JP2020509379A - マイクロ流体デバイスおよび関連する方法 - Google Patents

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Abstract

マイクロ流体デバイスは、試料を受け取るように構成された入口ポートと、入口ポートに流体的に結合された第１反応室と、入口ポートに流体的に結合された第１ポンプと、混合室に流体的に結合された第２ポンプと、第１反応室および混合室に流体的に結合された計量チャネルと、混合室に流体的に結合された１つまたは複数の第２反応室と、を備えている。第１ポンプは、流体を、入口ポートから第１反応室におよび第１ポンプから入口ポートに、移動させるように構成されている。第２ポンプは、流体を、第２ポンプから混合室に第１反応室から混合室におよび混合室から１つまたは複数の第２反応室に、移動するように構成されている。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年２月２８日に出願された「マイクロ流体デバイスおよび関連方法」と題する米国特許出願第６２／４６４，５７６号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
政府の利益に関する声明
本発明は、米国保健福祉省により授与されたＨＨＳＯ１００２０１４０００１１Ｃの下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本開示は、マイクロ流体デバイスに関し、より詳細には、診断分析を実施するために使用されるマイクロ流体デバイスに関する。
マイクロ流体デバイスは、多くの用途で幾何学的に制約されたネットワーク内の流体の流れを正確に制御するように設計されている。いくつかの例では、マイクロ流体デバイスを使用して、等温核酸増幅法（例えば、レコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＰＡ））または切断および伸長増幅反応法（Ｎｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＮＥＡＲ）））に基づく分析などの特定の分子診断分析を実行し、核酸のトレースレベルを検出する。場合によっては、マイクロ流体デバイスは、ポイントオブケア（ＰＯＣ）テストを容易にし、インフルエンザ（Ｆｌｕ）や呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を検出できる分析などの診断分析の利用可能性と速度とを向上させることができる。例えば、マイクロ流体デバイスは、インフルエンザおよび／またはＲＳＶウイルスに存在する標的核酸の迅速な検出を促進する可能性がある。
本明細書で開示されるマイクロ流体デバイスは、１つまたは複数の標的核酸を検出できる診断分析（例えば、インフルエンザ（Ｆｌｕ）および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を検出できる分析）を実行するために設計されている。例えば、マイクロ流体デバイスは、カートリッジアセンブリ、エラストマー層、および蓋を含む。カートリッジアセンブリおよびエラストマー層はともに、マイクロ流体デバイスに提供された試料中の１つまたは複数の標的核酸の存在を検出するための分析を実行できる一連の、流体的に連結されたポート、チャネル、室（ｃｈａｍｂｅｒ）、リザーバ、バルブ、および付属コンポーネントを提供する。蓋は、カートリッジアセンブリを覆い、カートリッジアセンブリ内で１つまたは複数の標的核酸が検出され得る層を提供する。
カートリッジアセンブリは、カートリッジ、キャップ、シール、プラグ、磁石、第１反応ペレットおよび第２反応ペレットを含む。カートリッジは、マイクロ流体ネットワークの形状と、マイクロ流体ネットワークへの入口ポートを提供する試料室を規定する。試料室は、試料採取装置（例えば、綿棒）を収容するサイズおよび形状であり、比較的広い第１部分および比較的狭い第２部分を含むので、液体試薬が試料室に送られた際には試料室内の綿棒の先端が完全に濡れる。
カートリッジは、マイクロ流体ネットワークに流体を押し込むか、マイクロ流体ネットワークから流体を引き出すように動作可能な２つのオンボードポンプも規定する。カートリッジは、マイクロ流体デバイス内で多重化が実行され得るように、第１反応ペレットでプライミングされる第１反応室、混合室、およびそれぞれの第２反応ペレットでプライミングされる複数の第２反応室を規定する。第２反応室内での混合は、混合および音響マイクロストリーミングの一方または両方を介して起こり得る。各第２反応室は、第２反応室が流体で満たされると発生する背圧の結果として第２反応室間の充填レベルが自動的に平衡化されるようにするために、第２反応室内の流体の均等な分配を可能にする同一の空気ばねを含む。したがって、第２反応室は、正確で精密な同等の体積の流体で満たされ、同等の圧力を達成することができる。
さらに、カートリッジと蓋との間に形成され、マイクロ流体ネットワークの外部にある容積は、マイクロ流体ネットワーク内の空気圧を緩衝する廃棄物リザーバ（例えば、空気リザーバ）を提供するので、マイクロ流体デバイスは別個の圧力平衡機構を備える必要がない。カートリッジ内の空洞と、空洞に沿って位置するエラストマー層の対応する領域とが協働して、マイクロ流体ネットワークに沿った選択位置にバルブを形成し、流体の流れを制御することができる。同様の分析を実行するために使用される従来のデバイスと比較して、周囲環境への漏れ汚染のリスクが大幅に低減されるように、閉じたシステムを提供するように、マイクロ流体デバイスは構成される。少なくとも部分的にマイクロ流体デバイスの構成により、マイクロ流体デバイスを使用して、約１５分未満でＦｌｕ／ＲＳＶ分析を実行することができる。
例えば、いくつかの実施形態において、本明細書では、マイクロ流体デバイスであって、試料を受け取るように構成された入口ポートと、入口ポートに流体的に結合された第１反応室と、入口ポートに流体的に結合された第１ポンプと、混合室に流体的に結合された第２ポンプと、第１反応室および混合室に流体的に結合された計量チャネルと、混合室に流体的に結合された１つまたは複数の第２反応室と、を備え、第１ポンプは、流体を、入口ポートから第１反応室におよび第１ポンプから入口ポートに、移動させるように構成されており、第２ポンプは、流体を、第２ポンプから混合室に第１反応室から混合室におよび混合室から１つまたは複数の第２反応室に、移動させるように構成されている、マイクロ流体デバイスが提供される。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイス内の流体圧力を調節するように構成された廃棄物リザーバをさらに備えている。いくつかの実施形態において、第１反応室は、第１の増幅試薬のセット（例えば、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）試薬）を含む。いくつかの実施形態において、ＲＰＡ試薬は凍結乾燥されている。いくつかの実施形態において、第１反応室は、触媒試薬（例えば、マグネシウム）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１の増幅試薬セットはオリゴマーを含む。いくつかの実施形態において、混合室は、第２の増幅試薬セット（例えば、ＲＰＡ試薬）を含む。いくつかの実施形態において、ＲＰＡ試薬は凍結乾燥されている。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の第２反応室はそれぞれ、第２の増幅試薬セット（例えば、ＲＰＡ試薬）を含む。いくつかの実施形態において、ＲＰＡ試薬は凍結乾燥されている。いくつかの実施形態において、第２の増幅試薬セットはオリゴマーを含む。いくつかの実施形態において、第１ポンプは第１緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、第１ポンプは第１緩衝液および溶解剤を含む。いくつかの実施形態において、第２ポンプは第２緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、第２ポンプは第２緩衝液および溶解剤を含む。いくつかの実施形態において、第１ポンプは触媒試薬を含む。いくつかの実施形態において、第２ポンプは触媒試薬を含む。いくつかの実施形態において、触媒試薬はマグネシウムを含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の第２反応室のそれぞれは検出室である。いくつかの実施形態において、各検出室の一部は光学的に透明である。いくつかの実施形態において、第１反応室は、加熱ユニットに結合されるように構成されている。いくつかの実施形態において、入口ポートは、加熱ユニットに結合されるように構成されている。いくつかの実施形態において、第１反応室は、混合手段を備えているか、混合手段に結合されている。いくつかの実施形態において、混合室は、混合手段を含むか、混合手段に結合されている。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の第２反応室はそれぞれ、混合手段を含むか、または混合手段に結合されている。いくつかの実施形態において、混合手段は磁石である。いくつかの実施形態において、混合手段は、音響ストリーミングによって動作する。いくつかの実施形態において、入口ポートは試料を含み、第１ポンプは第１緩衝液を含み、第１ポンプは第１緩衝液を第１ポンプから入口ポートに送って試薬と第１緩衝液とを含む希釈試料を生成するように構成されている。いくつかの実施形態において、第１反応室は第１の増幅試薬セットを含み、第１ポンプは、希釈試料の一部を入口ポートから第１反応室に提供して、希釈試料と第１の増幅試薬セットとを含む第１反応混合物を生成するように構成されている。いくつかの実施形態において、第２ポンプは、計量チャネルを介して第１反応室から混合室に第１反応混合物の一部を提供するように構成されている。