JP2020509762A - 抗ｐａｒ２抗体及びその使用 - Google Patents

抗ｐａｒ２抗体及びその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、ＰＡＲ２に結合することが可能な抗体及び抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＲ２抗体又はその抗原結合断片は、ｐＨ依存的にＰＡＲ２に結合する。本開示はさらに、抗体及び抗原結合断片を作製し、且つ使用するための方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１７年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／４７２，４６２号及び２０１８年３月２日に出願された米国仮特許出願第６２／６３７，７６６号の優先権の利益を主張する。前出の出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的手段により提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年３月８日に作成された前記ＡＳＣＩＩの複製は、１８４８０８１−０００２−０９３−ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは３５１，６６８バイトである。
慢性疼痛は、誰しもが発症する可能性があり、且つ患者、保健医療システム、及び経済に負担を課す病態である。米国では約１億人が慢性疼痛に罹患し、医療費並びに損失時間及び損失賃金の経済的コストを含む疼痛による保健医療のコストの毎年の増分は、５６００億ドルと６３５０億ドルの間であると推定される（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ，２０１１）。さらに、慢性疼痛患者の調査では、半数以上が自身の疼痛に関してほとんど又はまったく制御できていなかった（非特許文献１）。疼痛は、癌から糖尿病、関節炎まで様々な病態及び疾患によって引き起こされる可能性があり、侵害受容性、神経因性、及び混合型疼痛のカテゴリーに分類することができる。侵害受容性疼痛は、神経繊維の刺激（例えば、熱的、力学的、又は化学的刺激による）によって定義されるが、神経因性疼痛は、神経損傷、神経疾患、及び重要なこととして炎症などの多様な原因によって引き起こされる疼痛である。したがって、生物体が免疫細胞を動員し、傷害又は感染の部位に免疫性因子を放出するプロセスである炎症は、損傷修復及び疼痛の原因の両方の助けになるプロセスであり得る。
疼痛のための多くの治療は、炎症を阻害する。抗炎症性疼痛治療薬の２つの一般的な分類は、ステロイド性抗炎症剤及び非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）である。ステロイド性抗炎症剤は通常、炎症の産物であるプロスタグランジン及びロイコトリエンを抑制する。このような薬剤は信頼性があり且つ強力であるが、例えば、骨密度の低下、体重変動、免疫系抑制、及び成長／思春期異常を含む重篤な副作用のリスクを保有する（非特許文献２；非特許文献３）。ＮＳＡＩＤは、アラキドン酸からプロスタグランジンへの反応を触媒するシクロオキシゲナーゼ−１及び／又は２（ＣＯＸ−１及び／又はＣＯＸ−２）を阻害する。慢性疼痛及び炎症は長期の治療を必要とし、ＣＯＸ酵素の長期の阻害は、胃出血及び潰瘍などの胃腸管の問題を引き起こす場合がある。このような抗炎症疼痛治療に関連するリスクを考慮して、疼痛を治療するための代替のアプローチが必要とされている。
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、Ｎ末端細胞外ドメインとＣ末端細胞内ドメインが連結している７回膜貫通ドメインの共通の構造モチーフを共有する膜タンパク質のファミリーである（非特許文献４）。ＧＰＣＲは、光子、ホルモン、ケモカインなどの細胞外シグナルを感知し、細胞内Ｇタンパク質を活性化する。フリズルド、ロドプシン、セクレチン、アドヒージョン、及びプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）ファミリーなどのＧＰＣＲの多くのファミリーが存在する（非特許文献５；非特許文献６）。様々なＧＰＣＲファミリーが全体の構造的特徴を共有するが、それらは、異なる機能を呈し、様々なリガンドに結合し、且つ異なる機序によって活性化される。ＧＰＣＲのＰＡＲファミリーの活性化は、炎症及び侵害受容と関連している（非特許文献７）。
４種のＰＡＲ受容体が同定されている：ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、及びＰＡＲ４（非特許文献８；非特許文献７）。ＰＡＲ２活性化は炎症及び侵害受容を増強することが示されており、その阻害を抗炎症性疼痛治療のための魅力的な標的にしている。他のＧＰＣＲとは異なり、ＰＡＲは、繋ぎ止められた活性化リガンドとして機能するＮ末端配列を現わす細胞外ドメインのタンパク質切断によって活性化される。ＰＡＲ２は特に、トリプシン及びトリプターゼによって切断され、活性化される。
ＰＡＲ２発現は、血管付き組織、気道、骨芽細胞、心血管組織、角化細胞、外分泌腺、白血球、マスト細胞、腸管上皮、腎臓、神経細胞、膵臓、及び種々の平滑筋種において検出されている（上掲の非特許文献８）。ＰＡＲ２はまた、神経性炎症、侵害受容及び疼痛の伝達と関連する種々の疾患又は病態と関係づけられている。ＰＡＲ２は、いくつかの宿主及び病原体由来のセリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン、マスト細胞トリプターゼ、組織カリクレイン、又は血液凝固カスケードＴＦ−ＦＶＩＩａ及びＦＶａ−ＦＸａのメンバー）によって活性化され得る。
モノクローナル抗体は、種々の治療的適用に有用であることが示されており、現在では多くの抗体治療薬が上市されている（非特許文献９；非特許文献１０）。血流の循環における抗体の最も一般的な種類は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。治療目的のＩｇＧ抗体の有用性は、その標的に対する抗体の特異性、標的へのその結合の強度、並びに抗体を生成できる効率性の程度及び抗体が血清からなくなる速さ（抗体の血清半減期）を含むいくつかの要因に依存する。抗体の血清半減期は、一般的に、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインに結合するＦｃＲｎ（新生児型Ｆｃ受容体）によって調節される。インビボでは、ＩｇＧは液相ピノサイトーシスによって非特異的に取り入れられると考えられる（非特許文献１１）。エンドソーム内でＩｇＧがＦｃＲｎに結合すると、ＩｇＧをリサイクリングエンドソームへと識別し、リソソーム及び分解から離れて細胞表面へと戻る。ＩｇＧのリサイクリング率は、４４％のわずかな異化率になると推定され、抗体治療薬は依然として、投与後ほんの数日で枯渇し得る（非特許文献１２）。
炎症に関連する疼痛は慢性病態である場合が多い。治療用分子の投与量及び投与頻度を最小限にすることが望ましい。したがって、新規の抗炎症疼痛治療薬が必要とされている。標準的なモノクローナル抗体は魅力的な候補であるが、場合によっては、それらの血清半減期によって制限され得る。そのため、代替の治療が望ましい場合がある。
２００６ Ｖｏｉｃｅｓ ｏｆ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｐａｉｎ Ｓｕｒｖｅｙ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐａｉｎ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｉｒｖｉｎｇ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．２６（３）：３１３−３２９； Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｕｒｇ．２００７ Ａｕｇ；１５（８）：４５０−６０ Ｇｒａｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１２ Ａｕｇ；８（８）：６７０−６７３ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１２ Ｄｅｃ ２０；４９２（７４２９）：３８７−３９２； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌｓ．２０１５ Ｏｃｔ；３８（１０）：８３６−４２ Ｇｉｅｓｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ Ｓｉｇｎａｌ．２０１３；１１：８６ Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ．２００１ Ｊｕｎ；５３（２）：２４５−８２； Ｍａｇｇｏｎ，Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００７；１４（１８）：１９７８−８７； Ｂｒｅｋｋｅ ａｎｄ Ｓａｎｄｌｉｅ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２：５２−６２，２００３ Ｐｙｚｉｋ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５ Ｍａｙ １５；１９４（１０）：４５９５−６０３ Ｋｉｍ，Ｊｏｎｇｈａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２２．２（２００７）：１４６−１５５
本開示は、ＰＡＲ２に結合する抗体を提供する。本開示の抗体は、とりわけ、ＰＡＲ２媒介性シグナル伝達の阻害、並びにＰＡＲ２活性及び／若しくはＰＡＲ２シグナル伝達によるか又はそれに関連する疾患並びに障害の治療に有用である。
いくつかの実施形態では、本開示は、ｐＨ６．０よりｐＨ７．４でより高い親和性を有する、ＰＡＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ｐＨ６．０よりｐＨ７．４で少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００倍高い親和性を有してＰＡＲ２に結合する。いくつかの実施形態では、本開示は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、ＶＨは：ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号３の配列中に任意選択的に存在するＶＨ−ＣＤＲ１；ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号４の配列中に任意選択的に存在するＶＨ−ＣＤＲ２；及びｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号５の配列中に任意選択的に存在するＶＨ−ＣＤＲ３を含み；且つＶＬは：ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号８の配列中に任意選択的に存在するＶＬ−ＣＤＲ１；ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号９の配列中に任意選択的に存在するＶＬ−ＣＤＲ２；及びｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号１０の配列中に任意選択的に存在するＶＬ−ＣＤＲ３を含み；アミノ酸置換、欠失又は挿入は、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて７．４のｐＨで試験する場合、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬを有する抗体又は抗原結合断片と比較して、ヒトＰＡＲ２に対する抗体又はその抗原結合断片の結合親和性を１０００、８００、７００、５００、４００、３００、２００、１００、５０又は１０倍以下低減する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換、欠失又は挿入は、相同置換を含む。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号２の配列に存在するＣＤＲアミノ酸配列と比較して、ＶＨ ＣＤＲ中において１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以下のアミノ酸置換、挿入又は欠失を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号７の配列に存在するＣＤＲアミノ酸配列と比較して、ＶＬ ＣＤＲ中において１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以下のアミノ酸置換、挿入又は欠失を有する。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸置換、挿入又は欠失は、ヒスチジンによる１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の置換である。
いくつかの実施形態では、本開示は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、ＶＨは：ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１；ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するが、ヒスチジンが、配列番号４の１〜１７位（例えば、４位、５位、及び７〜１７位）に相当するアミノ酸位置のいずれか１つ以上で任意選択的に存在するＶＨ−ＣＤＲ２；及びｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を有するが、ヒスチジンが、配列番号５の１〜８位に相当するアミノ酸位置のいずれか１つ以上で任意選択的に存在するＶＨ−ＣＤＲ３を含み；且つＶＬは：ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１；ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２；及びｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するが、ヒスチジンが、配列番号１０の１〜１４位に相当するアミノ酸位置のいずれか１つ以上で任意選択的に存在するＶＬ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは：ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２、ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含み、且つＶＬは：ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２、ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、ＶＨは：ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２、ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含み、且つＶＬは：ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２、ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号４の５位、８位、１２位、１６位、及び１７位に相当するアミノ酸位置に存在し；且つヒスチジンは、配列番号５の２位及び３位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号４の５位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号４の７位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号４の８位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号４の１２位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号４の１５位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号４の１６位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号４の１７位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号４の５位及び８位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号４の５位、８位、１２位及び１６位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号４の５位、８位、１２位、１６位及び１７位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号５の２位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号５の３位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号５の２位及び３位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号１０の１位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号１０の５位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号１０の６位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号１０の１４位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２は、配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４、１０４、１１４、１２４、１３４、１４４、１５４、１６４、１７４、１８４、１９４、２０４、２１４、２２４、２３４、２４４、２５４、２６４、２７４、２８４、２９４、３０４、３１４、３２４、３３４、３４４、３５４、３６４、３７４、３８４、３９４、４０４、４１４、４２４、４３４、４４４、４５４、４６４、４７４、４８４、４９４、５０４、５１４、５２４、５３４、５４４、５５４、５６４、５７４、５８４、５９４、６０４、６１４、６２４、６３４、６４４、６５４、６６４、６７４、６８４、６９４、７０４、７１４、７２４、７３４、７４４、７５４、７６４、７７４、７８４、７９４、及び８１１〜８１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ３は、配列番号５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５、１０５、１１５、１２５、１３５、１４５、１５５、１６５、１７５、１８５、１９５、２０５、２１５、２２５、２３５、２４５、２５５、２６５、２７５、２８５、２９５、３０５、３１５、３２５、３３５、３４５、３５５、３６５、３７５、３８５、３９５、４０５、４１５、４２５、４３５、４４５、４５５、４６５、４７５、４８５、４９５、５０５、５１５、５２５、５３５、５４５、５５５、５６５、５７５、５８５、５９５、６０５、６１５、６２５、６３５、６４５、６５５、６６５、６７５、６８５、６９５、７０５、７１５、７２５、７３５、７４５、７５５、７６５、７７５、７８５、７９５、及び８１９〜８２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ３は、配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０及び８００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２は、配列番号１４に相当するアミノ酸配列を含み；ＶＨ−ＣＤＲ３は、配列番号１５に相当するアミノ酸配列を含み；且つＶＬ−ＣＤＲ３は、配列番号２０に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２は、配列番号８１１に相当するアミノ酸配列を含み；ＶＨ−ＣＤＲ３は、配列番号８１９に相当するアミノ酸配列を含み、且つＶＬ−ＣＤＲ３は、配列番号１０又は２０に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２は、配列番号８１４に相当するアミノ酸配列を含み；ＶＨ−ＣＤＲ３は、配列番号８２０に相当するアミノ酸配列を含み、且つＶＬ−ＣＤＲ３は、配列番号１０又は２０に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２は、配列番号８１６に相当するアミノ酸配列を含み；ＶＨ−ＣＤＲ３は、配列番号１５に相当するアミノ酸配列を含み、且つＶＬ−ＣＤＲ３は、配列番号１０又は２０に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２は、配列番号８１８に相当するアミノ酸配列を含み；ＶＨ−ＣＤＲ３は、配列番号１５に相当するアミノ酸配列を含み、且つＶＬ−ＣＤＲ３は、配列番号１０又は２０に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８０３〜８０６の各々と少なくとも９０％同一であるフレームワーク領域を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８０３〜８０６の各々と少なくとも９５％同一であるフレームワーク領域を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８０３〜８０６に相当するフレームワーク領域を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号８０７〜８１０の各々と少なくとも９０％同一であるフレームワーク領域を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号８０７〜８１０の各々と少なくとも９５％同一であるフレームワーク領域を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号８０７〜８１０に相当するフレームワーク領域を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２、１１２、１２２、１３２、１４２、１５２、１６２、１７２、１８２、１９２、２０２、２１２、２２２、２３２、２４２、２５２、２６２、２７２、２８２、２９２、３０２、３１２、３２２、３３２、３４２、３５２、３６２、３７２、３８２、３９２、４０２、４１２、４２２、４３２、４４２、４５２、４６２、４７２、４８２、４９２、５０２、５１２、５２２、５３２、５４２、５５２、５６２、５７２、５８２、５９２、６０２、６１２、６２２、６３２、６４２、６５２、６６２、６７２、６８２、６９２、７０２、７１２、７２２、７３２、７４２、７５２、７６２、７７２、７８２、及び７９２からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、１２７、１３７、１４７、１５７、１６７、１７７、１８７、１９７、２０７、２１７、２２７、２３７、２４７、２５７、２６７、２７７、２８７、２９７、３０７、３１７、３２７、３３７、３４７、３５７、３６７、３７７、３８７、３９７、４０７、４１７、４２７、４３７、４４７、４５７、４６７、４７７、４８７、４９７、５０７、５１７、５２７、５３７、５４７、５５７、５６７、５７７、５８７、５９７、６０７、６１７、６２７、６３７、６４７、６５７、６６７、６７７、６８７、６９７、７０７、７１７、７２７、７３７、７４７、７５７、７６７、７７７、７８７、及び７９７からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１２に相当するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号１７に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８２１に相当するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号７又は１７に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８２４に相当するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号７又は１７に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８２７に相当するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号７又は１７に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８３１に相当するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号７又は１７に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗原結合断片はｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗原結合断片はＦａｂ’である。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は
モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片はヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片はヒトのものである。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、１１１、１２１、１３１、１４１、１５１、１６１、１７１、１８１、１９１、２０１、２１１、２２１、２３１、２４１、２５１、２６１、２７１、２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４８１、４９１、５０１、５１１、５２１、５３１、５４１、５５１、５６１、５７１、５８１、５９１、６０１、６１１、６２１、６３１、６４１、６５１、６６１、６７１、６８１、６９１、７０１、７１１、７２１、７３１、７４１、７５１、７６１、７７１、７８１、７９１、及び８３３〜８４１のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、１１１、１２１、１３１、１４１、１５１、１６１、１７１、１８１、１９１、２０１、２１１、２２１、２３１、２４１、２５１、２６１、２７１、２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４８１、４９１、５０１、５１１、５２１、５３１、５４１、５５１、５６１、５７１、５８１、５９１、６０１、６１１、６２１、６３１、６４１、６５１、６６１、６７１、６８１、６９１、７０１、７１１、７２１、７３１、７４１、７５１、７６１、７７１、７８１、７９１、及び８３３〜８４１のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、１１１、１２１、１３１、１４１、１５１、１６１、１７１、１８１、１９１、２０１、２１１、２２１、２３１、２４１、２５１、２６１、２７１、２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４８１、４９１、５０１、５１１、５２１、５３１、５４１、５５１、５６１、５７１、５８１、５９１、６０１、６１１、６２１、６３１、６４１、６５１、６６１、６７１、６８１、６９１、７０１、７１１、７２１、７３１、７４１、７５１、７６１、７７１、７８１、７９１、及び８３３〜８４１のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、１１６、１２６、１３６、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、１９６、２０６、２１６、２２６、２３６、２４６、２５６、２６６、２７６、２８６、２９６、３０６、３１６、３２６、３３６、３４６、３５６、３６６、３７６、３８６、３９６、４０６、４１６、４２６、４３６、４４６、４５６、４６６、４７６、４８６、４９６、５０６、５１６、５２６、５３６、５４６、５５６、５６６、５７６、５８６、５９６、６０６、６１６、６２６、６３６、６４６、６５６、６６６、６７６、６８６、６９６、７０６、７１６、７２６、７３６、７４６、７５６、７６６、７７６、７８６、及び７９６のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、１１６、１２６、１３６、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、１９６、２０６、２１６、２２６、２３６、２４６、２５６、２６６、２７６、２８６、２９６、３０６、３１６、３２６、３３６、３４６、３５６、３６６、３７６、３８６、３９６、４０６、４１６、４２６、４３６、４４６、４５６、４６６、４７６、４８６、４９６、５０６、５１６、５２６、５３６、５４６、５５６、５６６、５７６、５８６、５９６、６０６、６１６、６２６、６３６、６４６、６５６、６６６、６７６、６８６、６９６、７０６、７１６、７２６、７３６、７４６、７５６、７６６、７７６、７８６、及び７９６のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、１１６、１２６、１３６、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、１９６、２０６、２１６、２２６、２３６、２４６、２５６、２６６、２７６、２８６、２９６、３０６、３１６、３２６、３３６、３４６、３５６、３６６、３７６、３８６、３９６、４０６、４１６、４２６、４３６、４４６、４５６、４６６、４７６、４８６、４９６、５０６、５１６、５２６、５３６、５４６、５５６、５６６、５７６、５８６、５９６、６０６、６１６、６２６、６３６、６４６、６５６、６６６、６７６、６８６、６９６、７０６、７１６、７２６、７３６、７４６、７５６、７６６、７７６、７８６、及び７９６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１１と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１１と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号１６と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号１６と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片はＰＡＲ２に結合する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、トリプシン、トリプターゼ及び／又はマトリプターゼのＰＡＲ２との相互作用を妨げる。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、トリプシン、トリプターゼ及び／又はマトリプターゼによるＰＡＲ２の切断を妨げる。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ＰＡＲ２の細胞外ドメインの切断を妨げる。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、テザーリガンドの露出を阻害する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、テザーリガンドのＰＡＲ２の第２の膜貫通ループとの相互作用を妨げる。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ｐＨ６．０よりｐＨ７．４でより高い親和性を有してＰＡＲ２に結合する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて、ｐＨ７．４で配列番号３〜５及び８〜１０のＣＤＲを有する抗体又は抗原結合断片と競合する場合、１００ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて、ｐＨ７．４で配列番号３〜５及び８〜１０のＣＤＲを有する抗体又は抗原結合断片と競合する場合、５０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて、ｐＨ７．４で配列番号３〜５及び８〜１０のＣＤＲを有する抗体又は抗原結合断片と競合する場合、４０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて、ｐＨ６．０で配列番号３〜５及び８〜１０のＣＤＲを有する抗体又は抗原結合断片と競合する場合、５００ｎＭより大きいＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて、ｐＨ６．０で配列番号３〜５及び８〜１０のＣＤＲを有する抗体又は抗原結合断片と競合する場合、１０００ｎＭより大きいＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて、ｐＨ６．０で配列番号３〜５及び８〜１０のＣＤＲを有する抗体又は抗原結合断片と競合する場合、１１００ｎＭより大きいＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて、配列番号３〜５及び８〜１０のＣＤＲを有する抗体又は抗原結合断片と競合する場合、ｐＨ６．０よりｐＨ７．４で２０倍を超えて低いＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて、配列番号３〜５及び８〜１０のＣＤＲを有する抗体又は抗原結合断片と競合する場合、ｐＨ６．０よりｐＨ７．４で２５倍を超えて低いＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて、配列番号３〜５及び８〜１０のＣＤＲを有する抗体又は抗原結合断片と競合する場合、ｐＨ６．０よりｐＨ７．４で３０倍を超えて低いＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ヒトＡ５４９細胞におけるカルシウム流入アッセイにおいて３．０×１０−１０Ｍ未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ヒトＡ５４９細胞におけるカルシウム流入アッセイにおいて１．５×１０−１０Ｍ未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ラットＫＮＲＫ細胞におけるカルシウム流入アッセイにおいて７．０×１０−１０Ｍ未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ラットＫＮＲＫ細胞におけるカルシウム流入アッセイにおいて５．５×１０−１０Ｍ未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、カニクイザルＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞におけるカルシウム流入アッセイにおいて７．０×１０−１１Ｍ未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、カニクイザルＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞におけるカルシウム流入アッセイにおいて５．