JP2020505032A - エンドソーム切断可能なリンカー - Google Patents

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Abstract

本開示は、概して、切断可能なリンカー及びその使用に関する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき、２０１７年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／４４７，７８６号明細書の利益を主張するものであり、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、概して、切断可能なリンカー及びその使用に関する。
切断、例えばエンドソーム切断を起こし、且つ／又はプロテアーゼ切断可能であるリンカーが当技術分野で必要とされている。本開示は、その必要性に対するいくつかの解決策を与えるものである。
一態様では、切断可能なリンカー、例えばエンドソーム切断可能及び／又はプロテアーゼ切断可能なリンカーが本明細書において提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載する切断可能なリンカーは、より大きいリンカーに含まれ得る。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、血液若しくは血清（又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞内（又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）で少なくとも１．２５、１．５、１．７５、２、３、４、５、１０、２５、５０又は１００倍速く切断される炭水化物リンカーである。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、細胞内（又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、血液中（又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）で９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又は１％未満切断される。一部の実施形態では、リンカーは、対象の血液若しくは血清中又は第２の基準条件下（例えば、血液又は血清中に見出される条件を模倣又は表すために選択することができる）より、標的細胞内又は第１の基準条件下（例えば、細胞内条件を模倣又は表すために選択することができる）で少なくとも１０倍以上、好ましくは少なくとも１００倍以上速く切断される。本発明の切断可能なリンカーを生成するための例示的な化合物は、実施例７〜１１中のスキーム７〜１１に記載されている。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、図１〜６に示されるリンカーである。
限定なしに、本明細書に記載する切断可能なリンカーは、リソソーム内コンパートメントにおける切断を必要とする任意の分子に使用され得る。本明細書に記載する切断可能なリンカーは、エンドソーム切断可能な作用剤又はリソソーム内コンパートメントにおいて活性化若しくは遊離される必要があり得る任意の他の作用剤を結合する、特に疎水性コンジュゲートのためのプロドラッグ手法に特に有効であり得る。従って、本明細書に記載するリンカーは、限定しないが、多標的分子及びプロドラッグなどの複数の用途に使用され得る。
一態様では、本明細書に記載する切断可能なリンカーを含むプロドラッグコンジュゲートが本明細書において提供される。
別の態様では、本明細書に記載する切断可能なリンカーを介してリガンドに結合されるエンドソーム作用剤を含むコンジュゲートが本明細書において提供される。
さらに別の態様では、本明細書に記載する切断可能なリンカーを介してリガンドと共役された核酸ベースのエフェクター分子を含むコンジュゲートが本明細書において提供される。限定なしに、標的の遺伝子発現を調節することが可能な任意の核酸ベースのエフェクター分子がコンジュゲートに含まれ得る。
さらに別の態様では、多標的分子が本明細書において提供される。概して、多標的分子は、本明細書に記載する切断可能なリンカーによって互いに結合された少なくとも２つの核酸ベースのエフェクター分子を含む。限定なしに、標的の遺伝子発現を調節することが可能な任意の核酸ベースのエフェクター分子は、本明細書に開示する多標的分子に含まれ得る。
「核酸ベースのエフェクター分子」とは、標的遺伝子の遺伝子発現を調節することが可能な修飾又は非修飾一本鎖又は二本鎖核酸分子を意味する。標的遺伝子の遺伝子発現を調節することが可能な例示的な核酸ベースのエフェクター分子としては、限定しないが、二本鎖及び一本鎖ＲＮＡ干渉剤（ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ並びに本明細書においてｄｓＲＮＡ剤と呼ばれるものなど）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡ又は抗ｍｉｒ（ａｎｔｉｍｉｒ）、スーパーｍｉｒ（ｓｕｐｅｒｍｉｒ）、アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、リボザイム、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ活性化剤、Ｕ１アダプター、ＣＲＩＳＰＲ ＣａｓのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などが挙げられる。
前記少なくとも２つのエフェクター分子が２つの別個のエフェクター分子であることに留意する。換言すれば、少なくとも２つのエフェクター分子は、互いに重ならない。従って、本明細書に開示する多標的分子は、１つのエフェクター分子が２つの異なる標的に向けられた分子、例えば各鎖が異なる標的に向けられた二本鎖エフェクター分子又は配列の少なくとも一部が２つの異なる標的配列と相補的であるか、又はそれとハイブリダイズすることができる配列を含むエフェクター分子と異なる。
一部の実施形態では、多標的分子又は多標的分子中のエフェクター分子は、２つの異なる機構によって非特異的な遺伝子発現を調節しない。例えば、多標的分子又は多標的分子中のエフェクター分子は、ＲＮＡ干渉及びマイクロＲＮＡのシード領域のターゲティングによって遺伝子発現を調節しない。
一部の実施形態では、多標的分子中の各核酸ベースのエフェクター分子は、標的核酸の遺伝子発現を調節することができる。限定なしに、多標的分子中の各エフェクター分子は、同じ標的遺伝子、異なる標的遺伝子、同じ標的遺伝子による異なる位置又は同じ標的遺伝子の異なる転写物に向けられ得る。さらに、本明細書に開示する多標的分子に含まれる前記エフェクター分子は、本明細書に記載する核酸修飾、モチーフ又は構造のいずれかを含み得ることに留意する。
さらに、本明細書に記載する多標的分子に含まれるエフェクター分子は、前記エフェクター分子が多標的分子の一部でない場合の遺伝子発現調節活性と比較して同等の遺伝子発現調節活性を有する。換言すれば、エフェクター分子は、それが多標的分子の一部でない場合と比べて、それが本明細書に開示する多標的分子の一部である場合、同様の遺伝子発現調節活性を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載する多標的分子に含まれるエフェクター分子は、独立に、多標的分子の一部でない場合の遺伝子発現のそれらの調節と比べて、少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上）だけそれらのそれぞれの標的核酸の遺伝子発現を調節することができる。一部の実施形態では、多標的分子中のエフェクター分子の１つは、前記多標的分子中の他のエフェクター分子と比べてより高いレベルで遺伝子発現を調節する。一部の実施形態では、多標的分子中の前記少なくとも２つのエフェクター分子は、同様のレベル（例えば、互いに１０％、７．５％、５％、２．５％以下の範囲内）で遺伝子発現を調節する。
本発明者らは、リガンドと共役された多標的分子が遺伝子発現を調節するのに特に有効であることを見出した。従って、一部の実施形態では、少なくとも１つのリガンドを多標的分子と共役させる。従って、少なくとも１つのリガンドと共役された多標的分子は、本明細書において「共役多標的分子」とも呼ばれる。限定なしに、リガンドは、多標的分子中のエフェクター分子のいずれかに存在し得る。さらに、リガンドは、エフェクター分子及び／又は多標的分子の任意の位置に存在し得る。例えば、リガンドは、多標的分子中のエフェクター分子の５’末端、３’末端、内部位置又はこれらの組合せにおいて共役させることができる。一部の実施形態では、少なくとも２つのリガンドを多標的分子と共役させる。前記少なくとも２つのリガンドは、同じか、異なるか又は同じ及び異なるものの任意の組合せであり得る。２つのリガンドは、独立に、多標的分子中の任意の位置において共役され得る。一部の実施形態では、多標的分子中の少なくとも２つのエフェクター分子には、少なくとも１つのリガンドが結合されている。特定の理論に拘束されることは意図しないが、リガンドは、共役多標的分子の送達又は薬物動態プロファイルを向上させることができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載する切断可能なリンカーは、２０１６年７月１５日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０４２４９８号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる）に記載される多標的単一体コンジュゲートに使用され得る。
例示的な切断可能なリンカーの構造を示す。実施例２８、表１に記載されるビス（ｓｉＲＮＡ）設計に使用される様々な炭水化物及び非炭水化物リンカーを示す。 例示的な切断可能なリンカーの構造を示す。ガラクトース、ガラクトサミン、グルコース、グルコサミン、マンノース及びマンノサミン誘導体など、様々な修飾炭水化物の例示的な単糖を示す。ｎは１〜１２であり、ｍは１〜１２である。 例示的な切断可能なリンカーの構造を示す。ガラクトース、ガラクトサミン、グルコース、グルコサミン、マンノース及びマンノサミン誘導体など、様々な修飾炭水化物の例示的な単糖を示す。ｎは１〜１２であり、ｍは１〜１２である。 例示的な切断可能なリンカーの構造を示す。ガラクトース、ガラクトサミン、グルコース、グルコサミン、マンノース及びマンノサミン誘導体など、様々な修飾炭水化物の例示的な二糖若しくは三糖を示す。ｎは１〜１２であり、ｍは１〜１２である。 例示的な切断可能なリンカーの構造を示す。ガラクトース、ガラクトサミン、グルコース、グルコサミン、マンノース及びマンノサミン誘導体など、様々な修飾炭水化物の例示的な二糖若しくは三糖を示す。ｎは１〜１２であり、ｍは１〜１２である。 例示的な切断可能なリンカーの構造を示す。例示的なプロテアーゼ切断リンカーを示す。 ラットにおける例示的なリンカーを含むビス（ｓｉＲＮＡ）の分解を示すゲル移動度アッセイの写真である。ビス（ｓｉＲＮＡ）化合物は、ＡＭ−１０６〜ＡＭ−１２９である。 図７−１の続き。 ラットにおける例示的なリンカーを含むビス（ｓｉＲＮＡ）の分解を示すゲル移動度アッセイの写真である。ビス（ｓｉＲＮＡ）化合物は、ＡＭ−１３０〜ＡＭ−１４７である。 図８−１の続き。 ラットにおける例示的なリンカーを含むビス（ｓｉＲＮＡ）の分解を示すゲル移動度アッセイの写真である。ビス（ｓｉＲＮＡ）化合物は、ＡＭ−１４８〜ＡＭ−１５４である。 ラットにおける例示的なリンカーを含むビス（ｓｉＲＮＡ）の分解を示すゲル移動度アッセイの写真である。ビス（ｓｉＲＮＡ）化合物は、ＡＭ−１５５〜ＡＭ−１６１である。
以上の概要及び以下の詳細な説明のいずれも、例示及び説明を意図するものであり、特許請求の範囲に記載する通り、本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。本明細書において、単数形の使用は、特に別の記載がない限り、複数形を含む。本明細書で使用されるとき、「又は」の使用は、別に記載のない限り、「及び／又は」を意味する。さらに、用語「含んでいる」並びに「含む」及び「含まれる」などの他の形態の使用も限定的ではない。また、「要素」又は「成分」などの用語は、特に別の記載がない限り、１単位を含む要素及び成分と、２サブユニット以上を含む要素及び成分との両方を包含する。
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成を目的とするに過ぎず、記載される主題を限定するものとして解釈すべきではない。本願に引用される全ての文献又は文献の一部、例えば、限定しないが、特許、特許出願、論文、書籍及び専門書は、あらゆる目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれるものとする。
エフェクター分子
当業者であれば、２０〜２３、特に２１塩基対の二重螺旋構造を含む二本鎖オリゴヌクレオチドがＲＮＡ干渉を誘導するのに特に有効であるとして認められていることは十分認識している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７−６８８８）。しかしながら、他に、これより短い又は長い二本鎖オリゴヌクレオチドも有効となり得ることが見出されている。
本明細書で使用されるとき、用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する物質を指す。これらの物質は、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られる細胞質多タンパク質複合体と結合する。ＲＮＡ干渉を誘導する上で有効な物質は、本明細書においてｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ剤又はｉＲＮＡ剤とも呼ばれる。本明細書で使用されるとき、用語ｓｉＲＮＡは、マイクロＲＮＡ及びｐｒｅ−マイクロＲＮＡを含む。本明細書で使用されるとき、用語「ｓｉＲＮＡ活性」及び「ＲＮＡｉ活性」は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシングを指す。
二本鎖オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズして、二重螺旋構造を形成するのに十分に相補的である２つのオリゴヌクレオチド鎖を含む。一般に、二重螺旋構造は、１５〜３５、より一般的には１８〜２５、さらに一般的には１９〜２４、最も一般的には１９〜２１塩基対の長さである。一部の実施形態では、長さが２５〜３０塩基対と、より長い二本鎖オリゴヌクレオチドが好ましい。一部の実施形態では、長さが１０〜１５塩基対と、より短い二本鎖オリゴヌクレオチドが好ましい。別の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも２１ヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、ここで、アンチセンスＲＮＡ鎖は、標的配列の少なくとも一部と相補的である相補性の領域を有し、二重螺旋領域は、１４〜３０ヌクレオチド長である。同様に、標的配列に対する相補性の領域は、１４〜３０、より一般的には１８〜２５、さらに一般的には１９〜２４、最も一般的には１９〜２１ヌクレオチド長である。
本明細書で使用されるとき、語句「アンチセンス鎖」は、目的とする標的配列に対して実質的に相補的又は１００％相補的であるオリゴマー化合物を指す。「アンチセンス鎖」という語句は、２つの個別の鎖から形成される両オリゴマー化合物のアンチセンス領域並びにヘアピン又はダンベル型構造を形成することができる単分子化合物を含む。用語「アンチセンス鎖」及び「ガイド鎖」は、本明細書では置き換え可能に使用される。
語句「センス鎖」は、メッセンジャーＲＮＡ又はＤＮＡの配列などの標的配列と、全部又は一部が同じヌクレオシド配列を有するオリゴマー化合物を指す。「センス鎖」及び「パッセンジャー鎖」という用語は、本明細書では置き換え可能に使用される。
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０若しくはそれを上回るヌクレオチチド対と等しいか又は少なくともその長さである。
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０若しくはそれを上回るヌクレオチチド対と等しいか又は少なくともその長さである。
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０若しくはそれを上回るヌクレオチチド対と等しいか又は少なくともその長さである。
一部の実施形態では、１つの鎖は、二本鎖領域内に１〜１０個の一本鎖ヌクレオチドの少なくとも１区間を有する。「二本鎖領域内に一本鎖ヌクレオチドの区間」とは、別のヌクレオチドと塩基対を形成しない二本鎖領域内の少なくとも１つのヌクレオチドが存在することを意味する。一本鎖ヌクレオチドの区間が二本鎖領域の内部に存在する場合、一本鎖区間の両端に少なくとも１つのヌクレオチド塩基対が存在し得る。二本鎖領域の端部に存在する場合、一本鎖ヌクレオチドの区間は、一本鎖突出部であり得る。二本鎖領域内の一本鎖ヌクレオチドの区間は、バルジ又は１つ又は複数のミスマッチヌクレオチドの形態であり得る。一部の実施形態では、両方の鎖が、二本鎖領域内に１〜５（例えば、１、２、３、４又は５）個の一本鎖ヌクレオチドから構成される少なくとも１区間を有する。両方の鎖が、二本鎖領域内に１〜５（例えば、１、２、３、４又は５）個の一本鎖ヌクレオチドから構成される１区間を有する場合、このような一本鎖ヌクレオチドは、互いに反対（例えば、ミスマッチの区間）であり得、又は第２の鎖が第１の鎖の一本鎖オリゴヌクレオチドと反対の非塩基対ヌクレオチドを含まないようにこれらを配置し得、またその逆（例えば、一本鎖ループ）も可能である。一部の実施形態では、一本鎖ヌクレオチドは、いずれかの末端から８ヌクレオチド以内、例えば２つの鎖間の相補性の領域の５’又は３’末端のいずれかから８、７、６、５、４、３若しくは２ヌクレオチドに存在する。
ヘアピン及びダンベルタイプオリゴヌクレオチドは、少なくとも１４、１５、１５、１６、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド対以上の二重螺旋領域を有し得る。二重螺旋領域は、２００、１００又は５０以下の長さであり得る。一部の実施形態では、二重螺旋領域の範囲は、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３及び１９〜２１ヌクレオチド対の長さである。
一部の実施形態では、核酸ベースのエフェクター分子は、一部の実施形態では３’に、また一部の実施形態ではヘアピンのアンチセンス側に一本鎖突出部又は末端非対合領域を有し得るヘアピンオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、突出部は、１〜４、より一般的には２〜３ヌクレオチド長であった。ＲＮＡ干渉を誘導することができるヘアピンオリゴヌクレオチドは、本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とも呼ばれる。
いくつかの実施形態では、２つのオリゴヌクレオチド鎖は、特定の結合が要望される条件下、すなわちインビボアッセイ若しくは治療処置の場合、生理学的条件下で、且つインビトロアッセイの場合、アッセイが実施される条件下で、非標的核酸配列とアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合に特異的にハイブリダイズする。
本明細書で使用されるとき、「緊縮ハイブリダイゼーション条件」又は「緊縮条件」は、アンチセンス化合物がその標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とは最小数にハイブリダイズする条件を指す。緊縮条件は、配列依存的であり、様々な状況で異なり、アンチセンス化合物が標的配列とハイブリダイズする「緊縮条件」は、アンチセンス化合物の性質及び組成並びにそれらが試験されるアッセイによって決定される。
当技術分野では、ヌクレオチド親和性修飾の組み込みにより、非修飾活性化と比較して、より多くのミスマッチ数を達成し得ることが理解される。同様に、特定のオリゴヌクレオチド配列は、他のオリゴヌクレオチド配列よりミスマッチに対してより耐性であり得る。当業者は、オリゴヌクレオチド同士又はオリゴヌクレオチド及び標的核酸同士の適切な数のミスマッチを例えば融解温度（Ｔｍ）の決定により決定することができる。Ｔｍ又はΔＴｍは、当業者に周知である技術によって計算することができる。例えば、Ｆｒｅｉｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５，２２：４４２９−４４４３）に記載される技術により、当業者は、ヌクレオチド修飾を、それらがＲＮＡ：ＤＮＡ及びＲＮＡ：ＲＮＡ二重螺旋の融解温度を高める能力について評価することができる。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤、すなわちｓｉＲＮＡである。ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチドは、別の記載がない限り同義的に使用され得ることが理解される。ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、それぞれ１４〜４０ヌクレオチドを有する。ｄｓＲＮＡ剤は、式（Ｉ）：
Figure 2020505032
 により表される。
式（Ｉ）中、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’及びＢ４’は、それぞれ独立に、２’−Ｏ−アルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ及びＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドである。一部の実施形態では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’及びＢ４’は、それぞれ２’−ＯＭｅ修飾を含む。
Ｃ１は、アンチセンス鎖のシード領域（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜８位）とは反対の部位に配置される熱不安定化ヌクレオチドである。例えば、Ｃ１は、アンチセンス鎖の５’末端の２〜８位のヌクレオチドと対合するセンス鎖の１つの位置にある。Ｃ１ヌクレオチドは、熱不安定化修飾を担持し、これは、脱塩基修飾；二重螺旋中の反対側ヌクレオチドとのミスマッチ；並びに２’−デオキシ修飾又は非環状ヌクレオチド、例えばアンロックド核酸（ＵＮＡ）若しくはグリセロール核酸（ＧＮＡ）などの糖修飾を含み得る。一部の実施形態では、Ｃ１は、ｉ）アンチセンス鎖の反対側ヌクレオチドとのミスマッチ；ｉｉ）
Figure 2020505032
 からなる群から選択される脱塩基修飾；及びｉｉｉ）
Figure 2020505032
 からなる群から選択される糖修飾からなる群から選択される熱不安定化修飾を有し、ここで、Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基であり、Ｒ１及びＲ２は、独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３若しくはアルキルであり；Ｒ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール若しくは糖である。一部の実施形態では、Ｃ１における熱不安定化修飾は、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ及びＵ：Ｔからなる群から選択されるミスマッチ；及び任意選択で、ミスマッチ対における少なくとも１つの核酸塩基は、２’−デオキシ核酸塩基である。一例では、Ｃ１における熱不安定化修飾は、ＧＮＡ又は
Figure 2020505032
 である。
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’及びＴ３’は、それぞれ独立に、２’−ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さをヌクレオチドに付与する修飾を含むヌクレオチドを示す。修飾は、ヌクレオチドのリボース糖の２’位にあるか、又は非リボースヌクレオチド、非環状ヌクレオチド又はヌクレオチドの骨格に対する修飾であり得、この修飾は、リボース糖の２’位と類似又は均等であり、且つ２’−ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さをヌクレオチドに付与する。例えば、Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’及びＴ３’は、それぞれ独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ及び２’−Ｆ−５’−メチルから選択される。一部の実施形態では、Ｔ１はＤＮＡである。一部の実施形態では、Ｔ１’は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＬＮＡである。一部の実施形態では、Ｔ２’は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。一部の実施形態では、Ｔ３’は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。
ｎ１、ｎ３及びｑ１は、独立に、４〜１５ヌクレオチド長である。
ｎ５、ｑ３及びｑ７は、独立に、１〜６ヌクレオチド長である。
ｎ４、ｑ２及びｑ６は、独立に、１〜３ヌクレオチド長である。
ｑ５は、独立に、０〜１０ヌクレオチド長である。
ｎ２及びｑ４は、独立に、０〜３ヌクレオチド長である。
或いは、ｎ４は、０〜３ヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、ｎ４は、０であり得る。一例では、ｎ４は、０で、ｑ２及びｑ６は、１である。別の例では、ｎ４は、０で、ｑ２及びｑ６は、１であり、ここで、センス鎖の１〜５位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（センス鎖の５’末端から数えて）を有し、アンチセンス鎖の１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を、また１８〜２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）を有する。
一部の実施形態では、ｎ４、ｑ２及びｑ６は、それぞれ１である。
一部の実施形態では、ｎ２、ｎ４、ｑ２、ｑ４及びｑ６は、それぞれ１である。
一部の実施形態では、センス鎖が、１９〜２２ヌクレオチド長であり、且つｎ４が１であるとき、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１４〜１７位にある。
一部の実施形態では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位で開始する。一例では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、ｑ６は、１に等しい。
一部の実施形態では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位で開始する。一例では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、ｑ２は、１に等しい。
一部の実施形態では、Ｔ１’及びＴ３’は、長さ１１ヌクレオチドだけ隔てられている（すなわちＴ１’及びＴ３’ヌクレオチドを計数しない。
一部の実施形態では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にある。一例では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、ｑ２は、１に等しく、非リボース、非環状若しくは骨格における１つ又は複数の２’位の修飾は、２’−ＯＭｅリボース修飾より小さい立体的嵩高さを付与する。
一部の実施形態では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にある。一例では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、ｑ６は、１に等しく、非リボース、非環状若しくは骨格におけ１つ又は複数のる２’位の修飾は、２’−ＯＭｅリボース修飾より小さい立体的嵩高さを付与する。
一部の実施形態では、Ｔ１は、センス鎖の切断部位にある。一例では、センス鎖が、１９〜２２ヌクレオチド長であり、且つｎ２が１であるとき、Ｔ１は、センス鎖の５’末端から１１位にある。
一部の実施形態では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６位で開始する。一例では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６〜１０位にあり、ｑ４は、１である。
一部の実施形態では、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’−ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’−ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’−Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’−Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’−Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’−ＯＭｅであり、ｑ７は、１である。
一部の実施形態では、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’−ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’−ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’−Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’−Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’−Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’−ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１〜５位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（センス鎖の５’末端から数えて）を有し、アンチセンス鎖の１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を、また１８〜２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）を有する。
一部の実施形態では、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’−ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’−ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’−Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’−Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’−ＯＭｅであり、ｑ７は、１である。
一部の実施形態では、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’−ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’−ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’−Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’−Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’−ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１〜５位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（５’末端から数えて）を有し、アンチセンス鎖の１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を、また１８〜２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（５’末端から数えて）を有する。
一部の実施形態では、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’−ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’−ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’−Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’−Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’−Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’−Ｆであり、ｑ７は、１である。
一部の実施形態では、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’−ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’−ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’−Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’−Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’−Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’−Ｆであり、ｑ７は、１であり；ここで、センス鎖の１〜５位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（センス鎖の５’末端から数えて）を有し、アンチセンス鎖の１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を、また１８〜２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）を有する。
