JP2020513753A - エリートイベントee−gm5ならびに生物学的試料中でそのようなイベントを同定するための方法およびキット - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年12月22日に出願された米国仮特許出願第62/437,874号、および2017年4月4日に出願された米国仮特許出願第62/481,292号の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
i)植物発現プロモーターおよび配列番号7のコード配列を含むキメラ遺伝子などの、植物発現プロモーターの制御下にあるCry14Ab−1タンパク質をコードするバチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)由来のcry14Ab−1.b遺伝子を含む第1のキメラ遺伝子
ii)植物発現プロモーターおよび配列番号9のコード配列を含むキメラ遺伝子などの、植物発現プロモーターの制御下にある、より耐性の高いHPPD酵素をコードするシュードモナス(Pseudomonas)由来の改変型hppdPf−4Pa遺伝子を含む第2のキメラ遺伝子
を含む挿入T−DNAを含む。
a)前記標的核酸配列を、ヌクレオチド位置167からヌクレオチド位置184までの配列番号5のヌクレオチド配列またはその相補体を含む第1の核酸オリゴヌクレオチド、またはヌクレオチド位置341からヌクレオチド位置358までの配列番号6のヌクレオチド配列またはその相補体を含む前記第1の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップ;
b)前記標的核酸配列を、ヌクレオチド149からヌクレオチド166までの配列番号5のヌクレオチド配列またはその相補体を含む第2の核酸オリゴヌクレオチド、またはヌクレオチド359からヌクレオチド376までの配列番号6のヌクレオチド配列またはその相補体を含む前記核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップであって、前記第1および第2のオリゴヌクレオチドが少なくとも1ヌクレオチド重複し、前記第1または第2のオリゴヌクレオチドのいずれかが前記標識核酸プローブとなるように標識される、ステップ;
c)プローブ:標的核酸配列二本鎖内の標識プローブのみを、二本鎖の解離を生じる選択的プローブ切断を引き起こす酵素で、標的配列を無傷のまま残して切断するステップ;
d)ステップ(a)〜(c)を反復することにより標的核酸配列を再利用するステップ;および
e)切断された標識プローブを検出し、それにより、前記標的核酸配列の存在を決定し、前記生物学的試料中のエリートイベントEE−GM5の存在を検出するステップ
を含む、方法。
a)形質の有効性;
b)挿入T−DNAの存在が、農業成績または商品価値に関連するものなどの、植物の他の所望の特性を損なわないこと;
c)安定して遺伝し、同定管理のための適切なツールを開発することのできる、明確に定義された分子構造によって、イベントが特徴付けられること;
d)目的の遺伝子が、イベントを保有する植物が通常の農学的使用において晒される可能性がある範囲の環境条件において、商業的に許容されるレベルで、正確、適切かつ安定な空間的および時間的表現型発現を示すこと。
− 5’T−DNA隣接配列(ヌクレオチド1からヌクレオチド166までの配列番号5、またはヌクレオチド1からヌクレオチド1113までの配列番号24、またはその上流に隣接する植物ゲノム配列)から選択される、連続した少なくとも17ヌクレオチド、好ましくは連続した少なくとも20ヌクレオチドのヌクレオチド配列をそれらの3’末端に含む、長さ17nt〜約200ntの範囲のオリゴヌクレオチド(5’T−DNA隣接配列を認識するプライマー);または
− 3’T−DNA隣接配列(ヌクレオチド359からヌクレオチド691までの配列番号6の相補体、またはヌクレオチド359からヌクレオチド1449までの配列番号25の相補体のヌクレオチド配列、またはその下流に隣接する植物ゲノム配列)から選択される、連続した少なくとも17ヌクレオチド、好ましくは連続した少なくとも20ヌクレオチドのヌクレオチド配列をそれらの3’末端に含む、長さ17nt〜約200ntの範囲のオリゴヌクレオチド(3’T−DNA隣接配列を認識するプライマー);または
− 挿入T−DNA配列(ヌクレオチド167からヌクレオチド353までの配列番号5の相補体、またはヌクレオチド1からヌクレオチド358までの配列番号6の配列、またはヌクレオチド1からヌクレオチド7459までの配列番号11の配列、またはヌクレオチド1114からヌクレオチド8572までの配列番号23の配列、またはその相補体)から選択される、連続した少なくとも17ヌクレオチド、好ましくは連続した少なくとも20ヌクレオチドのヌクレオチド配列をそれらの3’末端に含む、長さ17nt〜約200ntの範囲のオリゴヌクレオチド(挿入T−DNAを認識するプライマー)。
a)前記標的核酸配列を、ヌクレオチド位置167からヌクレオチド位置184までの配列番号5のヌクレオチド配列またはその相補体を含む第1の核酸オリゴヌクレオチド、またはヌクレオチド位置341からヌクレオチド位置358までの配列番号6のヌクレオチド配列またはその相補体を含む前記第1の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップ;
b)前記標的核酸配列を、ヌクレオチド149からヌクレオチド166までの配列番号5のヌクレオチド配列またはその相補体を含む第2の核酸オリゴヌクレオチド、またはヌクレオチド359からヌクレオチド376までの配列番号6のヌクレオチド配列またはその相補体を含む前記第2の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップであって、前記第1および第2のオリゴヌクレオチドが少なくとも1ヌクレオチド重複し、前記第1または第2のオリゴヌクレオチドのいずれかが前記標識核酸プローブとなるように標識される、ステップ;
c)プローブ:標的核酸配列二本鎖内の標識プローブのみを、二本鎖の解離を生じる選択的プローブ切断を引き起こす酵素で、標的配列を無傷のまま残して切断するステップ;
d)ステップ(a)〜(c)を反復することにより標的核酸配列を再利用するステップ;および
e)切断された標識プローブを検出し、それにより、前記標的核酸配列の存在を決定し、前記生物学的試料中のエリートイベントEE−GM5の存在を検出するステップ
を含む、方法が提供される。
配列番号1:5’接合EE−GM5
配列番号2:3’接合EE−GM5
配列番号3:EE−GM5 5’接合
配列番号4:EE−GM5 3’接合
配列番号5:EE−GM5 5’領域
配列番号6:EE−GM5 3’領域
配列番号7:cry14Ab−1.bコード配列
配列番号8:Cry14Ab−1タンパク質アミノ酸配列
配列番号9:hppdPf−4Paコード配列
配列番号10:HPPD−4タンパク質アミノ酸配列
配列番号11:形質転換プラスミドpSZ8832−T−DNAボーダー間の配列
配列番号12:プライマーPRIM1038
配列番号13:プライマーPRIM1039
配列番号14:プローブTM1788
配列番号15:プライマーKVM164
配列番号16:プライマーKVM165
配列番号17:プローブTM1242
配列番号18:プライマーPRIM1041
配列番号19:プライマーPRIM1040
配列番号20:プローブTM1789
配列番号21:プライマーPRIM1629
配列番号22:プローブTM2083
