用于区分肿瘤和正常肺组织，鉴定肺癌的不同遗传亚型，并且检测肺肿瘤中的代谢组学改变。
迄今为止，尽管在常规化学疗法中添加了免疫治疗剂和EGFR受体靶向疗法，但肺腺癌似乎无法治愈。结果表明，KRAS诱导的肺腺癌可能特别易受FASN的靶向治疗抑制。
材料和方法
解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)。DESI-MSI用于生成16μm厚的组织切片的二维化学图谱，以评估组织的脂质谱。将肺样品在液氮中快速冷冻并在加工前储存在-80℃。使用低温切片机将冷冻的样品在-21℃切成16μm切片并解冻包埋到显微镜载玻片上。将载玻片储存在-80℃。在分析之前，将载玻片在干燥器中在真空下干燥大约20分钟。使用与LTQ-Orbitrap-XL质谱仪(Thermo Fisher Scientific)耦合的实验室构建的DESI-MSI源，并且在负离子模式下以m/z 90–1,000进行DESI-MSI，空间分辨率为200μm(图7)。Orbitrap用作质量分析器，同时设置为60,000分辨率。通过这种方法使用二甲基甲酰胺和乙腈(1:1)作为溶剂系统以0.5μL/min的流速对小鼠组织样品进行成像。N2压力设定为175psi。在DESI-MSI中，将带电溶剂喷洒到组织上，从而使分子(如代谢物和脂质)溶解并从组织表面提取，然后转移到质谱仪中用于测量质荷(m/z)比率。ImgGenerator软件用于将原始文件转换为2D图像。使用BioMap软件组装空间精确的离子图像。在DESI-MSI后，使用光学显微镜对相同组织切片进行标准H&E染色以进行组织病理学评价。将DESI-MS离子图像与相同组织H&E染色的组织切片的光学显微镜图像进行比较，以描绘肿瘤病灶。使用Orbitrap和线性离子阱进行串联MS分析以进行质量分析来确认脂质一致性。LipidMaps数据库也用于辅助脂质鉴定。
患者组织样品。在经批准的IRB方案下，从范德比尔特病理转化共享资源(Vanderbilt Translational Pathology Shared Resource)组织库获得具有其匹配的正常组织对照的人肺腺癌样品。示出了此研究中使用的患者样品及其KRAS突变状态(参见图13)。
基于四环素的条件性小鼠模型。Tet-On系统用于在转基因小鼠的肺组织中条件性地活化KRAS4bG12D(一种致癌形式的KRAS剪接变体)。在这种系统中，将编码可逆四环素反式活化因子(rtTA)的基因置于Clara细胞分泌蛋白(CCSP)启动子的控制下，所述启动子驱动其在肺Clara细胞和II型肺细胞中的组成型表达。将KRAS4bG12D cDNA置于四环素响应性最小启动子(TetO-KRAS4bG12D)的控制下。在不存在四环素的情况下，rtTA结合TetO序列并阻遏致癌基因的转录。在存在四环素的情况下，多西环素与rtTA的结合使得rtTA不能结合TetO序列，从而导致癌基因转录的活化。通过从4周龄开始向饮用水(100mg/mL)施用多西环素(Sigma)来活化突变型KRAS。KRAS从四只小鼠诱导肺肿瘤，并且在第24周收获来自三只小鼠的正常肺组织，且然后通过DESI-MSI进行分析。所有动物研究均获得斯坦福大学实验动物护理管理小组(Stanford University Administrative Panel on Laboratory AnimalCare)(APLAC)的批准。使用CCSP-rtTA/TetO-KRAS4bG12D双转基因小鼠。示出了这些转基因小鼠中存在的Tet-On调控系统的图示(图8)。
微阵列。使用Illumina WG6小鼠微阵列平台由Stanford Functional GenomicsFacility进行微阵列分析。进行全基因组基因表达谱分析以比较来自KRAS开启对比KRAS关闭的转基因小鼠的肺组织的基因表达。对数据进行log2转换并对分位数进行标准化。
细胞培养。人非小细胞肺癌细胞系A549和H1299用于体外实验。将A549细胞维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、1％L-谷氨酰胺、1％丙酮酸钠、1％非必需氨基酸和抗生素-抗真菌剂的杜氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM)中。将H1299细胞维持在补充有10％FBS、50μMβ-巯基乙醇和抗生素-抗真菌剂的RPMI 1640培养基中。胰蛋白酶-EDTA用于对A549和H1299细胞进行传代。所有细胞培养试剂均购自(Thermo Fisher Scientific Inc.)。