一部の実施形態では、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’−ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’−ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’−Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’−Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’−Ｆであり、ｑ７は、１である。
一部の実施形態では、Ｂ１は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’−ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’−ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’−Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’−Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’−Ｆであり、ｑ７は、１であり；ここで、センス鎖の１〜５位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（センス鎖の５’末端から数えて）を有し、また、アンチセンス鎖の１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と、１８〜２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）を有する。
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤の１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％又は３０％が、修飾されている。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス及びアンチセンス鎖の各々は、独立に、非環状ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、２’−フルオロ、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）又は２’−アラ−Ｆで修飾されている。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス及びアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの異なる修飾を含有する。
一部の実施形態では、式（Ｉ）のｄｓＲＮＡ剤は、１〜１０ヌクレオチド長の３’及び／又は５’突出部をさらに含む。一例では、式（Ｉ）のｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に３’突出部を含み、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。別の例では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の５’末端に５’末端突出部を有する。
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、２’−Ｆ修飾を一切含まない。
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個の２’−Ｆ修飾を含む。一例では、本発明のエフェクター分子は、９又は１０個の２’−Ｆ修飾を含む。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の１つ又は複数のブロックを含む。一例では、センス鎖は、２つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の１つのブロックを含む。一例では、アンチセンス鎖は、２つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックを含む。例えば、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックは、１６〜１８リン酸ヌクレオチド間結合により隔てられている。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス及びアンチセンス鎖の各々は、１５〜３０ヌクレオチドを有する。一例では、センス鎖は、１９〜２２ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は、１９〜２５ヌクレオチドを有する。別の例では、センス鎖は、２１ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチドを有する。
一部の実施形態では、二重螺旋におけるアンチセンス鎖の５’末端の１位のヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ及びｄＴからなる群から選択される。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端から１番目、２番目及び３番目の塩基対の少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡと１００％相補的であり、これとハイブリダイズして、ＲＮＡ干渉によりその発現を阻害する。別の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡと少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％又は少なくとも５０％相補的である。
一態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有する。センス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含有し、ここで、少なくとも１つの前記熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域とは反対の部位（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜８位）又はその付近に存在する。例えば、センス鎖が、２１ヌクレオチド長のとき、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４〜１７位に存在する。アンチセンス鎖は、立体的要求性のある２’−ＯＭｅ修飾より小さい、少なくとも２つの修飾核酸を含有する。好ましくは、立体的要求性のある２’−ＯＭｅ修飾より小さい、２つの修飾核酸は、長さ１１ヌクレオチドだけ隔てられている。例えば、２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２及び１４位にある。
特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分岐状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；及び
（ｉｉｉ）１、３、５、７、９〜１１、１３、１７、１９及び２１位における２’−Ｆ修飾並びに２、４、６、８、１２、１４〜１６、１８及び２０位における２’−ＯＭｅ修飾（５’末端から数えて）；並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、３、５、９、１１〜１３、１５、１７、１９、２１及び２３位における２’−ＯＭｅ修飾並びに２、４、６〜８、１０、１４、１６、１８、２０及び２２位における２’Ｆ修飾（５’末端から数えて）；及び
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置２１及び２２間並びにヌクレオチド位置２２及び２３間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み、ここで、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチド突出部及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分岐状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１、３、５、７、９〜１１、１３、１５、１７、１９及び２１位における２’−Ｆ修飾並びに２、４、６、８、１２、１４、１６、１８及び２０位における２’−ＯＭｅ修飾（５’末端から数えて）；及び
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１及び２間並びにヌクレオチド位置２及び３間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、３、５、７、９、１１〜１３、１５、１７、１９及び２１〜２３位における２’−ＯＭｅ修飾並びに２、４、６、８、１０、１４、１６、１８及び２０位における２’Ｆ修飾（５’末端から数えて）；及び
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置１及び２間、ヌクレオチド位置２及び３間、ヌクレオチド位置２１及び２２間並びにヌクレオチド位置２２及び２３間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み、ここで、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチド突出部及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分岐状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１〜６、８、１０及び１２〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾、７及び９位における２’−Ｆ修飾並びに１１位におけるデソキシ−ヌクレオチド（例えば、ｄＴ）（５’末端から数えて）；及び
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１及び〜２間並びにヌクレオチド位置２及び３間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、３、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９〜２３位における２’−ＯＭｅ修飾並びに２、４〜６、８、１０、１２、１４、１６及び１８位における２’−Ｆ修飾（５’末端から数えて）；及び
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置１及び２間、ヌクレオチド位置２及び３間、ヌクレオチド位置２１及び２２間並びにヌクレオチド位置２２及び２３間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み、ここで、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチド突出部及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分岐状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１〜６、８、１０、１２、１４及び１６〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾並びに７、９、１１、１３及び１５位における２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１及び２間並びにヌクレオチド位置２及び３間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１〜２３位における２’−ＯＭｅ修飾並びに２〜４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０位における２’−Ｆ修飾（５’末端から数えて）；及び
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置１及び２間、ヌクレオチド位置２及び３間、ヌクレオチド位置２１及び２２間並びにヌクレオチド位置２２及び２３間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み、ここで、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチド突出部及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分岐状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１〜９及び１２〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾並びに１０及び１１位における２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１及び２間並びにヌクレオチド位置２及び３間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、３、５、７、９、１１〜１３、１５、１７、１９及び２１〜２３位における２’−ＯＭｅ修飾並びに２、４、６、８、１０、１４、１６、１８及び２０位における２’−Ｆ修飾（５’末端から数えて）；及び
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置１及び２間、ヌクレオチド位置２及び３間、ヌクレオチド位置２１及び２２間並びにヌクレオチド位置２２及び２３間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み、ここで、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチド突出部及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分岐状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１、３、５、７、９〜１１及び１３位における２’−Ｆ修飾並びに２、４、６、８、１２及び１４〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾；及び
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１及び２間並びにヌクレオチド位置２及び３間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、３、５〜７、９、１１〜１３、１５、１７〜１９及び２１〜２３位における２’−ＯＭｅ修飾並びに２、４、８、１０、１４、１６及び２０位における２’−Ｆ修飾（５’末端から数えて）；及び
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置１及び２間、ヌクレオチド位置２及び３間、ヌクレオチド位置２１及び２２間並びにヌクレオチド位置２２及び２３間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み、ここで、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチド突出部及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分岐状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１、２、４、６、８、１２、１４、１５、１７及び１９〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾並びに３、５、７、９〜１１、１３、１６及び１８位における２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１及び２間並びにヌクレオチド位置２及び３間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２５ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、４、６、７、９、１１〜１３、１５、１７及び１９〜２３位における２’−ＯＭｅ修飾、２、３、５、８、１０、１４、１６及び１８位における２’−Ｆ修飾並びに２４及び２５位におけるデソキシ−ヌクレオチド（例えば、ｄＴ）（５’末端から数えて）；及び
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置１及び２間、ヌクレオチド位置２及び３間、ヌクレオチド位置２１及び２２間並びにヌクレオチド位置２２及び２３間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み、ここで、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に４つのヌクレオチド突出部及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分岐状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１〜６、８及び１２〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾並びに７及び９〜１１位における２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１及び２間並びにヌクレオチド位置２及び３間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、３〜５、７、８、１０〜１３、１５及び１７〜２３位における２’−ＯＭｅ修飾並びに２、６、９、１４及び１６位における２’−Ｆ修飾（５’末端から数えて）；及び
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置１及び２間、ヌクレオチド位置２及び３間、ヌクレオチド位置２１及び２２間並びにヌクレオチド位置２２及び２３間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み、ここで、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチド突出部及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分岐状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１〜６、８及び１２〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾並びに７及び９〜１１位における２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１及び２間並びにヌクレオチド位置２及び３間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、３〜５、７、１０〜１３、１５及び１７〜２３位における２’−ＯＭｅ修飾並びに２、６、８、９、１４及び１６位における２’−Ｆ修飾（５’末端から数えて）；及び
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置１及び２間、ヌクレオチド位置２及び３間、ヌクレオチド位置２１及び２２間並びにヌクレオチド位置２２及び２３間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み、ここで、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチド突出部及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）１９ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分岐状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１〜４、６及び１０〜１９位における２’−ＯＭｅ修飾並びに５及び７〜９位における２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１及び２間並びにヌクレオチド位置２及び３間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、３〜５、７、１０〜１３、１５及び１７〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾並びに２、６、８、９、１４及び１６位における２’−Ｆ修飾（５’末端から数えて）；及び
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置１及び２間、ヌクレオチド位置２及び３間、ヌクレオチド位置１９及び２０間並びにヌクレオチド位置２０及び２１間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み、ここで、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチド突出部及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
一実施形態では、本明細書に記載するｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７位に、センス鎖の５’末端から数えて１５位に、センス鎖の５’末端から数えて２１位に又はこれらの組合せで熱不安定化修飾をさらに含む。
一態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有する。センス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含有し、ここで、少なくとも１つの前記熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域とは反対の部位（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜８位）又はその付近に存在する。例えば、センス鎖が２１ヌクレオチド長のとき、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４〜１７位に存在する。アンチセンス鎖は、長さ１１ヌクレオチドだけ隔てられた、立体的要求性のある２’−ＯＭｅ修飾より小さい２つの修飾核酸を含む。例えば、２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２及び１４位にある。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖は、センス鎖の切断部位においてエンドヌクレアーゼ感受性修飾ヌクレオチドをさらに含む。一例では、エンドヌクレアーゼ感受性修飾ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端から１１位にある。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、マイクロＲＮＡである。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ又はｍｉｒ）は、植物及び動物のゲノム中のＤＮＡから転写されるが、タンパク質へと翻訳されない小ＲＮＡ分子の高度に保存されたクラスである。Ｐｒｅ−マイクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＡへとプロセシングされる。プロセシングされるマイクロＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、発達、細胞増殖、アポトーシス及び分化の主要調節因子として同定された一本鎖約１７〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡ分子である。それらは、特定のｍＲＮＡの３’−非翻訳領域に結合することにより、遺伝子発現の調節に役割を果たすものと考えられる。ＲＩＳＣは、翻訳阻害、転写物切断又はその両方により遺伝子発現の下方制御を媒介する。ＲＩＳＣは、広範囲にわたる真核生物の核内の転写サイレンシングにも関与している。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、リボザイムである。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有するオリゴヌクレオチドである（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｅｃｈ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８７ Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２；Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ｓｙｍｏｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９８７ Ａｐｒ ２４；４９（２）：２１１−２０）。少なくとも６つの基本的な種類の天然酵素ＲＮＡが現在知られている。概して、酵素核酸は、まず、標的ＲＮＡに結合することによって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断する役割を果たす分子の酵素部分にごく近接して保持される酵素核酸の標的結合部分によって行われる。従って、酵素核酸は、まず標的ＲＮＡを認識し、次に相補的な塩基対合によって標的ＲＮＡに結合し、適切な部位に結合すると、酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされたタンパク質の直接合成のその能力を破壊するであろう。酵素核酸が、そのＲＮＡ標的に結合し、それを切断した後、それは、別の標的を探すためにそのＲＮＡから放出され、新たな標的に繰り返し結合し、それを切断することができる。
任意の標的配列にターゲティングされたリボザイムを産生する方法が当技術分野において公知である。リボザイムは、国際特許出願公開国際公開第９３／２３５６９号パンフレット及び国際特許出願公開国際公開第９４／０２５９５号パンフレット（それぞれ参照により本明細書に明確に組み込まれる）に記載されるように設計され、これらの文献に記載されるように、インビトロ及びインビボで試験されるように合成され得る。
一部の実施形態では、エフェクターは、アプタマーである。アプタマーは、高い親和性及び特異性を有する該当する特定の分子に結合する核酸又はペプチド分子である（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５（１９９０）；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８（１９９０））。大きいタンパク質からの多くの様々な実体を小さい有機分子に結合するＤＮＡ又はＲＮＡアプタマーが問題なく産生された。Ｅａｔｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：１０−１６（１９９７），Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：３２４−９（１９９９）及びＨｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８２０−５（２０００）を参照されたい。アプタマーは、ＲＮＡ又はＤＮＡベースであり得る。概して、アプタマーは、インビトロ選択又は同等にＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）を複数回にわたり繰り返すことにより、小分子、タンパク質、核酸、さらには細胞、組織及び生物などの様々な分子標的に結合するように改変される。アプタマーは、合成、組み換え及び精製方法を含む任意の公知の方法によって調製され得、単独で又は同じ標的に特異的な他のアプタマーと組み合わせて使用され得る。さらに、本明細書により完全に記載されるように、用語「アプタマー」は、特に、２つ以上の公知のアプタマーを所与の標的と比較することから得られるコンセンサス配列を含有する「二次アプタマー」を含む。
転写因子は、周囲のゲノムＤＮＡの非存在下でさえ、それらの比較的短い結合配列を認識するため、特定の転写因子のコンセンサス結合配列を有する短いオリゴヌクレオチドは、生細胞内の遺伝子発現を操作するためのツールとして使用され得る。この手法は、このような「デコイオリゴヌクレオチド」の細胞内輸送を含み、次に、デコイオリゴヌクレオチドは、標的因子によって認識され、結合される。従って、一部の実施形態では、エフェクター分子は、デコイオリゴヌクレオチドである。
デコイによる転写因子のＤＮＡ結合部位の占有により、転写因子は、標的遺伝子のプロモーター領域に後に結合することができなくなる。デコイは、転写因子によって活性化される遺伝子の発現を阻害するため、又は転写因子の結合によって抑制される遺伝子を上方制御するため、治療剤として使用され得る。デコイオリゴヌクレオチドの利用の例は、Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０００，１０６：１０７１−１０７５に見出され、これは、全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、ｍｉＲＮＡ模倣物である。マイクロＲＮＡ模倣物（ｍｉＲＮＡ模倣物）は、１つ又は複数のｍｉＲＮＡの遺伝子調節活性を模倣するのに使用され得るクラスの分子を表す。従って、用語「マイクロＲＮＡ模倣物」は、ＲＮＡｉ経路に入り、遺伝子発現を調節することができる合成非コードＲＮＡ（すなわち、ｍｉＲＮＡは、内在性ｍｉＲＮＡの源からの精製によって得られない）を指す。ｍｉＲＮＡ模倣物は、成熟分子（例えば、一本鎖）又は模倣物前駆体（例えば、ｐｒｉ−又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）として設計され得る。１つの設計では、ｍｉＲＮＡ模倣物は、（例えば、約１６〜約３１ヌクレオチド長の二重螺旋領域を有する）二本鎖分子であり、所与のｍｉＲＮＡの成熟鎖との同一性を有する１つ又は複数の配列を含む。二本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物は、二本鎖オリゴヌクレオチドについて上述されるのと同様の設計を有する。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ模倣物は、１６〜３１ヌクレオチドの二重螺旋領域及び以下の化学修飾パターンの１つ又は複数を含む：センス鎖は、（センスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２並びにＣｓ及びＵｓの全ての２’−Ｏ−メチル修飾を含有し；アンチセンス鎖修飾は、Ｃｓ及びＵｓの全ての２’Ｆ修飾、オリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸化及び２ヌクレオチド３’突出部と結合された安定化ヌクレオチド間結合を含み得る。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、スーパーｍｉｒである。スーパーｍｉｒは、ｍｉＲＮＡと実質的に同一であり、且つその標的に対してアンチセンスであるヌクレオチド配列を有する例えば一本鎖、二本鎖又は部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドを指す。この用語は、同様に機能する少なくとも１つの非天然部分を含むオリゴヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、スーパーｍｉｒは、センス鎖を含まず、別の好ましい実施形態では、スーパーｍｉｒは、かなりの程度まで自己ハイブリダイズしない。本発明の主題であるスーパーｍｉｒは、二次構造を有し得るが、それは、生理学的条件下で実質的に一本鎖である。実質的に一本鎖であるスーパーｍｉｒは、スーパーｍｉｒの約５０％未満（例えば、約４０％、３０％、２０％、１０％又は５％未満）がそれ自体と二本鎖を形成する程度に一本鎖である。スーパーｍｉｒは、ヘアピンセグメントを含むことができ、例えば、配列は、好ましくは、３’末端において自己ハイブリダイズし、二重螺旋領域、例えば少なくとも１、２、３又は４つ、好ましくは８、７、６又は５つ未満のヌクレオチド、例えば５つのヌクレオチドの二重螺旋領域を形成することができる。二重螺旋領域は、リンカー、例えばヌクレオチドリンカー、例えば３、４、５又は６ｄＴ、例えば修飾ｄＴによって連結され得る。別の実施形態では、スーパーｍｉｒは、例えば、３’及び５’末端の一方若しくは両方又は１つの端部及びスーパーｍｉｒの非末端又は中央において、例えば５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド長のより短いオリゴと二本鎖を形成する。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、抗ｍｉｒである。用語「抗ｍｉｒ」、「マイクロＲＮＡ阻害剤」又は「ｍｉＲ阻害剤」は、同義であり、特定のｍｉＲＮＡの活性に干渉するオリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチドを指す。阻害剤は、一本鎖、二本鎖（ＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖）及びヘアピン設計を含む様々な形態を取ることができ、概して、マイクロＲＮＡ阻害剤は、ターゲティングされるｍｉＲＮＡの成熟鎖（又は鎖）と相補的であるか又は部分的に相補的である１つ又は複数の配列又は配列の部分を含み、さらに、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、成熟ｍｉＲＮＡと逆相補的な配列の５’及び３’に位置するさらなる配列も含み得る。さらなる配列は、成熟ｍｉＲＮＡが得られるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡにおいて成熟ｍｉＲＮＡに隣接する配列と逆相補的であり得、又はさらなる配列は、任意配列であり得る（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ又はｄＴの混合物を有する）。一部の実施形態では、さらなる配列の一方又は両方は、ヘアピンを形成することが可能な任意配列である。従って、一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡと逆相補的な配列には５’側及び３’側にヘアピン構造が配置されている。マイクロＲＮＡ阻害剤は、二本鎖である場合、逆鎖にヌクレオチド間のミスマッチを含み得る。さらに、マイクロＲＮＡ阻害剤は、細胞中への阻害剤の取り込みを促進するためにコンジュゲート部分に結合され得る。