配列番号23:ダイズイベントEE−GM5
配列番号24:EE−GM5 5’接合配列
配列番号25:EE−GM5 3’接合配列
配列番号26:プライマーGLPA210
配列番号27:プライマーGLPA212
配列番号28:プライマーGLPB167
配列番号29:プライマーGLPB170
配列番号30:プライマーPRIM2123
配列番号31:プライマーPRIM2122
配列番号32:プローブTM2327
配列番号33:挿入前遺伝子座配列
1.1.cry14Ab−1.bおよびhppdPf−4Paキメラ遺伝子を含む挿入T−DNAの説明
以下のhppdPf−4Paおよびcry14Ab−1.b発現カセットを含有するベクターpSZ8832を用いたアグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介形質転換により、EE−GM5ダイズを開発した。
(i)HPPD−4タンパク質をコードする変異型hppdPf−4Pa遺伝子(そのアミノ酸配列は配列番号10に示される)。hppdPf−4Paコード配列は、位置335(ProによるGluの置換)、位置336(TrpによるGlyの置換)、位置339(AlaによるLysの置換)および位置340(GlnによるAlaの置換)に点変異をシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)株A32由来のHPPDタンパク質をコードするDNA中に導入することによって発現された。HPPD−4タンパク質の発現は、イソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのHPPD阻害除草剤に対する耐性を付与する。
(ii)cry14Ab−1.b遺伝子は、Cry14Ab−1タンパク質(そのアミノ酸配列は配列番号8に示される)をコードする。Cry14Ab−1タンパク質の発現は、ダイズシストセンチュウのヘテロデラ・グリシネス(Heterodera glycines)などのセンチュウに対する抵抗性を付与する。
T−DNAベクターpSZ8832をアグロバクテリウム・ツメフアシェンス(Agrobacterium tumefaciens)に導入し、形質転換ダイズ植物(変種Thorne)を当技術分野で公知の方法に従ってHPPD阻害剤耐性を用いて選択した。生存している植物を自家受粉させてT1種子を生成した。その後の世代は自家受粉によって、または他のダイズの生殖質への交雑によって産生された。
エリートイベントEE−GM5は、広範な選択手順に基づき(温室および圃場における形質有効性、分子特性、および農業特性を含むがこれらに限定されないパラメータに基づき)、同じキメラ遺伝子を用いて得られた広範囲の異なる形質転換イベントから選択された。EE−GM5を含有するダイズ植物は、ダイズ植物ゲノム中の単一遺伝子座に導入遺伝子の挿入を有すること、形質転換に使用された親植物と同様の総合的農学を有すること、形質転換DNAの挿入による収量の不利益を引き起こさないこと(導入遺伝子が分離した形質転換植物から得られた「ヌル」植物系統などの、イベントを有しない対応する同質遺伝子系統と比較して)、標準的なSCN温室アッセイにおいて根を汚染する雌成虫の有意な減少をもたらすこと、およびEE−GM5を含有しない同遺伝子型ヌル系統と比較して、圃場におけるSCNセンチュウプレッシャー下で改善された収量を有することが見出された。さらに、HPPD阻害除草剤の施用に対する耐性が圃場試験で測定されたが、除草剤耐性はエリートイベント選択の選択基準ではなかった。
サザンブロットの結果は、EE−GM5が、cry14Ab−1.bキメラ遺伝子の単一コピーおよびhppdPf−4Paキメラ遺伝子の単一コピーを含有する、単一のトランスジェニック遺伝子座を含有することを示した。EE−GM5は、hppdPf−4Paキメラ遺伝子の35Sプロモーターの一部を欠いている(これは、形質転換中に配列番号11の全T−DNAがダイズゲノムに挿入されたわけではないことを示す)。T−DNAの左右の境界およびaadA配列に隣接するベクター骨格配列を標的とするプライマーを用いたPCR分析ではPCR断片は得られなかった。また、複数世代のEE−GM5における同一のEE−GM5組込み断片の存在は、イベントの構造的安定性を実証する。
PCR分析によりhppdPf−4Paおよびcry14Ab−1.b遺伝子の遺伝子型を試験することによる、後継世代における挿入T−DNA挿入物の遺伝は、EE−GM5挿入物内に含有されるhppdPf−4Paおよびcry14Ab−1.b遺伝子は、予測可能な方法で、かつ単一の挿入について予想されるように遺伝することを示す。これらのデータはメンデルの原理と一致しており、EE−GM5イベントがダイズ核ゲノム内の単一の染色体遺伝子座に組み込まれた単一の挿入物からなるという結論をサポートする。
温室生育植物におけるHPPD−4およびCry14Ab−1タンパク質のタンパク質発現レベルは、EE−GM5ダイズの異なる世代(例えば、T4、T6およびBC2F3)から収集された葉、根および種子試料中のサンドイッチ酵素結合免疫測定法(ELISA)によって決定した。HPPD−4およびCry14Ab−1は、試験した全ての世代にわたって、葉、根および種子において同様の平均発現レベルを示す。Cry14Ab−1およびHPPD−4濃度において観察されたいかなる差異も、天然の植物間可変性に起因するものであった。
農学的等価性試験において、本来の形質転換バックグラウンド(Thorne)中にEE−GM5を含む植物を、SCNの非存在下で生育した場合の分離ヌル(EE−GM5を欠く)および野生型Thorne植物と比較した。試験区はHPPD除草剤で処理されなかったが、従来の除草剤の使用および必要に応じて手作業での除草によって、雑草がないように維持された。異なる場所での比較試験において生育した場合、花の色、鞘の色、種子の色および柔毛などの定性的植物特性について、および収量、全高、倒伏、植分、成熟までの日数などの定量的特性について検査すると、イベント含有する植物と分離ヌル(EE−GM5を欠く)との間で生物学的に有意な方法で農業成績に影響する差異は観察されなかった。したがって、EE−GM5を含む植物は、対応する非トランスジェニック植物に匹敵する正常な農業特性を示した。
温室内で雌性指数を測定する標準的なSCNアッセイは、Thorne野生型ダイズ植物と比較した場合、EE−GM5を含有する植物の根のSCNシストの有意な減少を示した。さらに、温室内で雌性指数を測定する標準的なSCNアッセイでも、イベントEE−GM5および天然SCN抵抗性を含有するダイズ植物は、EE−GM5を含まないSCN抵抗性エリートダイズ系統と比較して、根におけるSCNシストの有意な減少を示すことが示された。EE−GM5を、PI88788ダイズ抵抗性を有するエリートダイズ系統(成熟度群3)またはPekingダイズ抵抗性を有するエリートダイズ系統(成熟度群6.2)に遺伝子移入した場合、根において、天然の抵抗性のみを有する根と比較して、一貫してSCNシスト数の減少が見られた。
EE−GM5エリートイベントに含有される、挿入T−DNAおよびそれに隣接するT−DNAに隣接する領域の配列を、添付の配列表に示す。
EE−GM5の5’T−DNA隣接領域を含むと同定された断片を配列決定し、そのヌクレオチド配列を配列番号5、ヌクレオチド1〜166に表す。この5’−T−DNA隣接領域は、挿入前遺伝子座配列(配列番号5、ヌクレオチド1〜166)に対応するダイズゲノム配列で構成されている。挿入T−DNA配列の一部およびそれに隣接するT−DNA 5’隣接配列の一部を含む5’接合領域は、配列番号1および3に表される。
