JP2020512356A - ニコチンアミドｎ−メチルトランスフェラーゼ（ｎｎｍｔ）のキノリン由来小分子阻害剤及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ニコチンアミドＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＮＮＭＴ）のキノリン由来小分子阻害剤、その調製、及びその使用に関する。式（Ｉ）。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月３０日出願の米国仮出願第６２／４７９，２５６号及び２０１７年９月１５日出願の米国仮出願第６２／５５９，４１７号の利益を主張する。前述の出願の内容に依拠し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。

連邦政府の支援を受けた研究開発であることの表明
本発明は、米国国防省（ＤＯＤ）より与えられた交付第Ｗ８１ＸＷＨ−１５−１−０３７２号のもと、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において、ある一定の権利を有する。

本発明の分野は、一般に、ニコチンアミドＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＮＮＭＴ）のキノリン由来小分子阻害剤、その調製、及びその使用に関する。

ニコチンアミドＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＮＮＭＴ）は、補因子Ｓ−（５’−アデノシル）−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）から、ニコチンアミド（ＮＣＡ）などの基質、ピリジン及び関連類似体、たとえば、キノリン、イソキノリン、及び脂肪族アミン１，２，３，４テトラヒドロイソキノリンへのメチル基の転移を触媒する、細胞質ゾル環境中にある鍵酵素である。

ＮＮＭＴは、１−メチルニコチンアミド（１−ＭＮＡ）、メチル化ピリジニウム、メチル化関連類似体などのメチル化代謝産物の生成によって、内因性及び外因性薬物／生体異物の解毒を直接調節する。その主な代謝機能から考えると、ＮＮＭＴは、主として肝臓において発現されるが、若干のレベルのその酵素が脂肪組織、腎臓、脳、肺、心臓、及び筋肉を含む他の組織にも存在する。

ＮＮＭＴの発現及び酵素活性の増大は、いくつかの慢性疾患状態と関連付けられているため、医薬品開発の関連ターゲットとなっている。たとえば、いくつかの研究は、がん細胞におけるＮＮＭＴ活性の増大と、様々ながん性状態における腫瘍増殖／増悪との因果関係を裏付けており、ＮＮＭＴに、がん予後のバイオマーカー、及び抗がん治療開発のための関連ターゲットとしての潜在的な含みをもたせている。ＮＮＭＴ活性は、パーキンソン病患者の脳組織においても上向き調節され（たとえば、非特許文献１；非特許文献２を参照されたい）、神経変性の病因と関連付けられる神経毒として働くＮ−メチルピリジニウムイオンの脳における過剰産生につながる（たとえば、非特許文献３を参照されたい）。

さらに、動物及びヒトの両方で、肥満及び関連した慢性代謝状態（たとえば、２型糖尿病）においてＮＮＭＴ発現及び活性が増大することも報告されている。実際に、脂肪組織及び肝臓においてアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してＮＮＭＴタンパク質をノックダウンすると、高脂肪食を与えたマウスにおいて体重増加が制限され、エネルギー消費の増大によって、体脂肪量が実質的に減少した。

加えて、ＮＮＭＴは、メチオニン−ホモシステイン回路及び細胞のエネルギー消費に不可欠なニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）合成経路における細胞内代謝産物の代謝回転をモジュレートすることが知られている。したがって、ＮＮＭＴの標的化小分子阻害剤は、機構調査のための分子プローブとして、また異常なＮＮＭＴ活性を特徴とする代謝性及び慢性疾患状態を処置するための治療薬の開発に、著しく有益となりうる。

最後に、幹細胞には、自己複製能、及び身体におけるすべての組織を再生させる能力があるため、その生物学的機序を理解することは、重要な目標となっている。実際に、最近、ＮＮＭＴがｈＥＳＣにおける幹細胞多能性の調節に関与することが発見された。たとえば、非特許文献４を参照されたい。特に、ＮＮＭＴは、低いＳＡＭレベル及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３抑制状態に必要となることがわかっている。たとえば、非特許文献４を参照されたい。ＮＮＭＴと幹細胞との間にこの関連があるため、変性関連疾患を処置する治療薬の開発は、関連ターゲットとなる。

さらに、最近のいくつかの研究は、細胞内ＮＡＤ＋の若干の増加が、栄養補助食品によって実現され、老齢マウス及びデュシェンヌＭＤのｍｄｘマウスモデルにおける筋肉幹細胞（ｍｕＳＣ）活性を劇的に増大させたことを示している。

要約すると、ＮＮＭＴがいくつかの疾患／状態において役割を果たすという事実があるため、ＮＮＭＴ阻害剤の開発は、種々の疾患／状態を処置する治療薬を開発するための重要な経路になる。

この背景情報は、本発明に潜在的に関連していると出願人が考える情報を公開する目的で提供している。前述の情報はいずれも、本発明に対する先行技術をなすことを必然的に認めるものではなく、そのように解釈すべきでもない。

Ｋ．Ａｏｙａｍａ、Ｋ．Ｍａｔｓｕｂａｒａ、Ｍ．Ｋｏｎｄｏ、Ｙ．Ｍｕｒａｋａｗａ、Ｍ．Ｓｕｎｏ、Ｋ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｓ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、Ｓ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｌｕｍｂａｒ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．２９８、７８〜８０、２００１ Ｒ．Ｂ．Ｐａｒｓｏｎｓ、Ｍ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ、Ａ．Ｃ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｒ．Ｈ．Ｗａｒｉｎｇ、Ｄ．Ｂ．Ｒａｍｓｄｅｎ、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｅ．Ｃ．２．１．１．１）ｉｎ ｔｈｅ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ ｂｒａｉｎ、Ｊ．Ｎｕｅｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．６１、１１１〜１２４、２００２ Ｈｅｒｒａｉｚ Ｔ．、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅｓ ａｎｄ ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｃａｔｉｏｎｓ ａｓ ｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｌｋａｌｏｉｄｓ、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ Ｔｏｘｉｃｏｌ．、９７、２３〜３９、２０１６ Ｓｐｅｒｂｅｒ，Ｈ．ら、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７：１５２３〜１５３５（２０１５）

本発明者らは、ある特定の新規の小分子ＮＮＭＴ阻害剤を発見し、そうした分子の調製方法を開発した。

本発明者らは、ＮＮＭＴ阻害剤を使用して、ＮＮＭＴを阻害し、関連疾患及び状態を処置できることも発見した。さらに、本発明者らは、ＮＮＭＴ阻害剤を筋肉治療に使用できることも発見した。

本発明の一態様は、式Ｉの小分子キノリン由来カチオン

に関するものであり、式中、
Ｒ^１は、Ｃ_１〜４アルキルであり、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^５は、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、ハロゲン置換Ｃ_１〜４アルキル、ＮＲ^９Ｒ^１０、及びＣＮからなる群から独立に選択され、
Ｒ^６は、Ｈ又はハロゲンであり、
Ｒ^７は、Ｈ、メチル、又はＮＲ^１１Ｒ^１２であり、
Ｒ^８は、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、ハロゲン置換Ｃ_１〜４アルキルであり、
Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２は、Ｈ及びＣ_１〜４アルキルから独立に選択され、
前記化合物は、Ｒ^２〜Ｒ^８の位置に少なくとも２つの非水素置換基を有しており、
Ｒ^２〜Ｒ^８の位置にある前記非水素置換基の少なくとも１つは、ＮＨ_２である。

本発明の別の態様は、式ＩＡの小分子キノリン由来カチオン

に関するものであり、式中、
式ＩＡのカチオンは、２つ以上の非水素置換基を含み、
Ｒ^５は、Ｈ又はＮＨ_２であり、
Ｒ^６は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^７は、Ｈ又はＮＨ_２であり、
Ｒ^８は、Ｈ又はメチルである。

本発明のさらなる態様は、本発明のカチオンを使用して、ＮＮＭＴを阻害し、関連疾患又は状態を処置することに関する。一部の実施形態では、本発明は、ＮＮＭＴを発現する細胞を接触させることによる、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでＮＮＭＴを阻害するための、本発明の１種以上のカチオンの使用を包含する。

一部の実施形態では、本発明は、肥満、又はメタボリック症候群、糖尿病前症、２型糖尿病、肥満と関連付けられる疾患（たとえば、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、ＣＶＤなど）を始めとする関連した慢性代謝状態を処置するための、本発明の１種以上のカチオンの使用を包含する。

一部の実施形態では、本発明は、ＮＮＭＴ発現がんを処置するための、本発明の１種以上のカチオンの使用を包含する。さらなる実施形態では、本発明は、ＮＮＭＴ陽性がんの腫瘍形成及び転移を処置するための、本発明の１種以上のカチオンの使用を包含する。

一部の実施形態では、本発明は、パーキンソン病及び関連神経性疾患を処置するための、本発明の１種以上のカチオンの使用を包含する。

一部の実施形態では、本発明は、幹細胞分化をモジュレートするための、本発明の１種以上のカチオンの使用を包含する。

本発明の一態様は、式Ｉの小分子キノリン由来カチオン

の筋肉治療への使用に関するものであり、式中、
Ｒ^１は、Ｃ_１〜４アルキルであり、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^５は、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、ハロゲン置換Ｃ_１〜４アルキル、ＮＲ^９Ｒ^１０、及びＣＮからなる群から独立に選択され、
Ｒ^６は、Ｈ又はハロゲンであり、
Ｒ^７は、Ｈ、メチル、又はＮＲ^１１Ｒ^１２であり、
Ｒ^８は、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、ハロゲン置換Ｃ_１〜４アルキルであり、
Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２は、Ｈ及びＣ_１〜４アルキルから独立に選択され、
前記化合物は、Ｒ^２〜Ｒ^８の位置に少なくとも２つの非水素置換基を有しており、
Ｒ^２〜Ｒ^８の位置にある前記非水素置換基の少なくとも１つは、ＮＨ_２である。

本発明の別の態様は、式ＩＡの小分子キノリン由来カチオン

の筋肉治療への使用に関するものであり、式中、
式ＩＡのカチオンは、２つ以上の非水素置換基を含み、
Ｒ^５は、Ｈ又はＮＨ_２であり、
Ｒ^６は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^７は、Ｈ又はＮＨ_２であり、
Ｒ^８は、Ｈ又はメチルである。

キノリニウム誘導体であるＮＮＭＴ阻害剤１ｊ（５−アミノ−１−メチルキノリニウム）についての正規化反応曲線を示すグラフである。データ点は、正規化されたＮＮＭＴ活性の平均及び標準偏差を表す［各実験内で無阻害剤条件（０μＭ）に対して正規化されたデータ点、ｎ＝５実験］。適合された曲線とデータの適合度Ｒ２は、０．９７であった。 エネルギー代謝に送り込まれる前駆体としてのＮＡから出発するＮＡＤ＋生合成サルベージ経路、細胞内ＳＡＭ濃度、したがって細胞のエピジェネティック修飾及びポリアミン流出を調節するメチオニン回路、並びに１−ＭＮＡ及び排泄産物への変換によるＮＡのクリアランスを含む、ＮＮＭＴによって調節される経路の概略図である。経路酵素略語には、ＮＭＮＡＴ（ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ）、ＮＡＭＰＴ（ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ＭＴａｓｅ（ＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼ）、ＰＡＲＰ（ポリ−ＡＤＰ−リボースポリメラーゼ）、及びＣＤ３８（分化クラスター３８／サイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼ）が含まれる。 （Ｂ）阻害剤（３０μＭ）で２４時間処理した分化脂肪細胞（３Ｔ３細胞）におけるＮＡＤ＋、ＮＡ、ＮＡＤ＋：ＮＡ比の細胞内レベルに対するＮＮＭＴ阻害剤５−アミノ−１ＭＱの効果を示すグラフである。データは、生物学的に二連で、５−アミノ−１ＭＱで処理した脂肪細胞においてＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定された平均代謝産物レベル（空白のバー）を対照未処理脂肪細胞（塗りつぶしのバー）レベルに対して正規化したものを表す（±ＳＤ）。対応のないスチューデントのｔ検定によって分析した、対照未処理脂肪細胞に対しての＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１。 阻害剤（３０μＭ）で２４時間処理した分化脂肪細胞（３Ｔ３細胞）におけるＳＡＭ、ＳＡＨ、ＳＡＭ：ＳＡＨ比の細胞内レベルに対するＮＮＭＴ阻害剤５−アミノ−１ＭＱの効果を示すグラフである。データは、生物学的に二連で、５−アミノ−１ＭＱで処理した脂肪細胞においてＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定された平均代謝産物レベル（空白のバー）を対照未処理脂肪細胞（塗りつぶしのバー）レベルに対して正規化したものを表す（±ＳＤ）。対応のないスチューデントのｔ検定によって分析した、対照未処理脂肪細胞に対しての＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１。 コア骨格それぞれにおけるＮ１’位にメチル置換を有するすべての類似体（〜４０化合物）について、ＡｕｔｏＤｏｃｋ Ｖｉｎａ Ｐｒｏｇｒａｍを使用して求めたＶｉｎａドッキングスコアと、実験によって立証されたＩＣ_５０値間の相関を示すグラフである。ピアソンの相関分析によって、算出されたドッキングスコア（類似体とＮＮＭＴ活性部位間のエネルギー相互作用を示す）と阻害効力（ＩＣ_５０値）とに若干の正の線形相関が示された（ｒ＝０．６７６、ｐ＜０．０００１、Ｒ２＝０．５）。 基質（Ａ）５−アミノ−１−メチルキノリニウム（１ｊ）とのＮＮＭＴ活性基質結合部位の模式図である。リガンドと相互作用する疎水性ＮＮＭＴ残基標識を赤色とする。リガンドと相互作用する水素結合ＮＮＭＴ残基結合を褐色とし、残基／結合距離標識を緑色とする。模式図は、ＬＩＧＰＬＯＴを用いて作成した。 ５−アミノ−１−メチルキノリン−１−イウムヨージド（１ｊ）の化学構造を示す図である。 老齢（２７か月齢Ｃ５７ＢＬ６）及び若齢（３か月齢Ｃ５７ＢＬ／６）マウス（ｎ＝２）から単離された前脛骨筋における（β−アクチンを基準とした）ＮＮＭＴタンパク質の発現を示すグラフである。ＮＮＭＴ又はβ−アクチンに特異的な一次抗体を使用するウエスタンブロッティングから定量化された発現レベル。 （ａ）。様々な５−アミノ−１ＭＱ濃度で処理した後の脂肪細胞における細胞内１−ＭＮＡレベルを示す用量反応曲線である（ｂ）。データ点は、内部標準に対して正規化し、対対照％値±ＳＤに変換した平均１−ＭＮＡレベルを表す（データ点あたりｎ＝２反復試験）。適合された曲線とデータの適合度Ｒ２は、０．９４であった。スチューデントのｔ検定、又はダネットの事後を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって適宜分析した、対照前脂肪細胞に対しての＃：Ｐ＜０．０５；対照脂肪細胞に対しての＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１；５−アミノ−１ＭＱ（１０μＭ）処理脂肪細胞に対しての＾：Ｐ＜０．０１。 データは、生物学的に二連で、５−アミノ−１ＭＱで処理した脂肪細胞においてＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定した平均代謝産物レベル（空白のバー）を、対照未処理脂肪細胞（塗りつぶしのバー）レベルに対して正規化したものを表す（±ＳＤ）。一元配置ＡＮＯＶＡ分析に続いてダネットの後検定比較によって求めた、対照未処置脂肪細胞に対しての＊：Ｐ＜０．０５。 ＤＩＯマウスにおいて１１日間にわたってＳＣ投与された食塩水又はＮＮＭＴ阻害剤（５−アミノ−１ＭＱ、２０ｍｇ／ｋｇ、１日３回）が、ベースラインからの体重変化（ａ）、平均食物摂取（ｇ／日）及び１１日間の累積食物摂取［挿入グラフ］（ｂ）に与える効果を示すグラフ又は像である。データ点はすべて、ｎ＝９マウス／群の平均値±ＳＥＭを表す。対応のないスチューデントのｔ検定、又は多重比較事後検定を用いた反復測定二元配置ＡＮＯＶＡによって適宜分析した、食塩水処置ＤＩＯに対しての＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．０００１。 ＤＩＯマウスにおいて１１日間にわたってＳＣ投与された食塩水又はＮＮＭＴ阻害剤（５−アミノ−１ＭＱ、２０ｍｇ／ｋｇ、１日３回）が、精巣上体脂肪パッド重量（ｃ）、ＥＷＡＴのサイズ（代表的な像）（ｄ）に与える効果を示すグラフ又は像である。データ点はすべて、ｎ＝９マウス／群の平均値±ＳＥＭを表す。対応のないスチューデントのｔ検定、又は多重比較事後検定を用いた反復測定二元配置ＡＮＯＶＡによって適宜分析した、食塩水処置ＤＩＯに対しての＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．０００１。 ＤＩＯマウスにおいて１１日間にわたってＳＣ投与された食塩水又はＮＮＭＴ阻害剤（５−アミノ−１ＭＱ、２０ｍｇ／ｋｇ、１日３回）が、２０．７±１．８（ＤＩＯ、食塩水）及び２８．６±２．３（ＤＩＯ、５−アミノ−１ＭＱ）脂肪細胞という平均数に従って求めた脂肪細胞サイズ（μｍ２）（ｅ）、食塩水及び５−アミノ−１ＭＱ処置ＤＩＯ ＥＷＡＴ組織の代表的なＨ＆Ｅ染色像（スケールバー＝２００μｍ）（ｆ）、並びに４時間の絶食期間後の総血漿コレステロールレベル（ｍｇ／ｇＬ）（ｇ）に与える効果を示すグラフ又は像である。データ点はすべて、ｎ＝９マウス／群の平均値±ＳＥＭを表す。対応のないスチューデントのｔ検定、又は多重比較事後検定を用いた反復測定二元配置ＡＮＯＶＡによって適宜分析した、食塩水処置ＤＩＯに対しての＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．０００１。 分化する３Ｔ３−Ｌ１細胞における脂質生合成に対する５−アミノ−１ＭＱの効果を示す像又はグラフである。対照未処理及び５−アミノ−１ＭＱ（１５、３０、及び６０μＭ）処理脂肪細胞（分化期間中終始継続した処理）における脂肪滴のオイルレッドＯ染色後の、代表的な培養プレート像（上のパネル）及び顕微鏡像（２０倍の倍率、スケールバー＝５０μｍ、下のパネル）（ａ）。 ５−アミノ−１ＭＱ（１５、３０、及び６０μＭ）処理脂肪細胞におけるオイルレッドＯ染色の定量化によって求めた脂質蓄積。データ点は、処理脂肪細胞サンプルにおける平均正規化（対未処理対照％）値（±ＳＥＭ）を表す（実験あたりｎ＝２反復試験、実験は３回実施）（ｂ）。５−アミノ−１ＭＱ（０．１〜６０μＭ）で処理した３Ｔ３−Ｌ１細胞の生存度。データ点は、処理３Ｔ３−Ｌ１サンプルにおける平均正規化（対未処理対照％）値（±ＳＥＭ）を表す（実験あたりｎ＝３反復試験、実験は３回実施）。ダネットの事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって分析した、未処理脂肪細胞（０μＭ）に対しての＊＊＊：Ｐ＝０．０００１、未処理３Ｔ３−Ｌ１細胞に対しての＊：Ｐ＜０．０１（ｃ）。 ＮＮＭＴタンパク質が、老齢（２８か月）前脛骨（ＴＡ）骨格筋組織において、若齢（４か月）ＴＡ筋組織に比べて高度に発現されることを示すグラフである。 ＮＮＭＴ阻害剤での処置によって、老齢（２４か月齢超）マウスにおいて、筋線維横断面積が２倍になり、傷害後の筋幹細胞（ｍｕＳＣ）活性化及び再生筋線維への統合が増強されることを示す像及びグラフである。処置動物において、ＥｄＵ＋／Ｐａｘ７＋ｍｕＳＣ（白い矢印）、ＥｄＵ＋筋核（赤い矢印）のより顕著な行き渡り、及びより大きい平均線維横断面積（ＣＳＡ、ラミニン染色周囲の点線の輪によって示される）がはっきりと認められた（パネルＡ）。 ＮＮＭＴ阻害剤での処置によって、老齢（２４か月齢超）マウスにおいて、筋線維横断面積が２倍になり、傷害後の筋幹細胞（ｍｕＳＣ）活性化及び再生筋線維への統合が増強されることを示す像及びグラフである。スケールバー＝５０ｕｍ。＊：対照に対してのｐ＜０．０５。Ｅｄｕ＋陽性ｍｕＳＣ％は、処置マウスにおいて２倍になった（パネルＢ）。処置マウスにおいて対照の２倍になった線維横断面積（ＣＳＡ）（パネルＣ）。損傷筋線維への融合の増加を示す、処置マウスにおいて増加したＥｄｕ＋線維％（パネルＤ）。 ＮＮＭＴ阻害剤での処置によって、老齢マウス（２４か月齢超）の四頭骨格筋におけるミトコンドリア呼吸能及び酸化的リン酸化が増大したことを示すグラフである。