０×１０−１１Ｍ未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、マウスＬＬ／２細胞におけるカルシウム流入アッセイにおいて６．０×１０−１１Ｍ未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、マウスＬＬ／２細胞におけるカルシウム流入アッセイにおいて４．０×１０−１１Ｍ未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ヒスチジン改変を欠く抗体又は抗原結合断片より遅く、治療された患者の血清からなくなる。いくつかの実施形態では、任意選択的に存在するヒスチジン又はヒスチジン（複数）は、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて７．４のｐＨで試験する場合、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬを有する抗体又は抗原結合断片と比較して、ヒトＰＡＲ２に対する抗体又はその抗原結合断片の結合親和性を１０００、８００、７００、５００、４００、３００、２００、１００、５０又は１０倍以下低減する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で開示される抗体又は抗原結合断片のいずれかを発現することが可能な核酸を提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、１１１、１２１、１３１、１４１、１５１、１６１、１７１、１８１、１９１、２０１、２１１、２２１、２３１、２４１、２５１、２６１、２７１、２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４８１、４９１、５０１、５１１、５２１、５３１、５４１、５５１、５６１、５７１、５８１、５９１、６０１、６１１、６２１、６３１、６４１、６５１、６６１、６７１、６８１、６９１、７０１、７１１、７２１、７３１、７４１、７５１、７６１、７７１、７８１、７９１、及び８３３〜８４１のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、１１１、１２１、１３１、１４１、１５１、１６１、１７１、１８１、１９１、２０１、２１１、２２１、２３１、２４１、２５１、２６１、２７１、２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４８１、４９１、５０１、５１１、５２１、５３１、５４１、５５１、５６１、５７１、５８１、５９１、６０１、６１１、６２１、６３１、６４１、６５１、６６１、６７１、６８１、６９１、７０１、７１１、７２１、７３１、７４１、７５１、７６１、７７１、７８１、７９１、及び８３３〜８４１のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、１１１、１２１、１３１、１４１、１５１、１６１、１７１、１８１、１９１、２０１、２１１、２２１、２３１、２４１、２５１、２６１、２７１、２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４８１、４９１、５０１、５１１、５２１、５３１、５４１、５５１、５６１、５７１、５８１、５９１、６０１、６１１、６２１、６３１、６４１、６５１、６６１、６７１、６８１、６９１、７０１、７１１、７２１、７３１、７４１、７５１、７６１、７７１、７８１、７９１、及び８３３〜８４１のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、１１６、１２６、１３６、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、１９６、２０６、２１６、２２６、２３６、２４６、２５６、２６６、２７６、２８６、２９６、３０６、３１６、３２６、３３６、３４６、３５６、３６６、３７６、３８６、３９６、４０６、４１６、４２６、４３６、４４６、４５６、４６６、４７６、４８６、４９６、５０６、５１６、５２６、５３６、５４６、５５６、５６６、５７６、５８６、５９６、６０６、６１６、６２６、６３６、６４６、６５６、６６６、６７６、６８６、６９６、７０６、７１６、７２６、７３６、７４６、７５６、７６６、７７６、７８６、及び７９６のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、１１６、１２６、１３６、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、１９６、２０６、２１６、２２６、２３６、２４６、２５６、２６６、２７６、２８６、２９６、３０６、３１６、３２６、３３６、３４６、３５６、３６６、３７６、３８６、３９６、４０６、４１６、４２６、４３６、４４６、４５６、４６６、４７６、４８６、４９６、５０６、５１６、５２６、５３６、５４６、５５６、５６６、５７６、５８６、５９６、６０６、６１６、６２６、６３６、６４６、６５６、６６６、６７６、６８６、６９６、７０６、７１６、７２６、７３６、７４６、７５６、７６６、７７６、７８６、及び７９６のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、１１６、１２６、１３６、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、１９６、２０６、２１６、２２６、２３６、２４６、２５６、２６６、２７６、２８６、２９６、３０６、３１６、３２６、３３６、３４６、３５６、３６６、３７６、３８６、３９６、４０６、４１６、４２６、４３６、４４６、４５６、４６６、４７６、４８６、４９６、５０６、５１６、５２６、５３６、５４６、５５６、５６６、５７６、５８６、５９６、６０６、６１６、６２６、６３６、６４６、６５６、６６６、６７６、６８６、６９６、７０６、７１６、７２６、７３６、７４６、７５６、７６６、７７６、７８６、及び７９６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１１と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１１と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１６と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１６と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で開示される核酸のいずれかを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で開示される核酸のいずれか１つ以上を含むベクターのセットを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるベクターのいずれか１つ以上を含む宿主細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、薬学的に許容される担体及び本明細書で開示される抗体又は抗原結合断片のいずれかを含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で開示される抗体又はその抗原結合断片のいずれかを含む凍結乾燥組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で開示される抗体又はその抗原結合断片のいずれかを含む再構成された凍結乾燥組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、舐剤、噴霧剤、経口投与、遅延放出又は持続放出、経粘膜投与、シロップ剤、粘膜付着性、バッカル製剤、粘膜付着性錠剤、局所投与、非経口投与、注射、皮下投与、経口溶液、直腸投与、バッカル投与又は経皮投与による投与のために製剤化される。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で開示される抗体若しくはその抗原結合断片のいずれか又は本明細書で開示される組成物のいずれかを含むキットを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、必要とする対象において疼痛を治療するための方法であって、治療有効量の本明細書で開示される抗体又は抗原結合断片のいずれかを対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、必要とする対象において疼痛を治療するための方法であって、治療有効量の本明細書で開示される組成物のいずれかを対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、疼痛は、侵害受容性疼痛、神経因性疼痛、及び混合型疼痛からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、疼痛は、頭痛、慢性頭痛、片頭痛、癌、ウイルス感染、関節リウマチ、変形性関節症、クローン病、肝疾患、多発性硬化症、脊髄損傷、帯状疱疹後神経痛、糖尿病性ニューロパシー、腰痛、炎症性心疾患、腎疾患、胃炎、歯肉炎、歯周疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、自己免疫疾患、過敏性腸症候群、線維筋痛症、下肢痛、脚不穏症候群、糖尿病性ニューロパシー、アレルギー病態、外科手技、急性若しくは慢性の身体的傷害、骨折若しくは圧挫、脊髄損傷、炎症性疾患、非炎症性の神経因性疼痛病態若しくは機能傷害性疼痛病態、又はこれらの組み合わせと関連する。いくつかの実施形態では、疼痛は変形性関節症疼痛である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で開示される抗体又は抗原結合断片のいずれかを作製する方法であって、培養細胞において本明細書で開示される核酸のいずれかを発現する工程、抗体又は抗原結合断片を精製する工程を含む方法を提供する。
提出された本特許又は特許出願は、有色で作成された少なくとも１つの図面を含有する。有色の図面を有する本特許又は特許出願公報のコピーは、入手を要請し、必要な手数料を支払えば、当該特許庁により提供される。
Ｐａｒ００６７の同じＣＤＲと比較した様々なクローンのＶＨ ＶＨ ＣＤＲ２（それぞれ掲載順に配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４、１０４、１１４、１２４、１３４、１４４、１５４、１６４、１７４、１８４、１９４、２０４、２１４、２２４、２３４、２４４、２５４、２６４、２７４、２８４、２９４、３０４、３１４、３２４、３３４、３４４、３５４、３６４、３７４、３８４、３９４、４０４、４１４、４２４、４３４、４４４、４５４、４６４、４７４、４８４、４９４、５０４、５１４、５２４、５３４、５４４、５５４、５６４、５７４、５８４、５９４、６０４、６１４、６２４、６３４、６４４、６５４、６６４、６７４、６８４、６９４、７０４、７１４、７２４、７３４、７４４、７５４、７６４、７７４、７８４、及び７９４）並びにＣＤＲ３（それぞれ掲載順に配列番号５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５、１０５、１１５、１２５、１３５、１４５、１５５、１６５、１７５、１８５、１９５、２０５、２１５、２２５、２３５、２４５、２５５、２６５、２７５、２８５、２９５、３０５、３１５、３２５、３３５、３４５、３５５、３６５、３７５、３８５、３９５、４０５、４１５、４２５、４３５、４４５、４５５、４６５、４７５、４８５、４９５、５０５、５１５、５２５、５３５、５４５、５５５、５６５、５７５、５８５、５９５、６０５、６１５、６２５、６３５、６４５、６５５、６６５、６７５、６８５、６９５、７０５、７１５、７２５、７３５、７４５、７５５、７６５、７７５、７８５、及び７９５）における配列の相違を示す表である。ＣＤＲ１及びフレームワーク領域は、Ｐａｒ００６７及び示されるクローンの全てについて同じである（すなわち、Ｐａｒ００６７及び当該クローンの各々は、配列番号３及び８０３〜８０６の配列を含んだ）。 Ｐａｒ００６７の同じＣＤＲと比較した様々なクローンのＶＬ ＣＤＲ３（それぞれ掲載順に配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、及び８００）における配列の相違を示す表である。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びフレームワーク領域は、Ｐａｒ００６７及び示されるクローンの全てについて同じである（すなわち、当該クローンは、配列番号８、９、及び８０７〜８１０の配列を含んだ）。 様々なＩｇＧ型抗体を用いた細胞力価アッセイからのＩＣ５０データを提供する。細胞アッセイの各々で使用される細胞の種類が示される。ＮＩ＝非阻害性。 当該当量濃度での抗体へのアゴニスト反応と比較した、Ａ５４９細胞におけるトリプシンに対するＰａＢ６７０１２９に関するＩＣ５０曲線を提供する。 異なるＰＡＲ２プロテアーゼ活性体に対するＰａＢ６７０１２９に関するＩＣ５０曲線を提供する。 ラット脊髄後根神経節（ＤＲＧ）感覚神経又は非神経細胞をＰａＢ６７０１２９（本明細書においてはＰａＢ６７０１２９としてもまた参照される）の存在下又は非存在下でマトリプターゼ（ｍａｔｒｉｐａｓｅ）により処理した実験の結果を示す。アイソタイプ対照（２０ｎＭ）で前処理されたラットＤＲＧ感覚神経は、マトリプターゼ誘導性カルシウムトランジェントを示す（５Ａ）。ＰａＢ６７０１２９ ＩｇＧ１ＴＭ（２０ｎＭ）で前処理された感覚神経は、マトリプターゼに対して応答しない（５Ｂ）；（５Ｃ）において定量化されたマトリプターゼに対して応答する神経の％。アイソタイプ対照（２０ｎＭ）で前処理されたＤＲＧの非神経細胞もまた、マトリプターゼ誘導性カルシウムトランジェントを示す（８Ｄ）が、ＰａＢ６７０１２９ ＩｇＧ１ＴＭ（２０ｎＭ）で前処理された非神経細胞は示さなかった（５Ｅ）；（５Ｆ）において定量化されたマトリプターゼに対して応答する非神経細胞の％。図５Ａ〜５Ｅは、配列番号８３２として「ＬＩＧＲＬＯ」を開示する。 ヒトＡ５４９細胞におけるトロンビン誘導性ＰＡＲ１活性化に対するＰａＢ６７０１２９（対 抗ＰＡＲ１抗体又はボラパクサール）の効果を示す。 ラットにおいてモノ−ヨード酢酸（ＭＩＡ）により誘導される同側／対側過感受性のパーセントに対する異なる治療（ＰＡＲ２抗体、Ｐａｒ００６７を含む）の効果を示すグラフを表す。 ラットにおいてＭＩＡにより誘導される同側／対側過感受性のパーセントに対する異なる用量のＰａＢ６７０１２９又はアイソタイプ対照抗体の効果を示すグラフを表す。「ｉ．ｖ．」は静脈内を意味し、「ｐ．ｏ．」はｐｅｒ ｏｓ（経口）を意味する。 マウスにおいて末梢神経の部分結紮により誘導される同側／対側過感受性のパーセントに対する異なる用量のＰａＢ６７０１２９又はアイソタイプ対照抗体の効果を示すグラフを表す。「ｓ．ｃ．」は、皮下を意味する。Ｎ＝１群当たり９〜１０。データを、依存因子として時間及び治療を用いる二元配置ＡＮＯＶＡを使用して解析した。その結果生じた統計的有意性を、テューキーの事後検定を用いて得た。個々の比較は、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１ 対 手術＋アイソタイプ対照 １０ｍｇ／ｋｇで示される。
本開示を説明する前に、この開示は、記載される特定の方法及び実験条件に限定されず、そのため、このような方法及び条件は変更される場合があることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載するためだけのものであり、限定を意図しないことも理解されたい。
特に他で定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同様の意味を有する。
本明細書に記載されるものと同様又は等価の任意の方法及び材料を本開示の実施及び試験において使用できるが、好ましい方法及び材料はここで記載される。
Ａ．定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明白に指示しない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書では、アミノ酸は、一般に知られる３文字記号又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨される１文字記号のいずれかによって参照され得る。ヌクレオチドは、同様に、一般に受け入れられている１文字コードで参照され得る。
本明細書で使用する場合、「及び／又は」は、２つの指定される特徴又は構成要素の各々の、他方を伴うか又は伴わない特定の開示と解釈されるべきであることをここで指摘すると都合がよい。例えば「Ａ及び／又はＢ」は、ちょうど本明細書中に各々が個別に記載されているように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の特定の開示であると解釈されるものとする。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、天然に存在するアミノ酸の重合体及び天然に存在しないアミノ酸の重合体のみならず、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸重合体に適用される。
本明細書で使用する場合、語句「プロテアーゼ活性化受容体２」、「ＰＡＲ２」などは、配列番号８０１のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するヒトＰＡＲ２タンパク質、又はその生物学的に活性な断片を指す。
用語「テザーリガンド」は、ＰＡＲ２受容体それ自体に結合し、且つそれを活性化するＰＡＲ２のＮ末端部分の領域を指す。いくつかの実施形態では、ＰＡＲ２のテザーリガンド部分は、プロテアーゼ（例えば、トロンビン又はトリプシン）がＰＡＲ２酵素の一部をタンパク分解性に切断するまで露出されない。いくつかの実施形態では、テザーリガンドは、配列番号８０２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるポリペプチドに相当する。
本明細書で使用する場合、「ＰＡＲ２に結合する抗体」、「抗ＰＡＲ２抗体」などは、膜結合型ＰＡＲ２又はその断片に結合する抗体、及びその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＲ２抗体又はその抗原結合断片は、ＰＡＲ２のテザーリガンド部分に結合する。
Ｂ．抗体及びその抗原結合断片
本明細書で使用する場合、「本開示の抗体又は抗原結合断片」は、本明細書で提供される抗体及び抗原結合断片のいずれか１つ以上を指す。本開示の抗体及び抗原結合断片は、重鎖可変ドメインを含む重鎖（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメインを含む軽鎖（ＶＬ）を含む。ＶＨドメインは、本明細書で提供され、且つＣｈｏｔｉａ、Ｋａｂａｔ若しくはＩＭＧＴシステムによって定義又は同定されるＣＤＲのいずれかなどの、３つのＣＤＲを含む。これらのＣＤＲは通常、フレームワーク領域（ＦＲ）とともに点在し、且つ合わせてＶＨドメインを含む。同様に、ＶＬは、本明細書で提供され、且つＣｈｏｔｉａ、Ｋａｂａｔ若しくはＩＭＧＴシステムによって定義されるＣＤＲのいずれかなどの、３つのＣＤＲを含む。これらのＣＤＲは通常、フレームワーク領域（ＦＲ）とともに点在し、且つ合わせてＶＬドメインを含む。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び／又はＦＲ４などのＦＲ領域は、同様に、Ｃｈｏｔｉａ、Ｋａｂａｔ若しくはＩＭＧＴシステムによって定義又は同定することができる。本出願を通して、ＣＤＲが存在し、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ若しくはＩＭＧＴシステムによって同定又は定義される場合、ＣＤＲがこれらのシステム（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ又はＩＭＧＴ ＣＤＲ）に従うことを意味する。Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ又はＩＭＧＴ ＣＤＲが参照されているかどうかを示すために、これらの用語のいずれかが使用され得る。
本明細書で使用する場合、用語「抗体」はまた、全長抗体分子の抗原結合断片を含む。本明細書で使用する場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、天然に存在する、酵素的に得られる、合成の、若しくは遺伝子改変された任意のポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、タンパク質消化又は抗体の可変ドメイン及び任意選択的に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作並びに発現を含む組換え遺伝子工学技術などの任意の好適な標準的技術を用いて全長抗体分子から得てもよい。このようなＤＮＡは知られており且つ／若しくは例えば民間の供給元、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ−抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、又は合成することができる。当該ＤＮＡを配列決定してもよく、且つ化学的に又は分子生物学の技術を用いることによって操作して、例えば、１つ以上の可変及び／又は定常ドメインを好適な構成に配置するか、又はコドンを導入するか、システイン残基を作り出すか、アミノ酸を修飾するか、付加するか若しくは欠失させるなどしてもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、ｐＨ６．０よりｐＨ７．４でより高い親和性を有する、ＰＡＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ｐＨ６．０よりｐＨ７．４で少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００倍高い親和性を有してＰＡＲ２に結合する。いくつかの実施形態では、本開示は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片を提供し、ＶＨは：ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号３の配列中に任意選択的に存在するＶＨ−ＣＤＲ１；ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号４の配列中に任意選択的に存在するＶＨ−ＣＤＲ２；及びｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号５の配列中に任意選択的に存在するＶＨ−ＣＤＲ３を含み；且つＶＬは：ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号８の配列中に任意選択的に存在するＶＬ−ＣＤＲ１；ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号９の配列中に任意選択的に存在するＶＬ−ＣＤＲ２；及びｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号１０の配列中に任意選択的に存在するＶＬ−ＣＤＲ３を含み；アミノ酸置換、欠失又は挿入は、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて７．４のｐＨで試験する場合、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬを有する抗体又は抗原結合断片と比較して、ヒトＰＡＲ２に対する抗体又はその抗原結合断片の結合親和性を１０００、８００、７００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、１０又は５倍以下低減する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換、欠失又は挿入は、相同置換を含む。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号２の配列に存在するＣＤＲアミノ酸配列と比較して、ＶＨ ＣＤＲ中において１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以下のアミノ酸置換、挿入又は欠失を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号７の配列に存在するＣＤＲアミノ酸配列と比較して、ＶＬ ＣＤＲ中において１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以下のアミノ酸置換、挿入又は欠失を有する。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸置換、挿入又は欠失は、ヒスチジンによる１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の置換である。
いくつかの実施形態では、本開示は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、ＶＨは：ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号１３の配列中に任意選択的に存在するＶＨ−ＣＤＲ１；ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号１４の配列中に任意選択的に存在するＶＨ−ＣＤＲ２；及びｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は１５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号１５の配列中に任意選択的に存在するＶＨ−ＣＤＲ３を含み；且つＶＬは：ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号１８の配列中に任意選択的に存在するＶＬ−ＣＤＲ１；ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号１９の配列中に任意選択的に存在するＶＬ−ＣＤＲ２；及びｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号２０の配列中に任意選択的に存在するＶＬ−ＣＤＲ３を含み；アミノ酸置換、欠失又は挿入は、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて７．４のｐＨで試験する場合、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＬを有する抗体又は抗原結合断片と比較して、ヒトＰＡＲ２に対する抗体又はその抗原結合断片の結合親和性を１０００、８００、７００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、１０又は５倍以下低減する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換、欠失又は挿入は、相同置換を含む。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１２の配列に存在するＣＤＲアミノ酸配列と比較して、ＶＨ ＣＤＲ中において１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以下のアミノ酸置換、挿入又は欠失を有する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１７の配列に存在するＣＤＲアミノ酸配列と比較して、ＶＬ ＣＤＲ中において１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以下のアミノ酸置換、挿入又は欠失を有する。いくつかの実施形態では、本開示は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、ＶＨは：ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２、ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含み、且つＶＬは：ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２、ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸置換、挿入又は欠失は、ヒスチジンによる１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の置換である。
いくつかの実施形態では、本開示は、抗体又は抗原結合断片を提供し、ここで、抗体又は抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ＶＨドメインは、配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２、１１２、１２２、１３２、１４２、１５２、１６２、１７２、１８２、１９２、２０２、２１２、２２２、２３２、２４２、２５２、２６２、２７２、２８２、２９２、３０２、３１２、３２２、３３２、３４２、３５２、３６２、３７２、３８２、３９２、４０２、４１２、４２２、４３２、４４２、４５２、４６２、４７２、４８２、４９２、５０２、５１２、５２２、５３２、５４２、５５２、５６２、５７２、５８２、５９２、６０２、６１２、６２２、６３２、６４２、６５２、６６２、６７２、６８２、６９２、７０２、７１２、７２２、７３２、７４２、７５２、７６２、７７２、７８２、及び７９２のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列のＣＤＲのうち少なくとも１つ、２つ又は３つ全て（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ又はＫａｂａｔシステムのいずれかを用いて測定する場合）を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、抗体又は抗原結合断片を提供し、ここで、抗体又は抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ＶＨドメインは、配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２、１１２、１２２、１３２、１４２、１５２、１６２、１７２、１８２、１９２、２０２、２１２、２２２、２３２、２４２、２５２、２６２、２７２、２８２、２９２、３０２、３１２、３２２、３３２、３４２、３５２、３６２、３７２、３８２、３９２、４０２、４１２、４２２、４３２、４４２、４５２、４６２、４７２、４８２、４９２、５０２、５１２、５２２、５３２、５４２、５５２、５６２、５７２、５８２、５９２、６０２、６１２、６２２、６３２、６４２、６５２、６６２、６７２、６８２、６９２、７０２、７１２、７２２、７３２、７４２、７５２、７６２、７７２、７８２、及び７９２のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ又はＫａｂａｔシステムのいずれかを用いて測定する場合）を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、抗体又は抗原結合断片を提供し、ここで、抗体又は抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ＶＨドメインは、配列番号２又は１２に記載されるアミノ酸配列のＣＤＲのうち少なくとも１つ、２つ又は３つ全て（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ又はＫａｂａｔシステムのいずれかを用いて測定する場合）を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、抗体又は抗原結合断片を提供し、ここで、抗体又は抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ＶＬドメインは、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、１２７、１３７、１４７、１５７、１６７、１７７、１８７、１９７、２０７、２１７、２２７、２３７、２４７、２５７、２６７、２７７、２８７、２９７、３０７、３１７、３２７、３３７、３４７、３５７、３６７、３７７、３８７、３９７、４０７、４１７、４２７、４３７、４４７、４５７、４６７、４７７、４８７、４９７、５０７、５１７、５２７、５３７、５４７、５５７、５６７、５７７、５８７、５９７、６０７、６１７、６２７、６３７、６４７、６５７、６６７、６７７、６８７、６９７、７０７、７１７、７２７、７３７、７４７、７５７、７６７、７７７、７８７、及び７９７のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列のＣＤＲのうち少なくとも１つ、２つ又は３つ全て（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ又はＫａｂａｔシステムのいずれかを用いて測定する場合）を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、抗体又は抗原結合断片を提供し、ここで、抗体又は抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ＶＬドメインは、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、１２７、１３７、１４７、１５７、１６７、１７７、１８７、１９７、２０７、２１７、２２７、２３７、２４７、２５７、２６７、２７７、２８７、２９７、３０７、３１７、３２７、３３７、３４７、３５７、３６７、３７７、３８７、３９７、４０７、４１７、４２７、４３７、４４７、４５７、４６７、４７７、４８７、４９７、５０７、５１７、５２７、５３７、５４７、５５７、５６７、５７７、５８７、５９７、６０７、６１７、６２７、６３７、６４７、６５７、６６７、６７７、６８７、６９７、７０７、７１７、７２７、７３７、７４７、７５７、７６７、７７７、７８７、及び７９７のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ又はＫａｂａｔシステムのいずれかを用いて測定する場合）を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、抗体又は抗原結合断片を提供し、ここで、抗体又は抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ＶＬドメインは、配列番号７又は１７に記載されるアミノ酸配列のＣＤＲのうち少なくとも１つ、２つ又は３つ全て（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ又はＫａｂａｔシステムのいずれかを用いて測定する場合）を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、抗体又は抗原結合断片を提供し、ここで、抗体又は抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ＶＨドメインは、配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２、１１２、１２２、１３２、１４２、１５２、１６２、１７２、１８２、１９２、２０２、２１２、２２２、２３２、２４２、２５２、２６２、２７２、２８２、２９２、３０２、３１２、３２２、３３２、３４２、３５２、３６２、３７２、３８２、３９２、４０２、４１２、４２２、４３２、４４２、４５２、４６２、４７２、４８２、４９２、５０２、５１２、５２２、５３２、５４２、５５２、５６２、５７２、５８２、５９２、６０２、６１２、６２２、６３２、６４２、６５２、６６２、６７２、６８２、６９２、７０２、７１２、７２２、７３２、７４２、７５２、７６２、７７２、７８２、及び７９２のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ又はＫａｂａｔシステムのいずれかを用いて測定する場合）を含み、且つＶＬドメインは、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、１２７、１３７、１４７、１５７、１６７、１７７、１８７、１９７、２０７、２１７、２２７、２３７、２４７、２５７、２６７、２７７、２８７、２９７、３０７、３１７、３２７、３３７、３４７、３５７、３６７、３７７、３８７、３９７、４０７、４１７、４２７、４３７、４４７、４５７、４６７、４７７、４８７、４９７、５０７、５１７、５２７、５３７、５４７、５５７、５６７、５７７、５８７、５９７、６０７、６１７、６２７、６３７、６４７、６５７、６６７、６７７、６８７、６９７、７０７、７１７、７２７、７３７、７４７、７５７、７６７、７７７、７８７、及び７９７のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ又はＫａｂａｔシステムのいずれかを用いて測定する場合）を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、抗体又は抗原結合断片を提供し、ここで、抗体又は抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ＶＨドメインは、配列番号２又は１２に記載されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ又はＫａｂａｔシステムのいずれかを用いて測定する場合）を含み、且つＶＬドメインは、配列番号７又は１７に記載されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ又はＫａｂａｔシステムのいずれかを用いて測定する場合）を含む。