小分子抑制剂。将125ng/mL的小分子SCH772984(Cayman)、5-20ng/mL的法呢基硫代水杨酸(FTS)(Sigma)和1-10μg/mL的浅蓝菌素(Sigma)添加至细胞培养基以分别实现对ERK、KRAS和脂肪酸合成酶(FASN)的抑制。FTS是合成的法呢基半胱氨酸模拟物，其干扰KRAS锚定至质膜。浅蓝菌素通过共价结合至所述酶不可逆地抑制FASN。在一段时间内将各种水平的这些药物施用至培养中的细胞，以评估剂量-响应关系。
细胞计数。从培养基中取出一定体积的细胞，并与等体积的0.4％台盼蓝染色剂混合。然后取出10μL并置于血细胞计数器中进行细胞计数。活细胞计数用作细胞增殖的量度。
RNA提取和cDNA合成。使用QIAGEN RNeasy Mini试剂盒从细胞和肺组织中分离总RNA。通过分光光度计评估RNA质量和浓度。使用III第一链合成系统(Invitrogen)将RNA逆转录成cDNA。所有程序均根据制造商的方案进行。
实时PCR。在QuantStudioTM 12K Flex实时PCR系统上的384孔板中进行实时PCR。通过使用Green I染料作为荧光团来检测扩增子。反应在20μL体积中进行，所述体积含有1μL cDNA、0.5μM正向引物和反向引物以及Green PCR主混合物(AppliedBiosystems)。扩增循环设定如下：50℃持续2分钟；95℃持续10分钟；95℃持续15秒、60℃持续1分钟、72℃持续30秒的40个循环。在扩增阶段后，进行解链曲线以鉴定任何非特异性扩增。对于每种基因，确定阈值循环(Ct)数，其表示达到阈值荧光所需的循环数。将Ct值导出到Excel中进行统计分析。泛素(UBC)用作管家(参考)基因。2-ΔΔCT方法用于测定相对mRNA表达水平。图14列出本研究中使用的实时PCR引物。
纳米免疫测定(NIA)。使用Nanopro 1000(Protein Simple)进行NIA以检测由肺肿瘤组织产生的溶解产物中ERK1和ERK2的磷酸化状态。NIA是一种高灵敏度的基于毛细管的等电聚焦方法，所述方法使用抗体检测来定量蛋白质同种型以及表征翻译后蛋白质修饰如磷酸化。负载到Nanopro 1000的每个毛细管中的最终蛋白质浓度是0.1μg/μL。将针对ERK1/2的第一兔抗体(Millipore)1:300稀释，并将用于负载对照的第一小鼠抗体Hsp70(SantaCruz Biosciences)1:500稀释。将与辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠和抗兔第二抗体1:100稀释。在添加鲁米诺和过氧化物检测试剂后记录化学发光信号。在Compass软件(ProteinSimple)中进行NIA数据的分析。
统计分析。基于计算的标准偏差(SD)值构建误差条。误差条代表平均值±SD。在适当的情况下，使用学生t检验来评估统计学显著性。通过t检验的统计显著性指示*代表p值<.05；**代表p值<0.01；***代表p值<0.001。
实施例2
纳米级蛋白质测量可用于评估实体瘤的肿瘤内与患者内异质性。纳米免疫测定(NIA)用于分析来自肾癌患者的细针抽吸活检(FNA)中的ERK信号传导。39名患者各自具有通过FNA取样的其肾脏肿瘤的2-3个区域。如图15中所示，每个圆圈是在技术重复中平均的肿瘤FNA(N＝91个FNA)。来自每个患者的样品通过垂直线连接。患者按ERK2样品内的平均值排序。在同种型中，技术重复内的变化具有1％的平均标准偏差。
在来自同一肿瘤的不同区域的样品中，样品之间的变化具有6％的平均标准偏差。相比之下，跨不同患者的测量的比例的标准偏差在同种型中在5％至22％的范围内。
这些数据表明，对于ERK(一种关键信号传导蛋白)，肿瘤内异质性(6％)小于患者内异质性(对于磷酸同种型pERK2b为22％)。这一发现表明，来自肿瘤的单一FNA中的ERK同种型的分析可代表整个肿瘤。
实施例3
NIA可用于测量肾细胞癌(RCC)和肺癌患者的临床样本中的蛋白质