前述の本発明の一般説明及び以下の詳細な説明は、両方とも例示的であり、したがって、本発明の範囲を限定しないと理解される。

定義
本発明の原理の理解を促進する目的で、ここでは特定の実施形態に言及し、それについて述べるのに特定の専門用語を使用する。それにもかかわらず、本発明の範囲がそれによって限定されるものではなく、本発明が関連する分野の技術者が通常見出すことになるような、示される発明の変更及び改変並びに本明細書で示すとおりの本発明の原理のさらなる適用は、本明細書において企図されると理解される。

別段定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する業界の技術者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。

本明細書を説明する目的で、以下の定義が適用され、適切である場合、単数形で使用される用語は、複数形も包含し、逆もまたそうである。以下で示す定義が、参照により本明細書に援用される文書を含む、他のいずれかの文書におけるその単語の用法と矛盾する事象において、本明細書及びそれに関連する請求項を説明する目的では、（たとえば、その用語がもともと使用されている文書において）反対の意味が明確に意図されない限り、以下で示す定義によって統制されるものとする。

「ｏｒ」の使用は、別段明記しない限り、「ａｎｄ／ｏｒ」を意味する。

本明細書における「ａ」の使用は、別段明記しない限り、又は「ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ」の使用が明らかに不適切である場合でない限り、「ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ」を意味する。

「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、及び「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」の使用は、相互交換可能であり、限定するものではない。さらに、１つ以上の実施形態の記述が、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」を使用している場合において、当業者なら、ある特定の例では、その実施形態を、別法として、専門用語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ」及び／又は「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」を使用して記載することができると理解する。

本明細書で使用するとき、用語「約」とは、表示値からの±１０％の変動を指す。そのような変動は、詳細に言及されているかどうかに関わりなく、本明細書で提供する所与の値に常に含まれると理解される。

本明細書で使用する用語「アルキル」とは、それ自体で、又は別の基の一部として、直鎖及び分鎖両方のラジカルを指す。一実施形態では、アルキル基は、１〜１２個の炭素を有する。別の実施形態では、アルキル基は、１〜７個の炭素を有する。別の実施形態では、アルキル基は、１〜６個の炭素を有する。別の実施形態では、アルキル基は、１〜４個の炭素を有する（「Ｃ_１〜４アルキル」又は「Ｃ１〜４アルキル」とも呼ばれる）。用語「アルキル」は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、４，４−ジメチルペンチル、オクチル、２，２，４−トリメチルペンチル、ノニル、デシル、ウンデシル、及びドデシルを含みうる。

本明細書で使用する用語「アルキレン」とは、直鎖及び分鎖アルキル連結基、すなわち、分子においてある基を別の基に連結しているアルキル基を指す。一部の実施形態では、用語「アルキレン」は、−（ＣＨ_２）ｎ−（ｎは、２〜８である）を含みうる。

用語「アリール」とは、非置換であるか、又はハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボニル、アルキルアミド、ニトロ、アミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、チオ、又はチオアルキルから選択される１つ以上の基で置換されている場合のある、少なくとも１つの炭素環式芳香族基又はヘテロ環式芳香族基を有する芳香族基を指す。アリール環の非限定的な例は、フェニル、ナフチル、ピラニル、ピロリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピラゾリル、ピリジニル、フラニル、チオフェニル、チアゾリル、イミダゾリル、イソオキサゾリルなどである。

「アミノ」基とは、−ＮＨ２基を指す。

「アミド」基とは、−ＣＯＮＨ_２基を指す。アルキルアミド基とは、−ＣＯＮＨＲ基を指し、Ｒは、上で定義したとおりである。ジアルキルアミド基とは、−ＣＯＮＲＲ’基を指し、Ｒ及びＲ’は、上で定義したとおりである。

本明細書で使用する用語「ハロゲン」又は「ハロ」とは、それ自体で、又は別の基の一部として、塩素、臭素、フッ素、又はヨウ素を指す。

本明細書で使用する用語「ヒドロキシ」又は「ヒドロキシル」とは、それ自体で、又は別の基の一部として、−ＯＨ基を指す。

「アルコキシ」基とは、−Ｏ−アルキル基を指し、「アルキル」は、上で定義したとおりである。

「チオ」基とは、−ＳＨ基を指す。

「アルキルチオ」基とは、−ＳＲ基を指し、Ｒは、上で定義したとおりのアルキルである。

本明細書で使用する用語「ヘテロアリール」とは、５〜１４個の環原子を有し、環配列において６、１０、又は１４個の７π電子が共有され、炭素原子と、１、２、又は３個の酸素、窒素、又は硫黄ヘテロ原子とを含んでいる基を指す。ヘテロアリール部分は、非置換であるか、又はハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボニル、アルキルアミド、ニトロ、アミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、チオ、又はチオアルキルから選択される１つ以上の基で置換されている場合がある。ヘテロアリール基の例としては、チエニル、イマジゾリル（ｉｍａｄｉｚｏｌｙｌ）、オキサジアゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、フリル、ピラニル、チアントレニル、ピラゾリル、ピラジニル、インドリジニル、イソインドリル、イソベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル、キサンテニル、２Ｈ−ピロリル、ピロリル、３Ｈ−インドリル、インドリル、インダゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キナゾリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ペリミジニル（ｐｅｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）、フェナントロリニル、フェナジニル、イソチアゾリル、フェノチアジニル、イソオキサゾリル、フラザニル、及びフェノキサジニル基が挙げられる。特に好ましいヘテロアリール基としては、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、５−アミノ１，２，４−トリアゾール、イミダゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，４−オキサジアゾール、３−アミノ−１，２，４−オキサジアゾール、１，２，５−オキサジアゾール、１，３，４−オキサジアゾール、ピリジン、及び２−アミノピリジンが挙げられる。

本明細書で使用する用語「ヘテロ環」又は「ヘテロ環式環」は、特記する場合を除き、そのいずれかの環が、飽和又は不飽和である場合があり、炭素原子と、Ｎ、Ｏ、及びＳからなる群から選択される１個〜３個のヘテロ原子とからなり、窒素及び硫黄ヘテロ原子は、任意選択で酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は、任意選択で四級化されていてもよい、安定な５〜７員単環式又は安定な７〜１１員二環式のヘテロ環式環系を表し、上で定義したヘテロ環式環のいずれかがベンゼン環に縮合している任意の二環式基を含む。環は、１個の酸素若しくは硫黄、１個〜３個の窒素原子、又は１個若しくは２個の窒素原子と組み合わされた１個の酸素若しくは硫黄を含んでいる場合がある。ヘテロ環式環は、結果として安定した構造が作られる、いずれのヘテロ原子又は炭素原子において結合していてもよい。さらに、「ヘテロ環」又は「ヘテロ環式環」部分は、非置換であるか、又はハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボニル、アルキルアミド、ニトロ、アミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、チオ、又はチオアルキルから選択される１つ以上の基で置換されている場合がある。そのようなヘテロ環基の例としては、ピペリジニル、ピペラジニル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリジニル、２−オキソピロロジニル、２−オキソアゼピニル、アゼピニル、ピロリル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、キヌクリジニル、イソチアゾリジニル、インドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾイミダゾリル、チアジアゾイル、ベンゾピラニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、フリル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピラニル、チエニル、ベンゾチエニル、チアモルホリニル、チアモルホリニルスルホキシド、チアモルホリニルスルホン、及びオキサジアゾリルが挙げられる。モルホリノは、モルホリニルと同じものである。

本明細書で使用する用語「アルキルアミノ」とは、それ自体で、又は別の基の一部として、１〜６個の炭素原子を有する１つのアルキル基で置換されているアミノ基を指す。本明細書で使用する用語「ジアルキルアミノ」とは、それ自体で、又は別の基の一部として、それぞれが１〜６個の炭素原子を有する２つのアルキル基で置換されているアミノ基を指す。

本明細書で使用する用語「アルキルチオ」とは、それ自体で、又は別の基の一部として、１〜６個の炭素原子を有する１つのアルキル基で置換されているチオ基を指す。

本明細書で使用するとき、（本明細書では区別なく使用される）用語「細胞（ｃｅｌｌ）」、「細胞（ｃｅｌｌｓ）」、及び「ＮＮＭＴを発現する細胞」とは、限定はせず、ラット、マウス、サル、ウマ、イヌ、ネコ、ヒトなどのいずれかの動物からの、ＮＮＭＴを発現する１個以上の細胞を指す。たとえば、限定はせず、細胞は、幹細胞などの前駆細胞、又は内皮細胞、平滑筋細胞などの分化細胞である場合がある。ある特定の実施形態では、医療処置のための細胞は、自家処置では患者から、同種異系間処置では他のドナーから得ることができる。

「治療有効量」とは、医学的状態と関連する症状を軽減、予防、又は改善するのに十分な量である。

用語「非水素置換基」とは、水素だけではできていない置換基を指す。非水素置換基の例としては、ハロゲン、Ｃ１〜４アルキル、ハロゲン置換Ｃ１〜４アルキル、ＮＲ^９Ｒ^１０、ＮＲ^１１Ｒ^１２、及びＣＮが挙げられる。一部の実施形態では、非水素置換基として、メチルが挙げられる。さらなる実施形態では、非水素置換基として、フッ化物（Ｆ）が挙げられる。さらなる実施形態では、非水素置換基として、ＮＨ_２が挙げられる。

用語「化合物」、「カチオン」、「小分子カチオン」、及び「キノリン由来小分子カチオン」は、本出願全域で、本発明の実施形態に言及するのに区別なく使用しており、そうすることが本発明の範囲を限定するということは一切ない。

本明細書で使用する用語「筋肉治療」とは、対象の１個以上の細胞を１種以上のＮＮＭＴ阻害剤と接触させて、筋障害を処置及び／若しくは予防し、神経筋機能を向上させ、神経筋機能の回復に必要となる時間を短縮し、神経筋傷害を予防し、かつ／又は筋再生を向上させることを指す。この用語は、筋障害を処置及び／若しくは予防し、神経筋機能を向上させ、神経筋機能の回復に必要となる時間を短縮し、神経筋傷害を予防し、かつ／又は筋再生を向上させるための、ＮＮＭＴ阻害剤の投与も包含する。

本明細書で使用する用語「ＮＮＭＴ阻害剤」とは、ＮＮＭＴの酵素活性を阻害する小分子の化学的実体を指し、式Ｉ及び式ＩＡの化合物並びに表１〜３中の化合物を包含する。

用語「投与する」又は「投与」とは、（ヒト、ウマ、ネコ、イヌ、サル、ラット、及びマウスを含む）対象の１個以上の細胞を１種以上のＮＮＭＴ阻害剤と接触させることを指す。一部の実施形態では、投与は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる場合がある。さらなる実施形態では、投与は、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる場合がある。