EE−GM5の3’T−DNA隣接領域を含むと同定された断片を配列決定し、そのヌクレオチド配列を配列番号6、ヌクレオチド359〜691に表す。この3’T−DNA隣接領域は、39ヌクレオチドのフィラーDNA配列(配列番号6の位置359から位置397まで)と、それに続く、挿入前遺伝子座配列に対応するダイズゲノム配列(配列番号6の位置398から位置691まで)とから構成される。挿入T−DNA配列の一部およびそれに隣接するT−DNA 3’隣接配列の一部を含む3’接合領域は、配列番号2および4に表される。
上記の5’−T−DNA隣接配列に隣接する挿入T−DNAを配列決定し、そのヌクレオチド配列を配列番号5、ヌクレオチド167〜353に表す。また、上記の3’−T−DNA隣接配列に隣接する挿入T−DNAを配列決定し、そのヌクレオチド配列を配列番号6、ヌクレオチド1〜358に表す。形質転換の間に、63bpのゲノムDNAが挿入前遺伝子座配列において欠失され、これらは挿入DNA(T−DNAおよび少量の充填剤DNAから構成される)によって置換された。
挿入T−DNAの上流および下流の植物DNAならびにEE−GM5中の挿入T−DNAを標的とするプライマーを用いたPCR増幅は、EE−GM5の5’および3’隣接配列を確認および伸長した。
GLPA210およびGLPB167の2つのプライマーは、イベントEE−GM5のT−DNA挿入断片との5’T−DNA隣接配列の接合領域にわたるおよそ5118bpのアンプリコンを増幅するように設計された。プライマーGLPA210の配列はダイズ(Glycine max)Williams 82.a2.v1のダイズ参照配列に由来する。
GLPA210 5’−CTCTCACCCAgATTTCAC−3’(配列番号26)
GLPB167 5’−TACAACgTgCTCgCTATTCC−3’(配列番号28)
5μl Expand(商標)緩衝液(Roche)
1μl dNTP(10mM)
2μl フォワードプライマー(10pmol/μl)
2μl リバースプライマー(10pmol/μl)
0.75μl Expand(商標)High Fidelity酵素ミックス(3.5U/μL;Roche)
50ng テンプレートDNA
50μlまで水
GLPB170およびGLPA212の2つのプライマーは、3’T−DNA隣接配列とのイベントEE−GM5のT−DNA挿入断片の接合領域にわたるおよそ4982bpのアンプリコンを増幅するように設計された。プライマーGLPA212の配列はダイズ(Glycine max)Williams 82.a2.v1の参照配列に由来する。
GLPB170 5’−TCTCggTATCAgCgTTCTTg−3’(配列番号29)
GLPA212 5’−CCCATgCggTATTATgTg−3’(配列番号27)
5μl Expand(商標)緩衝液(Roche)
1μl dNTP(10mM)
2μl フォワードプライマー(10pmol/μl)
2μl リバースプライマー(10pmol/μl)
0.75μl Expand(商標)High Fidelity酵素ミックス(3.5U/μL;Roche)
50ng テンプレートDNA
50μlまで水
2.1.EE−GM5同一性分析のためのエンドポイント法
この方法は、標準的なDNA抽出手順を用いて植物材料(例えば、葉または種子)などの生物学的試料から得られたDNA試料中のイベントEE−GM5特異的DNA配列の存在を分析するためのポリメラーゼ連鎖反応検出法を説明する。
この方法は、Taqmanケミストリーを使用して2つの標的配列を増幅および検出する:EE−GM5特異的反応がイベントの存在を決定し、タクソン特異的反応がイベント特異的反応についての否定的な結果を検証する。
PRIM1038およびPRIM1039の2つのプライマーは、イベントEE−GM5のT−DNA挿入断片との3’隣接配列の接合領域にわたる85bpのアンプリコンを増幅するように設計された。
PRIM1038 5’−gAgCCACCTTCCTTTTCCACTA−3’(配列番号12)
PRIM1039 5’−ATAgggTTACTgCTTCgTAAAATAAgCA−3’(配列番号13)
TM1788 FAM 5’−CgCgTCCATgATgCTgCgACTATg−3’BHQ1(配列番号14)
2つのプライマー、KVM164およびKVM165は、ダイズ内因性レクチン1遺伝子配列の102bpのアンプリコンを増幅するように設計された。
KVM164 5’−CTTTCTCgCACCAATTgACA−3’(配列番号15)
KVM165 5’−TCAAACTCAACAgCgACgAC−3’(配列番号16)
TM1242 JOE 5’−CCACAAACACATgCAggTTATCTTgg−3’BHQ1(配列番号17)
5.0μl 2x PerfeCta qPCR FastMix II,ROX
0.2μl PRIM1038[10pmol/μl]
0.2μl PRIM1039[10pmol/μl]
0.05μl KVM164[10pmol/μl]
0.05μl KVM165[10pmol/μl]
0.1μl TM1788[10pmol/μl]
0.1μl TM1242[10pmol/μl]
×μl テンプレートDNA(20ng*)
10μlまで水
注:
● 2x PerfeCta qPCR FastMix II,ROXは、Quanta Bioscienceによって供給された。他の酵素緩衝液を使用してもよいが、性能を検証すべきである
● プライマーおよび標識プローブはIntegrated DNA Technologiesで注文した
● *反応あたりのテンプレートDNAの量は異なり得るが、確認すべきである
試験試料の結果を検証するために、以下の対照試料を実験に含めるべきである。
● 陽性対照:標的および内因性配列を含有するDNA試料
● 陰性対照:内因性配列のみを含有するDNA試料
● テンプレートなし対照:水試料(DNAなし)
● 全ての試料について、バックグラウンドに対する蛍光シグナルの比率(S/B)は、標的および内因性反応の両方に対して計算される。
● 対照試料は予測される結果を与えるべきであり、すなわち、
○ 陽性対照は「検出」と評価されるべきである
○ 陰性対照は「検出なし」と評価されるべきである
○ テンプレートなし対照は蛍光バックグラウンドレベルのみを示すべきである
● 試料は以下の通り評価される。
○ 検出:標的S/Bおよび内因性S/Bが許容される閾値比(例えば、2)を超える
○ 検出なし:標的S/Bが許容される閾値比(例えば、1)未満であり、さらに、内因性S/Bが許容される閾値比(例えば、2)を超える。
○ 不確定:標的および内因性S/Bが、許容される閾値(例えば、1)未満である
この方法は、標準的なDNA抽出手順を用いて植物材料(例えば、葉または種子)などの生物学的試料から得られたDNA試料中のイベントEE−GM5特異的DNA配列の存在および接合性状態を分析するためのポリメラーゼ連鎖反応検出法を説明する。
この方法は、Taqmanケミストリーを使用して2つの標的配列を増幅および検出する:EE−GM5特異的反応がイベントの存在を決定し、挿入前遺伝子座特異的反応が、イベントの挿入前遺伝子座の存在を決定する。
A.オプション1
PRIM1040およびPRIM1041の2つのプライマーは、イベントEE−GM5のT−DNA挿入断片とのT−DNA 5’隣接配列の接合領域にわたる84bpのアンプリコンを増幅するように設計された。
PRIM1041 5’−CATTgTgCTgAATAggTTTATAgCTATgAT−3’(配列番号18)
PRIM1040 5’−TCAAATCAACATgggTgACTAgAAA−3’(配列番号19)