いくつかの実施形態において、第２ポンプは第２緩衝液を含み、第２ポンプは、計量チャネルを介して第２ポンプから混合室に第２緩衝液を送って、第２緩衝液が第１反応混合物の一部と結合して希釈された第１反応混合物を生成するように構成されている。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の第２反応室は、それぞれ第２の増幅試薬セットを含み、第２ポンプは混合室から１つまたは複数の第２反応室のそれぞれに、希釈された第１反応混合物の一部を送って希釈された第１反応混合物および第２の増幅試薬セットを含む第２反応混合物を生成するように構成されている。いくつかの実施形態において、第２の増幅試薬セットはオリゴマーを含む。いくつかの実施形態において、混合室は第２の増幅試薬セットを含み、第２試薬室は第２緩衝液を含み、第２ポンプは、第２試薬室から計量チャネルを介して混合室に第２緩衝液を送るよう構成され、第２緩衝液は、第１反応混合物の一部および第２の増幅試薬セットと結合して第２反応混合物を生成する。いくつかの実施形態において、第２ポンプは、第２反応混合物の一部を１つまたは複数の第２反応室のそれぞれに送るように構成されている。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の第２反応室のそれぞれは、オリゴマーを含む。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つの第２反応室を含む。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、一連のバルブをさらに含む。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、試料を処理するとともに試料をマイクロ流体デバイスに送るように構成されたリーダにマイクロ流体デバイスを接続するための位置合わせ穴をさらに含む。いくつかの実施形態において、接続ポートは、リーダと係止可能に係合するように構成されている。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは使い捨てカートリッジである。いくつかの実施形態において、第１ポンプおよび第２ポンプはシリンジポンプである。いくつかの実施形態において、入口ポートはキャップを含む。いくつかの実施形態において、キャップは、ガスケットシールリブを含むガスケットを含む。いくつかの実施形態において、キャップは、キャップを開位置に固定するための戻り止め機能を備えている。
追加の実施形態は、本明細書に記載のマイクロ流体デバイスを受け入れるように構成されたリーダを提供し、リーダは、１つまたは複数の第２反応室内の第２反応産物の存在を検出する検出器を備えている。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスまたはリーダは、キャップの閉鎖または漏れを検出するように構成されたキャップ位置検出コンポーネントを含む。いくつかの実施形態において、キャップ位置検出コンポーネントは、１つまたは複数のコンポーネント（例えば、光学キャップ閉鎖センサおよび／または圧力センサ）を含む。いくつかの実施形態において、光学キャップ閉鎖センサは、キャップが閉じた密封位置にあるときに遮断される光ビームを含む。いくつかの実施形態において、圧力センサは、キャップが圧力に耐える能力を評価する。いくつかの実施形態では、デバイスのポンプを使用して圧力が生成される。いくつかの実施形態において、所定の範囲外の圧力は、密閉されていないキャップを示す。いくつかの実施形態において、リーダは、キャップが密閉されていると識別されない場合、リーダまたはマイクロ流体デバイスの動作を停止するように構成されている。
さらに他の実施形態は、
方法であって、
少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列を含む標的核酸を含む試料流体をマイクロ流体デバイスに提供することと、
等温条件下で少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列を増幅することと、
を含み、
増幅することが、
第１の増幅されたポリヌクレオチド配列を含む第１増幅産物を産生するために、標的ポリヌクレオチド配列に対して第１回目の増幅を実行することと、
第２の増幅されたポリヌクレオチド配列を含む第２増幅産物を産生するために、第１の増幅されたポリヌクレオチド配列に対して第２回目の増幅を実行することであって、第２の増幅されたポリヌクレオチド配列は、第１回目の増幅中に生成される第１の増幅されたポリヌクレオチド配列内に完全に含まれるより小さい配列を含む、第２回目の増幅を実行することと、
を含む、方法
を提供する。
いくつかの実施形態では、方法は、第２増幅産物を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２増幅産物を検出することは、フルオロフォアおよびクエンチャに連結された第１オリゴヌクレオチドで第２増幅産物を標識して、標識された第２産物を産生することと、標識された第２増幅産物からクエンチャを切断することと、フルオロフォアからの信号を光学的に検出することであって、検出可能な信号は第２増幅産物の存在を示す、検出することとを含む。いくつかの実施形態において、クエンチャの切断は、ヌクレアーゼを使用して実施される。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは二本鎖ＤＮＡを標的とする。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼはホルムアミドピリミン−ＤＮＡグリコシラーゼである。いくつかの実施形態において、増幅するステップは、第１回目の増幅を実行することを含み、増幅はＲＰＡである。いくつかの実施形態において、増幅するステップは、第２回目の増幅を実行することを含み、増幅はＲＰＡである。いくつかの実施形態において、増幅するステップは、増幅がＲＰＡである第１回目の増幅と、増幅がＲＰＡである第２回目の増幅とを実行することを含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、血液、痰、粘液、唾液、涙、または尿である。いくつかの実施形態では、方法は、動物からサンプルを取得するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、サンプルは動物から得られ、動物はヒトである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、動物病原体の標的核酸である。一部の実施形態では、動物病原体は、一本鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルス、または一本鎖ＲＮＡウイルスである。いくつかの実施形態では、動物病原体は細菌である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成二本鎖ＤＮＡまたは合成一本鎖ＤＮＡから選択される。いくつかの実施形態において、標的核酸はウイルスＤＮＡまたはウイルスＲＮＡである。いくつかの実施形態において、動物病原体は、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、または呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、２つの標的ポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、標的核酸は、３つの標的ポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、方法は、サンプルをマイクロ流体デバイスに提供するステップの前に、サンプルをＲＰＡ試薬と混合するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２増幅産物は、試料をマイクロ流体デバイスに提供するステップの後、約３０分未満、約１５分未満、約１０分未満、または約５分未満で検出される。いくつかの実施形態では、第２増幅産物はリアルタイムで検出される。いくつかの実施形態において、方法は、増幅の前に試料を溶解するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、溶解するステップは、試料を溶解剤と組み合わせるステップを含む。いくつかの実施形態において、溶解剤は酵素である。いくつかの実施形態において、溶解するステップは機械的手段を含む。いくつかの実施形態において、溶解するステップは、試料を加熱することを含む。
さらなる実施形態は、
方法であって、
少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列を含む標的核酸を含む試料をマイクロ流体デバイスに提供することと、
少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列を増幅することと、を含み、増幅することは、第１の増幅されたポリヌクレオチド配列を含む第１増幅産物を産生するために、標的ポリヌクレオチド配列に対して第１回目の増幅を実行することと、
追加の増幅産物を形成するために、第１の増幅されたポリヌクレオチド配列に対して１回または複数回の追加の連続した増幅を実行することであって、各連続したｎ＋１回目の増幅からの増幅産物は、前回のｎ回目の間に生成された増幅されたポリヌクレオチド配列内に完全に含まれるより小さい配列である増幅されたポリヌクレオチド配列を含む、追加の連続した増幅を実行することと、
最終増幅産物を産生するために、最後から２番目に増幅されたポリヌクレオチド配列に対して最終回の増幅を実行することと、
最終増幅産物を検出することと、
を含む、方法
を提供する。
他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図、および特許請求の範囲から明らかになるだろう。