先の記述は、例示的なものであり、したがって、本発明の範囲を限定しないと理解される。

式Ｉの化合物
本発明者らは、驚いたことに、ＮＮＭＴの阻害に使用することのできる式Ｉのキノリン由来カチオン類を発見した。一部の実施形態では、本発明は、式Ｉのカチオン

を包含し、式中、
Ｒ^１は、Ｃ_１〜４アルキルであり、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^５は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、ハロゲン置換Ｃ_１〜４アルキル、ＮＲ^９Ｒ^１０、及びＣＮからなる群から独立に選択され、
Ｒ^６は、Ｈ又はハロゲンであり、
Ｒ^７は、Ｈ、メチル、又はＮＲ^１１Ｒ^１２であり、
Ｒ^８は、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、ハロゲン置換Ｃ_１〜４アルキルであり、
Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２は、Ｈ及びＣ_１〜４アルキルから独立に選択され、
前記化合物は、Ｒ^２〜Ｒ^８の位置に少なくとも２つの非水素置換基を有しており、
Ｒ^２〜Ｒ^８の位置にある前記非水素置換基の少なくとも１つは、ＮＨ_２である。

さらなる実施形態では、Ｒ^１は、メチル又はエチルである場合がある。

さらなる実施形態では、Ｒ^１は、メチルである。

一部の実施形態では、Ｒ^２及びＲ^３の少なくとも一方は、ＮＨ_２である。

一部の実施形態では、Ｒ^５は、ＮＨ_２である。

一部の実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４は、水素である。

一部の実施形態では、Ｒ^６は、ハロゲンである。

一部の実施形態では、Ｒ^６は、Ｆである。

一部の実施形態では、Ｒ^７は、ＮＨ_２である。

一部の実施形態では、Ｒ^８は、メチル又はＣＦ_３である。

一部の実施形態では、Ｒ^８は、メチルである。

さらなる実施形態では、本発明は、式ＩＡのカチオン

を包含し、式中、
式ＩＡのカチオンは、Ｒ^２〜Ｒ^８の位置に、２つ以上の非水素置換基を含み、
Ｒ^５は、Ｈ又はＮＨ_２であり、
Ｒ^６は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^７は、Ｈ又はＮＨ_２であり、
Ｒ^８は、Ｈ又はメチルである。

式ＩＡの一部の実施形態では、Ｒ^１は、メチル又はエチルである。

式ＩＡの一部の実施形態では、Ｒ^６は、Ｆである。

ある特定の実施形態では、式ＩＡのカチオンは、

の１つであり、
式中、
Ｒ^５は、Ｈ又はＮＨ_２であり、
Ｒ^６は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^８は、Ｈ又はメチルである。

ある特定の実施形態では、本発明の小分子カチオンは、対アニオン（Ｘ⁻）を伴う場合がある。一部の実施形態では、対イオンは、スルホン酸（たとえば、トリフルオロメタンスルホン酸、メシル酸、トシル酸、ベシル酸など）、ハロゲン化物（たとえば、フッ化物、臭化物、塩化物、又はヨウ化物）、酢酸、硫酸、硫酸水素、硝酸、シュウ酸、吉草酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリン酸、ホウ酸、安息香酸、乳酸、リン酸、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、グルコヘプトン酸、及びラクトビオン酸から選択される場合がある。

本発明の別の態様は、一般に、ＮＮＭＴを阻害し、ＮＮＭＴが関与する疾患又は状態を抑制するための本発明のカチオンの使用に関する。ＮＮＭＴは、いくつかの慢性疾患／状態と関連付けられている。たとえば、いくつかの研究は、がん細胞におけるＮＮＭＴ活性の増大と、様々ながん性状態における腫瘍増殖／増悪との因果関係を裏付けており、ＮＮＭＴに、がん予後のためのバイオマーカー、及び抗がん治療開発のための関連ターゲットとしての潜在的な含みをもたせている。最近では、たとえば、ＮＮＭＴが、間葉性の神経膠芽腫幹細胞（ＧＳＣ）によって優先的に発現されたことが見出された。たとえば、Ｊｕｎｇ，Ｊ．ら、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ、２：１〜２３（２０１７）の図５及び９を参照されたい。

ＮＮＭＴ活性は、パーキンソン病、及び幹細胞分化のモジュレートにおいても役割を果たす。さらに、動物及びヒト両方における新しい報告では、ＮＮＭＴが、肥満及び関連した慢性代謝状態（たとえば、２型糖尿病）において役割を果たすことが示されている。

一部の実施形態では、本発明は、ＮＮＭＴを発現する細胞を、本発明の１種以上のカチオンと接触させることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでＮＮＭＴを阻害する方法を包含する。さらなる実施形態では、本発明は、ＮＮＭＴを発現する細胞を、１ｃ、１ｆ、１ｌ、１ｍ、２ｊ、２ｋ、２ｌ、２ｍ、２ａａ、１ｃ’、１ｆ’、１ｌ’、１ｍ’、２ｊ’、２ｋ’、２ｌ’、２ｍ’、及び２ａａ’から選択される１種以上のカチオンと接触させることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでＮＮＭＴを阻害する方法を包含する。

さらなる実施形態では、本発明は、ＮＮＭＴを発現する細胞を、表１、２、３ａ、及び３ｂから選択される１種以上のカチオンと接触させることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでＮＮＭＴを阻害する方法を包含する。さらなる実施形態では、本発明は、ＮＮＭＴを発現する細胞を、本発明の１種以上のカチオン並びに表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンと接触させることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでＮＮＭＴを阻害する方法を包含する。本発明の一態様では、本発明の１種以上のカチオンを、表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンと同時に、ＮＮＭＴを発現する細胞と接触させる。本発明の別の態様では、本発明の１種以上のカチオンを、ＮＮＭＴを発現する細胞と接触させた後、前記ＮＮＭＴを発現する細胞を、表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンと接触させる。本発明のさらなる態様では、表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを、ＮＮＭＴを発現する細胞と接触させた後、前記ＮＮＭＴを発現する細胞を、本発明の１種以上のカチオンと接触させる。

一部の実施形態では、本発明は、治療有効量の本発明の１種以上のカチオンを投与することにより、肥満又は関連した慢性代謝状態を処置する方法を包含する。さらなる実施形態では、本発明は、１ｃ、１ｆ、１ｌ、１ｍ、２ｊ、２ｋ、２ｌ、２ｍ、２ａａ、１ｃ’、１ｆ’、１ｌ’、１ｍ’、２ｊ’、２ｋ’、２ｌ’、２ｍ’、及び２ａａ’から選択される、治療有効量の１種以上のカチオンを投与することにより、肥満又は関連した慢性代謝状態を処置する方法を包含する。

さらなる実施形態では、本発明は、治療有効量の表１、２、３ａ、及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを投与することにより、肥満又は関連した慢性代謝状態を処置する方法を包含する。さらなる実施形態では、本発明は、本発明の１種以上のカチオン並びに表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを治療有効量投与することにより、肥満又は関連した慢性代謝状態を処置する方法を包含する。本発明の一態様は、治療有効量の本発明の１種以上のカチオンを、表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを同時投与しながら投与することにより、肥満又は関連した慢性代謝状態を処置することに関する。本発明の別の態様は、治療有効量の本発明の１種以上のカチオンを投与した後、表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを投与することにより、肥満又は関連した慢性代謝状態を処置することに関する。本発明のさらなる態様は、治療有効量の表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを投与した後、本発明の１種以上のカチオンを投与することにより、肥満又は関連した慢性代謝状態を処置することに関する。

ある特定の実施形態では、本発明は、治療有効量の本発明の１種以上のカチオンを投与することにより、神経膠芽腫などのＮＮＭＴ発現がんを処置する方法を包含する。さらなる実施形態では、本発明は、１ｃ、１ｆ、１ｌ、１ｍ、２ｊ、２ｋ、２ｌ、２ｍ、２ａａ、１ｃ’、１ｆ’、１ｌ’、１ｍ’、２ｊ’、２ｋ’、２ｌ’、２ｍ’、及び２ａａ’から選択される、治療有効量の１種以上のカチオンを投与することにより、神経膠芽腫などのＮＮＭＴ発現がんを処置する方法を包含する。

さらなる実施形態では、本発明は、治療有効量の、表１、２、３ａ、及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを投与することにより、神経膠芽腫などのＮＮＭＴ発現がんを処置する方法を包含する。さらなる実施形態では、本発明は、本発明の１種以上のカチオン並びに表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを治療有効量投与することにより、ＮＮＭＴ発現がんを処置する方法を包含する。本発明の一態様は、治療有効量の本発明の１種以上のカチオンを、表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを同時投与しながら投与することにより、神経膠芽腫などのＮＮＭＴ発現がんを処置することに関する。本発明の別の態様は、治療有効量の本発明の１種以上のカチオンを投与した後、表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを投与することにより、神経膠芽腫などのＮＮＭＴ発現がんを処置することに関する。本発明のさらなる態様は、表３ａ及び３ｂから選択される、治療有効量の１種以上のカチオンを投与した後、本発明の１種以上のカチオンを投与することにより、神経膠芽腫などのＮＮＭＴ発現がんを処置することに関する。

ある特定の実施形態では、本発明は、治療有効量の本発明の１種以上のカチオンを投与することにより、パーキンソン病及び関連神経性疾患を処置する方法を包含する。さらなる実施形態では、本発明は、１ｃ、１ｆ、１ｌ、１ｍ、２ｊ、２ｋ、２ｌ、２ｍ、２ａａ、１ｃ’、１ｆ’、１ｌ’、１ｍ’、２ｊ’、２ｋ’、２ｌ’、２ｍ’、及び２ａａ’から選択される、治療有効量の１種以上のカチオンを投与することにより、パーキンソン病及び関連神経性疾患を処置する方法を包含する。

さらなる実施形態では、本発明は、表１、２、３ａ、及び３ｂから選択される、治療有効量の１種以上のカチオンを投与することにより、パーキンソン病及び関連神経性疾患を処置する方法を包含する。さらなる実施形態では、本発明は、本発明の１種以上のカチオン並びに表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを治療有効量投与することにより、パーキンソン病及び関連神経性疾患を処置する方法を包含する。本発明の一態様は、治療有効量の本発明の１種以上のカチオンを、表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを同時投与しながら投与することにより、パーキンソン病及び関連神経性疾患を処置することに関する。本発明の別の態様は、治療有効量の本発明の１種以上のカチオンを投与した後、表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを投与することにより、パーキンソン病及び関連神経性疾患を処置することに関する。本発明のさらなる態様は、表３ａ及び３ｂから選択される、治療有効量の１種以上のカチオンを投与した後、本発明の１種以上のカチオンを投与することにより、パーキンソン病及び関連神経性疾患を処置することに関する。

一部の実施形態では、本発明は、ＮＮＭＴを発現する幹細胞を本発明の１種以上のカチオンと接触させることにより、幹細胞分化をモジュレートする方法を包含する。さらなる実施形態では、本発明は、ＮＮＭＴを発現する幹細胞を、１ｃ、１ｆ、１ｌ、１ｍ、２ｊ、２ｋ、２ｌ、２ｍ、２ａａ、１ｃ’、１ｆ’、１ｌ’、１ｍ’、２ｊ’、２ｋ’、２ｌ’、２ｍ’、及び２ａａ’から選択される１種以上のカチオンと接触させることにより、幹細胞分化をモジュレートする方法を包含する。

さらなる実施形態では、本発明は、ＮＮＭＴを発現する幹細胞を、表１、２、３ａ、及び３ｂから選択される１種以上のカチオンと接触させることにより、幹細胞分化をモジュレートする方法を包含する。さらなる実施形態では、本発明は、ＮＮＭＴを発現する幹細胞を、本発明の１種以上のカチオン並びに表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンと接触させることにより、幹細胞分化をモジュレートする方法を包含する。本発明の一態様では、本発明の１種以上のカチオンを、表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンと同時に、ＮＮＭＴを発現する幹細胞と接触させる。本発明の別の態様では、本発明の１種以上のカチオンを、ＮＮＭＴを発現する幹細胞と接触させた後、前記ＮＮＭＴを発現する幹細胞を、表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンと接触させる。本発明のさらなる態様では、表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを、ＮＮＭＴを発現する幹細胞と接触させた後、前記ＮＮＭＴを発現する幹細胞を、本発明の１種以上のカチオンと接触させる。

式Ｉ及びＩＡのカチオンの合成
本発明のある特定の実施形態の調製についての記述は、本発明のある特定の実施形態を例示するものである。本明細書及び以下で概略を述べる合成変換に使用した試薬及び反応物は、単に例示的なものにすぎない。本発明は、本発明のカチオンの調製を実現するのに、本明細書で論述した同じ又は異なる試薬を使用することを企図する。

式Ｉ及びＩＡのある特定のカチオンは、置換キノリン誘導体のＮ−アルキル化によって調製することができる。一部の実施形態では、式Ｉ及びＩＡのある特定のカチオンの調製は、たとえば、ヨードメタン又はトリフルオロメタンスルホン酸メチルを使用して、キノリン骨格のＮ位をアルキル化することにより行われる場合がある（スキーム１を参照されたい）。

スキーム１．本発明のある特定のカチオンの合成経路^ａ

^ａ試薬及び条件：（ａ）ヨードメタン、イソプロパノール、９０℃、１２時間、（ｂ）ＭｅＯＴｆ、トルエン、１００℃、１２時間。

一部の実施形態では、本発明のある特定のカチオンの調製は、還元的アミノ化に続くアルキル化によって行われる場合がある。

スキーム２．本発明のある特定のＣ３−アミノアルキル化キノリニウム誘導体の合成^ａ

^ａ試薬及び条件：（ａ）オルトギ酸トリエチル、ＴＦＡ、１２５℃、１２時間、次いで、ＮａＢＨ_４、ＥｔＯＨ、室温、１２時間、（ｂ）ＭｅＩ、ＩＰＡ、９０℃、１２時間。

本発明のある特定のカチオンは、カチオン１ｆの調製で例示されるとおり、スキーム２に概略を示した２段階工程によって調製することができる。詳細には、化合物８などのＣ３−アミノ−キノリン由来前駆体のアルキル化を、たとえば、ＴＦＡ中にてオルトギ酸トリエチルを用いた還元的アミノ化に続き、ＮａＢＨ_４で処理して、対応する第二級Ｃ３−アミン誘導体（Ｎ−メチル−Ｃ３−アミノ−キノリン９など）を得ることにより実現することができる。次いで、第二級Ｃ３−アミン誘導体中間体（たとえば、化合物９）をメチル化して、所望のカチオン（たとえば、化合物１ｆ）を取得することができる。

一部の実施形態では、本発明のある特定のカチオンの調製は、カチオン２ｊの調製（スキーム３）で例示されるとおり、ＳｎＣｌ_２を媒介とするフリードレンダー合成を含む、Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎらによって報告されているワンポット手順、続いてクルティウス転位、及びその後のアルキル化による脱保護によって行われる場合がある。

特に、カチオン２ｊは、５−フルオロ−２−ニトロ−ベンズアルデヒド１１から、所望のＣ２−エチル−カルボキシレートキノリン１２を構築するための、ＳｎＣｌ_２を媒介とするフリードレンダー合成を含む、Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎらによって報告されているワンポット手順によって調製することができる（スキーム３）。得られるエステル基を、次いで、加水分解し、ＤＰＰＡを用いてアジ化アシルに変換した後、ｔｅｒｔ−ブタノールなどのアルコールを用いたクルティウス転位にかけて、対応するＮ−Ｂｏｃ保護された基体（図示せず）を得ることができる。ＴＦＡを用いたＮ−Ｂｏｃ脱保護によって、対応するフッ素化Ｃ３−アミノ−キノリン中間体１３が得られる。次いで、たとえば、スキーム１に概略を示す一般法を使用して、前駆体１３のメチル化を行って、カチオン２ｊを得ることができる。