TM1789 FAM 5’−CAgTACTgggCCCTTgTggCgCT−3’BHQ−1(配列番号20)
PRIM2123およびPRIM1041の2つのプライマーは、イベントEE−GM5のT−DNA挿入断片とのT−DNA 5’隣接配列の接合領域にわたる134bpのアンプリコンを増幅するように設計された。
PRIM1041 5’−CATTgTgCTgAATAggTTTATAgCTATgAT−3’(配列番号18)
PRIM2123 5’−gCACTgTTTAACTTTAAATAACTCATTTgAg−3’(配列番号30)
TM1789 FAM 5’−CAgTACTgggCCCTTgTggCgCT−3’BHQ−1(配列番号20)
A.オプション1
PRIM1629およびPRIM1040の2つのプライマーは、挿入前遺伝子座とEE−GM5挿入前遺伝子座の5’隣接配列との接合部にわたる72bpのアンプリコンを増幅するように設計されている。
PRIM1629 5’−TTggTgAAAAACAATTTggTgTACA−3’(配列番号21)
PRIM1040 5’−TCAAATCAACATgggTgACTAgAAA−3’(配列番号19)
TM2083 VIC 5’−AATCAAATCgACATCAATgT−3’MGB−NFQ(配列番号22)
PRIM2122およびPRIM2123の2つのプライマーは、挿入前遺伝子座とEE−GM5挿入前遺伝子座の5’隣接配列との接合部にわたる193bpのアンプリコンを増幅するように設計されている。
PRIM2122 5’CAAgCAAAATAAgCAACTAgATCTATTgg−3’(配列番号31)
PRIM2123 5’−gCACTgTTTAACTTTAAATAACTCATTTgAg−3’(配列番号30)
TM2327 VIC 5’−TTTggTgAAAAACAATTTggTgT−3’MGB−NFQ(配列番号32)
A.オプション1
5.0μl 2x PerfeCta qPCR FastMix II,ROX
0.4μl PRIM1040[10pmol/μl]
0.2μl PRIM1041[10pmol/μl]
0.2μl PRIM1629[10pmol/μl]
0.1μl TM1789[10pmol/μl]
0.1μl TM2083[10pmol/μl]
×μl テンプレートDNA(20ng*)
10μlまで水
5.0μl 2x PerfeCta qPCR FastMix II,ROX
0.2μl PRIM1041[10pmol/μl]
0.2μl PRIM2122[10pmol/μl]
0.2μl PRIM2123[10pmol/μl]
0.1μl TM1789[10pmol/μl]
0.1μl TM2327[10pmol/μl]
×μl テンプレートDNA(20ng*)
10μlまで水
注:
● 2x PerfeCta qPCR FastMix II,ROXは、Quanta Bioscienceによって供給された。他の酵素緩衝液を使用してもよいが、性能を検証すべきである
● プライマーおよび標識プローブはIntegrated DNA Technologiesで注文した
● *反応あたりのテンプレートDNAの量は異なり得るが、確認すべきである
試験試料の結果を検証するために、以下の対照試料を実験に含めるべきである。
● ホモ接合対照:ホモ接合状態の標的配列を含有するDNA試料
● ヘミ接合対照:ヘミ接合状態の標的配列を含有するDNA試料
● 野生型対照:標的配列を含有しないDNA試料
● テンプレートなし対照:水試料
● 全ての試料について、バックグラウンドに対する蛍光シグナルの比率(S/B)は、標的および挿入前遺伝子座反応の両方に対して計算される。
● 対照試料は予測される結果を与えるべきであり、すなわち、
○ ホモ接合対照は「ホモ接合」と評価されるべきである
○ ヘミ接合対照は「ヘミ接合」と評価されるべきである
○ 野生型対照は「野生型」と評価されるべきである
○ テンプレートなし対照は蛍光バックグラウンドレベルのみを示すべきである
● 試料は以下の通り評価される。
○ ホモ接合:標的S/Bが許容される閾値比(例えば、2)を超え、挿入前遺伝子座S/Bが許容される閾値比(例えば、1)未満である。
○ ヘミ接合:標的および挿入前遺伝子座S/Bの両方が許容される閾値比(例えば、2)を超える
○ 野生型:標的S/Bが許容される閾値比(例えば、1)未満であり、挿入前遺伝子座S/Bが許容される閾値比(例えば、2)を超える。
○ 不確定:標的および挿入前遺伝子座S/Bが、許容される閾値(例えば、1)未満である
この方法は、標準的なDNA抽出手順を用いて植物材料(例えば、葉または種子)などの生物学的試料から得られたDNA試料中のイベントEE−GM5 DNA配列の接合性状態を分析するための定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応検出法を説明する。
この方法は、TaqmanケミストリーおよびリアルタイムPCRの原理を用いて、EE−GM5特異的配列の相対コピー数を定量する。
PRIM1038およびPRIM1039の2つのプライマーは、イベントEE−GM5のT−DNA挿入断片との3’隣接配列の接合領域にわたる85bpのアンプリコンを増幅するように設計された。
PRIM1038 5’−gAgCCACCTTCCTTTTCCACTA −3’(配列番号12)
PRIM1039 5’−ATAgggTTACTgCTTCgTAAAATAAgCA−3’(配列番号12)
TM1788 FAM 5’−CgCgTCCATgATgCTgCgACTATg−3’BHQ−1(配列番号14)
2つのプライマー、KVM164およびKVM165は、ダイズ内因性レクチン1遺伝子配列の102bpのアンプリコンを増幅するように設計された。
KVM164 5’−CTTTCTCgCACCAATTgACA−3’(配列番号15)
KVM165 5’−TCAAACTCAACAgCgACgAC−3’(配列番号16)
TM1242 JOE 5’−CCACAAACACATgCAggTTATCTTgg−3’BHQ1(配列番号17)
5.0μl 2x PerfeCta qPCR FastMix II,Low ROX
0.2μl PRIM1038[10pmol/μl]
0.2μl PRIM1039[10pmol/μl]
0.2μl KVM164[10pmol/μl]
0.2μl KVM165[10pmol/μl]
0.05μl TM1788[10pmol/μl]
0.05μl TM1242[10pmol/μl]
× μl テンプレートDNA(20ng*)
10μlまで水
注:
● 2×PerfecCta qPCR FastMix II,LOW ROXは、Quanta Bioscienceによって供給された。他の酵素緩衝液を使用してもよいが、性能を検証すべきである
● プライマーおよび標識プローブはIntegrated DNA Technologiesで注文した
● *反応あたりのテンプレートDNAの量は異なり得るが、確認すべきである
試験試料の結果を検証するために、以下の対照試料を実験に含めるべきである。
● ホモ接合対照:ホモ接合状態の標的配列を含有するDNA試料
● ヘミ接合対照:ヘミ接合状態の標的配列を含有するDNA試料
● 野生型対照:標的配列を含有しないDNA試料
● テンプレートなし対照:水試料
● データ分析は、ddCt法を使用して実行される。この方法では、コピー数は、選択された参照試料に対して全ての試料について計算される。参照試料としてヘミ接合対照を使用することが推奨される。
● 対照試料は予測される結果を与えるべきであり、すなわち、
○ ホモ接合対照は「ホモ接合」と評価されるべきである