ヘアピンｍｉＲＮＡ阻害剤を含むマイクロＲＮＡ阻害剤は、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ａｒｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ Ｏｆ Ｐｏｔｅｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＲＩＳＣ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”，ＲＮＡ １３：７２３−７３０（２００７）並びに国際公開第２００７／０９５３８７号パンフレット及び国際公開第２００８／０３６８２５号パンフレット（これらのそれぞれは、全体が参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。当業者は、所望のｍｉＲＮＡのデータベースから配列を選択し、本明細書に開示する方法に有用な阻害剤を設計することができる。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、アンタゴｍｉｒである。アンタゴｍｉｒは、ＲＮＡｓｅ保護並びに向上した組織及び細胞取り込みなどの薬理学的特性のために様々な修飾を有するＲＮＡ様オリゴヌクレオチドである。それらは、例えば、糖の完全な２’−Ｏ−メチル化、ホスホロチオエート糖間結合及び例えば３’末端におけるコレステロール−部分が通常のＲＮＡと異なる。好ましい実施形態では、アンタゴｍｉｒは、全てのヌクレオチドにおける２’−Ｏ−メチル修飾、３’末端におけるコレステロール部分、５’末端の最初の２つの位置における２つのホスホロチオエート糖間結合及び分子の３’末端における４つのホスホロチオエート結合を含む。アンタゴｍｉｒは、アンタゴｍｉｒ及び内在性ｍｉＲＮＡを含む二重鎖を形成することによって内在性ｍｉＲＮＡを効率的にサイレンシングするのに使用され得、それによりｍｉＲＮＡに誘導される遺伝子サイレンシングを防ぐ。アンタゴｍｉｒに媒介されるｍｉＲＮＡサイレンシングの一例は、Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３８：６８５−６８９（これは、全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる）に記載されるｍｉＲ−１２２のサイレンシングである。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、Ｕ１アダプターである。Ｕ１アダプターは、ポリＡ部位を阻害し、標的遺伝子の末端エキソン中の部位に相補的な標的ドメイン及びＵ１ ｓｎＲＮＰのＵ１のより小さい核ＲＮＡ成分に結合する「Ｕ１ドメイン」を有する二官能価オリゴヌクレオチドである。例えば、国際特許出願公開国際公開第２００８／１２１９６３号パンフレット及びＧｏｒａｃｚｎｉａｋ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２７（３），２５７−２６３（これらのそれぞれは、全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる）を参照されたい。Ｕ１ ｓｎＲＮＰは、主に、ｐｒｅ−ｍＲＮＡエキソン−イントロン境界への結合によってスプライセオソーム形成における初期段階を指令するように機能するリボヌクレオタンパク質複合体である（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｓｉｍｐｓｏｎ，１９９８，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ ４９：７７−９５）。
一部の実施形態では、Ｕ１アダプターは、少なくとも１つのエフェクタードメイン（Ｕ１ドメイン）に結合された少なくとも１つのアニーリングドメイン（ターゲティングドメイン）を含み、ここで、アニーリングドメインは、標的遺伝子配列にハイブリダイズし、エフェクタードメインは、Ｕ１ ｓｎＲＮＰのＵ１ ｓｎＲＮＡにハイブリダイズする。一部の実施形態では、Ｕ１アダプターは、１つのアニーリングドメインを含む。一部の実施形態では、Ｕ１アダプターは、１つのエフェクタードメインを含む。
特定の理論に拘束されることは意図しないが、アニーリングドメインは、典型的に、約１０〜約５０ヌクレオチド長、より典型的に、約１０〜約３０ヌクレオチド又は約１０〜約２０ヌクレオチドである。一部の好ましい実施形態では、アニーリングドメインは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド長である。アニーリングドメインは、標的遺伝子と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又はより好ましくは１００％相補的であり得る。一部の実施形態では、アニーリングドメインは、末端コード領域及び３’ＵＴＲ及びポリアデニル化シグナル配列（例えば、ポリアデニル化部位を介して）を含む、ｐｒｅ−ｍＲＮＡの３’末端エキソン内の標的部位とハイブリダイズする。別の実施形態では、標的配列は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのポリ（Ａ）シグナル配列の約５００塩基対、約２５０塩基対、約１００塩基対又は約５０塩基対以内である。一部の実施形態では、アニーリングドメインは、標的遺伝子配列との１、２、３又は４つのミスマッチを含む。
エフェクタードメインは、約８ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド又は約１０〜約１５ヌクレオチド長であり得る。Ｕｌドメインは、Ｕｌ ｓｎＲＮＡ、特に、５’末端と、より特定的に、ヌクレオチド２〜１１とハイブリダイズすることができる。別の実施形態では、Ｕｌドメインは、内在性Ｕｌ ｓｎＲＮＡのヌクレオチド２〜１１と完全に相補的である。一部の実施形態では、Ｕ１ドメインは、５’−ＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ−３’、５’−ＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ−３’、５’−ＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ−３’、５’−ＣＡＧＧＵＡＡＧＵ−３’、５’−ＣＡＧＧＵＡＡＧ−３’及び５’−ＣＡＧＧＵＡＡ−３’からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｕ１ドメインは、ヌクレオチド配列５’−ＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡ−３’を含む。特定の理論に拘束されることは意図しないが、ステム１への塩基対合及び／又はＵｌ ｓｎＲＮＡの位置１への塩基対合を含むためにＵｌドメインの長さを増加させることにより、Ｕｌ ｓｎＲＮＰに対するＵｌアダプターの親和性を向上させる。
Ｕｌアダプターのアニーリング及びエフェクタードメインは、エフェクタードメインがアニーリングドメインの５’末端及び／又は３’末端にあるように結合され得る。２つのドメインは、一方のドメインの３’末端が他方のドメインの５’末端に結合されるか、又は一方のドメインの３’末端が他方のドメインの３’末端に結合されるか、又は一方のドメインの５’末端が他方のドメインの５’末端に結合されるように結合され得る。アニーリング及びエフェクタードメインは、互いに直接又はヌクレオチドベース若しくは非ヌクレオチドベースのリンカーによって結合され得る。リンカーがヌクレオチドベースである場合、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、最大１５、最大２０又は最大２５ヌクレオチドを含み得る。
一部の実施形態では、アニーリングドメインとエフェクタードメインとの間のリンカーは、本明細書に記載する切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、アニーリングドメインとエフェクタードメインとの間のリンカーは、多価、例えば三価、四価又は五価である。特定の理論に拘束されることは意図しないが、多価リンカーは、単一のアニーリングドメインを複数のアダプタードメインと一緒に結合するのに使用され得る。
Ｕ１アダプターが、本明細書に記載する任意のオリゴヌクレオチド修飾を含み得ることが理解されるべきである。Ｕ１アダプターのための例示的な修飾としては、アニーリング親和性、特異性、細胞及び生物内におけるバイオアベイラビリティ、細胞及び／又は核輸送、安定性及び／又は分解に対する耐性を向上させるものが挙げられる。
最近の研究では、ｄｓＲＮＡが遺伝子発現も活性化することができること、すなわち「小さいＲＮＡに誘導される遺伝子活性化」又はＲＮＡａ（活性化ＲＮＡ）と呼ばれている機構が見出された。例えば、Ｌｉ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．（２００６），１０３（４６）：１７３３７−４２及びＬｉ Ｌ．Ｃ．（２００８）．“Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”．ＲＮＡ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｈｉｄｄｅｎ Ｌａｙｅｒ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ．Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．ＩＳＢＮ ９７８−１−９０４４５５−２５−７を参照されたい。ｄｓＲＮＡターゲティング遺伝子プロモーターが関連遺伝子の強力な転写活性化を誘導することが示されている。ＲＮＡａを引き起こす内在性ｍｉＲＮＡは、ヒトにおいても見出されている。Ｅ．Ｎａｔｕｒｅ（２００７）．４４８（７１５６）：８５５−８５８を確認されたい。
別の驚くべき観察は、ＲＮＡａによる遺伝子活性化が長続きすることである。遺伝子発現の誘導は、１０日間以上続くことが分かった。ＲＮＡａの長期の効果は、ｄｓＲＮＡ標的部位における後成的変化に起因し得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ活性化剤は、遺伝子の発現を増加させることができる。一部の実施形態では、増加した遺伝子発現は、生存、成長発達及び／又は複製を阻害する。
従って、一部の実施形態では、エフェクター分子は、活性化ＲＮＡである。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）である。最近の研究では、配列特異的に二重螺旋ＤＮＡ中のポリプリン／ポリピリミジン領域を認識し、それに結合することができる三重鎖形成性オリゴヌクレオチドが設計され得ることが示された。これらの認識規則は、Ｍａｈｅｒ ＩＩＩ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）ｖｏｌ．２４５，ｐｐ ７２５−７３０；Ｍｏｓｅｒ，Ｈ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）ｖｏｌ．２３８，ｐｐ ６４５−６３０；Ｂｅａｌ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）ｖｏｌ．２５１，ｐｐ １３６０−１３６３；Ｃｏｎｎｅｙ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）ｖｏｌ．２４１，ｐｐ ４５６−４５９及びＨｏｇａｎ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＰ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ３７５４０８に概説されている。挿入剤の導入及び糖間結合置換などのオリゴヌクレオチドの修飾及び結合条件（ｐＨ及びカチオン濃度）の最適化は、電荷斥力及び不安定性などのＴＦＯ活性に対する固有の障害を克服するのに役立ち、合成オリゴヌクレオチドが特定の配列にターゲティングされ得ることが最近示された（最近の論述については、Ｓｅｉｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００３；ｌ １２：４８７−９４を参照されたい）。概して、三重鎖形成性オリゴヌクレオチドは、以下の配列対応を有する。
オリゴ３’−ＡＧＧＴ
二重鎖５’−ＡＧＣＴ
二重鎖３’−ＴＣＧＡ
しかしながら、Ａ−ＡＴ及びＧ−ＧＣトリプレットが最大の三重螺旋安定性を有することが示された（Ｒｅｉｔｈｅｒ ａｎｄ Ｊｅｌｔｓｃｈ，ＢＭＣ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００２，Ｓｅρｔｌ２，Ｅｐｕｂ）。同じ著者が、Ａ−ＡＴ及びＧ−ＧＣ規則に従って設計されたＴＦＯが非特異的三重鎖を形成しないことを実証しており、これは、三重鎖形成が実際に配列特異的であることを示す。
従って、任意の所与の配列について三重鎖形成性配列が考案され得る。三重鎖形成性オリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも１５、より好ましくは２５、さらにより好ましくは３０以上のヌクレオチド長、最大５０又は１００ヌクレオチドである。
標的ＤＮＡによる三重螺旋構造の形成は、立体及び機能変化を誘導し、転写の開始及び伸長を妨げ、内在性ＤＮＡにおける所望の配列変化の導入を可能にし、遺伝子発現の特異的な下方制御をもたらす。ＴＦＯで処理された細胞内の遺伝子発現のこのような抑制の例としては、哺乳動物細胞内のエピソームｓｕｐＦＧｌ及び内在性ＨＰＲＴ遺伝子のノックアウト（Ｖａｓｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９；２７：１１７６−８１及びＰｕｒｉ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００１；２７６：２８９９１−９８）並びに前立腺癌の病因において重要なＥｔｓ２転写因子（Ｃａｒｂｏｎｅ，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２００３；３１：８３３−４３）及び炎症誘発性ＩＣＡＭ−Ｉ遺伝子（Ｂｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００２；２７７：３２４７３−７９）の発現の配列特異的及び標的特異的な下方制御が挙げられる。さらに、Ｖｕｙｉｓｉｃｈ及びＢｅａｌは、最近、配列特異的ＴＦＯがｄｓＲＮＡに結合することができ、ＲＮＡ依存性キナーゼなどのｄｓＲＮＡ依存性酵素の活性を阻害することを示した（Ｖｕｙｉｓｉｃｈ ａｎｄ Ｂｅａｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０００；２８：２３６９−７４）。
さらに、上記の原理に従って設計されたＴＦＯは、ＤＮＡ修復を行うことが可能な定方向突然変異誘発を誘導し、従って、内在性遺伝子の発現の下方制御及び上方制御の両方を提供することができる（Ｓｅｉｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００３；１１２：４８７−９４）。有効なＴＦＯの設計、合成及び投与の詳細な説明は、Ｆｒｏｅｈｌｅｒらの米国特許出願公開第２００３ ０１７０６８号明細書及び同第２００３ ００９６９８０号明細書並びにＥｍａｎｕｅｌｅらの同第２００２ ０１２８２１８号明細書及び同第２００２ ０１２３４７６号明細書及びＬａｗｎに付与された米国特許第５，７２１，１３８号明細書（その内容は、全体として本明細書に組み込まれる）に見出される。
多標的分子
一態様では、多標的分子が本明細書において提供される。概して、多標的分子は、互いに共有結合又は非共有結合された少なくとも２つの核酸ベースのエフェクター分子を含む。限定なしに、標的の遺伝子発現を調節することが可能な任意の核酸ベースのエフェクター分子は、本明細書に開示する多標的分子に含まれ得る。
一部の実施形態では、多標的分子中の少なくとも１つのエフェクター分子は、ｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、多標的分子は、少なくとも２つのｓｉＲＮＡを含む。限定なしに、２つのｓｉＲＮＡは、同じか又は異なり得る。例えば、２つのｓｉＲＮＡは、同じ標的又は異なる標的に向けられ得る。さらに、２つのｓｉＲＮＡは、同じ標的上の異なる領域に向けられ得る。
一部の実施形態では、多標的分子は、２つの別個のｓｉＲＮＡ分子から組み立てられ、ここで、ｓｉＲＮＡの少なくとも１つに少なくとも１つのリガンドが結合される。一部の他の実施形態では、多標的分子は、２つの別個のｓｉＲＮＡ分子から組み立てられ、各ｓｉＲＮＡに少なくとも１つのリガンドが結合される。
それぞれ少なくとも１つのリガンドを有する少なくとも２つのｓｉＲＮＡが互いに結合される、多標的分子の様々な実施形態では、前記少なくとも２つのリガンドは、同じであり得るか又はそれらは異なり得る。さらに、前記少なくともリガンドは、独立に、それぞれのｓｉＲＮＡの任意の位置において共役され得る。例えば、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖に結合され得、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのセンス鎖に結合され得るか、又は１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖に結合され得、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に結合され得るか、又は１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に結合され得、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に結合され得る。限定なしに、第１のリガンドは、独立に、第１のｓｉＲＮＡの１つの鎖（センス又はアンチセンス）の５’末端、３’末端又は内部位置において結合され得る。同様に、第２のリガンドは、独立に、第２のｓｉＲＮＡの１つの鎖（センス又はアンチセンス）の５’末端、３’末端又は内部位置において結合され得る。
一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の内部位置において共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の内部位置において共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのセンス鎖の内部位置において共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのセンス鎖の内部位置において共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の内部位置において共役され、他のリガンドが第２のｓｉＲＮＡのセンス鎖の内部位置において共役される。
一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のセンス鎖の３’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のセンス鎖の５’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のセンス鎖の３’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のセンス鎖の５’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のセンス鎖の内部位置において共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のセンス鎖の内部位置に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のセンス鎖の内部位置において共役され、他のリガンドが第２のセンス鎖の内部位置において共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のアンチセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のアンチセンス鎖の３’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のアンチセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のアンチセンス鎖の５’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のアンチセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のアンチセンス鎖の３’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のアンチセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のアンチセンス鎖の５’末端に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のアンチセンス鎖の３’末端に共役され、他のリガンドが第２のアンチセンス鎖の内部位置において共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のアンチセンス鎖の５’末端に共役され、他のリガンドが第２のアンチセンス鎖の内部位置に共役される。一部の実施形態では、１つのリガンドが第１のアンチセンス鎖の内部位置において共役され、他のリガンドが第２のアンチセンス鎖の内部位置において共役される。
一部の実施形態では、多標的分子は、２つのｓｉＲＮＡから組み立てられ、ここで、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖が第２のｓｉＲＮＡのセンス鎖に共有結合される。限定なしに、２つのセンス鎖は、任意の配向で互いに結合され得る。例えば、第１のセンス鎖の３’末端は、第２のセンス鎖の５’末端に結合され得；第１のセンス鎖の３’末端は、第２のセンス鎖の３’末端に結合され得；又は第１のセンス鎖の５’末端は、第２のセンス鎖の５’末端に結合され得る。
一部の実施形態では、多標的分子は、２つのｓｉＲＮＡから組み立てられ、ここで、第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に共有結合される。限定なしに、２つのアンチセンス鎖は、任意の配向で互いに結合され得る。例えば、第１のアンチセンス鎖の３’末端は、第２のアンチセンス鎖の５’末端に結合され得；第１のアンチセンス鎖の３’末端は、第２のアンチセンス鎖の３’末端に結合され得；又は第１のアンチセンス鎖の５’末端は、第２のアンチセンス鎖の５’末端に結合され得る。
一部の実施形態では、多標的分子は、２つのｓｉＲＮＡから組み立てられ、ここで、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖が第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に共有結合される。限定なしに、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、任意の配向で第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に結合され得る。例えば、センス鎖の３’末端は、アンチセンス鎖の５’末端に結合され得；センス鎖の３’末端は、アンチセンス鎖の３’末端に結合され得；又はセンス鎖の５’末端は、アンチセンス鎖の５’末端に結合され得る。
一部の実施形態では、多標的分子は、２つのｓｉＲＮＡから組み立てられ、ここで、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖が第２のｓｉＲＮＡのセンス鎖に共有結合され、第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に共有結合される。一部の実施形態では、多標的分子は、２つのｓｉＲＮＡから組み立てられ、ここで、第１のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、第２のｓｉＲＮＡのセンス鎖に共有結合され、第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖が第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に共有結合される。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。一部の実施形態では、多標的分子は、２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドから組み立てられる。限定なしに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、同じか又は異なり得る。
２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、いずれかの端部おいて互いに結合され得る。例えば、第１のアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端は、第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端のいずれかに結合され得る。或いは、第１のアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端は、第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端のいずれかに結合され得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、ｓｉＲＮＡであり、エフェクター分子の少なくとも１つは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、マイクロＲＮＡである。一部の実施形態では、多標的分子は、少なくとも２つのマイクロＲＮＡを含む。限定なしに、マイクロＲＮＡは、同じか又は異なり得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、ｓｉＲＮＡであり、エフェクター分子の少なくとも１つは、マイクロＲＮＡである。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、リボザイムである。一部の実施形態では、多標的分子は、少なくとも２つのリボザイムを含む。限定なしに、リボザイムは、同じか又は異なり得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、ｓｉＲＮＡであり、エフェクター分子の少なくとも１つは、リボザイムである。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、アプタマーである。一部の実施形態では、多標的分子は、少なくとも２つのアプタマーを含む。限定なしに、アプタマーは、同じか又は異なり得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、ｓｉＲＮＡであり、エフェクター分子の少なくとも１つは、アプタマーである。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、デコイオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、多標的分子は、少なくとも２つのデコイオリゴヌクレオチドを含む。限定なしに、デコイオリゴヌクレオチドは、同じか又は異なり得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、ｓｉＲＮＡであり、エフェクター分子の少なくとも１つは、デコイオリゴヌクレオチドである。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、ｍｉＲＮＡ模倣物である。一部の実施形態では、多標的分子は、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ模倣物を含む。限定なしに、ｍｉＲＮＡ模倣物は、同じか又は異なり得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、ｓｉＲＮＡであり、エフェクター分子の少なくとも１つは、ｍｉＲＮＡ模倣物である。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、スーパーｍｉｒである。一部の実施形態では、多標的分子は、少なくとも２つのスーパーｍｉｒを含む。限定なしに、スーパーｍｉｒは、同じか又は異なり得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、ｓｉＲＮＡであり、エフェクター分子の少なくとも１つは、スーパーｍｉｒである。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、抗ｍｉｒである。一部の実施形態では、多標的分子は、少なくとも２つの抗ｍｉｒを含む。限定なしに、抗ｍｉｒは、同じか又は異なり得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、ｓｉＲＮＡであり、エフェクター分子の少なくとも１つは、抗ｍｉｒである。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、アンタゴｍｉｒである。一部の実施形態では、多標的分子は、少なくとも２つのアンタゴｍｉｒを含む。限定なしに、アンタゴｍｉｒは、同じか又は異なり得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、ｓｉＲＮＡであり、エフェクター分子の少なくとも１つは、アンタゴｍｉｒである。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、Ｕ１アダプターである。一部の実施形態では、多標的分子は、少なくとも２つのＵ１アダプターを含む。限定なしに、Ｕ１アダプターは、同じか又は異なり得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、ｓｉＲＮＡであり、エフェクター分子の少なくとも１つは、Ｕ１アダプターである。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、活性化ＲＮＡである。一部の実施形態では、多標的分子は、少なくとも２つの活性化ＲＮＡを含む。限定なしに、活性化ＲＮＡは、同じか又は異なり得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、ｓｉＲＮＡであり、エフェクター分子の少なくとも１つは、活性化ＲＮＡである。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、三重鎖形成性オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、多標的分子は、少なくとも２つの三重鎖形成性オリゴヌクレオチドを含む。限定なしに、三重鎖形成性オリゴヌクレオチドは、同じか又は異なり得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中のエフェクター分子の少なくとも１つは、ｓｉＲＮＡであり、エフェクター分子の少なくとも１つは、三重鎖形成性オリゴヌクレオチドである。
リガンドと共役された１つのエフェクター分子を含むコンジュゲート
別の態様では、本明細書に記載する切断可能なリンカーを介してリガンドと共役された１つのエフェクター分子を含むコンジュゲートが本明細書において提供される。限定なしに、エフェクター分子は、二本鎖及び一本鎖ＲＮＡ干渉剤（ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ並びに本明細書においてｄｓＲＮＡ剤と呼ばれるものなど）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡ又は抗ｍｉｒ、スーパーｍｉｒ、アンタゴｍｉｒ、リボザイム、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ活性化剤、Ｕ１アダプター及びＣＲＩＳＰＲ ＣａｓのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）からなる群から選択され得る。一部の実施形態では、エフェクター分子は、ｓｉＲＮＡである。
限定なしに、リガンドは、エフェクター分子の任意の位置において結合され得る。例えば、エフェクター分子がｓｉＲＮＡである場合、リガンドは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端又は内部位置において結合され得る。
リガンド
概して、リガンドは、限定しないが、薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞取り込み、電荷及びクリアランスを含む結合された分子（例えば、多標的分子、エフェクター分子又はエンドソーム作用剤）の１つ又は複数の特性を修飾する。リガンドは、化学分野で常用的に使用されており、親化合物に直接又は任意選択の連結部分若しくは結合基を介して連結される。リガンドの好ましいリストは、限定しないが、挿入剤、リポータ分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸塩、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン及び染料を含む。
本発明に適した好ましいリガンドとしては、以下のものが挙げられる：コレステロール部分などの脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３）；コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４，１０５３）；チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５）；チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３）；脂肪族鎖、例えばドデカジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９）；リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ラク−グリセロール又はトリエチルアンモニウム−１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ラク−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸塩（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７）；ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９）；アダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１）；パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９）；又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３）。
