JP2020511167A - Ｃｎｇｂ１連鎖性網膜色素変性症の治療のための遺伝子療法 - Google Patents

Ｃｎｇｂ１連鎖性網膜色素変性症の治療のための遺伝子療法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒト光受容器特異的プロモーターエレメント、コアプロモーターを含むプロモーターと、少なくとも1つの導入遺伝子とを含むポリヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むプラスミド、上記ポリヌクレオチドを含むウイルスベクター、及び上記ポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、医薬として使用するための、特に網膜の疾患の療法において使用するための、上記プラスミド、上記ウイルスベクター、又は上記医薬組成物に関する。【選択図】図7

Description

網膜色素変性症（RP）は、光受容器を冒す網膜の遺伝性変性疾患の遺伝的に多様な群を指すために使用される用語である。遺伝子の突然変異は、桿体光受容器においてのみ又は主として発現される遺伝子に関係している。したがって、その疾患は、桿体機能及び構造の一次障害又は喪失を特徴とする。桿体の変質に続いて、錐体の二次変性が起こる。網膜変性の発症及び経時変化は、それぞれ早発型で迅速に進行する形態から遅発性で遅く進行する形態まで様々である。RPの最も一般的な症状は、夜盲症、進行性の視野狭窄、及び網膜における色素沈着の異常蓄積である。臨床的特徴としては、特徴的な形状の色素沈着及び進行性の網膜血管の減衰が挙げられる。多くの場合において、RPは最終的に法的盲を引き起こす。RPの全有病率は、1:4000と見積もられる。RPは遺伝的に非常に異質性であり、特定されたRP遺伝子の数はおよそ50個である（非特許文献1）。多くの疾患遺伝子は、光検出及び処理のために必要なタンパク質（例えば、ロドプシン）又は桿体細胞の形態の維持のために必要なタンパク質（例えば、ペリフェリン-2）をコードしている。RP症例の10%〜25%は、常染色体優性の遺伝パターン（adRP）を示し、6%〜18%は、X連鎖性（xRP）であり、20%〜30%は、常染色体劣性遺伝（arRP）する。別の40%〜50%は、散発性のarRPであり、遺伝的に最も多様なRPサブグループであり、既知の疾患遺伝子のいずれも15%を超える相対頻度を有しない。最も一般的なarRP遺伝子は、EYS（5%〜12%）、USH2A（5%〜15%）、CRB1（約5%）、及びPDE6B（4%〜10%）である。しかしながら、おそらくは創始者効果のため、これらの値は、異なるサブポピュレーション間、及び地域によって様々である。
CNGB1は、桿体の環状ヌクレオチド依存性（CNG）チャネルのβ-サブユニットをコードする（RP45座）。いわゆるCNGB1連鎖性RP又はRP45型をそれぞれ引き起こすRP45座における突然変異は、arRP症例の2%〜4%に見られる（非特許文献2）。したがって、CNGB1連鎖性arRPの推定患者数は、ドイツで約900人、EUで約5000人である。視覚障害は、臨床的及び社会経済的な重要性が高い最も重要な非致死的なハンディキャップの1つとみなされる。RP患者は、生涯の長い期間を通じて深刻な生活の質の損失を被る。残念なことに、RPの根治的治療又は対症治療は存在しない。臨床の専門家及び医療機関は、遺伝子療法の最有力候補の1つとしてRPを挙げている。以前に、網膜色素変性症のCNGB1（-/-）マウスモデルにおいて、遺伝子補充療法により視覚が回復し、変性が遅延すること（非特許文献3）を、マウスロドプシン（Rho）プロモーターの制御下にマウスCngb1遺伝子を含む組み換えAAV2/8ベクター：AAV2/8（Y733F）-Rho-Cngb1を使用することにより実証することができた。該ベクターは、Cngb1をコードする遺伝子のエキソン26に遺伝子欠失を伴うマウス（Cngb1 KO）の眼に注射された。その注射は、光受容器の存続を促進し、網膜機能を改善した。しかしながら、幾つかの問題により、このアプローチはCNGB1連鎖性RPにより網膜変性を患う人の治療にはあまり有望でないものとなる。
（a）rAAVシスベクターのゲノムサイズ（5.0 kb）が、野生型AAVのゲノムサイズ（<4.7kb）を上回ったこと、
（b）マウスのロドプシン（Rho）遺伝子のプロモーターが使用されたこと、及び、
（c）マウスのCngb1遺伝子配列が使用されたこと。
非特許文献4は、ヒトロドプシンキナーゼ1（hGRK1）プロモーターの制御下にイヌのCngb1遺伝子（cCngb1）のコーディング配列を有するrAAV2/5ベクター：AAV5-hGRK1-cCngb1を記載している。該ベクターは、Cngb1遺伝子のエキソン26に突然変異を有するイヌの眼に注射された。その注射は、網膜機能を改善した。しかしながら、以下の問題により、このアプローチはCNGB1連鎖性RPにより網膜変性を患う人の治療にはあまり有望でないものとなる。
（a）このアプローチで使用されるhGRK1プロモーターが、桿体における発現を駆動するが、錐体光受容器におけるオフターゲット発現を駆動すること。このオフターゲット発現は、網膜機能及び形態に対して悪影響を及ぼし得たこと、及び、
（b）イヌのCngb1遺伝子配列が使用されたこと。
Daiger SP, et al. (1998) Investigative Ophthalmology and Visual Science (Supplement) 39:S295 Hartong DT, et al. (2006) Lancet 368 (9549):1795-1809 Koch S, et al. (2012) Hum Mol. Genet. 21(20):4486-96 Petersen-Jones et al. (2016) Invest. Ophthalmol. 57: 1842
したがって、当該技術分野において、in vivoの状況において悪影響を及ぼさない、又はそれらの活性を失わない、小さいサイズを有するトランスジェニックエレメントを特定することが求められている。
本発明は、ヒト桿体プロモーターの短い部分が、in vivoにおいて桿体光受容器特異的発現を、このプロモーターエレメントに作動可能に連結された導入遺伝子へと移すという驚くべき発見に基づく。本明細書で定義されるプロモーターエレメントがin vivo環境で使用された場合に、導入遺伝子の安定的な発現が観察された。その発現レベルは、導入遺伝子を有するアデノ随伴ウイルスベクターで感染させた試験動物の視覚能力を改善するために適していた。この驚くべき知見により、とりわけ従来技術を上回る以下の利点が得られる：（i）細胞中に導入される構築物のサイズの減少、（ii）導入遺伝子のウイルスベクター中へのパッケージング効率の増加、（iii）組み換え事象がin vivoで起こる可能性の減少、（iv）導入遺伝子の標的細胞中への、特に標的細胞の核中への導入の効率の増加、（v）桿体関連疾患を治療するために適したヒト患者における発現レベル、（vi）網膜機能の保全及び／又は改善、並びに（vii）視覚の保全及び／又は改善。
第1の態様において、本発明は、
a）配列番号1又はその変異体による核酸配列を含む、実質的に該核酸配列からなる、又は該核酸配列からなるヒト桿体光受容器特異的プロモーターエレメント（hRPSPE）と、コアプロモーター（CP）とを含むプロモーターと、
b）a）のプロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子（TG）と、
をこの順序で含むポリヌクレオチドであって、
前記配列番号1の変異体は、配列番号1のヌクレオチド位置6〜位置13、位置32〜位置40、位置70〜位置83、及び位置87〜位置94の範囲外に1つ以上の核酸置換を含み、前記プロモーターの長さは特に350塩基以下である、ポリヌクレオチドに関する。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記hRPSPEの5'末端は、配列番号2又はその変異体の1から160までの核酸位置にあり、3'末端は、配列番号2又はその変異体の290から310までの核酸位置にある。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記CPは、TATAボックス及び／又はイニシエーター（Inr）を含む。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記プロモーターの5'末端は、配列番号2又はその変異体の1から160までの核酸位置にあり、3'末端は、配列番号2又はその変異体の340から350までの核酸位置にある。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記導入遺伝子は、桿体の生理学的機能を維持又は改善するタンパク質をコードする核酸を含む。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記導入遺伝子は、（i）ヒト桿体の環状ヌクレオチド依存性チャネルβサブユニット（hCNGB1）、ABCA4、AIPL1、BEST1、CACNA1F、CLN3、CLRN1、CNGA1、CEP290、CRB1、CRB2、CRX、GPR98、GUCA1A、GUCA1B、MYO7A、NRL、PDE6A、PDE6B、PRPH2、PROM1、RHO、ROM1、RP1、RP2、RPE65、RPGR、SAG、USH1C、USH1G、USH2A若しくはその機能的断片若しくは変異体をコードする核酸、それらのドミナントネガティブ突然変異体をコードするmRNAを標的とするmiRNA若しくはshRNAをコードする核酸、及び／又はそれらのドミナントネガティブ突然変異体に特異的に結合する抗体若しくは抗体結合フラグメントをコードする核酸を含む、又は（ii）桿体細胞の増殖を阻害するタンパク質、好ましくはトキシン、プロドラッグ変換酵素、例えばチミジンキナーゼ、細胞周期阻害剤、例えば網膜芽細胞腫タンパク質（pRB）、p53、p21CIP1、p27KIP1、及びp57KIP2をコードする核酸を含み、その細胞周期阻害剤のドミナントネガティブ突然変異体をコードするmRNAを含み、及び／又はその細胞周期阻害剤のドミナントネガティブ突然変異体をコードする核酸を含む。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記hCNGB1は、配列番号3、配列番号40、若しくは配列番号41、又はそれらの変異体によるアミノ酸配列を含む。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記ポリヌクレオチドは、（i）ポリアデニル化シグナル（PAS）、及び／又は（ii）1又は2つの末端逆位反復（ITR）配列、及び／又は（iii）感染性ウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニア／ポックスウイルスベクター、若しくはヘルペスウイルスベクター、特に単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクターを形成するために必要なウイルスのヌクレオチド配列からなる群から選択される1つ以上の更なるヌクレオチド配列エレメントを含む。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記ポリアデニル化シグナルは、シミアンウイルス40のPASを含む、実質的にシミアンウイルス40のPASからなる、又はシミアンウイルス40のPASからなる。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記ポリアデニル化シグナルは、配列番号4又はその機能的変異体による核酸を含む、実質的に該核酸からなる、又は該核酸からなる。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記ITR配列は、アデノ随伴ウイルス（AAV）のITRである。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記AAVは、AVV血清型2、AVV血清型5、AVV血清型8、又はAVV血清型9である。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記プロモーター及び前記導入遺伝子は、それらの5'末端でL-ITRと隣接しており、それらの3'末端でR-ITRと隣接している。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記L-ITRは、配列番号5若しくはその変異体による配列を含む、実質的に該配列からなる、若しくは該配列からなる、及び／又は前記R-ITRは、配列番号6若しくはその変異体による配列を含む、実質的に該配列からなる、若しくは該配列からなる。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記ポリヌクレオチドの全長は、5200塩基以下、好ましくは5100塩基以下、より好ましくは5000塩基以下である。
第2の態様において、本発明は、第1の態様のポリヌクレオチドを含むプラスミドに関する。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記プラスミドは、配列番号7、配列番号42〜配列番号44又はそれらの変異体による核酸配列を含む。
本発明の第3の態様は、本発明の第1の態様のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターに関する。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記ウイルスは、AAV2、AAV5、AAV8、AVV9、又はそれらの変異体からなる群から選択される。
本発明の第4の態様は、医薬として使用するための、本発明の第1の態様によるポリヌクレオチド、本発明の第2の態様のプラスミド、及び／又は本発明の第3の態様によるウイルスベクターに関する。
本発明の第5の態様は、本発明の第1の態様によるポリヌクレオチド、本発明の第2の態様のプラスミド、及び／又は本発明の第3の態様によるウイルスベクターと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物に関する。
本発明の第6の態様は、網膜の疾患、特に網膜変性の療法において使用するための、本発明の第1の態様によるポリヌクレオチド、本発明の第2の態様によるプラスミド、及び／又は本発明の第3の態様によるウイルスベクターに関する。
或る特定の例示的な実施の形態において、投与経路は、眼内、眼球内、硝子体内、又は網膜下から選択される。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記網膜変性は、遺伝子の突然変異、置換、及び／又は欠失と関連している。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記網膜変性は、夜盲症、盲目、網膜変性、網膜ジストロフィー、及び網膜色素変性症からなる群から選択される。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記網膜色素変性症は、CNGB1連鎖性網膜色素変性症又は網膜色素変性症45型（RP45）である。
本発明の第7の態様は、
a）配列番号9又はその変異体による核酸配列を含むヒトロドプシンプロモーターと、
b）a）のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つの導入遺伝子（TG）と、
をこの順序で含むポリヌクレオチドに関する。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記導入遺伝子は、桿体の生理学的機能を維持又は改善するタンパク質をコードする核酸を含む。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記導入遺伝子は、（i）ヒト桿体の環状ヌクレオチド依存性チャネルβサブユニット（hCNGB1）、ABCA4、AIPL1、BEST1、CACNA1F、CLN3、CLRN1、CNGA1、CEP290、CRB1、CRB2、CRX、GPR98、GUCA1A、GUCA1B、MYO7A、NRL、PDE6A、PDE6B、PRPH2、PROM1、RHO、ROM1、RP1、RP2、RPE65、RPGR、SAG、USH1C、USH1G、USH2A若しくはその機能的断片若しくは変異体をコードする核酸、それらのドミナントネガティブ突然変異体をコードするmRNAを標的とするmiRNA若しくはshRNAをコードする核酸、及び／又はそれらのドミナントネガティブ突然変異体に特異的に結合する抗体若しくは抗体結合フラグメントをコードする核酸を含む、又は（ii）桿体細胞の増殖を阻害するタンパク質、好ましくはトキシン、プロドラッグ変換酵素、例えばチミジンキナーゼ、細胞周期阻害剤、例えば網膜芽細胞腫タンパク質（pRB）、p53、p21CIP1、p27KIP1、及びp57KIP2をコードする核酸を含み、その細胞周期阻害剤のドミナントネガティブ突然変異体をコードするmRNAを含み、及び／又はその細胞周期阻害剤のドミナントネガティブ突然変異体をコードする核酸を含む。
或る特定の例示的な実施の形態において、
（i）ポリアデニル化シグナル（PAS）、
（ii）1又は2つの末端逆位反復（ITR）配列、及び、
（iii）感染性ウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニア／ポックスウイルスベクター、又はヘルペスウイルスベクター、特に単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクターを形成するために必要なウイルスのヌクレオチド配列、
からなる群から選択される1つ以上の更なるヌクレオチド配列エレメントを含む。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記ポリアデニル化シグナルは、シミアンウイルス40のPASを含む。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記ITR配列は、アデノ随伴ウイルス（AAV）のITRである。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記AAVは、AVV血清型2、AVV血清型5、AVV血清型8、又はAVV血清型9である。
本発明の第8の態様は、本発明の第7の態様によるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターに関する。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記ウイルスは、AAV2、AAV5、AAV8、AVV9、又はそれらの変異体からなる群から選択される。
本発明の第9の態様は、網膜変性の治療を必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、前記被験体に、治療的有効量の本発明の第7の態様によるポリヌクレオチド又は本発明の第8の態様によるウイルスベクターを投与することを含む、方法に関する。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記ポリヌクレオチド又はウイルスベクターは、配列番号43に示される核酸配列を含む。