この特許または特許出願公開には、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、ＵＳＰＴＯから要求および関連する料金の支払いに応じて提供される。
分析を実施するために使用されるマイクロ流体デバイスの分解図を示す。 図１のマイクロ流体デバイスの正面図を示す。 図１のマイクロ流体デバイスの背面図を示す。 図１のマイクロ流体デバイスのカートリッジの上面図を示す。 図４のカートリッジの底面図を示す。 図４のカートリッジのポンプ室の断面図を示す。 図６のポンプ室内のプラグの断面図を示す。 図４のカートリッジの反応室の断面側面図を示す。 図８の反応室の断面斜視図を示す。 図８の反応室の上面図を示す。 図４のカートリッジに沿ったバルブの上面図を示す。 図１１のバルブの斜視断面図を示す。 図１のマイクロ流体デバイスを使用して分析を実施する方法に対応する図４のカートリッジの一連の概略図を示す。 図１のマイクロ流体デバイスを使用して分析を実施する方法に対応する図４のカートリッジの一連の概略図を示す。 図１のマイクロ流体デバイスを使用して分析を実施する方法に対応する図４のカートリッジの一連の概略図を示す。 図１のマイクロ流体デバイスを使用して分析を実施する方法に対応する図４のカートリッジの一連の概略図を示す。 図１のマイクロ流体デバイスを使用して分析を実施する方法に対応する図４のカートリッジの一連の概略図を示す。 図１のマイクロ流体デバイスを使用して分析を実施する方法に対応する図４のカートリッジの一連の概略図を示す。 図１のマイクロ流体デバイスを使用して分析を実施する方法に対応する図４のカートリッジの一連の概略図を示す。 図１のマイクロ流体デバイスを使用して分析を実施する方法に対応する図４のカートリッジの一連の概略図を示す。 図１のマイクロ流体デバイスを使用して分析を実施する方法に対応する図４のカートリッジの一連の概略図を示す。 図１のマイクロ流体デバイスを使用して分析を実施する方法に対応する図４のカートリッジの一連の概略図を示す。 図１のマイクロ流体デバイスを使用して分析を実施する方法に対応する図４のカートリッジの一連の概略図を示す。 例示的なマイクロ流体デバイスを示す。 例示的なキャップ設計の実施形態を示す。 例示的なキャップ閉鎖検出コンポーネントを示す。 例示的な蓋設計の実施形態を示す。
図１から図３は、分析（例えば、Ｆｌｕ／ＲＳＶ分析などのインフルエンザ（Ｆｌｕ）および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の多重診断）を実施するためのマイクロ流体デバイス１００の分解斜視図、正面（上面）図、および背面（底面）図をそれぞれ示す。マイクロ流体デバイス１００は、マイクロ流体デバイス１００の特定の機能（例えば、バルブ構成、混合操作、加熱、ポンピング、およびそのような機能の監視）を制御するリーダに結合することができる。マイクロ流体デバイス１００は、カートリッジアセンブリ１０２、エラストマー層１０４、および蓋１０６を含む。カートリッジアセンブリ１０２およびエラストマー層１０４はともに、マイクロ流体デバイス１００に提供された試料中の１つまたは複数の標的核酸の存在を検出するための分析を実行できる一連の流体的に連結されたポート、チャネル、室（ｃｈａｍｂｅｒ）、リザーバ、バルブ、および付属コンポーネントを提供する。蓋１０６は、カートリッジアセンブリ１０２を覆い、カートリッジアセンブリ１０２内で１つまたは複数の標的核酸が検出され得る層を提供する。カートリッジアセンブリ１０２は、カートリッジ１０８と、キャップ１１０、シール１１２（例えば、Ｏリングシール）、４つのプラグ１１４、第１磁石１１６、任意の第２磁石１１８、複数（例えば、８個）の第３磁石１２０、第１反応ペレット１２２、任意の中間ペレット１２３、および複数（例えば、８個）の第２反応ペレット１２４を含むいくつかの付属コンポーネント（図２および図３には図示せず）を含む。
図４および図５は、それぞれカートリッジ１０８の上面図および底面図を示している。カートリッジ１０８は、分析中に流体が流れるマイクロ流体ネットワークの形状を規定する。カートリッジ１０８は、開口部１２８を形成する試料室１２６を画定する。試料室１２６は、マイクロ流体ネットワークへの入口ポートを提供し、スワブ（例えば綿棒）および収集チューブなどのさまざまな試料採取装置を収容するようなサイズおよび形状である。例えば、試料室１２６は、比較的広い第１部分１３０と比較的狭い第２部分１３２とを含む。第１部分１３０は、約５ｍｍから約２０ｍｍ（例えば、約１３ｍｍ）の長さと、約８ｍｍから約２０ｍｍ（例えば、約１６ｍｍ）の比較的大きな内径とを有し、第１部分１３０は、広く使用されている試料収集スワブまたはチューブに対応できる。第１部分１３０は、約１０ｍｍから約３０ｍｍ（例えば、約１６ｍｍ）の長さと、約６ｍｍから約１０ｍｍ（例えば、約８ｍｍ）の比較的小さな内径とを有する第２部分１３２に狭まり、その結果、液体試薬が試料室１２６に送られた際には、試料室１２６内の綿棒の先端が完全に濡れる。カートリッジアセンブリ１０２のキャップ１１０およびシール１１２は、（例えば、シール１１２がキャップ１１０を取り囲むように）試料室１２６の開口部１２８に挿入されて、試料室１２６を閉じて密閉するような大きさである。
カートリッジ１０８はまた、第１ポンプ室１３４および第２ポンプ室１３６を画定する。図６は、第１ポンプ室１３４および第２ポンプ室１３６の断面図を示している。プラグ１１４は、第１ポンプ室１３４および第２ポンプ室１３６の各端部領域内に配置されている。図７は、マイクロ流体ネットワークから離れて配置されたプラグ１１４（すなわち、図６の左側のプラグ１１４）の１つの断面図を示している。各プラグ１１４は、リーダのロッド１４０と係合（例えば保持）してロッドがプラグ１１４に力を加えて（例えば、押したり引いたり）、ポンプ室１３４、１３６内の流体をマイクロ流体ネットワークに押し入れたり、または流体をマイクロ流体ネットワークからポンプ室１３４、１３６内に引き出したりできるように形成されたアンダーカット１３８を画定する。ポンプ室１３４、１３６は、それぞれ２つのプラグ１１４とともに、それぞれ、リーダのロッド１４０によって作動してマイクロ流体ネットワーク内の流体の流れを送り込む第１ポンプ１３５および第２ポンプ１３７（例えば、搭載された一体型シリンジポンプ）を形成する。
第１ポンプ１３５および第２ポンプ１３７の初期の閉鎖状態（ａ）では、マイクロ流体ネットワークに隣接して配置されたプラグ１１４は、ポンプ室１３４、１３６のポート１４２、１４４とマイクロ流体ネットワークとの間の流体連通を遮断する。第１ポンプ１３５および第２ポンプ１３７の作動状態（ｂ）では、マイクロ流体ネットワークに隣接して配置されたプラグ１１４は、ポンプ室１３４、１３６のポート１４２、１４４とマイクロ流体ネットワークとの間の流体連通を可能にする。各ポンプ室１３４、１３６は、約５０ｍｍから約１００ｍｍ（例えば、約８０ｍｍ）の長さと、約４ｍｍから約８ｍｍ（例えば、約６ｍｍ）の内径とを有している。プラグ１１４の体積を除いて、ポンプ室１３４、１３６のそれぞれは、約１ｍＬから約５ｍＬ（例えば、約２ｍＬ）の流体体積を収容することができる。
再び図４および図５を参照すると、カートリッジ１０８は、第１反応ペレット１２２でプライミングされるとともに第１磁石１１６を収容する第１反応室１４６を画定する。第１反応室１４６は、約１５ｍｍから約２０ｍｍ（例えば、約１８ｍｍ）の内径と、約１ｍＬから約２ｍＬ（例えば、約１．６ｍＬ）の容積とを有している。カートリッジ１０８はさらに、第２磁石１１８および中間ペレット１２３を収容する混合室１４８を画定する。混合室１４８は、約１２ｍｍから約１８ｍｍ（例えば、約１５ｍｍ）の内径と約０．７ｍＬから約１．７ｍＬ（例えば、約１．１ｍＬ）の容積とを有している。第１反応室１４６内の液体試薬に第１反応ペレット１２２を溶解するべく、第１磁石１１６は、リーダによって作動（例えば、回転）され得る。第２磁石１１８は、混合室１４８内の流体を混合するべく、リーダによって作動（例えば、回転）され得る。第１反応室１４６および混合室１４８は、最大約６０ｒａｄ／秒の磁石回転速度に耐えることができる。分析中、第１磁石１１６および第２磁石１１８は、約６ｒａｄ／秒から約３０ｒａｄ／秒の範囲の角速度でリーダによって回転されてもよい。加えて、第１反応室１４６および混合室１４８は、約８０℃までの温度に耐えることができ、分析中、リーダのそれぞれの隣接する加熱要素によって約３７℃〜約６０℃の温度に加熱され得る。
カートリッジ１０８はまた、多重化がマイクロ流体デバイス１００内で実行され得るように、複数（例えば、８つ）の第２反応室１５０のセットを規定する。各第２反応室１５０は、第２反応ペレット１２４でプライミングされ、任意の第３磁石１２０を収容する。各第２反応室１５０は、約２．０ｍｍ〜約４．０ｍｍ（例えば、約３．０ｍｍ）の内部幅、約５．０ｍｍ〜約１５．０ｍｍ（例えば、約１０．０ｍｍ）の内部長さ、および約１．０ｍｍ〜約３ｍｍ（例えば、約２．２ｍｍ）の内部深さを有しており、したがって、各第２反応室１５０は、約１０μＬ〜約２００μＬ（例えば、約６６μＬ）の容積を有している。いくつかの実施形態において、第３磁石１２０は、第２反応室１５０内の液体試薬に第２反応ペレット１２４を溶解するべく、リーダによって作動（例えば、回転）される。第２反応室１５０は、最大約６０ｒａｄ／秒の磁石回転速度に耐えることができる。いくつかの実施形態において、第３磁石１２０は、約５Ｈｚまでのレートで第２反応室１５０内において垂直に移動することができる。分析中、第３磁石１２０は、リーダにより約６ｒａｄ／秒〜約３０ｒａｄ／秒の範囲の角速度で回転されてもよく、または約１Ｈｚ〜約５Ｈｚのレートで室内において上下されてもよい。加えて、第２反応室１５０は、最大約８０℃の温度に耐えることができ、分析中、リーダのそれぞれの隣接する加熱要素によって約３７℃〜約６０℃の温度に加熱され得る。第２反応室１５０内での第３磁石１２０との混合に加えて、またはその代わりに、第２反応室１５０内での混合は、音響マイクロストリーミングにより達成され得る。