このような抗体をコードするヌクレオチド配列が決定されると、キメラ抗体又はヒト化抗体が組換え法により作製され得る。当該抗体をコードする核酸は、当技術分野で一般に知られ、且つ本明細書で記載される材料及び手順を用いて宿主細胞に導入され、発現される。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、１１１、１２１、１３１、１４１、１５１、１６１、１７１、１８１、１９１、２０１、２１１、２２１、２３１、２４１、２５１、２６１、２７１、２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４８１、４９１、５０１、５１１、５２１、５３１、５４１、５５１、５６１、５７１、５８１、５９１、６０１、６１１、６２１、６３１、６４１、６５１、６６１、６７１、６８１、６９１、７０１、７１１、７２１、７３１、７４１、７５１、７６１、７７１、７８１、７９１、及び８３３〜８４１のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１又は１１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、１１６、１２６、１３６、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、１９６、２０６、２１６、２２６、２３６、２４６、２５６、２６６、２７６、２８６、２９６、３０６、３１６、３２６、３３６、３４６、３５６、３６６、３７６、３８６、３９６、４０６、４１６、４２６、４３６、４４６、４５６、４６６、４７６、４８６、４９６、５０６、５１６、５２６、５３６、５４６、５５６、５６６、５７６、５８６、５９６、６０６、６１６、６２６、６３６、６４６、６５６、６６６、６７６、６８６、６９６、７０６、７１６、７２６、７３６、７４６、７５６、７６６、７７６、７８６、及び７９６のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号６又は１６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。
本開示は、ＰＡＲ２に結合する抗ＰＡＲ２抗体及びその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、中和及び／又は遮断抗ＰＡＲ２抗体又は抗原結合断片である。本明細書で使用する場合、「中和」若しくは「遮断」抗体又は抗原結合断片は、ＰＡＲ２との結合が：（ｉ）ＰＡＲ２とプロテアーゼ（例えば、トリプシン、トリプターゼ及び／又はマトリプターゼ）の間の相互作用を妨げ；（ｉｉ）プロテアーゼによるＰＡＲ２の切断を阻害し；（ｉｉｉ）ＰＡＲ２シグナル伝達若しくはＰＡＲ２活性化を阻害し；且つ／又は（ｉｖ）ＰＡＲ２の少なくとも１つの生物学的機能の阻害をもたらす抗体又は抗原結合断片を指すことが意図される。いくつかの実施形態では、本開示の抗体又は抗原結合断片はＰＡＲ２の活性化を阻害する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、不活性型の切断されていないＰＡＲ２から活性型の切断されたＰＡＲ２への変換を阻害する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、テザーリガンドの露出を阻害する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、そのテザーリガンドによるＰＡＲ２受容体の活性化を阻害する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、テザーリガンドのＰＡＲ２の第２の膜貫通ドメインへの結合を阻害する。抗ＰＡＲ２中和又は遮断抗体によりもたらされる阻害は、それが適切なアッセイを用いて検出可能である限り、完全である必要はない。いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、阻害されていない活性型ＰＡＲ２と比較して、ＰＡＲ２の活性を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％阻害する。代表的な抗ＰＡＲ２抗体又は抗原結合断片の活性を検出するためのアッセイのいくつかの例は、例証の節において記載される。当業者は、さらなる抗ＰＡＲ２抗体活性アッセイを理解している。
特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体又は抗原結合断片のいずれかは、ＰＡＲ２とプロテアーゼの間の相互作用を妨げる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼはトリプシンである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは好中球エラスターゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは好中性プロテイナーゼ３である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼはマスト細胞トリプターゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは組織因子／因子ＶＩＩａ／因子Ｘａである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼはカリクレイン関連ペプチダーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは膜結合型セリンプロテイナーゼ−１／マトリプターゼ１である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは寄生体システインプロテイナーゼである。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＲ２抗体又は抗原結合断片は、例証の節で記載されるものなどの結合アッセイによって測定されるとおり、約１５ｎＭ未満のＩＣ５０値を有して、インビトロでのＰＡＲ２とプロテアーゼ（例えば、トリプシン）の間の相互作用を遮断する。ある種の実施形態では、本開示の抗体又は抗原結合断片は、約２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、５ｐＭ、１ｐＭ又は０．１ｐＭ未満のＩＣ５０値を有して、ｐＨ７．４で、インビトロでのＰＡＲ２とプロテアーゼ（例えば、トリプシン）の間の相互作用を遮断する。ある種の実施形態では、本開示の抗体又は抗原結合断片は、約３００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１０００ｎＭ、１１００ｎＭ、又は１２００ｎＭより大きいＩＣ５０値を有して、ｐＨ６．０で、インビトロでのＰＡＲ２とプロテアーゼ（例えば、トリプシン）の間の相互作用を遮断する。ある種の実施形態では、抗ＰＡＲ２抗体又はその断片のＩＣ５０は、本明細書で提供される例証の節において記載されるエピトープ競合アッセイなどのエピトープ競合アッセイにおいて測定される。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＲ２抗体又はその断片のＩＣ５０は、細胞力価アッセイにおいて測定される。いくつかの実施形態では、細胞力価アッセイは、ヒト細胞（例えば、Ａ５４９細胞）、ラット細胞（例えば、ＫＮＲＫ細胞）、カニクイザル細胞（例えば、ＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞）、又はマウス細胞（例えば、ＬＬ／２細胞）を利用する。いくつかの実施形態では、細胞力価アッセイは、カルシウム流入アッセイを利用する（例えば、本明細書で提供される例証の節において記載されるカルシウム流入アッセイ）。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、１ｎＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、１ｐＭ又は０．１ｐＭ未満のＩＣ５０を有して、カルシウム流入アッセイにおけるカルシウム流入を阻害する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、トリプシンによるＰＡＲ２の異常な活性化を妨げる。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、炎症誘導性疼痛を阻害／低減する。
特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体又は抗原結合断片のいずれかは、ＰＡＲ２とプロテアーゼ（例えば、トリプシン）の間の相互作用を妨げる。いくつかの実施形態では、抗体は、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）が、ＰＡＲ２と結合し、ＰＡＲ２を切断し、且つ／又はＰＡＲ２を活性化することを妨げる。本開示は、生理的な細胞外ｐＨ（すなわち、ｐＨ７．４）で高親和性を有してＰＡＲ２分子に結合する抗ＰＡＲ２抗体及びその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態では、抗体及び抗体の抗原結合断片は、約５ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６５０ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ又は５０ｐＭ未満のＫＤを有してｐＨ７．４（例えば、２５℃又は３７℃で）でＰＡＲ２に結合する。いくつかの実施形態では、抗体及び抗体の抗原結合断片は、約１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、８０ｎＭ、又は１００ｎＭより大きいＫＤを有して弱酸性ｐＨ（ｐＨ６．０など）（例えば、２５℃又は３７℃で）でＰＡＲ２に結合する。いくつかの実施形態では、弱酸性ｐＨは、エンドソーム区画のｐＨである。いくつかの実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又は水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）を用いるなどの、現在の標準的な方法に従って測定することができる。
本開示はまた、ｐＨ７．４における２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴などのアッセイを用いて測定されるとおり、約１．５分、１．７５分、２分、２．５分、３分、５分、１０分、２０分、又は３０分を超える解離半減期（ｔ１／２）を有してＰＡＲ２に特異的に結合する抗ＰＡＲ２抗体及びその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＲ２抗体及びその抗原結合断片は、弱酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ６）における２５℃又は３７℃での表面プラズモン共鳴などのアッセイを用いて測定されるとおり、約１分、４５秒、３０秒、２０秒、１５秒、１３秒、７秒、５秒、又は３秒未満の解離半減期（ｔ１／２）を有してＰＡＲ２に結合する。いくつかの実施形態では、弱酸性ｐＨは、エンドソーム区画のｐＨである。いくつかの実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又は水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）を用いるなどの、現在の標準的な方法に従って測定することができる。
本開示の抗体又は抗原結合断片は、前述の生物学的特徴、又はその任意の組み合わせの１つ以上を有し得る。本開示の抗体の他の生物学的特徴は、本明細書で提供される例証の節を含む本開示の確認から当業者に明らかであろう。
ポリペプチドに適用する場合、用語「実質的な類似性」又は「実質的に類似の」は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを用いるＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムなどにより最適にアラインメントされる場合に、少なくとも９５％の配列同一性、より一層好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される抗体又は抗原結合断片のいずれかは、参照配列（例えば、配列番号２、７、１２又は１７のアミノ酸配列のいずれか）と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換される置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変えない。２つ以上のアミノ酸配列が、保存的置換によって互いに異なる場合、パーセント配列同一性又は類似度を調整して、置換の保存的性質を上方に補正してもよい。この調整を行うための手段は当業者によく知られている。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照されたい。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに（７）硫黄含有側鎖はシステイン及びメチオニンであることが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換の群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。
あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−１４４５において開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて正値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて非負値を有する任意の変化である。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）を異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分類される。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元配置はよく知られており、一般に、例えば、Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．，２０００）において記載されている。抗体は、１つ以上の他のタンパク質又はペプチドとの抗体の共有結合性又は非共有結合性の会合により形成される、より大きな融合分子の一部であり得る。
抗原結合断片の非限定的な例としては：（ｉ）Ｆａｂ断片；（ｉｉ）Ｆａｂ’断片；（ｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｖ）Ｆｄ断片；（ｖ）Ｆｖ断片；（ｖｉ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉｉ）ｄＡｂ断片；及び（ｖｉｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小の認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、又は限定的なＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドが挙げられる。改変された他の分子、例えば、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ラクダ科動物（ｃａｍｅｌｉｉｄ）抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、アドネクチン、小モジュラー免疫医薬（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインもまた、本明細書で使用される語句「抗原結合断片」に包含される。
抗体の抗原結合断片は通常、少なくとも１つの可変ドメイン（例えば、ＶＨ又はＶＬの少なくとも１つ）を含むことになる。可変ドメインは、いずれのサイズ又はアミノ酸組成であってもよく、一般に、１つ以上のフレームワーク配列と隣接するか又はインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含むことになる。ＶＬドメインと会合したＶＨドメインを有する抗原結合断片では、ＶＨ及びＶＬドメインは、互いに対して任意の好適な配置で位置し得る。例えば、可変領域は、二量体であり得るし、且つＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＬ二量体を含有し得る。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶＨ又はＶＬドメインを含有してもよい。
ある種の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合で連結した少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本開示の抗体の抗原結合断片内で見出され得る可変及び定常ドメインの非限定的な例示的配置としては：（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２；（Ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬが挙げられる。上記の例示的配置のいずれかを含む可変及び定常ドメインの任意の配置において、可変及び定常ドメインは、互いに直接連結してもよいし、全体若しくは部分的なヒンジ又はリンカー領域によって連結してもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子における隣接した可変及び／又は定常ドメイン間の可動性又は半可動性の連結をもたらす少なくとも２個（例えば、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個又はそれ以上）のアミノ酸からなり得る。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、グリシン−セリンリンカーを含む。
さらに、本開示の抗体の抗原結合断片は、互いに及び／又は１つ以上の単量体のＶＨ若しくはＶＬドメインと非共有結合的に会合した（例えば、ジスルフィド結合によって）上に列記した可変及び定常ドメイン配置のいずれかのホモ二量体又はヘテロ二量体（又は他の多量体）を含み得る。
全長抗体分子と同様に、抗原結合断片は、単一特異性又は多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合断片は通常、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含むことになり、ここで、各可変ドメインは、別々の抗原又は同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合することが可能である。本明細書で開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む任意の多重特異性抗体フォーマットは、当技術分野で利用可能な通例の技術を用いて、本開示の抗体の抗原結合断片との関係の中で使用するために適合され得る。
本開示のある種の実施形態では、本開示の抗ＰＡＲ２抗体はヒト抗体である。本明細書で使用する場合、用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的な変異誘発又はインビボでの体細胞変異により導入される変異）を、例えば、ＣＤＲ、またいくつかの実施形態ではＣＤＲ３に含み得る。しかし、本明細書で使用する場合、用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むように意図されていない。
本開示の抗体は、いくつかの実施形態において、組換えヒト抗体であり得る。本明細書で使用する場合、用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって作製、発現、生成又は単離される全てのヒト抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体（さらに後述する）、組換え体から単離された抗体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリー（さらに後述する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子が遺伝子導入されている動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５を参照されたい）、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって作製、発現、生成若しくは単離された抗体を含むことを意図している。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する。しかしながら、ある種の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（又はヒトＩｇ配列が遺伝子導入された動物が使用される場合、インビボ体細胞変異誘発）にかけられ、したがって、組換え抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨ配列及びＶＬ配列に由来し、それらと関係するが、インビボにおいてヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に天然に存在しない場合がある配列である。
ヒト抗体は、ヒンジ異質性に関連する２つの形態で存在し得る。一方の形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって維持される、約１５０〜１６０ｋＤａの安定した四鎖構築物を含む。第２の形態では、二量体は鎖間ジスルフィド結合によって連結されておらず、約７５〜８０ｋＤａの分子が、共有結合で結合された軽鎖と重鎖で形成され、構成される（半抗体）。これらの形態は、親和性精製後でさえ分離することが極めて困難であった。
種々のインタクトなＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、限定されるものではないが、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造的相違に起因する。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、第２の形態の出現を、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して通常観察されるレベルに有意に低減させることができる（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５）。本開示は、例えば、生産の際、所望の抗体形態の収率を向上させるために望ましい場合がある、ヒンジ、ＣＨ２又はＣＨ３領域に１つ以上の変異を有する抗体を意図する。
本開示の抗体は、単離された抗体又は単離された抗原結合断片であり得る。本明細書で使用する場合、「単離された抗体」又は「単離された抗原結合断片」は、その天然の環境の少なくとも１つの成分から同定並びに分離及び／又は回収された抗体又は抗原結合断片を意味する。例えば、生物体の少なくとも１つの成分から、又は抗体が自然に存在するか若しくは自然に産生される組織若しくは細胞から分離されたか又は取り出された抗体又は抗原結合断片は、本開示の目的のための「単離された抗体」又は「単離された抗原結合断片」である。単離された抗体はまた、組換え細胞内の生体内原位置の抗体を含む。単離された抗体又は抗原結合断片は、少なくとも１回の精製工程又は単離工程にかけられた抗体又は抗原結合断片である。ある種の実施形態によれば、単離された抗体又は抗原結合断片は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない場合がある。
本明細書で開示される抗ＰＡＲ２抗体又は抗原結合断片は、抗体が由来する対応する生殖細胞系列配列と比較して、重鎖並びに軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域において１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含む場合がある。本開示は、本明細書で開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体、及びその抗原結合断片を含み、ここで、１つ以上のフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体又は抗原結合断片が由来する生殖細胞系列配列の対応する残基に、又は別のヒト生殖細胞系列配列の対応する残基に、又は対応する生殖細胞系列残基の保存的アミノ酸置換に変異される（このような配列の変化は、本明細書では一括して「生殖細胞系列変異」と呼ばれる）。当業者は、本明細書で開示される重鎖及び軽鎖可変領域配列で出発して、１つ以上の個々の生殖細胞系列変異又はそれらの組合せを含む多数の抗体及び抗原結合断片を容易に生成することができる。ある種の実施形態では、ＶＨ及び／又はＶＬドメイン内のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基の全てが、抗体が由来する元の生殖細胞系列配列中で見出される残基に復帰変異される。他の実施形態では、特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸中若しくはＦＲ４の最後の８アミノ酸中で見出される変異残基のみ、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２若しくはＣＤＲ３内で見出される変異残基のみが、元の生殖細胞系列配列に復帰変異される。他の実施形態では、フレームワーク及び／又はＣＤＲ残基の１つ以上が、異なる生殖細胞系列配列（すなわち、抗体が本来由来した生殖細胞系列配列とは異なる生殖細胞系列配列）の対応する残基に変異される。いくつかの実施形態では、ＶＨフレームワーク領域１は、配列番号８０３の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨフレームワーク領域２は、配列番号８０４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨフレームワーク領域３は、配列番号８０５の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨフレームワーク領域４は、配列番号８０６の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬフレームワーク領域１は、配列番号８０７の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬフレームワーク領域２は、配列番号８０８の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬフレームワーク領域３は、配列番号８０９の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬフレームワーク領域４は、配列番号８１０の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨフレームワークは、配列番号８０３〜８０６のいずれか１つの参照配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の保存的置換を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬフレームワークは、配列番号８０７〜８１０のいずれか１つの参照配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の保存的置換を含む。
さらに、本開示の抗体は、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の２つ以上の生殖細胞系列変異の任意の組み合わせを含有する場合があり、例えば、特定の個々の残基は特定の生殖細胞系列配列の対応する残基に変異されるが、元の生殖細胞系列配列とは異なる特定の他の残基は維持されるか、又は異なる生殖細胞系列配列の対応する残基に変異される。１つ以上の生殖細胞系列変異を含有する抗体及び抗原結合断片は、ひとたび得てしまえば、１つ以上の所望の特性、例えば、結合特異性の向上、結合親和性の増大、アンタゴニスト又はアゴニストとしての生物学的特性の向上又は増強（場合によって）、免疫原性の低減などについて容易に試験することができる。この一般的手法で得られる抗体及び抗原結合断片は、本開示内に包含される。
本開示はまた、１つ以上の保存的置換を有する本明細書で開示されるＶＨ、ＶＬ、及び／又はＣＤＲのアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗ＰＡＲ２抗体を含む。例えば、本開示は、例えば、本明細書で開示されるＶＨ、ＶＬ、及び／又はＣＤＲのアミノ酸配列のいずれかに対して、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個の保存的アミノ酸置換を有するＶＨ、ＶＬ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＰＡＲ２抗体を含む。
用語「エピトープ」は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域における特異的な抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。１つの抗原は、２つ以上のエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は、抗原の異なる領域に結合し得、且つ異なる生物学的作用を有し得る。エピトープは、立体構造的又は線状のいずれかであり得る。立体構造的なエピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によってもたらされる。線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接したアミノ酸残基によってもたらされるものである。一定の状況では、エピトープは、抗原上の糖部分、ホスホリル基、又はスルホニル基を含み得る。
本開示の抗体又は抗原結合断片のいずれかの任意の部分を、エピトープタグ、ＰＥＧ部分などで同様に修飾してもよいことに留意すべきである。さらに、抗体又は抗原結合断片は、２つのエピトープタグなどの２つ以上のエピトープタグを含んでもよいし、０個のエピトープタグを含んでもよい。
核酸又はその断片を指す場合、用語「実質的な同一性」又は「実質的に同一の」は、別の核酸（又はその相補鎖）と適切なヌクレオチド挿入又は欠失とともに最適にアラインメントされる場合、以下に説明するとおり、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧａｐなどの配列同一性の任意のよく知られるアルゴリズムによって測定した際に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、及びより好ましくは約９６％、９７％、９８％又は９９％においてヌクレオチド配列の同一性があることを示す。参照の核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、ある事例では、参照の核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じ又は実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
配列同一性とも称されるポリペプチドについての配列類似性は通常、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、様々な置換、欠失及び保存的アミノ酸置換を含む他の改変に割り当てられた類似性の尺度を使用して、類似の配列を対応させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、ＧＡＰ及びＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含み、それらを既定のパラメータで使用して、異なる生物種由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチドの間、又は野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性又は配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧ バージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧ バージョン６．１のプログラムであるＦＡＳＴＡを使用して、既定の又は推奨されるパラメータを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、アラインメント及び問い合わせ配列と探索配列との間で最も重複する領域のパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上掲）。本開示の配列を種々の生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定のパラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２を参照されたい。いくつかの実施形態では、配列は、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅペアワイズ配列アラインメントを使用して比較される。
いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗原結合断片はｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗原結合断片はＦａｂ’である。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
モノクローナル抗体の開発を機に、抗体は有用になり、且つ医薬品として関心が持たれるようになった。モノクローナル抗体は、培養液中の継代細胞株によって抗体分子を産生する任意の方法を使用して産生される。モノクローナル抗体を作製するための好適な方法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒらのハイブリドーマ法（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）及びヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，１９８４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；及びＢｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．５１−６３）が挙げられる。多くの場合、ハイブリドーマを使用して、マウス又は齧歯類起源の初期の抗体を作製する。次に、この初期の抗体を、組換え技術などを使用して改変して、齧歯類の変異体、キメラ抗体、及びヒト化抗体などを作製してもよい。初期の抗体を作製するための他の方法が存在し、このような方法は当技術分野において知られている。しかしながら、次に、初期の抗体又はさらに初期の抗体の変異体を作製するために使用される方法と無関係に、非ヒト起源の任意の所与の抗体を、そのヒトらしさを増大させるように改変することができる。
本開示の抗体又は抗原結合断片は、コンビナトリアルライブラリーを使用して、所望の活性を有する抗体についてスクリーニングすることによって作製され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を有する抗体についてこのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野において知られている。このような方法は、一般に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に記載されている。例えば、目的の抗体を作製する１つの方法は、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３において記載されるファージ抗体ライブラリーの使用によるものである。
原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合された抗体可変領域（Ｆｖ）の様々な断片を提示するファージを含有するファージライブラリーをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリーは、所望の抗原に対する親和性クロマトグラフィーによりパンニングされる。所望の抗原に結合することができるＦｖ断片を発現するクローンは、抗原に吸着されるため、ライブラリーの非結合クローンから分離される。次に、結合クローンは、抗原から溶出され、追加の抗原吸着／溶出サイクルによってさらに濃縮され得る。本開示の抗体のいずれかは、目的のファージクローンについて選択するための好適な抗原スクリーニング手順を設計し、続いてＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３に記載される、目的とするファージクローンからのＦｖ配列及び好適な定常領域（Ｆｃ）配列を使用して完全長抗体クローンを構築することによって得ることができる。診断、治療、又は研究の目的かどうかにかかわらず、ヒト対象及びヒト細胞での使用にさらに好適になるように非ヒト抗体のヒトらしさを増大させることが有利であり得る。抗体を、治療薬として使用するために改変してもよい。このような抗体（抗体断片を含む）の例としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び完全ヒト抗体が挙げられる。キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体の作製のための多数の方法が、当技術分野に存在する。本開示の文脈では、ＶＨドメイン又はＶＬドメインのうちの少なくとも１つがヒト化されている場合、抗体はヒト化されていると見なされる。さらに、親非ヒト（例えば、マウス）抗体と比較して、ＦＲ領域の少なくとも１つの少なくとも一部のアミノ酸配列が、その部分のアミノ酸配列がヒト抗体又はヒトコンセンサス配列のものに相当するように改変されている場合、ＶＨドメイン又はＶＬドメインはヒト化されている。ある種の実施形態では、ＶＨドメインの少なくとも１つ、２つ、３つ、若しくは４つのＦＲ領域及び／又はＶＬドメインの少なくとも１つ、２つ、３つ、若しくは４つのＦＲ領域は、それらの配列がヒト配列とより密接に関連するように（全体又は一部が）改変されている。ある種の実施形態における前述のいずれかのために、ヒト若しくは非ヒトの軽鎖定常領域及び／又は重鎖定常領域（例えば、ＣＬ並びにＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３のドメインのうちの１つ以上を含む）の文脈において、ヒト化抗体断片が提供され得る。ある種の実施形態では、存在する場合、本開示のヒト化抗体又は抗原結合断片を、ヒトの軽鎖定常ドメイン及び／又は重鎖定常ドメインの文脈の中で提供する。本明細書で開示されるヒト化軽鎖可変ドメイン及び／又は重鎖可変ドメインのいずれかを組み合わせる抗体並びに抗体結合断片は、本開示の抗体及び抗原結合断片の典型である。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片はヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片はキメラである。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片はヒトのものである。
本開示のある種の実施形態によれば、ＦｃＲｎ受容体への抗体の結合を、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、増強するか又は減少させる１つ以上の変異を含むＦｃドメインを含む抗ＰＡＲ２抗体が提供される。例えば、本開示は、ＦｃドメインのＣＨ２又はＣＨ３領域における変異を含む抗ＰＡＲ２抗体を含み、ここで、その変異は、酸性環境において（例えば、ｐＨ範囲が約５．５〜約６．０にあるエンドソームにおいて）ＦｃＲｎへのＦｃドメインの親和性を増大させる。このような変異は、動物に投与される場合に抗体の血清半減期の増大をもたらす場合がある。このようなＦｃ改変の非限定的な例としては、例えば、２５０位（例えば、Ｅ若しくはＱ）；２５０位及び４２８位（例えば、Ｌ若しくはＦ）；２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／Ｗ若しくはＴ）、２５４位（例えば、Ｓ若しくはＴ）、及び２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／Ｄ若しくはＴ）での改変；又は４２８位及び／若しくは４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑ若しくはＫ）及び／若しくは４３４位（例えば、Ｈ／Ｆ又はＹ）での改変；又は２５０位及び／若しくは４２８位での改変；又は３０７位若しくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及び４３４位での改変が挙げられる。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２位、２５４位及び２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）の改変；２５０Ｑ及び４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）；並びに３０７位及び／又は３０８位の改変（例えば、３０８Ｆ又は３０８Ｐ）を含む。さらに別の実施形態では、改変は、２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）及び／又は２９７Ａ（例えば、Ｄ２９７Ａ）の改変を含む。前述のＦｃドメイン変異の可能な全ての組み合わせ、及び本明細書で開示される抗体可変ドメイン内の他の変異は、本開示の範囲内であると考えられる。いくつかの実施形態では、抗体は、三重変異Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（「ＴＭ」）を含む。ＴＭは、ヒトＣ１ｑ、ＣＤ６４、ＣＤ３２Ａ及びＣＤ１６へのヒトＩｇＧ１分子の結合活性の顕著な低減をもたらす。例えば、Ｏｇａｎｅｓｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６４：７００−７０４（２００８）を参照されたい。増大した半減期を有する抗体はまた、ＦｃとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与すると同定されたアミノ酸残基を改変することによって作製され得る。例えば、三重変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（「ＹＴＥ」）のヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＣＨ２ドメインへの導入は、ヒト新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのそれらの結合の増大をもたらす。内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０８３，７８４号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態では、抗体はＹＴＥ改変を含む。
本開示のある種の実施形態によれば、ＰＡＲ２への抗体の結合を、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、増強するか又は減少させるＶＨ及び／又はＶＬドメイン中の１つ以上の変異を含む抗ＰＡＲ２抗体が提供される。例えば、本開示は、ＶＨドメインのＣＤＲ２（配列番号４）若しくはＣＤＲ３（配列番号５）領域及び／又はＶＬドメインのＣＤＲ３（配列番号１０）中に変異を含む抗ＰＡＲ２抗体を含み、ここで、その変異は、１つ以上のアミノ酸をヒスチジンで置き換え、且つ酸性環境において（例えば、ｐＨ範囲が約５．５〜約６．０にあるエンドソームにおいて）ＰＡＲ２へのＶＨ及び／又はＶＬドメインの親和性を低減する。このような変異は、動物に投与される場合に抗体の血清半減期の増大をもたらす場合がある。このようなＶＨの改変の非限定的な例としては、例えば、ＣＤＲ２（配列番号４）のアミノ酸位置４、５、７、８、１０、１１、１２、１４、１５、１６、及び１７並びにＣＤＲ３（配列番号５）のアミノ酸位置１、２、４、５、及び７での改変が挙げられる。このようなＶＬの改変の非限定的な例としては、例えば、ＣＤＲ３（配列番号１０）の位置１、２、４、５、６、７、８、９、１２、及び１４での改変が挙げられる。さらに別の実施形態では、ＶＨは、ＣＤＲ２（配列番号４）の位置５、８、１２、１６、及び１７並びにＣＤＲ３（配列番号５）の位置２及び３での改変を含む。前述のＶＨ及びＶＬドメイン変異の可能な全ての組み合わせ、及び本明細書で開示されるＦｃドメイン内の他の変異は、本開示の範囲内であると考えられる。
いくつかの実施形態では、本開示は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、ＶＨは：ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１；ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するが、ヒスチジンが、配列番号４の１〜１７位（例えば、４位、５位、及び７〜１７位）に相当するアミノ酸位置のいずれか１つ以上で任意選択的に存在するＶＨ−ＣＤＲ２；及びｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を有するが、ヒスチジンが、配列番号５の１〜８位に相当するアミノ酸位置のいずれか１つ以上で任意選択的に存在するＶＨ−ＣＤＲ３を含み；且つＶＬは：ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１；ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２；及びｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するが、ヒスチジンが、配列番号１０の１〜１４位に相当するアミノ酸位置のいずれか１つ以上で任意選択的に存在するＶＬ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは：ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２、ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含み、且つＶＬは：ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２、ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原断片は、配列番号４の７位、８位、１２位、１５位、１６位、又は１７位のいずれか１つ以上に相当するアミノ酸位置でヒスチジンを有する。いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原断片は、配列番号５の２位又は３位のいずれか１つ以上に相当するアミノ酸位置でヒスチジンを有する。いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原断片は、配列番号１０の１位、５位、６位、又は１４位のいずれか１つ以上に相当するアミノ酸位置でヒスチジンを有する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、配列番号４の５位、８位、１２位、１６位、及び１７位に相当するアミノ酸位置に存在し；且つヒスチジンは、配列番号５の２位及び３位に相当するアミノ酸位置に存在する。いくつかの実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２は、配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４、１０４、１１４、１２４、１３４、１４４、１５４、１６４、１７４、１８４、１９４、２０４、２１４、２２４、２３４、２４４、２５４、２６４、２７４、２８４、２９４、３０４、３１４、３２４、３３４、３４４、３５４、３６４、３７４、３８４、３９４、４０４、４１４、４２４、４３４、４４４、４５４、４６４、４７４、４８４、４９４、５０４、５１４、５２４、５３４、５４４、５５４、５６４、５７４、５８４、５９４、６０４、６１４、６２４、６３４、６４４、６５４、６６４、６７４、６８４、６９４、７０４、７１４、７２４、７３４、７４４、７５４、７６４、７７４、７８４、７９４、及び８１１〜８１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ３は、配列番号５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５、１０５、１１５、１２５、１３５、１４５、１５５、１６５、１７５、１８５、１９５、２０５、２１５、２２５、２３５、２４５、２５５、２６５、２７５、２８５、２９５、３０５、３１５、３２５、３３５、３４５、３５５、３６５、３７５、３８５、３９５、４０５、４１５、４２５、４３５、４４５、４５５、４６５、４７５、４８５、４９５、５０５、５１５、５２５、５３５、５４５、５５５、５６５、５７５、５８５、５９５、６０５、６１５、６２５、６３５、６４５、６５５、６６５、６７５、６８５、６９５、７０５、７１５、７２５、７３５、７４５、７５５、７６５、７７５、７８５、７９５、及び８１９〜８２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ３は、配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０及び８００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２は、配列番号１４に相当するアミノ酸配列を含み；ここで、ＶＨ−ＣＤＲ３は、配列番号１５に相当するアミノ酸配列を含み、且つＶＬ−ＣＤＲ３は、配列番号２０に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２は、配列番号８１１に相当するアミノ酸配列を含み；ＶＨ−ＣＤＲ３は、配列番号８１９に相当するアミノ酸配列を含み、且つＶＬ−ＣＤＲ３は、配列番号１０又は２０に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２は、配列番号８１４に相当するアミノ酸配列を含み；ＶＨ−ＣＤＲ３は、配列番号８２０に相当するアミノ酸配列を含み、且つＶＬ−ＣＤＲ３は、配列番号１０又は２０に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２は、配列番号８１６に相当するアミノ酸配列を含み；ＶＨ−ＣＤＲ３は、配列番号１５に相当するアミノ酸配列を含み、且つＶＬ−ＣＤＲ３は、配列番号１０又は２０に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２は、配列番号８１８に相当するアミノ酸配列を含み；ＶＨ−ＣＤＲ３は、配列番号１５に相当するアミノ酸配列を含み、且つＶＬ−ＣＤＲ３は、配列番号１０又は２０に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８０３〜８０６とそれぞれ少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるフレームワーク領域を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号８０７〜８１０とそれぞれ少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるフレームワーク領域を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２、１１２、１２２、１３２、１４２、１５２、１６２、１７２、１８２、１９２、２０２、２１２、２２２、２３２、２４２、２５２、２６２、２７２、２８２、２９２、３０２、３１２、３２２、３３２、３４２、３５２、３６２、３７２、３８２、３９２、４０２、４１２、４２２、４３２、４４２、４５２、４６２、４７２、４８２、４９２、５０２、５１２、５２２、５３２、５４２、５５２、５６２、５７２、５８２、５９２、６０２、６１２、６２２、６３２、６４２、６５２、６６２、６７２、６８２、６９２、７０２、７１２、７２２、７３２、７４２、７５２、７６２、７７２、７８２、及び７９２からなる群から選択される配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、１２７、１３７、１４７、１５７、１６７、１７７、１８７、１９７、２０７、２１７、２２７、２３７、２４７、２５７、２６７、２７７、２８７、２９７、３０７、３１７、３２７、３３７、３４７、３５７、３６７、３７７、３８７、３９７、４０７、４１７、４２７、４３７、４４７、４５７、４６７、４７７、４８７、４９７、５０７、５１７、５２７、５３７、５４７、５５７、５６７、５７７、５８７、５９７、６０７、６１７、６２７、６３７、６４７、６５７、６６７、６７７、６８７、６９７、７０７、７１７、７２７、７３７、７４７、７５７、７６７、７７７、７８７、及び７９７からなる群から選択される配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１２に相当するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号１７に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８２１に相当するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号７又は１７に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８２４に相当するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号７又は１７に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８２７に相当するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号７又は１７に相当するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８３１に相当するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号７又は１７に相当するアミノ酸配列を含む。
本開示はまた、キメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む抗ＰＡＲ２抗体を含み、ここで、キメラＣＨ領域は、２つ以上の免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ領域に由来するセグメントを含む。例えば、本開示の抗体は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインの一部又は全てと組み合わせた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインの一部又は全てを含むキメラＣＨ領域を含み得る。ある種の実施形態によれば、本開示の抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣＨ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列（ＥＵナンバリングに従う２２８位〜２３６位のアミノ酸残基）と組み合わせた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵナンバリングに従う２１６位〜２２７位のアミノ酸残基）を含み得る。
ある種の実施形態によれば、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４の上部ヒンジに由来するアミノ酸残基及びヒトＩｇＧ２の下部ヒンジに由来するアミノ酸残基を含む。本明細書に記載されるキメラＣＨ領域を含む抗体は、ある種の実施形態において、抗体の治療上の特性又は薬物動態特性に悪影響を及ぼすことなく、改変されたＦｃエフェクター機能を示し得る。（例えば、米国特許出願公開第２０１５−０２０３５９１Ａ１号明細書を参照されたい）。
本開示は、ＰＡＲ２の１つ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＰＡＲ２抗体又は抗原結合断片を含む。抗体が結合し得るエピトープは、ＰＡＲ２の３個以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個又はそれ以上）のアミノ酸の単一の連続した配列からなり得る。あるいは、エピトープは、ＰＡＲ２の複数の非連続的なアミノ酸（又はアミノ酸配列）からなり得る。
当業者に知られる様々な技術を使用して、抗体がポリペプチド又はタンパク質内の「１つ以上のアミノ酸と相互作用」するかどうかを決定することができる。代表的な技術としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．，ＮＹ）に記載されるものなどの通例のクロスブロッキングアッセイ、アラニンスキャニング変異解析、ペプチドブロット解析（Ｒｅｉｎｅｋｅ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３−４６３）、及びペプチド切断解析が挙げられる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出及び抗原の化学修飾などの方法を採用することができる（Ｔｏｍｅｒ，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７−４９６）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することができる別の方法は、質量分析により検出される水素／重水素交換である。一般論として、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質を重水素標識した後、重水素標識タンパク質に抗体を結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移して、抗体によって保護された（重水素標識されたままの）残基を除く全ての残基で水素−重水素交換を発生させる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断及び質量分析にかけ、それによって、抗体が相互作用する特異的なアミノ酸に相当する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７ （２）：２５２−２５９；Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ−２６５Ａを参照されたい。
本開示はさらに、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片（例えば、配列番号１２及び１７のアミノ酸配列を含む抗体又は抗原結合断片）のいずれかと同じエピトープに結合する抗ＰＡＲ２抗体又はその抗原結合断片を含む。同様に、本開示はまた、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片（例えば、配列番号１２及び１７のアミノ酸配列を含む抗体又は抗原結合断片）のいずれかとＰＡＲ２への結合に関して競合する抗ＰＡＲ２抗体又は抗原結合断片を含む。当業者は、抗体が、参照抗ＰＡＲ２抗体と同じエピトープに結合するか、又はそれと結合に関して競合するかを、当技術分野で知られ、且つ本明細書に例示される通例の方法を使用することによって容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本開示の参照抗ＰＡＲ２抗体と同じエピトープに結合するかを決定するために、参照抗体をＰＡＲ２タンパク質に結合させる。次に、試験抗体のＰＡＲ２分子に結合する能力を評価する。参照抗ＰＡＲ２抗体との結合が飽和した後に試験抗体がＰＡＲ２に結合することができる場合、試験抗体は参照抗ＰＡＲ２抗体とは異なるエピトープに結合すると結論することができる。他方では、参照抗ＰＡＲ２抗体との結合が飽和した後に試験抗体がＰＡＲ２分子に結合することができない場合、試験抗体は、本開示の参照抗ＰＡＲ２抗体により結合されるエピトープと同じエピトープに結合し得る。次に、さらなる通例の実験（例えば、ペプチド変異及び結合解析）を実施して、観察された試験抗体の結合の欠如が、実際に参照抗体と同じエピトープに結合することによるものなのか、又は立体配置による遮断（又は別の現象）が観察された結合の欠如に関与するのかを確認することができる。この種の実験は、当技術分野で利用可能なＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、又は任意の他の定量的若しくは定性的抗体結合アッセイを用いて実施することができる。本開示のある種の実施形態によれば、例えば、１、５、１０、２０、又は１００倍過剰な一方の抗体が、競合結合アッセイにおいて測定される際に他方の結合を少なくとも５０％であるが好ましくは７５％、９０％あるいは９９％阻害する場合、２つの抗体は同じ（又は重複した）エピトープに結合する。（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５−１５０２を参照されたい）。
あるいは、本質的に、一方の抗体の結合を低減又は排除する抗原における全てのアミノ酸変異が他方の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は同じエピトープに結合すると見なされる。一方の抗体の結合を低減又は排除するアミノ酸変異のサブセットのみが他方の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は「重複するエピトープ」を有すると見なされる。
抗体が参照抗ＰＡＲ２抗体と結合に関して競合するか（又は結合に関して交差競合するか）を決定するために、上述の結合方法を２つの方針で実施する：第１の方針において、飽和条件下で参照抗体をＰＡＲ２タンパク質に結合させた後、ＰＡＲ２分子への試験抗体の結合を評価する。第２の方針において、飽和条件下で試験抗体をＰＡＲ２分子に結合させた後、ＰＡＲ２分子への参照抗体の結合を評価する。両者の方針において、第１の（飽和している）抗体のみがＰＡＲ２分子に結合することができる場合、試験抗体及び参照抗体は、ＰＡＲ２への結合に関して競合すると結論される。当業者に理解されるとおり、参照抗体と結合に関して競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合するというわけではないが、重複しているか又は隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的に遮断する場合がある。
完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を作製するための方法は、当技術分野で知られている。任意のそのような既知の方法を本開示の文脈において使用して、ヒトＰＡＲ２に特異的に結合するヒト抗体を作製することができる。
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術、例えば、又は完全ヒトモノクローナル抗体を作製するための任意の他の既知の方法を使用して、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有するＰＡＲ２に対して高親和性のキメラ抗体を最初に単離する。下の実験の節のとおり、抗体を特徴付けし、親和性、選択性、エピトープなどを含む所望の特徴について選択する。必要であれば、マウス定常領域を、所望のヒト定常領域、例えば、野生型又は改変ＩｇＧ１又はＩｇＧ４と置き換えて、完全ヒト抗ＰＡＲ２抗体を作製する。選択された定常領域は、特定の用途に従って変化し得るが、高親和性抗原結合及び標的特異性の特徴は可変領域に備わっている。特定の場合には、完全ヒト抗ＰＡＲ２抗体は、抗原陽性Ｂ細胞から直接的に単離される。
本開示の抗ＰＡＲ２抗体及び抗体断片は、記載された抗体のものから変化し得るが、ＰＡＲ２（例えば、配列番号８０１）、又はいくつかの実施形態においてより具体的には、ＰＡＲ２のテザーリガンド（例えば、配列番号８０２）に結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。このような変異体抗体又は抗体断片は、親配列と比較した場合にアミノ酸の１つ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、記載された抗体のものと本質的に等価な生物活性を示す。同様に、本開示の抗ＰＡＲ２抗体をコードするＤＮＡ配列は、記載された配列と比較した場合にヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、本開示の抗ＰＡＲ２抗体又は抗体断片と本質的に生物学的に同等な抗ＰＡＲ２抗体又は抗体断片をコードする配列を包含する。このような変異体のアミノ酸及びＤＮＡ配列の例は、上述されている。
２つの抗体又は抗原結合断片は、例えば、それらが、同様の実験条件、単回投与又は複数回投与のいずれかにおいて同じモル用量で投与されるときに、その吸収の速度及び程度が有意差を示さない薬学的等価物であるか又は薬学的な代替物である場合、生物学的に同等であると考えられる。一部の抗体又は抗原結合断片は、それらが、それらの吸収の程度は等価であるが、それらの吸収の速度は等価ではない場合にも等価物又は薬学的代替物であると考えられ、それでも、そのような吸収の速度の差は意図的なものであり、標識に反映され、例えば、長期の使用において有効な体内薬物濃度の達成のために必須ではなく、また、試験される特定の薬品に関して医学的に重要でないと考えられることが理由で、生物学的に同等であると考えられ得る。
いくつかの実施形態では、２つの抗体又は抗原結合断片は、それらの安全性、純度、及び力価に臨床的に意味のある差がない場合、生物学的に同等である。
いくつかの実施形態では、２つの抗体又は抗原結合断片は、患者に対して、参照物と当該生物学的製品の切り換えを伴わない継続療法と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化又は有効性の減弱を含めた有害作用のリスクの上昇が予測されることなくそのような切り替えを１回以上行うことができる場合、生物学的に同等である。
いくつかの実施形態では、２つの抗体又は抗原結合断片は、それらの両方が使用する条件について共通の作用機構によって、そのような作用機構が知られる限りにおいて、作用する場合、生物学的に同等である。
生物学的同等性は、インビボ及びインビトロにおける方法によって実証され得る。生物学的同等性の測定としては、例えば、（ａ）血液、血漿、血清、又は他の生体液において、抗体又はその代謝産物の濃度を時間の関数として測定する、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ試験；（ｂ）ヒトのインビボでの生物学的利用能データと相関し、その合理的な予測であるインビトロ試験；（ｃ）抗体（又はその標的）の適切な急性の薬理学的効果を時間の関数として測定する、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ試験；及び（ｄ）抗体の安全性、有効性、又は生物学的利用能若しくは生物学的同等性を確立する、十分に管理された臨床試験が挙げられる。
本開示の抗ＰＡＲ２抗体の生物学的に同等な変異体は、例えば、残基若しくは配列の種々の置換を行うこと、又は生物活性に必要ではない末端若しくは内部の残基若しくは配列を欠失させることによって構築され得る。例えば、生物活性に必須ではないシステイン残基を欠失させるか又は他のアミノ酸と置き換えて、復元の際に不必要な又は適正でない分子内ジスルフィド架橋が形成されるのを予防することができる。他の状況では、生物学的に同等な抗体又は抗原結合断片は、抗体又は抗原結合断片のグリコシル化特性を改変するアミノ酸の変化、例えば、グリコシル化を排除又は除去する変異を含む抗ＰＡＲ２抗体変異体を含み得る。
ある種の実施形態によれば、本開示は、ヒトＰＡＲ２に結合するが他の種に由来するＰＡＲ２に結合しない抗ＰＡＲ２抗体又は抗原結合断片を提供する。本開示はまた、ヒトＰＡＲ２に結合し、且つ１種以上の非ヒト種に由来するＰＡＲ２に結合する抗ＰＡＲ２抗体を含む。例えば、本開示の抗ＰＡＲ２抗体は、ヒトＰＡＲ２に結合してもよく、且つ場合によって、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、雌ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル又はチンパンジーのＰＡＲ２のうち１つ以上に結合しても、結合しなくてもよい。ある種の実施形態によれば、抗体又は抗原結合断片は、ヒトＡ５４９細胞、ラットＫＮＲＫ細胞、カニクイザルＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞又はマウスＬＬ／２細胞におけるＰＡＲ２に結合する。