スキーム３．本発明のある特定のＣ６−フッ素化キノリニウム誘導体の合成^ａ

^ａ試薬及び条件：（ａ）ＳｎＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、エチル３，３−ジエトキシプロピオネート、ＥｔＯＨ、９０℃、２４時間、（ｂ）３Ｎ ＮａＯＨ、ＭｅＯＨ、室温、２時間、（ｃ）ジフェニルホスホリルアジド、Ｅｔ_３Ｎ、トルエン、室温、３０分、次いで、ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ、還流、１２時間、（ｄ）ＴＦＡ／ＣＨ_２Ｃｌ_２、室温、３時間、（ｅ）ＭｅＩ、ＩＰＡ、９０℃、１２時間。

一部の実施形態では、本発明のある特定のカチオンの調製は、カチオン２ｋの調製（スキーム４）で例示されるとおり、（たとえば、ｍＣＰＢＡを使用する）キノリンの酸化に続き、それぞれ、ニトロ化及び塩素化、さらにその後、それぞれ、アミノ化及びアルキル化を経て行われる場合がある。

特に、カチオン２ｋは、キノリンからｍＣＰＢＡ酸化を経て導くことのできるキノリン−Ｎ−オキシド１４などから調製することができる（スキーム４）。化合物１４などのＣ３位に、１４の位置選択的ニトロ化を使用して、ニトロ基を選択的に導入した後、ＰＯＣｌ_３の存在下で、キノリン−Ｎ−オキシド部分を塩素化して、中間体１５を得ることができる。所望のＣ２／３−ジアミノ基を、たとえばアンモニアを用いたＣ２−クロロ基のアミノ化と、（たとえば、水素化による）Ｃ３−ニトロ基の還元とを含む２段階の順序で導入して、前駆体１６を得ることができる。化合物１６を、たとえば、スキーム１で概略を示した一般法を使用してメチル化すると、カチオン２ｋを得ることができる。

スキーム４．本発明のある特定のＣ２，３−ジアミノ−キノリニウム誘導体の合成^ａ

^ａ試薬及び条件：（ａ）ｍＣＰＢＡ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、０℃〜室温、１２時間、（ｂ）亜硝酸ｔｅｒｔ−ブチル、ＭｅＣＮ、１００℃、２４時間、（ｃ）ＰＯＣｌ_３、９５℃、１２時間、（ｄ）ＮＨ_３（ＭｅＯＨ中７Ｎ）、９０℃、１２時間、（ｅ）Ｐｄ／Ｃ、Ｈ_２、ＭｅＯＨ／ＴＨＦ、室温、１２時間、（ｆ）ＭｅＩ、ＩＰＡ、９０℃、１２時間。

筋肉治療を施すためのＮＮＭＴ阻害剤の使用
本発明の別の態様は、一般に、筋肉治療を施すためのＮＮＭＴ阻害剤の使用に関する。ＮＮＭＴは、いくつかの疾患／状態と関連付けられている。たとえば、ＮＮＭＴ活性が、ある特定の神経性疾患／状態において役割を果たすことが示されている。本発明者らは、驚いたことに、ＮＮＭＴ阻害剤を、ある特定の筋ジストロフィー疾患の処置を始めとする筋肉治療に使用できることを発見した。

一部の実施形態では、本発明は、１個以上の細胞を１種以上のＮＮＭＴ阻害剤と接触させることを含む、１種以上のＮＮＭＴ阻害剤の筋肉治療への使用を包含する。他の実施形態では、本発明は、１個以上の細胞を１種以上のＮＮＭＴ阻害剤と接触させることを含む、筋ジストロフィー疾患を処置するためのＮＮＭＴ阻害剤の使用を包含する。

一部の実施形態では、本発明は、式Ｉのカチオン

を投与することによって筋肉治療を施す方法を包含し、式中、
Ｒ^１は、Ｃ_１〜４アルキルであり、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^５は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、ハロゲン置換Ｃ_１〜４アルキル、ＮＲ^９Ｒ^１０、及びＣＮからなる群から独立に選択され、
Ｒ^６は、Ｈ又はハロゲンであり、
Ｒ^７は、Ｈ、メチル、又はＮＲ^１１Ｒ^１２であり、
Ｒ^８は、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、ハロゲン置換Ｃ_１〜４アルキルであり、
Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２は、Ｈ及びＣ_１〜４アルキルから独立に選択され、
前記化合物は、Ｒ^２〜Ｒ^８の位置に少なくとも２つの非水素置換基を有しており、
Ｒ^２〜Ｒ^８の位置にある前記非水素置換基の少なくとも１つは、ＮＨ_２である。

さらなる実施形態では、Ｒ^１は、メチル又はエチルである場合がある。

さらなる実施形態では、Ｒ^１は、メチルである。

一部の実施形態では、Ｒ^２及びＲ^３の少なくとも一方は、ＮＨ_２である。

一部の実施形態では、Ｒ^５は、ＮＨ_２である。

一部の実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４は、水素である。

一部の実施形態では、Ｒ^６は、ハロゲンである。

一部の実施形態では、Ｒ^６は、Ｆである。

一部の実施形態では、Ｒ^７は、ＮＨ_２である。

一部の実施形態では、Ｒ^８は、メチル又はＣＦ_３である。

一部の実施形態では、Ｒ^８は、メチルである。

さらなる実施形態では、本発明は、式ＩＡのカチオン

を投与することによって筋肉治療を施す方法を包含し、式中、
式ＩＡのカチオンは、Ｒ^２〜Ｒ^８の位置に、２つ以上の非水素置換基を含み、
Ｒ^５は、Ｈ又はＮＨ_２であり、
Ｒ^６は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^７は、Ｈ又はＮＨ_２であり、
Ｒ^８は、Ｈ又はメチルである。

式ＩＡの一部の実施形態では、Ｒ^１は、メチル又はエチルである。

式ＩＡの一部の実施形態では、Ｒ^６は、Ｆである。

ある特定の実施形態では、本発明は、式ＩＡのカチオンを投与することによって筋肉治療を施す方法を包含し、前記カチオンは、

から選択され、
式中、
Ｒ^５は、Ｈ又はＮＨ_２であり、
Ｒ^６は、Ｈ又はＦであり、
Ｒ^８は、Ｈ又はメチルである。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の小分子カチオンは、対アニオン（Ｘ⁻）を伴う場合がある。一部の実施形態では、対イオンは、スルホン酸（たとえば、トリフルオロメタンスルホン酸、メシル酸、トシル酸、ベシル酸など）、ハロゲン化物（たとえば、フッ化物、臭化物、塩化物、又はヨウ化物）、酢酸、硫酸、硫酸水素、硝酸、シュウ酸、吉草酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリン酸、ホウ酸、安息香酸、乳酸、リン酸、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、グルコヘプトン酸、及びラクトビオン酸から選択される場合がある。

ある特定の実施形態では、本発明は、表１、２、３ａ、及び３ｂから選択される本明細書に記載のカチオンを投与することにより、筋肉治療を施す方法を包含する。

一部の実施形態では、本発明は、ＮＮＭＴを発現する細胞を、本発明の１種以上のカチオンと接触させることにより、筋肉治療を施す方法を包含する。さらなる実施形態では、本発明は、ＮＮＭＴを発現する細胞を、１ｃ、１ｆ、１ｌ、１ｍ、２ｊ、２ｋ、２ｌ、２ｍ、２ａａ、１ｃ’、１ｆ’、１ｌ’、１ｍ’、２ｊ’、２ｋ’、２ｌ’、２ｍ’、及び２ａａ’から選択される１種以上のカチオンと接触させることにより、筋肉治療を施す方法を包含する。

さらなる実施形態では、本発明は、ＮＮＭＴを発現する細胞を、表１、２、３ａ、及び３ｂから選択される１種以上のカチオンと接触させることにより、筋肉治療を施す方法を包含する。さらなる実施形態では、本発明は、ＮＮＭＴを発現する細胞を、本発明の１種以上のカチオン並びに表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンと接触させることにより、筋肉治療を施す方法を包含する。本発明の一態様では、本発明の１種以上のカチオンを、表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンと同時に、ＮＮＭＴを発現する細胞と接触させる。本発明の別の態様では、本発明の１種以上のカチオンを、ＮＮＭＴを発現する細胞と接触させた後、前記ＮＮＭＴを発現する細胞を、表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンと接触させる。本発明のさらなる態様では、表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを、ＮＮＭＴを発現する細胞と接触させた後、前記ＮＮＭＴを発現する細胞を、本発明の１種以上のカチオンと接触させる。

一部の実施形態では、本発明は、治療有効量の１種以上のＮＮＭＴ阻害剤を投与することにより、筋肉治療を施す方法を包含する。一部の実施形態では、本発明は、治療有効量の本発明の１種以上のカチオンを投与することにより、筋肉治療を施す方法を包含する。本発明の別の態様は、治療有効量の１種以上のカチオンを投与することにより、筋肉治療を施す方法に関する。

さらなる実施形態では、本発明は、治療有効量の、１ｃ、１ｆ、１ｌ、１ｍ、２ｊ、２ｋ、２ｌ、２ｍ、２ａａ、１ｃ’、１ｆ’、１ｌ’、１ｍ’、２ｊ’、２ｋ’、２ｌ’、２ｍ’、及び２ａａ’から選択される１種以上のカチオンを投与することにより、筋肉治療を施す方法を包含する。

さらなる実施形態では、本発明は、治療有効量の、表１、２、３ａ、及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを投与することにより、筋肉治療を施す方法を包含する。さらなる実施形態では、本発明は、本発明の１種以上のカチオン並びに表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを治療有効量投与することにより、筋肉治療を施す方法を包含する。本発明の一態様は、治療有効量の本発明の１種以上のカチオンを、表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを同時投与しながら投与することにより、筋肉治療を施すことに関する。本発明の別の態様は、治療有効量の本発明の１種以上のカチオンを投与した後、表３ａ及び３ｂから選択される１種以上のカチオンを投与することにより、筋肉治療を施すことに関する。本発明のさらなる態様は、表３ａ及び３ｂから選択される、治療有効量の１種以上のカチオンを投与した後、本発明の１種以上のカチオンを投与することにより、筋肉治療を施すことに関する。

本発明の一態様は、１種以上のＮＮＭＴ阻害剤を、たとえば、動物の１個以上の細胞を接触させることにより投与して、
（ａ）限定はしないが、筋肉減少症、筋萎縮、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、ポンペ病、心筋症、肺障害を始めとする筋障害を処置及び／又は予防する
（ｂ）限定はしないが、急性筋傷害後、オーバーユース筋傷害後、慢性筋傷害後、体力／抵抗力及び／又は持久力トレーニング中、加齢に伴う筋機能不全中／後、筋萎縮症後を始めとして、神経筋機能を向上させる
（ｃ）限定はしないが、急性筋傷害後、オーバーユース筋傷害後、及び／又は慢性筋傷害後を始めとして、神経筋機能の回復に必要となる時間を短縮する
（ｄ）限定はしないが、急性、オーバーユース、及び／又は慢性筋傷害を生じかねない活動と関連するものを含めて、神経筋傷害を予防する
（ｅ）筋再生を向上させる
ことに関する。

さらなる実施形態では、ＮＮＭＴ阻害剤の投与は、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。さらなる実施形態では、ＮＮＭＴ阻害剤の投与は、ｉｎ ｖｉｖｏである。

一部の実施形態では、相乗又は相加効果を生じさせるために、ＮＮＭＴ阻害剤を、細胞内ＮＡＤ＋レベルを増大させる１種以上の化学的実体（たとえば、ニコチンアミドリボシド、ニコチンアミドモノヌクレオチド）と共に使用して、筋肉治療を施すことができる。

一部の実施形態では、本発明は、治療有効量の１種以上のＮＮＭＴ阻害剤を、細胞内ＮＡＤ＋レベルを増大させる１種以上の化学的実体（たとえば、ニコチンアミドリボシド、ニコチンアミドモノヌクレオチド）と共投与して筋肉治療を施すことにより、筋肉治療を施す方法を包含する。

さらなる実施形態では、本発明は、ＮＮＭＴを発現する細胞を、ＮＮＭＴ阻害剤（式Ｉ若しくはＩＡ、又は本明細書において別の形で開示するカチオンなど）及び細胞内ＮＡＤ＋レベルをモジュレートする１種以上の化学的実体（たとえば、ニコチンアミドリボシド、ニコチンアミドモノヌクレオチド）と接触させて筋肉治療を施すことにより、筋肉治療を施す方法を包含する。一部の実施形態では、本発明は、ＮＮＭＴを発現する細胞を、ＮＮＭＴ阻害剤（式Ｉ若しくはＩＡ、又は本明細書において別の形で開示するカチオンなど）及び細胞内ＮＡＤ＋レベルを増大させる１種以上の化学的実体（たとえば、ニコチンアミドリボシド、ニコチンアミドモノヌクレオチド）と接触させて筋肉治療を施すことにより、筋肉治療を施す方法を包含する。

本発明の一態様では、１種以上のＮＮＭＴ阻害剤（式Ｉ若しくはＩＡ、又は本明細書において別の形で開示するカチオンなど）を、細胞内ＮＡＤ＋レベルを増大させる１種以上の化学的実体（たとえば、ニコチンアミドリボシド、ニコチンアミドモノヌクレオチド）と同時に、ＮＮＭＴを発現する細胞と接触させて、筋肉治療を施す。一部の実施形態では、本発明は、１種以上のＮＮＭＴ阻害剤（式Ｉ若しくはＩＡ、又は本明細書において別の形で開示するカチオンなど）を、細胞内ＮＡＤ＋レベルをモジュレートする１種以上の化学的実体（たとえば、ニコチンアミドリボシド、ニコチンアミドモノヌクレオチド）と同時に、ＮＮＭＴを発現する細胞と接触させて、筋肉治療を施すことを包含する。

本発明の別の態様では、１種以上のＮＮＭＴ阻害剤（式Ｉ若しくはＩＡ、又は本明細書において別の形で開示するカチオンなど）を、ＮＮＭＴを発現する細胞と接触させた後、前記ＮＮＭＴを発現する細胞を、細胞内ＮＡＤ＋レベルをモジュレートする１種以上の化学的実体（たとえば、ニコチンアミドリボシド、ニコチンアミドモノヌクレオチド）と接触させて、筋肉治療を施す。

本発明の別の態様では、１種以上のＮＮＭＴ阻害剤（式Ｉ若しくはＩＡ、又は本明細書において別の形で開示するカチオンなど）を、ＮＮＭＴを発現する細胞と接触させた後、前記ＮＮＭＴを発現する細胞を、細胞内ＮＡＤ＋レベルを増大させる１種以上の化学的実体（たとえば、ニコチンアミドリボシド、ニコチンアミドモノヌクレオチド）と接触させて、筋肉治療を施す。

本発明のさらなる態様では、筋肉治療を施すための細胞内ＮＡＤ＋レベルをモジュレートする１種以上の化学的実体（たとえば、ニコチンアミドリボシド、ニコチンアミドモノヌクレオチド）を、ＮＮＭＴを発現する細胞と接触させた後、前記ＮＮＭＴを発現する細胞を、１種以上のＮＮＭＴ阻害剤（式Ｉ若しくはＩＡ、又は本明細書において別の形で開示するカチオンなど）と接触させる。

本発明のさらなる態様では、筋肉治療を施すための細胞内ＮＡＤ＋レベルを増大させる１種以上の化学的実体（たとえば、ニコチンアミドリボシド、ニコチンアミドモノヌクレオチド）を、ＮＮＭＴを発現する細胞と接触させた後、前記ＮＮＭＴを発現する細胞を、１種以上のＮＮＭＴ阻害剤（式Ｉ若しくはＩＡ、又は本明細書において別の形で開示するカチオンなど）と接触させる。
［実施例］