本発明の第10の態様は、網膜色素変性症の治療を必要とする被験体において網膜色素変性症を治療する方法であって、前記被験体に、治療的有効量の本発明の第7の態様によるポリヌクレオチド又は本発明の第8の態様によるウイルスベクターを投与することを含む、方法に関する。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記ポリヌクレオチド又はウイルスベクターは、配列番号43に示される核酸配列を含む。
本発明の第11の態様は、網膜変性の治療を必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、前記網膜変性が前記被験体の網膜細胞におけるCNGB1の欠陥又は不存在を特徴とし、前記被験体に、配列番号43に示される核酸配列を含むウイルスベクターを治療的有効量、投与することを含む、方法に関する。
或る特定の例示的な実施の形態において、前記網膜変性は、CNGB1連鎖性網膜色素変性症又は網膜色素変性症45型（RP45）である。
本発明の第12の態様は、CNGB1連鎖性網膜色素変性症又は網膜色素変性症45型（RP45）の治療を必要とする被験体においてCNGB1連鎖性網膜色素変性症又は網膜色素変性症45型（RP45）を治療する方法であって、前記被験体に、配列番号43に示される核酸配列を含むウイルスベクターを治療的有効量、網膜下投与することを含む、方法に関する。
本発明の第13の態様は、
a）配列番号1又はその変異体による核酸配列を含むヒト桿体光受容器特異的プロモーターエレメント（hRPSPE）と、コアプロモーター（CP）とを含むプロモーターと、
b）a）のプロモーターに作動可能に連結されたヒト桿体の環状ヌクレオチド依存性チャネルβサブユニット（hCNGB1）をコードする導入遺伝子と、
をこの順序で含むポリヌクレオチドであって、
前記配列番号1の変異体は、配列番号1のヌクレオチド位置6〜位置13、位置32〜位置40、位置70〜位置83、及び位置87〜位置94の範囲外に1つ以上の核酸置換を含む、ポリヌクレオチドに関する。
本発明の第14の態様は、
a）配列番号1又はその変異体による核酸配列を含むヒト桿体光受容器特異的プロモーターエレメント（hRPSPE）と、コアプロモーター（CP）とを含むプロモーターと、
b）a）のプロモーターに作動可能に連結されたヒト桿体の環状ヌクレオチド依存性チャネルβサブユニット（hCNGB1）をコードする導入遺伝子と、
をこの順序で含むポリヌクレオチドであって、前記配列番号1の変異体が配列番号1のヌクレオチド位置6〜位置13、位置32〜位置40、位置70〜位置83、及び位置87〜位置94の範囲外に1つ以上の核酸置換を含む、ポリヌクレオチドと、
薬学的に許容可能な担体と、
を含む医薬組成物に関する。
本発明の第15の態様は、配列番号43に示される核酸配列を含むウイルスベクターと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物に関する。
以下で、本明細書に含まれる図面の内容を記載する。この文脈において、上記及び／又は下記の本発明の詳細な説明も参照されたい。
rAAV hRHO194.hCNGB1ベクターのゲノムの構造を示す図である。 pGL2.0-hRHO194-hCNGB1a-SV40シスベクタープラスミドのマップを示す図である。 図３Ａ及び図３Ｂ：hCNGB1の代わりにeGFPを発現する型のベクターで処置された野生型マウスにおける本来のeGFP蛍光を示す代表的な共焦点像を示す図である。これらの代表的な共焦点像は、rAAV.hRHO194.eGFPベクターにより網膜下で4週間目に処置された8週齢の野生型マウスからの網膜断面における本来のeGFP蛍光を示す。処置された動物において、強い桿体特異的なeGFPシグナルが観察されたが（図3A）、注射されていないコントロールにおいては見られなかった（図3B）。 図４Ａ及び図４Ｂ：本発明によるベクターで処置されたCNGB1（-/-）マウスからの代表的なERG測定、すなわち本発明によるベクターで一方の眼に処置されたCNGB1（-/-）マウスからの網膜電図（ERG）測定データを示す図である。（図4A）4.4 cd/m2の単発フラッシュ刺激に際して得られる代表的なERGトレース。斜の入ったトレースは、処置4ヶ月後のCNGB1（-/-）マウスの処置された眼からのものであり、黒いトレースは、処置4ヶ月後のCNGB1（-/-）マウスの未処置の眼からのものである。（図4B）野生型マウス（灰色）、処置されたCNGB1（-/-）マウス（暗灰色）、及び未処置のCNGB1（-/-）マウス（黒色）からの同じ条件下で測定されたERG b波の振幅を示すサマリーグラフ。*p<0.05、スチューデントのt検定、N=4。 図５Ａ〜図５Ｃ：本発明によるベクターで一方の眼において処置されたCNGB1（-/-）マウスからの光受容器の層厚の光干渉断層撮影（OCT）測定を示す図である。（図5A及び図5B）処置された眼（図5A）及び未処置の眼（図5B）からの代表的なOCTスキャン。光受容器の層厚は、垂直の黒いバーで表示されている。OCTを使用する光受容器の層厚の定量化（図5C）。***p<0.001、一元ANOVA、N=9。 図６Ａ及び図６Ｂ：本発明によるベクターで処置された（図6A）又は未処置（図6B）のCNGB1（-/-）マウスにおけるhCNGB1の免疫組織学的染色からの代表的な共焦点像を示す図である。 本発明による一般的なベクター設計を示す図である。 図８Ａ及び図８Ｂ：本発明によるベクターで処置されたCNGB1（-/-）マウスからの代表的なERG測定を示す図である（図8A）。処置前の野生型マウス及びCNGB1（-/-）マウスにおける代表的なERG測定（図8B）。 図９Ａ及び図９Ｂ：本発明によるベクターで処置されたCNGB1（-/-）マウス（図9A）及び未処置のマウス（図9B）におけるhCNGB1の免疫組織学的染色からの代表的な共焦点像を示す図である。 図１０Ａ〜図１０Ｃ：網膜変性における大幅な遅延を明らかにするOCT分析を示す図である。本発明によるベクターの一般的な注射スケジュール（図10A）。本発明によるベクターで処置されたCNGB1（-/-）マウス（図10B）及び未処置のマウス（図10C）において9ヶ月目に収集されたOCT像。 図１１Ａ〜図１１Ｅ：本発明によるベクターで処置されたCNGB1（-/-）マウスにおける2ヶ月までの桿体機能の回復を示す図である。本発明によるベクターで処置されたCNGB1（-/-）マウス及び未処置のマウスにおける代表的なERG b波の測定（図11A）。本発明によるベクターで処置されたCNGB1（-/-）マウス及び未処置のマウスにおける-0.5 log（cd/m2）の光刺激に応答して測定されたERG b波の振幅を示すサマリーグラフ（図11B）。本発明によるベクターで処置されたCNGB1（-/-）マウス（図11C）及び未処置のマウス（図11D）からの光受容器の層厚のOCT測定。OCTを使用する光受容器の層厚の定量化（図11E）。N=6。 同上 図１２Ａ及び図１２Ｂ：桿体特異的刺激（図12A）及びフリッカー応答（図12B）を使用した、本発明によるベクターで処置されたCNGB1（-/-）イヌ及び未処置のイヌの眼において観察される明らかなERGのレスキューを示す図である。 同上 図１３Ａ及び図１３Ｂ：本発明によるベクターで処置されたCNGB1（-/-）イヌが、桿体媒介視覚を有し、視覚検査成績が改善されることを示す視覚検査データを示す図である。正しい出口の選択（図13A）及び出口までの時間（図13B）における成績の改善により指摘される桿体視覚の回復。 本発明によるベクターで処置されたCNGB1（-/-）イヌにおけるa波及びb波の振幅における改善を示すERG測定を示す図である。処置された眼におけるa波の振幅により指摘される応答閾値の改善は、1.5 log単位より大きいことが判明した（図14A）。処置された眼におけるb波の振幅により指摘される応答閾値の改善は、2 log単位より大きいことが判明した（図14B）。
配列リスト
配列番号1 コア組織特異的エレメントを含むヒトロドプシンプロモーターの99ヌクレオチド長のフラグメントの配列、
配列番号2 組織特異的エレメント及び転写開始点を含むヒトロドプシンプロモーターの350ヌクレオチド長のフラグメントの配列、
配列番号3 ヒトCNGB1タンパク質の配列、
配列番号4 ポリアデニル化シグナルSV40の配列、
配列番号5 左側末端逆位反復（L-ITR）の配列、
配列番号6 右側末端逆位反復（R-ITR）の配列、
配列番号7 ベクターコンストラクトpGL2.0-hRho194-hCNGB1a-SV40の配列、
配列番号8 ヒトCNGB1遺伝子の配列、
配列番号9 ヒトロドプシンプロモーターのフラグメント194塩基対の配列、
配列番号10 ヒトAbca4タンパク質の配列、
配列番号11 ヒトAIPL1タンパク質の配列、
配列番号12 ヒトBEST1タンパク質の配列、
配列番号13 ヒトCACNA1Fタンパク質の配列、
配列番号14 ヒトCLN3タンパク質の配列、
配列番号15 ヒトCLRN1タンパク質の配列、
配列番号16 ヒトCNGA1タンパク質の配列、
配列番号17 ヒトCEP290タンパク質の配列、
配列番号18 ヒトCRB1タンパク質の配列、
配列番号19 ヒトCRB2タンパク質の配列、
配列番号20 ヒトCRXタンパク質の配列、
配列番号21 ヒトGPR98タンパク質の配列、
配列番号22 ヒトGUCA1Aタンパク質の配列、
配列番号23 ヒトGUCA1Bタンパク質の配列、
配列番号24 ヒトMYO7Aタンパク質の配列、
配列番号25 ヒトNRLタンパク質の配列、
配列番号26 ヒトPDE6Aタンパク質の配列、
配列番号27 ヒトPDE6Bタンパク質の配列、
配列番号28 ヒトPRPH2タンパク質の配列、
配列番号29 ヒトPROM1タンパク質の配列、
配列番号30 ヒトRHOタンパク質の配列、
配列番号31 ヒトROM1タンパク質の配列、
配列番号32 ヒトRP1タンパク質の配列、
配列番号33 ヒトRP2タンパク質の配列、
配列番号34 ヒトRPGRタンパク質の配列、
配列番号35 ヒトSAGタンパク質の配列、
配列番号36 ヒトUSH1Cタンパク質の配列、
配列番号37 ヒトUSH1Gタンパク質の配列、
配列番号38 ヒトUSH2Aタンパク質の配列、
配列番号39 ヒトNR2E3タンパク質の配列、
配列番号40 ヒトCNGB1タンパク質（次世代シーケンシング；NGS）の配列、
配列番号41 ヒトCNGB1タンパク質（GenBank NG_016351）の配列、
配列番号42 5'ITR-hRHOプロモーター-CNGB1a-SV40polyA-3'ITRの配列、
配列番号43 5'ITR-hRHOプロモーター-CNGB1a-SV40polyA-3'ITR（NGS）の配列、
配列番号44 5'ITR-hRHOプロモーター-CNGB1a-SV40polyA-3'ITR（GenBank）の配列、及び、
配列番号45 ヒトRPE65タンパク質。
本発明を以下で詳細に記載する前に、本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル及び試薬に限定されるものではなく、これらは変更することができると理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであると理解されるべきであり、本発明の範囲を限定することを目的とするものではなく、本発明の範囲は、付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることとなる。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
幾つかの文献が本明細書の文章全体を通して引用される。本明細書に引用される各々の文献（特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、使用説明書等の全てを含む）は、上記又は下記を問わず、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。本明細書中のいずれの記載も、本発明が先行発明のためにかかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるものではない。本明細書で引用される文献の幾つかは、「引用することにより本明細書の一部をなす」として特徴付けられる。そのような本明細書の一部をなす参考資料の定義又は教示と本明細書に列挙される定義又は教示との間に矛盾が生ずる場合に、本明細書の文章が優先される。
以下で、本発明の構成要素を記載する。これらの構成要素は、特定の実施形態をもって列挙されることがあるが、それらの構成要素を、あらゆる様式及びあらゆる数において組み合わせることで、更なる実施形態を作り出すことができると理解されるべきである。様々に記載される例及び好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載された実施形態のみに限定するものと解釈されるべきではない。この詳細な説明は、明示的に記載された実施形態と幾つもの開示された構成要素及び／又は好ましい構成要素とを合わせた実施形態をサポートし、かつ包含するものと理解されるべきである。さらに、本出願に記載される全ての構成要素のあらゆる並び替え及び組み合わせも、内容により特に指示されない限り、本出願の詳細な説明によって開示されるものと考慮されるべきである。
定義
本発明を実施するため、特に示されない限り、当該分野での文献（例えば、モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、第2版、J. Sambrook他編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor 1989を参照）に説明される化学、生化学、及び組換えDNA技術の慣用の方法が使用される。
以下で、本明細書で頻繁に使用される用語の幾つかの定義を示す。これらの用語は、それらがそれぞれ使用される場合に、本明細書の残りの部分では、それぞれ定義される意味及び好ましい意味を有することとなる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合に、単数形「a」、「an」、及び「the」は、内容が明らかに他のことを示していない限り、複数の指示物も含む。
本明細書で使用される用語「核酸」は、全ての既知の生命体にとって必須の、ポリマー型又はオリゴマー型の巨大分子、すなわち大きな生物学的分子を含む。DNA（デオキシリボ核酸）及びRNA（リボ核酸）を含む核酸は、ヌクレオチドとして知られる単量体からできている。殆どの天然に存在するDNA分子は、互いに巻き付いて二重らせんを形成した2つの相補的な生体ポリマー鎖からなる。DNA鎖は、ヌクレオチドからなるポリヌクレオチドとしても知られている。各ヌクレオチドは、窒素含有の核酸塩基と、デオキシリボース又はリボースと呼ばれる単糖及びリン酸基とから構成されている。天然に存在する核酸塩基は、グアニン（G）、アデニン（A）、チミン（T）、ウラシル（U）、又はシトシン（C）を含む。それらのヌクレオチドは、或るヌクレオチドの糖と次のヌクレオチドのリン酸との間の共有結合によって互いに鎖状に結合されて、交互の糖−リン酸骨格がもたらされる。糖がデオキシリボースである場合に、ポリマーはDNAである。糖がリボースである場合に、ポリマーはRNAである。一般的に、ポリヌクレオチドは、個々のヌクレオチド単量体の間でのホスホジエステル結合によって形成される。本発明の文脈においては、用語「核酸」には、限定されるものではないが、リボ核酸（RNA）、デオキシリボ核酸（DNA）、及びそれらの混合物、例えばRNA-DNAハイブリッド（1つの鎖内での）、並びにcDNA、ゲノムDNA、組み換えDNA、cRNA、及びmRNAが含まれる。核酸は、全遺伝子又はその一部からなっていてよく、該核酸は、miRNA、siRNA、piRNA、又はshRNAであってもよい。miRNAは、平均で22ヌクレオチド長であるが、より長くてもよく、あらゆる真核細胞、すなわち植物、動物、及び幾つかのウイルスにおいて見られ、遺伝子発現の転写調節及び転写後調節において機能する短いリボ核酸（RNA）分子である。miRNAは、標的のメッセンジャーRNA転写物（mRNA）上の相補的な配列に結合することで、通常は翻訳抑制及び遺伝子サイレンシングをもたらす転写後調節因子である。時には短い干渉RNA又はサイレンシングRNAとして知られる低分子干渉RNA（siRNA）は、20ヌクレオチド長から25ヌクレオチド長の間の短いリボ核酸（RNA分子）である。siRNAは、特定の遺伝子の発現に干渉するRNA干渉（RNAi）経路に関与する。低分子ヘアピン型RNAとも呼ばれる短いヘアピン型RNA（shRNA）は、RNA干渉（RNAi）を介して標的遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができる急なヘアピン型の折り返しを伴う人工RNA分子である。細胞内でのshRNAの発現は、一般的にプラスミドの送達によって又はウイルスベクターを通じて達成される。
用語「ポリヌクレオチド」は、本発明の文脈において使用される場合に、特定のヌクレオチド数の長さに限定されない核酸を指す。
本発明の文脈において使用される用語「ヒト桿体光受容器」は、特定の細胞型、すなわち光受容器細胞を指す。ヒトの眼の網膜は、2つの種類の光受容器、すなわち桿体及び錐体を含む。平均して、ヒトの網膜には約9千万個の桿体細胞が存在する。桿体は、錐体よりも感受性が高い。しかしながら、桿体は、色に対しては感受性がない。桿体は、暗順応視覚又は暗所視の役割を担う。桿体は通常、網膜の外縁に集中して見られ、周辺視覚に使用される。このように、周辺視覚はより光感受性であることから、周辺視覚においてより暗い物体を見ることが可能となる。桿体細胞は、錐体細胞よりも感受性が高く、暗視の役割のほぼ全体を担う。桿体は、ロドプシンと呼ばれる感受性の光色素を使用する。光受容器は、高度に特化された感光性ニューロンであり、細胞の膜電位の変化を誘発する光量子を捕捉することが意図されている。桿体光受容器は、薄明視を可能にするが、錐体光受容器は、より明るい光条件下で色覚及び高い視覚を取り持つ。マウス及びヒトを含む脊椎動物の網膜には、ロドプシン視色素を有する桿体光受容器はたった1種類しか存在しない。その「活性化の準備が整った」状態においては、各オプシン分子は、感光性発色団の11-シスレチナールに共有結合されている。光子を捕捉すると、該発色団はオールトランスレチナールに異性体化し、こうしてロドプシンに立体配置変化が引き起こされ、メタロドプシンIIへと活性化される。これにより、光受容器の細胞膜過分極におけるイオンチャネルの閉鎖と、シナプス末端での神経伝達物質放出の調節を介した網膜内層における二次ニューロンへの1つ以上の信号の伝達とで完結する生化学的事象のカスケードである光伝達のプロセスが開始される。光受容器の完全性及び機能は、視覚にとって絶対的に重要であり、光受容器の機能又は生存に影響を及ぼす突然変異は光伝達プロセスを破断し、こうして盲目につながる。