如本文所述，NIA电荷分离已用于测量许多样本类型和不同恶性肿瘤中的新蛋白质。例如，样本类型包括但不限于快速冷冻肿瘤、包埋在OTC中的冷冻切片、细针抽吸物、骨髓、血液、CTC和血浆。人肿瘤临床样本包括但不限于淋巴瘤、CML、MDS、肾癌、肺癌和头颈癌。所使用的药物包括但不限于阿托伐他汀、利戈舍替、FTS和抗EPHA3。本文呈现的数据证明NIA可用于诊断。对于肾癌，测量了谷氨酰胺酶水平。对于肺癌，区分了RAS+与RAS-。此外，使不同类型的癌症诸如肾癌、头癌和颈癌彼此区分开。所呈现的数据证明NIA可用于治疗性监测和药物开发。已经使用诸如FTS(临床前)、利戈舍替(临床试验)和阿托伐他汀(临床试验)的药物。
如通过NIA信号传导测量值用于区分不同肿瘤类型的能力、NIA用于测量来自肺癌患者的CTC中的ERK信号传导的能力以及NIA区分KRAS+和KRAS-肺肿瘤的能力所观察到，本文呈现的数据说明NIA可用作诊断工具。此外，如通过监测FTS治疗的肿瘤中的ERK水平以及NIA区分利戈舍替治疗之前对比之后的头颈癌(HNSCC)所观察到，本文呈现的数据说明NIA可监测治疗功效。
NIA可用于测量RCC和肺癌患者的临床样本中的蛋白质。
如图16所示，使用Mag-Sifter技术从10名患者中分离了循环肿瘤细胞：将来自每个患者的细胞冷冻成团块。使用NIA分析来自每个患者的细胞团块以测量ERK同种型。
实施例4
NIA检测通过RAS的FTS抑制的变化
如通过监测FTS治疗的肿瘤中的Akt和ERK水平以及NIA区分利戈舍替治疗之前对比之后的头颈癌(HNSCC)所观察到，本文呈现的数据说明NIA可监测治疗功效。
NIA检测通过RAS的FTS抑制的变化。如图17所示，法呢基硫代水杨酸(FTS)阻断质膜处的Ras结合。
如图18所示，FTS治疗抑制体内ERK活化(NIA分析)。用FTS治疗患有MYC诱导的淋巴瘤的小鼠。通过细针抽吸对来自未治疗或治疗4天后的小鼠的肿瘤取样。将FNA快速冷冻并分批分析。NIA用于使用NIA分析ERK同种型。总体ERK1/2水平没有变化，而所有磷酸-ERK同种型在第4天减少。
如图19所示，BCL2+Ras失活在体内诱导BCL2淋巴瘤中的细胞凋亡(连续FNA)。未治疗患有BCL2诱导的淋巴瘤的小鼠(BCL2 Untx)，治疗所述小鼠以使BCL2失活(BCL2 Dox)，仅用FTS治疗所述小鼠以抑制Ras(BCL2 FTS)或治疗所述小鼠以使BCL2和Ras两者失活(BCL2Dox FTS)。通过细针抽吸对来自未治疗或治疗1、2、3或4天后的小鼠的肿瘤取样。将FNA快速冷冻并分批分析。NIA用于使用NIA分析ERK同种型。
图20示出BCL2和ras的失活比单独使任一致癌基因失活更有效地抑制肿瘤生长。BCL2和Ras两者的失活比任一单独致癌基因更有效地抑制肿瘤生长：患有BCL2诱导的淋巴瘤的小鼠。小鼠群组中肿瘤面积随时间推移的曲线：未治疗(UnTx)、用BCL2失活(BCL2关闭)、Ras失活(Ras关闭，或BCL2和Ras两者失活(BCL2关闭，Ras关闭)治疗。
如图21所示，通过DOX使BCL2失活并且通过FTS使RAS失活比单独使任一致癌基因失活更有效地抑制肿瘤生长。
图22示出来自转基因淋巴瘤的FNA中的ERK同种型的NIA分析。NIA揭示FTS在第4天使ERK1/2磷酸化降低35％。在治疗前(UnTx)通过细针抽吸对肿瘤取样，并在用FTS治疗1-8天后进行治疗。
图23示出来自转基因淋巴瘤的FNA中的ERK同种型的NIA分析。示出与dox的比较。用FTS(BC2FTS)或BCL2失活(BCL2Dox)治疗小鼠。在治疗前(UnTx)通过细针抽吸对肿瘤取样，并在用FTS治疗1-8天后进行治疗。
实施例5
NIA检测通过HMG-辅酶A还原酶的阿托伐他汀抑制的变化
图24示出ERK数据(阿托伐他汀治疗之前和之后)。两名患者接受了HMG辅酶A还原酶抑制剂阿托伐他汀的临床试验。NIA用于测量在治疗之前和治疗8天之后取样的肿瘤细胞中ERK同种型的变化。对于患者A，肿瘤负荷降低。对于患者B，未观察到肿瘤负荷的变化。
图25示出MEK数据(阿托伐他汀治疗之前和之后)。两名患者接受了HMG辅酶A还原酶抑制剂阿托伐他汀的临床试验。NIA用于测量在治疗之前和治疗8天之后MEK同种型的变化。对于患者A，肿瘤负荷降低。对于患者B，未观察到肿瘤负荷的变化。