図８、図９、および図１０は、それぞれ、第２反応室１５０の断面側面図、断面斜視図、および上面図を示す。音響マイクロストリーミングを使用して、第２反応室１５０の底面１８２に沿って、或いはカートリッジ１０８を覆う蓋１０６の上部の第２反応室１５０の上方に配置された空洞１８４によって形成されたエアポケットに作用する、リーダ内の圧電トランスデューサまたはソノトロードにより、第２反応室１５０での混合を達成することができる。複数の空洞１８４は、第２反応室１５０の底面１８２から延びている。室（ｃｈａｍｂｅｒ）を流体で満たすことにより、第２反応室１５０の空洞１８４にマイクロバブル１８６が閉じ込められる。閉じ込められたマイクロバブル１８６の表面は、超音波トランスデューサの作用の結果として振動する。マイクロバブル表面（例えば、バブル「スキン」）の動きは、マイクロバブル１８６と接触する液体の動きを引き起こす。適用された音響周波数でのこれらの結果の振動は、流体体積内に微小渦に似た２次流れを引き起こす。図１０は、第２反応室１５０内の音響マイクロストリーミングを介して生じる混合の４つの連続した画像を示している。図示されるように、第２反応室１５０内において約７秒以内にほぼ完全な混合が達成され得る。
任意の第３磁石１２０を収容することに加えて、第２反応室１５０の各々は、第２反応室１５０内の流体の均一な分配を可能にする同一の空気ばねを含む。各第２反応室１５０はそれ自体の空気ばねを含むので、第２反応室１５０が流体で満たされると発生する背圧の結果として、第２反応室１５０間の充填レベルが自動的に平衡する。したがって、第２反応室１５０は、正確で精密な同等の体積の流体で満たされ、同等の圧力を達成することができる。
再び図４および図５を参照すると、カートリッジ１０８は、マイクロ流体ネットワークの複数の流体チャネルを規定する。さらに、カートリッジ１０８と蓋１０６との間に形成され、カートリッジ１０８によって画定されるマイクロ流体ネットワークの外部にある容積は、マイクロ流体ネットワーク内の空気圧を緩衝する廃棄物リザーバ１９２（例えば、空気リザーバ）を提供するので、マイクロ流体デバイス１００は、別個の圧力平衡機構を備える必要がない。ポンプ室１３４、１３６から延びる流体チャネル１５２、試料室１２６の第２部分１３２から流体チャネル１５２まで延びる流体チャネル１５４、流体チャネル１５２から第１反応室１４６まで延びる流体チャネル１５６、流体チャネル１５２から混合室１４８まで延びる流体チャネル１５８、流体チャネル１５２から延びる末端流体チャネル１６０、第２反応室１５０に供給する流体チャネルネットワーク１６２、混合室１４８から流体チャネルネットワーク１６２まで延びる流体チャネル１６４、試料室１２６の第１部分１３０から延びる流体チャネル１６６、流体チャネル１６６から延びる流体チャネル１６８、ポンプ室１３４、１３６から流体チャネル１６８および廃棄物リザーバ１９２まで延びる分岐流体チャネル１７０、第１反応室１４６から流体チャネル１６８まで延びる流体チャネル１７２、第１反応室１４６から廃棄物リザーバ１９２まで延びる流体チャネル１７４、混合室１４８から流体チャネル１６８まで延びる流体チャネル１７６、および混合室１４８から廃棄物リザーバ１９２まで延びる流体チャネル１７８を、カートリッジ１０８は画定する。さまざまなチャネル１５２〜１７８は、約１．０ｍｍ〜約２．５ｍｍの範囲の内部幅と、約０．５ｍｍ２〜約１．５ｍｍ２の範囲の断面積とを有している。
カートリッジ１０８は、エラストマー層１０４とともに、マイクロ流体ネットワークに沿って一連のバルブ１〜１３をさらに画定する。バルブ１〜６は、チャネルバルブとして形成され、バルブ７〜１３は、ページングバルブとして形成される。図１１および図１２は、カートリッジ１０８に沿った弁の上面および斜視断面図を示している。カートリッジ１０８内の特定の空洞および空洞に沿って位置するエラストマー層１０４の対応する領域は、協働して、マイクロ流体ネットワークに沿った選択された位置にバルブを形成することができる。例えば、カートリッジ１０８の空洞１９０に沿って位置するエラストマー層１０４の領域１８８は、協働してバルブ３を形成する。バルブ３の開状態（図１１および図１２に示すように）では、空洞１９０の両端に連結された流体チャネル間の空洞１９０を流体が通過できるように、領域１８８は空洞１９０の表面から離れている。分析中の所望の時点で、リーダのピストンが領域１８８に力を加えて領域１８８を空洞１９０に押し込み、空洞１９０と接触させて、空洞１９０の両端に結合された空洞１９０を通って流体が流体チャネル間を流れないようにすることができ、それによりバルブ３を閉じる。バルブ１〜１３が閉じた状態では、空洞は存在しない（すなわち、空洞には深さが全くない）。バルブが開いた状態では、流体の流れによってバルブが強制的に開かれる（つまり、流体の流れが空洞に深さを与える）。したがって、カートリッジ１０８に沿った空洞は、約０μｍ〜約７５０μｍの範囲の深さを有していてもよく、リーダは、エラストマー層１０４の領域とカートリッジ１０８に隣接する空洞との間の適切な接触を達成するべく、約６Ｎ〜約８Ｎの範囲の力を加えてバルブを閉じてもよい。
試料室１２６がキャップ１１０で閉じられたときにマイクロ流体デバイス１００が密閉されるように、さまざまな接合構造（例えば、レーザー溶接、超音波溶接、接着、熱溶接、およびいくつかの締結構造）の周辺端部に沿って、（例えば、図２および図３の暗い線で示されるように）エラストマーガスケットに沿った１つまたは複数の内部位置でカートリッジ１０８に、エラストマー層１０４および蓋１０６は取り付けられる。マイクロ流体デバイス１００は、単回使用後（例えば、単一の分析を実施するために使用された後）に廃棄できる使い捨てユニットである。マイクロ流体デバイス１００が容易に取り扱われ、包装され、輸送され、および保管され得るように、マイクロ流体デバイス１００は、設置面積がコンパクトであり、約２０ｇ〜約４０ｇと軽量である。マイクロ流体デバイス１００は、ペレットおよび試薬でプライミングされた、組み立てられた、すぐに使用できるデバイスとして提供されてもよい。マイクロ流体デバイス１００は、水分／酸素吸収剤ペレット（例えば、そのような敏感なコンポーネントとともに使用するための）を含む大気制御パッケージング（例えば、複合プラスチック／金属ホイルポーチ）内に提供され得る。マイクロ流体デバイス１００は、試薬（例えば、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）試薬）の安定性により決定されるように、約１２ヶ月〜約２４ヶ月の貯蔵寿命を有し得る。
カートリッジ１０８は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリメチルメタクリレート、およびポリエーテルエーテルケトンなどの１つまたは複数の化学的に堅牢な材料で作られ得る剛性構造である。いくつかの実施形態において、カートリッジ１０８は、約８０ｍｍ〜約２００ｍｍ（例えば、約１５０ｍｍ）の全長（試料室１２６の範囲を含む）を有する。いくつかの実施形態において、カートリッジ１０８は、約５０ｍｍ〜約１００ｍｍ（例えば、約８０ｍｍ）の全幅（試料室１２６の範囲を含む）を有する。いくつかの実施形態において、カートリッジ１０８は、約８ｍｍ〜約２０ｍｍ（例えば、約１６ｍｍ）の総厚（試料室１２６の範囲を含む）を有する。いくつかの実施形態において、磁石１１６、１１８、１２０は、ネオジウム、テフロン（登録商標）、またはガラスなどの１つまたは複数の化学的に堅牢な材料で作られてもよい。いくつかの例では、他の不活性材料を使用して、磁石１１６、１１８、１２０を封入することもできる。いくつかの実施形態では、これらの場所の磁石１１６、１１８、１２０の代わりに、外部磁場に（すなわちリグから）引き付けられる金属材料（例えば、鉄、ニッケル、および合金）が使用され得る。カートリッジ１０８は、視覚化および／または検出を可能にするために、１つまたは複数の部分（例えば、室（ｃｈａｍｂｅｒｓ）１４６、１４８、１５０）において透明または半透明であってもよい。カートリッジ１０８はまた、リーダ内にマイクロ流体デバイス１００を配置するようなサイズおよび位置にされた１つまたは複数の位置合わせ穴１９９（例えば、図１から図３に示される）を規定する。例えば、リーダ内の関連するピンは、カートリッジの位置合わせ穴１９９に係合するように配置される。
いくつかの実施形態において、キャップ１１０およびシール１１２は、ポリプロピレンまたはニトリルブタジエンゴムなどの１つまたは複数の化学的に堅牢な材料で作製され得る。いくつかの実施形態において、シール１１２は、プラスチックオンプラスチックまたはオーバーモールドされた熱可塑性エラストマーで作られてもよい。いくつかの実施形態において、プラグ１１４は、ブロモブチルまたは別の材料でできていてもよい。カートリッジ１０８およびプラグ１１４の化学的堅牢性に少なくとも部分的に起因して、ポンプ１３５、１３７は、液体リザーバとして使用される場合、約０．０００５４ｇ／（パッケージ×日）と低い平均水蒸気透過（例えば、拡散）速度を達成することが判明した。
エラストマー層１０４は、熱可塑性エラストマーなどの１つまたは複数の化学的に堅牢な材料で作成され得る。そのような材料配合によれば、エラストマー層１０４は、弾性的に（例えば、可逆的に）変形して、バルブ１〜１３を開閉することができる。いくつかの実施形態において、エラストマー層１０４は、約５０ｍｍ〜約１５０ｍｍ（例えば、約１００ｍｍ）の全長を有する。いくつかの実施形態において、エラストマー層１０４は、約２０ｍｍ〜約８０ｍｍ（例えば、約５０ｍｍ）の全幅を有する。いくつかの実施形態において、エラストマー層１０４は、約０．５ｍｍ〜約１．５ｍｍ（例えば、約１．０ｍｍ）の総厚を有する。
蓋１０６は、ポリプロピレンまたはポリカーボネートを含む１つまたは複数の材料で作られてもよい。蓋１０６は、透明または半透明であり、カートリッジ１０８の室１４６、１４８、１５０内で生じる反応の視覚化および検出を可能にする。いくつかの実施形態では、蓋１０６の全長が約５０ｍｍ〜約２００ｍｍ（例えば、約１３０ｍｍ）である。いくつかの実施形態では、蓋１０６は、約２０ｍｍ〜約８０ｍｍ（例えば、約５０ｍｍ）の全幅を有する。いくつかの実施形態では、蓋１０６は、約０．５ｍｍ〜約１．０ｍｍ（例えば、約０．７ｍｍ）の総厚を有する。