リガンドは、天然に存在する分子又は組換え若しくは合成分子を含み得る。例示的なリガンドとして、限定しないが、以下のものが挙げられる：ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコライド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、例えばＰＥＧ−２Ｋ、ＰＥＧ−５Ｋ、ＰＥＧ−１０Ｋ、ＰＥＧ−１２Ｋ、ＰＥＧ−１５Ｋ、ＰＥＧ−２０Ｋ、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、ポリホスファジン、ポリエチレンイミン、カチオン基、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第４級塩、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、アプタマー、アシアロフェチュイン、ヒアルロナン、プロコラーゲン、免疫グロブリン（例えば、抗体）、インスリン、トランスフェリン、アルブミン、糖−アルブミンコンジュゲート、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（例えば、ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子（例えば、ステロイド、胆汁酸、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル若しくはフェノキサジン）、ペプチド（例えば、α螺旋ペプチド、両親媒性ペプチド、ＲＧＤペプチド、細胞透過ペプチド、エンドソーム溶解性／融合性ペプチド）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、ナプロキセン、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、ＡＰ、抗体、ホルモン及びホルモン受容体、レクチン、炭水化物、多価炭水化物、ビタミン（例えば、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン及びピリドキサール）、ビタミン補因子、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化剤、ＮＦ−κＢの活性化剤、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、ミオセルビン、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β、γインターフェロン、天然若しくは組換え低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、天然若しくは組換え高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）並びに細胞透過剤（例えば、螺旋状細胞透過剤）。
ペプチド及びペプチド模倣リガンドとしては、天然又は修飾ペプチド、例えばＤ又はＬペプチド；α、β若しくはγペプチド；Ｎ−メチルペプチド；アザペプチド；１つ又は複数のアミドを有するペプチド、すなわちペプチド、１つ又は複数の尿素、チオ尿素、カルバメート若しくはスルホニル尿素結合で置換された結合；又は環状ペプチドを有するものがある。ペプチド模倣物（本明細書では、オリゴペプチド模倣物とも呼ばれる）は、天然のペプチドに類似した明確な３次元構造にフォールディングすることができる分子である。ペプチド又はペプチド模倣リガンドは、約５〜５０アミノ酸長、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０アミノ酸長であり得る。
例示的な両親媒性ペプチドとして、限定しないが、セクロピン、リコトキシン（ｌｙｃｏｔｏｘｉｎ）、パラダキシン（ｐａｒａｄａｘｉｎ）、ブホリン、ＣＰＦ、ボンビニン様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシジン、セラトトキシン（ｃｅｒａｔｏｔｏｘｉｎ）、Ｓ．クラバ（Ｓ．ｃｌａｖａ）ペプチド、メクラウナギ（ｈａｇｆｉｓｈ）腸抗菌ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎｅ）、ブレビニン−２、デルマセプチン、メリチン、プレウロシジン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ペプチド、エスクレンチニス−１（ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎｉｓ−１）及びカエリンが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、用語「エンドソーム溶解性リガンド」は、エンドソーム溶解性を有する分子を指す。エンドソーム溶解性リガンドは、本発明の組成物若しくはその成分の溶解及び／又は本発明の組成物若しくはその成分の、エンドソーム、リソソーム、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、微小管、ペロキシソーム又は細胞内の他の小胞体などの細胞内コンパートメントから細胞の細胞質への輸送を促進する。いくつかの例示的なエンドソーム溶解性リガンドとして、限定しないが、イミダゾール、ポリ若しくはオリゴイミダゾール、直鎖若しくは分岐状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖及び分岐状ポリアミン、例えばスペルミン、カチオン性直鎖若しくは分岐状ポリアミン、ポリカルボキシレート、ポリカチオン、マスクオリゴ若しくはポリカチオン又はアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケタール、オルトエステル、マスク若しくは非マスクカチオン又はアニオン電荷を有する直鎖若しくは分岐状ポリマー、マスク若しくは非マスクカチオン又はアニオン電荷を有するデンドリマー、ポリアニオン性ペプチド、ポリアニオン性ペプチド模倣薬、ｐＨ感受性ペプチド、天然及び合成融合性脂質、天然及び合成カチオン性脂質が挙げられる。
例示的なエンドソーム溶解性／融合性ペプチドとして、限定しないが、以下のものが挙げられる：ＡＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡＡＡＡＧＧＣ（ＧＡＬＡ）（配列番号１）；ＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＡＡＡＧＧＣ（ＥＡＬＡ）（配列番号２）；ＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡ（配列番号３）；ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＷＤＹＧ（ＩＮＦ−７）（配列番号４）；ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧ（Ｉｎｆ ＨＡ−２）（配列番号５）；ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＣＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤ ＧＷＹＧＣ（ｄｉＩＮＦ−７）（配列番号６）；ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＧＣＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＧＣ（ｄｉＩＮＦ−３）（配列番号７）；ＧＬＦＧＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＨＬＡＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＡＧＧＳＣ（ＧＬＦ）（配列番号８）；ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＬＡＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＡＧＧＳＣ（ＧＡＬＡ−ＩＮＦ３）（配列番号９）；ＧＬＦ ＥＡＩ ＥＧＦＩ ＥＮＧＷ ＥＧｎＩ ＤＧ Ｋ ＧＬＦ ＥＡＩ ＥＧＦＩ ＥＮＧＷ ＥＧｎＩ ＤＧ（ＩＮＦ−５、ｎは、ノルロイシンである）（配列番号１０）；ＬＦＥＡＬＬＥＬＬＥＳＬＷＥＬＬＬＥＡ（ＪＴＳ−１）（配列番号１１）；ＧＬＦＫＡＬＬＫＬＬＫＳＬＷＫＬＬＬＫＡ（ｐｐＴＧ１）（配列番号１２）；ＧＬＦＲＡＬＬＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＬＲＡ（ｐｐＴＧ２０）（配列番号１３）；ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡＣＥＡ（ＫＡＬＡ）（配列番号１４）；ＧＬＦＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧＣ（ＨＡ）（配列番号１５）；ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（Ｍｅｌｉｔｔｉｎ）（配列番号１６）；Ｈ５ＷＹＧ（配列番号１７）；及びＣＨＫ６ＨＣ（配列番号１８）。
特定の理論に拘束されることは意図しないが、融合性脂質は、膜と融合し、その結果、膜を不安定化する。融合性脂質は、通常、小さい頭部基及び不飽和アシル鎖を有する。例示的な融合性脂質として、限定しないが、１，２−ジレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−オール（Ｄｉ−Ｌｉｎ）、Ｎ−メチル（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）メタンアミン（ＤＬｉｎ−ｋ−ＤＭＡ）及びＮ−メチル−２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）エタンアミン（本明細書では、ＸＴＣとも呼ばれる）が挙げられる。
本発明に適したエンドソーム溶解活性を有する合成ポリマーは、米国特許出願公開第２００９／００４８４１０号明細書；同第２００９／００２３８９０号明細書；同第２００８／０２８７６３０号明細書；同第２００８／０２８７６２８号明細書；同第２００８／０２８１０４４号明細書；同第２００８／０２８１０４１号明細書；同第２００８／０２６９４５０号明細書；同第２００７／０１０５８０４号明細書；同第２００７００３６８６５号明細書；及び同第２００４／０１９８６８７号明細書に記載されており、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
例示的な細胞透過性ペプチドとして、限定しないが、以下のものが挙げられる：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（ペネトラチン）（配列番号１９）；ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ（Ｔａｔ断片４８〜６０）（配列番号２０）；ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（シグナル配列ベースのペプチド）（配列番号２１）；ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（ＰＶＥＣ）（配列番号２２）；ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（トランスポルタン）（配列番号２３）；ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（両親媒性モデルペプチド）（配列番号２４）；ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（Ａｒｇ９）（配列番号２５）；ＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ（細菌細胞壁透過性ペプチド）（配列番号２６）；ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ（ＬＬ−３７）（配列番号２７）；ＳＷＬＳＫＴＡＫＫＬＥＮＳＡＫＫＲＩＳＥＧＩＡＩＡＩＱＧＧＰＲ（セクロピンＰ１）（配列番号２８）；ＡＣＹＣＲＩＰＡＣＩＡＧＥＲＲＹＧＴＣＩＹＱＧＲＬＷＡＦＣＣ（α−デフェンシン）（配列番号２９）；ＤＨＹＮＣＶＳＳＧＧＱＣＬＹＳＡＣＰＩＦＴＫＩＱＧＴＣＹＲＧＫＡＫＣＣＫ（β−デフェンシン）（配列番号３０）；ＲＲＲＰＲＰＰＹＬＰＲＰＲＰＰＰＦＦＰＰＲＬＰＰＲＩＰＰＧＦＰＰＲＦＰＰＲＦＰＧＫＲ−ＮＨ２（ＰＲ−３９）（配列番号３１）；ＩＬＰＷＫＷＰＷＷＰＷＲＲ−ＮＨ２（インドリシジン）（配列番号３２）；ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（ＲＦＧＦ）（配列番号３３）；ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（ＲＦＧＦ類似体）（配列番号３４）；及びＲＫＣＲＩＶＶＩＲＶＣＲ（バクテネシン）（配列番号３５）。
例示的なカチオン性基として、限定しないが、例えばＯ−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）；アミノアルコキシ、例えばＯ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ、（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）；アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ又はアミノ酸）；並びにＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ又はジヘテロアリールアミノ）から得られる、プロトン化アミノ基が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、用語「ターゲティングリガンド」は、選択される標的、例えば細胞、細胞型、組織、臓器、身体の領域又はコンパートメント、例えば細胞、組織若しくは臓器コンパートメントに対し、増大した親和性を付与する任意の分子を指す。いくつかの例示的なターゲティングリガンドとして、限定しないが、抗体、抗原、葉酸塩、受容体リガンド、炭水化物、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ及びＨＤＬリガンドが挙げられる。
炭水化物ベースのターゲティングリガンドとして、限定しないが、Ｄ−ガラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、多価ＧａｌＮＡｃ、例えばＧａｌＮＡｃ２及びＧａｌＮＡｃ３；Ｄ−マンノース、多価マンノース、多価ラクトース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸及びレクチンが挙げられる。多価という用語は、２つ以上の単糖単位が存在することを示す。このような単糖サブユニットは、グリコシド結合を介して互いに連結するか、又はスカフォールド分子に連結することができる。
リガンドとして、本発明に適したいくつかの葉酸塩及び葉酸塩類似体が米国特許第２，８１６，１１０号明細書；同第５，５５２，５４５号明細書；同第６，３３５，４３４号明細書及び同第７，１２８，８９３号明細書に記載されており、これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「ＰＫ調節リガンド」及び「ＰＫモジュレータ」は、本発明の組成物の薬剤動態を調節することができる分子を指す。いくつかの例示的なＰＫモジュレータとして、限定しないが、親油性分子、胆汁酸、ステロール、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ビタミン、脂肪酸、フェノキサジン、アスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン、スプロフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ＰＥＧ、ビオチン及びトランスサイレチア−結合リガンド（例えば、テトラヨードチロ酢酸、２，４，６−トリヨードフェノール及びフルフェナム酸）が挙げられる。いくつかのホスホロチオエート糖間結合を含むオリゴマー化合物は、血清タンパク質と結合することも知られており、従って、短いオリゴマー化合物、例えば約５〜３０ヌクレオチド（例えば、５〜２５ヌクレオチド、好ましくは５〜２０ヌクレオチド、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０ヌクレオチド）を含み、骨格に複数のホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドもリガンド（例えば、ＰＫ調節リガンド）として本発明に適している。ＰＫ調節オリゴヌクレオチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを上回るホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート結合を含み得る。一部の実施形態では、ＰＫ調節オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート結合である。さらに、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーもＰＫ調節リガンドとして本発明に適している。血清成分（例えば、血清タンパク質）との結合は、Ｏｒａｖｃｏｖａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ（１９９６），６７７：１−２７に記載されているものなどのアルブミン結合アッセイから予測することができる。
２つ以上のリガンドが存在する場合、リガンドは、全て同じ特性を有し得、全てが異なる特性を有するか、又は一部のリガンドが同じ特性を有し、残りは異なる特性を有し得る。例えば、リガンドは、ターゲティング特性を有するか、エンドソーム溶解活性を有するか、又はＰＫ調節特性を有することができる。好ましい実施形態では、リガンドは、全て異なる特性を有する。
リガンド又は係留されたリガンドは、モノマーが多標的分子のエフェクター分子又は構成要素に組み込まれている場合、前記モノマー上に存在し得る。一部の実施形態では、リガンドは、「前駆体」モノマーを多標的分子のエフェクター分子又は構成要素に組み込んだ後、カップリングによって前記「前駆体」モノマーに組み込むことができる。例えば、例としてアミノ末端テザーを有する（すなわちリガンドが結合していない）モノマー、例えばモノマー−リンカー−ＮＨ２は、多標的分子のエフェクター分子又は構成要素に組み込むことができる。次の操作で、すなわち多標的分子のエフェクター分子又は構成要素への前駆体モノマーの組み込み後、求電子基、例えばペンタフルオロフェニルエステル又はアルデヒド基を有するリガンドをリガンドの求電子基と前駆体モノマーのテザーの末端求核基とのカップリングにより前駆体モノマーに結合することができる。
別の例では、クリックケミストリー反応に参加するのに好適な化学基を有するモノマー、例えばアジド又はアルキン末端テザー／リンカーを組み込むことができる。次の操作で、すなわち鎖への前駆体モノマーの組み込み後、相補的化学基を有するリガンド、例えばアルキン又はアジドを、アルキン及びアジドとのカップリングにより前駆体モノマーに結合することができる。
一部の実施形態では、リガンドは、エフェクター分子又は多標的分子の核酸塩基、糖部分又はヌクレオシド間結合に共役させることができる。プリン核酸塩基又はその誘導体への共役は、環内及び環外原子を含む任意の位置で実施され得る。一部の実施形態では、プリン核酸塩基の２−、６−、７−又は８位をリガンドに結合する。ピリミジン核酸塩基又はその誘導体への共役も任意の位置で実施され得る。一部の実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２−、５−及び６位をリガンドで置換することができる。リガンドを核酸塩基に共役させる場合、好ましい位置は、ハイブリダイゼーションを妨害しない、すなわち塩基対合に必要な水素結合相互作用を妨害しない位置である。
ヌクレオシドの糖部分への共役は、任意の炭素原子で実施され得る。コンジュゲート部分に結合することができる糖部分の例示的な炭素原子として、２’、３’及び５’炭素原子がある。また、１’位もコンジュゲート部分、例えば脱塩基残基に結合することができる。ヌクレオシド間結合は、コンジュゲート部分を担持することもできる。リン含有結合（例えば、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートなど）の場合、コンジュゲート部分をリン原子に直接又はリン原子に結合したＯ、Ｎ若しくはＳ原子に結合することができる。アミン−又はアミド含有ヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）の場合、コンジュゲート部分を、アミン若しくはアミドの窒素原子又は隣接する炭素原子に結合することができる。
オリゴヌクレオチドのコンジュゲートを調製する多くの方法がある。一般に、オリゴヌクレオチドの反応性基（例えば、ＯＨ、ＳＨ、アミン、カルボキシル、アルデヒドなど）をコンジュゲート部分の反応性基と接触させることにより、オリゴヌクレオチドをコンジュゲート部分に結合する。一部の実施形態では、一方の反応性基は求電子性であり、他方は求核性である。
例えば、求電子基は、カルボニル含有官能基であり得、求核基は、アミン又はチオールであり得。結合基を用いる又は用いない核酸及び関連オリゴマー化合物の共役方法は、例えば、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ ＬｅＢｌｅｕ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９９３，Ｃｈａｐｔｅｒ １７（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）などの文献に十分に記載されている。
リガンドは、担体モノマー、例えばリガンド担体を介してエフェクター分子、多標的分子又はエンドソーム作用剤に結合することができる。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格結合点」、好ましくは２つの「骨格結合点」と、（ｉｉ）少なくとも１つの「係留結合点」とを含む。本明細書で使用する「骨格結合点」は、官能基、例えばヒドロキシル基又は一般に骨格、例えばオリゴヌクレオチドのリン酸若しくは修飾リン酸（例えば、硫黄含有）骨格への担体モノマーの組み込みに利用可能であり且つ好適な結合を指す。「係留結合点」（ＴＡＰ）は、担体モノマーの原子、例えば炭素原子又はヘテロ原子（骨格結合点を付与する原子と異なる）を指し、これは、選択された部分を連結する。選択された部分は、例えば、炭水化物、例えば単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖及び多糖であり得る。任意選択で、選択された部分は、介在テザーにより担体モノマーに連結される。従って、担体は、官能基、例えばアミノ基を含むことが多く、又は一般に別の化学実体、例えば構成原子へのリガンドの組み込み又は係留に好適な結合を提供する。
核酸のコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許として、限定しないが、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書、同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同第５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，１４９，７８２号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書；同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書、同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書、同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書；同第５，６７２，６６２号明細書；同第５，６８８，９４１号明細書；同第５，７１４，１６６号明細書；同第６，１５３，７３７号明細書；同第６，１７２，２０８号明細書；同第６，３００，３１９号明細書；同第６，３３５，４３４号明細書；同第６，３３５，４３７号明細書；同第６，３９５，４３７号明細書；同第６，４４４，８０６号明細書；同第６，４８６，３０８号明細書；同第６，５２５，０３１号明細書；同第６，５２８，６３１号明細書；同第６，５５９，２７９号明細書が挙げられ、これらの内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、
Figure 2020505032
 に示す構造を有するリガンドを含み、式中、
ＬＧは、それぞれの存在について独立に、リガンド、例えば炭水化物、例えば単糖、二糖、三糖、四糖、多糖であり；
Ｚ’、Ｚ’’、Ｚ’’’及びＺ’’’’は、それぞれの存在についてそれぞれ独立に、Ｏ又はＳである。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）：
Figure 2020505032
 のリガンドを含み、式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ及びｑ５Ｃは、それぞれの存在について独立に、０〜２０を表し、反復単位は、同じか又は異なり得；
Ｑ及びＱ’は、それぞれの存在について独立に、非存在、−（Ｐ７−Ｑ７−Ｒ７）ｐ−Ｔ７−又は−Ｔ７−Ｑ７−Ｔ７’−Ｂ−Ｔ８’−Ｑ８−Ｔ８であり；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｐ７、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃ、Ｔ７、Ｔ７’、Ｔ８及びＴ８’は、それぞれの存在についてそれぞれ独立に、非存在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏであり；
Ｂは、−ＣＨ２−Ｎ（ＢＬ）−ＣＨ２−であり；
ＢＬは、−ＴＢ−ＱＢ−ＴＢ’−Ｒｘであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃ、Ｑ７、Ｑ８及びＱＢは、それぞれの存在について独立に、非存在、アルキレン、置換アルキレンであり、１つ又は複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’）、Ｃ≡Ｃ又はＣ（Ｏ）の１つ又は複数によって分断若しくは終結することができ；
ＴＢ及びＴＢ’は、それぞれの存在についてそれぞれ独立に、非存在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏであり；
Ｒｘは、親油性物質（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸，Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル又はフェノキサジン）、ビタミン（例えば、葉酸塩、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビオチン、ピリドキサール）、ペプチド、炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖）、エンドソーム溶解性成分、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えばサルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）又はカチオン性脂質であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃ、Ｒ７は、それぞれの存在についてそれぞれ独立に、非存在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
Figure 2020505032
 又はヘテロシクリルであり；
Ｌ１、Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは、それぞれの存在についてそれぞれ独立に、炭水化物、例えば単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖及び多糖であり；
Ｒ’及びＲ’’は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ又はＮ（ＲＮ）２であり；
ＲＮは、それぞれの存在について独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル又はベンジルであり；
Ｒａは、Ｈ又はアミノ酸側鎖であり；
Ｚ’、Ｚ’’、Ｚ’’’及びＺ’’’’は、それぞれの存在についてそれぞれ独立に、Ｏ又はＳであり；
ｐは、それぞれの存在について独立に、０〜２０を表す。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載する切断可能なリンカーを介してリガンドに結合されるエフェクター分子中のリガンドは、上述されるリガンドである。
一部の実施形態では、本明細書に記載する切断可能なリンカーを介してリガンドに結合されるエンドソーム作用剤中のリガンドは、上述されるリガンドである。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
一部の実施形態では、Ｌ２Ａ及びＬ２Ｂは、いずれも異なる。
一部の好ましい実施形態では、Ｌ３Ａ及びＬ３Ｂは、いずれも同じである。
一部の実施形態では、Ｌ３Ａ及びＬ３Ｂは、いずれも異なる。
一部の好ましい実施形態では、Ｌ４Ａ及びＬ４Ｂは、いずれも同じである。
一部の実施形態では、Ｌ４Ａ及びＬ４Ｂは、いずれも異なる。
一部の好ましい実施形態では、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは、全て同じである。
一部の実施形態では、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃの２つが同じである。
一部の実施形態では、Ｌ５Ａ及びＬ５Ｂは、同じである。
一部の実施形態では、Ｌ５Ａ及びＬ５Ｃは、同じである。
一部の実施形態では、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは、同じである。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含み、ここで、Ｙは、Ｏ又はＳであり、ｎは、１〜６である。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含み、ここで、Ｙ＝Ｏ又はＳである。ｎは、１〜６であり、Ｒは、水素又は核酸であり、Ｒ’は核酸である。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含み、ここで、Ｙは、Ｏ又はＳであり、ｎは、１〜６である。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 の少なくとも１、２、３又は４つのモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含み、ここで、Ｘは、Ｏ又はＳである。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含み、ここで、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＯＨである。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含み、ここで、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＯＨである。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含み、ここで、Ｒは、Ｏ又はＳである。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含み、ここで、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＯＨである。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含み、ここで、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＯＨである。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含み、ここで、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＯＨである。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含み、ここで、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＯＨである。
いくつかの実施形態では、多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含み、ここで、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＯＨである。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
前述したモノマーにおいて、Ｘ及びＹは、それぞれの存在についてそれぞれ独立に、Ｈ、保護基、リン酸基、リン酸ジエステル基、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ−オリゴヌクレオチド、脂質、ＰＥＧ、ステロイド、ポリマー、ヌクレオチド、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドであり；Ｚ’及びＺ’’は、それぞれの存在についてそれぞれ独立に、Ｏ又はＳである。
一部の実施形態では、本明細書に開示するリンカーを介してリガンドに結合されるエフェクター分子は、モノマー１〜３０からなる群から選択されるモノマーを含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示するリンカーを介してリガンドに結合されるエンドソーム作用剤は、モノマー１〜３０からなる群から選択されるモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子、多標的分子又はエンドソーム作用剤は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドと共役される。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子、多標的分子又はエンドソーム作用剤は、構造：
Figure 2020505032
 のリガンドと共役される。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、構造：
Figure 2020505032
 のモノマーを含む。
前述したリガンド及びモノマーの合成は、例えば、米国特許第８，１０６，０２２号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
標的遺伝子
限定なしに、エフェクター分子の標的遺伝子として、限定しないが、不要な細胞増殖を促進する遺伝子、増殖因子遺伝子、増殖因子受容体遺伝子、遺伝子発現キナーゼ、アダプタータンパク質遺伝子、Ｇタンパク質スーパーファミリー分子をコードする遺伝子、転写因子をコードする遺伝子、血管新生を媒介する遺伝子、ウイルス遺伝子、ウイルス複製に必要な遺伝子、ウイルス機能を媒介する細胞遺伝子、細菌性病原体の遺伝子、アメーバ性病原体の遺伝子、寄生体病原体の遺伝子、真菌性病原体の遺伝子、不要な免疫応答を媒介する遺伝子、痛みのプロセシングを媒介する遺伝子、神経疾患を媒介する遺伝子、ヘテロ接合性の喪失を特徴とする細胞に見出される対立遺伝子又は多型遺伝子の１つの対立遺伝子が挙げられる。