本開示は、細胞毒、化学療法薬、免疫抑制剤又は放射性同位体などの治療用成分とコンジュゲートした抗ＰＡＲ２モノクローナル抗体（「免疫複合体」）を包含する。免疫複合体を形成するための好適な細胞傷害性薬剤及び化学療法薬剤の例は当技術分野で知られている（例えば、国際公開第０５／１０３０８１号パンフレットを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、単一特異性、二重特異性、又は多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、又は２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９；Ｋｕｆｅｒ ｅｉ ａ／．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８−２４４を参照されたい。本開示の抗ＰＡＲ２抗体又は抗原結合断片は、別の機能性分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質と結合又は共発現され得る。例えば、抗体又はその抗原結合断片は、第２の結合特異性を有する二重特異性抗体又は多重特異性抗体を生成するための別の抗体又は抗原結合断片などの、１つ以上の他の分子実体に機能的に結合され得る（例えば、化学結合、遺伝子融合、非共有結合的な会合又はその他の様式により）。例えば、本開示は二重特異性抗体を含み、ここで免疫グロブリンの一方のアームは、ヒトＰＡＲ２又はその断片に特異的であり、且つ免疫グロブリンの他方のアームは第２の治療標的に特異的であるか、又は治療用成分にコンジュゲートされる。
本開示の文脈において使用することができる例示的な二重特異性抗体又は抗原結合断片フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメイン及び第２のＩｇ ＣＨ３ドメインの使用を含み、ここで、第１及び第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸により互いに異なり、少なくとも１つのアミノ酸の相違が、アミノ酸の相違のない二重特異性抗体と比較して、プロテインＡに対する二重特異性抗体の結合を低減する。一実施形態では、第１のＩｇ ＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合し、且つ第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を低減又は消失させる変異を含有する。第２のＣＨ３はさらに、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）を含む。第２のＣＨ３内に見出され得るさらなる改変としては：ＩｇＧ１抗体の場合Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２Ｉ）；並びにＩｇＧ４抗体の場合Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ）が挙げられる。上記の二重特異性抗体フォーマットの変形形態は、本開示の範囲内であると考えられる。
本開示の文脈において使用することができる他の例示的な二重特異性フォーマットとしては、限定されるものではないが、例えば、ｓｃＦｖ系又はダイアボディ二重特異性フォーマット、ＩｇＧ−Ｆｖ融合物、二重の可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、クアドローマ、ノブ・イントゥ・ホール、共通の軽鎖（例えば、ノブ・イントゥ・ホールなどを伴う共通の軽鎖）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ｂｏｄｙ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用性Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ、及びＭａｂ＜２＞二重特異性フォーマット（例えば、前述のフォーマットの確認のために、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ ４：６，１−１１、及びそこで引用される参考文献を参照されたい）。二重特異性抗体又は抗原結合断片はまた、ペプチド／核酸コンジュゲーションを用いて構築することができ、例えば、直交する化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して、後に既定の組成、結合価、及び形状を有する多量体複合体へと自己組織化する部位特異的抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを生成する。（例えば、Ｋａｚａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃ ｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：Ｄｅｃ．４，２０１２］を参照されたい）。
Ｃ．核酸及び発現系
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で開示される抗原結合断片の抗体のいずれかを発現することが可能な核酸を提供する。核酸は、単鎖又は二重鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり得る。さらなる実施形態では、抗体又は抗原結合断片の核酸配列は、単離された核酸配列、組換え核酸配列、及び／又は異種ヌクレオチド配列と融合された核酸配列、又はＤＮＡライブラリー中の核酸配列であり得る。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、１１１、１２１、１３１、１４１、１５１、１６１、１７１、１８１、１９１、２０１、２１１、２２１、２３１、２４１、２５１、２６１、２７１、２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４８１、４９１、５０１、５１１、５２１、５３１、５４１、５５１、５６１、５７１、５８１、５９１、６０１、６１１、６２１、６３１、６４１、６５１、６６１、６７１、６８１、６９１、７０１、７１１、７２１、７３１、７４１、７５１、７６１、７７１、７８１、及び／又は７９１のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、１１６、１２６、１３６、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、１９６、２０６、２１６、２２６、２３６、２４６、２５６、２６６、２７６、２８６、２９６、３０６、３１６、３２６、３３６、３４６、３５６、３６６、３７６、３８６、３９６、４０６、４１６、４２６、４３６、４４６、４５６、４６６、４７６、４８６、４９６、５０６、５１６、５２６、５３６、５４６、５５６、５６６、５７６、５８６、５９６、６０６、６１６、６２６、６３６、６４６、６５６、６６６、６７６、６８６、６９６、７０６、７１６、７２６、７３６、７４６、７５６、７６６、７７６、７８６、及び／又は７９６のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、核酸は、配列番号１、６、１１及び／又は１６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
ある種の実施形態では、抗体又は抗原結合断片をコードする核酸はまた、上記の抗体又は抗原結合断片のいずれかをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列、又はその相補配列に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２、１１２、１２２、１３２、１４２、１５２、１６２、１７２、１８２、１９２、２０２、２１２、２２２、２３２、２４２、２５２、２６２、２７２、２８２、２９２、３０２、３１２、３２２、３３２、３４２、３５２、３６２、３７２、３８２、３９２、４０２、４１２、４２２、４３２、４４２、４５２、４６２、４７２、４８２、４９２、５０２、５１２、５２２、５３２、５４２、５５２、５６２、５７２、５８２、５９２、６０２、６１２、６２２、６３２、６４２、６５２、６６２、６７２、６８２、６９２、７０２、７１２、７２２、７３２、７４２、７５２、７６２、７７２、７８２、及び７９２のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、１２７、１３７、１４７、１５７、１６７、１７７、１８７、１９７、２０７、２１７、２２７、２３７、２４７、２５７、２６７、２７７、２８７、２９７、３０７、３１７、３２７、３３７、３４７、３５７、３６７、３７７、３８７、３９７、４０７、４１７、４２７、４３７、４４７、４５７、４６７、４７７、４８７、４９７、５０７、５１７、５２７、５３７、５４７、５５７、５６７、５７７、５８７、５９７、６０７、６１７、６２７、６３７、６４７、６５７、６６７、６７７、６８７、６９７、７０７、７１７、７２７、７３７、７４７、７５７、７６７、７７７、７８７、及び７９７のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシーの条件が変更され得ることを容易に理解するであろう。例えば、約４５℃の６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でハイブリダイゼーションを実施した後に、５０℃における２．０×ＳＳＣでの洗浄を実施し得る。例えば、洗浄工程の塩濃度は、５０℃における約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃における約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択され得る。加えて、洗浄工程の温度は、室温（約２２℃）での低ストリンジェンシー条件から約６５℃での高ストリンジェンシー条件まで上昇され得る。温度及び塩の両方が変更されても、他の可変要素が変えられる一方で温度又は塩濃度が一定に保たれてもよい。一実施形態では、本開示は、室温における６×ＳＳＣの後の室温における２×ＳＳＣでの洗浄の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
遺伝暗号の縮重のために抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸とは異なっている単離された核酸も本開示の範囲内である。例えば、いくつかのアミノ酸が２つ以上のトリプレットによって示される。同じアミノ酸を指定するコドン、すなわちシノニム（例えば、ＣＡＵ及びＣＡＣは、ヒスチジンのシノニムである）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異をもたらし得る。しかしながら、対象タンパク質のアミノ酸配列の変化につながるＤＮＡ配列多型が哺乳動物細胞間に存在すると予想される。特定のタンパク質をコードする核酸の１つ以上のヌクレオチド（ヌクレオチドの最大約３〜５％）のこれらの変異が、天然の対立遺伝子変異のため所与の種の個体間に存在し得ることを、当業者は理解するであろう。任意の及び全てのこのようなヌクレオチド変異体及び結果として生じるアミノ酸多型が本開示の範囲内である。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で開示される核酸のいずれかを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。
本開示の抗体が全長抗体又は抗原結合断片である場合と無関係に、本開示の抗体及び抗原結合断片を、細胞株中で組換え発現させることができる。これらの実施形態では、特定の抗体又は抗原結合断片をコードする配列を、哺乳動物宿主細胞又は酵母宿主細胞などの好適な宿主細胞の形質転換のために使用することができる。これらの実施形態によれば、例えば、ウイルス（又はウイルスベクター内）へのポリヌクレオチドのパッケージング及びウイルス（又はベクター）を使用するか又は当技術分野で知られるトランスフェクション手順による宿主細胞への形質導入を含む、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための任意の既知の方法を使用して、形質転換を行うことができる。一般に、使用される形質転換手順は、形質転換される宿主に依存し得る。哺乳動物細胞に異種ポリヌクレオチドを導入するための方法は当技術分野でよく知られており、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチドのカプセル化、及び核内へのＤＮＡの直接微量注入が含まれるが、これらに限定されない。
本開示のある種の実施形態によれば、重鎖定常領域（全て又は一部）、本開示の重鎖可変領域、軽鎖定常領域、又は本開示の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子は、標準的なライゲーション技術を使用して適切な発現ベクターに挿入される。好ましい実施形態では、重鎖定常領域又は軽鎖定常領域が適切な可変領域のＣ末端に付加され、発現ベクターに結合される。ベクターは通常、使用される特定の宿主細胞中で機能的である（すなわち、遺伝子の増幅及び／又は遺伝子発現が起こり得るように宿主細胞機構にベクターが適合する）ように選択される。発現ベクターの概説については、Ｇｏｅｄｄｅｌ（ｅｄ．），１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｎ．Ｙ．を参照されたい。抗体発現の文脈において、重鎖及び軽鎖の両方は同じベクターから（例えば、同じベクター上に存在する同じ又は異なるプロモーターから）発現されてもよいし、重鎖及び軽鎖は異なるベクターから発現されてもよい。ある種の実施形態では、重鎖及び軽鎖は、同じ宿主細胞にトランスフェクトされ、共発現される異なるベクターから発現される。重鎖及び軽鎖が同じ宿主細胞中の同じ又は異なるベクターから発現される場合と無関係に、その際鎖は、抗体（又は抗体断片、発現されている重鎖及び軽鎖部分に依存する）を形成するように会合することができる。
通常、宿主細胞のいずれかにおいて使用される発現ベクターは、プラスミドの維持並びに外来性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列を含有することになる。このような配列は、ある種の実施形態において、一括して「隣接配列」と呼ばれ、通常、以下のヌクレオチド配列のうち１つ以上を含むことになる：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナースプライス部位及びアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、及び選択マーカー配列。これらのベクター部分はよく知られており、タンパク質の発現のために選択及び使用することができる一般的に利用可能なベクターが多数存在する。所望の宿主細胞及び適用に基づいてベクターを容易に選択することができる。
複製起点は通常、市販の原核生物発現ベクターの一部であり、その起点は、宿主細胞中のベクターの増幅に役立つ。選択されるベクターが複製起点部位を含有しない場合、既知の配列に基づいて化学合成され、ベクターに結合され得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ）に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に好適であり、種々のウイルスの起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｕｓ）ウイルス（ＶＳＶ）、又はＨＰＶ若しくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターに必要ではない（例えば、ＳＶ４０の起点は、それがウイルス初期プロモーターも含有しているという理由でのみ利用されることが多い）。
本開示の発現ベクター及びクローニングベクターは通常、宿主生物によって認識され、重鎖及び／又は軽鎖をコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含有することになる。プロモーターは、構造遺伝子（一般に、約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンの上流（すなわち、５’側）に位置し、構造遺伝子の転写を制御する非転写配列である。プロモーターは通常、２つのクラス：誘導性プロモーター及び構成的プロモーターのうちの１つに分類される。誘導性プロモーターは、栄養素の有無又は温度変化などの培養条件のいくらかの変化に応答してそれらの制御下でＤＮＡからの転写レベルの上昇を惹起する。他方では、構成的プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を惹起する；すなわち、遺伝子発現をほとんど又は全く制御しない。種々の潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターがよく知られている。好適なプロモーターは、本開示の抗体又は抗原結合断片を含む重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ある種の実施形態では、同じプロモーターが、重鎖及び軽鎖の両方のために使用される。他の実施形態では、異なるプロモーター（同じ又は異なるベクター上に存在する）がそれぞれのために使用される。
酵母宿主との使用に好適なプロモーターも当技術分野でよく知られている。酵母エンハンサーを、酵母プロモーターとともに使用することが有利である。哺乳動物宿主細胞との使用に好適なプロモーターがよく知られており、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉種ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが挙げられる。
関心が持たれ得るさらなるプロモーターとしては：ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの長い３’末端反復配列中に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１４４４−４５）；メタロチオニン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３１）；又はｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５）が挙げられるが、これらに限定されない。組織特異性を示し、且つトランスジェニック動物で利用されている以下の動物転写調節領域も興味深い：膵腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵β細胞で活性なインスリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−２２）；リンパ球系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−４４）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ球系細胞及びマスト細胞で活性なマウス乳癌ウイルス調節領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−９５）；肝臓で活性なアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓で活性なα−フェトタンパク質遺伝子調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）；肝臓で活性なα１−抗トリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄系細胞で活性なβ−グロビン遺伝子調節領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳内の乏突起膠細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−１２）；骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−８６）；及び視床下部で活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−７８）。
ベクターはまた、軽鎖又は重鎖をコードするＤＮＡの転写を増加させるためのエンハンサー配列を含んでもよい。
本開示の発現ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築され得る。このようなベクターは、所望の隣接配列の全てを含有しても、含有しなくてもよい。本明細書中に記載される隣接配列の１つ以上がベクター中に事前に存在しない場合、それらを個別に入手し、ベクターに結合してもよい。隣接配列の各々を得るために使用される方法は、当業者によく知られている。
ベクターを構築し、本開示の抗体又は抗原結合断片を含む軽鎖若しくは重鎖又は軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子をベクターの適切な部位に挿入した後、完全なベクターが増幅及び／又はポリペプチド発現に好適な宿主細胞に挿入され得る。選択された宿主細胞への発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、微量注入、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、又は他の既知の技術を含む、よく知られる方法によって行われ得る。選択される方法は、部分的には、使用される宿主細胞の種類に応じることになる。これらの方法及び他の好適な方法は、当業者によく知られている。
宿主細胞は、適切な条件下で培養した場合、本開示の抗体又は抗原結合断片を合成し、続いてそれを培養液から回収することができるか（宿主細胞がそれを培地中に分泌する場合）、又はそれを産生する宿主細胞から直接回収することができる（それが分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性のために望ましいか又は必要なポリペプチド修飾（グリコシル化又はリン酸化など）、及び生物学的に活性な分子への折りたたみの容易さなどの種々の要因に依存することになる。
発現のための宿主細胞として利用可能な哺乳動物細胞株は当技術分野でよく知られており、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、及び多数の他の細胞株が含まれるが、これらに限定されないアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）から利用可能な多数の不死化細胞株を含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、自身の抗体を作製しないが、異種抗体（例えば、マウス骨髄腫細胞株ＮＳ０及びＳＰ２／０）を作製及び分泌する能力を有するＢ細胞系列由来の細胞株を選択してもよい。他の実施形態では、酵母細胞株（例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ））などの哺乳動物細胞以外の細胞が使用される。
ある種の実施形態では、細胞株は、本開示の抗体又は抗原結合断片を安定に発現する。他の実施形態では、細胞は、本開示の抗体又は抗原結合断片を一過性に発現する。
Ｄ．治療用製剤及び投与
本開示は、本開示の抗ＰＡＲ２抗体又はその抗原結合性断片を含む医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物は、好適な担体、賦形剤、及び移行、送達、耐性の向上をもたらす他の薬剤などを用いて製剤化される。多数の適切な製剤を全ての薬剤師に知られる処方集において見出すことができる：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ。これらの製剤としては、例えば、散剤、ペースト剤、軟膏剤、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）を含有する小胞（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡなど）、無水吸収ペースト剤、水中油型エマルジョン及び油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカーボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌらの”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８−３１ １も参照されたい。
患者に投与される抗体の用量は、患者の年齢及び体格、標的疾患、病態、投与経路などに応じて変動し得る。好ましい用量は通常、体重又は体表面積に応じて算出される。病態の重症度に応じて、治療の頻度及び持続時間を調整することができる。抗ＰＡＲ２抗体又は抗原結合断片を投与するための有効な投与量及びスケジュールは経験的に決定することができる。例えば、患者の進行を周期的な評価によってモニタリングし、それに応じて用量を調整することができる。さらに、投与量の種間スケーリングを、当技術分野でよく知られる方法を用いて実施することができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。
種々の送達系、例えば、リポソーム中の封入、微小粒子、マイクロカプセル、変異体ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスが知られており、本開示の医薬組成物を投与するために使用することができる（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照されたい）。導入の方法としては、皮内、髄腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、任意の好都合な経路によって、例えば、点滴又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚の内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を通じた吸収によって投与されてもよく、且つ他の生物学的に活性な薬剤と合わせて投与されてもよい。投与は全身的又は局所的であってもよい。
いくつかの実施形態では、抗体及びその抗原結合断片は、中枢神経系と関連付けられた、及び特に脳と関連付けられた病態及び障害の治療の際に有用性を有する。抗体又は抗原結合断片などの高分子を対象の脳に投与する場合に様々な要因、すなわち、抗体又は抗原結合断片が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する能力を考慮しなければならないが、当業者は、このような高分子を脳に投与する方法を認識している。例えば、いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、抗体又は抗原結合断片がＢＢＢを越えて内部移行する可能性を増大させるために、ヘキサメチレンジアミン又はテトラメチレンジアミンなどの１つ以上のカチオン性ポリアミンにより共有結合的に修飾される。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、二重特異性抗体又は抗原結合断片であり、抗体又は断片はＰＡＲ２を標的化し、且つＢＢＢを越える輸送を促進する受容体（例えば、トランスフェリン受容体、インスリン受容体及びＴＭＥＭ３０Ａ）もまた標的化する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ＢＢＢを越える輸送を促進する受容体（例えば、トランスフェリン受容体、インスリン受容体及びＴＭＥＭ３０Ａ）を標的化する薬剤にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＢＢＢは、抗体又は断片の投与の前又は投与中に一時的に破綻させられる。いくつかの実施形態では、ＢＢＢは、超音波、放射線、生化学的処理（例えば、ＮＳ−１６１９などのＫＣａ受容体アゴニストによる）、又は濃縮された高浸透圧性溶液の動脈内注入によって一時的に破綻させられる。
本開示の医薬組成物は、標準的な針及び注射器により皮下又は静脈内に送達され得る。加えて、皮下送達に関しては、ペン型送達デバイスが本開示の医薬組成物の送達に容易に適用される。そのようなペン型送達デバイスは、再使用可能又は使い捨てであり得る。再使用可能なペン型送達デバイスには、一般に、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジが利用される。カートリッジ内の医薬組成物の全てが投与され、カートリッジが空になったら、空のカートリッジを即座に廃棄し、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。続いて、ペン型送達デバイスを再使用することができる。使い捨てペン型送達デバイスでは、交換可能なカートリッジはない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスにはデバイス内のレザバー中に保持された医薬組成物が予め充填されている。医薬組成物がなくなりレザバーが空になったら、デバイス全体を廃棄する。
多数の再使用可能なペン型及び自己注射器送達デバイスが本開示の医薬組成物の皮下送達に適用される。例としては、ほんの数例を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｒｇｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、並びにＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の医薬組成物の皮下送達に適用される使い捨てペン型送達デバイスの例としては、ほんの数例を挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自己注射器（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）、及びＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ ＩＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。
一定の状況では、医薬組成物を制御放出系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用してもよい（Ｌａｎｇｅｒ，上掲；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる；Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。さらに別の実施形態では、制御放出系を組成物の標的の近傍に置くことができ、したがって、全身用量のほんの一部のみが必要になる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，上掲，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８を参照されたい）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３による概説において考察されている。
注射用製剤としては、静脈内、皮下、髄腔内、皮内及び筋肉内注射、点滴注入などのための剤形を挙げてもよい。これらの注射用製剤は、公知の方法によって調製され得る。例えば、注射用製剤は、例えば、注射剤に従来使用されている滅菌水性媒体又は油性媒体に上記の本明細書で開示される抗体若しくは抗原結合断片又はその塩のいずれかを溶解するか、懸濁させるか又は乳化させることによって調製され得る。注射剤のための水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の補助剤を含有する等張溶液などがあり、これらは、適切な可溶化剤、例えばアルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加体）］などと併用されることもある。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが使用され、これらは、可溶化剤、例えば安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用されることもある。このようにして調製された注射剤は、適切なアンプルに充填されることが好ましい。
上記の経口又は非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量に適合させるのに適した単位用量の剤形に調製することが有利である。そのような単位用量の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含有される上述の抗体の量は、一般に、単位用量の剤形当たり約５〜約５００ｍｇであり；特に、上述の抗体又は抗原結合断片は、注射剤の形態では約５〜約１００ｍｇで、及び他の剤形では約１０〜約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
Ｅ．抗体の治療的使用
本明細書に記載される方法のいずれかについて、本開示は、本開示の抗体又は抗原結合断片のいずれかの使用を企図する。
いくつかの実施形態では、本開示は、望ましくない且つ／又は異常なＰＡＲ２活性が関与する対象における障害を治療する方法であって、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片のいずれかを投与することを含む方法を提供する。本明細書で使用する場合、「障害」、「病態」及び「疾患」は互換的に使用され、本明細書で開示される障害、病態又は疾患のいずれかを指す。いくつかの実施形態では、望ましくない且つ／又は異常なＰＡＲ２活性が関与する疾患／障害／病態は、異常な又は望ましくない炎症と関連付けられた疾患／障害／病態である。異常な又は望ましくないＰＡＲ２活性が関与する疾患／障害／病態の例としては、急性又は慢性疼痛、急性又は慢性掻痒、急性又は慢性炎症（例えば、関節、肺、脳、胃腸管、歯周組織、皮膚、及び血管系の急性又は慢性炎症）、自己免疫障害、歯周炎、変形性関節症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬、肥満症、糖尿病、心血管疾患、膵炎、癌（例えば、乳癌、肺癌、大腸癌、胃癌又は前立腺癌）、喘息、線維症、胃潰瘍、線維症又は線維性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、収縮皮膚炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、糸球体腎炎、及び髄膜炎が挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示は、代謝症候群、又は内臓脂肪沈着、高血圧、グルコースとインスリンの恒常性の異常、インスリン抵抗性、内皮損傷、心血管肥大、炎症、血管炎症、アテローム硬化症、心室収縮不全、線維症及び脂肪肝疾患などの１つ以上の代謝症候群と関連付けられた病態を有する対象を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、疼痛、例えば本明細書で開示される疾患／障害／病態のいずれかと関連付けられた疼痛（例えば、骨関節炎疼痛）を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