上述のように、マイクロ流体デバイス１００は、マイクロ流体デバイス１００を受け取ることができるリーダとともに使用されるように構成されている（例えば、サイズ、形状、および材料構成要素を有する）。リーダは、テストポート内でマイクロ流体デバイス１００を受け取ることができる。リーダは、マイクロ流体デバイス１００内の分析の動作中にマイクロ流体デバイス１００と相互作用するように構成される。一連のアクチュエータが、さまざまなバルブ構造の近くでマイクロ流体デバイス１００に接触して、バルブを効果的に「開閉」する。上述のように、典型的には、アクチュエータがエラストマー層１０４を下にある成形カートリッジ１０８に対して圧縮すると、バルブは閉じた状態になる。したがって、アクチュエータが解放されると、エラストマー層１０４が弛緩し、それによりバルブが開状態に戻ることが可能になる。リーダはまた、分析の実行中に必要に応じて、マイクロ流体デバイス１００の領域に局所加熱を加える加熱要素を含む。リーダはまた、マイクロ流体ネットワーク内で所望の流体運動を達成するために、各ポンプのプランジャ（例えば、ロッド１４０）を押したり引いたりできるアクチュエータを含む。リーダには、試験中の試料内における標的種の有無を示す測定値を提供するために、それぞれの反応室を調べる蛍光検出光学系も含まれている。リーダは、マイクロ流体デバイスが規定の使用期限内にあるかどうかを確認し、テスト結果を電子患者の記録に関連付けるために、テストタイプを識別するバーコードまたは同様のシステムをさらに含み得る。
図１３から図２３は、マイクロ流体デバイス１００を使用して標的核酸を検出する分析を実施する方法に対応するカートリッジ１０８の連続概略図を示す。いくつかの実施形態において、分析は、等温条件で実行されるＦｌｕ／ＲＳＶ分析である。先ず図１３を参照すると、カートリッジ１０８の試料室１２６は、マイクロ流体デバイス１００が周囲環境に対して開いているように、分析の開始前にキャップが外される。第１ポンプ１３５は閉じた状態にあり、青色で示される約１ｍＬ〜約５ｍＬ（例えば、約２ｍＬ）の第１液体試薬１９４でプライミングされる。いくつかの実施形態において、第１液体試薬１９４は溶解緩衝液であり、マグネシウムなどの触媒剤を含む。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液は酵素溶解剤である。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液は、約１０ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度の塩酸（ＨＣＬ）および約０．１％〜約１％の濃度のＴｒｉｔｉｏｎＸ１００を含む。
さらに図１３を参照すると、第２ポンプ１３７は、閉状態にあり、緑色で示される約１ｍＬ〜約５ｍＬ（例えば、約２ｍＬ）の第２液体試薬１９６でプライミングされる。いくつかの実施形態では、第２液体試薬１９６は典型的には反応緩衝液であり、中性に近いｐＨを有する。第２液体試薬は、マグネシウムなどの触媒剤を含んでもよい。第１反応室１４６および第２反応室１５０は、それぞれ第１反応ペレット１２２および第２反応ペレット１２４でプライミングされる。いくつかの実施形態では、第１反応ペレット１２２および第２反応ペレット１２４のそれぞれは、ＲＰＡ試薬、触媒試薬（例えば、マグネシウム）、およびオリゴマーなどの１つまたは複数の凍結乾燥増幅試薬を含む。ＲＰＡ試薬は、目的の標的に特異的なプライマ、ならびに存在する場合、増幅された標的の視覚化のための検出可能な標識を備えた少なくとも１つのプローブを含み得る。プローブは通常、増幅された試料混合物中に存在する場合、プローブが相補配列にハイブリダイズする場合、ヌクレアーゼによる切断後に別々になるフルオロフォアとクエンチャとを含む。
マイクロ流体デバイス１００は、リーダに挿入され、リーダは、分析を開始するために、１つまたは複数の制御要素（例えば、ボタンおよびスイッチ）を介して手動で操作される。分析開始時に、カートリッジ１０８をリーダに挿入している間、バルブ１〜１３は開いている。その後、リーダは、マイクロ流体デバイス１００を使用して分析を実行するべく、バルブ１〜１３、ポンプ１３５、１３７、磁石１１６、１１８、１２０、および圧電トランスデューサ１８０（図８に示す）を作動させるとともに、室１４６、１４８、１５０を特定の回数だけ加熱するように制御される。
図１４を参照すると、バルブ２、３が開き、約５秒〜約１０秒（例えば、約９秒）の期間にわたって、第１ポンプ１３５が、第１ポンプ室１３４から流体チャネル１５２、１５４を介して第１液体試薬１９４を試料室１２６に送り込む（例えば、押すまたは押し込む）する。図１５を参照すると、バルブ２、３は閉じ、バルブ１、１２、１３は開く。第１ポンプ１３５は、約１秒〜約１０秒（例えば、約５秒）の期間にわたって周囲環境から約１ｍＬ〜約５ｍＬ（例えば、約２ｍＬ）の空気を、流体チャネル１７０、１６８、１６６および試料室１２６を介してポンプ室１３４に引き込む（例えば、引く）。
図１６を参照すると、バルブ１、１２、１３が閉じる。試料は、ユーザによって試料室１２６に送られ、試料室１２６は、ユーザによって閉じられ、キャップ１１０およびシール１１２で密閉される。いくつかの実施形態において、試料は、人間または別の動物から収集された生体液または物質である。例えば、試料は、血液、痰、粘液、唾液、涙、または尿の１つまたは複数を含み得る。試料は、綿棒や収集チューブなどの適切な試料採取装置を使用して、被験者から取得できる。例えば、綿棒を使用して、鼻、鼻咽頭、膣、頬、または組織の開口道の試料を採取し、耳、目、喉、傷またはその他の身体表面に適用できる。いくつかの実施形態において、試料収集装置を用いて被験者から試料が収集された直後に試料室１２６に、試料は直接送られ得る。いくつかの実施形態において、試料は、対象からの収集後にウイルス輸送培地（ＶＴＭ）または他の液体試薬に保存することができ、保存した試料の一定分量を、分析を開始するために試料室１２６に送ることができる。対象から得られた試料または別の媒体に保存された試料は、対象から収集されたものと実質的に同じ形（例えば、標的核酸を単離するための試料の精製なし、または試料から生体マトリックスまたはその他の成分を除去する）で、試料室１２６に適用することができる。
いくつかの実施形態において、試料は、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、または２つまたは３つの標的ポリヌクレオチド配列などの１つより多い標的ポリヌクレオチド配列）を含む標的核酸を含む。いくつかの実施形態において、標的核酸は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成二本鎖ＤＮＡおよび合成一本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸はウイルスＤＮＡまたはウイルスＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸は動物病原体（例えば、一本鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルス、一本鎖ＲＮＡウイルス、または細菌）に由来する。いくつかの実施形態において、動物の病原体はインフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、またはＲＳＶである。いくつかの実施形態において、試料は、試料室１２６に送られる前にＲＰＡ試薬と混合されている。
試料は、約０秒〜約６０秒（例えば、約１０秒）の間、試料室１２６に含まれる約４００μＬ〜約１５００μＬ（例えば、約５００μＬ）の第１液体試薬１９４と混合する。第１液体試薬１９４が溶解剤を含む場合、この混合期間中に試料が溶解され得る。いくつかの実施形態において、試料室１２６は、混合ステップ中に加熱されてもよい。試料が試料室１２６に送られ、ユーザによってキャップが置かれると、試料室１２６のシールの完全性がリーダによってテストされる。
図１７を参照すると、バルブ１、３、４、９、１２、１３が開き、第１ポンプ１３５は、流体チャネル１７０、１６８、１６６を介してポンプ室１３４内に含まれる空気を試料室１２６に送り込み、これによって約２００μＬ〜約１０００μＬ（例えば、約５００μＬ）の体積の試料および試料室１２６に含まれる第１液体試薬１９４を、約５秒〜約１５秒（例えば、約１０秒）の期間にわたって、流体チャネル１５４、１５２、１５６を介して第１反応室１４６に送り込む。約３００秒〜約６００秒（例えば、約４８０秒）の期間にわたって第１反応室１４６で第１増幅反応が起こり、第１反応産物が産生される。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列を増幅するための第１増幅反応はＲＰＡ反応であり、第１反応産物は第１の増幅されたポリヌクレオチド配列を含む。第１増幅反応中、第１反応室１４６が加熱され、第１反応室１４６内の第１磁石１１６が回転して、試料中の第１反応ペレット１２２を溶解する。
図１８を参照すると、バルブ３、４、９、１２、１３が閉じ、バルブ１１が開き、第１ポンプ１３５が約１ｍＬ〜約５ｍＬ（例えば、約２ｍＬ）の空気を廃棄物リザーバ１９２から引き出し、流体チャネル１７０を介して第１ポンプ室１３４に流入させ、その間、シアンの色で示されるように、第１反応室１４６で第１増幅反応が起こる。図１９を参照すると、バルブ１１が閉じ、バルブ１２、１０、４、６が開く。第１ポンプ１３５は、第１ポンプ室１３４に含まれる空気を、流体チャネル１７０、１６８、１７２を介して第１反応室１４６に送り込み、それにより約５秒〜約１０秒（例えば、約７秒）の期間にわたって、約１００μＬ〜約４００μＬ（例えば、約２００μＬ）の第１反応産物を、第１反応室１４６から計量チャネル１９８を画定するバルブ４、６の間の流体チャネル１５２の一部に送り込む。シアンの色で示されるように、計量チャネル１９８内における過剰量１９７の第１反応産物が末端流体チャネル１６０に流入する。