如图26所示，阿托伐他汀在九名NHL患者中的四名中引起三磷酸-MEK1的显著变化。9名患者接受了HMG辅酶A还原酶抑制剂阿托伐他汀的临床试验。NIA用于测量在治疗之前(第1天)和治疗8天之后MEK同种型的变化。
图27示出阿托伐他汀在九名NHL患者中的四名中引起二磷酸-MEK1的显著变化。9名患者接受了HMG辅酶A还原酶抑制剂阿托伐他汀的临床试验。NIA用于测量在治疗之前(第1天)和治疗8天之后MEK同种型的变化。
图28示出阿托伐他汀在九名NHL患者中的四名中引起单磷酸-MEK1的显著变化。9名患者接受了HMG辅酶A还原酶抑制剂阿托伐他汀的临床试验。NIA用于测量在治疗之前(第1天)和治疗8天之后MEK同种型的变化。
实施例6
NIA检测通过P13K的利戈舍替抑制的变化
现在综述了在实体瘤中通过NIA作为治疗评估的Erk特征。如图29所示，评估了通过NIA的Erk活性作为患有铂耐药性、复发性或转移性H&N SCC的患者中对利戈舍替的治疗响应的潜在生物标志物。
图30示出利戈舍替的作用机制。利戈舍替是蛋白激酶活性的变构抑制剂。已知在CML和MDS中抑制PI3K和Plk1途径。
如图31所示，对于利戈舍替治疗，向患者施用560mg BID利戈舍替，持续21天周期的连续14天(2周用药，1周停药方案)。患者接受2周治疗与1周停药方案的2个周期。对于第1周期，仅第14天，5名患有HNSCC的患者将进行活检或FNA，以对通过利戈舍替、ERK和负载对照抑制的途径中的总蛋白和磷酸蛋白进行纳米蛋白质组学谱分析。对于第1周期第14天和第2周期第14天，进行药代动力学血液分析。
图32示出利戈舍替减少头颈部鳞状细胞癌中的Erk途径。在利戈舍替的临床试验中治疗的患有头颈癌的患者在治疗之前(治疗前)和治疗之后(治疗后)进行了肿瘤取样。NIA用于测量ERK同种型。
出于描述和公开例如描述于公布中并且可与目前所描述的发明结合使用的化合物以及方法学的目的，本文所提及的所有公布均以引用的方式并入本文。以上和贯穿本文讨论的公布仅针对其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。本文的任何内容都不应解释为承认本发明人由于在先发明而无权先于此类公开内容。

Claims (87)

1.一种测定患者的肿瘤是否由KRAS突变(KRAS+)驱动的方法，所述方法包括：
获得疑似为KRAS+的肿瘤的样品；以及
进行以下中的一种或两种：
针对ERK磷酸同种型的纳米流体蛋白质组学免疫测定(NIA)；以及
针对在约m/z区域700-1000和/或约m/z 200-400的区域内的脂质种类的解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)；
测定所述样品是否相对于KRAS-肿瘤或正常组织显示改变的ERK1同种型和/或改变的脂质种类；其中KRAS+肿瘤相对于KRAS-肿瘤或正常组织显示改变的ERK1同种型和/或改变的脂质种类；以及
向所述患者提供所述测定。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括根据所述测定来治疗所述患者。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是肺腺癌。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述样品是活检样品。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述活检样品是少于100,000个细胞的肿瘤细胞样品。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述活检样品是细针抽吸物样品。
7.如权利要求4所述的方法，其中对照组织是在不同时间点来自同一肿瘤的样品。
8.如权利要求7所述的方法，其中对来自单个肿瘤的多个时间点进行比较。
9.如权利要求1所述的方法，其中使所述细胞样品预先冷冻。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中当与KRAS+肿瘤的总ERK蛋白质水平相比时，NIA检测到显著增加的ppERK1和pERK1水平。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述DESI-MSI检测到KRAS+肿瘤的显著增加的复合甘油磷脂和游离脂肪酸水平。