○ ヘミ接合対照は「ヘミ接合」と評価されるべきである
○ 野生型対照は「野生型」と評価されるべきである
○ テンプレートなし対照は蛍光バックグラウンドレベルのみを示すべきである
● 試料は以下の通り評価される。
○ ホモ接合:相対コピー数が、2+/−許容される閾値(例えば0.5)である
○ ヘミ接合:相対コピー数が、1+/−許容される閾値(例えば0.25)である
○ 野生型:相対コピー数が、0+許容される閾値(例えば、0.1)である
○ 不確定:相対コピー数が、ホモ接合型、ヘミ接合型および野生型試料の許容範囲外である
この方法は、標準的なDNA抽出手順を使用して、バルク植物材料(例えば、葉または種子)または加工材料(例えば、加工ダイズ子実を含有する食品または飼料)から得られるイベントEE−GM5 DNA配列の低レベル存在を分析する検出方法を説明する。
この方法は、TaqmanケミストリーおよびリアルタイムPCRの原理を使用して、DNA試料中の低レベルのEE−GM5を検出または定量する。
PRIM1041 5’−CATTgTgCTgAATAggTTTATAgCTATgAT−3’(配列番号18)
PRIM1040 5’−TCAAATCAACATgggTgACTAgAAA−3’(配列番号19)
TM1789 FAM 5’−CAgTACTgggCCCTTgTggCgCT−3’BHQ−1(配列番号20)
10.0μl 2x PerfeCta qPCR Fastmix II,Low ROX
0.5μl PRIM1040[10pmol/μl]
0.5μl PRIM1041[10pmol/μl]
0.5μl TM1789[10pmol/μl]
×μl テンプレートDNA(200ng*)
20μlまで水
注:
● 2×PerfeCta qPCR FastMix II,LOW ROXは、Quanta Bioscienceによって供給された。他の酵素緩衝液を使用してもよいが、性能を検証すべきである
● プライマーおよび標識プローブはIntegrated DNA Technologiesで注文した
● *反応あたりのテンプレートDNAの量は異なり得るが、確認すべきである
内因性配列を標的とするリアルタイムPCR検出法は、標的特異的リアルタイムPCR法で使用されるのと同じ量のテンプレートDNAで同時に行われるべきである。タクソン特異的方法の結果は、データ分析および解釈をサポートするために、すなわち、入力DNAの量を正規化するため、および標的特異的反応についての任意の否定的な結果を検証するために、使用すべきである。
● 全ての試験試料を二重に分析することが推奨される。
● 標的およびタクソン特異的方法の両方について標準曲線を生成する較正試料のセットは実験に含まれる。
● さらに、以下の対照試料が含まれる。
○ 陽性対照:検出限界のレベルで標的配列を含有するDNA試料。
○ 陰性対照:内因性配列のみを含有するDNA試料
○ テンプレートなし対照:水試料
● 全ての試料について、閾値サイクル値(すなわち、Ct値)は、標的およびタクソン特異的方法の両方について決定される。閾値サイクルは、所与の試料の増幅プロットが定義されたシグナル閾値に達するサイクル数として定義される(図4参照)。
● 較正試料のCt値およびゲノムコピー量を用いて、標的およびタクソン特異的方法の両方について標準曲線式が計算される。
● 標準曲線パラメータは、勾配および線形性(R2)の許容基準、例えば、以下のものを満たすべきである。
○ −3.2<勾配<−3.6
○ R2>0.98
● 全ての試料について、標的および内因性方法のゲノムコピー数は線形回帰分析を用いて計算される。
● タクソン特異的DNAの総量に対する低レベルの存在量は、標的およびタクソン特異的方法についてゲノムコピー数の%比を計算することによって決定される。
● 対照試料は予測される結果を与えるべきであり、すなわち、
○ 陽性対照は「検出」と評価されるべきである
○ 陰性対照は「検出なし」と評価されるべきである
○ テンプレートなし対照は蛍光バックグラウンドレベルのみを示すべきである
● 試料は以下の通り評価される。
○ 検出:方法の測定値の不確実性を考慮して、低レベルの存在が全ての反復測定の検出限界を超えている
○ 検出なし:方法の測定値の不確実性を考慮して、低レベルの存在が全ての反復測定の検出限界未満である
○ 不確定:複製された試料は一貫性のないスコアを与える
エリートイベントEE−GM5は、6つの異なるエリートダイズ系統への反復戻し交雑により導入された。系統は一定の範囲の成熟度を表すように選択された:MG Iから2系統、MG IIIから1系統、MG VIから2系統およびMG IXから1系統。MG I系統の1つおよびMG III系統は、PI88788由来のRhg1天然抵抗性対立遺伝子を含有し、MG VI系統の1つは、PI437654由来のRhg1およびRhg4天然抵抗性対立遺伝子を保有していた。他の3系統はSCNに感受性であった。
Claims (68)
- 配列番号1、3、もしくは5のいずれか1つの配列と、または配列番号2、4、もしくは6のいずれか1つの配列、または前記配列の相補体と本質的に類似したヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
- 配列番号3、4、5、6、24または25のヌクレオチド配列またはその相補体と、少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
- 配列番号1もしくは3または配列番号2もしくは4のいずれか1つのヌクレオチド配列、または前記配列の相補体を含む、または配列番号1もしくは3および配列番号2もしくは4のヌクレオチド配列を含む、請求項1または2に記載の核酸分子。
- 配列番号7および9のヌクレオチド配列、またはその相補体も含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸分子。
- ヌクレオチド位置188からヌクレオチド位置7101までの配列番号11のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも98%、もしくは少なくとも99%、もしくは少なくとも99.5%、もしくは少なくとも99.9%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 配列番号5もしくは24、および配列番号6もしくは25のヌクレオチド配列、またはその相補体を含む、請求項5に記載の核酸分子。
- 受託番号PTA−123625でATCCに寄託された種子から得ることができる核酸分子であって、前記核酸分子が、配列番号1、3、または5のいずれか1つのヌクレオチド配列、および配列番号2、4、または6のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ダイズゲノムDNA。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ダイズ植物、細胞、植物部分、種子またはそれらの子孫。
- 配列番号3のヌクレオチド配列および配列番号4のヌクレオチド配列をそのゲノム中に含む、ダイズ植物、細胞、植物部分、種子またはその子孫。
- 配列番号5のヌクレオチド配列および配列番号6のヌクレオチド配列、または配列番号24のヌクレオチド配列および配列番号25のヌクレオチド配列をそのゲノム中に含む、ダイズ植物、細胞、植物部分、種子またはその子孫。
- 配列番号7および9のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド位置1114からヌクレオチド位置8572までの配列番号23のヌクレオチド配列も含む、請求項10または11に記載の植物、細胞、植物部分、種子または子孫。