図２０を参照すると、バルブ１、１２、１０、４、および６が閉じ、バルブ５、７が開く。第２ポンプ１３７は、約２００μＬ〜約８００μＬ（例えば、約４００μＬ）の第２液体試薬１９６を第２ポンプ室１３６から計量チャネル１９８および流体チャネル１５８を介して混合室１４６に送り込み、それによって約５秒〜約１０秒（例えば、約８秒）の期間にわたって、計量チャネル１９８内の第１反応産物をも押し流して混合室１４８に流入する。計量チャネル１９８および混合室１４８内において、第２液体試薬１９６は、計量チャネル１９８内に含まれていた第１反応産物を希釈する（例えば、約１：５０で）。約５００μＬ〜約２０００μＬ（例えば、約１０００μＬ）の体積の第２液体試薬１９６が第２ポンプ室１３６に残っている。混合室１４８は、黄色で示される第１反応産物の約５μＬ〜約２０μＬ（例えば、約８μＬ）の容積を有する。混合室１４８が加熱され、黄色で示されるように、第２磁石１１８が回転して、ペレット１２３を第１反応産物および第２液体試薬１９６に溶解する。混合は、約２秒〜約１０秒（例えば、約５秒）の期間で起こる。混合室１４８内の残留空気は、バルブ７を介して廃棄物リザーバ１９２に排出される。
図２１を参照すると、バルブ５、７が閉じ、バルブ１１が開き、第１ポンプ１３５が約１０００μＬ〜約５０００μＬ（例えば、約２０００μＬ）の空気を廃棄物リザーバ１９２から流体チャネル１７０を介して第１ポンプ室１３４に引き込み、その間に混合室１４８で混合が行われる。図２２を参照すると、バルブ１１が閉じ、バルブ８、１２、１４が開く。第１ポンプ１３５は、流体チャネル１７０、１６８、１７６を介して第１ポンプ室１３４から混合室に約２００μＬ〜約１０００μＬ（例えば、約５００μＬ）の空気を送り込み、それにより混合室１４６中の第１反応産物を、約５秒〜約２０秒（例えば、約１７秒）の期間にわたって押し流して、流体チャネルネットワーク１６２を介して第２反応室１５０に入れる。第１反応産物は、第２反応室１５０に関連付けられた空気ばねに抗して押し流され、約２２．５μＬ〜約２７．５μＬ（例えば、約２５．０μＬ）の第１反応産物の等しい体積が第２反応室１５０に送られ、その結果、第２反応室１５０は約３０％満たされる。
約１８０秒〜約６００秒（例えば、約２４０秒）の期間にわたって第２反応室１５０で第２増幅反応が起こり、その間、第２反応室１５０は加熱され、第３磁石１２０は回転または垂直に移動して第２反応ペレット１２４を第１反応産物に溶解する。いくつかの実施形態において、第１の増幅されたポリヌクレオチド配列を増幅するための第２増幅反応はＲＰＡ反応であり、第２反応産物は、第１の増幅されたポリヌクレオチド配列内に完全に含まれるより小さい配列を含む第２の増幅されたポリヌクレオチド配列を含む。
図２３を参照すると、バルブ１、８、１４が閉じ、第２増幅反応の連続的な蛍光検出が実行される。いくつかの実施形態において、連続的な蛍光検出は、
フルオロフォアとクエンチャに結合した第一のオリゴヌクレオチドで第２増幅産物を標識して標識された第２産物を生成することと、
標識された第２増幅産物からクエンチャを切断することと、
フルオロフォアからの信号（例えば、第２増幅産物の存在を示す）を光学的に検出することと、を含む。
いくつかの実施形態では、消光剤はヌクレアーゼを使用して切断される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは二本鎖ＤＮＡを標的とする。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼはホルムアミドピリミン−ＤＮＡグリコシラーゼである。検出は、約３分〜約１０分（例えば、約４分）の期間にわたって、約５秒〜約２０秒（例えば、約１５秒）ごとに第２反応室１５０に沿って蓋１０６およびカートリッジ１０８に隣接するリーダを使用して実行され得る。
試料が試料室１２６に送られる時点から検出が完了する時点まで測定されるように、分析はマイクロ流体デバイス１００を使用して約３０分未満（例えば、約１５分未満、約１０分未満、または約５分未満）の期間内に実行され得る。検出に続いて、マイクロ流体デバイス１００はリーダから排出され、マイクロ流体デバイス１００はリーダから手動で取り外される。少なくとも部分的にマイクロ流体デバイス１００の閉鎖システム構成（例えば、試料室１２６のキャッピング後）により、同様の分析を実施するために使用される従来のデバイスと比較して、周囲環境への漏れ汚染のリスクが大幅に低減する。
図２４から図２７は、本明細書に記載のマイクロ流体デバイスの追加の例示的実施形態および特徴を示す。図２４を参照すると、例示的な寸法のデバイスが示されている。いくつかの実施形態において、デバイスは、その最も広い寸法が約８２ｍｍ×１０６ｍｍ×１１ｍｍであるが、他の寸法が特に考えられる（例えば、±５％、±１０％、±１５％、±２０％、±３０％、±４０％、±５０％など。さらに図２４を参照すると、いくつかの実施形態において、デバイスは、第１反応室１４６の内部傾斜部分２０４を備えている。さらに図２４を参照すると、いくつかの実施形態において、デバイスのハンドル２０６は、より人間工学的な設計のためにグリップ縁部に完全な円形を備えている。
図２７を参照すると、いくつかの実施形態において、デバイスの蓋１０６は、スナップ２０７を介してデバイスに取り付けられている。いくつかの実施形態において、蓋１０６はＶノッチ２０８がないが、デバイスの本体はＶノッチ２０８を保持している（図２４に示されている）。
いくつかの実施形態において、バルブ構成は、デバイスのサイズを最小化する（例えば、デバイスの寸法を最小化する）ように配置されている。図２４は、例示的なバルブ構成を示しているが、他の構成も特に考えられる。いくつかの実施形態では、漏れ検出を容易にするために、流体の流れの領域間の共有溶接が回避される。例えば、図２４を参照すると、いくつかの実施形態では、領域１５０は、デバイスコンポーネント間の共有溶接部を持たない。
いくつかの実施形態において、デバイスの堅牢性は、例えば、より薄いコアアウトされた壁部、強力なコアアウトされた特徴、および堅牢なコアピンを含む成形技術により強化される。
いくつかの実施形態では、デバイスは、デバイスとともに使用される検出機器の汚染の回避を含む、危険なまたは有害な物質（例えば、病原体を含む生物学的試料）のリスクおよび汚染を最小限にするための漏れ防止密閉キャップを含む。いくつかの実施形態において、これは、密封キャップ、キャップ閉鎖センサ、およびキャップ圧力センサの１つまたは複数またはそれぞれで達成される。図２５から図２６は、そのような例示的な実施形態を示している。
図２５を参照すると、キャップ１１０の実施形態が示されている。図２５の上部パネルを参照すると、キャップ１１０を開位置に固定するように設計された戻り止め機構２０１が示されている。さらに図２５を参照すると、キャップガスケット２００が示されている。特定の材料に限定されることなく、いくつかの実施形態では、キャップガスケット２００は適所に成形され、シリコーンを含む。さらに図２５を参照すると、ガスケットシールリブ２０２が示されている。いくつかの実施形態において、ガスケットおよびガスケットシールリブは、試料室１０６からの試料の漏れを防ぐ。また、図２５を参照すると、閉位置でキャップを密封するためのスナップフック２０５コンポーネントが示されている。閉じた位置にあるスナップフック２０５は、試料室１２６の上部領域の嵌合構造２０９と組み合う。
図２６を参照すると、キャップ位置検出コンポーネント２０３が示されている。いくつかの実施形態において、キャップ位置検出コンポーネント２０３は、漏れおよび／または適切に固定されていないキャップを検出するように構成されている。いくつかの実施形態において、キャップ位置検出コンポーネントは、光学式キャップ閉鎖センサおよび／または圧力検出器である。
いくつかの実施形態において、キャップ位置検出コンポーネント２０３は、光学キャップ閉鎖センサを含む。例えば、いくつかの実施形態において、キャップ閉鎖検出コンポーネントは、キャップ開口部を横切る光ビームを生成し、この光ビームは、キャップ１１０が所定の位置に固定されると（例えば、スナップフック２０５または他のキャップシーリングコンポーネントを介して）遮断される。いくつかの実施形態において、デバイスまたはデバイスとともに機能する機器は、キャップが閉じた密閉位置にないとき（例えば、光ビームが遮断されていないとき）、動作を停止するかアラームを鳴らすように構成されている。
いくつかの実施形態において、キャップ位置検出コンポーネント２０３は、圧力に耐えるキャップの能力を測定する圧力センサを備えている。いくつかの実施形態において、圧力の力フィードバック（例えば、装置のポンプによって提供される）は、適切に密閉されていないか、漏れを示しているキャップを検出するために利用される。いくつかの実施形態では、予想範囲外の圧力（例えば、キャップが適切にシールされていないこと、またはキャップが漏れていることを示す）は、アラームまたはデバイスまたはデバイスとともに機能する機器の動作の停止をもたらす。
本発明の多くの実施形態が説明された。それにもかかわらず、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく、さまざまな修正を行うことができることを理解されたい。したがって、他の実施形態は、この詳細な説明に続く特許請求の範囲内にある。
例えば、マイクロ流体デバイス１００は、８つの第２反応室１５０を含むものとして説明および図示されたが、いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイス１００と構造および機能が実質的に類似するマイクロ流体デバイスは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つ超の第２反応室など異なる数の第２反応室を含み得る。