12.如权利要求2所述的方法，其中用脂肪酸合酶(FASN)的抑制剂治疗所述患者。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述抑制剂与第二治疗方案组合施用。
14.如权利要求12或权利要求13所述的方法，其中所述FASN的抑制剂是浅蓝菌素。
15.如权利要求2所述的方法，所述方法还包括测定来自所述患者的样品在治疗过程内的两个或更多个时间点是否相对于KRAS-肿瘤或正常组织显示改变的ERK1同种型和/或改变的脂质种类以确定就指示KRAS驱动的肿瘤发生的标志物而言疗法的有效性。
16.一种用于鉴定患有KRAS+癌症的受试者的方法，所述方法包括：
对从受试者获得的临床样品进行纳米流体蛋白质组学免疫测定(NIA)和/或解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)；以及
测量所述临床样品中的ERK1磷酸同种型和/或脂质种类。
17.如权利要求16所述的方法，其中当与总ERK蛋白质水平相比时，所述临床样品具有显著增加的ppERK1和pERK1水平。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中当与正常组织样品或KRAS-癌症相比时，所述临床样品具有显著增加的ppERK1和pERK1水平。
19.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其中进行所述DESI-MSI涉及检测在约m/z区域700-1000和/或约m/z 200-400范围内的区域中的脂质种类。
20.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述临床样品相对于正常组织样品或KRAS-癌症显示改变的脂质种类。
21.如权利要求16-20中任一项所述的方法，其中所述临床样品具有增加的m/z745.5034，PG(18:1/16:1)；m/z 747.5190，as PG(18:1/16:0)；m/z 793.5023，PG(18:2/20:4)；以及m/z 865.5034，PG(22:6/22:6)相对丰度和/或总丰度。
22.如权利要求16-21中任一项所述的方法，其中所述DESI-MSI检测到KRAS+肿瘤的显著增加的复合甘油磷脂和游离脂肪酸水平。
23.如权利要求16-22中任一项所述的方法，其中所述临床样品是血液样品。
24.如权利要求16-23中任一项所述的方法，其中所述临床样品是活检样品。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述活检样品从肿瘤获得。
26.如权利要求16-25中任一项所述的方法，其中所述临床样品包含少于100,000个细胞。
27.如权利要求16-25中任一项所述的方法，其中所述临床样品包含少于1,000个细胞。
28.如权利要求16-25中任一项所述的方法，其中所述临床样品包含少于100个细胞。
29.如权利要求16-28中任一项所述的方法，其中所述临床样品通过细针抽吸获得。
30.如权利要求16-29中任一项所述的方法，其中所述临床样品是在体内取样的细针抽吸物(FNA)。
31.如权利要求30所述的方法，所述方法还包括将所述FNA与邻近的非肿瘤组织进行比较。
32.如权利要求16-31中任一项所述的方法，其中所述受试者被诊断患有肺腺癌。
33.如权利要求16-31中任一项所述的方法，其中所述受试者被诊断患有肾癌。
34.如权利要求16-33中任一项所述的方法，所述方法还可包括在不同时间点从同一肿瘤进行第二NIA和/或第二DESI-MSI。
35.如权利要求16-34中任一项所述的方法，其中使所述临床样品预先冷冻。
36.如权利要求16-35中任一项所述的方法，其中在进行所述NIA和/或所述DESI-MSI之前，使所述临床样品预先在冰上保持超过30分钟。
37.一种治疗或减轻有需要的受试者的KRAS+癌症的方法，所述方法包括：
对从所述受试者上的部位获得的临床样品进行纳米流体蛋白质组学免疫测定(NIA)和/或解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)；