いくつかの実施形態では、本開示は、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）とＰＡＲ２との相互作用を妨げる方法であって、本明細書で記載される抗体又は抗原結合断片のいずれかを細胞に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＡＲ２のテザーリガンドの細胞上での露出を阻害する方法であって、本明細書で記載される抗体又は抗原結合断片のいずれかを細胞に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＡＲ２のテザーリガンドとＰＡＲ２タンパク質の第２の膜貫通ループとの相互作用を阻害する方法であって、本明細書で記載される抗体又は抗原結合断片のいずれかを細胞に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞上のＰＡＲ２受容体の活性化を阻害する方法であって、本明細書で記載される抗体又は抗原結合断片のいずれかを細胞に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は神経（例えば、感覚神経）である。いくつかの実施形態では、細胞はインビトロにある。他の実施形態では、細胞は対象中にある。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、本明細書で開示される障害のいずれかに罹患している。
本明細書に記載される方法のいずれかについて、本開示は、１つの方法の任意の１つ又は複数の工程と別の方法からの任意の１つ又は複数の工程の組み合わせを企図する。これらの方法は、有効量の特定の疾患又は病態に適切な本開示の化合物を、それを必要とする個体に投与することを含む。特定の実施形態では、これらの方法は、本明細書で開示される抗体又は抗原結合断片のいずれかを、それを必要とする対象の細胞に送達することを含む。
用語「治療」、「治療する」、「緩和」などは、本明細書中で、一般に所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味するために使用され、これらはまた、治療されている病態の１つ以上の症状の重症度を改善、緩和、及び／又は低減することを指すために使用され得る。効果は、疾患、病態、又はその症状の発生又は再発の完全な又は部分的な遅延の観点からは予防的であり得、且つ／又は疾患若しくは病態及び／又は疾患若しくは病態に寄与する有害作用の部分的又は完全な治癒の観点からは治療的であり得る。「治療」は、本明細書で使用する場合、哺乳動物、特に、ヒトの疾患又は病態の任意の治療を包含し、（ａ）疾患又は病態にかかりやすいかもしれないが依然として罹患していると診断されていない対象において疾患又は病態の発症を予防すること；（ｂ）疾患又は病態を抑制すること（例えば、その発症の抑止）；又は（ｃ）疾患又は病態を軽減すること（例えば、疾患又は病態の退行をもたらすこと、１つ以上の症状の改善をもたらすこと）のいずれか１つ以上を含む。例えば、疼痛（例えば、骨関節炎疼痛）の「治療」は、治療される対象における疼痛症状の低減、抑止、緩和又は除去を含む。当該疾患について当該方法により治療される対象の集団は、望ましくない病態又は疾患に罹患している対象、及び病態又は疾患の発症のリスクのある対象を含む。
本明細書に記載される方法のいずれかについて、本開示は、本願を通して記載される抗体又は抗原結合断片のいずれかの使用を企図する。加えて、本明細書に記載される方法のいずれかについて、本開示は、１つの方法の任意の１つ又は複数の工程と別の方法からの任意の１つ又は複数の工程の組み合わせを企図する。
ある種の実施形態では、本発明は、本明細書で開示される疾患／病態／障害、例えば、急性又は慢性疼痛（例えば、骨関節炎疼痛）のいずれかと関連付けられた病態を治療する方法を提供する。これらの方法は、治療有効量の上記の抗体又は抗原結合断片のいずれかを個体に投与することを含む。これらの方法は特に、動物、より具体的にはヒトの治療的及び予防的治療を目指している。本開示は、前述の態様及び実施形態のいずれかの全ての組み合わせ、並びに発明を実施するための形態及び実施例に記載される実施形態のいずれかとの組み合わせを企図する。
用語「治療有効用量」は、投与の目的となる所望の効果をもたらす用量を意味する。正確な用量は、治療の目的に依存することになり、既知の技術を使用して当業者によって確認可能である（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照されたい）。
ある種の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片のいずれかは、単独で又は本明細書で開示される疾患／病態／障害、例えば、急性若しくは慢性疼痛（例えば、骨関節炎疼痛）のいずれかを治療するための１つ以上の追加の化合物若しくは療法と組み合わせて投与され得る。例えば、本明細書で開示される抗体又は抗原結合断片のいずれかは、１つ以上の治療用化合物とともに同時投与され得る。同時投与が示される場合、併用療法は、同時又は交互投与を包含し得る。加えて、併用は、急性又は慢性投与を包含し得る。任意選択により、抗体／抗原結合断片及び追加の化合物は、本明細書で開示される疾患／病態／障害、例えば、急性又は慢性疼痛（例えば、骨関節炎疼痛）のいずれかを治療するために相加的又は相乗的な様式で作用する。併用療法において使用される追加の化合物としては、小分子、ポリペプチド、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びｓｉＲＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、追加の化合物は、抗炎症剤、鎮痛剤、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド、ヒアルロン酸、アセトアミノフェン、コデイン、ローセット、ロータブ、バイコジン、ヒドロコドン、モルヒネ、オキシコンチン、ロキシコドン、パーコセット、アスピリン、セレコキシブ、プレガバリン、関節固定、関節置換、アバタセプト、アダリムマブ、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、トシリズマブ及びトファシチニブのいずれか１つ以上である。併用療法の性質に依存して、本開示の抗体又は抗原結合開示の投与は、他の療法が投与されている間及び／又はその後、継続され得る。抗体又は抗原結合断片の投与は、単回投与又は複数回投与でなされ得る。いくつかの例では、抗体又は抗原結合断片の投与は、他の療法の少なくとも数日前に開始されるが、その他の例では、投与は、他の療法の投与の直前又は投与時のいずれかに開始される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される追加の化合物のいずれかは、本明細書で開示される抗体又は抗原結合断片のいずれかにコンジュゲートされる。
併用療法の別の例では、本開示の抗体又は抗原結合断片のいずれかは、１つ以上の追加の治療モダリティと組み合わせた治療レジメンの一部として使用することができる。一例として、このような他の治療モダリティは、食事療法、作業療法、理学療法、精神療法、マッサージ、刺鍼術、指圧、移動補助具、介助動物などを含むが、これらに限定されない。
本明細書で開示される抗体又は抗原結合断片は他の療法と組み合わせて使用することができるが、ある種の実施形態では、抗体又は抗原結合断片が、療法の唯一の形態として提供されることに留意されたい。単独で投与されるか又は他の薬物若しくは治療レジメンと組み合わせて投与されるかに関係なく、抗体又は抗原結合断片の用量、頻度、投与経路、及び投与のタイミングは、患者の病態及び必要性に基づいて医師により決定される。
本開示のある種の実施形態によれば、抗ＰＡＲ２抗体又はその抗原結合断片（又は抗ＰＡＲ２抗体と本明細書に記載される追加の療法のいずれかとの組み合わせを含む医薬組成物）の複数の用量が、既定の時間経過にわたって対象に投与され得る。本開示のこの態様による方法は、本開示の抗ＰＡＲ２抗体又は抗原結合断片の複数の用量を対象に逐次的に投与することを含む。本明細書で使用する場合、「逐次的に投与する」は、抗ＰＡＲ２抗体又は抗原結合断片の各用量が、異なる時点で、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週又は数ヶ月）によって隔てられた異なる日に対象に投与されることを意味する。本開示は、抗ＰＡＲ２抗体又は抗原結合断片の単一の初回用量に続いて、抗ＰＡＲ２抗体又は抗原結合断片の１用量以上の第２の用量、任意選択によりその後、抗ＰＡＲ２抗体又は抗原結合断片の１用量以上の第３の用量を患者に逐次的に投与することを含む方法を含む。
用語「初回用量」、「第２の用量」、及び「第３の用量」は、本開示の抗ＰＡＲ２抗体又は抗原結合断片の投与の時系列を指す。したがって、「初回用量」は、治療レジメンの開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも呼ばれる）であり；「第２の用量」は、初回用量後に投与される用量であり；「第３の用量」は、第２の用量後に投与される用量である。初回、第２、及び第３の用量は全て、同量の抗ＰＡＲ２抗体又は抗原結合断片を含有することもあるが、一般に、投与の頻度に関して互いに異なり得る。しかしながら、ある種の実施態様では、初回、第２、及び／又は第３の用量に含有される抗ＰＡＲ２抗体又は抗原結合断片の量は、治療経過中、互いに変化する（例えば、適宜、上方調整又は下方調整される）。ある種の実施態様では、２以上の（例えば、２、３、４、又は５）用量が、治療レジメンの開始時に「ローディング用量」として、その後、より低い頻度で投与される後続の用量（例えば、「維持用量」）として投与される。
Ｆ．抗体又は抗原結合断片の診断上の／他の使用
本開示の抗ＰＡＲ２抗体はまた、試料において、例えば、診断目的で、ＰＡＲ２又はＰＡＲ２発現細胞を検出し且つ／又は測定するために使用され得る。例えば、抗ＰＡＲ２抗体、又はその抗原結合断片は、ＰＡＲ２の異常な発現（例えば、過剰発現、過小発現、発現の欠如など）により特徴付けられる病態又は疾患を診断するために使用され得る。ＰＡＲ２に関する例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得た試料を本開示の抗ＰＡＲ２抗体と接触させることを含んでもよく、ここで、抗ＰＡＲ２抗体は、検出可能な標識又はレポーター分子で標識される。
あるいは、標識されていない抗ＰＡＲ２抗体を、診断への適用においてそれ自体が検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて使用することができる。検出可能な標識又はレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、又は１２５Ｉなどの放射性同位体；フルオレセインイソチオシアネート、若しくはローダミンなどの蛍光若しくは化学発光部分；又はアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、若しくはルシフェラーゼなどの酵素であってもよい。試料中のＰＡＲ２を検出又は測定するために使用することができる特定の例示的なアッセイとしては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
本開示の組成物には多数の用途がある。例えば、本開示の抗体及び抗原結合断片は、インビトロ及び／又はインビボでの細胞及び組織中の優先的な細胞及び組織分布の研究に有用である。同様に、単独の又は異種薬剤にコンジュゲートされた抗体及び抗原結合断片は、エクスビボ又はインビボでの診断上の適用などのためのイメージング剤として有用である。例えば、放射性部分にコンジュゲートされた抗体又は抗原結合断片は、エクスビボ又はインビボ画像化研究に有用である。同様に、本開示の抗体又は抗原結合断片のいずれかが同様に有用である。
インビトロで使用する場合、本開示の抗体及び抗原結合断片は、送達されている抗体又は抗原結合断片の結合パートナーの同定（例えば、抗体又は抗原結合断片に結合するタンパク質又はペプチドの同定）、並びに局在化及び輸送の評価に好適である。同様に、インビボで使用する場合、抗体又は抗原結合断片は、送達されている抗体又は抗原結合断片の結合パートナーの同定（例えば、抗体又は抗原結合断片に結合するタンパク質又はペプチドの同定）、局在化及び輸送の評価、生体内分布及び半減期の評価、並びに免疫原性の評価に有用である。
Ｇ．動物／細胞モデル
抗体又はその断片のいずれかを試験するのに有用であろう多数の動物モデルが当業者に知られている。例えば、Ｋｕｙｉｎｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ，１１（１９）：１０．１１８６／ｓ１３０１８−０１６−０３４６−５を参照されたい。いくつかの実施形態では、動物モデルは、モノヨード酢酸ナトリウム（ＭＩＡ）又はカラゲニンなどの化学物質により動物を処理することにより産生された疼痛モデルである。いくつかの実施形態では、化学物質は、動物において疼痛が誘導されることになる部位に注射される。いくつかの実施形態では、動物モデルは、前十字靭帯切除、半月板切除、又は内側半月板切除などの損傷が手術後に（例えば、切開性）誘導される動物である。いくつかの実施形態では、動物モデルは、下部食道過敏、結腸炎症、胃潰瘍形成、膀胱炎症、膵臓炎症及び子宮炎症などの炎症性病態と関連付けられたものである。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｉｎ ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，”Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｉｎ”，２００９において言及される動物モデルを参照されたい。
Ｈ．キット
ある種の実施形態では、本発明はまた、本開示の少なくとも１つの抗体又は抗原結合断片で充填された１つ以上の容器を含む医薬品パッケージ又はキットを提供する。このような容器には、任意選択により、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形態の通知であって、（ａ）ヒトへの投与のための製造、使用又は販売に関する当該機関による承認、（ｂ）使用のための説明書、又はその両方を反映する通知が付随し得る。
以下の実施例は、本開示の方法及び組成物を作製し且つ使用する方法に関する完全な開示と説明を当業者に提供するように提出されるが、本発明者らが自らの発明と考えるものの範囲を限定することを意図するものではない。使用される数（例えば量、温度など）に関しては、正確さを確保するように努めたが、ある程度の実験誤差と偏差は考慮されるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、そして圧力は大気圧又は大気圧近傍である。
実施例１：ＰＡＲ２に対するｐＨ感受性結合を有する抗体の生成
組換えヒト、ラット及びカニクイザルＰＡＲ２並びにＰＡＲ１タンパク質の生成
細胞外残基１〜７５を含むヒト、ラット及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＰＡＲ２（プロテイナーゼ活性化受容体２）コンストラクトを、Ｎ末端ＡｖｉＴａｇ（商標）（Ａｖｉｄｉｔｙ ＬＬＣ）及びＣ末端Ｆｌａｇ及びポリヒスチジンタグとともに設計し、ベクターｐＤＥＳＴ１２．２ ＯｒｉＰ ＦＨ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローン化した。細胞外残基１〜１０２を含むヒトＰＡＲ１（プロテイナーゼ活性化受容体１）コンストラクトを、Ｃ末端Ｆｌａｇ及びポリヒスチジンタグとともに設計し、ベクターｐＤＥＳＴ１２．２ ＯｒｉＰ ＦＨ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローン化した。このコンストラクトをＨＥＫ２９３細胞で発現させ、標準的な親和性及びサイズ排除クロマトグラフィー精製を用いて培地から精製した。ビオチン化タンパク質を生成するために、ＡｖｉＴａｇ（商標）を製造者の指示書に従って酵素的にビオチン化した。
コンビナトリアルヒスチジンスキャニングライブラリーの構築
スプリットプールオリゴヌクレオチドを設計して、Ｐａｒ００６７のＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３又はＶＬＣＤＲ３のいずれかの各位置でヒスチジン又は野生型アミノ酸を導入した。その後、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３又はＶＬＣＤＲ３のいずれかにおいて０％〜１００％のヒスチジン残基が存在する３つのＰａｒ００６７ ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーを構築した。
ｐＨ感受性Ｐａｒ００６７変異体ｓｃＦｖの選択
ｐＨ７．４でＰＡＲ２に結合するが、ｐＨ６．０で結合の低減を有するＰａｒ００６７変異体を単離するために、コンビナトリアルヒスチジンスキャニングライブラリーを親和性に基づくファージディスプレイ選択にかけた。これを実現するために、ビオチン化組換えヒトＰＡＲ２の濃度の減少を用いて４ラウンドの選択を各ライブラリーで実施した（Ｈａｗｋｉｎｓ，ＲＥ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｕｇ ５；２２６（３）：８８９−９６）。各ラウンドにおいて、ファージを、ストレプトアビジンでコーティングした常磁性ビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））で１時間プレインキュベートして、ストレプトアビジン結合体を除去した。引き続いて、ストレプトアビジンビーズをＤＹＮＡＬ（登録商標）磁石で除去して捨て、残留するファージをｐＨ７．４でビオチン化組換えヒトＰＡＲ２に加えた。選択を２時間続けた後、ストレプトアビジンでコーティングした常磁性ビーズを加えて、ビオチン化組換えヒトＰＡＲ２が結合したファージを捕捉した。ビーズをＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で５回洗浄した後、低ｐＨ緩衝液（ｐＨ５．５〜ｐＨ６．０）において特異的なｓｃＦｖを溶出した。次に、選択されたｓｃＦｖ−ファージ粒子を以前に記載されたとおりに（Ｏｓｂｏｕｒｎ ＪＫ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２（３）：１８１−９６，１９９６）レスキューし、濃度を低減したビオチン化ＰＡＲ２（４ラウンドの間１ｎＭ〜０．０５ｎＭ）の存在下で選択工程を繰り返した。
ｓｃＦｖのＩｇＧ１−ＴＭへの再フォーマット
抗体を、ｓｃＦｖから完全免疫グロブリンＧ１三重変異体（ＩｇＧ１−ＴＭ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓの変異を組み込んでいるＩｇＧ１ Ｆｃ配列）抗体フォーマットに、下の変更を伴って基本的にはＰｅｒｓｉｃら（１９９７，Ｇｅｎｅ，１８７，９−１８）によって記載されたとおりに変換した。ＣＨＯ一過性細胞との使用を容易にし、且つエピソーム複製を可能にするため、発現ベクターにＯｒｉＰ断片を含めた。ヒト重鎖定常ドメイン及び調節エレメントを含有するベクターに可変重鎖（ＶＨ）ドメインをクローン化して、哺乳動物細胞において完全ＩｇＧ１重鎖を発現させた。同様に、ヒト軽鎖（ラムダ）定常ドメイン及び調節エレメントの発現用ベクターに可変軽鎖（ＶＬ）ドメインをクローン化して、哺乳動物細胞において完全ＩｇＧ軽鎖を発現させた。ＩｇＧを得るために、これらの重鎖及び軽鎖ＩｇＧ発現ベクターをＣＨＯ一過性哺乳動物細胞にトランスフェクトした（Ｄａｒａｍｏｌａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ３０（１）：１３２−４１（２０１４））。ＩｇＧを発現させて、培地中に分泌させた。回収物を濾過した後に精製し、続いてプロテインＡクロマトグラフィーを用いてＩｇＧを精製した。培養上清を適切なサイズのＣｅｒａｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＢｉｏＳｅｐｒａ）のカラムにロードし、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄した。０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）を使用して結合したＩｇＧをカラムから溶出させて、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）の添加により中和した。溶出した材料をＮａｐ１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、＃１７−０８５４−０２）を使用してＰＢＳに緩衝液交換し、ＩｇＧのアミノ酸配列に基づく吸光係数を用いてＩｇＧ濃度を分光光度的に決定した（Ｍａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００（１）：７４−８０（１９９２））。ＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用し、且つＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製されたＩｇＧを凝集及び分解純度に関して分析した。
ｐＨ感受性Ｐａｒ００６７変異体ｓｃＦｖ及びＩｇＧのスクリーニング
潜在的なｐＨ依存的結合を有する抗体をスクリーニングし、且つ特性を明らかにするために、生化学的エピトープ競合アッセイフォーマットを使用した。ホモジニアス時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ（商標））の技術を使用したアッセイを設計して、ヒトＰＡＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する親Ｐａｒ００６７ ＩｇＧ抗体の結合の相互作用を阻害する試験抗体（ｓｃＦｖ又はＩｇＧ）の能力を評価した。重要なことに、アッセイは、２つの異なるｐＨ値（ｐＨ７．４及びｐＨ６．０）で実行された。
最初に、ｐＨ７．４とｐＨ６．０での並行したアッセイ（上記のとおり）を使用して、単一点の３８４ウェルハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）において粗製の未精製ｓｃＦｖ（細菌抽出物）をスクリーニングした。この単一点の並行したＨＴＳフォーマットにより、多く（数千個）の試験ｓｃＦｖのスクリーニングが可能になり、且つｐＨ７．４と比較してｐＨ６．０においてヒトＰＡＲ２に対する親Ｐａｒ００６７ ＩｇＧ結合の相互作用の阻害を低減した抗体を、さらなる特徴付けに進めた。その後、同じエピトープ競合アッセイ手法を、複数点での用量反応ＩＣ５０フォーマットにおいて実行して、精製ｓｃＦｖ及び精製ＩｇＧの両方を試験した（後者の場合、セクションＣにおいて記載のとおり、アッセイ設計の軽微な変更を必要とした）。さらに、アッセイをｐＨ７．４とｐＨ６．０で実行したが、これらの実験において、発明者らは試験抗体に最も関心を持ち、そこでは、用量反応阻害曲線は、ｐＨ７．４で観察された対応する用量反応阻害曲線に対してｐＨ６．０で右方向への大幅なシフトを示した（すなわち、ＩＣ５０値を著しく増大させた）。
以下のプロトコルは、粗製の未精製ｓｃＦｖの単一点の試験並びにその後の精製ｓｃＦｖ及びＩｇＧの試験の両方のための方法を含む。
セクションＡ：一般的なアッセイ条件：
アッセイ緩衝液：
アッセイ緩衝液を使用する日に新たに作製した。ｐＨ７．４での実験のために、ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １４１９０−０８６）にＫＦ（０．４Ｍ）（ＶＷＲ、１０３４４４Ｔ）及びＢＳＡ（０．１％ ｗ／ｖ）（ＰＡＡ、Ｋ０５−０１３）を加えた後、ｐＨを再確認し、必要に応じてｐＨ７．４に細かく調整した。ｐＨ６．０での実験のために、上で概要を述べたｐＨ７．４のアッセイ緩衝液と他の全ての緩衝液成分を同一に保ちながら、ｐＨ６．０のアッセイ緩衝液を、２００ｍＭ ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ−５２８７）（ＤＰＢＳとは対照的に）の塩基緩衝液を用いて作製した。ＫＦ（０．４Ｍ）及びＢＳＡ（０．１％ ｗ／ｖ）の添加の後、２００ｍＭ ＭＥＳ系の緩衝液をＨＣＬでｐＨ６．０に調整した。
アッセイプレート：黒色浅型ウェル３８４プレート（丸底、非結合型）（Ｃｏｒｎｉｎｇ、４５１４）を使用してアッセイを実施した。
アッセイ体積：２０μＬ
インキュベーション及びプレートの読み取り：アッセイプレートを室温で２時間インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーの標準的なＨＴＲＦ（商標）読み取りプロトコルを用いて読み取った。
セクションＢ：ｓｃＦｖの試験：（未精製の細菌ライセート及び精製ｓｃＦｖ）
Figure 2020509762
Ｐａｒ００６７ ＩｇＧの調製／添加：
標識されていない精製Ｐａｒ００６７ ＩｇＧ（内製）を、セクションＡに前述された２つのアッセイ緩衝液（ｐＨ７．４及びｐＨ６．０）の各々において４．４４ｎＭ（１．１１ｎＭ 最終［アッセイ］）の濃度にした。５μｌ／ウェルの適切なｐＨの４．４４ｎＭ Ｐａｒ００６７ ＩｇＧ溶液を、該当するアッセイプレート（ｐＨ７．４及びｐＨ６．０）の全てのウェルに加えた。
試験ｓｃＦｖの調製／添加：
ａ）ｐＨ７．４及びｐＨ６．０の両方での粗製の未精製細菌ライセートｓｃＦｖ試料の並行した単一点ＨＴＳのために、必要に応じてｐＨ７．４又はｐＨ６．０いずれかのアッセイ緩衝液を用いて、試料をまず、それらの適切な濃度の４０％まで事前に希釈した。その後、５μｌの４０％の事前に希釈された試料を、１０．０％の最終アッセイ試料濃度（２０μｌ最終アッセイ体積中）を得るために、適切なアッセイ（ｐＨ７．４又はｐＨ６．０）に移した。親Ｐａｒ００６７ ｓｃＦｖは対照として全てのＨＴＳ実験に含まれ、特異的ｐＨ依存的抗体も、それらが利用可能（基準のために）であったため同様であった。
ｂ）精製ｓｃＦｖ抗体の複数点での用量反応ＩＣ５０試験のために、試料を、適切な未希釈の試料（すなわち、事前の希釈工程が実施されなかった）の最大最終アッセイの１／４から試験した。次に、複製の１１点の１：３段階希釈を、２つのアッセイ緩衝液（ｐＨ７．４及び６．０）の各々における３８４ウェルポリプロピレンＧｒｅｉｎｅｒプレート上で調製した。各段階希釈の１ウェル当たり５μｌを、該当するｐＨのｓｃＦｖ希釈プレートから対応するアッセイプレート（ｐＨ７．４及びｐＨ６．０）に移した。５μｌの適切なｐＨのアッセイ緩衝液を、全体及び非特異的ウェルに加えた。親Ｐａｒ００６７精製ｓｃＦｖは対照として全ての複数点での用量反応ＩＣ５０実験に含まれ、特異的ｐＨ依存的精製ｓｃＦｖも、それらが利用可能（基準のために）であったため同様であった。データは表１において示される。
ビオチン化ヒトＰＡＲ２ ＥＣＤの調製／添加：
内製のビオチン化ヒトＰＡＲ２ ＥＣＤを、２つのアッセイ緩衝液（ｐＨ７．４及びｐＨ６．０）の各々に希釈して、４．０ｎＭ（１ｎＭ最終アッセイ濃度）の標準溶液を得た。次に、５μｌ／ウェルの適切な４．０ｎＭのビオチン化ヒトＰＡＲ２ ＥＣＤ標準溶液を、陰性結合対照ウェルを除く対応するアッセイプレート（ｐＨ７．４及びｐＨ６．０）の全てのウェルに加えた。５μｌ／ウェルの適切なｐＨのアッセイ緩衝液を、陰性結合ウェルに加えた。
ＨＴＲＦ検出試薬の調製／添加：
ユーロピウムクリプテート標識ストレプトアビジン（ＣｉｓＢｉｏ、６１０ＳＡＫＬＢ）及びＸＬ６６５標識抗ヒトＦｃ（ＣｉｓＢｉｏ、６１ＨＦＣＸＬＢ）を、各ｐＨのアッセイ緩衝液（ｐＨ７．４及びｐＨ６．０）にそれぞれ希釈して、６．０ｎＭ（ユーロピウムクリプテート標識ストレプトアビジン）及び４０ｎＭ（ＸＬ６６５標識抗ヒトＦｃ）の濃度の組み合わされた標準溶液を得た。４倍希釈してアッセイに入れる場合、これは、１．５ｎＭ（ユーロピウムクリプテート標識ストレプトアビジン）及び１０ｎＭ（ＸＬ６６５標識抗ヒトＦｃ）の最終アッセイ濃度をもたらした。次に、５μｌ／ウェルの該当するｐＨの組み合わされたＨＴＲＦ（商標）検出試薬標準溶液を、対応するアッセイプレート（ｐＨ７．４及びｐＨ６．０）の全てのウェルに加えた。
セクションＣ：精製ＩｇＧの試験：
Figure 2020509762
Ｐａｒ００６７ ＩｇＧ Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０標識：
Ｐａｒ００６７ ＩｇＧのＤｙｌｉｇｈｔ６５０標識を、Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０標識キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号８４５３６）を使用して実施した。内製の精製Ｐａｒ００６７ ＩｇＧの標識を、製造業者の推奨する標識手順に従って実施した。最終Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０標識Ｐａｒ００６７ ＩｇＧ濃度は、２．７モル色素／モルＩｇＧのＩｇＧ色素組み込み比率に対する平均Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０により０．５６ｍｇ／ｍｌと決定された。
Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０標識Ｐａｒ００６７ ＩｇＧの調製／添加：
Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０標識Ｐａｒ００６７ ＩｇＧ（０．５６ｍｇ／ｍｌ、３，７３３ｎＭ）を、材料セクションに前述された２つのアッセイ緩衝液（ｐＨ７．４及びｐＨ６．０）の各々において４．４４ｎＭ（１．１１ｎＭ 最終［アッセイ］）の濃度にした。５μｌ／ウェルの適切なｐＨの４．４４ｎＭ Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０Ｐａｒ００６７ ＩｇＧ溶液を、該当するアッセイプレート（ｐＨ７．４及びｐＨ６．０）の全てのウェルに加えた。
試験ＩｇＧの段階希釈／添加：
親Ｐａｒ００６７ ＩｇＧ（全てのアッセイにおいて基準／対照として使用される）を事前に希釈して、２つの異なるｐＨのアッセイ緩衝液の各々において２０００ｎＭストックを得た（５００ｎＭの最大最終アッセイＩｇＧ濃度を得るため）。全ての試験、又は他の基準／対照ＩｇＧを、適切な未希釈の試料（すなわち、事前の希釈工程が実施されなかった）の最大最終アッセイ濃度の１／４から試験した。次に、複製の１１点の１：３段階希釈を、２つのアッセイ緩衝液（ｐＨ７．４及び６．０）の各々における３８４ウェルポリプロピレンＧｒｅｉｎｅｒプレート上で調製した。１ウェル当たり５μｌを、該当するｐＨのＩｇＧ希釈プレートから対応するアッセイプレート（ｐＨ７．４及びｐＨ６．０）に移した。５μｌの適切なｐＨのアッセイ緩衝液を、全体及び非特異的ウェルに加えた。
ビオチン化ヒトＰＡＲ２ ＥＣＤの調製／添加：
内製のビオチン化ヒトＰＡＲ２ ＥＣＤを、２つのアッセイ緩衝液（ｐＨ７．４及びｐＨ６．０）の各々に希釈して、４．０ｎＭ（１ｎＭ最終アッセイ濃度）の標準溶液を得た。次に、５μｌ／ウェルの適切な４．０ｎＭのビオチン化ヒトＰＡＲ２ ＥＣＤ標準溶液を、陰性結合対照ウェルを除く対応するアッセイプレート（ｐＨ７．４及びｐＨ６．０）の全てのウェルに加えた。５μｌ／ウェルの適切なｐＨのアッセイ緩衝液を、陰性結合ウェルに加えた。
ＨＴＲＦ検出試薬の調製／添加：
ユーロピウムクリプテート標識ストレプトアビジン（ＣｉｓＢｉｏ、６１０ＳＡＫＬＢ）を、各ｐＨのアッセイ緩衝液（ｐＨ７．４及びｐＨ６．０）に希釈して、６．０ｎＭの濃度の標準溶液を得た。４倍希釈してアッセイに入れる場合、これは、１．５ｎＭの最終アッセイユーロピウムクリプテート標識ストレプトアビジン濃度をもたらした。次に、５μｌ／ウェルの該当するｐＨのユーロピウムクリプテート標識ストレプトアビジン標準溶液を、対応するアッセイプレート（ｐＨ７．４及びｐＨ６．０）の全てのウェルに加えた。
セクションＤ：データ分析
まず、６６５ｎｍ及び６２０ｎｍカウントを、６６５ｎｍ／６２０ｎｍの比率値に変換した。次に、デルタＦ（％）を、下式に従って計算した。
デルタＦ（％）＝（（試料比率−陰性比率）／陰性比率）×１００
陰性比率値を、Ｐａｒ００６７ ＩｇＧの非存在下で該当する陰性結合対照ウェルから計算した。
次に、％特異的結合を、下式に従って計算した。
％特異的結合＝｛（試料％デルタＦ−陰性結合％デルタＦ）／（全体結合％デルタＦ−陰性結合％デルタＦ）｝×１００
単一点ＨＴＳのために、ｐＨ７．４に対するｐＨ６．０での阻害の低減（より高い％特異的結合）を有するｓｃＦｖの分布を可視化するため、ｐＨ７．４に対するｐＨ６．０での％特異的結合を、それぞれｘ及びｙ軸にプロットした。
複数点での用量反応曲線のために、％特異的結合の値を試験精製抗体濃度（ｓｃＦｖ又はＩｇＧ）に対してプロットした。ＩＣ５０値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてシグモイド用量反応阻害可変勾配曲線フィット（４パラメータのロジスティック方程式）により決定した。
Figure 2020509762
Figure 2020509762
複数のヒスチジンの単一ｓｃＦｖへの組換え
Ｐａｒ００６７エピトープ競合結合アッセイにおいてｐＨ依存的結合を実証したｓｃＦｖに由来するヒスチジン残基が、部位特異的変異誘発を用いて組み換えられた（Ｒｅｉｋｏｆｓｋｉ Ｊ ａｎｄ Ｔａｏ ＢＹ，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ，１０（４）：５３５-５４７）。その結果として生じる２つの異なるＣＤＲ中にヒスチジンを含有したｓｃＦｖを、完全免疫グロブリンＧ１三重変異体（ＩｇＧ１−ＴＭ）（表２）として競合結合アッセイにおいて再試験して、親抗体であるＰａｒ００６７と比較してｐＨ依存的結合がさらに向上した変異体を同定した。
参照Ｐａｒ００６７抗体のＣＤＲ配列と比較したヒスチジン改変クローンの各々についての配列アラインメントが図１Ａ〜１Ｂ及び２Ａ〜２Ｂにおいて提供される。
Figure 2020509762
ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって決定されたヒト、ラット及びカニクイザルＰＡＲ２に対する抗ＰＡＲ２ Ｆａｂの親和性
抗ＰＡＲ２抗体の抗原結合断片（Ｆａｂ）を発現させ（Ｓｐｏｏｎｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１２：１４７２−７）、様々な種（ヒト、ラット及びカニクイザル）の組換えＰＡＲ２についての親和性をＢｉａｃｏｒｅによって決定した。
Ｂｉａｃｏｒｅ親和性分析
抗ＰＡＲ２ Ｆａｂの親和性を様々なｐＨ（ｐＨ７．４、ｐＨ６．０及びｐＨ５．６）において２５℃でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００を用いて測定した。Ｎ末端Ａｖｉタグ及びＣ末端Ｆｌａｇ−Ｈｉｓタグを有する組換えヒト、ラット及びカニクイザルＰＡＲ２を用いて実験を実施した。
標準的なアミンカップリング技術を用いて、１０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ４．５中において４μｇ／ｍｌの濃度でストレプトアビジンをＣ１チップ表面に共有結合的に固定化した。約３０〜１００ＲＵの最終ストレプトアビジン表面に達した。組換えビオチン化ＰＡＲ２種（内製）を、飽和状態（Ｒｍａｘ）でＦａｂ結合が可能となるようにＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液中４μｇ／ｍｌでストレプトアビジンチップ表面上に滴定した。この低レベルの分析物の結合により、最小限の物質移動効果を確保した。
抗ＰＡＲ２ Ｆａｂを、ＨＢＳ−ＥＰ＋ｐＨ７．４の緩衝液若しくはＭＥＳ−ＢＳ−ＥＰ＋ｐＨ６．０の緩衝液中、又はＭＥＳ−ＢＳ−ＥＰ＋ｐＨ５．６の緩衝液中において段階希釈し（０．３９ｎＭ〜２５ｎＭ）、３分の会合と最長３０分の解離を伴って５０μｌ／分でチップ上に流した。同じ条件下で複数回の緩衝液のみの注入を行って、最終的なセンサーグラムセットのダブルリファレンスの差し引きを可能にし、ＢｉａＥｖａｌソフトウェア（バージョン２．０．１）を用いて分析した。チップ表面は４Ｍ ＭｇＣｌ２の適用により完全に再生された。