本発明の文脈における用語「プロモーター」は、転写活性化タンパク質及び転写抑制タンパク質のための結合部位を含む転写制御のために必要とされるエレメントと、転写を開始するエレメントとの両方を含むヌクレオチド配列を指す。転写活性化タンパク質及び／又は転写抑制タンパク質のための結合部位は、典型的にコアプロモーター内に含まれる転写開始部位の上流又は5'末端に直接的に位置している。このように、RNAポリメラーゼ及び必要な転写因子は、プロモーター配列に結合し、転写を開始する。プロモーター配列は、転写の方向を規定し、どちらのDNA鎖が転写されるかを指示し、この鎖はセンス鎖として知られている。本発明のプロモーターは、プロモーターの下流に、すなわち3'末端に位置する導入遺伝子上の桿体光受容器特異性を移す。
用語「コアプロモーター」（CP）は、本明細書においては、RNAポリメラーゼに結合し、下流（3'方向）のコーディング配列の転写を開始することが可能な遺伝子から誘導されるDNA調節配列を含むヌクレオチド領域を指すその通常の意味で使用される。したがって、コアプロモーターは、遺伝子の転写を適切に開始するために必要なプロモーターの最小部分であり、RNAポリメラーゼ（RNAポリメラーゼI、RNAポリメラーゼII、又はRNAポリメラーゼIII）のための結合部位を含む。CPのRNAポリメラーゼ結合部位は、転写TSSから約25塩基〜35塩基上流（5'）にある。コアプロモーターは、古細菌及び真核生物の遺伝子のプロモーター領域にしばしば見られるDNA配列（シス調節エレメント）である、いわゆるTATAボックス（ゴールドバーグ−ホグネスボックスとも呼ばれる）を含み得る。TATAボックスは、コアDNA配列の5'-TATAAA-3'又はその変異体を有し、通常はそれに3個以上のアデニン塩基が続く。TATAボックスは通常、転写開始部位の25塩基対〜35塩基対上流に位置している。コアプロモーターは、TATAボックスを有しない場合もある。TATAボックスを欠いた遺伝子は、その代わりにイニシエーターエレメント又は下流コアプロモーターを使用する。コアプロモーターはまた、イニシエーター（Inr）を含み得る。Inrは、イニシエーターモチーフからなり、TATAボックスと機能において類似している。Inrエレメントは、転写因子II D（TFIID）への結合を促す。
本発明の文脈において使用される用語「ヒト桿体光受容器特異的プロモーターエレメント」（hRPSPE）は、桿体細胞、特にヒト桿体細胞においてのみ下流の導入遺伝子の転写を媒介するプロモーターエレメントを意味する。組織特異的プロモーターの使用により、ヒトの眼の網膜細胞において組織特異的にタンパク質又は機能的RNAを発現することが可能となる。hRPSPEは、天然に存在するヒト桿体光受容器プロモーター配列の部分又は断片のみを含む。
用語「遺伝子」又は「コーディング配列」又は特定のタンパク質若しくはペプチドを「コードする」配列は、本発明の文脈においては、適切な制御配列の制御下にある場合にin vitro又はin vivoで転写される（DNAの場合）及びポリペプチドに翻訳される（mRNAの場合）核酸分子を指すために使用される。遺伝子の境界は、5'（すなわちアミノ）末端の開始コドン及び3'（すなわちカルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決められる。遺伝子という用語には、限定されるものではないが、原核性又は真核性のmRNA、cDNA、原核性DNA又は真核性DNAからのゲノムDNA配列、そして更に合成DNA配列も含まれる。転写終結配列は、通常は遺伝子配列の3'側に位置することとなる。
用語「導入遺伝子」は、本発明の文脈においては、その自然な状況から切り離された、異種プロモーターの発現制御下にある遺伝子を指すために使用される。本発明の導入遺伝子の1つの例は、桿体の環状ヌクレオチド依存性チャネルのβ-サブユニットをコードする「桿体の環状ヌクレオチド依存性チャネルβ」（CNGB1）遺伝子である。更なる実施形態において、導入遺伝子は、ヒトタンパク質：ATP結合カセットサブファミリーAメンバー4（ABCA4）、アリール炭化水素受容体相互作用タンパク質様1（AIPL1）、ベストロフィン1（BEST1）、電位依存性カルシウムチャネルサブユニットα1F（CACNA1F）、神経セロイドリポフスチン症3（CLN3）、クラリン1（CLRN1）、環状ヌクレオチド依存性チャネルα1（CNGA1）、中心体タンパク質290（CEP290）、Crumbs1（CRB1）、Crumbs2（CRB2）、錐体桿体ホメオボックス（CRX）、G-タンパク質共役型受容体98（GPR98）、グアニル酸シクラーゼアクチベーター1A（GUCA1A）、グアニル酸シクラーゼアクチベーター1B（GUCA1B）、ミオシンVIIA（MYO7A）、核受容体サブファミリー2グループEメンバー3（NR2E3）、神経網膜ロイシンジッパー（NRL）、ホスホジエステラーゼ6A（PDE6A）、ホスホジエステラーゼ6B（PDE6B）、ペリフェリン2（PRPH2）、プロミニン1（PROM1）、ロドプシン（RHO）、網膜外部膜タンパク質1（ROM1）、網膜色素変性症1タンパク質（RP1）、網膜色素変性症2タンパク質（RP2）、網膜色素上皮特異的タンパク質65（RPE65）、網膜色素変性症GTPアーゼレギュレーター（RPGR）、S-抗原視覚アレスチン（SAG）、アッシャー症候群1C型タンパク質（USH1C）、アッシャー症候群1G型タンパク質（USH1G）、アッシャー症候群2A型タンパク質（USH2A）又はその機能的断片若しくは変異体を含み得る。上記タンパク質の具体的な実施形態のアミノ酸配列は、配列番号10〜配列番号41、及び配列番号45に示されている。機能的断片は、桿体光受容器の正常な機能における各々のタンパク質の機能を維持するそれらの断片である。同様に、変異体も、桿体光受容器における各々のタンパク質の機能を維持する。長いアミノ酸配列を有するタンパク質、例えば、ヒトのCACNA1Fタンパク質、CEP290タンパク質、GPR98タンパク質、MYO7Aタンパク質、RP1タンパク質、及びUSH2Aタンパク質は、それぞれ選択されるベクター系、特にAAVベクターによって送達可能な導入遺伝子によってコードされるには長すぎる。AAVベクターのサイズ制限に合わせるために、遺伝子療法のためのインテイン媒介スプリットシステムの開発を使用する「スプリットベクター」技術を使用することができる。スプリットインテインの使用により、AAVのパッケージング限界を避けることができる。したがって、対象となる導入遺伝子のそれぞれの半分を、対応するスプリットインテイン部分に融合することができ、同時発現に際してのみ、インテイン媒介トランススプライシングが起こり、完全なトランスジェニックタンパク質が再構成される。こうして、同時導入に際して標的細胞内で全長の機能的タンパク質へと集成するトランスジェニックタンパク質の断片をコードする2つのベクターを構築することが可能となる。
本出願の文脈で使用される用語「CNGB1」は、その遺伝子又はCNGB1遺伝子によりコードされるタンパク質、すなわち、細胞内cGMPのレベルの光に誘発される変化に応答して桿体光受容器外節へのイオンの流れの制御を助ける桿体光受容器cGMP依存性カチオンチャネルのいずれかを指す。このチャネルは、α及びβの2つのサブユニットからなり、上記遺伝子によりコードされるタンパク質は、βサブユニットに相当する。CNGB1及びこの遺伝子における欠陥と関連する疾患には、網膜色素変性症45型及びCNGB1関連網膜色素変性症が含まれる。環状ヌクレオチド依存性チャネルのCNGB1サブユニットは、視覚シグナル伝達及び嗅覚シグナル伝達の両方に重要な役割を担う。CNGA1に関連する場合に、それは、細胞内cGMPのレベルの光に誘発される変化に応答した、桿体光受容器外節（ROS）へのイオンの流れの調節に関与している。
本明細書で使用される用語「増殖」は、細胞増殖の増加又は減少のいずれかをもたらし得る、細胞成長及び細胞分裂の結果として細胞数が増加することを指す。過剰な細胞増殖は、過剰増殖性障害を併発し、その際、細胞の細胞分裂は、正常な組織に比べて増加する。そのような障害は、異常増殖（産生）、すなわち細胞の過剰産生を特徴とする。過剰増殖性障害は、腫瘍疾患を含む。腫瘍疾患は、良性腫瘍又は悪性腫瘍を含み得て、悪性腫瘍疾患は、癌と呼ばれる。過剰増殖性障害という用語は、癌だけでなく、前癌障害も含む。特定の実施形態においては、過剰増殖性障害は、桿体細胞の過剰増殖性障害、特に網膜芽細胞腫である。
用語「アミノ酸」は一般的に、置換若しくは非置換のアミノ基、置換若しくは非置換のカルボキシ基、及び1つ以上の側鎖若しくは基、又はこれらの基のいずれかの類似体を含む任意のモノマー単位を指す。本明細書で使用される場合に、用語「アミノ酸」は、以下の20種類の天然すなわち遺伝子によりコードされるαアミノ酸：アラニン（Ala又はA）、アルギニン（Arg又はR）、アスパラギン（Asn又はN）、アスパラギン酸（Asp又はD）、システイン（Cys又はC）、グルタミン（Gln又はQ）、グルタミン酸（Glu又はE）、グリシン（Gly又はG）、ヒスチジン（His又はH）、イソロイシン（Ile又はI）、ロイシン（Leu又はL）、リシン（Lys又はK）、メチオニン（Met又はM）、フェニルアラニン（Phe又はF）、プロリン（Pro又はP）、セリン（Ser又はS）、トレオニン（Thr又はT）、トリプトファン（Trp又はW）、チロシン（Tyr又はY）、及びバリン（Val又はV）を含む。「X」残基が定義されていない場合に、これらは「任意のアミノ酸」として定義されるべきである。これらの20種の天然アミノ酸の構造は、例えばStryer et al., Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company (2002)に示されている。セレノシステイン及びピロリシン等の更なるアミノ酸が遺伝的にコードされていてもよい（Stadtman (1996) "Selenocysteine," Annu Rev Biochem. 65:83-100、及びIbba et al. (2002) "Genetic code: introducing pyrrolysine," Curr Biol. 12(13):R464-R466）。複数のアミノ酸がペプチド結合により結合されることで、ペプチド又はポリペプチドが形成され得る。
本発明の文脈においては、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸の短いポリマーを指す。ペプチドは、タンパク質と同じ化学（ペプチド）結合を有するが、通常はより長さが短い。最も短いペプチドは、単一のペプチド結合によって結合された2個のアミノ酸からなるジペプチドである。また、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド等も存在し得る。典型的には、ペプチドは、8アミノ酸、10アミノ酸、12アミノ酸、15アミノ酸、18アミノ酸、又は20アミノ酸までの長さを有する。ペプチドは、それが環状ペプチドではない限り、アミノ末端及びカルボキシル末端を有する。
本発明の文脈においては、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって共に結合されたアミノ酸の単一の直鎖を指し、それは、典型的には少なくとも約21個のアミノ酸を含む。ポリペプチドは、2つ以上の鎖から構成されるタンパク質の1つの鎖であってよく、又はポリペプチドは、タンパク質が1つの鎖から構成される場合にはタンパク質それ自体であってよい。
本明細書で使用される用語「断片」は、天然に存在する断片（例えば、スプライス変異体）だけでなく、人工的に構築された断片も指し、特に遺伝子工学的手段により得られる断片を指す。典型的には、断片は、親ポリペプチドと比較して、そのN末端及び／又はそのC末端に及び／又は内部に、好ましくはそのN末端、そのN末端及びC末端、又はそのC末端に1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、220個、230個、240個、250個、260個、270個、280個、290個、又は300個までのアミノ酸の欠失を有する。
本明細書で使用される場合に、用語「変異体」は、誘導される元のポリペプチド又はポリヌクレオチドと比較して、長さ又は配列における1つ以上の変化により異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドとして理解されるべきである。ポリペプチド変異体又はポリヌクレオチド変異体が誘導される元のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、親ポリペプチド又は親ポリヌクレオチドとしても知られている。用語「変異体」は、親分子の「断片」又は「誘導体」を含む。典型的には、「断片」は、親分子よりも長さ又は大きさが小さいが、「誘導体」は、親分子と比較してその配列に1つ以上の違いを示す。また、修飾された分子、例えば限定されるものではないが、翻訳後修飾されたタンパク質（例えば、グルコシル化、ビオチニル化、リン酸化、ユビキチン化、パルミトイル化、又はタンパク質分解されたタンパク質）及び修飾された核酸、例えばメチル化DNAも包含される。また、異なる分子の混合物、例えば制限されるものではないがRNA-DNAハイブリッドも、用語「変異体」によって包含される。典型的には、変異体は、人工的に、好ましくは遺伝子工学的手段によって構築されるが、親タンパク質又は親ポリヌクレオチドは、野生型タンパク質若しくはポリヌクレオチド、又はそのコンセンサス配列である。しかしながら、また天然に存在する変異体も、本明細書で使用される用語「変異体」によって包含されると理解されるべきである。さらに、本発明で使用可能な変異体は、親分子のホモログ、オルソログ若しくはパラログから、又は人工的に構築された変異体から誘導され得るが、但し、該変異体は、親分子の少なくとも1つの生物学的活性を示す、すなわち機能的に活性である。
特に、用語「ペプチド変異体」又は「ポリペプチド変異体」は、誘導される元のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質と比較して、アミノ酸配列における1つ以上の変化によって異なるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質として理解されるべきである。ペプチド変異体、ポリペプチド変異体、又はタンパク質変異体が誘導される元のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、親ペプチド、親ポリペプチド、又は親タンパク質としても知られる。さらに、本発明で使用可能な変異体はまた、親ペプチド、親ポリペプチド、若しくは親タンパク質のホモログ、オルソログ、若しくはパラログから、又は人工的に構築された変異体から誘導され得るが、但し、該変異体は、親ペプチド、親ポリペプチド、又は親タンパク質の少なくとも1つの生物学的活性を示す。アミノ酸配列における変化は、アミノ酸交換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、N末端欠損若しくはC末端欠損、又はこれらの変化の任意の組み合わせであってよく、それらは1つの部位又は幾つかの部位で存在し得る。ペプチド変異体、ポリペプチド変異体、又はタンパク質変異体は、アミノ酸配列中に200個まで（1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、又は200個まで）の全数の変化（すなわち、交換、挿入、欠失、N末端欠損及び／又はC末端欠損）を示し得る。アミノ酸交換は、保存的及び／又は非保存的であり得る。それに代えて又はそれに加えて、本明細書で使用される「変異体」は、誘導される元の親ペプチド、親ポリペプチド、又は親タンパク質との或る特定の度合いの配列同一性を特徴とし得る。より厳密には、本発明の文脈におけるペプチド変異体、ポリペプチド変異体、又はタンパク質変異体は、その親ペプチド、親ポリペプチド、又は親タンパク質と少なくとも80%の配列同一性を示す。ペプチド変異体、ポリペプチド変異体、又はタンパク質変異体の配列同一性は、20個、30個、40個、45個、50個、60個、70個、80個、90個、100個以上のアミノ酸の連続的な範囲にわたっている。
「配列同一性のパーセント」は、2つの最適にアライメントされた配列を比較ウィンドウにわたって比較することにより決定され、比較ウィンドウ内の配列の部分は、2つの配列の最適なアライメントのための参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。そのパーセントは、両方の配列に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が存在する位置の数を調べることで、合致した位置の数を得て、その合致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数により割り、その結果に100を掛けることによって計算することで、配列同一性のパーセントが得られる。
2つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「同一」という用語は、同じである、すなわちヌクレオチド又はアミノ酸の同じ配列を含む2つ以上の配列又は部分配列を指す。以下の配列比較アルゴリズムの1つを使用して、又は手動のアライメント及び目視確認によって評価して、比較ウィンドウ又は指定領域にわたる最大の一致について比較及びアライメントした場合に、同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセントを配列が有するのであれば（例えば、アライメントされた領域にわたって少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92 %、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の同一性）、配列は互いに「実質的に同一」である。これらの定義は、試験配列の相補体にも当てはまる。したがって、用語「少なくとも80%の配列同一性」は、明細書全体を通して、ポリペプチド配列比較及びポリヌクレオチド配列比較に関して使用される。この表現は、好ましくは、それぞれの参照ポリペプチド又はそれぞれの参照ポリヌクレオチドに対して、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を指す。
用語「配列比較」は、或る配列が参照配列としての役割を果たし、それと試験配列を比較する方法を指す。配列比較アルゴリズムを使用する場合に、必要な部分列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定されたら、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力する。デフォルトのプログラムパラメーターが一般に使用され、又は代替的なパラメーターが指定され得る。その際に配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列についてのパーセントの配列同一性又は類似性を計算する。2つの配列が比較される場合であって、配列同一性のパーセントが計算される比較対象となるべき参照配列が特定されていない場合に、配列同一性は、特段の記載がない限りは、比較されるべき2つの配列のうち長い方を参照して計算されるべきである。参照配列が示される場合に、配列同一性は、特段の記載がない限り、配列番号によって示される参照配列の全長を基礎として決定される。