在第一时间点测量所述临床样品中的ERK1磷酸同种型和/或脂质种类；
对已经用有效量的抗癌剂治疗所述受试者后从所述受试者上的大约相同部位获得的临床样品进行第二NIA和/或第二DESI-MSI；以及
在第二时间点测量已经用抗癌剂治疗所述受试者后从所述受试者上的大约相同部位获得的所述临床样品中的ERK1磷酸同种型和/或脂质种类。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述抗癌剂是脂肪酸合酶抑制剂。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述抗癌剂是脂肪生成酶抑制剂。
40.如权利要求37-39中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述患者置于治疗方案中，其中所述治疗方案包括施用有效量的抗癌治疗剂至少1个月。
41.如权利要求37-40中任一项所述的方法，所述方法还包括基于已经用所述抗癌剂治疗所述受试者后从所述受试者上的大约相同部位获得的所述临床样品中的所述ERK1磷酸同种型和/或所述脂质种类而维持、调整或停止所述治疗方案，其中所述ERK1磷酸同种型和/或所述脂质种类的变化指示对所述治疗方案的响应。
42.如权利要求37-41中任一项所述的方法，其中当在所述第一时间点与总ERK蛋白质水平相比时，所述临床样品具有显著增加的ppERK1和pERK1水平。
43.如权利要求37-41中任一项所述的方法，其中当在所述第一时间点与正常组织样品或KRAS-癌症相比时，所述临床样品具有显著增加的ppERK1和pERK1水平。
44.如权利要求37-43中任一项所述的方法，其中所述ppERK1和pERK1的水平在所述第一时间点比所述第二时间点高。
45.如权利要求37-44中任一项所述的方法，其中进行所述DESI-MSI涉及检测在约m/z区域700-1000和/或约m/z 200-400范围内的区域中的脂质种类。
46.如权利要求37-45中任一项所述的方法，其中所述临床样品在所述第一时间点相对于正常组织样品或KRAS-癌症显示改变的脂质种类。
47.如权利要求37-46中任一项所述的方法，其中所述临床样品在所述第一时间点具有增加的m/z 745.5034，PG(18:1/16:1)；m/z 747.5190，as PG(18:1/16:0)；m/z 793.5023，PG(18:2/20:4)；以及m/z 865.5034，PG(22:6/22:6)相对丰度和/或总丰度。
48.如权利要求37-47中任一项所述的方法，其中所述DESI-MSI在所述第一时间点检测到KRAS+肿瘤的显著增加的复合甘油磷脂和游离脂肪酸水平。
49.如权利要求37-48中任一项所述的方法，其中所述复合甘油磷脂和游离脂肪酸的水平在所述第一时间点比所述第二时间点高。
50.如权利要求37-49中任一项所述的方法，其中所述临床样品是血液样品。
51.如权利要求37-49中任一项所述的方法，其中所述临床样品是活检样品。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述活检样品从肿瘤获得。
53.如权利要求37-52中任一项所述的方法，其中所述临床样品包含少于100,000个细胞。
54.如权利要求37-53中任一项所述的方法，其中所述临床样品包含少于1,000个细胞。
55.如权利要求37-53中任一项所述的方法，其中所述临床样品包含少于100个细胞。
56.如权利要求37-55中任一项所述的方法，其中所述临床样品通过细针抽吸获得。
57.如权利要求37-56中任一项所述的方法，其中所述临床样品是在体内取样的细针抽吸物(FNA)。
58.如权利要求57所述的方法，所述方法还包括将所述FNA与邻近的非肿瘤组织进行比较。
59.如权利要求37-58中任一项所述的方法，其中所述受试者被诊断患有肺腺癌。
60.如权利要求37-58中任一项所述的方法，其中所述受试者被诊断患有肾癌。
61.如权利要求37-60中任一项所述的方法，其中使所述临床样品预先冷冻。
62.如权利要求37-61中任一项所述的方法，其中在进行所述NIA和/或所述DESI-MSI之前，使所述临床样品预先在冰上超过30分钟。