本発明のある特定の例示的実施形態の調製
化学。すべての試験化合物の同一性は、１Ｈ ＮＭＲ及びＨＰＬＣ−ＭＳによって確認され、純度は、９５％以上になるように徹底された（裏付け情報を参照されたい）。

ＳＡＭは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから、ニコチンアミドは、Ｆｌｕｋａ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ（南アフリカ国クワズール−ナタール、米国ではＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈが販売）から取得した。ＭＮＡ塩化物及びＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（ミシガン州アナーバー）から取得した。化合物はすべて、二段蒸留水中で作製した。

一般手順。別段指摘しない限り、反応はすべて、標準の合成化学法及び装備を使用して、市販品として入手可能な標準ガラス器具において実施した。空気及び水分に敏感な反応はすべて、無水条件下で、乾燥させた溶媒及びガラス器具を用い、窒素雰囲気中で実施した。出発材料及び試薬は、入手可能な最高純度の市販化合物とし、精製せずに使用した。反応に使用した溶媒には、工業用無水（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｄｒｙ）又は超無水（ｅｘｔｒａ−ｄｒｙ）又は分析グレードとの表示があった。分析薄層クロマトグラフィーは、Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ２５４でコートされたアルミニウムプレートで実施し、ＵＶ照射（２５４ｎｍ）によって、又は過マンガン酸カリウムの溶液で染色して可視化した。

フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｉｓｏｌｅｒａ Ｏｎｅ ２．２において、Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０（２３０〜４００メッシュ）シリカゲルが予め充填された市販のカラムを使用して実施した。生物学的試験用の化合物は、すべて、ＨＰＬＣ−ＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲによって測定される純度が９５％以上であった。

ＮＭＲ。ＮＭＲ実験は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＤ２ ４００ＭＨｚ分光計において周囲温度で記録した。サンプルを重水素化溶媒（ＣＤＣｌ_３、ＣＤ_３ＯＤ、及びＤＭＳＯｄ_６）に溶解させ、調製し、すべての場合において、残留溶媒を内部標準として使用した。重水素化溶媒ピークはすべて、標準化学シフト（ＣＤＣｌ_３，ｄ_Ｈ＝７．２６ｐｐｍ、ＣＤ_３ＯＤ，ｄ_Ｈ＝ ３．３１ｐｐｍ、ＤＭＳＯ−ｄ_６，ｄ_Ｈ＝２．５０ｐｐｍ）に対して補正した。スペクトルは、自動のベースライン補正後に、すべて手作業で積分した。化学シフト（ｄ）は、百万分率（ｐｐｍ）で示し、結合定数（Ｊ）は、ヘルツ（Ｈｚ）で示す。

プロトンスペクトルは、ｄ（多重度、結合定数Ｊ、プロトンの数）のように報告する。多重度を説明するのに、次の略語を使用した：ａｐｐ＝明白、ｂ＝ブロード、ｄ＝二重線、ｄｄ＝二重線の二重線、ｄｄｄ＝二重線の二重線の二重線、ｄｄｄｄ＝二重線の二重線の二重線の二重線、ｍ＝多重線、ｓ＝一重線、ｔ＝三重線。

ＨＰＬＣ−ＭＳ。サンプルはすべて、バイナリポンプと、デガッサーと、ＵＶ検出器とからなり、Ａｇｉｌｅｎｔ ６１５０質量分析計と連結されているオートサンプラーを備えた、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０シリーズのＨＰＬＣシステムにおいて分析した。純度は、２３０〜４００ｎｍの範囲内の１７０ｎｍのバンド幅を用いたＵＶ検出によって求めた。一般的なＬＣパラメーターは、次のとおりである。カラム− Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８、サイズ２．１×５０ｍｍ；溶媒Ａ：水中０．１０％のギ酸、溶媒Ｂ：アセトニトリル中０．００％のギ酸；流量− ０．７ｍＬ／分；勾配：５分で５％のＢ〜９５％のＢ、９５％のＢで２分間保持；ＵＶ検出器− チャネル１＝２５４ｎｍ、チャネル２＝２５４ｎｍ。質量検出器 ＡＪＳ−ＥＳ。

合成− 一般手順Ａ：ヨウ化メチル（ＭｅＩ）を使用するキノリニル環Ｎ−アルキル化
適切なキノリン誘導体（およそ１当量）及びＭｅＩ（別段指摘しない限り、およそ１．５当量）の０．５Ｍのイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）中の混合物を、９０℃でおよそ１２時間加熱した。反応液を周囲温度まで冷却し、得られた沈殿を真空濾過によって単離し、ＩＰＡ／Ｅｔ_２Ｏ（ｖ：ｖ／１：１）の混合物で洗浄し、真空乾燥した。

合成− 一般手順Ｂ：ＭｅＯＴｆを使用するキノリニル環Ｎ−アルキル化
適切なキノリン誘導体（およそ１当量）及びトリフルオロメタンスルホン酸メチル（ＭｅＯＴｆ）（別段指摘しない限り、およそ３当量）のトルエン（０．２Ｍ）中の混合物を、１００℃で１２時間加熱した。反応液を周囲温度に冷却し、Ｅｔ_２Ｏを加えて、沈殿を誘導した。得られる沈殿を真空濾過によって単離し、Ｅｔ_２Ｏで洗浄し、真空乾燥した。

本発明のある特定の例示的実施形態の調製
２−アミノ−１−メチルキノリン−１−イウムヨージド（１ｃ）

一般手順Ａに従って、表題化合物を灰色の粉末として得た（収率２６％）。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 9.45 (br, 1H), 8.87 (br, 1H), 8.34 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.01 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.87 (dd, J = 8.4, 7.6 Hz, 1H), 7.57 (dd, J = 7.6, 7.6 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H).ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＪＳ−ＥＳ）：Ｒｔ １．３１分、ｍ／ｚ１５９．１［Ｍ＋−Ｉ］。

１−メチル−３−（メチルアミノ）キノリン−１−イウムヨージド（１ｆ）

一般手順Ａに従って、表題化合物を橙色の粉末として得た（収率７２％）。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.90 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.22 (dd, J = 4.8, 4.4 Hz, 1H), 8.10 (dd, J = 4.8, 4.4 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 4.8, 4.4 Hz, 1H), 7.13 (br, 1H), 4.54 (s, 3H), 2.90 (s, 3H);ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＪＳ−ＥＳ）：Ｒｔ ０．７８分、ｍ／ｚ１７３．１［Ｍ＋−Ｉ］。

６−アミノ−１−メチルキノリン−１−イウムヨージド（１ｍ）

一般手順Ａに従って、表題化合物を橙褐色の粉末として得た（収率５８％）。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.94 (s, 1H), 8.77 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.18 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.83 (m, 1H), 7.58 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.11 (s, 1H), 6.46 (br, 2H), 4.48 (s, 3H);ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＪＳ−ＥＳ）：Ｒｔ ０．７４分、ｍ／ｚ１５９．１［Ｍ＋−Ｉ］。

３−アミノ−６−フルオロ−１−メチルキノリン−１−イウム（２ｊ）

一般手順Ａに従って、表題化合物を黄色の粉末として得た（収率５８％）。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.84 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.35 (dd, J = 9.6, 4.4 Hz, 1H), 7.99 (dd, J = 9.2, 2.8 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.76 (ddd, J = 8.8, 8.8, 3.2 Hz, 1H), 6.78 (br, 2H), 4.56 (s, 3H);ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＪＳ−ＥＳ）：Ｒｔ ０．２２分、ｍ／ｚ１７７．１［Ｍ＋−Ｉ］。

４−クロロ−１−メチル−８−（トリフルオロメチル）キノリン−１−イウム トリフルオロメタンスルホネート（２ｌ）

一般手順Ｂに従って、生成物の単離に過剰量のＭｅＯＴｆ（５当量）を使用し、表題化合物を薄灰色の粉末として得た（収率８８％）。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.56 (m, 1H), 8.33 - 8.10 (m, 2H), 7.59 (m, 1H), 6.47 (m, 1H), 3.93 (m, 3H);ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＡＪＳ−ＥＳ）：Ｒｔ ０．９２分、ｍ／ｚ２２６．１［Ｍ＋−ＯＳＯ_２ＣＦ_３］。

生物学。組換え型ｈＮＮＭＴの発現及び精製。ＩＰＴＧ誘導可能プラスミドｐＪ４０１発現ベクターにクローン化された、改変突然変異体ヒトＮＮＭＴ（ｍｔ−ｈＮＮＭＴ）［結晶構造において観察されなかったＮＮＭＴタンパク質のＣ末端から３つのアミノ酸残基を欠いている］（３ＲＯＤ、ＰＤＢ受入コード）を、ＤＮＡ２．０（カリフォルニア州メンローパーク）から購入した。ｍｔ−ｈＮＮＭＴの発現及び精製は、以前に報告されたプロトコールに手を加えたものとした。簡潔に述べると、この発現ベクターを使用して、化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１／ＤＥ３細胞を形質転換させた。ＢＬ２１形質転換体を、カナマイシン（ＫＡＮ）（３０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天プレートに播き、３７℃で終夜インキュベートし、これを、０．５ｍＭずつの塩化マグネシウム及びカルシウムと共に使用して１Ｌの培地に播種して、タンパク質を過剰発現させた。

培養物を、ＯＤ_６００が０．７〜０．８になるまで（〜２〜３時間）３７℃の振盪機に入れた後、０．５ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導し、さらに３時間インキュベートした。１０℃で２０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を除去することにより、細胞を収穫した。精製については、収穫した細胞を、冷やした溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ７．９］、０．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのイミダゾール、１０％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＳＦ）にまず再懸濁し、溶解混合物を氷上で超音波処理した。細胞可溶化液を４℃で３０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離した。可溶性分画を、溶解緩衝液で予め平衡化した、ニッケルセファロースビーズ（ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から生成されたニッケルアフィニティーカラムにかけた。

カラムを、溶解緩衝液（溶解緩衝液中５ｍＭのイミダゾール）及び漸増濃度のＮａＣｌ（０．５ｍＭ及び１ｍＭ）に続いて、漸増濃度のイミダゾール（溶解緩衝液中５ｍＭ及び２０ｍＭ）で洗浄して、混入しているタンパク質を除去した。溶解緩衝液、及び１ｍｌの一定分量中の１５０ｍＭのイミダゾール、２００ｍＭの塩、及び５％のグリセロールを用いて、結合したｍｔ−ｈＮＮＭＴをカラムから溶離させた。収集された分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動させて、タンパク質発現を検証し、貯蔵緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ ８．６］、２０％のグリセロール、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ）に対して透析した。プールされたタンパク質透析液濃度を、ＵＶ分光法によって求め、最終グリセロール濃度を２０％とした１２０ｕＬの一定分量に分割し、液体窒素でフラッシュ凍結し、−７０℃で貯蔵した。

ＮＮＭＴ活性アッセイ：ＨＰＬＣ計測及びクロマトグラフィー条件。以前に報告されたプロトコール（Ｐａｔｅｌら、２０１３）に手を加えることにより、ＮＮＭＴによって触媒された産物である１−メチルニコチンアミド（ＭＮＡ）を検出するためのＨＰＬＣ−ＵＶ法を開発した。手動サンプル注入器を備えたＳｈｉｍａｔｚｕ １０ＡＶＰ ＨＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｔｚｕ、日本国京都府）を使用して、１０ｍＭの１−ヘプタンスルホネート、２０ｍＭのリン酸二水素カリウム［ｐＨ３．１］、４％のメタノール、及び３％のアセトニトリルからなる移動相を用いた定組成勾配でＨＰＬＣ−ＵＶ法を実施した。クロマトグラフィー分離は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＥＰＳ Ｃ１８ １００Ａ ３ｕ（長さ：５３ｍｍ、内径：７ｍｍ、最大圧力：５０００ＰＳＩＧ）分析用カラム（Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、イリノイ州ディアフィールド）において、周囲温度で、移動相の流量を１ｍｌ／分に保ちながら実施した。サンプル注入体積は、１００μＬとし、実施時間は、１サンプルあたり２０分とした。

ＭＮＡ検量線及びＮＮＭＴ活性アッセイ。ＭＮＡピークを検出するための線形曲線を構築するために、１ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ８．６］、１ｍＭのＤＴＴ、１０％のトリクロロ酢酸、４％のメタノール、及び水を含有する反応緩衝液中に、１０〜０．３１２５ｕＭ／１００μＬに２倍連続希釈されたＭＮＡサンプルを調製した。同様に、１００μＭの、基質であるニコチンアミド、５μＭの、メチル供与体であるＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）、及び５μＭ濃度のＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＨ）サンプルについても、反応緩衝液［１ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ８．６］、１ｍＭのＤＴＴ、１０％のトリクロロ酢酸、４％のメタノール、及び水］中で個々に進めて、溶離時間を突き止め、基質、補因子、及び産物ピークを明確にした。ＭＮＡ、ニコチンアミド、ＳＡＭ、及びＳＡＨピークを、２６５ｎｍの波長を使用して検出した。ＮＮＭＴ活性を求めるために、水中に作製した１０ｍＭのニコチンアミド５μＬ、水中に作製した１ｍＭのＳＡＭ２．５μＬに、５００μＬの反応緩衝液を加えた。２５μＭの貯蔵精製ＮＮＭＴタンパク質４μＬを加えて反応を開始し（ＮＮＭＴの反応液中最終濃度は２００ｎＭとした）、３７℃の温熱ブロック上で６分間インキュベートし、その後、１０％トリクロロ酢酸と４％メタノールの混合物を加えて反応を終結させ、５秒間ボルテックス撹拌し、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、タンパク質を沈殿させた。上述のクロマトグラフィー条件を使用して１００μＬの上清を流すことにより、ＭＮＡについてのピーク面積及びピーク高さを求めた。各実験において、対照サンプルとして、ＮＮＭＴなしで反応を実施した。

阻害剤のＮＮＭＴ ＩＣ_５０曲線。ＮＮＭＴ反応産物を上述のとおりのＨＰＬＣによって分析し、１−ＭＱ及び１−ＭＱ類似体についての阻害曲線の構築に使用した。初めに、化合物を、１００μＭ又は１ｍＭの濃度でのＮＮＭＴ阻害活性について試験した（１００ｕＭで活性のない化合物を、１ｍＭの濃度で試験した）。１ｍＭで阻害活性が５０％を超える化合物を、包括的な濃度−反応分析（１００ｎＭ〜１ｍＭ／反応液１００μＬの濃度範囲）へと進めた。そうでなければ、ＩＣ_５０値が１０００ｕＭより高い、又は観察可能な阻害なし（ＮＩ）と報告される。データを正規化し、試験した濃度（ｕＭ）に対するＮＮＭＴ活性％として報告した。最小二乗法によって適合させた３パラメーター非線形回帰［阻害剤濃度対正規化されたＮＮＭＴ活性％］によって、ＩＣ_５０値を求めた（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ラホーヤ）。ＩＣ５０値が２０μＭより低い、かつ／又は曲線適合のためのＲ２値が０．８より小さい化合物については、データセットを二回又は三回運用し、分析のために平均した。

分子ドッキング。ＡｕｔｏＤｏｃｋ Ｖｉｎａプログラムを使用して、本発明のある特定の実施形態（及びある特定の構造類似体）を、ｍｔ−ｈＮＮＭＴ単量体鎖Ａ［３ＲＯＤ、ＰＤＢ受入コード］のＮＣＡ結合部位に、コンピューター上で合体させた。マイナスのＶｉｎａドッキングスコアが最も低い類似体立体構造が、ＮＮＭＴタンパク質のＮＣＡ活性部位内で、最も好都合な相互作用を有する、予測された結合型阻害剤立体構造に相当した。それぞれの化合物について、Ｖｉｎａドッキングスコアと、実験によって打ち立てられたＩＣ５０間で、ピアソンの相関を使用する相関分析を行った（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ラホーヤ）。