本発明の文脈で使用される「作動可能に連結された」は、そのように記載された構成要素がそれらの通常の機能を発揮するように構成されるエレメントの配置を指す。核酸が、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合に、核酸は「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターは、それが1つ以上の導入遺伝子の転写に影響を及ぼすのであれば、1つ以上の導入遺伝子に作動可能に連結されている。さらに、コーディング配列に作動可能に連結された制御エレメントは、コーディング配列の発現に影響を及ぼすことが可能である。制御エレメントがコーディング配列を発現に向かわせる機能を有する限りは、制御エレメントはコーディング配列と連続している必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される介在配列が、プロモーター配列とコーディング配列との間に存在する場合があり、そのプロモーター配列は、依然としてコーディング配列に「作動可能に連結されている」とみなされ得る。
本明細書で使用される用語「ポリアデニル化シグナル」（PAS）は、翻訳のための成熟メッセンジャーRNA（mRNA）産生の過程に関与する配列を指す。したがって、ポリアデニル化は、遺伝子発現のより長い過程の一部をなす。ポリアデニル化の過程は、遺伝子の転写が終結してから開始する。新たにできたpre-mRNAの最も3'側のセグメントは、一連のタンパク質によって最初に切断され、これらのタンパク質は次いで、RNAの3'末端でポリ（A）テールを合成する。幾つかの遺伝子において、これらのタンパク質は、幾つかの可能な部位の1つにポリ（A）テールを付加する。したがって、ポリアデニル化は、選択的スプライシングと同様に、単一の遺伝子から2つ以上の転写物を産生し得る（選択的ポリアデニル化）。ポリ（A）テールは、mRNAの核外搬出、翻訳、及び安定性のために重要である。該テールは、時間の経過と共に短くなり、十分に短くなると、mRNAは酵素分解される。しかしながら、少数の細胞型においては、短いポリ（A）テールを有するmRNAは、再ポリアデニル化による後の活性化のために細胞質ゾル中に貯蔵される。本発明のPASは、短いシミアンウイルス40（SV40）ポリアデニル化シグナル（SV40 PAS）をコードする核酸を含み得る。このポリヌクレオチド修飾は、対象となる遺伝子、例えば光受容器細胞中のhCNGB1の発現が大幅に増強されるという利点を有する。SV40 PASを含むことにより達成される長期発現は、ポリヌクレオチドを活性の遺伝子療法剤として使用するために適している。特に、PASは、配列番号4による核酸配列を含み得る。
本明細書で使用される場合に、発現構築物とも呼ばれる「ベクター」という用語は、通常は細胞内でのタンパク質発現のために設計されたウイルスである。用語「ベクター」は、細胞内に導入され得るタンパク質若しくはポリヌクレオチド若しくはそれらの混合物、又は含まれるタンパク質及び／又は核酸を細胞内に導入することが可能なタンパク質若しくはポリヌクレオチド又はそれらの混合物を指す。ベクターの例としては、限定されるものではないが、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、又は人工染色体が挙げられる。特に、ベクターは、本発明のプロモーター及び導入遺伝子を適切な宿主細胞中に運搬するために使用される。ベクターは、そのベクターの宿主細胞内での自律複製を促す「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含み得る。外来DNAは、宿主細胞において天然に見られないDNAであり、例えばベクター分子を複製し、選択可能若しくはスクリーニング可能なマーカーをコードし、又は導入遺伝子をコードする異種DNAとして定義される。宿主細胞内に入ると、ベクターは、宿主染色体DNAと独立して又はそれと同時に複製され得て、ベクター及びその挿入されたDNAの幾つかのコピーが生成され得る。さらに、ベクターはまた、挿入されたDNAのmRNA分子への転写を可能にするか、又はその他に挿入されたDNAのRNAの複数のコピーへの複製を引き起こす必要なエレメントも含み得る。ベクターは、対象となる遺伝子の発現を調節する「発現制御配列」を更に含み得る。典型的には、発現制御配列は、限定されるものではないが、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、又はリプレッサー等のポリペプチド又はポリヌクレオチドである。対象となる1つ以上の遺伝子産物をコードする2つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターにおいて、発現は、1つ以上の発現制御配列によって一緒に又は別個に制御され得る。より具体的には、ベクター上に含まれる各ポリヌクレオチドは、別個の発現制御配列によって制御され得るか、又はベクター上に含まれる全てのポリヌクレオチドは、単一の発現制御配列によって制御され得る。単一の発現制御配列によって制御される単一のベクター上に含まれるポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレームを形成し得る。幾つかの発現ベクターは、発現されるmRNAの半減期を高める、及び／又はmRNAのタンパク質分子への翻訳を可能にする挿入されたDNAに隣接する配列エレメントを更に含む。多くのmRNAの分子及び挿入されたDNAによってコードされるポリペプチドは、したがって迅速に合成され得る。
本発明の文脈で使用される用語「AAVベクター」は、完全なウイルス粒子、すなわち、AAVカプシドタンパク質外被と会合した線状一本鎖AAV核酸ゲノムを含む完全なウイルス粒子を指す。これに関して、いずれかの相補鎖の一本鎖AAV核酸分子（すなわち、「センス」鎖又は「アンチセンス」鎖）が、いずれか1つのAAVビリオン中にパッケージングされ得る。両方の鎖は等しく感染性である。本発明のAAVベクターは、両側でAAV ITRと隣接し得る対象となる異種DNA分子（例えば、hCNGB1）をカプシド形成するAAVタンパク質外殻から構成される感染性の複製欠損性ウイルスでもあり得る。例示的なAAVの5'ITRは、配列番号5による核酸配列を有し、かつ例示的なAAVの3'ITRは、配列番号6の相補体の核酸配列を有する。本発明のAAVベクターは、AAVベクター、AAVヘルパー機能、及びその中に導入されたアクセサリー機能を有した適切な宿主細胞中で産生され得る。このようにして、宿主細胞は、後続の遺伝子送達のために組換えビリオン粒子中にAAVゲノム（すなわち、対象となる組み換えヌクレオチド配列を含む）をパッケージングするために必要なAAVポリペプチドをコードすることが可能となる。
12種のヒト血清型（AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、及びAAV12）を含むアデノ随伴ウイルス（AAV）の様々な天然に存在する血清型、及び非ヒト霊長類からの幾つかの血清型が特定されている。異なるAAV血清型は、そのゲノム配列においても、例えば末端逆位反復配列（ITR）又はカプシドをコードする配列においても異なる。本発明の文脈で使用される用語「AAVゲノム」は、限定されるものではないが、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-9、AAV-7等を含むアデノ随伴ウイルス血清型に由来する任意の核酸配列を指す。AAVゲノムは、全体又は一部が欠失しているが、機能を保持しており、末端逆位反復（「ITR」）配列に隣接するAAV野生型遺伝子の1つ以上、好ましくはRep遺伝子及び／又はCap遺伝子を有し得る。機能的なITR配列は、一般的にAAVゲノムのレスキュー、複製、及びパッケージングのために必要である。したがって、AAVゲノムは、本明細書においては、ウイルスの複製及びパッケージングのためにシスに必要とされるそれらの配列（例えば、機能的なITR）を少なくとも含むと定義される。ITRは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的なレスキュー、複製、及びパッケージングを提供する限り（例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換によって）改変されてもよい。ITRは、配列番号5及び／又は配列番号6による配列を含み得る。
本発明の文脈において使用される「抗体」は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する糖タンパク質であり、抗体及び免疫グロブリンという用語は、しばしば区別なく使用される。抗体は、形質細胞により産生されるタンパク質分子を指し、細菌及びウイルス等の異物を同定及び中和するために免疫系により使用される。抗体は、外来標的の固有の部分、つまりその抗原を認識する。
本明細書で使用される用語「抗体結合フラグメント」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つ以上のフラグメントを指す。用語「抗体結合フラグメント」の範囲内に含まれる結合フラグメントの例としては、抗原結合（Fab）フラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、重鎖抗体、単一ドメイン抗体（sdAb）、単鎖可変領域フラグメント（scFv）、可変領域フラグメント（Fv）、VHドメイン、VLドメイン、単一ドメイン抗体、ナノボディ、IgNAR（免疫グロブリン新規抗原受容体）、di-scFv、二重特異性T細胞エンゲージャー（BITE）、二重親和性再標的化（DART）分子、トリプルボディ（triple body）、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、代替足場タンパク質、及びそれらの融合タンパク質が挙げられる。
本出願で使用される用語「医薬組成物」は、有効化合物又は有効成分、すなわち本発明のポリヌクレオチド、プラスミド、及び／又はベクターの製剤を含み、組織状態又は疾患の特定、予防、維持、又は治療のために使用される物質及び／又は物質の組み合わせ物を指す。医薬組成物は、疾患を予防及び／又は治療するために、及び／又は生理学的状態を維持するために患者に投与するために適切に製剤化される。さらに、医薬組成物は、有効作用物質と、組成物を治療的使用に適したものにする不活性又は活性の担体との組み合わせ物を指す。医薬組成物は、それらの化学的特性及び物理的特性に応じて、経口、非経口、局所、吸入、直腸、舌下、経皮、皮下、又は膣の投与経路のために製剤化され得る。医薬組成物は、固体、半固体、液体、経皮治療システム（TTS）を含む。固体組成物は、錠剤、被覆錠剤、粉剤、粒状剤、ペレット剤、カプセル剤、発泡錠、又は経皮治療システムからなる群から選択される。また、液剤、シロップ剤、輸液、エキス剤、静脈内投与用液剤、輸液用液剤、又は本発明の担体システムの液剤からなる群から選択される液体組成物も含まれる。本発明の文脈において使用され得る半固体組成物は、乳剤、懸濁剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、丸剤、バッカル錠剤、及び坐剤を含む。
「薬学的に許容可能」は、連邦政府若しくは州政府の規制庁によって承認されていること、又は動物、より具体的にはヒトにおける使用について米国薬局方若しくはその他の一般的に認められた薬局方に列挙されていることを意味する。
本明細書内で参照される「担体」は、試薬を人体の所望の部分、例えば或る特定の細胞型へと送達することが可能な組成物を含み、選択された投与経路及び投与計画により投与した後に薬物の放出を提供及び制御するために有用である。
本明細書で使用される場合に、投与経路は、人体における生体異物の吸収を説明し、生体異物が適用される位置によって分類される。ポリヌクレオチド及び／又はウイルスベクターを含む医薬組成物は、特に治療方法において、眼内用、眼球内用、硝子体内用、又は網膜下用から選択される。
用語「疾患」は、異常な状態、特に細胞、組織、器官、又は個体がその機能をもはや効果的に満たすことができない病気又は怪我等の異常な医学的状態を指す。典型的には、必ずそうとは言えないが、疾患は、そのような疾患の存在を指示する特定の症候又は徴候と関連している。したがって、そのような症候又は徴候の存在は、疾患を患う細胞、組織、器官、又は個体のための指標であり得る。これらの症候又は徴候の変化は、そのような疾患の進行に関する指標となり得る。疾患の進行は、典型的には、該疾患の「悪化」又は「好転」を示し得る症候又は徴候の増加又は減少によって特徴付けられる。疾患の「悪化」は、細胞、組織、器官、又は個体／患者がその機能を効果的に満たす能力の低下によって特徴付けられ、その一方で、疾患の「好転」は典型的には、細胞、組織、器官、又は個体／患者がその機能を効果的に満たす能力の増加によって特徴付けられる。疾患に「罹患しやすい」細胞、組織、器官、又は個体は、健康な状態にあるが、例えば遺伝的素因、予防接種の欠如、免疫の不十分な発達又は未熟な免疫、栄養状態の不良等のため、疾患の出現を特に受けやすい。
本発明の文脈における「網膜の疾患」は、限定されるものではないが、任意の種類の網膜変性を指す。網膜変性の群に属する網膜ジストロフィーは、様々な重症度の異なる遺伝パターンを有する遺伝性網膜障害の広範な群である。網膜ジストロフィーは、色素性網膜症の群に属する。網膜色素変性症は、最も一般的な網膜ジストロフィーであり、眼底検査で視認可能な網膜色素沈着と、桿体光受容器細胞の一次的喪失に続く錐体光受容器の二次的喪失とを特徴とする。患者は、典型的には暗視盲目（night vision blindness）及び中間周辺視野の喪失を伴う。疾患状態が進行するにつれ、疾患を患う患者は、それらの遠部周辺視野を失い、最終的には中心視覚も失う。網膜変性は、遺伝子の突然変異、置換、及び／又は欠失と関連し得る。網膜変性は、夜盲症、盲目、網膜変性、網膜ジストロフィー、及び網膜色素変性症からなる群から選択される。網膜色素変性症は、CNGB1連鎖性網膜色素変性症又は網膜色素変性症45型（RP45）であり得る。
網膜障害のその他の例としては、限定されるものではないが、RPE65媒介網膜障害、黄斑変性（例、加齢黄斑変性）、遺伝性若年性黄斑変性（例、シュタルガルト病）、桿体錐体ジストロフィー、椎体桿体ジストロフィー、小口病、常染色体優性放射状ドルーゼン等が挙げられる。
本明細書で使用される場合に、「CNGB1連鎖性網膜色素変性症」は、網膜の進行性変性を伴い、典型的には中間周辺部で始まり、黄斑及び中心窩に向かって進行する疾患のクラスを指す（Ferrani et al. (2011) Curr. Genomics 12(4):238）。典型的な表現型症状としては、夜盲症に続く視野の減少が挙げられ、こうして視野狭窄、そして最終的には法的盲、又は多くの場合には完全な盲目が引き起こされる。細胞レベルでは、これは主として冒される桿体光受容器系と相関している。後期には、該疾患は更に錐体光受容器を冒し、こうして最終的に完全な盲目が引き起こされる場合がある。患部の光受容器はアポトーシスを起こし、これは、網膜内の外顆粒層の厚さの減少、並びに眼底の病変及び／又は網膜色素沈着に反映される。患者は、視力の喪失を経る前にその光受容器のかなりの部分を失い得る。臨床的表現型の特徴としては、限定されるものではないが、（i）骨小体様沈着と網膜血管の減衰とを伴う異常な眼底、（ii）網膜電図（ERG）におけるa波及びb波の異常、減少、又は欠如、並びに（iii）視野の減少が挙げられる。症状は典型的には10代前半に始まり、40歳〜50歳までに重度の視覚障害が生ずる。
網膜色素変性症の病原であることが知られている遺伝子変異の1つの例は、CNGB1遺伝子のエキソン32のドナー部位でのホモ接合型スプライス部位突然変異（3444+1G-A）であり、それはフレームシフトと最後の28個のアミノ酸の欠損をもたらす。網膜色素変性症の病原であることが知られている遺伝子変異のもう1つの例は、CNGB1遺伝子のエキソン30におけるホモ接合型の2978G-Tトランスバージョンであり、それはタンパク質の位置993でのグリシンからバリンへの置換（G993V）をもたらすと予想される。CNGB1のグリシン993は、保存された残基である。網膜色素変性症の病原であることが知られている遺伝子変異のもう1つの例は、CNGB1遺伝子におけるホモ接合型のc.1589C-Gトランスバージョンであり、それによりCNGB1タンパク質の位置530でプロリンからアルギニンへの置換（P530R）がもたらされる。網膜色素変性症の病原であるもう1つの既知の遺伝子変異としては、CNGB1遺伝子におけるc.2128C-Tの変化が挙げられ、それによりCNGB1タンパク質の位置710でグルタミンから終止への置換（Q710Stop）がもたらされる。網膜色素変性症の病原であるその他の遺伝子変異は、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）データベース、及び米国立バイオテクノロジー情報センターにより管理されるClinVarデータベースにおいて見出すことができ、これらは全ての目的について、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
CNGB1連鎖性網膜色素変性症は、本明細書に記載される1つ以上の表現型徴候及び／又はCNGB1遺伝子における1つ以上の遺伝子変異を検出する、当該技術分野において知られる方法によって特定することができる。CNGB1の保存された残基の変化をもたらすあらゆる遺伝子変異は、網膜色素変性症についての病原である可能性がある。
本明細書で使用される場合に、疾患又は障害を「治療する（treat）」、それらを「治療すること（treating）」、それらの「治療（treatment）」又は「療法（therapy）」は、以下の（a）障害の重症度を軽減すること、（b）治療される1つ以上の障害の症候特性の発生を制限又は防止すること、（c）治療される1つ以上の障害の症候特性の悪化を抑えること、（d）以前に1つ以上の障害を有していた個体における1つ以上の障害の再発を制限又は防止すること、及び（e）以前に1つ以上の障害の徴候を有していた個体における症候の再発を制限又は防止することのうちの1つ以上を達成することを意味する。
実施形態
以下で、本発明の種々の態様をより詳細に定義する。こうして定義される各々の態様は、そうでないことが明確に示されていない限り、任意のその他の1つ以上の態様と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であることが示される任意の特徴は、好ましい又は有利であることが示される任意のその他の1つ以上の特徴と組み合わせることができる。