エフェクター分子の特定の例示的な標的遺伝子として、限定しないが、以下のものが挙げられる：ＰＣＳＫ−９、ＡｐｏＣ３、ＡＴ３、ＡＧＴ、ＡＬＡＳ１、ＴＭＰＲ、ＨＡＯ１、ＡＧＴ、Ｃ５、ＣＣＲ−５、ＰＤＧＦベータ遺伝子；Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子；ＣＲＫ遺伝子；ＧＲＢ２遺伝子；ＲＡＳ遺伝子；ＭＥＫＫ遺伝子；ＪＮＫ遺伝子；ＲＡＦ遺伝子；Ｅｒｋ１／２遺伝子；ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子；ＭＹＢ遺伝子；ｃ−ＭＹＣ遺伝子；ＪＵＮ遺伝子；ＦＯＳ遺伝子；ＢＣＬ−２遺伝子；サイクリンＤ遺伝子；ＶＥＧＦ遺伝子；ＥＧＦＲ遺伝子；サイクリンＡ遺伝子；サイクリンＥ遺伝子；ＷＮＴ−１遺伝子；β−カテニン遺伝子；ｃ−ＭＥＴ遺伝子；ＰＫＣ遺伝子；ＮＦＫＢ遺伝子；ＳＴＡＴ３遺伝子；サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）遺伝子；Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子；トポイソメラーゼＩ遺伝子；トポイソメラーゼＩＩ α遺伝子；ｐ７３遺伝子；ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子；ＰＰＭ１Ｄ遺伝子；カベオリンＩ遺伝子；ＭＩＢ Ｉ遺伝子；ＭＴＡＩ遺伝子；Ｍ６８遺伝子；腫瘍抑制遺伝子；ｐ５３遺伝子；ＤＮ−ｐ６３遺伝子；ｐＲｂ腫瘍抑制遺伝子；ＡＰＣ１腫瘍抑制遺伝子；ＢＲＣＡ１腫瘍抑制遺伝子；ＰＴＥＮ腫瘍抑制遺伝子；ＭＬＬ融合遺伝子、例えばＭＬＬ−ＡＦ９、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子；ＴＥＬ／ＡＭＬ１融合遺伝子；ＥＷＳ／ＦＬＩ１融合遺伝子；ＴＬＳ／ＦＵＳ１融合遺伝子；ＰＡＸ３／ＦＫＨＲ融合遺伝子；ＡＭＬ１／ＥＴＯ融合遺伝子；α ｖ−インテグリン遺伝子；Ｆｌｔ−１受容体遺伝子；チューブリン遺伝子；ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、Ａ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、Ａ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、Ｄ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｄ Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、Ｄ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｄ Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、Ｅ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、Ｅ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、Ｆ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｆ Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、Ｆ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｆ Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、Ｇ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｇ Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、Ｇ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｇ Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、Ｈ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｈ Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、Ｈ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｈ Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、ヘルペスサイトメガロウイルス（ｈｅｒｐｅｓ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）遺伝子、ヘルペスサイトメガロウイルス（ｈｅｒｐｅｓ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、ヘルペスエプスタインバーウイルス（ｈｅｒｐｅｓ Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、ヘルペスエプスタインバーウイルス（ｈｅｒｐｅｓ Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ Ｓａｒｃｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ Ｓａｒｃｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、ＪＣウイルス（ＪＣ Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、ＪＣウイルス（ＪＣ Ｖｉｒｕｓ）複製に必要なヒト遺伝子、ミクソウイルス遺伝子、ミクソウイルス遺伝子複製に必要な遺伝子、ライノウイルス遺伝子、ライノウイルス複製に必要な遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コロナウイルス複製に必要な遺伝子、西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、セントルイス脳炎（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）遺伝子、セントルイス脳炎（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）複製に必要な遺伝子、ダニ媒介性脳炎ウイルス（Ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）遺伝子、ダニ媒介性脳炎ウイルス（Ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、マリーバレー脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）遺伝子、マリーバレー脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、デング熱ウイルス遺伝子、デング熱ウイルス遺伝子複製に必要な遺伝子、シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ）４０遺伝子、シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ）４０複製に必要な遺伝子、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、モロニー−マウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ−Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）遺伝子、モロニー−マウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ−Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、脳心筋炎ウイルス遺伝子、脳心筋炎ウイルス複製に必要な遺伝子、はしかウイルス遺伝子、はしかウイルス複製に必要な遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖｅｒｉｃｅｌｌａ ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ）遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖｅｒｉｃｅｌｌａ ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ）複製に必要な遺伝子、アデノウイルス遺伝子、アデノウイルス複製に必要な遺伝子、黄熱病ウイルス遺伝子、黄熱病ウイルス複製に必要な遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ポリオウイルス複製に必要な遺伝子、ポックスウイルス遺伝子、ポックスウイルス複製に必要な遺伝子、プラスモジウム（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）遺伝子、プラスモジウム（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）遺伝子複製に必要な遺伝子、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）遺伝子、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）複製に必要な遺伝子、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）遺伝子、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複製に必要な遺伝子、癩菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）遺伝子、癩菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）複製に必要な遺伝子、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）遺伝子、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）複製に必要な遺伝子、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）遺伝子、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）複製に必要な遺伝子、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）遺伝子、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）複製に必要な遺伝子、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）遺伝子、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）複製に必要な遺伝子、マイコプラズマ肺炎菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）遺伝子、マイコプラズマ肺炎菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）複製に必要な遺伝子、インテグリン遺伝子、セレクチン遺伝子、補体系遺伝子、ケモカイン遺伝子、ケモカイン受容体遺伝子、ＧＣＳＦ遺伝子、Ｇｒｏ１遺伝子、Ｇｒｏ２遺伝子、Ｇｒｏ３遺伝子、ＰＦ４遺伝子、ＭＩＧ遺伝子、前血小板塩基性タンパク質遺伝子、ＭＩＰ−１Ｉ遺伝子、ＭＩＰ−１Ｊ遺伝子、ＲＡＮＴＥＳ遺伝子、ＭＣＰ−１遺伝子、ＭＣＰ−２遺伝子、ＭＣＰ−３遺伝子、ＣＭＢＫＲ１遺伝子、ＣＭＢＫＲ２遺伝子、ＣＭＢＫＲ３遺伝子、ＣＭＢＫＲ５ｖ、ＡＩＦ−１遺伝子、Ｉ−３０９遺伝子、イオンチャネルの構成要素の遺伝子、神経伝達物質受容体の遺伝子、神経伝達物質リガンドの遺伝子、アミロイドファミリー遺伝子、プレセニリン遺伝子、ＨＤ遺伝子、ＤＲＰＬＡ遺伝子、ＳＣＡ１遺伝子、ＳＣＡ２遺伝子、ＭＪＤ１遺伝子、ＣＡＣＮＬ１Ａ４遺伝子、ＳＣＡ７遺伝子、ＳＣＡ８遺伝子、ヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）細胞に見出される対立遺伝子、多型遺伝子の１つの対立遺伝子並びにこれらの組合せ。
ヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）は、ＬＯＨの領域に配列、例えば遺伝子のヘミ接合を引き起こし得る。これにより、正常細胞と疾患状態の細胞、例えば癌細胞との間に有意な遺伝的差異が生じ得るが、これは、正常細胞と疾患状態の細胞、例えば癌細胞との間の有用な差異を提供する。この差異は、遺伝子又は他の配列が二倍体細胞においてヘテロ接合性であるが、ＬＯＨを有する細胞ではヘミ接合性であるために起こり得る。ＬＯＨの領域は、多くの場合、喪失によって不要な増殖を促進する遺伝子、例えば腫瘍抑制遺伝子並びに例えば他の遺伝子、一部の事例では正常な機能、例えば成長に不可欠な遺伝子を含む他の配列を含む。本発明の方法は、部分的に、本発明の組成物による必須遺伝子の１つの対立遺伝子の特異的な調節を利用するものである。
核酸修飾
エフェクター分子又は多標的分子は、本明細書に記載する少なくとも１つの核酸修飾を含み得る。例えば、修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基、修飾糖及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの修飾である。限定なしに、このような修飾は、エフェクター分子又は多標的分子中のいずれかの箇所に存在し得る。例えば、修飾は、エフェクター分子又は多標的分子の２つのエフェクター分子を連結するリンカーの１つに存在し得る。
ヌクレオシドの天然に存在する塩基部分は、典型的に、複素環式塩基である。このような複素環式塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリン及びピリミジンである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基を糖の２’、３’又は５’ヒドロキシル部分に連結することができる。オリゴヌクレオチドを形成する際、これらのリン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合させて、直鎖ポリマー化合物を形成する。オリゴヌクレオチド内において、リン酸基は、一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するものを指す。ＲＮＡ及びＤＮＡの天然に存在する結合又は骨格は、３’−５’リン酸ジエステル結合である。
プリン核酸塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）並びにピリミジン核酸塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）などの「非修飾」又は「天然」核酸塩基に加えて、当業者に周知の多くの修飾核酸塩基又は核酸塩基模倣物が本明細書に記載する化合物で使用可能である。非修飾又は天然核酸塩基は、改善された特性を有するオリゴヌクレオチドを提供するために修飾又は置換することができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、これらの塩基又は合成及び天然核酸塩基（例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシン若しくはツベルシジン）並びに本明細書に記載のオリゴマー修飾のいずれか１つを用いて調製することができる。或いは、上記塩基及び「ユニバーサル塩基」のいずれかの置換若しくは修飾類似体を使用することができる。天然塩基を非天然及び／又はユニバーサル塩基により置換する場合、本明細書において、このヌクレオチドは、修飾核酸塩基及び／又は核酸塩基修飾を含むと言われる。修飾核酸塩基及び／又は核酸塩基修飾は、共役部分、例えば本明細書に記載のリガンドを含む天然、非天然及びユニバーサル塩基も含む。核酸塩基との共役のための好ましいコンジュゲート部分は、カチオン性アミノ基を含み、これらは、適切なアルキル、アルケニル又はアミド結合を有するリンカーを介して核酸塩基と共役され得る。
本明細書で使用されるとき、「非修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）並びにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。例示的な修飾核酸塩基として、限定しないが、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシン、ツベルシジン、２−（ハロ）アデニン、２−（アルキル）アデニン、２−（プロピル）アデニン、２−（アミノ）アデニン、２−（アミノアルキル）アデニン、２−（アミノプロピル）アデニン、２−（メチルチオ）−Ｎ６−（イソペンテニル）アデニン、６−（アルキル）アデニン、６−（メチル）アデニン、７−（デアザ）アデニン、８−（アルケニル）アデニン、８−（アルキル）アデニン、８−（アルキニル）アデニン、８−（アミノ）アデニン、８−（ハロ）アデニン、８−（ヒドロキシル）アデニン、８−（チオアルキル）アデニン、８−（チオール）アデニン、Ｎ６−（イソペンチル）アデニン、Ｎ６−（メチル）アデニン、Ｎ６、Ｎ６−（ジメチル）アデニン、２−（アルキル）グアニン、２−（プロピル）グアニン、６−（アルキル）グアニン、６−（メチル）グアニン、７−（アルキル）グアニン、７−（メチル）グアニン、７−（デアザ）グアニン、８−（アルキル）グアニン、８−（アルケニル）グアニン、８−（アルキニル）グアニン、８−（アミノ）グアニン、８−（ハロ）グアニン、８−（ヒドロキシル）グアニン、８−（チオアルキル）グアニン、８−（チオール）グアニン、Ｎ−（メチル）グアニン、２−（チオ）シトシン、３−（デアザ）−５−（アザ）シトシン、３−（アルキル）シトシン、３−（メチル）シトシン、５−（アルキル）シトシン、５−（アルキニル）シトシン、５−（ハロ）シトシン、５−（メチル）シトシン、５−（プロピニル）シトシン、５−（プロピニル）シトシン、５−（トリフルオロメチル）シトシン、６−（アゾ）シトシン、Ｎ４−（アセチル）シトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、２−（チオ）ウラシル、５−（メチル）−２−（チオ）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）−２−（チオ）ウラシル、４−（チオ）ウラシル、５−（メチル）−４−（チオ）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）−４−（チオ）ウラシル、５−（メチル）−２，４−（ジチオ）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）−２，４−（ジチオ）ウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−（アルキル）ウラシル、５−（アルキニル）ウラシル、５−（アリルアミノ）ウラシル、５−（アミノアリル）ウラシル、５−（アミノアルキル）ウラシル、５−（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５−（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル、５−（シアノアルキル）ウラシル、５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５−（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５−（ハロ）ウラシル、５−（メトキシ）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル、５−（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル、５−（プロピニル）ウラシル、５−（プロピニル）ウラシル、５−（トリフルオロメチル）ウラシル、６−（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ３−（メチル）ウラシル、５−ウラシル（すなわちプソイドウラシル）、２−（チオ）プソイドウラシル、４−（チオ）プソイドウラシル、２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）プソイドウラシル、５−（メチル）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−４−（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−４−（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１−置換プソイドウラシル、１−置換２（チオ）−プソイドウラシル、１−置換４−（チオ）プソイドウラシル、１−置換２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１−（アミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１−（アミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１−（アミノカルボニルエチレニル）−４−（チオ）プソイドウラシル、１−（アミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１−（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１−（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１−（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−４−（チオ）プソイドウラシル、１−（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキル−ヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、イノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンズイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、３−（メチル）イソカルボスチリリル、５−（メチル）イソカルボスチリリル、３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、７−（アザ）インドリル、６−（メチル）−７−（アザ）インドリル、イミジゾピリジニル、９−（メチル）−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル−７−（アザ）インドリル、２，４，５−（トリメチル）フェニル、４−（メチル）インドリル、４，６−（ジメチル）インドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、４−（フルオロ）−６−（メチル）ベンズイミダゾール、４−（メチル）ベンズイミダゾール、６−（アゾ）チミン、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、６−（アザ）ピリミジン、２−（アミノ）プリン、２，６−（ジアミノ）プリン、５−置換ピリミジン、Ｎ２−置換プリン、Ｎ６−置換プリン、Ｏ６−置換プリン、置換１，２，４−トリアゾール、ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルト−−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−７−アミノ−ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−ピリドピリミジン−３−イルなどの他の合成若しくは天然核酸塩基又はこれらの任意のＯ−アルキル化若しくはＮ−アルキル化誘導体が挙げられる。或いは、上記の塩基及び「ユニバーサル塩基」のいずれかの置換又は修飾類似体を使用することができる。
本明細書で使用されるとき、ユニバーサル核酸塩基は、融解挙動、細胞内酵素による認識又はオリゴヌクレオチド二重螺旋の活性に実質的に影響することなく、４つの天然に存在する核酸塩基の全てと塩基対合することができる任意の核酸塩基である。一部の例示的なユニバーサル核酸塩基として、限定しないが、２，４−ジフルオロトルエン、ニトロピロリル、ニトロインドリル、８−アザ−７−デアザアデニン、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル及びこれらの構造的誘導体（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７−２４４７を参照されたい）が挙げられる。
さらなる核酸塩基として、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されているもの；２００９年３月２６日に出願された国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第０９／０３８４２５号明細書に開示されているもの；Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの；Ｅｎｇｌｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３により開示されているもの；Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｉｎ，Ｐ．Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８に開示されているもの；並びにＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３により開示されているものが挙げられる。これらに文献全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、例えば、７−デアザプリン、５−メチルシトシン又はＧ−クランプなどの親核酸塩基と構造がかなり類似する核酸塩基である。いくつかの実施形態では、核酸塩基模擬物は、例えば、三環式フェノキサジン核酸塩基模擬物などのようにより複雑な構造を含む。前述した修飾核酸塩基の調製方法は、当業者に周知である。
エフェクター分子又は多標的分子は、修飾糖部分を有する、ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを上回る）のモノマーを含み得る。例えば、ヌクレオシドのフラノシル糖環は、いくつかの方法で修飾することができ、こうした方法として、限定しないが、置換基の付加、２つの非ジェミナル環原子の架橋によるロックド核酸又は二環式核酸の形成などがある。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、ＬＮＡである１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを上回る）のモノマーを含む。
ロックド核酸の一部の実施形態では、フラノシルの２’位は、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−Ｏ−、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−Ｎ（Ｒ１）−Ｏ−、−［Ｃ（Ｒ１Ｒ２）］ｎ−Ｏ−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ２）−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｃ（＝ＮＲ１）−、−Ｃ（＝ＮＲ１）−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒ１）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−及び−Ｎ（Ｒ１）−から独立に選択されるリンカーによって４’位に連結され、式中、
ｘは、０、１又は２であり；
ｎは、１、２、３又は４であり；
各Ｒ１及びＲ２は、独立に、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０アリール、複素環式ラジカル、置換複素環式ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５〜Ｃ７脂環式ラジカル、置換Ｃ５〜Ｃ７脂環式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｊ１）又はスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）であり；
各Ｊ１及びＪ２は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環式ラジカル、置換複素環式ラジカル、Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル又は保護基である。
一部の実施形態では、ＬＮＡ化合物のリンカーの各々は、独立に、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ１Ｒ２）−Ｎ（Ｒ１）−Ｏ−又は−Ｃ（Ｒ１Ｒ２）−Ｏ−Ｎ（Ｒ１）−である。別の実施形態では、前記リンカーの各々は、独立に、４’−ＣＨ２−２’、４’−（ＣＨ２）２−２’、４’−（ＣＨ２）３−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ１）−２’及び４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ１）−Ｏ−２’−であり、ここで、各Ｒ１は、独立に、Ｈ、保護基又はＣ１〜Ｃ１２アルキルである。
いくつかのＬＮＡは、特許文献並びに科学文献で調製及び開示されている（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６；Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２；国際公開第９４／１４２２６号パンフレット；国際公開第２００５／０２１５７０号パンフレット；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９；ＬＮＡを開示する発行米国特許及び公開出願の例として、例えば米国特許第７，０５３，２０７号明細書；同第６，２６８，４９０号明細書；同第６，７７０，７４８号明細書；同第６，７９４，４９９号明細書；同第７，０３４，１３３号明細書；及び同第６，５２５，１９１号明細書；並びに米国特許出願公開第２００４−０１７１５７０号明細書；同第２００４−０２１９５６５号明細書；同第２００４−００１４９５９号明細書；同第２００３−０２０７８４１号明細書；同第２００４−０１４３１１４号明細書；及び同第２００３００８２８０７号明細書が挙げられる。
リボシル糖環の２’−ヒドロキシル基が糖環の４’炭素原子に連結され、これによりメチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）結合を形成して、二環式糖部分を形成するＬＮＡも本明細書において提供される（Ｅｌａｙａｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ，２００１，２，５５８−５６１；Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００１，８１−７；及びＯｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００１，３，２３９−２４３に論述される；米国特許第６，２６８，４９０号明細書及び同第６，６７０，４６１号明細書も参照されたい）。連結は、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（−ＣＨ２−）基であり得、その場合、この二環式部分には用語メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡが用いられ；この位置にエチレン基がある場合、用語エチレンオキシ（４’−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡが用いられる（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６：Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，１１，２２１１−２２２６）。メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ及び他の二環式糖類似体は、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡとの非常に高い二重螺旋熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０℃）、３’−エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性及び良好な溶解性を示す。ＢＮＡを含む強力且つ非毒性アンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８）。
同じく取り上げられているメチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡの異性体は、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡであり、これは、３’−エキソヌクレアーゼに対する優れた安定性を有することが示されている。α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡは、アンチセンスギャップマー及びキメラに組み込まれ、これらは、強力なアンチセンス活性を示した（Ｆｒｉｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２１，６３６５−６３７２）。
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡモノマーアデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン及びウラシルの合成及び調製は、それらのオリゴマー化及び核酸認識特性と共に記載されている（Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０）。ＢＮＡ及びその調製も国際公開第９８／３９３５２号パンフレット及び国際公開第９９／１４２２６号パンフレットに記載されている。