Ａｕｔｏ Ｄｏｃｋ Ｔｏｏｌｓ（ＡＤＴ）分子グラフィックスプログラムを使用して、各骨格内でＩＣ５０値が最低である類似体についての、ｈＮＮＭＴ単量体（３ＲＯＤ、ＰＤＢ受入コード）とのＶｉｎａドッキングから生成された合体出力ＰＤＢファイルを使って合体画像を作成した。ＬｉｇＰｌｏｔ＋プログラム（Ｗａｌｌａｃｅら、１９９５）でも、リガンドとｈＮＮＭＴ単量体（３ＲＯＤ、ＰＤＢ受入コード）についての合体ＰＤＢファイルを使用して、代表的な二次元像を作成し、ＮＮＭＴのＮＣＡ活性部位における鍵触媒残基と阻害剤類似体間の４Åの距離内に、水素結合及び疎水性相互作用が示唆された。ＮＮＭＴ／阻害剤接触図におけるＮＣＡ基質部位を使用して、このシステムのための初期のＳＡＲパラメーターを書き表し、開発した。

本発明のある特定の実施形態（及びその類似体）の生物学的評価
以下の表１及び２に示すカチオンの阻害活性を探ることにより、本発明のカチオンのＮＮＭＴ阻害能を調査した。本発明者らは、驚いたことに、カチオン１ｃ、１ｆ、１ｌ、及び１ｍが、ＮＮＭＴに対して阻害活性を示すことを見出した。

^ａＩＣ_５０値は、二回又は三回の測定値の平均±ＳＤで表される。

本発明者らは、驚いたことに、Ｒ^１がメチルであり、二重位置置換を有する本発明の特定の実施形態でも、阻害活性を見出した（たとえば、表２の化合物２ｊ、２ｍ、２ｋ、及び２ｌを参照されたい）。

^ａＩＣ_５０値は、二回又は三回の測定値の平均±ＳＤで表される。

本発明者らは、驚いたことに、本発明のある特定の類似体が、ＮＮＭＴ阻害能を有することも発見した（表３を参照されたい）。

^ａＩＣ_５０値は、二回又は三回の測定値の平均±ＳＤで表される。

^ａＩＣ_５０値は、二回又は三回の測定値の平均±ＳＤで表される。

阻害剤の分子ドッキング及び結合モード
本発明のある特定の実施形態について、ピアソンの相関を使用して、Ｖｉｎａドッキングスコアと、実験によって打ち立てられたＩＣ_５０値間の相関分析を行うと、若干の正の線形相関が示された（図２を参照されたい、ｒ＝０．６７６、ｐ＜０．０００１、Ｒ^２＝０．５）。最もマイナスのドッキングスコアを有する試験化合物の一部（すなわち、最低のドッキングスコア、たとえば、化合物１ｊ、ドッキングスコア＝−８．１）は、ターゲットであるＮＮＭＴ酵素とのより活発な相互作用を示すものであり、高い効力を示し（すなわち、１ｊ、ＩＣ_５０＝１．２μＭ）、逆もまた同じであった（ドッキングスコアが−６．０〜−５．０の間であるすべての化合物は、ＩＣ_５０が１０００μＭを超えていた）。

Ｖｉｎａドッキング計算は、ターゲットタンパク質の触媒ドメイン内での小分子阻害剤の結合モード、配向、及び立体構造を予測するのに有用であることがわかっている。

Ｖｉｎａドッキング計算によって、ターゲットタンパク質の触媒ドメイン内での小分子阻害剤の結合モード、配向、及び立体構造が予測されるため、ＩＣ_５０値が１．２μＭである１−ＭＱ類似体１ｊについての合体出力を使用して、Ａｕｔｏ Ｄｏｃｋ Ｔｏｏｌｓ（ＡＤＴ）分子グラフィックスプログラムを使いながら、１ｊの予測阻害剤結合モードを生成した。最もマイナスのドッキングスコアに有利である配向及び立体構造を有する１ｊの予測阻害剤結合モードからは、ＮＮＭＴ酵素の内因性基質であるＮＣＡと重ね合わせたとき、この類似体が、ＮＣＡの結合モードと一致して結合する、すなわち、両方のリガンドのＮ１原子は、ほとんど同一の並び方であり、酵素の活性部位内で、鍵残基との同様の分子相互作用が付与されたことが示唆された。

１ｊの結合モードでは、Ｔｙｒ２０、Ｔｙｒ２０４、Ｔｙｒ２４２、Ｌｅｕ１６４、Ａｌａ１９８、及びＡｌａ２４７残基（赤い切り込み線で強調された疎水性残基、図３）からなる、キノリニウムＮ１原子を取り囲む無極性ポケット内での強力な疎水性相互作用の成立が可能になる。これは、ＮＮＭＴの活性部位へのＮＣＡピリジン環結合に関する以前の報告と一致する。１ｊの予測結合モードからは、ＮＮＭＴ Ｓｅｒ２１３残基から水素結合距離にあるＮＣＡアミド基とは異なり、Ｃ５’−アミノ置換基によって、Ｓｅｒ２０１残基のカルボン酸主鎖との水素結合相互作用及びＳｅｒ２１３残基との疎水性結合が成立することが示唆される。１ｊについてのこうした相互作用は、内因性基質であるＮＣＡに比べて、１ｊのはるかに低い計算Ｖｉｎａドッキングスコア（−８．１、対ＮＣＡ）によってさらに示された、より密な結合親和性を促進する可能性があり、ＮＮＭＴ活性部位における１ｊについての活発な相互作用の向上が示唆される。

筋組織におけるＮＮＭＴタンパク質発現は、老齢（２７か月齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス）個体において、若齢（３か月齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス）個体に比べて有意に大きかったことが観察された（図５）。したがって、ＮＮＭＴ阻害剤によって、老齢筋肉におけるＮＮＭＴ活性が低減されて、老齢筋細胞におけるＮＡＤ＋サルベージ回路が、若齢筋細胞において観察される機能に戻るといえる。

ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞内１−ＭＮＡレベルを低減し、脂質生合成を妨げる、膜透過性の高い選択的阻害剤としての小分子ＮＮＭＴ阻害剤を調査した。さらに、最も強力な阻害剤は、全身投与されたとき、観察可能な有害作用を引き起こすことなく、体重及び脂肪症の実質的な減少を引き起こすことにより肥満を後退させるという仮説を検証する、食事性肥満マウスにおける概念実証ｉｎ ｖｉｖｏ研究を実施した。

材料及び方法
化学。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ研究のためのＮＮＭＴ阻害剤及び標準物質は、確立された市販品供給業者から購入し、又は以前に記載されているとおりに、確立された合成スキームによって社内で合成した。ＳＡＭ、ＮＡ、１−ＭＱ、１，８−ジＭＱ、ＮＡＤ＋、及び６−クロロニコチンアミド（６−ＣＮ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）から入手した。１−ＭＮＡ及びＳ−（５’−アデノシル）−Ｌ−メチオニン（ＳＡＨ）は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（米国ミシガン州アナーバー）から取得した。

５．１ 平行人工膜透過性アッセイ（ＰＡＭＰＡ）。膜孔径が０．４μｍである９６ウェルプレコーティッドＰＡＭＰＡプレートシステム（Ｇｅｎｔｅｓｔ（商標）、Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国マサチューセッツ州ベッドフォー）を使用して、受動膜輸送特性を測定した。簡潔に述べると、各化合物の１ｍＭの保存液を脱イオン水中に調製し、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）中に希釈して最終濃度を４００μＭとし、プレート下層ウェル（ドナーウェル）に入れた。室温で４時間インキュベートした後、各化合物の吸収極大に相当する波長に設定した紫外可視分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＤＵ６４０）を使用して、ドナー及びアクセプターウェルにおけるサンプル濃度を測定した。４００〜３．１２５μＭにかけての検量線から、ドナー及びアクセプターウェルにおける化合物濃度を算出した。サンプルは、３つの別々の実験において三回試験した。

Ｃａｃｏ−２細胞を用いた双方向透過性アッセイ。確立された調査請負機関（Ｃｙｐｒｏｔｅｘ、米国マサチューセッツ州ウォータータウン）を利用してのＣａｃｏ−２細胞双方向透過性アッセイにおいて、化合物を試験した。簡潔に述べると、Ｃａｃｏ−２細胞を９６ウェルプレートに播き、培地において、２日おきに養分を与えながら３週間増殖させた。実験開始前に明確なＣａｃｏ−２細胞単層を確保するために、一定分量の細胞緩衝液を蛍光分析にかけて、不透過性染料ルシファーイエローの輸送を判定した。頂端から基底面（Ａ→Ｂ）及び基底面から頂端（Ｂ→Ａ）への透過性について、化合物を、それぞれ、頂端（Ａ）側及び基底面（Ｂ）側に１０μＭの濃度で加え、Ｂ側又はＡ側における化合物濃度を測定することにより、対応する透過量を求めた。Ａ側緩衝液は、輸送緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ中１．９８ｇ／Ｌのグルコース、１倍ハンクス平衡塩類溶液、ｐＨ７．４）中に１００μＭのルシファーイエロー染料を含有し、Ｂ側緩衝液は、ｐＨ７．４の輸送緩衝液とした。Ｃａｃｏ−２細胞を、これらの緩衝液と共に２時間インキュベートし、受け器側緩衝液を、（分析用内部標準としてブセチンを使用する）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析用に取り出した。データを、次式を使用して算出した透過性（Ｐａｐｐ）として示した。

５．２． ＭＴＴ細胞生存度アッセイ。３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞（カタログＣＬ−１７３、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国ヴァージニア州マナッサス）を、９６ウェルプレートに、ウェルあたり２×１０３細胞の密度で播き、標準培地［ＤＭＥＭ、４．５ｇ／Ｌのグルコース、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、米国マサチューセッツ州テュークスベリー）、１０％のＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）、１％の抗菌抗カビ溶液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、米国マサチューセッツ州テュークスベリー）］で培養し、集密度が〜９０％を超えるまで４８時間増殖させた。細胞培養培地において、細胞を０．１〜６００μＭのＮＮＭＴ阻害剤で２４時間処理した。３Ｔ３−Ｌ１細胞をＮＮＭＴアンチセンスオリゴヌクレオチド又は小分子ＮＮＭＴ産物阻害剤（１−ＭＮＡ）でそれぞれトランスフェクト又は処理するのに２４時間の期間を使用するという以前の報告に基づき、表現型測定に２４時間時点を選択した。各ウェルにＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（ＡＴＣＣ、米国ヴァージニア州マナッサス）を加え、製造者の指示に従ってアッセイにかけた。処理された細胞によって産生されたホルマザン色素の量に対応する吸光度を、対照（未処理）細胞によって産生されたものに対して正規化して、処理されたサンプル中の生細胞％を算出した。

５．３． ３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞の分化。３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞を標準培地（ＤＭＥＭ、４．５ｇ／Ｌのグルコース、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、１０％のＦＢＳ、１％の抗菌抗カビ溶液）で培養し、４８時間増殖させた後、製造者が提案し、以前の公開著述に手を加えたプロトコールを使用して、分化を起こさせた。簡潔に述べると、３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞の脂肪細胞への分化を促進するために、脂肪生成剤［３−イソブチル−１メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州）、デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州）、インスリン（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、米国ニューヨーク州グランドアイランド）］を１０日間かけて計画的に加えることにより標準培地を補充し、完全に集密な３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞に、培地中１ｍＭのＩＢＭＸと１μＭのデキサメタゾンと１０μｇ／ｍｌのインスリンの組合せを３日間（０〜３日目）加えて、分化を起こさせた。３日目に、培地を、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）で補充した培地と差し替えた。６日目の後、記載する実験を開始するまで（８〜１０日目）細胞を培地に維持した。

５．４． 培養細胞におけるＮＮＭＴ反応産物である１−ＭＮＡの定量的測定。Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０超高圧クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）システムに連結された超高感度高分解能ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ６５００ Ｑ−ｔｒａｐ質量分析計を使用して、細胞の１−ＭＮＡ濃度を求めた。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）陽イオンモードを使用しながら、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ Ａｎａｌｙｓｔ及びＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ ２．１ソフトウェア、並びにそれぞれｍ／ｚ１３７．１及び９４．１に設定した親プリカーサー及びＱ３質量を使用して、ピーク面積比から、１−ＭＮＡ ＮＮＭＴ反応産物を定量化した。１−ＭＮＡの検出及び確認に、ｍ／ｚがそれぞれ９２．１及び７７．９であるフラグメントイオンをさらに使用した。培養した３Ｔ３−Ｌ１細胞バッチ（〜７〜８継代目）すべてにわたって、未分化の３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞（０日目）及び分化した脂肪細胞（１０日目）の加工処理を、１−ＭＮＡレベルの回復及び再現性について最適化し、１−ＭＮＡレベルを前脂肪細胞と脂肪細胞とで比較した。前脂肪細胞及び分化した脂肪細胞（分化を起こす前に播かれた８×１０４細胞／ウェル）におけるＮＮＭＴ阻害剤のＮＮＭＴ活性に対する効果を明らかにするために、細胞を３０μＭの阻害剤で２４時間処理した。同様に、培養脂肪細胞においてＮＮＭＴ活性に対するいくつものＮＮＭＴ阻害剤の相対的な効果を比較するために、６ウェルプレート中の分化した脂肪細胞を、１０μＭの試験化合物で２４時間処理した。処理後、培地を、内部標準（ＩＳ）としての５００ｎｍｏｌの６−クロロニコチンアミド（６−ＣＮ）を含有する８０％（ｖ／ｖ）のメタノール（−８０℃に冷却）と差し替えて、細胞代謝産物を抽出した。付着細胞をこすり落とし、次いで、４℃で１５分間、１３０００ｇで遠心分離し、得られる上清を、確立されたプロトコールを使用して加工処理した。１−ＭＮＡ並びにＩＳの細胞内レベルを、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳピーク面積から求めた。引き続いて、サンプル間比較のために、データをＩＳピーク面積に対して正規化し、対対照値％として変換した。０．３〜６０μＭにかけての阻害剤濃度で上記手順を繰り返して、培養脂肪細胞において５０％のＮＮＭＴ活性を阻害するのに必要となる有効濃度（ＥＣ５０）を求めた。阻害剤濃度及び期間の選択は、ＭＴＴ研究の結果に基づいて行った。

５．４． 培養細胞における選択された代謝産物の定量的測定。ＮＮＭＴと関連する細胞エネルギー消費経路によって調節される選択された代謝産物（ＮＡ、ＳＡＭ、ＳＡＨ、ＮＡＤ＋）の相対的レベルを、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ及びＭＲＭ比を使用して並行して検出した。サンプル加工処理は、上述のとおりに行った。１２４．０、３９９．３、３８５．１、及び６６５．１Ｄａの親プリカーサー質量、並びにｍ／ｚ８０．０、２５０．１、１３６．０、及び１３６．０に設定したＱ３質量を、それぞれ、ＮＡ、ＳＡＭ、ＳＡＨ、及びＮＡＤ＋の定量化に使用した。

５．５． ＮＮＭＴ阻害剤の選択性。カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、及びタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ３（ＰＲＭＴ３）を含む、構造が類似した３種のメチルトランスフェラーゼに対する活性について、試験化合物を生化学的アッセイでスクリーニングした。追加の生化学的アッセイを使用して、化合物が、ＮＡＤ＋生合成／サルベージ経路における２種の酵素であるニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）及びＮＡＤ＋依存性タンパク質デアセチラーゼサーチュイン１（ＳＩＲＴ１）を阻害する能力を試験した。アッセイはすべて、Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＲＢＣ、米国ペンシルヴェニア州モルバーン）が実施し、完全なアッセイ細目を以下に記す。各試験化合物について、１０段階の濃度の半対数希釈系列を用いて作成された用量反応曲線からＩＣ５０値を算出した。アッセイ毎に、確立された酵素特異的阻害剤を、酵素機能及びアッセイ再現性についての陽性対照として含めた。４パラメーター用量反応曲線の補正されたデータ点への非線形最小二乗適合によって、ＩＣ５０値を求めた（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０、米国カリフォルニア州ラホーヤ）。