核酸を細胞内に導入することで、例えば発現を増強し、欠陥遺伝子を置き換え、及び／又は欠陥遺伝子の発現を阻害する遺伝子療法的アプローチ及び／又は遺伝子矯正治療アプローチにおいては、全てのトランスジェニックエレメントが小さいことが一般的に望まれる。それにもかかわらず、in vivoの状況において悪影響を及ぼさず、又はそれらの活性を失うことなくサイズを縮小することができるトランスジェニックエレメントを特定することは、しばしば困難である。一般的にin vitro実験は、該エレメントのin vivo挙動を示すために適しておらず、そのことが可能なサイズ縮小の決定を困難にし、予測不可能にしている。本発明へと導く研究において、驚くべきことに、ヒト桿体プロモーターの短い部分、すなわち200塩基より小さいエレメントが、in vivoにおいて桿体光受容器特異的発現を、このプロモーターエレメントに作動可能に連結された導入遺伝子へと移し得ることが分かった。本明細書で定義されるプロモーターエレメントがin vivo環境で使用された場合に、導入遺伝子の安定的な組み込み及び発現が観察された。その発現レベルは、導入遺伝子を有するアデノ随伴ウイルスベクターでトランスフェクションされた試験動物の視覚能力を改善するために適していた。
この驚くべき知見により、とりわけ当該技術分野を上回る以下の利点が得られる：（i）細胞中に導入される構築物のサイズの減少、（ii）導入遺伝子のウイルスベクター中へのパッケージング効率の増加、（iii）組み換え事象がin vivoで起こる可能性の減少、（iv）導入遺伝子の標的細胞中への、特に標的細胞の核中への導入の効率の増加、（v）桿体関連疾患を治療するために適したヒト患者における発現レベル、（vi）in vivoでの網膜機能の保全及び／又は改善、及び／又は（vii）in vivoでの視覚の保全及び／又は改善。
第1の態様において、本発明は、
a）配列番号1又はその変異体による核酸配列を含む、実質的に該核酸配列からなる、又は該核酸配列からなるヒト桿体光受容器特異的プロモーターエレメント（hRPSPE）と、コアプロモーター（CP）とを含むプロモーターと、
b）a）のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つの導入遺伝子（TG）と、
をこの順序で含むポリヌクレオチドであって、前記配列番号1の変異体は、配列番号1のヌクレオチド位置6〜位置13、位置32〜位置40、位置70〜位置83、及び位置87〜位置94の範囲外に1つ以上の核酸置換を含み、前記プロモーターの長さは特に350塩基以下である、ポリヌクレオチドに関する。上記利点の1つ以上をもたらすプロモーターは、350塩基より長くてもよく、例えば600塩基対以下、500塩基対以下、又は400塩基対以下であってもよい。特定の実施形態においては、該プロモーターは、300塩基以下の長さを有し、その他の実施形態においては、該プロモーターは、300塩基以下の長さを有し、その他の実施形態においては、該プロモーターは、250塩基以下の長さを有し、その他の実施形態においては、該プロモーターは、200塩基以下の長さを有し、その他の実施形態においては、該プロモーターは、194塩基以下の長さを有する。
患者へと導入される異種塩基の全長を最小化する試みにおいて、上記ポリヌクレオチドは、その他のヒト桿体プロモーター及び／又は上記a）に明確に定義された以外の遺伝子ヌクレオチド配列を含まない。
示されたヌクレオチドは、配列番号1の変異体において保存されているべきである。それというのも、本発明者らは、これらのヌクレオチド配列が、hRPSPEに桿体光受容器特異的発現を与える助けになると考えているからである。推定の転写因子結合配列（TFB）の範囲外では、1つ以上のヌクレオチドが突然変異又は挿入されていてもよい。ヌクレオチドが挿入される場合には、1個〜70個のヌクレオチドの挿入が有利な数であり、7の倍数が特に有利である。それというのも、この数はTFBの相対回転位置を維持するからである。しかしながら、TFB間の距離が変更されず、プロモーターエレメントに結合する転写因子の回転変位が回避されるのであれば有利である。こうして、配列番号1による99塩基対の長さの配列の範囲内で、位置1〜位置5、位置14〜位置31、位置41〜位置69、位置84〜位置86、及び位置95〜位置99で1つ以上のヌクレオチドが突然変異されることが許容される。したがって、配列番号1の範囲内では、最大50個のヌクレオチドが突然変異され得る。したがって、特定の変異体は、1個から50個の間の突然変異、すなわち1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、又は50個の突然変異を含む。その他の特定の変異体は、5個から40個の間の、10個から30個の間の、又は20個から25個の間の突然変異を含む。hRPSPEの変異体を含むプロモーターは、配列番号1による核酸配列を含むhRPSPEを含むプロモーター、好ましくは配列番号2のヌクレオチド155〜ヌクレオチド350、又はヌクレオチド155〜ヌクレオチド348からなるプロモーターと同等の桿体光受容器特異的発現レベルを示す。該変異体が配列番号2のヌクレオチド155〜ヌクレオチド350、又はヌクレオチド155〜ヌクレオチド348からなるプロモーターの発現レベルの少なくとも10%を示すのであれば有利である。その他の有利な発現レベルは、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、又は少なくとも100%である。それぞれの治療アプローチに応じて、異なる発現レベルが有利である場合があり、特に、導入遺伝子のより高い発現レベルが欠乏を過補償する又は有害効果を引き起こすのであれば、配列番号2のヌクレオチド155〜ヌクレオチド350からなるプロモーターで得られる発現レベルより低い発現レベルが有利である場合がある。
また、本発明のポリヌクレオチドが、a）のプロモーターに作動可能に連結された2つ以上の導入遺伝子を含むことも考えられる。そのような状況においては、2つ以上の導入遺伝子の個別の発現は、2つの導入遺伝子の間に、2つの導入遺伝子の個別の翻訳を可能にするヌクレオチド配列を挿入する、例えば配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードすることにより得ることができる。
本発明の第1の態様の1つの実施形態においては、a）のプロモーターに含まれるhRPSPEの5'末端は、配列番号2又はその変異体の1から160までの核酸位置にあり、3'末端は、配列番号2又はその変異体の290から310までの核酸位置にある。特定の実施形態においては、hRPSPEの5'末端は、以下の核酸位置：配列番号2の位置1、位置10、位置20、位置30、位置40、位置50、位置60、位置70、位置80、位置90、位置100、位置110、位置120、位置130、位置140、位置145、位置150、位置151、位置152、位置153、位置154、位置155、位置156、位置157、位置158、位置159、又は位置160の1つにある。特定の実施形態においては、hRPSPEの3'末端は、以下の核酸位置：配列番号2の位置290、位置291、位置292、位置293、位置294、位置295、位置296、位置297、位置298、位置299、位置300、位置301、位置302、位置303、位置304、位置305、位置306、位置307、位置308、位置309、又は位置310の1つにある。したがって、特定の実施形態によれば、a）のプロモーター中に含まれるhRPSPEは、配列番号2の核酸位置1〜位置310、位置10〜位置309、位置20〜位置308、位置30〜位置307、位置40〜位置306、位置50〜位置305、位置60〜位置304、位置70〜位置303、位置80〜位置302、位置90〜位置301、位置100〜位置300、位置110〜位置299、位置120〜位置298、位置130〜位置297、位置140〜位置296、位置150〜位置295、位置151〜位置294、位置152〜位置293、位置153〜位置292、位置154〜位置291、又は位置155〜位置290にまたがっている。用語「hRPSPEの変異体」は、先に概説された意味を有する。したがって、この段落に示される断片の変異体は、それぞれ示された5'末端及び3'末端を有し、配列番号1に関して上述した配列の範囲外に突然変異を更に含み得る。
本発明の第1の態様の1つの実施形態においては、CPは、TATAボックス及び／又はイニシエーター（Inr）を有する。特定の実施形態においては、ヒトrhoプロモーターのTATAボックス及びInrである。特定の実施形態においては、a）のプロモーターに含まれるCPの5'末端は、配列番号2のヌクレオチド位置300、位置301、位置302、位置303、位置304、位置305、位置306、位置307、位置308、位置309、位置310、位置311、位置312、位置313、位置314にあり、3'末端は、配列番号2の核酸位置330、位置331、位置332、位置333、位置334、位置335、位置336、位置337、位置338、位置339、位置340、位置342、位置343、位置344、位置345、位置346、位置347、位置348、位置349、又は位置350にある。したがって、特定の実施形態によれば、a）のプロモーターに含まれるCPは、配列番号2の核酸位置300〜位置350、位置301〜位置350、位置302〜位置350、位置303〜位置350、位置304〜位置349、位置305〜位置349、位置306〜位置349、位置307〜位置349、位置308〜位置348、位置309〜位置348、位置310〜位置348、位置311〜位置348、位置312〜位置348、位置313〜位置348、又は位置314〜位置348にまたがっている。本発明の第1の態様の1つの実施形態においては、上記プロモーターの5'末端は、配列番号2又はその変異体の1から160までの核酸位置にあり、3'末端は、配列番号2又はその変異体の340から350までの核酸位置にある。特定の実施形態においては、該プロモーターの5'末端は、以下の核酸位置：位置1、位置10、位置20、位置30、位置40、位置50、位置60、位置70、位置80、位置90、位置100、位置110、位置120、位置130、位置140、位置145、位置150、位置151、位置152、位置153、位置154、位置155、位置156、位置157、位置158、位置159、又は位置160の1つにある。特定の実施形態においては、該プロモーターの3'末端は、以下の核酸位置：配列番号2の位置330、位置331、位置332、位置333、位置334、位置335、位置336、位置337、位置338、位置339、位置340、位置342、位置343、位置344、位置345、位置346、位置347、位置348、位置349、又は位置350の1つにある。したがって、特定の実施形態によれば、a）のプロモーターは、配列番号2の核酸位置1〜位置350、位置10〜位置350、位置20〜位置350、位置30〜位置350、位置40〜位置350、位置50〜位置350、位置60〜位置350、位置70〜位置350、位置80〜位置350、位置90〜位置349、位置100〜位置349、位置110〜位置349、位置120〜位置349、位置130〜位置349、位置140〜位置348、位置150〜位置348、位置151〜位置348、位置152〜位置348、位置153〜位置348、位置154〜位置348、又は位置155〜位置348にまたがっている。特定の実施形態においては、該プロモーターは、配列番号9を含む、実質的に配列番号9からなる、又は配列番号9からなる。
本発明の第1の態様の1つの実施形態においては、導入遺伝子は、桿体細胞の生理学的機能を維持若しくは改善する、及び／又は桿体細胞の増殖を阻害するタンパク質をコードする核酸を含む、実質的に該核酸からなる、又は該核酸からなる。典型的には、そのような遺伝子は、健康な桿体細胞において天然に発現される。当業者は、桿体細胞の生理学的機能に関与する桿体細胞において発現される多数の遺伝子を認識している。この機能は、とりわけ、光子の検出、及び1つ以上の光子の検出に応答した神経パルスの生成を含む。
本発明の第1の態様の1つの実施形態においては、前記導入遺伝子は、
（i）ヒト桿体の環状ヌクレオチド依存性チャネルβサブユニット（hCNGB1）、ABCA4、AIPL1、BEST1、CACNA1F、CLN3、CLRN1、CNGA1、CEP290、CRB1、CRB2、CRX、GPR98、GUCA1A、GUCA1B、MYO7A、NRL、PDE6A、PDE6B、PRPH2、PROM1、RHO、ROM1、RP1、RP2、RPE65、RPGR、SAG、USH1C、USH1G、USH2A若しくはその機能的断片若しくは変異体をコードする核酸、それらのドミナントネガティブ突然変異体をコードするmRNAを標的とするmiRNA若しくはshRNAをコードする核酸、及び／又はそれらのドミナントネガティブ突然変異体に特異的に結合する抗体若しくは抗体結合フラグメントをコードする核酸を含む、又は、
（ii）桿体細胞の増殖を阻害するタンパク質、好ましくはトキシン、プロドラッグ変換酵素、例えばチミジンキナーゼ、細胞周期阻害剤、例えば網膜芽細胞腫タンパク質（pRB）、p53、p21CIP1、p27KIP1、及びp57KIP2をコードする核酸を含み、その細胞周期阻害剤のドミナントネガティブ突然変異体をコードするmRNAを含み、及び／又はその細胞周期阻害剤のドミナントネガティブ突然変異体をコードする核酸を含む。
桿体細胞の幾つかの疾患は、桿体細胞の機能を維持若しくは改善する、又は過剰増殖を抑制する遺伝子、特に（i）又は（ii）に示されるタンパク質をコードする遺伝子の1つ以上における劣性突然変異を特徴とする。そのような場合に、機能性タンパク質をコードする導入遺伝子が、特にベクターを使用して桿体細胞内に導入されれば、しばしば疾患を治癒又は少なくとも改善するために十分である。しかしながら、疾患がドミナントネガティブ突然変異によって引き起こされる場合に、機能性タンパク質又はその機能的断片をコードする導入遺伝子の供給は、しばしば疾患を治癒又は改善するのために十分ではない。そのような場合に、ドミナントネガティブ突然変異体タンパク質の発現又は機能が細胞内で低下する、すなわちノックダウンされることが好ましい。そのようなノックダウンは、ドミナントネガティブ突然変異体タンパク質の発現を特異的に低下させる阻害性RNAをコードする導入遺伝子を発現することによって、又はドミナントネガティブ突然変異体タンパク質に特異的に結合してそれを不活性化し、対応する機能性タンパク質にはあまり結合しない抗体又はその断片をコードする1つ以上の導入遺伝子によって影響され得る。当業者は、それぞれのドミナントネガティブ突然変異体タンパク質をコードするmRNAに特異的なそのような阻害性RNAを設計する方法を十分に認識している。同様に、当業者は、ドミナントネガティブ突然変異体タンパク質のみに特異的に結合し、野生型タンパク質には結合しない抗体を生成する方法に精通している。その天然形においては、抗体は2つの異なるタンパク質鎖を有する。したがって、抗体の両方のタンパク質鎖が発現されてタンパク質がノックダウンされる場合に、1つの導入遺伝子は、配列内リボソーム進入部位（IRES）を介して重鎖をコードするもう1つの導入遺伝子に連結された軽鎖をコードするヌクレオチドを含み得る。このように、両方の抗体鎖は、単一のmRNAから発現され得る。桿体細胞内での抗体の発現に影響を与えることなく軽鎖及び重鎖の順序を逆にし得ることは、当業者には明らかである。あるいは単鎖抗体が導入遺伝子によってコードされていてもよい。
特定の実施形態においては、治療されるべき疾患は、桿体細胞の機能を維持若しくは改善する、又は過剰増殖を促進する遺伝子の1つ以上、特にAIPL1、BEST1、NR2E3、NRL、PRPH2、RHO、ROM1、及び／又はRP1の1つ以上におけるドミナントネガティブ突然変異を特徴とする。この場合に、ドミナントネガティブ突然変異体遺伝子によってコードされるタンパク質の発現及び／又は機能がノックダウンされ、機能性タンパク質又はその機能的断片をコードする導入遺伝子が発現及び／又は機能することが好ましい。それぞれのベクターのサイズ制限が許すのであれば、ポリヌクレオチドは、機能性タンパク質又はその機能的断片をコードする導入遺伝子と、阻害性RNA又は阻害性抗体若しくはそのフラグメントをコードする導入遺伝子との両方を含むことが好ましい。両方の導入遺伝子がタンパク質をコードする場合に、それらは同じプロモーターの制御下にあると共に、例えば2つの導入遺伝子の間のIRES配列を使用することができ、又は1つの導入遺伝子が1つのタンパク質をコードし、もう1つの導入遺伝子が阻害性RNAである場合に、各導入遺伝子は本発明の第1の態様のi）による個別のプロモーターに作動可能に連結され得る。
用語「機能的断片」は、それぞれのタンパク質の桿体細胞特異的機能を喪失させないそれぞれのタンパク質のN末端及び／又はC末端の欠失を指す。用語「その変異体」は、それぞれ示されたヒト野生型タンパク質、特に配列番号3、配列番号10〜配列番号41、及び配列番号45によるタンパク質に対して少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質を指す。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号3に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号10に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号11に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号12に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号13に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号14に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号15に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号16に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号17に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号18に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号19に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号20に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号21に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号22に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号23に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号24に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号25に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号26に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号27に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号28に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号29に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号30に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号31に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号32に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号33に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号34に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号35に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号36に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号37に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号38に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号39に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号40に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号41に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。特定の実施形態においては、上記変異体は、配列番号45に対して、少なくとも70%の配列同一性、特に75%の配列同一性、より具体的には80%の配列同一性、より具体的には85%の配列同一性、より具体的には90%の配列同一性、より具体的には95%の配列同一性を有する。