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡの類似体、ホスホロチオエート−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ及び２’−チオ−ＬＮＡも調製されている（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２）。核酸ポリメラーゼの基質としてオリゴデオキリボヌクレオチド二重螺旋を含むロックドヌクレオシド類似体の調製も記載されている（Ｗｅｎｇｅｌらの国際公開第９９／１４２２６号パンフレット）。さらにまた、新規の配座固定された高親和性オリゴヌクレオチド類似体である２’−アミノ−ＬＮＡの合成も当技術分野で記載されている（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９）。さらには、２’−アミノ−及び２’−メチルアミノ−ＬＮＡが調製され、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ鎖とのそれらの二重螺旋の熱安定性が既に報告されている。
修飾糖部分は、よく知られており、その標的に対するアンチセンス化合物の親和性を改変する、典型的には増大させ、且つ／又はヌクレアーゼ耐性を増大させるために使用することができる。好ましい修飾糖の代表的なリストには、限定しないが、メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ及びエチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’架橋）ＥＮＡを含む二環式修飾糖；置換された糖、特に２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３又は２’−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３置換基を有する２’−置換糖；及び４’−チオ修飾糖が含まれる。また、糖は、とりわけ糖模擬基で置換することもできる。修飾糖の調製方法は、当業者に周知である。こうした修飾糖の調製を教示するいくつかの代表的な特許及び刊行物として、限定しないが、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；同第５，１１８，８００号明細書；同第５，３１９，０８０号明細書；同第５，３５９，０４４号明細書；同第５，３９３，８７８号明細書；同第５，４４６，１３７号明細書；同第５，４６６，７８６号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５１９，１３４号明細書；同第５，５６７，８１１号明細書；同第５，５７６，４２７号明細書；同第５，５９１，７２２号明細書；同第５，５９７，９０９号明細書；同第５，６１０，３００号明細書；同第５，６２７，０５３号明細書；同第５，６３９，８７３号明細書；同第５，６４６，２６５号明細書；同第５，６５８，８７３号明細書；同第５，６７０，６３３号明細書；同第５，７９２，７４７号明細書；同第５，７００，９２０号明細書；同第６，５３１，５８４号明細書；及び同第６，６００，０３２号明細書；並びに国際公開第２００５／１２１３７１号パンフレットが挙げられる。
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例として、アルコキシ又はアリールオキシ（ＯＲ、例えばＲ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール若しくは糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ、ｎ＝１〜５０；ヌクレオシドのフラノース部分が、フラノース環上の２つの炭素原子を連結する架橋を含み、それにより二環式環系を形成する「ロックド」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−アミン又はＯ−（ＣＨ２）ｎアミン（ｎ＝１〜１０、アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン又はポリアミノ）；及びＯ−ＣＨ２ＣＨ２（ＮＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２が挙げられる。
「デオキシ」修飾として、水素（すなわち突出一本鎖と特に関連するデオキシリボース糖）；ハロ（例えば、フルオロ）；アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ又はアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミン（アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ又はジヘテロアリールアミノ）；−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖）；シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；チオアルキル；アルキル；シクロアルキル；アリール；アルケニル及びアルキニルが挙げられ、これらは、任意選択で、例えばアミノ官能基で置換することができる。
他の好適な２’−修飾、例えば修飾ＭＯＥが米国特許出願公開第２０１３０１３０３７８号明細書（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
２’位の修飾は、アラビノース立体配置に存在し得る。用語「アラビノース立体配置」は、アラビノースにおける２’−ＯＨと同じ立体配置のリボースのＣ２’上の置換基の配置を指す。
糖は、糖の同じ炭素に２つの異なる修飾、例えばｇｅｍ修飾を含むことができる。糖基は、リボースにおける対応する炭素のものとは反対の立体化学配置を有する１個又は複数の炭素を含有することもできる。従って、オリゴマー化合物は、糖として、例えばアラビノースを含有する１つ又は複数のモノマーを含み得る。モノマーは、糖の１’位にα−結合、例えばα−ヌクレオシドを有し得る。モノマーは、４’位に反対の立体配置も有し得、例えばＣ５’及びＨ４’又はこれらを置換する置換基同士が交換される。Ｃ５’及びＨ４’又はこれらを置換する置換基同士が交換されている場合、この糖は、４’位で修飾されていると言う。
エフェクター分子又は多標的分子は、脱塩基糖、すなわちＣ−１’に核酸塩基が欠落しているか、又はＣ１’の核酸塩基の代わりに別の化学基を有する糖も含み得る。例えば、米国特許第５，９９８，２０３号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。これらの脱塩基糖は、１個又は複数の構成糖原子に修飾もさらに含むこともできる。エフェクター分子又は多標的分子は、Ｌ異性体、例えばＬ−ヌクレオシドである１つ又は複数の糖を含有することもできる。糖基に対する修飾は、硫黄、任意選択で置換された窒素若しくはＣＨ２基による４’−Ｏの置換も含み得る。一部の実施形態では、Ｃ１’と核酸塩基との連結は、α立体配置である。
糖修飾は、リボース炭素同士のＣ−Ｃ結合（例えば、Ｃ１’−Ｃ２’、Ｃ２’−Ｃ３’、Ｃ３’−Ｃ４’、Ｃ４’−Ｏ４’、Ｃ１’−Ｏ４’）が存在せず、且つ／又はリボース炭素又は酸素（例えば、Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ３’、Ｃ４’又はＯ４’）の少なくとも１つが独立に若しくは組合せでヌクレオチドに存在しない、非環状ヌクレオチドも含み得る。一部の実施形態では、非環状ヌクレオチドは、
Figure 2020505032
 であり、ここで、Ｂは、修飾若しくは非修飾核酸塩基であり、Ｒ１及びＲ２は、独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３又はアルキルであり；Ｒ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール若しくは糖である。
一部の実施形態では、糖修飾は、２’−Ｈ、２’−Ｏ−Ｍｅ（２’−Ｏ−メチル）、２’−Ｏ−ＭＯＥ（２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−Ｆ、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、２’−Ｓ−メチル、２’−Ｏ−ＣＨ２−（４’−Ｃ）（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−（４’−Ｃ）（ＥＮＡ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）及びアラビノース立体配置に２’−Ｏ−Ｍｅを有するｇｅｍ ２’−ＯＭｅ／２’Ｆからなる群から選択される。
特定のヌクレオチドがその２’位を介して次のヌクレオチドと連結している場合、本明細書に記載の糖修飾は、その特定のヌクレオチド、例えばその２’位を介して連結しているヌクレオチドについて糖の３’位に配置することができることが理解されるべきである。３’位の修飾は、キシロース立体配置で存在し得る。用語「キシロース立体配置」は、キシロース糖の３’−ＯＨと同じ立体配置でのリボースのＣ３’上の置換基の配置を指す。
Ｃ４’及び／又はＣ１’に結合した水素は、直鎖又は分岐状の任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルケニル、任意選択で置換されたアルキニルにより置換することができ、アルキル、アルケニル及びアルキニルの骨格は、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ’）、Ｃ（Ｏ）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、ＣＨ（Ｚ’）、リン含有結合、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、任意選択で置換された複素環式又は任意選択で置換されたシクロアルキルの１つ又は複数を含有することができ、ここで、Ｒ’は、水素、アシル又は任意選択で置換された脂肪族であり、Ｚ’は、ＯＲ１１、ＣＯＲ１１、ＣＯ２Ｒ１１、
Figure 2020505032
 、ＮＲ２１Ｒ３１、ＣＯＮＲ２１Ｒ３１、ＣＯＮ（Ｈ）ＮＲ２１Ｒ３１、ＯＮＲ２１Ｒ３１、ＣＯＮ（Ｈ）Ｎ＝ＣＲ４１Ｒ５１、Ｎ（Ｒ２１）Ｃ（＝ＮＲ３１）ＮＲ２１Ｒ３１、Ｎ（Ｒ２１）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２１Ｒ３１、Ｎ（Ｒ２１）Ｃ（Ｓ）ＮＲ２１Ｒ３１、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２１Ｒ３１、ＳＣ（Ｏ）ＮＲ２１Ｒ３１、Ｎ（Ｒ２１）Ｃ（Ｓ）ＯＲ１１、Ｎ（Ｒ２１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、Ｎ（Ｒ２１）Ｃ（Ｏ）ＳＲ１１、Ｎ（Ｒ２１）Ｎ＝ＣＲ４１Ｒ５１、ＯＮ＝ＣＲ４１Ｒ５１、ＳＯ２Ｒ１１、ＳＯＲ１１、ＳＲ１１及び置換若しくは非置換複素環式からなる群から選択され；Ｒ２１及びＲ３１は、それぞれの存在について独立に、水素、アシル、非置換若しくは置換脂肪族、アリール、ヘテロアリール、複素環式、ＯＲ１１、ＣＯＲ１１、ＣＯ２Ｒ１１又はＮＲ１１Ｒ１１’であるか；或いはＲ２１及びＲ３１は、それらが結合する原子と一緒に複素環を形成し；Ｒ４１及びＲ５１は、それぞれの存在について独立に、水素、アシル、非置換若しくは置換脂肪族、アリール、ヘテロアリール、複素環式化合物、ＯＲ１１、ＣＯＲ１１若しくはＣＯ２Ｒ１１又はＮＲ１１Ｒ１１’であり；Ｒ１１及びＲ１１’は、独立に、水素、脂肪族、置換脂肪族、アリール、ヘテロアリール又は複素環式である。一部の実施形態では、５’末端ヌクレオチドのＣ４’に結合した水素は、置換されている。
一部の実施形態では、Ｃ４’及びＣ５’は、一緒に、好ましくは少なくとも１つの−ＰＸ（Ｙ）−を含む任意選択で置換された複素環式を形成し、ここで、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、ＯＭ、ＳＨ、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアルコキシ、任意選択で置換されたアルキルチオ、任意選択で置換されたアルキルアミノ又は任意選択で置換されたジアルキルアミノであり、ここで、Ｍは、それぞれの存在について独立に、総電荷が＋１のアルキル金属又は遷移金属であり；Ｙは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ’であり、ここで、Ｒ’は、水素、任意選択で置換された脂肪族である。この修飾は、オリゴヌクレオチドの５末端にあることが好ましい。
いくつかの実施形態では、ＬＮＡは、式：
Figure 2020505032
 を有する二環式ヌクレオシドを含み、式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり；
Ｔ１は、Ｈ又はヒドロキシル保護基であり；
Ｔ２は、Ｈ、ヒドロキシル保護基又は反応性リン基であり；
Ｚは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アシル、置換アシル又は置換アミドである。
一部の実施形態では、置換された基の各々は、独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２及びＣＮ（各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ若しくはＮＪ１である）から独立に選択される、任意選択で保護された置換基で一又は多置換されている。
いくつかのこうした実施形態では、置換された基の各々は、独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１及びＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２（各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル若しくは置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ若しくはＮＪ １である）から独立に選択される置換基で一又は多置換されている。
いくつかの実施形態では、Ｚ基は、１つ又は複数のＸｘで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２又はＣＮ（各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ若しくはＮＪ１である）である。別の実施形態では、Ｚ基は、１つ又は複数のＸｘで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、アルコキシ（例えば、ＣＨ３Ｏ−）、置換アルコキシ又はアジドである。
いくつかの実施形態では、Ｚ基は、−ＣＨ２Ｘｘであり、ここで、Ｘｘは、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２又はＣＮ（各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ若しくはＮＪ１である）である。別の実施形態では、Ｚ基は、−ＣＨ２Ｘｘであり、ここで、Ｘｘは、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、アルコキシ（例えば、ＣＨ３Ｏ−）又はアジドである。
いくつかのこうした実施形態では、Ｚ基は、（Ｒ）−配置：
Figure 2020505032
 である。
いくつかのこうした実施形態では、Ｚ基は、（Ｓ）−配置：
Figure 2020505032
 である。
いくつかの実施形態では、各Ｔ１及びＴ２は、ヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基の好ましいリストは、ベンジル、ベンゾイル、２，６−ジクロロベンジル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、メシレート、トシレート、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、９−フェニルキサンチン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）及び９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ１は、アセチル、ベンジル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル及びジメトキシトリチルから選択されるヒドロキシル保護基であり、より好ましいヒドロキシル保護基は、４，４’−ジメトキシトリチルであるＴ１である。
いくつかの実施形態では、Ｔ２は、反応性リン基であり、好ましい反応性リン基としてジイソプロピルシアノエトキシホスホロアミダイト及びＨ−ホスホネートが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｔ１は、４，４’−ジメトキシトリチルであり、Ｔ２は、ジイソプロピルシアノエトキシホスホロアミダイトである。
いくつかの実施形態では、多標的分子は、式：
Figure 2020505032
 又は式：
Figure 2020505032
 又は式：
Figure 2020505032
 の少なくとも１つのモノマーを含み、式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり；
Ｔ３は、Ｈ、ヒドロキシル保護基、連結したコンジュゲート基又はヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、モノマーサブユニット若しくはオリゴマー化合物に結合したヌクレオシド間結合基であり；
Ｔ４は、Ｈ、ヒドロキシル保護基、連結したコンジュゲート基又はヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、モノマーサブユニット若しくはオリゴマー化合物に結合したヌクレオシド間結合基であり；
ここで、Ｔ３及びＴ４の少なくとも１つは、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、モノマーサブユニット若しくはオリゴマー化合物に結合したヌクレオシド間結合基であり；
Ｚは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アシル、置換アシル又は置換アミドである。
一部の実施形態では、置換された基の各々は、独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２及びＣＮ（各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ若しくはＮＪ１である）から独立に選択される、任意選択で保護された置換基で、一又は多置換されている。
一部の実施形態では、置換された基の各々は、独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１及びＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２（各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ若しくはＮＪ１である）から独立に選択される置換基で一又は多置換されている。
いくつかのこうした実施形態では、少なくとも１つのＺは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル又は置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、各Ｚは、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキル又は置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺは、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、各Ｚは、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺは、メチルである。いくつかの実施形態では、各Ｚは、メチルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺは、エチルである。いくつかの実施形態では、各Ｚは、エチルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺは、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、各Ｚは、独立に、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺは、置換メチルである。いくつかの実施形態では、各Ｚは、置換メチルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺは、置換エチルである。いくつかの実施形態では、各Ｚは、置換エチルである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの置換基は、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシである（例えば、少なくとも１つのＺは、１つ又は複数のＣ１〜Ｃ６アルコキシで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルである）。別の実施形態では、各置換基は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシである（例えば、各Ｚは、独立に、１つ又は複数のＣ１〜Ｃ６アルコキシで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルである）。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣ１〜Ｃ６アルコキシ置換基は、ＣＨ３Ｏ−である（例えば、少なくとも１つのＺは、ＣＨ３ＯＣＨ２−である）。別の実施形態では、各Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ置換基は、ＣＨ３Ｏ−である（例えば、各Ｚは、ＣＨ３ＯＣＨ２−である）。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの置換基は、ハロゲンである（例えば、少なくとも１つのＺは、１つ又は複数のハロゲンで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルである）。いくつかの実施形態では、各置換基は、独立に、ハロゲンである（例えば、各Ｚは、独立に、１つ又は複数のハロゲンで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルである）。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのハロゲン置換基は、フルオロである（例えば、少なくとも１つのＺは、ＣＨ２ＦＣＨ２−、ＣＨＦ２ＣＨ２−又はＣＦ３ＣＨ２−である）。いくつかの実施形態では、各ハロ置換基は、フルオロである（例えば、各Ｚは、独立に、ＣＨ２ＦＣＨ２−、ＣＨＦ２ＣＨ２−又はＣＦ３ＣＨ２−である）。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの置換基は、ヒドロキシルである（例えば、少なくとも１つのＺは、１つ又は複数のヒドロキシルで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルである）。いくつかの実施形態では、各置換基は、独立に、ヒドロキシルである（例えば、各Ｚは、独立に、１つ又は複数のヒドロキシルで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルである）。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺは、ＨＯＣＨ２−である。別の実施形態では、各Ｚは、ＨＯＣＨ２−である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺは、ＣＨ３−、ＣＨ３ＣＨ２−、ＣＨ２ＯＣＨ３−、ＣＨ２Ｆ−又はＨＯＣＨ２−である。いくつかの実施形態では、各Ｚは、独立に、ＣＨ３−、ＣＨ３ＣＨ２−、ＣＨ２ＯＣＨ３−、ＣＨ２Ｆ−又はＨＯＣＨ２−である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺ基は、１つ又は複数のＸｘで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２又はＣＮであり；各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ若しくはＮＪ１である。別の実施形態では、少なくとも１つのＺ基は、１つ又は複数のＸｘで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、アルコキシ（例えば、ＣＨ３Ｏ−）又はアジドである。
いくつかの実施形態では、各Ｚ基は、独立に、１つ又は複数のＸｘで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２又はＣＮであり；各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ若しくはＮＪ１である。別の実施形態では、各Ｚ基は、独立に、１つ又は複数のＸｘで置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、アルコキシ（例えば、ＣＨ３Ｏ−）又はアジドである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺ基は、−ＣＨ２Ｘｘであり、ここで、Ｘｘは、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２又はＣＮであり；各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ若しくはＮＪ１である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺ基は、−ＣＨ２Ｘｘであり、ここで、Ｘｘは、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、アルコキシ（例えば、ＣＨ３Ｏ−）又はアジドである。
いくつかの実施形態では、各Ｚ基は、独立に、−ＣＨ２Ｘｘであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２又はＣＮであり；各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ若しくはＮＪ１である。別の実施形態では、各Ｚ基は、独立に、−ＣＨ２Ｘｘであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、アルコキシ（例えば、ＣＨ３Ｏ−）又はアジドである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＺは、ＣＨ３−である。別の実施形態では、各Ｚは、ＣＨ３−である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのモノマーのＺ基は、式：
Figure 2020505032
 又は式：
Figure 2020505032
 又は式：
Figure 2020505032
 により表される（Ｒ）−配置である。
いくつかの実施形態では、上記式の各モノマーのＺ基は、（Ｒ）−配置である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのモノマーのＺ基は、式：
Figure 2020505032
 又は式：
Figure 2020505032
 又は式：
Figure 2020505032
 により表される（Ｓ）−配置である。
いくつかの実施形態では、上記式の各モノマーのＺ基は、（Ｓ）−配置である。
いくつかの実施形態では、Ｔ３は、Ｈ又はヒドロキシル保護基である。いくつかの実施形態では、Ｔ４は、Ｈ又はヒドロキシル保護基である。別の実施形態では、Ｔ３は、ヌクレオシド、ヌクレオチド又はモノマーサブユニットに結合したヌクレオシド間結合基である。いくつかの実施形態では、Ｔ４は、ヌクレオシド、ヌクレオチド又はモノマーサブユニットに結合したヌクレオシド間結合基である。いくつかの実施形態では、Ｔ３は、オリゴヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドに結合したヌクレオシド間結合基である。いくつかの実施形態では、Ｔ４は、オリゴヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドに結合したヌクレオシド間結合基である。いくつかの実施形態では、Ｔ３は、オリゴマー化合物に結合したヌクレオシド間結合基である。いくつかの実施形態では、Ｔ４は、オリゴマー化合物に結合したヌクレオシド間結合基である。いくつかの実施形態では、Ｔ３及びＴ４の少なくとも１つは、リン酸ジエステル又はホスホロチオエートから選択されるヌクレオシド間結合基を含む。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、式：
Figure 2020505032
 又は式：
Figure 2020505032
 又は式：
Figure 2020505032
 の少なくとも２つの連続したモノマーの少なくとも１つの領域を含み得る。
いくつかのこうした実施形態では、ＬＮＡとして、限定しないが、
Figure 2020505032
 に示すように、（Ａ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、（Ｂ）β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＬＮＡ及び（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＬＮＡが挙げられる。
いくつかの実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、上の式の少なくとも２つの連続したモノマーの少なくとも２つの領域を含み得る。いくつかの実施形態では、多標的分子は、ギャップモチーフを含む。いくつかの実施形態では、多標的分子は、約８〜約１４個の連続したβ−Ｄ−２’−デオキシリボフラノシルヌクレオシドの少なくとも１つの領域を含む。いくつかの実施形態では、多標的分子は、約９〜約１２個の連続したβ−Ｄ−２’−デオキシリボフラノシルヌクレオシドの少なくとも１つの領域を含む。
いくつかの実施形態では、多標的分子は、式：
Figure 2020505032
 （式中、Ｂｘは、複素環式塩基部分である）
の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを上回る）の（Ｓ）−ｃＥｔモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、モノマーは、糖模倣物を含む。いくつかのこうした実施形態では、糖又は糖−ヌクレオシド間結合組合せの代わりに模倣物を使用し、核酸塩基は、選択される標的とのハイブリダイゼーションのために維持する。糖模倣物の代表的な例として、限定しないが、シクロヘキセニル又はモルホリノが挙げられる。糖−ヌクレオシド間結合組合せの模倣物の代表的な例として、限定しないが、非荷電アキラル結合により連結されたペプチド核酸（ＰＮＡ）及びモルホリノ基が挙げられる。一部の事例では、核酸塩基の代わりに模倣物を用いる。代表的な核酸塩基模倣物は、当技術分野でよく知られており、限定しないが、三環式フェノキサジン類似体及びユニバーサル塩基（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２０００，２８：２９１１−１４、参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。糖、ヌクレオシド及び核酸塩基模倣物の合成方法は、当業者に周知である。
核酸修飾（糖間結合）
本明細書には、モノマー（限定しないが、修飾及び非修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドを含む）を互いに連結し、それによってオリゴマー化合物、例えばオリゴヌクレオチドを形成する結合基を記載する。こうした結合基は、糖間結合とも呼ばれる。２つの主要なクラスの結合基は、リン原子の存在又は非存在によって区別される。代表的なリン含有結合として、限定しないが、リン酸ジエステル（Ｐ＝Ｏ）、リン酸トリエステル、ホスホン酸メチル、ホスホロアミデート及びホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）が挙げられる。代表的な非リン含有結合基として、限定しないが、メチレンメチルイミノ（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−）、チオジエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−）、チオノカルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）−Ｓ−）；シロキサン（−Ｏ−Ｓｉ（Ｈ）２−Ｏ−）；及びＮ，Ｎ’−ジメチルヒドラジン（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−）が挙げられる。天然のリン酸ジエステル結合と比較して、修飾された結合は、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を改変、典型的には増大させるために使用することができる。いくつかの実施形態では、キラル原子を有する結合は、個別の鏡像体として、ラセミ混合物として調製することができる。代表的なキラル結合として、限定しないが、ホスホン酸アルキル及びホスホロチオエートが挙げられる。リン含有及び非リン含有結合の調製方法は、当業者に周知である。
結合基中のリン酸基は、酸素の１つを異なる置換基で置換することにより修飾することができる。この修飾による結果の１つは、核酸分解に対するオリゴヌクレオチドの耐性増大であり得る。修飾リン酸基の例として、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート及びリン酸トリエステルが挙げられる。一部の実施形態では、連結における非架橋リン酸酸素原子の１つは、Ｓ、Ｓｅ、ＢＲ３（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）、Ｃ（すなわちアルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（Ｒは、水素、任意選択で置換されたアルキル、アリールである）又はＯＲ（Ｒは、任意選択で置換されたアルキル又はアリールである）のいずれかにより置換することができる。非修飾リン酸基中のリン原子は、アキラルである。しかしながら、上記原子又は原子団の１つによる非架橋酸素の１つの置換は、リン原子をキラルにする。換言すれば、このように修飾されたリン酸基中のリン原子は、立体中心である。立体形成性リン原子は、「Ｒ」配置（本明細書ではＲｐ）又は「Ｓ」配置（本明細書ではＳｐ）のいずれかを有し得る。