５．５（ａ）． ＤＮＭＴ１活性アッセイ。ＲＢＣが、１００μＭ〜５ｎＭのＳＡＨを阻害剤陽性対照として使用して、放射測定アッセイを実施した。類似体である１，８−ジＭＱ及び５−アミノ−１ＭＱを、それぞれ２００μＭ〜１０ｎＭ及び６００μＭ〜１０ｎＭの濃度で試験した。０．００１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ基質Ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）、１μＭの放射標識Ｓ−アデノシル−Ｌ−［メチル−３Ｈ］メチオニン（ＳＡＭ）補助基質、及び組換え型ヒトＤＮＭＴ１酵素を用いて反応を実施した。放射標識された反応産物であるＤＮＡ５−［メチル−３Ｈ］−シトシンを定量化することにより、活性をモニターした。

５．５（ｂ）． ＰＲＭＴ３活性アッセイ。ＲＢＣが、１００μＭ〜５ｎＭのＳＡＨを阻害剤陽性対照として使用して、放射測定アッセイを実施した。類似体である１，８−ジＭＱ及び５−アミノ−１ＭＱを、それぞれ２００μＭ〜１０ｎＭ及び６００μＭ〜１０ｎＭの濃度で試験した。５μＭのヒストンＨ３（ヒストンＬ−アルギニン）基質、１μＭの放射標識Ｓ−アデノシル−Ｌ−［メチル−３Ｈ］メチオニン（ＳＡＭ）補助基質、及び組換え型ヒトＰＲＭＴ３酵素を用いて反応を実施した。放射標識された反応産物であるヒストン［メチル−３Ｈ］−Ｌ−アルギニンを定量化することにより、活性をモニターした。

５．５（ｃ）． ＣＯＭＴ活性アッセイ。ＲＢＣが、１μＭ〜５０ｐＭのトルカポンを阻害剤陽性対照として使用して、放射測定アッセイを実施した。類似体である１，８−ジＭＱ及び５−アミノ−１ＭＱを、それぞれ２００μＭ〜１０ｎＭ及び６００μＭ〜１０ｎＭの濃度で試験した。０．５μＭのカテコール基質ＣＯＭＴ−Ｓ０１、１μＭの放射標識Ｓ−アデノシル−Ｌ−［メチル−３Ｈ］メチオニン（ＳＡＭ）補助基質、及び組換え型ヒトＣＯＭＴ酵素を用いて反応を実施した。メチル化されたカテコール反応産物（グアイアコール［メチル−３Ｈ］）を定量化することにより、活性をモニターした。

５．５（ｄ）． ＮＡＭＰＴ活性アッセイ。ＲＢＣが、１μＭ〜５０ｐＭのＦＫ８６６を阻害剤陽性対照として使用して、蛍光定量的アッセイを実施した。類似体である５−アミノ−１ＭＱを、６００μＭ〜３０ｎＭの濃度で試験した。１ｍＭのＡＴＰ及び組換え型ヒトＮＡＭＰＴ酵素の存在下、２μＭのニコチンアミド及び３０μＭのホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）を用いて反応を実施した。ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）反応産物の蛍光検出及び定量化を使用して、活性をモニターした。

５．５（ｅ）． ＳＩＲＴ−１活性アッセイ。ＲＢＣが、１００μＭ〜５ｎＭのスラミンナトリウムを阻害剤陽性対照として使用して、蛍光定量的アッセイを実施した。類似体である５−アミノ−１ＭＱを、６００μＭ〜３０ｎＭの濃度で試験した。５０μＭのＲＨＫＫＡｃ、ｐ５３残基３７９〜３８２からの蛍光発生ペプチド基質、５００μＭのＮＡＤ＋補助基質、及び組換え型ヒトＳＩＲＴ−１（ＮＡＤ＋依存的）酵素を用いて反応を実施した。ＳＩＲＴ−１による基質の脱アセチル化に続いてフルオロフォアを二次的に放出するものであった２段階の結合反応によって生じる蛍光産物（クマリン）の生成によって、活性をモニターした。

５．６． 食事性肥満（ＤＩＯ）マウスにおけるＮＮＭＴ阻害剤５−アミノ−１ＭＱの効果。高脂肪食（ＨＦＤ）を（６週目に開始して）１１週間給餌された１７週齢の雄ＤＩＯ Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国メイン州バーハーバー）から購入した。マウスを、最初にグループで収容し（３匹／ケージ）、１２時間の明暗サイクル（０６００〜１８００時点灯）で、一定の温度（２１〜２３℃）及び湿度（４０〜５０％）に保たれたコロニー環境に順化させた。到着後、マウスには、４５％の脂肪由来エネルギーを含んだＨＦＤ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｉｎｃ．のＯｐｅｎ Ｓｏｕｒｃｅ ＤｉｅｔｓフォーミュラＤ１２４５１、米国ニュージャージー州ニューブランズウィック）を給餌し続けた。水は、自由に利用可能とした。

実験はすべて、実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に従って、またテキサス大学医学部におけるＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を得て実施した。７日間順化させた後、マウスを単独で収容し、ＨＦＤをさらに４週間継続させた。マウスは、体重及び食物摂取（ホッパー重量）を１週間に２〜３回測定しながら、断続的に取り扱った。ＨＦＤが合計１６週間給餌され（ＤＩＯの適切なげっ歯類モデル、ヒト肥満に匹敵）、到着前体重（〜３８ｇ）に達した後、マウスを、群平均重量及び標準偏差が同様であるバランスのとれた対照及び処置コホート（ｎ＝９／コホート）にランダム化した。媒体コホートのマウスには、３回の皮下（ＳＣ）食塩水（１ｍｌ／ｋｇ）注射／日（〜０９３０、１３３０、１７３０時）を施し、処置コホートのマウスには、ＮＮＭＴ阻害剤５−アミノ−１ＭＱの３回のＳＣ注射を、親化合物の合計用量を〜３４ｍｇ／ｋｇ／日（無体重に従って算出）とするための２０ｍｇ／ｋｇ／注射の用量で１１日間施した。選択した用量は、ＤＩＯマウス（ｎ＝２）における（１０ｍｇ／ｋｇ／日から１５０ｍｇ／ｋｇ／日の合計用量の範囲での）初期用量増大研究に基づいており、６０ｍｇ／ｋｇ／日の合計用量が、観察可能な有害作用なしに、申し分なく忍容された。体重及び食物摂取を１日おきに測定した。１２日目に、マウスを４時間の絶食期間にかけ、次いで、イソフルランを使用して深麻酔し、断頭によって躯幹血液を収集した。すべてのサンプルから血漿を分離し、サンプルの血漿脂質−パネル測定（総コレステロール及びトリグリセリド）を、Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＴＶＭＤＬ、米国テキサス州カレッジステーション）に委託した。トリグリセリド値は、サンプルの溶血性がアッセイにおけるトリグリセリド試薬に支障を来したことによって測定が混乱したため、分析に含めなかった。すべてのマウスから精巣上体脂肪パッド（精巣上体白色脂肪組織、ＥＷＡＴ）を切除し、秤量し、さらなる加工処理のために、１０％緩衝ホルマリン中に固定した。

５．７． 組織学的分析。ホルマリン固定したＥＷＡＴサンプルをパラフィン包埋し、薄片にし（４μＭ）、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭ ＬＢ）を使用して、２０倍の倍率で像を取得し、自動画像解析用にデジタル方式で撮影した。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）において「Ａｄｉｐｏｓｏｆｔ」プラグインソフトウェアを使用して画像を解析した。簡潔に述べると、画像を８ビット画像に変換し、（Ｌｅｉｃａ顕微鏡における２０倍の倍率に相当する）１画素あたり０．３６６ミクロンに調整した。最小及び最大直径パラメーターを割り当てて、自動脂肪細胞面積計算に適した細胞を特定し、画像の境界に沿った細胞を解析から除外した。サンプルあたり３件〜５件の画像を解析し、自動解析を目視検査によって確認した。各サンプルに対応する画像の平均をとって、サンプルあたりの平均脂肪細胞面積（μｍ２）を取得し、合わせて、対照（媒体処置ＥＷＡＴサンプル）及び処置（ＮＮＭＴ阻害剤処置ＥＷＡＴサンプル）コホートについて群平均値を算出した。

５．８． オイルレッドＯ染色によって定量化した、脂肪細胞分化に対するＮＮＭＴ阻害剤の効果。直径６０ｍｍのシャーレにおいて３Ｔ３−Ｌ１細胞を培養し（８．４×１０４細胞／シャーレ）、（上述した）分化過程の間の計画的な培地交換それぞれの際に、脂肪生成要素（１ｍＭのＩＢＭＸ、１μＭのデキサメタゾン、１０μｇ／ｍｌのインスリン）を含む／含まない培地に溶解させたＮＮＭＴ阻害剤で処理した。分化後９日目に、公開されているプロトコールを適合させ、改変しながら、細胞を定量的オイルレッドＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）染色にかけた。簡潔に述べると、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、室温にて１０％ホルマリンで３０分間固定し、オイルレッドＯ希釈標準溶液（９９％のイソプロパノール中〜０．２％のオイルレッドＯ）で３０分間染色した。次いで、取り込まれていないオイルレッドＯ染色剤が完全に除去されるまで、細胞を滅菌水で５回洗浄した。対照及び阻害剤処理細胞におけるオイルレッドＯ染色の像を、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４１、日本国東京都）を使用してデジタル方式で撮影した。画像を取り込んだ後、各シャーレに２−プロパノール（３．５ｍＬ）を１０分間加えて、オイルレッドＯ染色剤を溶解させ、４９２ｎｍの波長に設定したプレートリーダーにおいて吸光度を定量化した。オイルレッドＯ染色からの吸光度がプレートリーダーの線形検出範囲内になったことを確実にするために、以前に記載されているプロトコールを使用して、脂肪細胞におけるオイルレッドＯ染色についての検量線を作成した。

５．９． 統計分析。対応のないスチューデントのｔ検定を使用して、２群比較のための統計分析を行った。ダネットの事後検定を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、複数の群（細胞の評価における異なる阻害剤処理又は濃度効果）を対照と比較した。ＤＩＯマウスにおける体重尺度に対する毎日のＮＮＭＴ阻害剤効果は、Ｓｉｄａｋの多重比較事後検定を用いた反復測定二元配置ＡＮＯＶＡを使用して分析した。統計分析はすべて、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０を使用して、実験基準過誤率α＝０．０５として実施した。

結果
５．１０． ＮＮＭＴ阻害剤は、高い膜透過性を示す。ＮＮＭＴ阻害について〜１００倍のＩＣ５０値に及ぶ化合物を、Ｎ−メチル化キノリニウム骨格周囲での位置置換に基づいて選択して、薬物様の経口吸収／生物学的利用能特性の概算を実現し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ表現型研究のための阻害剤の選択を導いた。表４及び５に、構造活性関係が以前に明らかにされている小分子ＮＮＭＴ阻害剤を選択するための、受動的な膜拡散及び能動輸送膜透過性をそれぞれ要約する。ＮＮＭＴの産物阻害剤である１−ＭＮＡは、受動透過性を示さなかった（表４）。同様に、キノリニウムを含んでいる親類似体１−ＭＱも、受動拡散特性を欠いており（表４）、メチルキノリニウムシリーズ内の類似体の親油性及び薬物様透過性特性を化学修飾によって改善する必要があったことが示唆された。このために、本発明者らは、分配計数（ｃｌｏｇＰ）のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ計算によって導いた、いくつかの過メチル化キノリニウム類似体を合成した。キノリニウム骨格周囲に疎水性メチル基置換を加える（ＮＮＭＴ阻害活性にマイナスの影響を与えることが以前から知られている）ことだけが、１，８−ジＭＱ及び１，２，４，８−テトラＭＱについての低いがゼロではない透過性値によって示されるとおり、受動輸送による膜透過性をわずかに向上させた（表４）。対照的に、キノリニウムコア周囲での極性アミン位置置換は、以前に言及したとおりＮＮＭＴ阻害を向上させただけでなく、膜を介した好都合な受動及び能動輸送も可能にした（表４及び５）。詳細には、５−アミノ−１ＭＱ及び７−アミノ−１ＭＱは、膜を介した高い受動及び能動輸送を示し、Ｃａｃｏ−２細胞アッセイにおいて、検出可能な流出が認められなかった。対照的に、１ＭＱ骨格における２，３−ジアミノ置換（２，３−ジアミノ−１ＭＱ）は、高い受動透過性を示したが（表４）、中程度の流出比を伴って、中程度の双方向能動輸送を示した（表５）。ＰＡＭＰＡ測定値と一致して、１，８−ジＭＱ類似体は、Ｃａｃｏ−２細胞アッセイにおいて非常に低い双方向輸送を示した（表５）。

５．１１． ＮＮＭＴ阻害剤が３Ｔ３−Ｌ１細胞生存度に及ぼす影響。３種の膜透過性ＮＮＭＴ阻害剤、５−アミノ−１ＭＱ、７−アミノ−１ＭＱ、及び２，３−ジアミノ−１ＭＱの細胞毒性効果を、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞において評価した。細胞を１０μＭの５−アミノ−１ＭＱ又は７−アミノ−１ＭＱ及び３００μＭの２，３−ジアミノ−１ＭＱで２４時間処理しても、細胞生存度には影響が及ばなかった（図１）。５−アミノ−１ＭＱ及び７−アミノ−１ＭＱは、未処理細胞に比べると、１００〜３００μＭの範囲の濃度で穏当な細胞毒性を生じた（Ｐ＜０．０１、処理対対照未処理細胞）。３種すべての化合物が、試験した最高濃度で〜４０％の細胞毒性を示した（Ｐ＜０．００１、６００μＭ処理細胞対対照未処理細胞）。

５．１２． 分化３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞は、ＮＮＭＴ阻害剤作用機序を実証するための、妥当な細胞主体システムとなる。ＮＮＭＴ阻害剤を作用機序及び表現型によって特徴付けるための細胞主体システムとして分化３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を利用できるかを明らかにするために、本発明者らは、ＮＮＭＴの発現レベルを測定し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して、完全に分化した脂肪細胞（分化後９〜１０日目）及び未分化の前脂肪細胞（０日目）におけるＮＮＭＴ反応産物１−ＭＮＡのレベルを評価した。ＮＮＭＴタンパク質発現は、脂肪細胞（９日目）において、前脂肪細胞に対して〜３７倍の高さになることがわかった（Ｐ＜０．０００１）。同様に、総細胞タンパク質に対して正規化した１−ＭＮＡレベルも、脂肪細胞では、前脂肪細胞に比べて〜７．５倍の高さになり（Ｐ＜０．０５、前脂肪細胞対脂肪細胞）、完全に分化した脂肪細胞ではＮＮＭＴ酵素の活性が相対的に高いことが示唆された。前脂肪細胞（Ｐ＜０．０１、処理前脂肪細胞対未処理対照）と脂肪細胞（Ｐ＜０．０５、処理脂肪細胞対未処理対照）の両方において５−アミノ−１ＭＱ（３０μＭ濃度）を使用してＮＮＭＴを阻害すると、１−ＭＮＡの細胞内レベルは有意に低下した。