エラストマー層１０４、カートリッジ１０８、および蓋１０６は特定の寸法を有するものとして説明されたが、いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイス１００と構造および機能が実質的に類似するマイクロ流体デバイスは、エラストマー層、カートリッジ、およびエラストマー層１０４、カートリッジ１０８、および蓋１０６について示されたものとは異なる寸法を有する蓋を含み得る。
カートリッジ１０８は、任意の中間ペレット１２３を含むものとして説明および図示されているが、いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイス１００に構造および機能が類似するマイクロ流体デバイスは、任意の中間ペレット１２３を含まなくてもよい。
特定の分析に適用可能な特定の期間、流体量、ペレット成分、および液体試薬成分に関して図１３から図２７に示す方法を説明したが、いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイス１００を使用して、異なる期間、流体量、ペレット成分、および液体試薬成分を含む、同様の、または異なる分析を行うことができる。
本明細書の装置および方法は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）技術の応用として説明されているが、標的核酸を増幅および検出するための他の等温技術も、本明細書に記載のマイクロ流体デバイス１００に実装することができる（例えば、切断および伸長増幅反応（ＮＥＡＲ）技術）。本明細書に記載されるＲＰＡ増幅およびＲＰＡ増幅産物の検出の方法は、米国特許第７，３９９，５９０号明細書、第８，５８０，５０７号明細書、第７，２７０，９８１号明細書、第７，３９９，５９０号明細書、および第７，６６６，５９８号明細書、第７，４３５，５６１号明細書、米国特許出願公開第２００９／００２９４２１号明細書、および国際公開第２０１０／１４１９４０号パンフレットに詳細に記載されている。ＮＥＡＲ法は、米国特許出願公開第２００９／００８１６７０号明細書および第２００９／００１７４５３号明細書ならびに米国特許第９，５６２，２６３号明細書および第９，５６２，２６４号明細書に記載されている。前述の参考文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、本開示の一部とみなされる。

Claims (88)

  1. マイクロ流体デバイスであって、
    試料を受け取るように構成された入口ポートと、
    入口ポートに流体的に結合された第１反応室と、
    入口ポートに流体的に結合された第１ポンプと、
    混合室に流体的に結合された第２ポンプと、
    第１反応室および混合室に流体的に結合された計量チャネルと、
    混合室に流体的に結合された１つまたは複数の第２反応室と
    を備え、
    第１ポンプは、流体を、入口ポートから第１反応室におよび第１ポンプから入口ポートに、移動させるように構成されており、
    第２ポンプは、流体を、第２ポンプから混合室に第１反応室から混合室におよび混合室から１つまたは複数の第２反応室に、移動させるように構成されている、
    マイクロ流体デバイス。
  2. マイクロ流体デバイス内の流体圧力を調節するように構成された廃棄物リザーバをさらに備えている、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  3. 第１反応室が、第１の増幅試薬セットを含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  4. 第１の増幅試薬セットが、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）試薬を含む、請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
  5. ＲＰＡ試薬が、凍結乾燥されている、請求項４に記載のマイクロ流体デバイス。
  6. 第１反応室が、触媒試薬をさらに含む、請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
  7. 触媒試薬が、マグネシウムを含む、請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
  8. 第１の増幅試薬セットが、オリゴマーを含む、請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
  9. 混合室が、第２の増幅試薬セットを含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  10. 第２の増幅試薬セットが、ＲＰＡ試薬を含む、請求項９に記載のマイクロ流体デバイス。
  11. ＲＰＡ試薬が、凍結乾燥されている、請求項１０に記載のマイクロ流体デバイス。
  12. 第２の増幅試薬セットが、オリゴマーを含む、請求項９に記載のマイクロ流体デバイス。
  13. １つまたは複数の第２反応室が、それぞれ第２の増幅試薬セットを含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  14. 第２の増幅試薬セットが、ＲＰＡ試薬を含む、請求項１３に記載のマイクロ流体デバイス。
  15. ＲＰＡ試薬が、凍結乾燥されている、請求項１３に記載のマイクロ流体デバイス。
  16. 第２の増幅試薬セットが、オリゴマーを含む、請求項１３に記載のマイクロ流体デバイス。
  17. 第１ポンプが、第１緩衝液を含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  18. 第１ポンプが、第１緩衝液および溶解剤を含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  19. 第２ポンプが、第２緩衝液を含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  20. 第２ポンプが、第２緩衝液および溶解剤を含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  21. 第１ポンプが、触媒試薬を含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  22. 第２ポンプが、触媒試薬を含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  23. 触媒試薬が、マグネシウムを含む、請求項２１または請求項２２に記載のマイクロ流体デバイス。
  24. １つまたは複数の第２反応室の各々が、検出室である、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  25. 各々の検出室の一部が、光学的に透明である、請求項２４に記載のマイクロ流体デバイス。
  26. 第１反応室が、加熱ユニットに結合されるように構成されている、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  27. 入口ポートが、加熱ユニットに結合されるように構成されている、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  28. 第１反応室が、混合手段を備えるか、または混合手段に結合されている、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  29. 混合室が、混合手段を含むか、または混合手段に連結されている、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  30. １つまたは複数の第２反応室が、それぞれ混合手段を備えるか、または混合手段に結合されている、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  31. 混合手段が、磁石である、請求項２８、請求項２９、または請求項３０に記載のマイクロ流体デバイス。
  32. 混合手段が、音響ストリーミングによって動作する、請求項３０に記載のマイクロ流体デバイス。
  33. 入口ポートが、試料を含み、第１ポンプが、第１緩衝液を含み、第１ポンプが、第１緩衝液を第１ポンプから入口ポートに送って試料および第１緩衝液を含む希釈試料を生成するように構成されている、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  34. 第１反応室が、第１の増幅試薬セットを含み、第１ポンプが、希釈試料の一部を入口ポートから第１反応室に提供して、希釈試料と第１の増幅試薬セットとを含む第１反応混合物を生成するように構成されている、請求項３３に記載のマイクロ流体デバイス。
  35. 第２ポンプが、計量チャネルを介して、第１反応室から混合室に第１反応混合物の一部を提供するように構成されている、請求項３４に記載のマイクロ流体デバイス。
  36. 第２ポンプが、第２緩衝液を含み、第２ポンプが、計量チャネルを介して第２ポンプから混合室に第２緩衝液を送るように構成されており、第２緩衝液は第１反応混合物の一部と結合して、希釈された第１反応混合物を生成する、請求項３５に記載のマイクロ流体デバイス。
  37. １つまたは複数の第２反応室が、それぞれ第２の増幅試薬セットを含み、第２ポンプが、混合室から１つまたは複数の第２反応室のそれぞれに、希釈された第１反応混合物の一部を送って希釈された第１反応混合物および第２の増幅試薬セットを含む第２反応混合物を生成するように構成されている、請求項３６に記載のマイクロ流体デバイス。
  38. 第２の増幅試薬セットが、オリゴマーを含む、請求項３７に記載のマイクロ流体デバイス。
  39. 混合室が、第２の増幅試薬セットを含み、第２試薬室が、第２緩衝液を含み、第２ポンプが、第２試薬室から計量チャネルを介して混合室に第２緩衝液を送るよう構成され、第２緩衝液が、第１反応混合物の一部および第２の増幅試薬セットと結合して第２反応混合物を生成する、請求項３５に記載のマイクロ流体デバイス。