63.如权利要求37-62中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
64.如权利要求37-62中任一项所述的方法，其中所述受试者是动物。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述动物是小鼠。
66.如权利要求64或65所述的方法，所述方法还包括将癌细胞移植到所述动物中。
67.一种用于治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的抗癌剂，其中用所述抗癌剂治疗是基于从所述受试者获得的临床样品中的所述ppERK1和pERK1的水平和/或复合甘油磷脂和游离脂肪酸的水平，并且其中所述ppERK1和pERK1的水平和/或复合甘油磷脂和游离脂肪酸的水平与参考水平相比升高。
68.如权利要求67所述的方法，其中通过纳米流体蛋白质组学免疫测定(NIA)来测量所述ppERK1和pERK1的水平。
69.如权利要求67或68所述的方法，其中通过解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)来测量所述复合甘油磷脂和游离脂肪酸的水平，其中所述DESI-MSI涉及检测在约m/z区域700-1000和/或约m/z 200-400范围内的区域中的脂质种类。
70.如权利要求67-69中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是KRAS+癌症。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述KRAS+癌症是肺腺癌。
72.如权利要求70所述的方法，其中所述KRAS+癌症是肾癌。
73.如权利要求67-72中任一项所述的方法，其中所述抗癌剂是脂肪酸合酶抑制剂。
74.如权利要求67-73中任一项所述的方法，其中所述抗癌剂是脂肪生成酶抑制剂。
75.如权利要求67-74中任一项所述的方法，其中所述参考水平是KRAS-肿瘤或正常组织中所述ppERK1和pERK1的水平和/或复合甘油磷脂和游离脂肪酸的水平。
76.如权利要求67-75中任一项所述的方法，其中所述临床样品是血液样品。
77.如权利要求67-75中任一项所述的方法，其中所述临床样品是活检样品。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述活检样品从肿瘤获得。
79.如权利要求67-78中任一项所述的方法，其中所述临床样品包含少于100,000个细胞。
80.如权利要求67-78中任一项所述的方法，其中所述临床样品包含少于1,000个细胞。
81.如权利要求67-78中任一项所述的方法，其中所述临床样品包含少于100个细胞。
82.如权利要求67-81中任一项所述的方法，其中所述临床样品通过细针抽吸获得。
83.如权利要求67-82中任一项所述的方法，其中使所述临床样品预先冷冻。
84.如权利要求67-83中任一项所述的方法，其中在进行所述NIA和/或所述DESI-MSI之前，使所述临床样品预先在冰上超过30分钟。
85.一种治疗或减轻有需要的受试者的癌症KRAS+癌症的方法，所述方法包括：
将癌细胞移植到动物的部位中；
从所述部位移除所述癌细胞的一部分；
用有效量的抗癌剂离体治疗所述部分以产生经治疗的部分；
对所述经治疗的部分进行纳米流体蛋白质组学免疫测定(NIA)和/或解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)；以及
测量所述部分中的ERK1磷酸同种型和/或脂质种类。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述动物是小鼠。
87.如权利要求85或86所述的方法，所述方法还包括对所述部分进行纳米流体蛋白质组学免疫测定(NIA)和/或解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)；以及在用所述抗癌剂治疗之前，测量所述部分中的ERK1磷酸同种型和/或脂质种类。
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