５．１３． ＮＮＭＴ阻害剤は、分化脂肪細胞における１−ＭＮＡの産生を減少させる。分化脂肪細胞において１−ＭＮＡレベルを低下させるＮＮＭＴ阻害剤の相対的な有効性を、１０μＭの単一濃度（ＮＮＭＴ阻害剤の細胞毒性濃度範囲を十分に下回る濃度）で比較した。脂肪細胞を膜透過性ＮＮＭＴ阻害剤で２４時間処理すると、細胞１−ＭＮＡレベルは、未処理対照脂肪細胞における１−ＭＮＡのレベルに比べて有意に低下した（Ｆ（５，６）＝４２．６４、Ｐ＜０．０００１）。ダネットの事後検定によって、試験したすべての膜透過性ＮＮＭＴ阻害剤が、脂肪細胞における１−ＭＮＡレベルを、対照に比べて有意に低下させたことが明らかになった（対照未処理脂肪細胞に対して、それぞれ、５−アミノ−１ＭＱ、Ｐ＜０．００１；３−アミノ−６−フルオロ−１ＭＱ、Ｐ＜０．０１；及び２，３−ジアミノ−１ＭＱ、Ｐ＜０．０５）。対照的に、膜透過性の不十分なＮＮＭＴ阻害剤である１，２，４，８−テトラＭＱでは、細胞内１−ＭＮＡレベルが、未処理対照に比べて有意に低下しなかった（Ｐ＞０．０５、ｎ．ｓ．）。試験した阻害剤の中でも、ＩＣ５０値が低く（ＩＣ５０＝〜１μＭ）、膜透過性の高い（表５）、本発明者らの初期のＮＮＭＴ阻害剤シリーズからの類似体である５−アミノ−１ＭＱは、１０μＭの濃度で、細胞内１−ＭＮＡレベルの最も大幅な低下を生じた。これらの結果に基づき、本発明者らは、様々な５−アミノ−１ＭＱ濃度での２４時間の処理に応じた細胞内１−ＭＮＡの変化をモニターした。５−アミノ−１ＭＱは、完全に分化した脂肪細胞において、３パラメーターシグモイド用量反応曲線に適合させることのできた、濃度依存的なＮＮＭＴの阻害を示し、ＥＣ５０＝２．３＋／−１．１μＭが算出された（図６Ａ〜Ｂ、適合度Ｒ２＝０．９４）。

１０〜６０μＭの範囲の阻害剤濃度において、相対的な細胞内１−ＭＮＡレベルは、未処理脂肪細胞について観察されたレベルの〜４０％で安定化し、６０μＭより高い濃度は、３Ｔ３−Ｌ１細胞における細胞毒性効果が不明であるため試験しなかった。

５．１４． ＮＮＭＴ阻害は、分化脂肪細胞においてＮＡＤ＋及びＳＡＭの細胞内濃度を増大させる。図１Ａに、ＮＡを出発基質として使用する哺乳動物ＮＡＤ＋サルベージ経路の主な要素の概略を示す。ＮＮＭＴ阻害剤である５−アミノ−１ＭＱによって細胞内１−ＭＮＡ濃度が有意に低下したため、本発明者らは、脂肪細胞におけるＮＮＭＴ阻害によって、補助基質であるＮＡ及びＳＡＭの細胞内濃度が増大し、より多くのＮＡがＮＡＤ＋サルベージ回路へと向けられるという仮説を立てた。一元配置ＡＮＯＶＡによって、ＮＮＭＴ阻害剤処理の細胞内ＮＡＤ＋レベルに対するほぼ有意な主効果が明らかになり（Ｆ（５，６）＝４．１３１、Ｐ＝０．０５６８）（図７）、脂肪細胞をＮＮＭＴ阻害剤である５−アミノ−１ＭＱで処理すると、ＮＡＤ＋レベルは、濃度依存的に増大し、１〜６０μＭの範囲の濃度では、ＮＡＤ＋レベルが、対照脂肪細胞に比べて〜１．２〜１．６倍増大した。ダネットの後検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔｔｅｓｔｓ）によって、１０μＭの阻害剤濃度でのＮＡＤ＋レベルの有意な増大が明らかになった（対照に対してＰ＜０．０５、図７）。同様に、一元配置ＡＮＯＶＡによって、脂肪細胞における細胞内ＳＡＭレベルに対するＮＮＭＴ阻害の有意な主効果が明らかになった（Ｆ（５．５）＝７．３５、Ｐ＝０．０２３６）（図７）。ダネットの後検定によって、より高い濃度での、細胞内ＳＡＭレベルの、対照脂肪細胞と比べて有意な増大が明らかになった（３０μＭ、Ｐ＜０．０５；６０μＭ、Ｐ＝０．０６）。しかし、ＮＡ（Ｆ（５，６）＝１．０３１、Ｐ＞０．０５）及びＳＡＨ（Ｆ（５，６）＝０．３３４、Ｐ＞０．０５）の細胞内レベルについては、ＮＮＭＴ阻害剤処理の統計的に有意な主効果が観察されなかった（図３Ｂ）。

５．１５． ＮＮＭＴ阻害剤は、選択的であり、関連メチルトランスフェラーゼ又はＮＡＤ＋サルベージ経路における酵素に影響を及ぼさない。構造が類似したメチルトランスフェラーゼ及びＮＡＤ＋サルベージ経路における２種の酵素のパネルに対して試験することにより、ＮＮＭＴ阻害剤の選択性を確認した（ＮＡＭＰＴ及びＳＩＲＴ１、図１Ａ及び７）。それぞれ１０ｎＭ〜２００又は６００μＭの範囲の１，８−ジＭＱ及び５−アミノ−１ＭＱの濃度では、ＤＮＭＴ１又はＰＲＭＴ３が阻害されなかった。試験したＮＮＭＴ阻害剤濃度でＤＮＭＴ１及びＰＲＭＴ３の有意な阻害が観察されなかったため、シグモイド用量反応曲線、及び利用可能なデータに対する非線形最小二乗適合に基づく信頼性のあるＩＣ５０推定値を得ることはできなかった（表６）。加えて、１，８−ジＭＱ及び５−アミノ−１ＭＱは、濃度依存的な阻害の明確な傾向が認められなかったものの、それぞれ、２００μＭ（２０％の阻害）及び６００μＭ（１０％の阻害）の最大試験濃度で、ＣＯＭＴの阻害をわずかしか示さなかった。ＤＮＭＴ１及びＰＲＭＴ３について言及したとおり、試験したＮＮＭＴ阻害剤濃度で有意な阻害が観察されなかったため、シグモイド用量反応曲線及び信頼性のあるＩＣ５０推定値を得ることはできなかった。

５−アミノ−１ＭＱは、１００μＭの試験濃度までＮＡＭＰＴを阻害せず、１００μＭを上回る５−アミノ−１ＭＱ濃度では、ＮＡＭＰＴアッセイ読み出しシグナルに支障が出たため、信頼性のあるデータを得ることはできなかった（表６）。しかし、ＮＡＭＰＴアッセイに支障を来さなかった５−アミノ−１ＭＱの類似体である５−アミノ−６−フルオロ−１ＭＱでアッセイを繰り返したとき、３０μＭ〜６００μＭの間の類似体濃度でＮＡＭＰＴの阻害は観察されなかった（データは示さず）。

５−アミノ−１ＭＱは、１０ｎＭ〜３００μＭの範囲の濃度でＳＩＲＴ１を阻害せず、６００μＭの５−アミノ−１ＭＱによって、ＳＩＲＴ１活性の軽微な低下が観察された。しかし、試験した５−アミノ−１ＭＱ濃度では有意な阻害が観察されなかったため、シグモイド用量反応曲線及び信頼性のある（すなわち、Ｒ２＞０．８）ＩＣ５０推定値を得ることはできなかった。まとめると、これらの結果から、ＮＮＭＴ阻害に薬理学的に妥当な濃度での小分子５−アミノ−１ＭＱ類似体の高い選択性が示唆される。

５．１６． ＮＮＭＴ阻害剤は、ＤＩＯマウスにおいて体重減少及び脂肪組織質量の減少を引き起こす。ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究によって、５−アミノ−１ＭＱが高い細胞透過性、酵素選択性、及び細胞培養有効性を有することが示されたため、亜慢性（１１日）概念実証ｉｎ ｖｉｖｏ研究を行って、ＨＦＤ給餌マウスにおける肥満に対するＮＮＭＴ阻害の効果を試した。ＤＩＯマウスを２０ｍｇ／ｋｇの５−アミノ−１ＭＱで１日３回全身（ＳＣ）処置すると、対照に比べて、処置期間にかけて漸進的な体重の減少が引き起こされた（図８Ａ）。反復測定二元配置ＡＮＯＶＡによって、処置（Ｆ（１，１６）＝１２．４７、Ｐ＝０．００２８）、時間（日数）（Ｆ（５，８０）＝４．４３７、Ｐ＝０．００１２）因子の有意な主効果、及び有意な処置×時間交互作用（Ｆ（５，８０）＝１０．８９、Ｐ＜０．０００１）が明らかになった。

Ｓｉｄａｋの多重比較後検定によって、６日目（Ｐ＜０．０１）、９日目（Ｐ＜０．０００１）、及び１０日目（Ｐ＜０．０００１）における対照と処置ＤＩＯマウス間の体重の有意差が明らかになった（図８Ａ）。１１日の処置期間終了時に、対照ＤＩＯマウスは、０．６±０．４ｇの累積重量増加（ベースライン測定から〜１．４％の体重増加）を示したが、ＮＮＭＴ阻害剤で処置したＤＩＯマウスは、２．０±０．６ｇの体重減少（ベースライン測定から〜５．１％の体重減少）を示した（図８Ａ）。食物摂取は、群間で同じままであり、体重減少効果が主として代謝の変化に関係していることが示唆され（Ｆ（１，１６）＝１．１０１、Ｐ＞０．０５、図８Ｂ）、対照及び処置ＤＩＯマウスにおける合計累積食物摂取は、それぞれ、２８．１±１．２ｇ及び２６．２±１．４ｇであった（図８Ｂ、挿入グラフ）。加えて、ＤＩＯマウスをＮＮＭＴ阻害剤で処置すると、ＥＷＡＴの質量（図８Ｃ）及びサイズ（図８Ｄ）が、対照ＤＩＯマウスと比較して、実質的に〜３５％減少した（Ｐ＜０．００１）。これらの結果と一致して、処置ＤＩＯマウスからのＥＷＡＴの組織学的分析では、対照ＤＩＯマウスに比べて、脂肪細胞サイズの３０％を超える縮小（Ｐ＜０．０５、図８Ｅ及び８Ｆ）及び脂肪細胞体積の４０％を超える縮小（データは示さず）が示された。血漿脂質プロファイル測定では、処置ＤＩＯマウスにおける総コレステロールレベルが、対照ＤＩＯマウスに比べて〜３０％低かったことが示された（Ｐ＜０．０５、図８Ｇ）。本発明者らの研究終了時の対照ＤＩＯマウスにおける総コレステロールレベルは、同齢ＤＩＯマウスについて供給業者が報告したコレステロールレベルと同等であった。対照的に、ＮＮＭＴ阻害剤処置ＤＩＯマウスにおけるコレステロールレベルは、通常の固形飼料が給餌された同齢Ｃ５７Ｂｌ／６マウスについて供給業者が報告したコレステロールレベルと同様であった（ｗｗｗ．ｊａｘ．ｏｒｇ／ｊａｘ−ｍｉｃｅ−ａｎｄ−ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｆｉｎｄ−ａｎｄ−ｏｒｄｅｒ−ｊａｘ−ｍｉｃｅ／ｍｏｓｔ−ｐｏｐｕｌａｒ−ｊａｘ−ｍｉｃｅ−ｓｔｒａｉｎｓ／ｄｉｏ−ｂ６）。

５．１７． ＮＮＭＴ阻害によって、３Ｔ３−Ｌ１細胞における脂質生合成は抑制される。脂肪細胞分化及び脂質生合成に対するＮＮＭＴの効果を明らかにするために、脂肪生成要素を含有する培地において３Ｔ３−Ｌ１細胞をＮＮＭＴ阻害剤で処理した後の脂肪細胞において脂質蓄積を確認した。５−アミノ−１ＭＱでの処理によって、分化する前脂肪細胞における脂質蓄積の濃度依存的な阻害が引き起こされた（Ｆ（３，１９）＝３９．２６、Ｐ＜０．０００１、図９Ａ及び９Ｂ）。３０μＭ及び６０μＭの濃度の５−アミノ−１ＭＱによって、脂質生合成は、対照未処理脂肪細胞に比べて、それぞれ５０％及び７０％減少した（Ｐ＝０．０００１、図９Ｂ）。３Ｔ３−Ｌ１細胞生存度は、５−アミノ−１ＭＱの最高試験濃度でも、未処理細胞生存度に比べてわずかしか低下しなかった（Ｐ＜０．０５、図９Ｃ）。

Claims (20)

1. 式Ｉのカチオン
   ［式中、
   Ｒ^１は、Ｃ_１〜４アルキルであり、
   Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^５は、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、ハロゲン置換Ｃ_１〜４アルキル、ＮＲ^９Ｒ^１０、及びＣＮからなる群から独立に選択され、
   Ｒ^６は、Ｈ又はハロゲンであり、
   Ｒ^７は、Ｈ、メチル、又はＮＲ^１１Ｒ^１２であり、
   Ｒ^８は、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、ハロゲン置換Ｃ_１〜４アルキルであり、
   Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２は、Ｈ及びＣ_１〜４アルキルから独立に選択され、
   前記カチオンは、Ｒ^２〜Ｒ^８の位置に少なくとも２つの非水素置換基を有しており、
   Ｒ^２〜Ｒ^８の位置にある前記非水素置換基の少なくとも１つは、ＮＨ_２である］。
2. Ｒ^１がメチル又はエチルである、請求項１に記載のカチオン。
3. Ｒ^１がメチルである、請求項１に記載のカチオン。
4. Ｒ^２及びＲ^３の少なくとも一方がＮＨ_２である、請求項１に記載のカチオン。
5. Ｒ^５がＮＨ_２である、請求項１に記載のカチオン。
6. Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４が水素である、請求項１に記載のカチオン。
7. Ｒ^６がハロゲンである、請求項１に記載のカチオン。
8. Ｒ^６がＦである、請求項１に記載のカチオン。
9. Ｒ^７がＮＨ_２である、請求項１に記載のカチオン。
10. Ｒ^８がメチル又はＣＦ_３である、請求項１に記載のカチオン。
11. Ｒ^８がメチルである、請求項１０に記載のカチオン。
12. 式ＩＡのカチオン
    ［式中、
    前記カチオンは、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、及びＲ^８の位置のいずれかにおいて、２つ以上の非水素置換基を含み、
    Ｒ^５は、Ｈ又はＮＨ_２であり、
    Ｒ^６は、Ｈ又はＦであり、
    Ｒ^７は、Ｈ又はＮＨ_２であり、
    Ｒ^８は、Ｈ又はメチルである］。
13. Ｒ^１がメチル又はエチルである、請求項１２に記載のカチオン。
14. Ｒ^６がＦである、請求項１２に記載のカチオン。
15. から選択されるカチオン。
16. ＮＮＭＴを発現する細胞を、表１〜３から選択される１種以上のカチオンと接触させることを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでＮＮＭＴを阻害する方法。
17. ＮＮＭＴを発現する細胞を、請求項１に記載の１種以上のカチオンと接触させることを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでＮＮＭＴを阻害する方法。
18. 式Ｉのカチオン
    を投与することを含む、対象に筋肉治療を施す方法
    ［式中、
    Ｒ^１は、Ｃ_１〜４アルキルであり、
    Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、及びＲ^５は、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、ハロゲン置換Ｃ_１〜４アルキル、ＮＲ^９Ｒ^１０、及びＣＮからなる群から独立に選択され、
    Ｒ^６は、Ｈ又はハロゲンであり、
    Ｒ^７は、Ｈ、メチル、又はＮＲ^１１Ｒ^１２であり、
    Ｒ^８は、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、ハロゲン置換Ｃ_１〜４アルキルであり、
    Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、及びＲ^１２は、Ｈ及びＣ_１〜４アルキルから独立に選択され、
    前記カチオンは、Ｒ^２〜Ｒ^８の位置に少なくとも２つの非水素置換基を有しており、
    Ｒ^２〜Ｒ^８の位置にある前記非水素置換基の少なくとも１つは、ＮＨ_２である］。
19. から選択されるカチオンを投与することを含む、対象に筋肉治療を施す方法。
20. １種以上のＮＮＭＴ阻害剤を投与することを含む、対象に筋肉治療を施す方法。