- それぞれがそのゲノム中にエリートイベントEE−GM5を含むダイズ植物、細胞、部分、または種子であって、寄託番号PTA−123625でATCCに寄託された参照種子に見られるように、前記エリートイベントが、HPPD−4タンパク質をコードするキメラ遺伝子およびCry14Ab−1タンパク質をコードするキメラ遺伝子を含有する挿入T−DNA、および前記挿入T−DNAを直接囲む5’および3’隣接配列を含む遺伝子座である、ダイズ植物、細胞、部分、または種子。
- 請求項13に記載の植物、細胞、植物部分または種子の、子孫植物、細胞、植物部分または種子であって、前記子孫植物、細胞、植物部分または種子が配列番号3のヌクレオチド配列および配列番号4のヌクレオチド配列を含む、子孫植物、細胞、植物部分または種子。
- それぞれ配列番号18および配列番号19のヌクレオチド配列を含む2つのプライマーを用いてPCRを使用して分析した場合、そのゲノムDNAが84bpのDNA断片を生じる、請求項13または14に記載のダイズ植物、細胞、部分、または種子。
- イソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンに耐性である、請求項9〜15のいずれか一項に記載の植物。
- 請求項9〜16のいずれか一項に記載のダイズ植物、細胞、部分、または種子から産生したダイズ産物。
- ダイズミール、粉砕種子、ダイズ粉またはダイズフレークであるか、またはそれを含む、請求項17に記載のダイズ産物。
- 請求項17または18に記載のダイズ産物であって、前記ダイズ産物が、イベントEE−GM5につき診断的または特異的なアンプリコンを産生する核酸を含む、ダイズ産物。
- 請求項9〜16のいずれか一項に記載のダイズ植物、細胞、部分、種子または子孫を得るステップ、およびそれからダイズ産物を産生するステップを含む、ダイズ産物の産生方法。
- 前記ダイズ産物が、ダイズミール、粉砕種子、ダイズ粉またはダイズフレークであるか、またはそれを含む、請求項20に記載の方法。
- 請求項20または21に記載の方法であって、前記ダイズ産物が、イベントEE−GM5につき診断的または特異的なアンプリコンを産生する核酸を含む、方法。
- ダイズ植物が発芽する前であるが種子が蒔かれた後に、請求項9〜16のいずれか一項に記載のダイズ種子が蒔かれた圃場を、HPPD阻害除草剤で処理するステップを含む、雑草防除プロセス。
- 請求項9〜16のいずれか一項に記載のダイズ植物を、植物の上からHPPD阻害除草剤で処理することを含む、雑草防除プロセス。
- ダイズ植物を植える圃場を、ダイズ植物を植える前または種を蒔く前に、HPPD阻害除草剤で処理し、続いて、前記前処理された圃場に前記ダイズ植物または種子を植えるまたは蒔くステップを含む、発芽中の請求項9〜16のいずれか一項に記載のダイズ植物を雑草による競争から保護するための方法。
- 前記HPPD阻害除草剤が、イソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンである、請求項23〜25のいずれか一項に記載のプロセス。
- Cry14Ab−1をコードする遺伝子を欠き、HPPD−4をコードする遺伝子を欠く第1のダイズ植物を、請求項9〜16のいずれか一項に記載のダイズ植物と交雑することによって、SCNに対する抵抗性および/またはHPPD阻害除草剤に対する耐性をダイズ植物のゲノムに導入するステップ、およびSCNに抵抗性かつ/またはHPPD阻害除草剤に耐性の子孫植物を選択するステップを含む、SCNに抵抗性かつ/またはHPPD阻害除草剤に耐性のダイズ植物の産生方法。
- ダイズ種子を産生するための、前記植物、種子、部分、細胞もしくはそれらの子孫または請求項9〜16のいずれか一項に記載の使用。
- センチュウ抵抗性および/またはHPPD阻害除草剤耐性植物を生育するための、請求項9〜16のいずれか一項に記載のダイズ植物または種子の使用。
- ダイズ産物が、粉砕ダイズ子実、ダイズ粉、ダイズミール、またはダイズフレークであるか、またはそれを含む、前記ダイズ産物を得るための、請求項9〜16のいずれか一項に記載のダイズ種子の使用。
- 請求項9〜16のいずれか一項に記載の植物を他のダイズ植物と交雑するステップ、および前記交雑から得たEE−GM5を含む種子を植えるステップを含む、エリートイベントEE−GM5を含むダイズ植物または種子の産生方法。
- ヌクレオチド位置131からヌクレオチド位置7941までの配列番号11のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記核酸分子が、殺センチュウ性Cry14Abタンパク質およびHPPD阻害剤に耐性のHPPDタンパク質をコードする、核酸分子。
- 配列番号8のタンパク質またはそれと少なくとも99%同一のタンパク質、および配列番号10のタンパク質またはそれと少なくとも99%同一のタンパク質をコードする、請求項32に記載の核酸分子。
- EE−GM5中の5’または3’T−DNA隣接領域の一部およびそれと隣接する挿入T−DNAの一部を含有する領域を特異的に認識する特異的プライマー対または特異的プローブを用いた、EE−GM5特異的領域の検出を含む、生物学的試料中のエリートイベントEE−GM5を同定する方法。
- 最適化された検出条件下で、EE−GM5中の挿入T−DNAの5’または3’T−DNA隣接領域内の配列を特異的に認識する配列を含む第1のプライマー、および最適化された検出条件下で、前記5’または3’隣接領域と隣接するEE−GM5中の挿入T−DNA内の配列を特異的に認識する配列を含む第2のプライマーを含む、EE−GM5特異的検出における使用に適したプライマー対であって、前記5’T−DNA隣接領域がヌクレオチド1からヌクレオチド166までの配列番号5、もしくはヌクレオチド1からヌクレオチド1113までの配列番号24のヌクレオチド配列を含み、前記3’T−DNA隣接領域がヌクレオチド359からヌクレオチド691までの配列番号6の相補体のヌクレオチド配列、もしくはヌクレオチド359からヌクレオチド1449までの配列番号25の相補体のヌクレオチド配列を含み、前記挿入T−DNAがヌクレオチド167からヌクレオチド353までの配列番号5のヌクレオチド配列の相補体、またはヌクレオチド1からヌクレオチド358までの配列番号6のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド位置1からヌクレオチド位置7459までの配列番号11のヌクレオチド配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド1114からヌクレオチド8572までの配列番号23のヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む、プライマー対。