選択されたクローンについてのＢｉａＣｏｒｅ親和性結果は、表３〜１３において以下に提供される。
Figure 2020509762
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実施例２：細胞ベースのＰＡＲ２及びＰＡＲ１活性アッセイ
内在性ＰＡＲ２を発現するヒトＡ５４９細胞、ラットＫＮＲＫ、マウスＬＬ／２若しくはカニクイザルＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞、又はヒトＰＡＲ２を過剰発現するヒト１３２１Ｎ１−ｈＰＡＲ２−ｃｌ８細胞を、ＰＤＬでコーティングされた組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）上で１ウェル当たり５，０００個（ヒト、カニクイザル）又は７，０００個（マウス、ラット）の細胞で播種した。細胞をＦｌｕｏ−Ｓｃｒｅｅｎ Ｑｕｅｓｔ（商標）Ｆｌｕｏ−８洗浄なしのカルシウム色素（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ）とともにロードした。細胞を、アッセイ緩衝液（ＨＢＳＳ、０．１％ ＢＳＡ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）中で希釈されたＩｇＧ又はＦａｂで室温にて１時間前処理した。マウス及びカニクイザルのアッセイのために、細胞をそれぞれ０．５ｎＭ又は１０ｎＭのトロンビンで前処理して、ＰＡＲ１活性を脱感作した。１１ｎＭ（ヒト）、４００ｎＭ（マウス）又は８０ｎＭ（ラット、カニクイザル）トリプシン（Ｐｏｌｙｍｕｎ）に対するＰＡＲ２のカルシウム応答を、蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）Ｔｅｔｒａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で測定した。ヒトＰＡＲ１に対する機能活性を決定するために、Ａ５４９ヒト細胞株におけるトロンビンに駆動されるカルシウム応答を、同様にＦＬＩＰＲ ｔｅｔｒａ上で決定し、これらのアッセイでは、陽性対照として、中和抗ＰＡＲ１ ＩｇＧ ＷＥＤＥ１５（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）及びＡＴＡＰ２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。種々のプロテアーゼに対する機能活性を決定するために、ヒトＰＡＲ２を過剰発現する１３２１Ｎ１−ｈＰＡＲ２−ｃｌ８細胞をＰａＢ６７０１２９で前処理した後、０．５ｎＭトリプシン、５００ｎＭトリプターゼ又は１ｎＭマトリプターゼでカルシウム放出を刺激した。蛍光量を、プロテアーゼの添加の前、添加中、及び添加の後に測定し、ウェル当たりのピークＲＦＵを計算した。％応答（プロテアーゼ単独に対する）を抗体濃度に対して計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してＩＣ５０を決定した。
これらのアッセイにおけるヒト、カニクイザル、ラット、及びマウス細胞からの結果は、図３（それぞれＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ）、図３Ｅの計算されたＰＡＲ２ ＩＣ５０及び図６（ＰＡＲ１の特異性データ）において提供される。ＩＣ５０の計算値は、ＰａＢ６７０１２９が、内在性ＰＡＲ２を発現するヒト、マウス、ラット及びカニクイザル細胞におけるトリプシン誘導性ＰＡＲ２カルシウム応答を強力に阻害することを実証している（図３Ｅ）。さらに、ヒトＡ５４９細胞において、トロンビン誘導性のＰＡＲ１活性化は、ＰａＢ６７０１２９によっては阻害されないが、ボラパクサール及び抗ＰＡＲ１モノクローナル抗体により効率的に遮断され得る（図６）。これらのデータは、ＰａＢ６７０１２９がＰＡＲ２の強力且つ特異的なアンタゴニストであることを実証している。ＰＡＲ２発現細胞に対するＰａＢ６７０１２９の単独での適用は、細胞の基底のカルシウムレベルに影響を及ぼさないが、これは、ＰａＢ６７０１２９がＰＡＲ２においてあらゆるアゴニスト活性を欠くことを実証している（図４Ａ）。さらに、ＰａＢ６７０１２９は、トリプシン、トリプターゼ及びマトリプターゼを含む種々のプロテアーゼに対するＰＡＲ２誘発性の応答を強力にアンタゴナイズする（図４Ｂ）。
一次ＤＲＧグリア−神経のＰＡＲ２カルシウムアッセイ
スプラーグドーリーラットの子の脊髄後根神経節（ＤＲＧ）の解離した培養物を調製し、ラミニン及びＰＤＬでコーティングされた組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）上で増殖させた。アッセイにおける使用の前に、プレートを３７℃で２４〜７２時間インキュベートした。２μＭのＦｕｒａ−２カルシウム色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに細胞をロードした。２０ｎＭのＰＡＲ２抗体を含有するイメージング緩衝液（ＨＢＳＳ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭスルフィンピラゾン、１０μＭ ＰＡＲ１アンタゴニスト ボラパクサール）中で細胞をインキュベートした。次に、アゴニストであるトロンビン（Ｓｉｇｍａ）及びマトリプターゼ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）ＰＡＲ２活性化ペプチドＬＩＧＲＬＯ（配列番号８３２）、（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）及び高濃度の細胞外カリウム（５０ｍＭ）の適用に応答した細胞内カルシウムを、３４０及び３８０ｎｍで励起するキセノンアークランプを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１顕微鏡上でのＦｕｒａ−２のレシオメトリックイメージングにより定量化した。視野当たりのグリアに対する神経細胞の数を計算した（高濃度カリウムに対する応答を示すものとして定義される神経細胞）。次に、視野当たりのマトリプターゼ感受性神経細胞及びグリアの総数を計算した。カルシウムアッセイからの結果は図５Ａ〜Ｆに提供され、ＰａＢ６７０１２９抗体が、ＤＲＧの神経細胞（図５Ａ〜Ｃ）及び非神経細胞（図５Ｄ〜Ｆ）においてマトリプターゼに対する感受性を効率的に低減したことを示す。
実施例３：炎症性関節痛のラットモデルにおける抗ＰＡＲ２抗体の効果
スプラーグドーリーラットの同側膝におけるモノヨード酢酸ナトリウム（ＭＩＡ）の関節内投与は、最初は炎症反応を付随する激しく且つ長期間の痛覚過敏及び異痛症の発症を引き起こす。この動物モデルにおけるこれらの徴候の発症は、臨床的に関連のあるものと考えられ；変形性関節症（ＯＡ）又は関節リウマチなどの潜在的な病態と関連付けられる慢性の炎症性疼痛を呈している患者によって示される症状を反映している（Ｂｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｆｅｒｎｉｈｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｋａｌｂｈｅｎ １９８７）。（評価項目として体重負荷を用いて）ＭＩＡ誘導性痛覚過敏は経時的に、Ｃｏｘ−２感受性であり；且つ標準薬のセレコキシブによって顕著に低減される初期の主として炎症性の要素を有する２相性のパターンに続くことが以前に実証されている。この初期の炎症期は、プレガバリン（ＰＧＢ）感受性であり、且つセレコキシブ非感受性であるさらに慢性的な疼痛表現型に移行し、これは潜在的なより神経因性の要素を示唆している。
体重負荷：未処置のラットは、２本の後ろ足の間に均等に体重を分配する。しかしながら、注射された（左）後ろ膝に炎症があり且つ／又は痛みを感じる場合、体重は、冒された肢により少ない体重がかかるように再分配される（損傷された肢における体重負荷が低減する）。各後肢を通じた体重負荷を、小動物用鎮痛評価装置（Ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ｔｅｓｔｅｒ）（Ｌｉｎｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を使用して測定する。
スプラーグドーリーラットを、別々のセンサーに後ろ足を載せて小動物用鎮痛評価装置中に置き、両後肢によって及ぼされた平均の力を４秒間にわたって記録した。
手順：分娩後、ラットは試験開始前に７日の最小限の馴化期間を経た。未処置のラットを自由に食物と水を利用できる状態でホームケージにおいて処置室に馴化させた。体重負荷室への馴化を数日間にわたって実施した。ベースラインの体重負荷の記録を最終日に行った。
０日目に最終のベースラインの記録後、滅菌条件中において３：１で混合されたイソフルランと酸素を使用して動物を麻酔した。左膝領域を剪毛し、ヒビスクラブ希釈溶液で浄化した。
左後肢の膝関節へのＭＩＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｉ２５１２）溶液、８０ｍｇ／ｍｌの２５μｌ、（２ｍｇ）の注射により変形性関節症（ＯＡ）を誘導した。シャム動物を生理食塩水で注射した。動物を温かい環境で回復させた後、ホームケージに戻した。
動物は、ＭＩＡの後に炎症反応を発症し、患部を守り、且つなめる場合がある。したがって、苦痛又は激痛の予期しない徴候についてラットを注意深く監視し、その結果、そのような徴候を示す動物を即座に選別することができた。
最初の週は毎日、その後は数日毎に動物を計量した。ＭＩＡの注射後３、７、１０及び１４日目に慢性疼痛の発症に関して体重負荷を評価した。１８日目に体重負荷測定を行い、動物を分類し、ラテン方格法におけるＭＩＡ窓に従って治療群を無作為化した。
抗体投与レジメン：１８日目に、動物を、Ｐａｒ００６７（ＰＡＲ２＋ｖｅ）１０ｍｇ／ｋｇ又はアイソタイプ対照（ＰＡＲ２−ｖｅ）１０ｍｇ／ｋｇ 静注で処理し、さらに体重負荷測定を、抗体投与後４時間並びに１、２、６、８、１０及び１４日目に行った。
プレガバリン及びセレコキシブ投与レジメン：動物に、ＭＩＡ注射後２４、２５、２６、２７及び２８日目に毎日ＰＧＢ（３０ｍｇ／ｋｇ 経口；２ｍｌ／ｋｇ）又はセレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ 経口；２ｍｌ／ｋｇ）を投与した。体重負荷評価を２４、２６及び２８日目に投与後１時間行い、薬物治療の休止後の３２日目にさらに記録を取った。
投与後１、２、６、１０及び１４日目に、体重負荷評価後、抗体及びアイソタイプ対照治療群（ｎ＝５／群）から、ｐｋ分析のために４００μｌの血液を、尾静脈を通して採取した。
試験の評価：体重負荷（ｇ）記録を左右の後ろ足の両方で行い、差を計算した。データを、％比率 同側／対側（（体重負荷 左／体重負荷 右）×１００）（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）として表した。
計算：同側の測定値／対側の測定値 ×１００。未処置の体重負荷の差−投与前の体重負荷の差をＭＩＡ窓として定義した。
統計分析：ＩｎＶｉｖｏＳｔａｔ（ｉｎｖｉｖｏｓｔａｔ．ｃｏ．ｕｋ）を用いた反復測定ＡＮＯＶＡに続く計画比較検定、（ｐ＜０．０５を有意とみなした）。各時点で治療群を溶媒対照群と比較することによってデータを分析した。
損傷した後ろ足と未損傷の後ろ足との間の体重負荷の変化によって検出されるとおり、２ｍｇのＭＩＡの膝関節への注射により、明らかに３日目から顕著な炎症及び過敏性応答が引き起こされた。このＭＩＡ誘導性過敏性応答は１８日目に至るまで（溶媒処理対照動物に関してはそれ以降も）全ての群でなお明白であり、その時点で最初の試験薬剤を投与した。生理食塩水の注射は体重負荷に影響を及ぼさなかった。
図７Ａにおいて実証されるとおり、２４日目から２８日目までのプレガバリン（３０ｍｇ／ｋｇ）の毎日の投与後、過感受性の有意且つ顕著な回復が見られ、微弱に残留した効果は治療の先の休止後の３２日目においても依然として明らかであった。反対に、２４日目から２８日目までのセレコキシブ（５０ｍｇ／ｋｇ）の毎日の投与は、良くても過感受性の弱い回復を示すのみであった。この薬理学的プロファイルは、ＭＩＡ応答のこの期間に観察された過感受性が、本質的に、炎症性というよりも主に神経因性であることを示唆する。
図７Ａにおいてさらに実証されるとおり、過感受性の有意な回復は、投与後４時間から２８日目まで（投与後１０日）Ｐａｒ００６７により見られた。同じ期間においてアイソタイプ対照では効果は見られなかった。図７Ｂは、異なる濃度のＰａｒ００６７による治療の効果を示す。
実施例４：雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける部分的神経結紮に誘導される機械的痛覚過敏の回復に対するＰＡＲ２抗体、ＰａＢ６７０１２９の効果
導入
Ｓｅｌｔｚｅｒ（１９９０）により記載されるとおりの坐骨神経の部分結紮（ＰＮＬ）は、神経因性疼痛の前臨床モデルとして機能すると報告されるいくつかの神経結紮モデルの１つである。これにより、Ｒａｎｄａｌｌ及びＳｅｌｉｔｔｏ（１９５７）によって記載される鎮痛作用測定装置（ａｎａｌｇｙｓｅｍｅｔｅｒ）を使用して測定することができる重度の機械的痛覚過敏がもたらされる。本実施例は、この神経損傷／神経因性疼痛モデルにおける痛覚過敏に対する抗ＰＡＲ２抗体ＰａＢ６７０１２９の投与の効果を記載する。
手順
６０頭の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、試験開始の少なくとも５日前に同定の目的でトランスポンダーの挿入を受けた。機械的痛覚過敏を鎮痛作用測定装置（Ｒａｎｄａｌｌ及びＳｅｌｉｔｔｏ １９５７）（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ）を使用して決定した。離脱応答が観察されるまで、各後ろ足の背面に順番に力を増加させながら加えた。この時点で力の適用を停止し、体重をグラムで記録した。データは、同側の足及び対側の足についてグラムでの離脱閾値として表した。ベースラインの記録が確立した後、マウスを、坐骨神経を部分的に結紮させる手術を受けるか又はシャム手術対照として機能する、ほぼ等しい同側／対側比率を有する２群に分けた。手術を受けるマウスをイソフルランで麻酔した。この後、左坐骨神経の約１ｃｍを、大腿中央の位置で切開による鈍的切開によって露出させた。次に、縫合糸（８／０ Ｖｉｒｇｉｎ Ｓｉｌｋ：Ｅｔｈｉｃｏｎ）を背側の神経の３番に通して、きつく結んだ。次に、接着剤を使用して切開を閉じて、試験開始前の少なくとも６日間、マウスを回復させた。シャム手術マウスは同じプロトコルを受けたが、神経の露出後、マウスを縫合し、回復させた。
マウスを、手術後の７日目及び１０日目に痛覚過敏の発症について試験した。８０％を超える同側／対側比率を示すあらゆるマウスをノンレスポンダーとして分類し、試験から除外した。１０日目の試験後、マウスを最終的な治療群：
Ａ．群１：シャム手術＋アイソタイプ対照 １０ｍｇ／ｋｇ 皮下注射（Ｎ＝１０）
Ｂ．群２：神経結紮＋アイソタイプ対照 １０ｍｇ／ｋｇ 皮下注射（Ｎ＝９）
Ｃ．群３：神経結紮＋エタネルセプト ０．３ｍｇ／ｋｇ 皮下注射（Ｎ＝９）
Ｄ．群４：神経結紮＋ＰａＢ６７０１２９ ３ｍｇ／ｋｇ 皮下注射（Ｎ＝９）
Ｅ．群５：神経結紮＋ＰａＢ６７０１２９ １０ｍｇ／ｋｇ 皮下注射（Ｎ＝９）
Ｆ．群６：神経結紮＋ＰａＢ６７０１２９ ５０ｍｇ／ｋｇ 皮下注射（Ｎ＝９）
を示す群にさらに細分化した。
マウスに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈された対照又は試験分子を１３日目に投与し、投与から４時間後、及び投与後１、２、４及び７日目に、機械的痛覚過敏における変化について再試験した。
データ分析
同側及び対側の記録を、各試験時刻に各動物に対して取得した。同側及び対側の後肢による体重負荷は比率として表され、群のデータを、二元配置ＡＮＯＶＡを用いて分析し（ＰＲＩＳＭ）、必要に応じて、ペアワイズ比較がテューキー法を用いてなされた。
結果
坐骨神経の部分結紮が機械的痛覚過敏をもたらし、それは、シャム手術を受けた対照と比較した場合、７日目及び１０日目の同側／対側比率の有意な低下として顕在化した。アイソタイプ対照による治療の後、手術を受けたマウスは、機械的痛覚過敏のレベルにおいて投与前レベルから全く変化を示さず、これは効果の欠如を示している。内部標準薬のエタネルセプト（０．３ｍｇ／ｋｇ 皮下注射）の投与により、以前の研究で見られた結果に一致して、投与後４時間から７日目において痛覚過敏の有意な回復がもたらされた。ＰａＢ６７０１２９は、用量依存的に同側／対側比率の回復をもたらし、１０ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇの両方でピークの効果が見られた。最小用量の３ｍｇ／ｋｇは、投与後１、２及び７日目では有意であったが、より低い効果を示した（図８を参照のこと）。
坐骨神経の部分結紮は、以前に報告された結果と一致して、長期間の機械的痛覚過敏を誘導した。理論に束縛されるものではないが、これは、神経因性疼痛において観察される疼痛の前臨床の相関現象として役立つと考えられる。ＰａＢ６７０１２９の投与は、この痛覚過敏の有意且つ用量依存的な回復を示し、神経因性疼痛の治療におけるＰＡＲ２抗体の有望な用途を示している。
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・ Ａ．Ｗ．Ｄｒａｋｅ，Ｍ．Ｌ．Ｔａｎｇ，Ｇ．Ａ．Ｐａｐａｌｉａ，Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ，Ｍ．Ｈａａｋ−Ｆｒｅｎｄｓｃｈｏ，Ｓ．Ｌ．Ｋｌａｋａｍｐ，Ｂｉａｃｏｒｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｔｒｉｘ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ／ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｘ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２９（２０１２）５８−６９
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・ Ｒａｎｄａｌｌ ＬＯ，Ｓｅｌｉｔｔｏ ＪＪ（１９５７）．Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎａｌｇｅｓｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ ｉｎｆｌａｍｅｄ ｔｉｓｓｕｅ．Ａｒｃｈ Ｉｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ Ｔｈｅｒ．１１１（４）：４０９−４１９
配列表：
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配列番号８０１−ヒトＰＡＲ２プレプロタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５２３３．３）
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 配列番号８０２−ヒトＰＡＲ２のテザーリガンド
ＳＬＩＧＫＶＤＧＴＳＨＶＴＧＫＧＶＴＶＥＴＶＦＳＶＤＥＦＳＡＳＶＬＴＧＫＬＴＴ
配列番号８０３−例示的なＶＨフレームワーク領域１
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ
配列番号８０４−例示的なＶＨフレームワーク領域２
ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ
配列番号８０５−例示的なＶＨフレームワーク領域３
ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
配列番号８０６−例示的なＶＨフレームワーク領域４
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号８０７−例示的なＶＬフレームワーク領域１
ＳＩＥＬＴＱＰＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＳＩＴＣ
配列番号８０８−例示的なＶＬフレームワーク領域２
ＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＶＬＶＩＹ
配列番号８０９−例示的なＶＬフレームワーク領域３
ＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＹＣ
配列番号８１０−例示的なＶＬフレームワーク領域４
ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号８１１−例示的なＶＨ ＣＤＲ２
ＴＩＳＹＳＧＳＨＩＳＹＨＤＳＶＨＨ
配列番号８１２−例示的なＶＨ ＣＤＲ２
ＴＩＳＹＨＧＳＬＩＳＹＨＤＳＶＨＨ
配列番号８１３−例示的なＶＨ ＣＤＲ２
ＴＩＳＹＨＧＳＨＩＳＹＡＤＳＶＨＨ
配列番号８１４−例示的なＶＨ ＣＤＲ２
ＴＩＳＹＨＧＳＨＩＳＹＨＤＳＶＫＨ
配列番号８１５−例示的なＶＨ ＣＤＲ２
ＴＩＳＹＨＧＳＨＩＳＹＨＤＳＶＨＧ
配列番号８１６−例示的なＶＨ ＣＤＲ２
ＴＩＳＹＨＧＳＬＩＳＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号８１７−例示的なＶＨ ＣＤＲ２
ＴＩＳＹＳＧＳＨＩＳＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号８１８−例示的なＶＨ ＣＤＲ２
ＴＩＳＹＨＧＳＨＩＳＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号８１９−例示的なＶＨ ＣＤＲ３
ＩＨＮＤＰＭＤＶ
配列番号８２０−例示的なＶＨ ＣＤＲ３
ＩＮＨＤＰＭＤＶ
配列番号８２１−例示的なＶＨ
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 配列番号８２２−例示的なＶＨ
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 配列番号８２３−例示的なＶＨ
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 配列番号８２４−例示的なＶＨ
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 配列番号８２５−例示的なＶＨ
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 配列番号８２６−例示的なＶＨ
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 配列番号８２７−例示的なＶＨ
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 配列番号８２８−例示的なＶＨ
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 配列番号８２９−例示的なＶＨ
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 配列番号８３０−例示的なＶＨ
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 配列番号８３１−例示的なＶＨ
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参照による援用
本明細書で言及される全ての出版物及び特許は、個々の出版物又は特許の各々が具体的に且つ個々に参照により援用されていると示されているがごとく、それら全体が参照により本明細書に援用される。
本開示の特定の実施形態を論じたが、上記明細書は説明的なものであり、限定的なものではない。本明細書及び下記請求項の確認により当業者には本開示の多くの変形形態が明らかになるであろう。本開示の全範囲は、本請求項をそれらの全範囲の均等物とともに、及び本明細書をそのような変形形態ともに参照することにより決定されるべきである。

Claims (122)

  1. 重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片であって、前記ＶＨが：
    ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号３の配列中に任意選択的に存在するＶＨ−ＣＤＲ１；
    ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号４の配列中に任意選択的に存在するＶＨ−ＣＤＲ２；及び
    ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号５の配列中に任意選択的に存在するＶＨ−ＣＤＲ３を含み；
    且つ前記ＶＬが：
    ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号８の配列中に任意選択的に存在するＶＬ−ＣＤＲ１；
    ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号９の配列中に任意選択的に存在するＶＬ−ＣＤＲ２；及び
    ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するが、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換、欠失又は挿入が配列番号１０の配列中に任意選択的に存在するＶＬ−ＣＤＲ３を含み；
    前記アミノ酸置換、欠失又は挿入が、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて７．４のｐＨで試験する場合、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬを有する抗体又は抗原結合断片と比較して、ヒトＰＡＲ２に対する前記抗体又はその抗原結合断片の結合親和性を１０００、８００、７００、５００、４００、３００、２００、１００、５０又は１０倍以下低減する、抗体又はその抗原結合断片。
  2. 前記アミノ酸置換、欠失又は挿入が相同置換を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  3. 重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片であって、前記ＶＨが：
    ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１；
    ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するが、ヒスチジンが、配列番号４の１〜１７位に相当するアミノ酸位置のいずれか１つ以上で任意選択的に存在するＶＨ−ＣＤＲ２；及び
    ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を有するが、ヒスチジンが、配列番号５の１〜８位に相当するアミノ酸位置のいずれか１つ以上で任意選択的に存在するＶＨ−ＣＤＲ３を含み；
    且つ前記ＶＬが：
    ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１；
    ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２；及び
    ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するが、ヒスチジンが、配列番号１０の１〜１４位に相当するアミノ酸位置のいずれか１つ以上で任意選択的に存在するＶＬ−ＣＤＲ３を含む、抗体又はその抗原結合断片。
  4. 前記ＶＨが：
    ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１、
    ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２、
    ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含み、
    且つ前記ＶＬが：
    ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１、
    ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２、
    ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３を含む、
    請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  5. 前記ＶＨが：
    ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１、
    ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２、
    ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含み、
    且つ前記ＶＬが：
    ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１、
    ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２、
    ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３を含む、
    請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  6. ヒスチジンが、配列番号４の５位、８位、１２位、１６位、及び１７位に相当するアミノ酸位置に存在し；且つヒスチジンが、配列番号５の２位及び３位に相当するアミノ酸位置に存在する、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  7. ヒスチジンが、配列番号４の５位に相当するアミノ酸位置に存在する、請求項３又は５〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  8. ヒスチジンが、配列番号４の７位に相当するアミノ酸位置に存在する、請求項３又は５〜７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  9. ヒスチジンが、配列番号４の８位に相当するアミノ酸位置に存在する、請求項３又は５〜７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  10. ヒスチジンが、配列番号４の１２位に相当するアミノ酸位置に存在する、請求項１又は５〜７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  11. ヒスチジンが、配列番号４の１５位に相当するアミノ酸位置に存在する、請求項３又は５〜１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  12. ヒスチジンが、配列番号４の１６位に相当するアミノ酸位置に存在する、請求項３又は５〜１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  13. ヒスチジンが、配列番号４の１７位に相当するアミノ酸位置に存在する、請求項１又は５〜１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  14. ヒスチジンが、配列番号４の５位及び８位に相当するアミノ酸位置に存在する、請求項３又は５〜１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  15. ヒスチジンが、配列番号４の５位、８位、１２位、及び１６位に相当するアミノ酸位置に存在する、請求項３又は５〜１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  16. ヒスチジンが、配列番号４の５位、８位、１２位、１６及び１７位に相当するアミノ酸位置に存在する、請求項３又は５〜１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  17. ヒスチジンが、配列番号５の２位に相当するアミノ酸位置に存在する、請求項３又は５〜１６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  18. ヒスチジンが、配列番号５の３位に相当するアミノ酸位置に存在する、請求項３又は５〜１７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  19. ヒスチジンが、配列番号５の２位及び３位に相当するアミノ酸位置に存在する、請求項３又は５〜１８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  20. ヒスチジンが、配列番号１０の１位に相当するアミノ酸位置に存在する、請求項３又は５〜１９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  21. ヒスチジンが、配列番号１０の５位に相当するアミノ酸位置に存在する、請求項３又は５〜２０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  22. ヒスチジンが、配列番号１０の６位に相当するアミノ酸位置に存在する、請求項３又は５〜２１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  23. ヒスチジンが、配列番号１０の１４位に相当するアミノ酸位置に存在する、請求項３又は５〜２２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  24. 前記ＶＨ−ＣＤＲ２が、配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４、１０４、１１４、１２４、１３４、１４４、１５４、１６４、１７４、１８４、１９４、２０４、２１４、２２４、２３４、２４４、２５４、２６４、２７４、２８４、２９４、３０４、３１４、３２４、３３４、３４４、３５４、３６４、３７４、３８４、３９４、４０４、４１４、４２４、４３４、４４４、４５４、４６４、４７４、４８４、４９４、５０４、５１４、５２４、５３４、５４４、５５４、５６４、５７４、５８４、５９４、６０４、６１４、６２４、６３４、６４４、６５４、６６４、６７４、６８４、６９４、７０４、７１４、７２４、７３４、７４４、７５４、７６４、７７４、７８４、７９４、及び８１１〜８１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  25. 前記ＶＨ−ＣＤＲ３が、配列番号５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５、１０５、１１５、１２５、１３５、１４５、１５５、１６５、１７５、１８５、１９５、２０５、２１５、２２５、２３５、２４５、２５５、２６５、２７５、２８５、２９５、３０５、３１５、３２５、３３５、３４５、３５５、３６５、３７５、３８５、３９５、４０５、４１５、４２５、４３５、４４５、４５５、４６５、４７５、４８５、４９５、５０５、５１５、５２５、５３５、５４５、５５５、５６５、５７５、５８５、５９５、６０５、６１５、６２５、６３５、６４５、６５５、６６５、６７５、６８５、６９５、７０５、７１５、７２５、７３５、７４５、７５５、７６５、７７５、７８５、７９５、及び８１９〜８２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３又は２４に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  26. 