ホスホロジチオエートは、硫黄により置換された両方の非架橋酸素を有する。ホスホロジチオエート中のリン中心は、オリゴヌクレオチドジアステレオマーの形成を排除するアキラルである。従って、特定の理論に拘束されることは意図しないが、両方の非架橋酸素に対する修飾は、キラル中心、例えばホスホロジチオエート形成を排除し、それらがジアステレオマー混合物を生成することができないことから、望ましい場合がある。従って、非架橋酸素は、独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ又はＯＲ（Ｒは、アルキル又はアリールである）のいずれか１つであり得る。
リン酸リンカーは、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）及び炭素（架橋ホスホン酸メチレン）による、架橋酸素（すなわちリン酸塩をモノマーの糖に連結する酸素）の置換によって修飾することもできる。この置換は、連結酸素のいずれか一方又は両方の連結酸素で実施することができる。架橋酸素がヌクレオシドの３’−酸素であるとき、炭素による置換が好ましい。架橋酸素がヌクレオシドの５’−酸素であるとき、窒素による置換が好ましい。
リン酸塩に連結した酸素の少なくとも１つが置換されているか、又はリン酸基が非リン基によって置換されている修飾リン酸結合は、「非リン酸ジエステル糖間結合」又は「非リン酸ジエステルリンカー」とも呼ばれる。
いくつかの実施形態では、リン酸基は、非リン含有コネクター、例えばデホスホリンカーにより置換することができる。デホスホリンカーは、本明細書において非リン酸ジエステルリンカーとも呼ばれる。特定の理論に拘束されることは意図しないが、荷電リン酸ジエステル基は、核酸分解の反応中心であるため、中性構造模倣物によるその置換は、増強されたヌクレアーゼ安定性を付与するものと考えられる。やはり特定の理論に拘束されることは意図しないが、一部の実施形態では、荷電リン酸基を中性部分で置換する改変を導入することが望ましい場合がある。
リン酸基を置換することができる部分の例として、限定しないが、以下のものが挙げられる：アミド（例えば、アミド−３（３’−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−５’）及びアミド−４（３’−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−５’））、ヒドロキシルアミノ、シロキサン（ジアルキルシロキサン）、カルボキサミド、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、カルボン酸エステル、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、硫化物、スルホン酸塩、スルホンアミド、スルホン酸エステル、チオホルムアセタール（３’−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−５’）、ホルムアセタール（３’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−５’）、オキシム、メチレンイミノ、メチレンカルボニルアミノ、メチレンメチルイミノ（ＭＭＩ、３’−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−５’）、メチレンヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｈｙｄｒａｚｏ）、メチレンジメチルヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒａｚｏ）、メチレンオキシメチルイミノ、エーテル（Ｃ３’−Ｏ−Ｃ５’）、チオエーテル（Ｃ３’−Ｓ−Ｃ５’）、チオアセトアミド（Ｃ３’−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｓ−Ｃ５’、Ｃ３’−Ｏ−Ｐ（Ｏ）−Ｏ−ＳＳ−Ｃ５’、Ｃ３’−ＣＨ２−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ５’、３’−ＮＨＰ（Ｏ）（ＯＣＨ３）−Ｏ−５’及び３’−ＮＨＰ（Ｏ）（ＯＣＨ３）−Ｏ−５’及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成部分を含むノニオン結合。例えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ ａｎｄ Ｐ．Ｄ．Ｃｏｏｋ Ｅｄｓ．ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０；Ｃｈａｐｔｅｒｓ ３ ａｎｄ ４，（ｐｐ．４０−６５）を参照されたい。好ましい実施形態として、メチレンメチルイミノ（ＭＭＩ）、メチレンカルボニルアミノ、アミド、カルバメート及びエチレンオキシドリンカーが挙げられる。
当業者であれば、いくつかの事例において、非架橋酸素の置換は、隣接する２’−ＯＨによる糖間結合の切断増強をもたらし得るため、多くの事例において、非架橋酸素の修飾は、２’−ＯＨの修飾、例えば隣接する糖間結合、例えばアラビノース糖、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、ＬＮＡ及びＥＮＡの切断に参加しない修飾を必要とし得ることを十分に認識している。
好ましい非リン酸ジエステル糖間結合は、ホスホロチオエート、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれを上回る鏡像体過剰率のＳｐ異性体を含むホスホロチオエート、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれを上回る鏡像体過剰率のＲｐ異性体を含むホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキル−ホスホネート（例えば、メチル−ホスホネート）、セレノホスフェート、ホスホロアミデート（例えば、Ｎ−アルキルホスホロアミデート）及びボラノホスホネートを含む。
一部の実施形態では、多標的分子は、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを上回る、並びに各数値を含めてそれを下回る）の修飾若しくは非リン酸ジエステル結合を含む。一部の実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子は、少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを上回る、並びに各数値を含めてそれを下回る）のホスホロチオエート結合を含み得る。
リン酸リンカー及び糖がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド又はヌクレオチドサロゲートにより置換されているエフェクター分子又は多標的分子を構築することもできる。特定の理論に拘束されることは意図しないが、繰り返し荷電された骨格の非存在は、ポリアニオンを認識するタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ）に対する結合を弱めると考えられる。やはり特定の理論に拘束されることは意図しないが、一部の実施形態では、塩基が中性サロゲート骨格により係留される改変を導入することが望ましい場合がある。例として、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、アミノエチルグリシルＰＮＡ（ａｅｇＰＮＡ）及び骨格伸張ピロリジンＰＮＡ（ｂｅｐＰＮＡ）ヌクレオシドサロゲートが挙げられる。好ましいサロゲートは、ＰＮＡサロゲートである。
エフェクター分子又は多標的分子は、１つ又は複数の非対称中心を含み、従って鏡像異性体、ジアステレオマー及びその他の立体配置を生成し得るが、これらは、絶対立体化学に関して、糖アノマーなどの場合、（Ｒ）若しくは（Ｓ）として、又はアミノ酸などの場合、（Ｄ）若しくは（Ｌ）として定義され得る。本明細書において提供される多標的分子には、このような考えられるあらゆる異性体並びにそれらのラセミ形態及び光学的に純粋な形態が含まれる。
多標的分子又はエフェクター分子の末端を修飾することができる。このような修飾は、一方又は両方の末端で可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの３’及び／又は５’末端を標識部分、例えば発蛍光団（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３若しくはＣｙ５色素）又は保護基（例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素若しくはエステル系）などの他の機能性分子実体と共役させることができる。機能性分子実体は、リン酸基及び／又はリンカーを介して糖に結合することができる。リンカーの末端原子は、リン酸基の結合原子又は糖のＣ−３’若しくはＣ−５’Ｏ、Ｎ、Ｓ若しくはＣ基に連結するか、又はそれを置換することができる。或いは、リンカーは、ヌクレオチドサロゲート（例えば、ＰＮＡ）の末端原子に連結するか、又はそれを置換することができる。
リンカー／リン酸−機能分子実体−リンカー／リン酸アレイが二本鎖オリゴマー化合物の２つの鎖間に配置されているとき、このアレイは、ヘアピンタイプのオリゴマー化合物中のヘアピンループを置換し得る。
活性を調節する上で有用な末端修飾には、リン酸塩又はリン酸塩類似体によるオリゴヌクレオチドの５’末端の修飾がある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’末端は、リン酸化されているか、又はホスホリル類似体を含む。例示的な５’−リン酸修飾として、ＲＩＳＣ媒介性遺伝子サイレンシングと適合性であるものが挙げられる。５’末端の修飾は、対象の免疫系を刺激又は阻害する上でも有用となり得る。一部の実施形態では、オリゴマー化合物の５’末端は、修飾
Figure 2020505032
 を含み、ここで、Ｗ、Ｘ及びＹは、それぞれ独立に、Ｏ、ＯＲ（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）、Ｓ、Ｓｅ、ＢＲ３（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）、ＢＨ３ −、Ｃ（すなわちアルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）又はＯＲ（Ｒは、水素、アルキル又はアリールである）からなる群から選択され；Ａ及びＺは、それぞれの存在についてそれぞれ独立に、非存在、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、ＮＲ（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）又は任意選択で置換されたアルキレンであり、ここで、アルキレンの骨格は、内部及び／又は末端に、Ｏ、Ｓ、ＳＳ及びＮＲ（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）の１つ又は複数を含むことができ；ｎは、０〜２である。一部の実施形態では、ｎは、１又は２である。Ａは、糖の５’炭素に連結した酸素を置換することが理解される。ｎが０であるとき、Ｗ及びＹは、それらが結合されるＰと一緒に、任意選択で置換された５〜８員複素環式化合物を形成することができ、ここで、Ｗ及びＹは、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、ＮＲ’又はアルキレンである。複素環式化合物は、アリール又はヘテロアリールで置換されていることが好ましい。一部の実施形態では、５’末端ヌクレオチドのＣ５’上の一方又は両方の水素がハロゲン、例えばＦで置換されている。
例示的な５’−修飾として、限定しないが、５’−一リン酸塩（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−二リン酸塩（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−三リン酸塩（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオリン酸塩（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノジチオリン酸塩（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；５’−α−チオ三リン酸塩；５’−β−チオ三リン酸塩；５’−γ−チオ三リン酸塩；５’−ホスホロアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）が挙げられる。他の５’−修飾として、５’−アルキルホスホネート（Ｒ（ＯＨ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’、Ｒ＝アルキル、例えばメチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ（ＯＨ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’、Ｒ＝アルキルエーテル、例えばメトキシメチル（ＣＨ２ＯＭｅ）、エトキシメチルなど）が挙げられる。他の例示的な５’−修飾として、Ｚが任意選択で少なくとも１回置換されたアルキルであるもの、例えば（（ＨＯ）２（Ｘ）Ｐ−Ｏ［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、（（ＨＯ）２（Ｘ）Ｐ−Ｏ［−（ＣＨ２）ａ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、（（ＨＯ）２（Ｘ）Ｐ−［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’；ジアルキル末端リン酸塩及びリン酸塩模倣物：ＨＯ［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、Ｈ２Ｎ［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、Ｈ［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、Ｍｅ２Ｎ［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、ＨＯ［−（ＣＨ２）ａ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、Ｈ２Ｎ［−（ＣＨ２）ａ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、Ｈ［−（ＣＨ２）ａ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、Ｍｅ２Ｎ［−（ＣＨ２）ａ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’が挙げられ、ここで、ａ及びｂは、それぞれ独立に、１〜１０である。他の実施形態は、ＢＨ３、ＢＨ３ −及び／又はＳｅによる酸素及び／又は硫黄の置換を含む。
末端修飾は、分布をモニターする上でも有用となり得、このような場合、付加するのに好ましい基には、発蛍光団、例えばフルオレセイン又はＡｌｅｘａ色素、例えばＡｌｅｘａ ４８８がある。末端修飾は、取り込みを増強するのにも有用となり得、このための有用な修飾としては、ターゲティングリガンドがある。末端修飾は、別の部分にオリゴヌクレオチドを架橋する上でも有用となり得；このための有用な修飾として、マイトマイシンＣ、プソラレン及びそれらの誘導体が挙げられる。
アンチセンス鎖のシード領域（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の２〜８位）とは反対の部位でセンス鎖に熱不安定化修飾を導入することにより、ｄｓＲＮＡ二重螺旋が解離又は融解する傾向を高める（二重螺旋会合の自由エネルギーを低減する）ことにより、ｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ剤などのエフェクター分子をＲＮＡ干渉について最適化することができる。この修飾は、二重螺旋がアンチセンス鎖のシード領域内で解離又は融解する傾向を高めることができる。
熱不安定化修飾は、脱塩基修飾；反対側の鎖における反対側ヌクレオチドとのミスマッチ；並びに２’−デオキシ修飾又は非環状ヌクレオチド、例えばアンロックド核酸（ＵＮＡ）若しくはグリセロール核酸（ＧＮＡ）などの糖修飾を含み得る。
例示される脱塩基修飾は、以下の通りである。
Figure 2020505032
例示される糖修飾は、以下の通りである。
Figure 2020505032
用語「非環状ヌクレオチド」は、非環状リボース糖を有する任意のヌクレオチドを指し、例えば、その際、リボース炭素同士の結合（例えば、Ｃ１’−Ｃ２’、Ｃ２’−Ｃ３’、Ｃ３’−Ｃ４’、Ｃ４’−Ｏ４’若しくはＣ１’−Ｏ４’）のいずれかが存在せず、且つ／又はリボース炭素若しくは酸素（例えば、Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ３’、Ｃ４’又はＯ４’）の少なくとも１つが独立に又は組合せでヌクレオチドから欠失している。一部の実施形態では、非環状ヌクレオチドは、
Figure 2020505032
 であり、ここで、Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基であり、Ｒ１及びＲ２は、独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３又はアルキルであり；Ｒ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖である。用語「ＵＮＡ」は、アンロックド非環状核酸を指し、糖の結合のいずれかが除去されてアンロックド「糖」残基を形成する。一例では、ＵＮＡは、Ｃ１’−Ｃ４’間の結合（すなわちＣ１’及びＣ４’炭素同士の共有結合炭素−酸素−炭素結合）が除去されたモノマーも包含する。別の例では、糖のＣ２’−Ｃ３’結合（すなわちＣ２’及びＣ３’炭素同士の共有結合炭素−炭素結合）が除去されている（Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６（１７）：２０５９（１９８５）；及びＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，１０：１０３９（２００９）を参照されたく、これらは、全体として参照により本明細書に組み込まれる）。非環状誘導体は、ワトソン−クリック対合に影響を及ぼすことなく、より大きい骨格柔軟性を付与する。非環状ヌクレオチドは、２’−５’又は３’−５’結合を介して連結することができる。
用語「ＧＮＡ」は、ＤＮＡ又はＲＮＡに類似しているが、リン酸ジエステル結合：
Figure 2020505032
 により連結される反復グリセロール単位から構成される点で「骨格」の組成が異なるポリマーであるグリコール核酸を指す。
熱不安定化修飾は、ｄｓＲＮＡ二重螺旋内の熱不安定化ヌクレオチドと、反対側の鎖の反対側ヌクレオチドとのミスマッチ（すなわち非相補的塩基対）であり得る。例示的なミスマッチ塩基対は、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、Ｕ：Ｔ又はこれらの組合せを含む。当技術分野で知られる他のミスマッチ塩基対合も本発明に適している。ミスマッチは、天然に存在するヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドのいずれのヌクレオチド間でも起こり得る。すなわち、ミスマッチ塩基対合は、ヌクレオチドのリボース糖に対する修飾とは関係なく、それぞれのヌクレオチドからの核酸塩基同士で起こり得る。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ剤などのエフェクター分子は、ミスマッチ対合に少なくとも１つの核酸塩基を含有し、それは、２’−デオキシ核酸塩基であり；例えば、２’−デオキシ核酸塩基は、センス鎖に存在する。
脱塩基ヌクレオチド、非環状ヌクレオチド修飾（ＵＮＡ及びＧＮＡを含む）並びにミスマッチ修飾のさらなる例は、国際公開第２０１１／１３３８７６号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。
熱不安定化修飾は、反対側塩基との水素結合を形成する能力が低減又は無効化されたユニバーサル塩基、さらにはリン酸修飾も含み得る。
反対側の鎖における塩基との水素結合を形成する能力が障害又は完全に無効化された核酸塩基修飾は、国際公開第２０１０／００１１８９５号パンフレット（全体として参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ｄｓＲＮＡ二重螺旋の中央領域の不安定化について評価されている。例示的な核酸塩基修飾は、
Figure 2020505032
 である。
天然のリン酸ジエステル結合と比較してｄｓＲＮＡ二重螺旋の熱安定性を低下させることが分かっている例示的なリン酸修飾は、
Figure 2020505032
 である。
一部の実施形態では、多標的分子中のエフェクター分子は、２’−５’結合（２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅとの及びＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓとの）を含み得る。例えば、２’−５’結合修飾を用いてヌクレアーゼ耐性を促進するか、又はセンス鎖とアンチセンス鎖の結合を阻害することができ、或いは上記修飾をセンス鎖の５’末端に用いて、ＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避することができる。
別の実施形態では、多標的分子中のエフェクター分子は、Ｌ糖（例えば、２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅを含むＬリボース、Ｌ−アラビノース）を含み得る。例えば、これらのＬ糖修飾を用いてヌクレアーゼ耐性を促進するか、又はセンス鎖とアンチセンス鎖との結合を阻害することができ、或いは上記修飾をセンス鎖の５’末端に用いて、ＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避することができる。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、担体を介してリガンドに共役され、担体は、環状基又は非環状基であり得；好ましくは、環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル及びデカリンから選択され；好ましくは、非環状基は、セリノール骨格又はジエタノールアミン骨格から選択される。
一部の実施形態では、本明細書に開示する多標的分子中の少なくとも１つのエフェクター分子の少なくとも１つの鎖は、５’リン酸化されているか、又は５’プライム末端にホスホリル類似体を含む。５’−リン酸修飾は、ＲＩＳＣ媒介遺伝子サイレンシングと適合性のものを含む。好適な修飾としては、以下のものが挙げられる：５’−一リン酸塩（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−二リン酸塩（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−三リン酸塩（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化又は非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）及び任意の修飾若しくは非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオリン酸塩（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノジチオリン酸塩（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄置換一リン酸塩、二リン酸塩及び三リン酸塩（例えば、５’−α−チオ三リン酸塩、５’−γ−チオ三リン酸塩など）、５’−ホスホロアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、５’−アルケニルホスホネート（すなわちビニル、置換ビニル）、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）の任意のさらなる組合せ。
本発明は、キメラ化合物であるエフェクター分子及び多標的分子も含む。本発明に関連して、「キメラ」化合物又は「キメラ」は、２つ以上の化学的に異なる領域を含む化合物であり、各領域は、少なくとも１つのモノマー単位、例えばオリゴヌクレオチドの場合、修飾若しくは非修飾ヌクレオチドから構成される。キメラ化合物は、特定のモチーフを有するものとして記載することができる。一部の実施形態では、モチーフとして、限定しないが、交互モチーフ、ギャップモチーフ、ヘミマーモチーフ、均質に完全に修飾されたモチーフ及び位置修飾モチーフが挙げられる。本明細書で使用されるとき、「化学的に異なる領域」という語句は、化合物の他所に存在しない修飾を有するか又は化合物の他所に存在する修飾がない点で他の領域と異なる多標的分子の領域を指す。多標的分子は、２つ以上の化学的に異なる領域を含み得る。本明細書で使用されるとき、修飾を含まない領域も化学的に異なるとみなされる。
化学的に異なる領域は、多標的分子化合物内で反復することができる。従って、多標的分子内の化学的に異なる領域のパターンは、第１の化学的に異なる領域に、１つ又は複数の第２の化学的に異なる領域が続くように実現することができる。化学的に異なる領域のこうした配列は、１回又は複数回反復することができる。好ましくは、２回以上配列を反復する。例えば、二本鎖エフェクター分子の両方の鎖がこれらの配列を含むことができる。化学的に異なる領域の各々は、実際に、わずかに単一モノマー、例えばヌクレオチドを含むことがある。一部の実施形態では、化学的に異なる領域の各々は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８モノマー、例えばヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、交互ヌクレオチドは、同じ修飾を含み、例えば、鎖内の全ての奇数ヌクレオチドは、同じ修飾を有し、及び／又は鎖内の全ての偶数ヌクレオチドは、第１の鎖と類似の修飾を有する。一部の実施形態では、二本鎖エフェクター分子又は多標的分子中の全ての奇数ヌクレオチドは、同じ修飾を有し、全ての偶数ヌクレオチドは、奇数ヌクレオチドには存在しない修飾を有し、その逆も同じである。
二本鎖分子の両方の鎖が交互修飾パターンを含む場合、一方の鎖のヌクレオチドは、類似修飾された第２の鎖のヌクレオチドに対して相補的位置であり得る。別の実施形態では、第２の鎖の類似修飾のパターンに対して、それぞれ第１の鎖の修飾のパターン間に位相シフトが存在する。このシフトは、第１の鎖及び第２の鎖の類似修飾ヌクレオチドが、互いに相補的位置ではないようにすることが好ましい。
一部の実施形態では、第１の鎖は、交互ヌクレオチドが、２’−修飾、例えば２’−Ｏ−メチル修飾を含む、交互修飾パターンを有する。一部の実施形態では、第１の鎖が、交互２’−Ｏ−メチル修飾を含み、第２の鎖が、交互２’−フルオロ修飾を含む。他の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの両方の鎖が、交互２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
二本鎖オリゴヌクレオチドの両方の鎖が交互２’−Ｏ−メチル修飾を含む場合、このような２’−修飾ヌクレオチドは、二重螺旋領域において相補的位置であり得る。或いは、このような２’−修飾ヌクレオチドは、二重螺旋領域において相補的位置ではない。
一部の実施形態では、多標的分子中に存在するオリゴヌクレオチドは、２つの化学的に異なる領域を含み、ここで、各領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド長である。
他の実施形態では、多標的分子中に存在するオリゴヌクレオチドは、３つの化学的に異なる領域を含む。中央の領域は、約５〜１５、（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５）ヌクレオチド長であり、各フランキング又はウィング領域は、独立に、１〜１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）ヌクレオチド長である。３つの領域の全てが、異なる修飾を有し得、又はウィング領域が、互いに類似の修飾を有し得る。一部の実施形態では、ウィング領域は、同じ長さ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド長である。
本明細書で使用されるとき、用語「交互モチーフ」は、モノマーサブユニットが、化合物のほぼ全配列にわたって交互に繰り返す２つの異なるタイプの糖基を有する、連結モノマーサブユニットから構成される連続配列を含む化合物を指す。交互モチーフを有するオリゴヌクレオチドは、式：５’−Ａ（−Ｌ−Ｂ−Ｌ−Ａ）ｎ（−Ｌ−Ｂ）ｍ−３’により表すことができ、式中、Ａ及びＢは、異なる糖基を有するモノマーサブユニットであり、各Ｌは、ヌクレオシド間結合基であり、ｎは、約４〜約１２であり、ｍは、０又は１である。これにより、長さが約９〜約２６モノマーサブユニットの交互モチーフを有する化合物が可能になる。これより長い及び短い化合物も本発明に適していることから、この長さ範囲が限定的であるわけではない。一部の実施形態では、Ａ及びＢの一方は、本明細書において提供される２’−修飾ヌクレオシドである。
本明細書で使用されるとき、ある「タイプ」のヌクレオシド又はヌクレオシドに関して「修飾のタイプ」は、ヌクレオシドの修飾を指し、修飾及び非修飾ヌクレオシドを含む。従って、別に指定されない限り、「第１タイプの修飾を有するヌクレオシド」は、非修飾ヌクレオシドであり得る。
本明細書で使用されるとき、「タイプ領域」は、化合物の一部を指し、ここで、上記領域内のヌクレオシド及びヌクレオシド間結合は、全て同じタイプの修飾を含み；任意の隣接部分のヌクレオシド及び／又はヌクレオシド間結合は、少なくとも１つの異なるタイプの修飾を含む。本明細書で使用されるとき、用語「均質な完全修飾モチーフ」は、それぞれ同じタイプの糖基を有する連結モノマーサブユニットの連続的配列を含むオリゴヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、均質な完全修飾モチーフは、本発明のヌクレオシドの連続的配列を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるヌクレオシドの連続的配列の３’及び５’末端の一方又は両方は、１つ又は複数の非修飾ヌクレオシドなどの末端基を含む。
いくつかの実施形態では、化合物、例えば多標的分子又はエフェクター分子の５’末端モノマーは、５’末端にリン含有部分を含む。いくつかの実施形態では、５’末端モノマーは、２’−修飾を含む。いくつかのこうした実施形態では、５’末端モノマーの２’−修飾は、カチオン性修飾である。いくつかの実施形態では、５’末端モノマーは、５’−修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端モノマーは、２’−修飾及び５’−修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端モノマーは、５’−安定化ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、５’末端モノマーの修飾は、５’−リン酸塩を安定化する。いくつかの実施形態では、５’末端モノマーの修飾を含む化合物は、エキソヌクレアーゼに対して耐性である。いくつかの実施形態では、５’末端モノマーの修飾を含む化合物は、改善された遺伝子発現調節特性を有する。
いくつかの実施形態では、５’末端モノマーは、改変された結合により、残りの化合物に結合される。いくつかのこうした実施形態では、５’末端モノマーは、ホスホロチオエート結合により、残りの化合物に結合される。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物は、１つ又は複数の交互修飾の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、１つ又は複数の交互ヌクレオシド修飾の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、１つ又は複数の交互結合修飾の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、１つ又は複数の交互ヌクレオシド及び結合修飾の領域を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物は、１つ又は複数の交互２’−Ｆ修飾ヌクレオシド及び２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドの領域を含む。いくつかのこうした実施形態では、交互２’Ｆ修飾及び２’ＯＭｅ修飾ヌクレオシドのこのような領域も交互結合を含む。いくつかのこうした実施形態では、２’−Ｆ修飾ヌクレオシドの３’末端での結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかのこうした実施形態では、２’ＯＭｅヌクレオシドの３’末端での結合は、リン酸ジエステル結合である。
いくつかの実施形態では、このような交互領域は：
（２’−Ｆ）−（ＰＳ）−（２’−ＯＭｅ）−（ＰＯ）
である。
いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１個のこうした交互領域を含む。こうした領域は、連続的であり得、又は異なる修飾ヌクレオシド若しくは結合によって分断され得る。
いくつかの実施形態では、交互モチーフ中の１つ又は複数の交互領域は、複数のあるタイプの単一ヌクレオシドを含む。例えば、本発明のオリゴマー化合物は、以下のヌクレオシドモチーフ：
ＡＢＡ；
ＡＢＢＡ；
ＡＡＢＡ；
ＡＡＢＢＡＡ；
ＡＢＢＡＢＢ；
ＡＡＢＡＡＢ；
ＡＢＢＡＢＡＡＢＢ；
ＡＢＡＢＡＡ；
ＡＡＢＡＢＡＢ；
ＡＢＡＢＡＡ；
ＡＢＢＡＡＢＢＡＢＡＢＡＡ；
ＢＡＢＢＡＡＢＢＡＢＡＢＡＡ；又は
ＡＢＡＢＢＡＡＢＢＡＢＡＢＡＡ；
のいずれかの１つ又は複数の領域を含み得、ここで、Ａは、第１タイプのヌクレオシドであり、Ｂは、第２タイプのヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、Ａ及びＢは、それぞれ２’−Ｆ、２’−ＯＭｅ、ＬＮＡ、ＤＮＡ及びＭＯＥから選択される。
いくつかの実施形態では、Ａは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、Ｂは、ＤＮＡである。一部の実施形態では、Ａは、４’−ＣＨ２Ｏ−２’−ＬＮＡである。いくつかの実施形態では、Ｂは、４’−ＣＨ２Ｏ−２’−ＬＮＡである。いくつかの実施形態では、Ａは、ＤＮＡであり、Ｂは、４’−ＣＨ２Ｏ−２’−ＬＮＡである。いくつかの実施形態では、Ａは、４’−ＣＨ２Ｏ−２’−ＬＮＡであり、Ｂは、ＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、Ａは、２’−ＯＭｅである。いくつかの実施形態では。Ｂは、２’−ＯＭｅである。いくつかの実施形態では、Ａは、２’−ＯＭｅであり、Ｂは、４’−ＣＨ２Ｏ−２’−ＬＮＡである。いくつかの実施形態では、Ａは、４’−ＣＨ２Ｏ−２’−ＬＮＡであり、Ｂは、２’−ＯＭｅである。いくつかの実施形態では、Ａは、２’−ＯＭｅであり、Ｂは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、Ａは、ＤＮＡであり、Ｂは、２’−ＯＭｅである。