上記タンパク質の機能的断片は、特に光子の検出及び／又は光子の検出に関する情報の伝達において、正常に機能する桿体光受容器における各々のタンパク質の機能を維持する断片である。同様に、変異体も、正常に機能する桿体光受容器における各々のタンパク質の機能を維持する。
本発明の第1の態様の1つの実施形態においては、導入遺伝子によってコードされるhCNGB1は、配列番号3又はその変異体によるアミノ酸配列を含む。本発明の第1の態様の1つの実施形態においては、導入遺伝子によってコードされるhCNGB1は、配列番号40又はその変異体によるアミノ酸配列を含む。本発明の第1の態様の1つの実施形態においては、導入遺伝子によってコードされるhCNGB1は、配列番号41又はその変異体によるアミノ酸配列を含む。
本発明の第1の態様の1つの実施形態においては、ポリヌクレオチドは、
（i）ポリアデニル化シグナル（pA）、及び／又は、
（ii）1又は2つの末端逆位反復（ITR）配列、及び／又は、
（iii）感染性ウイルスベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニア／ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、特に単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクターを形成するために必要なウイルスのヌクレオチド配列
からなる群から選択される1つ以上の更なるヌクレオチド配列エレメントを含む。
それぞれの種類の感染性ウイルスベクターを形成するために必須のウイルスのヌクレオチド配列は、当該技術分野においてよく知られている。これらのエレメントのいずれも、本発明の第1の態様のポリヌクレオチドに含まれ得る。
本発明の第1の態様の1つの実施形態においては、前記ポリアデニル化シグナルは、シミアンウイルス40のPASを含む、実質的にシミアンウイルス40のPASからなる、又はシミアンウイルス40のPASからなる。
本発明の第1の態様の1つの実施形態においては、前記ポリアデニル化シグナルは、配列番号4又はその機能的変異体による核酸を含む、実質的に該核酸からなる、又は該核酸からなる。
本発明の第1の態様の1つの実施形態においては、前記ITR配列は、アデノ随伴ウイルス（AAV）のITRである。
本発明の第1の態様の1つの実施形態においては、前記AAVのITRは、AVV血清型2、AVV血清型5、AVV血清型8、又はAVV血清型9である。
本発明の第1の態様の1つの実施形態においては、前記プロモーター及び前記導入遺伝子は、それらの5'末端でL-ITRと隣接しており、それらの3'末端でR-ITRと隣接している。1つの特定の実施形態においては、それらのエレメントは、5'から3'の方向で以下の順序：L-ITR-プロモーター-導入遺伝子-R-ITR、L-ITR-導入遺伝子-プロモーター-R-ITR、R-ITR-プロモーター-導入遺伝子-L-ITR、又はR-ITR-導入遺伝子-プロモーター-L-ITRで配置されている。もう1つの特定の実施形態においては、それらのエレメントは、5'から3'の方向で以下の順序：L-ITR-プロモーター-導入遺伝子-PAS-R-ITR、L-ITR-PAS-導入遺伝子-プロモーター-R-ITR、R-ITR-プロモーター-導入遺伝子-PAS-L-ITR、又はR-ITR-PAS-導入遺伝子-プロモーター-L-ITRで配置されている。
本発明の第1の態様の1つの実施形態においては、前記L-ITRは、配列番号5若しくはその変異体による配列を含む、実質的に該配列からなる、若しくは該配列からなる、及び／又は前記R-ITRは、配列番号6若しくはその変異体による配列を含む、実質的に該配列からなる、若しくは該配列からなる。
使用されるウイルスベクターに応じて、ウイルスベクター中に効率的にパッケージングされ得る核酸の長さには、大きな幅がある。アデノウイルスベクターのような幾つかのベクターは、大きな核酸挿入物を収容することができるが、アデノウイルス随伴ベクターのような他のベクターは、4700塩基以下の長さを有するポリヌクレオチドを効率的にパッケージングする。ベクターの核酸パッケージング能力にかかわらず、特に異種核酸がゲノム中に安定に導入される場合に、患者に導入されるあらゆる異種核酸の長さを最小化することが一般的に望まれる。したがって、本発明の第1の態様の1つの実施形態においては、ポリヌクレオチドの全長は、5200塩基以下、特に5100塩基以下、特に5000塩基以下、特に4900塩基以下、特に4800塩基以下、より具体的には4700塩基以下である。
本発明の第1の態様の特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、5'から3'の方向で以下の核酸エレメント：L-ITR-プロモーター-導入遺伝子-SV40 PAS-R-ITR、L-ITR-SV40 PAS-導入遺伝子-プロモーター-R-ITR、R-ITR-プロモーター-導入遺伝子-SV40 PAS-L-ITR、又はR-ITR-SV40 PAS-導入遺伝子-プロモーター-L-ITRを含み、実質的に該核酸エレメントからなり、その際、上記導入遺伝子は、配列番号3のhCNGB1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、実質的に該ヌクレオチド配列を含み、又は該ヌクレオチド配列からなり、上記PASは、配列番号4のヌクレオチド配列を含み、実質的に該ヌクレオチド配列を含み、又は該ヌクレオチド配列からなり、上記L-ITRは、配列番号5のヌクレオチド配列を含み、実質的に該ヌクレオチド配列を含み、又は該ヌクレオチド配列からなり、上記R-ITRは、配列番号6のヌクレオチド配列を含み、実質的に該ヌクレオチド配列を含み、又は該ヌクレオチド配列からなり、かつ上記プロモーターは、配列番号1のヌクレオチド155〜ヌクレオチド348にまたがるヌクレオチド配列を含み、実質的に該ヌクレオチド配列を含み、又は該ヌクレオチド配列からなる。この実施形態においても、ポリヌクレオチドの全長は、5200塩基以下、特に5100塩基以下、特に5000塩基以下、特に4900塩基以下、特に4800塩基以下、より具体的には4700塩基以下である。
本発明の第2の態様は、本発明の第1の態様のポリヌクレオチドを含むプラスミドに関する。プラスミドは、細菌中で複製され得る環状DNAである。
本発明の第2の態様の1つの実施形態においては、プラスミドは、配列番号7又はその変異体による核酸配列を含む、実質的に該核酸配列からなる、又は該核酸配列からなる。本発明の第2の態様の1つの実施形態においては、プラスミドは、配列番号42又はその変異体による核酸配列を含む、実質的に該核酸配列からなる、又は該核酸配列からなる。本発明の第2の態様の1つの実施形態においては、プラスミドは、配列番号43又はその変異体による核酸配列を含む、実質的に該核酸配列からなる、又は該核酸配列からなる。本発明の第2の態様の1つの実施形態においては、プラスミドは、配列番号44又はその変異体による核酸配列を含む、実質的に該核酸配列からなる、又は該核酸配列からなる。
本発明の第3の態様は、本発明の第1の態様のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターに関する。特定の実施形態においては、ウイルスベクターは、AAVベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニア／ポックスウイルスベクター、又はヘルペスウイルスベクター、特に単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクターである。特定の実施形態においては、ウイルスベクターは、AAVである。
本発明の第3の態様の1つの実施形態においては、ウイルスは、AAV2、AAV5、AAV8、AVV9、又はそれらの変異体からなる群から選択される。
本発明の第4の態様は、医薬として使用するための、本発明の第1の態様によるポリヌクレオチド、本発明の第2の態様のプラスミド、及び／又は本発明の第3の態様によるウイルスベクターに関する。
本発明の第5の態様は、本発明の第1の態様によるポリヌクレオチド、本発明の第2の態様のプラスミド、及び／又は本発明の第3の態様によるウイルスベクターと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物に関する。
本発明の第6の態様は、網膜の疾患の療法において使用するための、本発明の第1の態様によるポリヌクレオチド、本発明の第2の態様のプラスミド、及び／又は本発明の第3の態様によるウイルスベクターに関する。
有利には、本発明の第1の態様によるポリヌクレオチド、本発明の第2の態様のプラスミド、及び／又は本発明の第3の態様によるウイルスベクターは、桿体受容体の機能の喪失又は異常な桿体受容体の機能に関連する疾患、特に網膜変性又は桿体細胞の過剰増殖、特に網膜芽細胞腫において使用され得る。導入遺伝子の組織特異的発現が、本発明の第1の態様のポリヌクレオチドのプロモーターによって得られるため、治療用のポリヌクレオチド、プラスミド、又はウイルスベクターの全身投与は、それを用いずに全身的であっても桿体受容器に限定されることとなるが、本発明の治療用のポリヌクレオチド、プラスミド、又はウイルスベクターが患者の眼に直接投与されればより効果的である。したがって、特定の投与経路は、眼内投与、眼球内投与、硝子体内投与、又は網膜下投与から選択される。
本発明の第6の態様の1つの実施形態においては、前記網膜変性は、遺伝子の突然変異、置換、及び／又は欠失と関連している。
本発明の第6の態様の1つの実施形態においては、前記網膜変性は、遺伝子の突然変異、置換、及び／又は欠失と関連している。
本発明の第6の態様の1つの実施形態においては、前記変性は、夜盲症、盲目、網膜変性、網膜ジストロフィー、及び網膜色素変性症からなる群から選択される。
本発明の第6の態様の1つの実施形態においては、前記網膜色素変性症は、CNGB1連鎖性網膜色素変性症又は網膜色素変性症45型（RP45）である。
本発明の第7の態様は、
a）配列番号9又はその変異体による核酸配列を含むヒトロドプシンプロモーターと、
b）a）のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つの導入遺伝子（TG）と、
をこの順序で含む、ポリヌクレオチドに関する。
本発明の第7の態様の1つの実施形態においては、前記導入遺伝子は、桿体の生理学的機能を維持又は改善するタンパク質をコードする核酸を含む。
本発明の第7の態様の1つの実施形態においては、前記導入遺伝子は、
（i）ヒト桿体の環状ヌクレオチド依存性チャネルβサブユニット（hCNGB1）、ABCA4、AIPL1、BEST1、CACNA1F、CLN3、CLRN1、CNGA1、CEP290、CRB1、CRB2、CRX、GPR98、GUCA1A、GUCA1B、MYO7A、NRL、PDE6A、PDE6B、PRPH2、PROM1、RHO、ROM1、RP1、RP2、RPE65、RPGR、SAG、USH1C、USH1G、USH2A若しくはその機能的断片若しくは変異体をコードする核酸、それらのドミナントネガティブ突然変異体をコードするmRNAを標的とするmiRNA若しくはshRNAをコードする核酸、及び／又はそれらのドミナントネガティブ突然変異体に特異的に結合する抗体若しくは抗体結合フラグメントをコードする核酸を含む、又は、
（ii）桿体細胞の増殖を阻害するタンパク質、好ましくはトキシン、プロドラッグ変換酵素、例えばチミジンキナーゼ、細胞周期阻害剤、例えば網膜芽細胞腫タンパク質（pRB）、p53、p21CIP1、p27KIP1、及びp57KIP2をコードする核酸を含み、その細胞周期阻害剤のドミナントネガティブ突然変異体をコードするmRNAを含み、及び／又はその細胞周期阻害剤のドミナントネガティブ突然変異体をコードする核酸を含む。
本発明の第7の態様の1つの実施形態においては、前記ポリヌクレオチドは、
（i）ポリアデニル化シグナル（PAS）、
（ii）1又は2つの末端逆位反復（ITR）配列、及び、
（iii）感染性ウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニア／ポックスウイルスベクター、又はヘルペスウイルスベクター、特に単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクターを形成するために必要なウイルスのヌクレオチド配列、
からなる群から選択される1つ以上のヌクレオチド配列エレメントを更に含む。
本発明の第7の態様の1つの実施形態においては、前記ポリアデニル化シグナルは、シミアンウイルス40のPASを含む。
本発明の第7の態様の1つの実施形態においては、前記ITR配列は、アデノ随伴ウイルス（AAV）のITRである。
本発明の第7の態様の1つの実施形態においては、前記AAVは、AVV血清型2、AVV血清型5、AVV血清型8、又はAVV血清型9である。
本発明の第8の態様は、本発明の第7の態様のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターに関する。
本発明の第8の態様の1つの実施形態においては、前記ウイルスは、AAV2、AAV5、AAV8、AVV9、又はそれらの変異体からなる群から選択される。
ヒト桿体光受容器特異的プロモーターエレメント（hRPSPE）若しくはその変異体と導入遺伝子（例えば、CNGB1）に作動可能に連結されたコアプロモーター（CP）とを含む本発明のポリヌクレオチド、又は導入遺伝子（例えば、CNGB1）に作動可能に連結されたヒトロドプシンプロモーターを含むポリヌクレオチドは、遺伝子療法的アプローチ及び／又は遺伝子矯正療法において使用され得る。そのような療法においては、該ポリヌクレオチドを細胞内に導入することで、発現が増強され、欠陥遺伝子が置き換えられ、及び／又は欠陥遺伝子の発現が阻害される。
したがって、本発明の第9の態様は、網膜変性の治療を必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、前記被験体に、治療的有効量の本発明の第7の態様によるポリヌクレオチド又は本発明の第8の態様によるウイルスベクターを投与することを含む、方法に関する。
本発明の第9の態様の1つの実施形態においては、前記ポリヌクレオチド又はウイルスベクターは、配列番号43に示される核酸配列を含む。
本発明の第10の態様は、網膜色素変性症の治療を必要とする被験体において網膜色素変性症を治療する方法であって、前記被験体に、治療的有効量の本発明の第7の態様によるポリヌクレオチド又は本発明の第8の態様によるウイルスベクターを投与することを含む、方法に関する。
本発明の第10の態様の1つの実施形態においては、前記ポリヌクレオチド又はウイルスベクターは、配列番号43に示される核酸配列を含む。
本発明の第11の態様は、網膜変性の治療を必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、前記網膜変性が前記被験体の網膜細胞におけるCNGB1の欠陥又は不存在を特徴とし、前記被験体に、配列番号43に示される核酸配列を含むウイルスベクターを治療的有効量、投与することを含む、方法に関する。
本発明の第11の態様の1つの実施形態においては、前記網膜変性は、CNGB1連鎖性網膜色素変性症又は網膜色素変性症45型（RP45）である。
本発明の第12の態様は、CNGB1連鎖性網膜色素変性症又は網膜色素変性症45型（RP45）の治療を必要とする被験体においてCNGB1連鎖性網膜色素変性症又は網膜色素変性症45型（RP45）を治療する方法であって、前記被験体に、配列番号43に示される核酸配列を含むウイルスベクターを治療的有効量、網膜下投与することを含む、方法に関する。
本発明の第13の態様は、
a）配列番号1又はその変異体による核酸配列を含むヒト桿体光受容器特異的プロモーターエレメント（hRPSPE）と、コアプロモーター（CP）とを含むプロモーターと、
b）a）のプロモーターに作動可能に連結されたヒト桿体の環状ヌクレオチド依存性チャネルβサブユニット（hCNGB1）をコードする導入遺伝子と、
をこの順序で含むポリヌクレオチドであって、
前記配列番号1の変異体は、配列番号1のヌクレオチド位置6〜位置13、位置32〜位置40、位置70〜位置83、及び位置87〜位置94の範囲外に1つ以上の核酸置換を含む、ポリヌクレオチドに関する。
本発明の第14の態様は、
a）配列番号1又はその変異体による核酸配列を含むヒト桿体光受容器特異的プロモーターエレメント（hRPSPE）と、コアプロモーター（CP）とを含むプロモーターと、
b）a）のプロモーターに作動可能に連結されたヒト桿体の環状ヌクレオチド依存性チャネルβサブユニット（hCNGB1）をコードする導入遺伝子と、
をこの順序で含むポリヌクレオチドであって、前記配列番号1の変異体が配列番号1のヌクレオチド位置6〜位置13、位置32〜位置40、位置70〜位置83、及び位置87〜位置94の範囲外に1つ以上の核酸置換を含む、ポリヌクレオチドと、
薬学的に許容可能な担体と、
を含む医薬組成物に関する。
本発明の第15の態様は、配列番号43に示される核酸配列を含むウイルスベクターと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物に関する。
表1：本発明の選択配列の表