- 請求項35に記載のプライマー対であって、前記第1のプライマーが、ヌクレオチド1からヌクレオチド166までの配列番号5、もしくはヌクレオチド1からヌクレオチド1113までの配列番号24のヌクレオチド配列、またはその相補体から選択される連続した17〜200ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、またはヌクレオチド358からヌクレオチド691までの配列番号6のヌクレオチド配列、もしくはヌクレオチド359からヌクレオチド1449までの配列番号25のヌクレオチド配列、またはその相補体から選択される連続した17〜200ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、かつ前記第2のプライマーが、ヌクレオチド167からヌクレオチド353までの配列番号5のヌクレオチド配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド1からヌクレオチド358までの配列番号6のヌクレオチド配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド位置1からヌクレオチド位置7459までの配列番号11のヌクレオチド配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド1114からヌクレオチド8572までの配列番号23のヌクレオチド配列もしくはその相補体から選択される連続した17〜200ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、プライマー対。
- 請求項35に記載のプライマー対であって、前記第1のプライマーが、ヌクレオチド1からヌクレオチド166までの配列番号5、もしくはヌクレオチド1からヌクレオチド1113までの配列番号24のヌクレオチド配列、またはその相補体から選択される連続した少なくとも17ヌクレオチドのヌクレオチド配列をその3’末端に含み、またはヌクレオチド358からヌクレオチド691までの配列番号6のヌクレオチド配列、もしくはヌクレオチド359からヌクレオチド1449までの配列番号25のヌクレオチド配列、またはその相補体から選択される連続した少なくとも17ヌクレオチドのヌクレオチド配列をその3’末端に含み、かつ前記第2のプライマーが、ヌクレオチド167からヌクレオチド353までの配列番号5のヌクレオチド配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド1からヌクレオチド358までの配列番号6のヌクレオチド配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド位置1からヌクレオチド位置7459までの配列番号11のヌクレオチド配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド1114からヌクレオチド8572までの配列番号23のヌクレオチド配列もしくはその相補体から選択される連続した少なくとも17ヌクレオチドをその3’末端に含む、プライマー対。
- 請求項35に記載のプライマー対であって、それぞれ、前記第1のプライマーが配列番号19もしくは配列番号13のヌクレオチド配列を含む、または前記第2のプライマーが配列番号18もしくは配列番号12のヌクレオチド配列を含む、プライマー対。
- 配列番号19のヌクレオチド配列もしくは配列番号13のヌクレオチド配列をその3’末端に含む第1のプライマーを含む、または配列番号18のヌクレオチド配列もしくは配列番号12のヌクレオチド配列をその3’末端に含む第2のプライマーを含む、請求項35に記載のプライマー対。
- PCRを用いて85または84bpのEE−GM5特異的断片を増幅する、請求項38または39に記載のプライマー対。
- その3’末端に配列番号13の配列を含む第1のプライマー、およびその3’末端に配列番号12の配列を含む第2のプライマーを含む、またはその3’末端に配列番号18の配列を含む第1のプライマー、およびその3’末端に配列番号19の配列を含む第2のプライマーを含む、プライマー対。
- 生物学的試料中のエリートイベントEE−GM5の同定のための特異的プローブであって、前記プローブが、EE−GM5の5’T−DNA隣接配列の一部およびその下流に隣接する挿入T−DNAの一部を含む配列、もしくはその相補体を特異的に認識する、またはEE−GM5の3’T−DNA隣接配列の一部およびその上流に隣接する挿入T−DNAの一部を含む配列、もしくはその相補体を特異的に認識する、プローブ。
- 5’T−DNA隣接配列の一部およびその下流に隣接する挿入T−DNAの一部を含む配列、もしくはその相補体、またはEE−GM5中の3’T−DNA隣接配列の一部およびその上流に隣接する挿入T−DNAの一部を含む配列、もしくはその相補体を含む配列と少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、生物学的試料中のエリートイベントEE−GM5の同定のための特異的プローブ。
- 配列番号1もしくは3の配列、または配列番号2もしくは4の配列、またはその相補体と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項43に記載のプローブ。
- 配列番号1、3、もしくは5のいずれか1つの配列、または配列番号2、4、もしくは6のいずれか1つの配列、またはその相補体を含む、請求項44に記載のプローブ。
- 配列番号3の配列または配列番号4の配列を含む、請求項42〜45のいずれか一項に記載のプローブ。
- 請求項34に記載の方法であって、前記方法が、少なくとも2つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記生物学的試料中に存在する核酸からの50〜1000bpのDNA断片を増幅することを含み、前記少なくとも2つのプライマーが、請求項35〜41のいずれか一項に記載のプライマーである、方法。
- 前記少なくとも2つのプライマーを用いて増幅されたDNA断片に特異的なプローブをハイブリダイズするステップをさらに含む、請求項47に記載の方法。
- 前記プローブが5’T−DNA隣接領域の一部およびそれに隣接する挿入T−DNAの一部を認識する、または前記プローブが3’T−DNA隣接領域の一部およびそれに隣接する挿入T−DNAの一部を認識する、請求項48に記載の方法。
- 前記プライマーがそれぞれ配列番号12および配列番号13の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号14の配列を含み、または前記プライマーがそれぞれ配列番号18および配列番号19の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号20の配列を含む、請求項47に記載の方法。
- 請求項35〜41のいずれか一項に記載のプライマー対を含む、EE−GM5特異的検出における使用に適したキット。
- 前記プライマー対によって増幅されたDNA断片に特異的なプローブをさらに含む、請求項51に記載のキット。
- 前記プローブが5’T−DNA隣接領域の一部およびそれに隣接する挿入T−DNAの一部を認識する、または前記プローブが3’T−DNA隣接領域の一部およびそれに隣接する挿入T−DNAの一部を認識する、請求項52に記載のキット。
- 前記プライマーが配列番号12および配列番号13の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号14の配列を含み、または前記プライマーが配列番号18および配列番号19の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号20の配列を含む、請求項52に記載のキット。
- 請求項42〜46のいずれか一項に記載のプローブを含む、EE−GM5特異的検出における使用に適したキット。
- 前記生物学的試料の核酸を請求項42〜46のいずれか一項に記載のプローブとハイブリダイズさせるステップを含む、請求項34に記載の方法。
- 種子純度を確認するための方法、またはエリートイベントEE−GM5の存在について種子をスクリーニングするための方法であって、前記方法が、前記種子の試料中の、請求項35〜41のいずれか一項に記載のプライマー対または請求項42〜46のいずれか一項に記載のプローブを用いた、EE−GM5特異的領域の検出を含む、方法。