前記ＶＬ−ＣＤＲ３が、配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０及び８００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３、２４又は２５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  27. 前記ＶＨ−ＣＤＲ２が、配列番号１４に相当するアミノ酸配列を含み；前記ＶＨ−ＣＤＲ３が、配列番号１５に相当するアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬ−ＣＤＲ３が、配列番号２０に相当するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  28. 前記ＶＨ−ＣＤＲ２が、配列番号８１１に相当するアミノ酸配列を含み；前記ＶＨ−ＣＤＲ３が、配列番号８１９に相当するアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬ−ＣＤＲ３が、配列番号１０又は２０に相当するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  29. 前記ＶＨ−ＣＤＲ２が、配列番号８１４に相当するアミノ酸配列を含み；前記ＶＨ−ＣＤＲ３が、配列番号８２０に相当するアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬ−ＣＤＲ３が、配列番号１０又は２０に相当するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  30. 前記ＶＨ−ＣＤＲ２が、配列番号８１６に相当するアミノ酸配列を含み；前記ＶＨ−ＣＤＲ３が、配列番号１５に相当するアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬ−ＣＤＲ３が、配列番号１０又は２０に相当するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  31. 前記ＶＨ−ＣＤＲ２が、配列番号８１８に相当するアミノ酸配列を含み；前記ＶＨ−ＣＤＲ３が、配列番号１５に相当するアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬ−ＣＤＲ３が、配列番号１０又は２０に相当するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  32. 前記ＶＨが、配列番号８０３〜８０６の各々と少なくとも９０％同一であるフレームワーク領域を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  33. 前記ＶＨが、配列番号８０３〜８０６の各々と少なくとも９５％同一であるフレームワーク領域を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  34. 前記ＶＨが、配列番号８０３〜８０６に相当するフレームワーク領域を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  35. 前記ＶＬが、配列番号８０７〜８１０の各々と少なくとも９０％同一であるフレームワーク領域を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  36. 前記ＶＬが、配列番号８０７〜８１０の各々と少なくとも９５％同一であるフレームワーク領域を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  37. 前記ＶＬが、配列番号８０７〜８１０に相当するフレームワーク領域を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  38. 前記ＶＨが、配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２、１１２、１２２、１３２、１４２、１５２、１６２、１７２、１８２、１９２、２０２、２１２、２２２、２３２、２４２、２５２、２６２、２７２、２８２、２９２、３０２、３１２、３２２、３３２、３４２、３５２、３６２、３７２、３８２、３９２、４０２、４１２、４２２、４３２、４４２、４５２、４６２、４７２、４８２、４９２、５０２、５１２、５２２、５３２、５４２、５５２、５６２、５７２、５８２、５９２、６０２、６１２、６２２、６３２、６４２、６５２、６６２、６７２、６８２、６９２、７０２、７１２、７２２、７３２、７４２、７５２、７６２、７７２、７８２、７９２及び８２１〜８３１からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  39. 前記ＶＬが、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、１２７、１３７、１４７、１５７、１６７、１７７、１８７、１９７、２０７、２１７、２２７、２３７、２４７、２５７、２６７、２７７、２８７、２９７、３０７、３１７、３２７、３３７、３４７、３５７、３６７、３７７、３８７、３９７、４０７、４１７、４２７、４３７、４４７、４５７、４６７、４７７、４８７、４９７、５０７、５１７、５２７、５３７、５４７、５５７、５６７、５７７、５８７、５９７、６０７、６１７、６２７、６３７、６４７、６５７、６６７、６７７、６８７、６９７、７０７、７１７、７２７、７３７、７４７、７５７、７６７、７７７、７８７、及び７９７からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  40. 前記ＶＨが、配列番号８２１に相当するアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬが、配列番号７又は１７に相当するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  41. 前記ＶＨが、配列番号８２４に相当するアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬが、配列番号７又は１７に相当するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  42. 前記ＶＨが、配列番号８２７に相当するアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬが、配列番号７又は１７に相当するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  43. 前記ＶＨが、配列番号８３１に相当するアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬが、配列番号７又は１７に相当するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  44. 前記ＶＨが、配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＬが、配列番号１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３〜３９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  45. 前記抗体又は抗原結合断片が抗原結合断片である、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  46. 前記抗原結合断片がｓｃＦｖである、請求項４５に記載の抗体又は抗原結合断片。
  47. 前記抗原結合断片がＦａｂ’である、請求項４５に記載の抗体又は抗原結合断片。
  48. 前記抗体又は抗原結合断片が抗体である、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  49. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４８に記載の抗体又は抗原結合断片。
  50. 前記抗体がＩｇＧ抗体である、請求項４８又は４９に記載の抗体又は抗原結合断片。
  51. 前記抗体又は抗原結合断片がヒト化されている、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  52. 前記抗体又は抗原結合断片がヒトのものである、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  53. 前記ＶＨが、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、１１１、１２１、１３１、１４１、１５１、１６１、１７１、１８１、１９１、２０１、２１１、２２１、２３１、２４１、２５１、２６１、２７１、２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４８１、４９１、５０１、５１１、５２１、５３１、５４１、５５１、５６１、５７１、５８１、５９１、６０１、６１１、６２１、６３１、６４１、６５１、６６１、６７１、６８１、６９１、７０１、７１１、７２１、７３１、７４１、７５１、７６１、７７１、７８１、７９１、及び８３３〜８４１のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  54. 前記ＶＨが、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、１１１、１２１、１３１、１４１、１５１、１６１、１７１、１８１、１９１、２０１、２１１、２２１、２３１、２４１、２５１、２６１、２７１、２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４８１、４９１、５０１、５１１、５２１、５３１、５４１、５５１、５６１、５７１、５８１、５９１、６０１、６１１、６２１、６３１、６４１、６５１、６６１、６７１、６８１、６９１、７０１、７１１、７２１、７３１、７４１、７５１、７６１、７７１、７８１、７９１、及び８３３〜８４１のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項５３に記載の抗体又は抗原結合断片。
  55. 前記ＶＨが、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、１１１、１２１、１３１、１４１、１５１、１６１、１７１、１８１、１９１、２０１、２１１、２２１、２３１、２４１、２５１、２６１、２７１、２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４８１、４９１、５０１、５１１、５２１、５３１、５４１、５５１、５６１、５７１、５８１、５９１、６０１、６１１、６２１、６３１、６４１、６５１、６６１、６７１、６８１、６９１、７０１、７１１、７２１、７３１、７４１、７５１、７６１、７７１、７８１、７９１、及び８３３〜８４１のいずれか１つの前記ヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項５３に記載の抗体又は抗原結合断片。
  56. 前記ＶＬが、配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、１１６、１２６、１３６、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、１９６、２０６、２１６、２２６、２３６、２４６、２５６、２６６、２７６、２８６、２９６、３０６、３１６、３２６、３３６、３４６、３５６、３６６、３７６、３８６、３９６、４０６、４１６、４２６、４３６、４４６、４５６、４６６、４７６、４８６、４９６、５０６、５１６、５２６、５３６、５４６、５５６、５６６、５７６、５８６、５９６、６０６、６１６、６２６、６３６、６４６、６５６、６６６、６７６、６８６、６９６、７０６、７１６、７２６、７３６、７４６、７５６、７６６、７７６、７８６、及び７９６のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  57. 前記ＶＬが、配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、１１６、１２６、１３６、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、１９６、２０６、２１６、２２６、２３６、２４６、２５６、２６６、２７６、２８６、２９６、３０６、３１６、３２６、３３６、３４６、３５６、３６６、３７６、３８６、３９６、４０６、４１６、４２６、４３６、４４６、４５６、４６６、４７６、４８６、４９６、５０６、５１６、５２６、５３６、５４６、５５６、５６６、５７６、５８６、５９６、６０６、６１６、６２６、６３６、６４６、６５６、６６６、６７６、６８６、６９６、７０６、７１６、７２６、７３６、７４６、７５６、７６６、７７６、７８６、及び７９６のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項５６に記載の抗体又は抗原結合断片。
  58. 前記ＶＬが、配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、１１６、１２６、１３６、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、１９６、２０６、２１６、２２６、２３６、２４６、２５６、２６６、２７６、２８６、２９６、３０６、３１６、３２６、３３６、３４６、３５６、３６６、３７６、３８６、３９６、４０６、４１６、４２６、４３６、４４６、４５６、４６６、４７６、４８６、４９６、５０６、５１６、５２６、５３６、５４６、５５６、５６６、５７６、５８６、５９６、６０６、６１６、６２６、６３６、６４６、６５６、６６６、６７６、６８６、６９６、７０６、７１６、７２６、７３６、７４６、７５６、７６６、７７６、７８６、及び７９６のいずれか１つの前記ヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項５６に記載の抗体又は抗原結合断片。
  59. 前記ＶＨが、配列番号１１と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  60. 前記ＶＨが、配列番号１１と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項５９に記載の抗体又は抗原結合断片。
  61. 前記ＶＨが、配列番号１１の前記ヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項５９に記載の抗体又は抗原結合断片。
  62. 前記ＶＬが、配列番号１６と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  63. 前記ＶＬが、配列番号１６と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項６２に記載の抗体又は抗原結合断片。
  64. 前記ＶＬが、配列番号１６の前記ヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項６２に記載の抗体又は抗原結合断片。
  65. 前記抗体又は抗原結合断片がＰＡＲ２に結合する、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  66. 前記抗体又は抗原結合断片が、トリプシン、トリプターゼ及び／又はマトリプターゼのＰＡＲ２との相互作用を妨げる、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  67. 前記抗体又は抗原結合断片が、トリプシン、トリプターゼ及び／又はマトリプターゼによるＰＡＲ２の切断を妨げる、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  68. 前記抗体又は抗原結合断片が、ＰＡＲ２の細胞外ドメインの切断を妨げる、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  69. 前記抗体又は抗原結合断片が、テザーリガンドの露出を阻害する、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  70. 前記抗体又は抗原結合断片が、前記テザーリガンドのＰＡＲ２の第２の膜貫通ループとの相互作用を妨げる、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  71. 前記抗体又は抗原結合断片が、ｐＨ６．０よりｐＨ７．４でより高い親和性を有してＰＡＲ２に結合する、請求項１〜７０のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  72. 前記抗体又は抗原結合断片が、約５ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６５０ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ又は５０ｐＭ未満のＫＤを有してｐＨ７．４でＰＡＲ２に結合する、請求項１〜７０のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  73. 前記抗体又は抗原結合断片が、約７００ｐＭ未満のＫＤを有してｐＨ７．４でＰＡＲ２に結合する、請求項７２に記載の抗体又は抗原結合断片。
  74. 前記抗体又は抗原結合断片が、約１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、８０ｎＭ、又は１００ｎＭより大きいＫＤを有してｐＨ６．０でＰＡＲ２に結合する、請求項１〜７０のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  75. 前記抗体又は抗原結合断片が、約３０ｎＭより大きいＫＤを有してｐＨ６．０でＰＡＲ２に結合する、請求項１〜７０のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  76. 前記抗体又は抗原結合断片が、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて、ｐＨ７．４で配列番号３〜５及び８〜１０の前記ＣＤＲを有する抗体又は抗原結合断片と競合する場合、１００ｎＭ未満のＩＣ５０を有する、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  77. 前記抗体又は抗原結合断片が、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて、ｐＨ７．４で配列番号３〜５及び８〜１０の前記ＣＤＲを有する抗体又は抗原結合断片と競合する場合、５０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する、請求項１〜７６のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  78. 前記抗体又は抗原結合断片が、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて、ｐＨ７．４で配列番号３〜５及び８〜１０の前記ＣＤＲを有する抗体又は抗原結合断片と競合する場合、４０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  79. 前記抗体又は抗原結合断片が、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて、ｐＨ６．０で配列番号３〜５及び８〜１０の前記ＣＤＲを有する抗体又は抗原結合断片と競合する場合、５００ｎＭより大きいＩＣ５０を有する、請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  80. 前記抗体又は抗原結合断片が、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて、ｐＨ６．０で配列番号３〜５及び８〜１０の前記ＣＤＲを有する抗体又は抗原結合断片と競合する場合、１０００ｎＭより大きいＩＣ５０を有する、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  81. 前記抗体又は抗原結合断片が、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて、ｐＨ６．０で配列番号３〜５及び８〜１０の前記ＣＤＲを有する抗体又は抗原結合断片と競合する場合、１１００ｎＭより大きいＩＣ５０を有する、請求項１〜８０のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  82. 前記抗体又は抗原結合断片が、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて、配列番号３〜５及び８〜１０の前記ＣＤＲを有する抗体又は抗原結合断片と競合する場合、ｐＨ６．０よりｐＨ７．４で２０倍を超えて低いＩＣ５０を有する、請求項１〜８１のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  83. 前記抗体又は抗原結合断片が、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて、配列番号３〜５及び８〜１０の前記ＣＤＲを有する抗体又は抗原結合断片と競合する場合、ｐＨ６．０よりｐＨ７．４で２５倍を超えて低いＩＣ５０を有する、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  84. 前記抗体又は抗原結合断片が、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて、配列番号３〜５及び８〜１０の前記ＣＤＲを有する抗体又は抗原結合断片と競合する場合、ｐＨ６．０よりｐＨ７．４で３０倍を超えて低いＩＣ５０を有する、請求項１〜８３のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  85. 前記抗体又は抗原結合断片が、ヒトＡ５４９細胞におけるカルシウム流入アッセイにおいて３．０×１０−１０Ｍ未満のＩＣ５０を有する、請求項１〜８４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  86. 前記抗体又は抗原結合断片が、ヒトＡ５４９細胞におけるカルシウム流入アッセイにおいて１．５×１０−１０Ｍ未満のＩＣ５０を有する、請求項１〜８５のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  87. 前記抗体又は抗原結合断片が、ラットＫＮＲＫ細胞におけるカルシウム流入アッセイにおいて７．０×１０−１０Ｍ未満のＩＣ５０を有する、請求項１〜８６のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  88. 前記抗体又は抗原結合断片が、ラットＫＮＲＫ細胞におけるカルシウム流入アッセイにおいて５．５×１０−１０Ｍ未満のＩＣ５０を有する、請求項１〜８７のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  89. 前記抗体又は抗原結合断片が、カニクイザルＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞におけるカルシウム流入アッセイにおいて７．０×１０−１１Ｍ未満のＩＣ５０を有する、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  90. 前記抗体又は抗原結合断片が、カニクイザルＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞におけるカルシウム流入アッセイにおいて５．０×１０−１１Ｍ未満のＩＣ５０を有する、請求項１〜８９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  91. 前記抗体又は抗原結合断片が、マウスＬＬ／２細胞におけるカルシウム流入アッセイにおいて６．０×１０−１１Ｍ未満のＩＣ５０を有する、請求項１〜９０のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  92. 前記抗体又は抗原結合断片が、マウスＬＬ／２細胞におけるカルシウム流入アッセイにおいて４．０×１０−１１Ｍ未満のＩＣ５０を有する、請求項１〜９１のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  93. 前記抗体又は抗原結合断片が、ヒスチジン改変を欠く抗体又は抗原結合断片より遅く、治療された患者の血清からなくなる、請求項９２のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  94. 任意選択的に存在する前記ヒスチジン又はヒスチジン（複数）が、ＰＡＲ２結合アッセイにおいて７．４のｐＨで試験する場合、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬを有する抗体又は抗原結合断片と比較して、ヒトＰＡＲ２に対する前記抗体又はその抗原結合断片の結合親和性を１０００、８００、７００、５００、４００、３００、２００、１００、５０又は１０倍以下低減する、請求項３又は５〜９３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  95. 請求項１〜９４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を発現することが可能な核酸。
  96. 配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、１１１、１２１、１３１、１４１、１５１、１６１、１７１、１８１、１９１、２０１、２１１、２２１、２３１、２４１、２５１、２６１、２７１、２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４８１、４９１、５０１、５１１、５２１、５３１、５４１、５５１、５６１、５７１、５８１、５９１、６０１、６１１、６２１、６３１、６４１、６５１、６６１、６７１、６８１、６９１、７０１、７１１、７２１、７３１、７４１、７５１、７６１、７７１、７８１、７９１、及び８３３〜８４１のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸。
  97. 前記核酸が、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、１１１、１２１、１３１、１４１、１５１、１６１、１７１、１８１、１９１、２０１、２１１、２２１、２３１、２４１、２５１、２６１、２７１、２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４８１、４９１、５０１、５１１、５２１、５３１、５４１、５５１、５６１、５７１、５８１、５９１、６０１、６１１、６２１、６３１、６４１、６５１、６６１、６７１、６８１、６９１、７０１、７１１、７２１、７３１、７４１、７５１、７６１、７７１、７８１、７９１、及び８３３〜８４１のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項９６に記載の核酸。
  98. 前記核酸が、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、１１１、１２１、１３１、１４１、１５１、１６１、１７１、１８１、１９１、２０１、２１１、２２１、２３１、２４１、２５１、２６１、２７１、２８１、２９１、３０１、３１１、３２１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１、３９１、４０１、４１１、４２１、４３１、４４１、４５１、４６１、４７１、４８１、４９１、５０１、５１１、５２１、５３１、５４１、５５１、５６１、５７１、５８１、５９１、６０１、６１１、６２１、６３１、６４１、６５１、６６１、６７１、６８１、６９１、７０１、７１１、７２１、７３１、７４１、７５１、７６１、７７１、７８１、７９１、及び８３３〜８４１のいずれか１つの前記ヌクレオチド配列を含む、請求項９６に記載の核酸。
  99. 配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、１１６、１２６、１３６、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、１９６、２０６、２１６、２２６、２３６、２４６、２５６、２６６、２７６、２８６、２９６、３０６、３１６、３２６、３３６、３４６、３５６、３６６、３７６、３８６、３９６、４０６、４１６、４２６、４３６、４４６、４５６、４６６、４７６、４８６、４９６、５０６、５１６、５２６、５３６、５４６、５５６、５６６、５７６、５８６、５９６、６０６、６１６、６２６、６３６、６４６、６５６、６６６、６７６、６８６、６９６、７０６、７１６、７２６、７３６、７４６、７５６、７６６、７７６、７８６、及び７９６のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸。
  100. 前記核酸が、配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、１１６、１２６、１３６、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、１９６、２０６、２１６、２２６、２３６、２４６、２５６、２６６、２７６、２８６、２９６、３０６、３１６、３２６、３３６、３４６、３５６、３６６、３７６、３８６、３９６、４０６、４１６、４２６、４３６、４４６、４５６、４６６、４７６、４８６、４９６、５０６、５１６、５２６、５３６、５４６、５５６、５６６、５７６、５８６、５９６、６０６、６１６、６２６、６３６、６４６、６５６、６６６、６７６、６８６、６９６、７０６、７１６、７２６、７３６、７４６、７５６、７６６、７７６、７８６、及び７９６のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項９９に記載の核酸。
  101. 前記核酸が、配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、１１６、１２６、１３６、１４６、１５６、１６６、１７６、１８６、１９６、２０６、２１６、２２６、２３６、２４６、２５６、２６６、２７６、２８６、２９６、３０６、３１６、３２６、３３６、３４６、３５６、３６６、３７６、３８６、３９６、４０６、４１６、４２６、４３６、４４６、４５６、４６６、４７６、４８６、４９６、５０６、５１６、５２６、５３６、５４６、５５６、５６６、５７６、５８６、５９６、６０６、６１６、６２６、６３６、６４６、６５６、６６６、６７６、６８６、６９６、７０６、７１６、７２６、７３６、７４６、７５６、７６６、７７６、７８６、及び７９６のいずれか１つの前記ヌクレオチド配列を含む、請求項９９に記載の核酸。
  102. 配列番号１１と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸。
  103. 前記核酸が、配列番号１１と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１０２に記載の核酸。
  104. 前記核酸が、配列番号１１の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項１０２に記載の核酸。
  105. 配列番号１６と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸。
  106. 前記核酸が、配列番号１６と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１０５に記載の核酸。
  107. 前記核酸が、配列番号１６の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項１０５に記載の核酸。
  108. 請求項９５〜１０７のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
  109. ａ）請求項９６〜９８又は１０２〜１０４のいずれか一項に記載の核酸；及びｂ）請求項９９〜１０１及び１０５〜１０７のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクターのセット。
  110. 請求項１０８又は１０９に記載のベクターのうちの１つ以上を含む宿主細胞。
  111. 薬学的に許容される担体及び請求項１〜９４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を含む組成物。
  112. 請求項１〜９４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む凍結乾燥組成物。
  113. 請求項１〜９４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、再構成された凍結乾燥組成物。
  114. 前記組成物が、舐剤、噴霧剤、経口投与、遅延放出又は持続放出、経粘膜投与、シロップ剤、粘膜付着性、バッカル製剤、粘膜付着性錠剤、局所投与、非経口投与、注射、皮下投与、経口溶液、直腸投与、バッカル投与又は経皮投与による投与のために製剤化される、請求項１１１〜１１３のいずれか一項に記載の組成物。
  115. 請求項１〜９４のいずれか一項に記載の抗体若しくは抗原結合断片又は請求項１１１〜１１４のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。
  116. 必要とする対象において疼痛を治療するための方法であって、治療有効量の請求項１〜９４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を前記対象に投与することを含む方法。
  117. 必要とする対象において疼痛を治療するための方法であって、治療有効量の請求項１１１〜１１４のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
  118. 前記疼痛が、侵害受容性疼痛、神経因性疼痛、及び混合型疼痛からなる群から選択される、請求項１１６又は１１７に記載の方法。
  119. 前記疼痛が、頭痛、慢性頭痛、片頭痛、癌、ウイルス感染、関節リウマチ、変形性関節症、クローン病、肝疾患、多発性硬化症、脊髄損傷、帯状疱疹後神経痛、糖尿病性ニューロパシー、腰痛、炎症性心疾患、腎疾患、胃炎、歯肉炎、歯周疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、自己免疫疾患、過敏性腸症候群、線維筋痛症、下肢痛、脚不穏症候群、糖尿病性ニューロパシー、アレルギー病態、外科手技、急性若しくは慢性の身体的傷害、骨折若しくは圧挫、脊髄損傷、炎症性疾患、非炎症性の神経因性疼痛病態若しくは機能傷害性疼痛病態、又はこれらの組み合わせと関連する、請求項１１６又は１１７のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記疼痛が変形性関節症疼痛である、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記対象がヒトである、請求項１１６〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
  122. 培養細胞中で請求項９５〜１０６のいずれか一項に記載の核酸を発現させる工程と、前記抗体又は抗原結合断片を精製する工程とを含む、請求項１〜９４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を作製する方法。
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