実施例1：核酸ベクター
この例示的な実施形態においては、rAAV.hCNGB1ベクターは、桿体光受容器の環状ヌクレオチド依存性（CNG）チャネルのβサブユニットをコードするヒトCNGB1遺伝子のcDNAを有するハイブリッド型のAAVベースのベクターである。hCNGB1のcDNAの発現は、桿体特異的ロドプシンプロモーター（hRHO）の制御下にあり、SV40 pA配列を使用して増強される。発現カセットは、AAV血清型2の末端逆位反復配列（ITR）に隣接しており、組み換えゲノムは、AAV血清型8のカプシド内にパッケージングされる。該発現カセットは、以下のエレメントを有する：
ヒトロドプシン遺伝子のプロモーター：0.194 Kb
桿体光受容器のcGMPホスホジエステラーゼのヒトCNGB1aサブユニットのcDNA：3.74 Kb
シミアンウイルス40（SV40）のポリアデニル化シグナル：0.23 Kb
AAV血清型2の末端逆位反復配列（ITR）：0.13 Kb。
rAAV.hRHO194.hCNGB1ベクターのゲノムの構造は、図1に示されている。
実施例2：pGL2.0-hRHO194-hCNGB1a-SV40シスベクタープラスミド
1つの例示的な実施形態においては、配列番号7に示されるヌクレオチド配列を有するpGL2.0-hRHO194-hCNGB1a-SV40シスベクタープラスミドであって、194塩基対の桿体光受容器特異的ヒトロドプシン（hRHO）プロモーターと、全長（3738塩基対）のヒトCNGB1のcDNAとを含む発現カセットを含む、ベクタープラスミドを使用する。該発現カセットはまた、227塩基対のシミアンウイルス40のポリアデニル化シグナル（SV40 pA）を含む。5591塩基対のベクター骨格は、L-ITRから1943塩基対に位置し、R-ITRから2853塩基対に位置し、pUC18のoriから2024塩基対に位置するカナマイシン耐性（KanR）を有する。rAAV.hCNGB1ベクターは、上記シスベクタープラスミドと、rep配列及びcap配列及びアデノウイルス遺伝子をコードする1つ以上のトランスのヘルパープラスミドとのヒト胎児腎293T細胞（HEK293T）における一過性の同時トランスフェクションを使用して作製される。rAAV.hRHO194.hCNGB1を、標準的な精製法、例えば塩化セシウム勾配超遠心分離、イオン交換クロマトグラフィー、及び／又はタンジェンシャルフロー濾過を使用して培養培地及び／又は細胞溶解物から回収する。得られたrAAV.hRHO194.hCNGB1ベクター懸濁液を、次いで滅菌ろ過し、充填し、製剤として貯蔵する。
実施例3：hRHO194プロモーターの活性及び特異性
新規のhRHO194プロモーターの活性及び特異性を検証するために、本発明者らは、hCNGB1のcDNAの代わりにeGFPのcDNAを含む型のAAVシスベクターを構築した。得られたpGL2.0-hRHO194-eGFP-SV40シスベクタープラスミドのマップは、図2に示されている。rAAV.hRHO194.eGFPベクターを4週齢の野生型マウスの網膜下腔内に送達することで、注射の4週間後に桿体光受容器中にのみeGFPの強力な発現が得られ（図3A）、それによりこのプロモーターの網膜細胞型特異性が確認された。代表的な結果については、図3A及び図3Bを参照のこと。rAAV.hRHO194.eGFPベクター処置により、処置された眼において強力なeGFPタンパク質発現が得られ、それは桿体光受容器中のみでの本来のeGFP蛍光によって反映される。
実施例4：rAAV.hRHO194.hCNGB1により与えられた生物学的活性及び導入遺伝子発現
生物学的活性及び導入遺伝子発現を検証するために、本発明者らは、AAV.hRHO194.hCNGB1ベクターを、4週齢のCNGB1（-/-）マウスの網膜下腔内に送達した。送達手順は、Koch et al., Gene therapy restores vision and delays degeneration in the CNGB1(-/-) mouse model of retinitis pigmentosa. Hum Mol Genet. 2012;21(20):4486-96. PubMed PMID: 22802073に記載される手順と同様であった。マウスは、処置された眼（TE）において網膜下注射を受けたが、他方の未処置の眼（UE）は、コントロールとしての役割を果たした。ベクター効率を、注射4ヶ月後に客観的な機能的in vivoアッセイである網膜電図（ERG）によって評価した（図4A及び図4B）。CNGB1(-/-)マウスは、通常の桿体光受容器機能を欠いている。桿体に次いで、罹患していない錐体光受容器も変性して、疾患の後期に錐体機能の喪失が生ずる。したがって、桿体機能及び錐体機能について特異的に試験するERGプロトコルは、CNGB1機能のための間接的な尺度として、そしてrAAV hRHO194.hCNGB1ベクターの生物学的活性（BAA）の評価のために適している。
実施例5：BAAの測定のためのin vivoでの光干渉断層撮影（OTC）
もう1つの一連の実験において、BAAを、in vivoでの光干渉断層撮影（OCT）イメージングに続いて光受容器の層厚を定量化することによって測定した。このために、マウスは、処置された眼（TE）において網膜下注射を受けたが、他方の未処置の眼（UE）は、コントロールとしての役割を果たした。光受容器の層厚の測定は、注射4ヶ月後にOCTによって実施した（図5A〜図5C）。CNGB1(-/-)マウスの桿体光受容器は、時間の経過と共に変性し、こうして光受容器細胞層の薄層化が生ずる（図5B及び図5C）。したがって、rAAV.hRHO194.hCNGB1ベクターの生物学的活性（BAA）は、処置されたCNGB1(-/-)マウスにおける光受容器の層厚をOCTを用いて測定することによって間接的に計測することができる。rAAV.hRHO194.hCNGB1ベクター処置により、処置された眼において明らかな治療効果が得られ、それは光受容器の層厚の保存によって反映される。特に、光受容器の層厚の45%を上回る増大が観察された（図5C）。
実施例6：Cngb1-/-マウスにおけるin vivoでのCNGB1遺伝子の増強
Cngb1-/-マウスを、1×1010個のウイルスゲノム（1 e 10 vgs）のAAV8-hRHO194-hCNGB1-SV40又はAAV5-hRHO194-hCNGB1-SV40で4週齢目に網膜下で処置した。構造的結果の尺度は、注射の1ヶ月後及び3ヶ月後のSD-OCT、組織学、並びに免疫組織化学を含んだ。
一般的なベクター設計は、図7に示されている。1 μl中の1 e 10の総ウイルスゲノムを、4週齢のCngb1-/-マウス（生後4週間、PW4）において網膜下で注射した。
AAV8-hRHO194-hCNGB1-SV40遺伝子の増強は、Cngb1-/-マウスにおける網膜下注射後に桿体機能の回復をもたらすことが分かった。効力は、処置後8ヶ月まで持続することが分かった。暗順応したERG b波の振幅は、処置されたマウスにおいて大幅に改善されることが分かった（図8A及び図8B）。9ヶ月（処置されたマウスにおける処置8ヶ月後）での桿体特異的刺激Cngb1-/-での暗所視網膜電図（ERG）は、図8Aに示されている。処置前の野生型マウス及びCngb1-/-マウスのERGにより、ERG b波が注射の時点ではCngb1-/-マウスには見られないことが示された（図8B）。桿体外節におけるCNGB1チャネルの発現は、回復することが分かった（図9A及び図9B）。ヒトCNGB1aのアミノ酸1078〜1168を認識するウサギポリクローナル抗CNGB1抗体（Sigma-Aldrich社）を、導入遺伝子発現アッセイのために使用した。AAV8-hRHO194-hCNGB1-SV40で処置されたCngb1-/-マウス（処置8ヶ月後、図9A）、及び未処置のCngb1-/-マウス（図9B）において、9ヶ月目に免疫組織化学を実施し、それにより、処置されたCngb1-/-マウスにおいてCNGB1チャネルの発現の回復が示された。OCT分析により、網膜変性における大幅な遅延が明らかとなった（図10A〜図10C）。一般的な注射スケジュールは、図10Aに示されている。AAV8-hRHO194-hCNGB1-SV40で処置されたCngb1-/-マウス（処置8ヶ月後、図10B）、及び未処置のCngb1-/-マウス（図10C）において、9ヶ月目にin vivoでの光干渉断層撮影（OCT）画像を収集した。図10に示されるように、9ヶ月目に、処置されたCngb1-/-マウスが、未処置のCngb1-/-マウスと比較してより厚い光受容器層を有することが判明した。
AAV5-hRHO194-hCNGB1-SV40遺伝子の増強は、Cngb1-/-マウスにおいて網膜下注射の2ヶ月後まで桿体機能の回復をもたらすことが分かった。暗順応したERG b波の振幅は、処置されたマウスにおいて有意に改善されることが分かった（図11A〜図11E）。暗所視ERGを、処置されたCngb1-/-マウス及び未処置のCngb1-/-マウスにおいて3月齢目（処置されたマウスにおいては網膜下処置2ヶ月後）に測定し、結果は図11Aに示されている。処置されたCngb1-/-マウス及び未処置のCngb1-/-マウス（n=8）において3月齢目（処置されたマウスにおいては網膜下処置2ヶ月後）に測定された-0.5 logの光刺激（cd/m2）に応答するb波の振幅が、図11Bに示されている。OCT分析により、網膜変性における有意な遅延が明らかとなった。AAV5-hRHO194-hCNGB1-SV40で処置されたCngb1-/-マウス（処置2ヶ月後、図11C）、及び未処置のCngb1-/-マウス（図11D）において、3ヶ月目にin vivoでの光干渉断層撮影（OCT）画像を収集した。光受容器の層厚の測定により、処置されたCngb1-/-マウスにおける3ヶ月目（処置後2ヶ月）の網膜変性において、野生型のCngb1-/-マウスと比較して有意な遅延が示された（n=6、図11E）。
実施例7：突然変異イヌの研究設計
Cngb1-/-イヌは、欠損した非機能性タンパク質をもたらし、桿体機能の喪失及び網膜変性を生ずるエキソン26における突然変異を有する。3匹のCngb1-/-イヌを、3月齢目に両眼に網膜下でAAV5-hRHO194-hCNGB1aにより処置した。各動物について、眼1を、5 e 11 vgsの用量で処置し（2×100 μlのブレブを目指す、「低用量」）、眼2を、1 e 12 vgsの用量で処置した（2×100 μlのブレブを目指す、「高用量」）。構造的結果の尺度は、注射の1ヶ月後及び3ヶ月後のSC-OCT、組織学、並びに免疫組織化学を含んだ。機能的結果の尺度は、注射1ヶ月後及び3ヶ月後での視覚検査及びERGを含んだ。
実施例8：突然変異イヌの研究結果
AAV5-hRHO194-hCNGB1a-SV40遺伝子の増強は、Cngb1-/-イヌにおいて網膜下注射の1ヶ月後まで桿体機能の回復をもたらすことが分かった。
暗順応したERG波形は、評価された両方の用量で処置後に大幅に改善されることが分かった。両眼に同等の注射を行った。桿体特異的刺激（図12A）及びフリッカー応答（図12B）を使用して、未処置のイヌと比較して、処置されたイヌの両眼において明らかなERGのレスキューが観察された。より高い用量で処置された眼において、より大きなERG振幅が観察された。
視覚検査により、処置されたイヌが、4択の視覚検査装置において桿体媒介視覚を有し、成績が改善することが判明した。図13A及び図13Bは、注射1ヶ月後の処置されたイヌ及び未処置のイヌの視覚検査の結果を示す。4択の視覚検査装置を使用した。未処置のCngb1-/-イヌは、この齢で通常の錐体視覚を有するが、桿体媒介視覚を欠くことが判明した。未処置のCngb1-/-イヌは、より低い光レベル（例えば、5.7 e -2 cd/m2）で盲目であり、正しい出口の選択がより少なく、試験装置から出るのにより長くかかる。両方の処置群（高用量及び低用量）は、最も低い照明レベルでの正しい出口の選択（図13A）及び出口までの時間（図13B）における有意な成績の改善により示されるように、桿体視覚が回復することが分かった。
高用量群における平均のERG a波及びb波の振幅は、低用量群と比較してより高いことが分かった。処置された眼におけるa波及びb波の振幅は、野生型のレベルの約80%であることが分かった。図14A及び図14Bは、各処置群及び未処置群における注射1ヶ月後のERGの振幅測定を示している。未処置のコントロールと比較して、両方の処置群についてa波の振幅における非常に有意な増加が観察された。処置された眼における応答閾値の改善は、1.5 log単位より大きいことが判明した（図14A）。高用量群の全ての段階と、低用量群についての2番目及び3番目に強い刺激を除く全ての段階とで、未処置のコントロールと比較して、b波の振幅の有意性の高い増加が見られた。処置された眼における応答閾値の改善は、2 log単位より大きいことが判明した（図14B）。
図1：
Human CNGB1 ヒトCNGB1