- 85bpのDNA断片を増幅するステップであって、前記プライマーがそれぞれ配列番号12および配列番号13の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号14の配列を含む、ステップ、または84bpのDNA断片を増幅するステップであって、前記プライマーがそれぞれ配列番号18および配列番号19の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号20の配列を含む、ステップを含む、請求項57に記載の方法。
- 実質的に相補的な標識核酸プローブとのハイブリダイゼーションにより、生物学的試料中のエリートイベントEE−GM5の存在を検出する方法であって、プローブ:標的核酸比が、標的核酸配列の再利用により増幅され、前記方法が、
a)前記標的核酸配列を、ヌクレオチド位置167からヌクレオチド位置184までの配列番号5のヌクレオチド配列またはその相補体を含む第1の核酸オリゴヌクレオチド、またはヌクレオチド位置341からヌクレオチド位置358までの配列番号6のヌクレオチド配列またはその相補体を含む前記第1の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップ;
b)前記標的核酸配列を、ヌクレオチド149からヌクレオチド166までの配列番号5のヌクレオチド配列またはその相補体を含む第2の核酸オリゴヌクレオチド、またはヌクレオチド359からヌクレオチド376までの配列番号6のヌクレオチド配列またはその相補体を含む前記核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップであって、前記第1および第2のオリゴヌクレオチドが少なくとも1ヌクレオチド重複し、前記第1または第2のオリゴヌクレオチドのいずれかが前記標識核酸プローブとなるように標識される、ステップ;
c)プローブ:標的核酸配列二本鎖内の標識プローブのみを、二本鎖の解離を生じる選択的プローブ切断を引き起こす酵素で、標的配列を無傷のまま残して切断するステップ;
d)ステップ(a)〜(c)を反復することにより標的核酸配列を再利用するステップ;および
e)切断された標識プローブを検出し、それにより、前記標的核酸配列の存在を決定するステップ
を含む、方法。 - エリートイベントEE−GM5を含む、植物、植物材料または種子の接合性状態を決定する方法であって、前記方法が、少なくとも3つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記生物学的試料中に存在する核酸からの50〜1000bpのDNA断片を増幅するステップであって、前記プライマーのうち2つが挿入前植物DNAを特異的に認識し、前記プライマーのうち第3のものが挿入T−DNA内の配列を認識する、ステップを含む、方法。
- 請求項60に記載の方法であって、挿入前植物DNAを特異的に認識する前記2つのプライマーが、配列番号19のヌクレオチド配列を含むプライマー、および配列番号21のヌクレオチド配列を含むプライマーであり、挿入T−DNA内の配列を認識するプライマーが、配列番号18のヌクレオチド配列を含むプライマーである、方法。
- 生物学的試料中のエリートイベントEE−GM5の存在を検出するための方法、またはEE−GM5を含む、植物、植物材料または種子の接合性状態を決定するための方法であって、前記方法が、実施例2.1、2.2、2.3、または2.4のいずれか1つに記載のものである、方法。
- 1)エリート形質転換イベントEE−GM5を含む植物または種子を得るステップ、および2)ダイズ植物または種子を植えるまたは蒔くステップを含む、ダイズ植物を植える圃場、特に、SCN、RKNまたはネグサレセンチュウ(Pratylenchus)などのセンチュウもしくはセンチュウの卵またはニセフクロセンチュウもしくはその卵を含有する、含有していた、もしくは含有することが予想される圃場における収量損失を減少させる方法であって、前記エリートイベントを含む参照種子が、寄託番号PTA−123625でATCCに寄託されている、方法。
- 1)エリート形質転換イベントEE−GM5を含む植物または種子を得るステップ、および2)ダイズ植物または種子を植えるまたは蒔くステップを含む、SCN、RKNまたはネグサレセンチュウ(Pratylenchus)などのセンチュウもしくはセンチュウの卵またはニセフクロセンチュウもしくはその卵を含有する圃場に植えられた場合に、ダイズ植物の収量を増加させる方法であって、前記エリートイベントを含む参照種子が、寄託番号PTA−123625でATCCに寄託されている、方法。
- エリートダイズ形質転換イベントEE−GM5をダイズ植物または種子のゲノムに導入するステップ、および任意選択により、イソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのHPPD阻害除草剤で、前記植物または種子を処理するステップ、または任意選択により、イソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのHPPD阻害除草剤で、前記植物または種子が植えられる圃場を処理し、前記前処理された圃場に前記植物または種子を植えるステップを特徴とする、イソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのHPPD阻害除草剤に耐性のダイズ植物または種子を産生する方法、またはSCN、RKNまたはネグサレセンチュウ(Pratylenchus)などのセンチュウまたはニセフクロセンチュウに耐性のダイズ植物または種子を産生する方法、またはイソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのHPPD阻害除草剤に耐性の、またはSCN、RKNまたはネグサレセンチュウ(Pratylenchus)などのセンチュウまたはニセフクロセンチュウに耐性の、ダイズ植物または種子を産生する方法。
- ダイズ植物ゲノムDNAの一部およびその下流に隣接したEE−GM5の挿入外来DNAの一部を含有する、配列番号1、3または5のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、および/またはEE−GM5の挿入外来DNAの一部およびその下流に隣接したダイズ植物ゲノムDNAの一部を含有する、配列番号2、4または6のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、ダイズエリート形質転換イベントEE−GM5を特異的に特徴付ける核酸分子。
- イソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのHPPD阻害剤を、前記植物に生育するダイズ種子に、または前記種子が植えられる圃場に、または前記植物の上から、施用するステップを含む、請求項27または31に記載の方法。
- 突然死症候群に汚染されたSCN含有圃場またはダイズに鉄欠乏性クロロシスを引き起こすSCN含有圃場でダイズ植物の収量を増加させる、方法であって、前記方法が、エリートイベントEE−GM5を含む植物を植えるステップまたは種子を蒔くステップを含み、前記エリートイベントを含む参照種子が、寄託番号PTA−123624でATCCに寄託されている、方法。
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