  40. 第２ポンプが、第２反応混合物の一部を１つまたは複数の第２反応室のそれぞれに送るように構成されている、請求項３９に記載のマイクロ流体デバイス。
  41. １つまたは複数の第２反応室の各々がオリゴマーを含む、請求項４０に記載のマイクロ流体デバイス。
  42. マイクロ流体デバイスが、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つの第２反応室を備えている、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  43. 一連のバルブをさらに備えている、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  44. 試料を処理するとともに試料をマイクロ流体デバイスに送るように構成されたリーダにマイクロ流体デバイスを接続するための位置合わせ穴をさらに備えている、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  45. 接続ポートがリーダと係止可能に係合するように構成されている、請求項４４に記載のマイクロ流体デバイス。
  46. マイクロ流体デバイスが使い捨てカートリッジである、請求項４１に記載のマイクロ流体デバイス。
  47. 第１ポンプおよび第２ポンプがシリンジポンプである、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  48. 入口ポートがキャップを含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  49. キャップが、ガスケットシールリブを含むガスケットを含む、請求項４８に記載のマイクロ流体デバイス。
  50. キャップが、キャップを開位置に固定するための戻り止め機能を備えている、請求項４８に記載のマイクロ流体デバイス。
  51. 請求項１に記載のマイクロ流体デバイスを受け取るように構成されたリーダであって、１つまたは複数の第２反応室内の第２反応産物の存在を検出するように構成された検出器を備えているリーダ。
  52. マイクロ流体デバイスまたはリーダが、キャップの閉鎖またはキャップの漏れを検出するように構成されたキャップ位置検出コンポーネントを備えている、請求項５１に記載のリーダ。
  53. キャップ位置検出コンポーネントが、光学キャップ閉鎖センサおよび圧力センサからなる群から選択される１つまたは複数のコンポーネントを備えている、請求項５２に記載のリーダ。
  54. 光学式キャップ閉鎖センサが、キャップが閉じた密封位置にあるときに遮断される光ビームを含む、請求項５３に記載のリーダ。
  55. 圧力センサが、キャップの圧力に耐える能力を評価する、請求項５４に記載のリーダ。
  56. 圧力が、デバイスのポンプを使用して生成される、請求項５５に記載のリーダ。
  57. 所定の範囲外の圧力が、密閉されていないキャップを示す、請求項５５に記載のリーダ。
  58. キャップが密閉されていると識別されない場合、リーダまたはマイクロ流体デバイスの動作を停止するように構成されている、請求項５２に記載のリーダ。
  59. 方法であって、
    少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列を含む標的核酸を含む試料流体をマイクロ流体デバイスに提供することと、
    等温条件下で少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列を増幅することと、を含み、増幅することが、
    第１の増幅されたポリヌクレオチド配列を含む第１増幅産物を産生するために、標的ポリヌクレオチド配列に対して第１回目の増幅を実行することと、
    第２の増幅されたポリヌクレオチド配列を含む第２増幅産物を産生するために、第１の増幅されたポリヌクレオチド配列に対して第２回目の増幅を実行することであって、第２の増幅されたポリヌクレオチド配列は、第１回目の増幅中に生成される第１の増幅されたポリヌクレオチド配列内に完全に含まれるより小さい配列を含む、第２回目の増幅を実行することと、
    を含む、方法。
  60. 第２増幅産物を検出することをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 第２増幅産物を検出することが、
    標識された第２産物を産生するために、フルオロフォアおよびクエンチャに連結された第１オリゴヌクレオチドで第２増幅産物を標識することと、
    標識された第２増幅産物からクエンチャを切断することと、
    フルオロフォアからの信号を光学的に検出することであって、検出可能な信号は第２増幅産物の存在を示す、検出することと
    を含む、請求項５９に記載の方法。
  62. クエンチャの切断が、ヌクレアーゼを使用して行われる、請求項６１に記載の方法。
  63. ヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡを標的とする、請求項６１に記載の方法。
  64. ヌクレアーゼが、ホルムアミドピリミン−ＤＮＡグリコシラーゼである、請求項６１に記載の方法。
  65. 増幅するステップが、第１回目の増幅を実行することを含み、増幅はＲＰＡである、請求項５９に記載の方法。
  66. 増幅するステップが、第２回目の増幅を実行することを含み、増幅はＲＰＡである、請求項５９に記載の方法。
  67. 増幅するステップが、増幅がＲＰＡである第１回目の増幅と、増幅がＲＰＡである第２回目の増幅とを実行することを含む、請求項５９に記載の方法。
  68. 試料が、血液、痰、粘液、唾液、涙、または尿である、請求項５９に記載の方法。
  69. 試料を動物から取得するステップをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
  70. 試料が、動物から得られ、動物はヒトである、請求項６９に記載の方法。
  71. 標的核酸が、動物病原体の標的核酸である、請求項５９に記載の方法。
  72. 動物病原体が、一本鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルス、または一本鎖ＲＮＡウイルスである、請求項７１に記載の方法。
  73. 動物病原体が細菌である、請求項７１に記載の方法。
  74. 標的核酸が、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡである、請求項５９に記載の方法。
  75. 標的核酸が、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成二本鎖ＤＮＡおよび合成一本鎖ＤＮＡからなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
  76. 標的核酸が、ウイルスＤＮＡまたはウイルスＲＮＡである、請求項５９に記載の方法。
  77. 動物病原体が、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、または呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である、請求項７１に記載の方法。
  78. 標的核酸が、２つの標的ポリヌクレオチド配列を含む、請求項５９に記載の方法。
  79. 標的核酸が、３つの標的ポリヌクレオチド配列を含む、請求項５９に記載の方法。
  80. 試料をマイクロ流体デバイスに提供するステップの前に、試料をＲＰＡ試薬と混合するステップをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
  81. 第２増幅産物が、マイクロ流体デバイスに試料を提供するステップの後、約３０分未満、約１５分未満、約１０分未満、または約５分未満で検出される、請求項５９に記載の方法。
  82. 第２の増幅産物が、リアルタイムで検出される、請求項８１に記載の方法。
  83. 増幅の前に試料を溶解するステップをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
  84. 溶解するステップが、試料を溶解剤と結合させるステップを含む、請求項８３に記載の方法。
  85. 溶解剤が、酵素である、請求項８４に記載の方法。
  86. 溶解するステップが、機械的手段を含む、請求項８３に記載の方法。
  87. 溶解するステップが、試料を加熱することを含む、請求項８３に記載の方法。
  88. 方法であって、
    少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列を含む標的核酸を含む試料をマイクロ流体デバイスに提供することと、
    少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列を増幅することと、を含み、
    増幅することが、
    第１の増幅されたポリヌクレオチド配列を含む第１増幅産物を産生するために、標的ポリヌクレオチド配列に対して第１回目の増幅を実行することと、
    追加の増幅産物を形成するために、第１の増幅されたポリヌクレオチド配列に対して１回または複数回の追加の連続した増幅を実行することであって、各連続したｎ＋１回目の増幅からの増幅産物は、前回のｎ回目の間に生成された増幅されたポリヌクレオチド配列内に完全に含まれるより小さい配列である増幅されたポリヌクレオチド配列を含む、追加の連続した増幅を実行することと、
    最終増幅産物を産生するために、最後から２番目に増幅されたポリヌクレオチド配列に対して最終回の増幅を実行することと、
    最終増幅産物を検出することと、
    を含む、方法。
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