図2：
Promoter プロモーター
pGL2.0-hRHO194-hCNGB1a-SV40MAP pGL2.0-hRHO194-hCNGB1a-SV40のマップ
polyA ポリA

図4A：
ERG amplitude ERGの振幅
untreated eye 未処置の眼
treated eye 処置された眼

図4B：
ERG b-wave amplitude ERG b波の振幅
wildtype 野生型
Cngb1 KO treated 処置されたCngb1 KO
Cngb1 KO untreated 未処置のCngb1 KO

図5A：
Cngb1 KO treated 処置されたCngb1 KO

図5B：
Cngb1 KO untreated 未処置のCngb1 KO

図5C：
photoreceptor layer thickness 光受容器の層厚
wildtype 野生型
Cngb1 KO treated 処置されたCngb1 KO
Cngb1 KO untreated 未処置のCngb1 KO

図8A：
Increasing Light Intensity 光強度の増加方向
light intensity in log (cd s m-2) log（cd s m-2）での光強度
Cngb1 KO treated 処置されたCngb1 KO
Cngb1 KO untreated 未処置のCngb1 KO

図8B：
ERG Pretreatment 処置前のERG

図9A：
Cngb1 KO treated 処置されたCngb1 KO

図9B：
Cngb1 KO untreated 未処置のCngb1 KO

図10A：
Photoreceptor layer thickness 光受容器の層厚
birth 出生
Injection: 4 weeks 注射：4週間目
Imaging: 9 months イメージング：9ヶ月目

図10B：
Cngb1 KO treated 処置されたCngb1 KO

図10C：
Cngb1 KO untreated 未処置のCngb1 KO

図11A：
Increasing Light Intensity 光強度の増加方向
light intensity in log (cd s m-2) log（cd s m-2）での光強度
Cngb1 KO treated 処置されたCngb1 KO
Cngb1 KO untreated 未処置のCngb1 KO

図11B：
b-wave amplitude in response to a light stimulus of -0.5 log (cd s/m2) -0.5 log（cd s/m2）の光刺激に応答するb波の振幅
ERG b-wave amplitude ERG b波の振幅
Cngb1 KO Treated 処置されたCngb1 KO
Cngb1 KO Untreated 未処置のCngb1 KO

図11C：
Cngb1 KO treated 処置されたCngb1 KO

図11D：
Cngb1 KO untreated 未処置のCngb1 KO

図11E：
Photoreceptor Layer Thickness 光受容器の層厚
Cngb1 KO Treated 処置されたCngb1 KO
Cngb1 KO Untreated 未処置のCngb1 KO

図12A：
Dog イヌ
Comparable injection both eyes 両眼に同等の注射
Low Dose 低用量
High Dose 高用量
Cngb1-/- dog Cngb1-/-イヌ
Untreated 未処置
Increasing Light Intensity 光強度の増加方向

図12B：
Low Dose 低用量
High Dose 高用量
Cngb1-/- dog Cngb1-/-イヌ
Untreated 未処置
Flicker Response フリッカー応答
Scale 尺度
x-axis = mSec x軸＝ミリ秒
y-axis = μVolts y軸＝マイクロボルト

図13A：
Vision Testing - Correct Exit Choice 視覚検査−正しい出口の選択
Correct Exit Choice 正しい出口の選択
High Dose 高用量
Low Dose 低用量
Untreated 未処置
Lighting Level 照明レベル

図13B：
Vision Testing - Time to Exit 視覚検査−出口までの時間
Time to Exit (sec) 出口までの時間（秒）
High Dose 高用量
Low Dose 低用量
Untreated 未処置
Lighting Level 照明レベル

図14A：
A-wave Mean (SD) Amplitude - 1 month PI a波の平均（SD）振幅−注射1ヶ月後
MicroVolts マイクロボルト
Mean Untreated 未処置での平均
Mean Low 低用量での平均
Mean High 高用量での平均
Mean Wild-Type 野生型での平均
Luminance 輝度

図14B：
B-wave Amp Mean (SD) - 1 month PI b波の振幅の平均（SD）−注射1ヶ月後
MicroVolts マイクロボルト
Mean Untreated 未処置での平均
Mean Low 低用量での平均
Mean High 高用量での平均
Mean Wild-Type 野生型での平均
Luminance 輝度

Claims (44)

  1. a）配列番号1又はその変異体による核酸配列を含む、実質的に該核酸配列からなる、又は該核酸配列からなるヒト桿体光受容器特異的プロモーターエレメント（hRPSPE）と、コアプロモーター（CP）とを含むプロモーターと、
    b）a）のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つの導入遺伝子（TG）と、
    をこの順序で含むポリヌクレオチドであって、
    前記配列番号1の変異体は、配列番号1のヌクレオチド位置6〜位置13、位置32〜位置40、位置70〜位置83、及び位置87〜位置94の範囲外に1つ以上の核酸置換を含む、ポリヌクレオチド。
  2. 前記hRPSPEの5’末端は、配列番号2又はその変異体の1から160までの核酸位置にあり、3'末端は、配列番号2又はその変異体の290から310までの核酸位置にある、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
  3. 前記CPは、TATAボックス及び／又はイニシエーター（Inr）を含む、請求項1又は2に記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記プロモーターの5'末端は、配列番号2又はその変異体の1から160までの核酸位置にあり、3'末端は、配列番号2又はその変異体の340から350までの核酸位置にある、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  5. 前記導入遺伝子は、桿体の生理学的機能を維持又は改善するタンパク質をコードする核酸を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  6. 前記導入遺伝子は、
    （i）ヒト桿体の環状ヌクレオチド依存性チャネルβサブユニット（hCNGB1）、ABCA4、AIPL1、BEST1、CACNA1F、CLN3、CLRN1、CNGA1、CEP290、CRB1、CRB2、CRX、GPR98、GUCA1A、GUCA1B、MYO7A、NRL、PDE6A、PDE6B、PRPH2、PROM1、RHO、ROM1、RP1、RP2、RPE65、RPGR、SAG、USH1C、USH1G、USH2A若しくはその機能的断片若しくは変異体をコードする核酸、それらのドミナントネガティブ突然変異体をコードするmRNAを標的とするmiRNA若しくはshRNAをコードする核酸、及び／又はそれらのドミナントネガティブ突然変異体に特異的に結合する抗体若しくは抗体結合フラグメントをコードする核酸を含む、又は、
    （ii）桿体細胞の増殖を阻害するタンパク質、好ましくはトキシン、プロドラッグ変換酵素、例えばチミジンキナーゼ、細胞周期阻害剤、例えば網膜芽細胞腫タンパク質（pRB）、p53、p21CIP1、p27KIP1、及びp57KIP2をコードする核酸を含み、その細胞周期阻害剤のドミナントネガティブ突然変異体をコードするmRNAを含み、及び／又はその細胞周期阻害剤のドミナントネガティブ突然変異体をコードする核酸を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  7. 前記hCNGB1は、配列番号3、配列番号40、若しくは配列番号41、又はそれらの変異体によるアミノ酸配列を含む、請求項6に記載のポリヌクレオチド。
  8. （i）ポリアデニル化シグナル（PAS）、及び／又は、
    （ii）1又は2つの末端逆位反復（ITR）配列、及び／又は、
    （iii）感染性ウイルスベクター、又はアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニア／ポックスウイルスベクター、若しくはヘルペスウイルスベクター、又は単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクターを形成するために必要なウイルスのヌクレオチド配列、
    からなる群から選択される1つ以上の更なるヌクレオチド配列エレメントを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  9. 前記ポリアデニル化シグナルは、シミアンウイルス40のPASを含む、実質的にシミアンウイルス40のPASからなる、又はシミアンウイルス40のPASからなる、請求項8に記載のポリヌクレオチド。
  10. 前記ポリアデニル化シグナルは、配列番号4又はその機能的変異体による核酸を含む、実質的に該核酸からなる、又は該核酸からなる、請求項9に記載のポリヌクレオチド。
  11. 前記ITR配列は、アデノ随伴ウイルス（AAV）のITRである、請求項8に記載のポリヌクレオチド。
  12. 前記AAVは、AVV血清型2、AVV血清型5、AVV血清型8、又はAVV血清型9である、請求項11に記載のポリヌクレオチド。
  13. 前記プロモーター及び前記導入遺伝子は、それらの5'末端でL-ITRと隣接しており、それらの3'末端でR-ITRと隣接している、請求項11に記載のポリヌクレオチド。
  14. 前記L-ITRは、配列番号5若しくはその変異体による配列を含む、実質的に該配列からなる、若しくは該配列からなる、及び／又は前記R-ITRは、配列番号6若しくはその変異体による配列を含む、実質的に該配列からなる、若しくは該配列からなる、請求項13に記載のポリヌクレオチド。
  15. 前記ポリヌクレオチドの全長は、5200塩基以下、又は5100塩基以下、又は5000塩基以下である、請求項1〜14のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  16. 請求項1〜15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミド。
  17. 配列番号7、配列番号42〜配列番号44又はそれらの変異体による核酸配列を含む、請求項16に記載のプラスミド。
  18. 請求項1〜15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むウイルスベクター。
  19. 前記ウイルスは、AAV2、AAV5、AAV8、AVV9、又はそれらの変異体からなる群から選択される、請求項18に記載のウイルスベクター。
  20. 医薬として使用するための、請求項1〜15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項16若しくは17に記載のプラスミド、及び／又は請求項18若しくは19に記載のウイルスベクター。
  21. 請求項1〜15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項16若しくは17に記載のプラスミド、及び／又は請求項18若しくは19に記載のウイルスベクターと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
  22. 網膜の疾患、特に網膜変性の療法において使用するための、請求項1〜15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項16若しくは17に記載のプラスミド、及び／又は請求項18若しくは19に記載のウイルスベクター。
  23. 投与経路は、眼内、眼球内、硝子体内、又は網膜下から選択される、請求項22に記載の使用のためのポリヌクレオチド、プラスミド、及び／又はウイルスベクター。
  24. 前記網膜変性は、遺伝子の突然変異、置換、及び／又は欠失と関連している、請求項22に記載の使用のためのポリヌクレオチド、プラスミド、又はウイルスベクター。
  25. 前記網膜変性は、夜盲症、盲目、網膜変性、網膜ジストロフィー、及び網膜色素変性症からなる群から選択される、請求項22に記載の使用のためのポリヌクレオチド、プラスミド、又はウイルスベクター。
  26. 前記網膜色素変性症は、CNGB1連鎖性網膜色素変性症又は網膜色素変性症45型（RP45）である、請求項25に記載の使用のためのポリヌクレオチド、プラスミド、又はウイルスベクター。
  27. a）配列番号9又はその変異体による核酸配列を含むヒトロドプシンプロモーターと、
    b）a）のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つの導入遺伝子（TG）と、
    をこの順序で含むポリヌクレオチド。
  28. 前記導入遺伝子は、桿体の生理学的機能を維持又は改善するタンパク質をコードする核酸を含む、請求項27に記載のポリヌクレオチド。
  29. 前記導入遺伝子は、
    （i）ヒト桿体の環状ヌクレオチド依存性チャネルβサブユニット（hCNGB1）、ABCA4、AIPL1、BEST1、CACNA1F、CLN3、CLRN1、CNGA1、CEP290、CRB1、CRB2、CRX、GPR98、GUCA1A、GUCA1B、MYO7A、NRL、PDE6A、PDE6B、PRPH2、PROM1、RHO、ROM1、RP1、RP2、RPE65、RPGR、SAG、USH1C、USH1G、USH2A若しくはその機能的断片若しくは変異体をコードする核酸、それらのドミナントネガティブ突然変異体をコードするmRNAを標的とするmiRNA若しくはshRNAをコードする核酸、及び／又はそれらのドミナントネガティブ突然変異体に特異的に結合する抗体若しくは抗体結合フラグメントをコードする核酸を含む、又は、
    （ii）桿体細胞の増殖を阻害するタンパク質又はトキシン、プロドラッグ変換酵素又はチミジンキナーゼ、細胞周期阻害剤又は網膜芽細胞腫タンパク質（pRB）、p53、p21CIP1、p27KIP1、及びp57KIP2をコードする核酸を含み、その細胞周期阻害剤のドミナントネガティブ突然変異体をコードするmRNAを含み、及び／又はその細胞周期阻害剤のドミナントネガティブ突然変異体をコードする核酸を含む、請求項27又は28に記載のポリヌクレオチド。
  30. （i）ポリアデニル化シグナル（PAS）、
    （ii）1又は2つの末端逆位反復（ITR）配列、及び、
    （iii）感染性ウイルスベクター、又はアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニア／ポックスウイルスベクター、若しくははヘルペスウイルスベクター、又は単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクターを形成するために必要なウイルスのヌクレオチド配列、
    からなる群から選択される1つ以上の更なるヌクレオチド配列エレメントを含む、請求項27〜29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  31. 前記ポリアデニル化シグナルは、シミアンウイルス40のPASを含む、請求項30に記載のポリヌクレオチド。
  32. 前記ITR配列は、アデノ随伴ウイルス（AAV）のITRである、請求項30に記載のポリヌクレオチド。
  33. 前記AAVは、AVV血清型2、AVV血清型5、AVV血清型8、又はAVV血清型9である、請求項32に記載のポリヌクレオチド。
  34. 請求項27〜33のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むウイルスベクター。
  35. 前記ウイルスは、AAV2、AAV5、AAV8、AVV9、又はそれらの変異体からなる群から選択される、請求項34に記載のウイルスベクター。
  36. 網膜変性の治療を必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、前記被験体に、治療的有効量の請求項27〜33のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項34若しくは35に記載のウイルスベクターを投与することを含む、方法。
  37. 網膜色素変性症の治療を必要とする被験体において網膜色素変性症を治療する方法であって、前記被験体に、治療的有効量の請求項27〜33のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項34若しくは35に記載のウイルスベクターを投与することを含む、方法。
  38. 前記ポリヌクレオチド又はウイルスベクターは、配列番号43に示される核酸配列を含む、請求項36又は37に記載の方法。
  39. 網膜変性の治療を必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、前記網膜変性が前記被験体の網膜細胞におけるCNGB1の欠陥又は不存在を特徴とし、前記被験体に、配列番号43に示される核酸配列を含むウイルスベクターを治療的有効量、投与することを含む、方法。
  40. 前記網膜変性は、CNGB1連鎖性網膜色素変性症又は網膜色素変性症45型（RP45）である、請求項39に記載の方法。
  41. CNGB1連鎖性網膜色素変性症又は網膜色素変性症45型（RP45）の治療を必要とする被験体においてCNGB1連鎖性網膜色素変性症又は網膜色素変性症45型（RP45）を治療する方法であって、前記被験体に、配列番号43に示される核酸配列を含むウイルスベクターを治療的有効量、網膜下投与することを含む、方法。
  42. a）配列番号1又はその変異体による核酸配列を含むヒト桿体光受容器特異的プロモーターエレメント（hRPSPE）と、コアプロモーター（CP）とを含むプロモーターと、
    b）a）のプロモーターに作動可能に連結されたヒト桿体の環状ヌクレオチド依存性チャネルβサブユニット（hCNGB1）をコードする導入遺伝子と、
    をこの順序で含むポリヌクレオチドであって、
    前記配列番号1の変異体は、配列番号1のヌクレオチド位置6〜位置13、位置32〜位置40、位置70〜位置83、及び位置87〜位置94の範囲外に1つ以上の核酸置換を含む、ポリヌクレオチド。
  43. a）配列番号1又はその変異体による核酸配列を含むヒト桿体光受容器特異的プロモーターエレメント（hRPSPE）と、コアプロモーター（CP）とを含むプロモーターと、
    b）a）のプロモーターに作動可能に連結されたヒト桿体の環状ヌクレオチド依存性チャネルβサブユニット（hCNGB1）をコードする導入遺伝子と、
    をこの順序で含むポリヌクレオチドであって、前記配列番号1の変異体が配列番号1のヌクレオチド位置6〜位置13、位置32〜位置40、位置70〜位置83、及び位置87〜位置94の範囲外に1つ以上の核酸置換を含む、ポリヌクレオチドと、
    薬学的に許容可能な担体と、
    を含む医薬組成物。
  44. 配列番号43に示される核酸配列を含むウイルスベクターと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
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