いくつかの実施形態では、Ａは、（Ｓ）−ｃＥｔである。一部の実施形態では、Ｂは、（Ｓ）−ｃＥｔである。いくつかの実施形態では、Ａは、２’−ＯＭｅであり、Ｂは、（Ｓ）−ｃＥｔである。いくつかの実施形態では、Ａは、（Ｓ）−ｃＥｔであり、Ｂは、２’−ＯＭｅである。いくつかの実施形態では、Ａは、ＤＮＡであり、Ｂは、（Ｓ）−ｃＥｔである。いくつかの実施形態では、Ａは、（Ｓ）−ｃＥｔであり、Ｂは、ＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、Ａは、２’−Ｆである。いくつかの実施形態では、Ｂは、２’−Ｆである。いくつかの実施形態では、Ａは、２’−Ｆであり、Ｂは、４’−ＣＨ２Ｏ−２’−ＬＮＡである。いくつかの実施形態では、Ａは、４’−ＣＨ２Ｏ−２’−ＬＮＡであり、Ｂは、２’−Ｆである。いくつかの実施形態では、Ａは、２’−Ｆであり、Ｂは、（Ｓ）−ｃＥｔである。いくつかの実施形態では、Ａは、（Ｓ）−ｃＥｔであり、Ｂは、２’−Ｆである。いくつかの実施形態では、Ａは、２’−Ｆであり、Ｂは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、Ａは、ＤＮＡであり、Ｂは、２’−Ｆである。いくつかの実施形態では、Ａは、２’−ＯＭｅであり、Ｂは、２’−Ｆである。いくつかの実施形態では、Ａは、ＤＮＡであり、Ｂは、２’−ＯＭｅである。いくつかの実施形態では、Ａは、２’−ＯＭｅであり、Ｂは、ＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、このような交互モチーフを有するオリゴマー化合物は、リン酸塩安定化修飾を含む５’末端ヌクレオシドも含む。いくつかの実施形態では、このような交互モチーフを有するオリゴマー化合物は、２’カチオン性修飾を含む５’末端ヌクレオシドも含む。いくつかの実施形態では、このような交互モチーフを有するオリゴマー化合物は、５’末端修飾も含む。
２−２−３モチーフ
いくつかの実施形態では、多標的分子中のオリゴヌクレオチドは、２−２−３モチーフを有する領域を含む。このような領域は、下記のモチーフ：
５’−（Ｅ）ｗ−（Ａ）２−（Ｂ）ｘ−（Ａ）２−（Ｃ）ｙ−（Ａ）３−（Ｄ）ｚ
を含み、式中、
Ａは、第１タイプの修飾ヌクレオシドであり；
Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、Ａと異なる修飾がなされたヌクレオシドであるが、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、互いに同じ又は異なる修飾を有し得；
ｗ及びｚは、０〜１５であり；
ｘ及びｙは、１〜１５である。
いくつかの実施形態では、Ａは、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、全て２’−Ｆ修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、Ａは、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドであり、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、全て２’−Ｆ修飾ヌクレオシドである。
いくつかの実施形態では、２−２−３モチーフの結合は、全て修飾結合である。いくつかの実施形態では、結合は、全てホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、第１タイプの各修飾の３’末端の結合は、リン酸ジエステルである。
いくつかの実施形態では、Ｚは０である。こうした実施形態では、第１タイプの３ヌクレオシドの領域は、オリゴヌクレオチドの３’末端にある。いくつかの実施形態では、このような領域は、オリゴマー化合物の３’末端にあり、第１タイプの３ヌクレオシドの領域の３’末端に他の基は結合していない。いくつかの実施形態では、Ｚが０であるオリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物は、３’末端ヌクレオシドに結合された末端基を含み得る。このような末端基は、別のヌクレオシドを含み得る。このような別のヌクレオシドは、典型的に、非ハイブリダイズヌクレオシドである。
いくつかの実施形態では、Ｚは１〜３である。いくつかの実施形態では、Ｚは２である。いくつかの実施形態では、Ｚのヌクレオシドは、２’−ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、Ｚは、非ハイブリダイズヌクレオシドを表す。混乱を避けるために、このような非ハイブリダイズヌクレオシドがＺ＝０の３’末端基としても記載され得ることに留意する。
組合せモチーフ
前述したモチーフ及び修飾のいくつかを組み合わせ得ることが理解されるべきである。モチーフは、少数のヌクレオチドのみを含み得ることから、特定のオリゴヌクレオチドは、２つ以上のモチーフを含むことができる。非限定的な例として、いくつかの実施形態では、多標的分子中のオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ、ホスホロチオエート結合、２’−ＯＭｅ、共役リガンドから選択される２つ以上のヌクレオチドモチーフを有し得る。
限定なしに、本明細書に記載する様々なヌクレオチドモチーフのいずれかを有する本発明の多標的分子は、任意の結合モチーフを有することもできる。例えば、多標的分子中に存在するオリゴヌクレオチドにおいて、５’末端の最初の１、２、３、４又は５糖間結合は、修飾された糖間結合であり得、３’末端の最初の４、５、６、７又は８糖間結合は、修飾された糖間結合であり得る。こうした修飾オリゴヌクレオチドの中央領域は、本明細書に記載する他のモチーフのいずれかに基づく糖間結合、例えば均質、交互、ヘミマー、ギャップマーなどを有し得る。一部の実施形態では、多標的分子中に存在するオリゴヌクレオチドは、５’末端の第１及び第２モノマー間のホスホロチオエート結合、中央領域におけるホスホロチオエート／リン酸ジエステル交互結合並びに３’末端の６、７又は８ホスホロチオエート結合を含む。
ヌクレオチドモチーフにより画定される領域の長さ及び結合モチーフの長さは、同じである必要はないことに留意すべきである。
一部の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチド又は二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの鎖は、以下のモチーフの少なくとも１つを含む：
（ａ）５’−ホスホロチオエート又は５’−ホスホロジチオエート；
（ｂ）５’末端のヌクレオチド１及び２のカチオン性修飾、ここで、カチオン性修飾は、ピリミジンのＣ５位及びプリンのＣ２、Ｃ６、Ｃ８、環外Ｎ２若しくは環外Ｎ６に位置する；
（ｃ）５’末端の最初の２つの末端ヌクレオチドにおける少なくとも１つのＧクランプヌクレオチド及びカチオン性修飾を有する他のヌクレオチド、ここで、カチオン性修飾は、ピリミジンのＣ５位又はプリンのＣ２、Ｃ６、Ｃ８、環外Ｎ２若しくは環外Ｎ６位に位置する；
（ｄ）核酸塩基修飾を含む少なくとも１つの２’−Ｆ修飾ヌクレオチド；
（ｅ）核酸塩基修飾を含む少なくとも１つのｇｅｍ−２’−Ｏ−メチル／２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、好ましくはメチル置換基は、上方配置、例えばアラビノース配置にある；
（ｆ）３’末端の５’−ＰｕＰｕ−３’ジヌクレオチド、ここで、いずれのヌクレオチドも、米国特許出願公開第２０１３０１３０３７８号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように２’位に修飾ＭＯＥを含む；
（ｇ）５’末端の５’−ＰｕＰｕ−３’ジヌクレオチド、ここで、いずれのヌクレオチドも、米国特許出願公開第２０１３０１３０３７８号明細書に記載のように２’位に修飾ＭＯＥを含む；
（ｈ）米国特許出願公開第２０１３０１３０３７８号明細書に記載のように２’位に修飾ＭＯＥを含む、５’末端のヌクレオチド；
（ｉ）３’−Ｆ修飾を有する５’末端のヌクレオチド；
（ｊ）４’−置換基を含む５’末端ヌクレオチド；
（ｋ）Ｏ４’修飾を含む５’末端ヌクレオチド；
（ｌ）４’−置換基を含む３’末端ヌクレオチド；及び
（ｍ）これらの組合せ。
一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの両方の鎖は、独立に、前述したモチーフの少なくとも１つを含む。一部の他の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの両方の鎖は、前述したモチーフの少なくとも１つを含み、これらのモチーフは、同じか又は異なり得、又は同じ及び異なるもののいくつかの組合せであり得る。
前述の例は、記載されるモチーフをどのように組み合わせて使用できるかを示すために提供されるに過ぎず、特定の組合せ又は組合せの例示に用いた特定の修飾に本発明を限定することは意図しない。さらに、限定しないが、上の表に示すものなどの本明細書における特定の例は、より一般的な実施形態を包含することを意図する。例えば、上の表の列Ａは、交互に繰り返す２’−ＯＭｅ及び２’−Ｆヌクレオシドの領域を例示する。従って、この同じ開示は、交互に繰り返す別の２’−修飾の領域も例示する。これは、交互に繰り返す２’−Ｏ−アルキル及び２’−ハロゲンヌクレオシドの領域も例示する。これは、交互に繰り返す異なる修飾ヌクレオシドの領域も例示する。本明細書全体の例の全てがこうした包括的解釈を考慮する。
化合物、例えば多標的分子中の存在するオリゴヌクレオチドの長さは、モチーフを破断することなく、記載の領域の１つ又は複数を伸長又は短縮することによって容易に操作し得ることにも留意する。
一部の実施形態では、エフェクター分子又は多標的分子中のオリゴヌクレオチドは、２つ以上の化学的に異なる領域を含み、２００９年３月２６日に出願された国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第０９／０３８４３３号明細書（その内容は、全体として本明細書に組み込まれる）に記載の構造を有する。
合成、精製及び分析
修飾及び非修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドのオリゴマー化は、ＤＮＡ（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｅｄ．Ａｇｒａｗａｌ（１９９３），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）及び／又はＲＮＡ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００１），２３，２０６−２１７．Ｇａｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ＲＮＡ ｉｎ ＲＮＡ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｅｄ．Ｓｍｉｔｈ（１９９８），１−３６．Ｇａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１），５７，５７０７−５７１３）についての文献に記載の手順に従って、常用的に実施することができる。
オリゴヌクレオチドなどの核酸は、固相合成の周知の技術によって好都合且つ常用的に製造することができる。こうした合成の装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を含む複数の供給業者により販売されている。当技術分野で公知であるこうした合成のための任意の他の手段を追加的又は代替的に使用し得る。類似の技術を用いて、ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製することはよく知られている。本発明は、合成の方法により限定されない。
核酸の精製及び分析の方法は、当業者に公知である。分析方法としては、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）及びエレクトロスプレー質量分析が挙げられる。こうした合成及び分析方法は、マルチウェルプレートで実施することができる。本発明の方法は、オリゴマー精製方法により限定されない。
オリゴヌクレオチドなどの核酸は、液相若しくは固相有機合成を用いて、又は当技術分野で公知の方法により酵素を用いて調製することもできる。有機合成は、非天然又は修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を容易に調製することができるという利点を提供する。当技術分野で公知のこうした合成のための任意の他の手段を追加的又は代替的に使用し得る。類似の技術を用いて、糖間結合のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート及びアルキル化誘導体を含むものなど、他の核酸を調製することも知られている。二本鎖核酸は、２ステップ法を用いて調製することができる。最初に、二本鎖分子の個々の鎖を別々に調製する。次に、構成鎖をアニーリングする。
合成の方法とは関係なく、核酸は、製剤化に適切な溶液（例えば、水及び／又は有機溶液）中で調製することができる。例えば、核酸調製物を沈殿させてから、純粋再蒸留水中に再溶解させた後、凍結乾燥させることができる。次に、乾燥させた核酸を、意図する製剤化方法に適した溶液に再懸濁させることができる。
特定の修飾核酸の合成に関する教示は、以下の米国特許又は係属中の特許出願に見出すことができる：ポリアミン共役オリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，１３８，０４５号明細書及び同第５，２１８，１０５号明細書；キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドの調製のためのモノマーに関する米国特許第５，２１２，２９５号明細書；修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，３７８，８２５号明細書及び同第５，５４１，３０７号明細書；骨格修飾オリゴヌクレオチド及び還元性カップリングによるその調製に関する米国特許第５，３８６，０２３号明細書；３−デアザプリン環系に基づく修飾核酸塩基及びその合成方法に関する米国特許第５，４５７，１９１号明細書；Ｎ−２置換プリンに基づく修飾核酸塩基に関する米国特許第５，４５９，２５５号明細書；キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドを調製するための方法に関する米国特許第５，５２１，３０２号明細書；ペプチド核酸に関する米国特許第５，５３９，０８２号明細書；βラクタム骨格を有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，５５４，７４６号明細書；オリゴヌクレオチドの合成のための方法及び材料に関する米国特許第５，５７１，９０２号明細書；アルキルチオ基を有するヌクレオシド（このような基は、ヌクレオシドの様々な位置のいずれかに結合した他の部分に対するリンカーとして使用することができる）に関する米国特許第５，５７８，７１８号明細書；高キラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，５８７，３６１号明細書及び同第５，５９９，７９７号明細書；２’−Ｏ−アルキルグアノシン及び関連化合物（２，６−ジアミノプリン化合物など）の調製方法に関する米国特許第５，５０６，３５１号明細書；Ｎ−２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，５８７，４６９号明細書；３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，５８７，４７０号明細書；いずれも共役４’−デスメチルヌクレオシド類似体に関する米国特許第５，２２３，１６８号明細書及び米国特許第５，６０８，０４６号明細書；骨格修飾オリゴヌクレオチド類似体に関する米国特許第５，６０２，２４０号明細書及び同第５，６１０，２８９号明細書；並びにとりわけ２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドの合成方法に関する米国特許第６，２６２，２４１号明細書及び同第５，４５９，２５５号明細書。
医薬組成物を製剤化するための組成物及び方法
リガンド又は多標的分子と共役されたエフェクター分子は、医薬組成物又は製剤の調製のために、薬学的に許容される活性及び／又は不活性物質と混合することができる。医薬組成物の製剤化のための組成物及び方法は、限定しないが、投与経路、疾患の程度又は投与しようとする用量などのいくつかの基準に左右される。
リガンド又は多標的分子と共役されたエフェクター分子は、このようなオリゴマー化合物を好適な薬学的に許容される希釈剤又は担体と組み合わせることにより、医薬組成物において使用することができる。薬学的に許容される希釈剤としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）がある。ＰＢＳは、非経口で送達しようとする組成物に使用するのに好適な希釈剤である。従って、一部の実施形態では、本明細書に開示するリンカーを介してリガンドと結合されるエフェクター分子及び薬学的に許容される希釈剤を含む医薬組成物が本明細書に記載する方法に使用される。一部の実施形態では、多標的分子及び薬学的に許容される希釈剤を含む医薬組成物が本明細書に記載する方法に使用される。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される希釈剤は、ＰＢＳである。
多標的分子を含む医薬組成物は、任意の薬学的に許容される塩、エステル又はこうしたエステルの塩を含む。いくつかの実施形態では、多標的分子を含む医薬組成物は、ヒトなどの動物に投与されると、生物学的に活性の代謝物又はその残基を（直接若しくは間接的に）付与することができる１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを含む。従って、例えば、本開示は、アンチセンス化合物の薬学的に許容される塩、プロドラッグ、こうしたプロドラッグの薬学的に許容される塩並びに他の生物学的均等物にも関する。好適な薬学的に許容される塩として、限定しないが、ナトリウム及びカリウム塩がある。
プロドラッグは、活性分子を形成するために、身体内で内在性ヌクレアーゼにより切断される多標的分子の一方又は両方の末端に別のヌクレオシドの組み込みを含むことができる。
本発明の医薬組成物は、局所又は全身治療のいずれが要望されるか、及び治療しようとする部位に応じて様々な方法で投与することができる。投与は、局所（例えば、経皮パッチにより）、肺、例えばネブライザーなどを用いて、粉末若しくはエアゾールの吸入又は通気により；気管内、鼻内、表皮及び経皮、経口若しくは非経口であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射又は注入；皮下、例えば埋込型デバイスにより；又は頭蓋内、例えば実質内、髄腔内若しくは脳室内投与が挙げられる。多標的分子は、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）などの特定の組織をターゲティングするように送達することができる。
局所投与のための医薬組成物及び製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴薬、坐薬、スプレー、液体及び粉末を挙げることができる。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが必要となるか、又は望ましい場合がある。また、コーティングされたコンドーム、手袋なども有用となり得る。好適な局所製剤として、本発明の主題である多標的分子が、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤及び界面活性剤などの局所送達剤と混合されているものが挙げられる。好適な脂質及びリポソームとして、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）及びカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明の主題である多標的分子は、リポソーム中に封入するか、又はそれと、特にカチオン性リポソームと複合体を形成し得る。或いは、多標的分子を脂質、特にカチオン性脂質と複合体化し得る。好適な脂肪酸及びエステルとして、限定しないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸エステル、トリカプリン酸エステル、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸エステル、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン又はＣ１〜２０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリスチン酸エステルＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、これらの又は薬学的に許容される塩が挙げられる。局所製剤は、米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
研究され、薬剤の製剤化のために使用されているマイクロエマルション以外にも多くの組織化された界面活性剤構造がある。これらは、単層、ミセル、二層及び小胞を含む。リポソームなどの小胞は、薬剤送達の観点からそれらが提供するその特異性及び作用の持続性のために大きい関心を集めている。本発明に使用されるとき、用語「リポソーム」は、球状二層又は二層内に配置される両親媒性脂質から構成される小胞を意味する。
リポソームは、親油性物質及び水性の内部から形成される膜を有する単層又は多層小胞である。水性部分は、送達しようとする組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁に効率的に融合することはできないが、インビボでマクロファージにより取り込まれる。
リポソームのさらなる利点は、以下の通りである：天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性及び生分解性であること；リポソームは、多様な水及び脂溶性薬剤を取り込み得ること；リポソームは、その内部コンパートメント内に封入された薬剤を代謝及び分解から保護し得ること（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製で重要な考慮事項は、脂質表面電荷、小胞サイズ及びリポソームの含水量である。
リポソームは、作用部位への活性成分の輸送及び送達に有用である。リポソーム膜は、構造的に生物膜と類似していることから、リポソームを組織に適用すると、リポソームは、細胞膜と融合し始め、リポソームと細胞の融合が進行するにつれ、リポソームの内容物は、細胞中に移され、そこで活性剤が作用し得る。
リポソーム製剤は、多くの薬剤の送達方法として広範囲にわたる研究の対象であった。局所投与の場合、リポソームは、他の製剤に対していくつかの利点を提供するというエビデンスが増えている。このような利点には、投与された薬剤の高度全身吸収に関連する副作用の低減、要望される標的部位での投与薬剤の蓄積増大並びに親水性及び疎水性両方の多様な薬剤を皮膚中に投与する能力が含まれる。
複数の報告が、高分子量ＤＮＡを含む薬剤を皮膚中に送達するリポソームの能力について詳述している。鎮痛薬、抗体、ホルモン及び高分子量ＤＮＡを含む化合物が皮膚に送達されている。ほとんどの場合、適用によって上面表皮のターゲティングが達成された。
リポソームは、２つの大きいクラスに分けられる。カチオン性リポソームは、陽荷電リポソームであり、陰荷電ＤＮＡ分子と相互作用して、安定した複合体を形成する。陽荷電ＤＮＡ／リポソーム複合体は、陰荷電細胞表面に結合し、エンドソーム内に内在化される。エンドソーム内は酸性ｐＨであるため、リポソームは破壊され、その内容物を細胞質中に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
ｐＨ感受性又は陰荷電であるリポソームは、ＤＮＡと複合体化するのではなく、ＤＮＡを捕捉する。ＤＮＡと脂質は、いずれも同様に荷電していることから、複合体形成ではなく、反発が起こる。それでも、一部のＤＮＡは、これらのリポソームの水性内部に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養中の細胞単層に送達するために用いられている。外来遺伝子の発現が標的細胞内で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。
１つの主要なタイプのリポソーム組成物は、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、アニオン性融合性リポソームは、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えば、ダイズＰＣ及び卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別のタイプは、リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物から形成される。
いくつかの研究では、皮膚へのリポソーム薬製剤の局所送達を評価している。インターフェロンを含有するリポソームをモルモットの皮膚に適用したところ、皮膚ヘルペスの軽減が達成されたのに対し、他の手段（例えば、溶液又はエマルションとして）によるインターフェロンの送達は有効ではなかった（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，２，４０５−４１０）。さらに、別の研究では、水性系を用いたインターフェロンの投与に対して、リポソーム製剤の一部として投与されるインターフェロンの効力を試験し、リポソーム製剤は、水性投与より優れているという結論が出された（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，１８，２５９−２６５）。
ノニオン性リポソーム系も、特にノニオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系が皮膚への薬剤送達における有用性を決定するために試験されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含むノニオン性リポソーム製剤が、マウス皮膚の真皮にシクロスポリン−Ａを送達するために使用された。結果から、こうしたノニオン性リポソーム系が、皮膚の様々な層へのシクロスポリン−Ａの沈着を促進する上で有効であることが分かった（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
リポソームは、「立体安定化」リポソームも含み、この用語は、本明細書で使用されるとき、１種又は複数の特殊化脂質を含むリポソームを指し、これらの脂質は、リポソームに組み込まれると、このような特殊化脂質のないリポソームと比較して循環寿命の増加をもたらす。立体安定化リポソームの例として、リポソームの小胞体形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つ又は複数の糖脂質を含むもの、又は（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１種又は複数の親水性ポリマーと誘導体化したものがある。特定の理論に拘束されることは意図しないが、当技術分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン又はＰＥＧ−誘導体化脂質を含有する立体安定化リポソームについて、これらの立体安定化リポソームの循環寿命の増加は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への取り込み低減によるものと考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
１種又は複数の糖脂質を含む様々なリポソームが当技術分野において公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、リポソームの血中半減期を向上させるモノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシド硫酸及びホスファチジルイノシトールの能力を報告している。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）により詳細に説明されている。米国特許第４，８３７，０２８号明細書及び国際公開第８８／０４９２４号パンフレット（いずれもＡｌｌｅｎらによる）は、（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧＭ１又はガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号明細書（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームが、国際公開第９７／１３４９９号パンフレット（Ｌｉｍら）に開示されている。
１種又は複数の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム及びその調製方法が当技術分野で公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は、ＰＥＧ部分を含有するノニオン性洗剤、２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームを記載している。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）は、ポリマーグリコールによるポリスチレン粒子の親水性コーティングにより、血中半減期が有意に増加したことを記載している。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボン酸基の結合により修飾された合成リン脂質が、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号明細書及び同第４，５３４，８９９号明細書）により記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）は、ＰＥＧで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）又はステアリン酸ＰＥＧを含むリポソームが、血中循環半減期の有意な増加を有することを立証する実験を記載している。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）は、こうした観察を、他のＰＥＧ−誘導体化リン脂質、例えばジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧとの組合せから形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧまで拡大した。外側表面に共有結合したＰＥＧ部分を有するリポソームが、Ｆｉｓｈｅｒの欧州特許第０ ４４５ １３１ Ｂ１号明細書及び国際公開第９０／０４３８４号パンフレットに記載されている。ＰＥＧで誘導体化されたＰＥを１〜２０モルパーセント含有するリポソーム組成物及びその使用方法が、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号明細書及び同第５，３５６，６３３号明細書）及びＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号明細書及び欧州特許第０ ４９６ ８１３ Ｂ１号明細書）によって記載されている。いくつかの他の脂質−ポリマーコンジュゲートを含むリポソームが、国際公開第９１／０５５４５号パンフレット及び米国特許第５，２２５，２１２号明細書（いずれもＭａｒｔｉｎら）及び国際公開第９４／２００７３号パンフレット（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームが、国際公開第９６／１０３９１号パンフレット（Ｃｈｏｉら）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号明細書（Ｍｉｙａｚａｋｉら）及び米国特許第５，５５６，９４８号明細書（Ｔａｇａｗａら）は、その表面で機能性部分とさらに誘導体化することができるＰＥＧ含有リポソームを記載している。
核酸を含むいくつかのリポソームが当技術分野で知られている。Ｔｈｉｅｒｒｙらの国際公開第９６／４００６２号パンフレットは、高分子量核酸をリポソームに封入するための方法を開示している。Ｔａｇａｗａらの米国特許第５，２６４，２２１号明細書は、タンパク質結合リポソームを開示し、こうしたリポソームの内容物がｄｓＲＮＡを含み得ることを主張する。Ｒａｈｍａｎらの米国特許第５，６６５，７１０号明細書は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソームに封入する特定の方法を記載する。Ｌｏｖｅらの国際公開第９７／０４７８７号パンフレットは、ｒａｆ遺伝子にターゲティングされたｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示する。
トランスファーソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、また別のタイプのリポソームであり、高度に変形可能な脂質凝集体であり、薬剤送達ビヒクルの魅力的な候補である。トランスファーソームは、脂肪滴と表現することができ、これは、高度に変形可能であるため、この脂肪滴より小さい孔を容易に透過することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応することができ、例えば自己最適化し（皮膚の孔の形状に適応性）、自己修復し、多くの場合、断片化せずにその標的に到達すると共に自己充填することが多い。トランスファーソームを製造するために、表面端活性剤、通常、界面活性剤を標準的リポソーム組成物に添加することができる。トランスファーソームは、皮膚に血清アルブミンを送達するために使用されている。トランスファーソーム媒介による血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同程度に有効であることが判明している。
研究ツール
いくつかの事例では、遺伝子発現を調節することが可能なオリゴヌクレオチドは、研究ツールとして使用されている。例えば、特定の遺伝子産物の機能を調べている研究者らは、細胞又は動物に存在するその遺伝子産物の量を低減するオリゴヌクレオチドを設計し、細胞又は動物における表現型変化を観察することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞又は動物における２つの異なる標的の量を低減するための方法を提供する。一部の実施形態では、２つの異なる標的は、２つの異なる遺伝子又は遺伝子産物であり得る。一部の実施形態では、２つの異なる標的は、同じ遺伝子又は遺伝子産物であり得る。いくつかの実施形態では、試験者らは、タンパク質又は非翻訳核酸を特性決定するために、こうした技術を使用することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子産物及び／又はいくつかの細胞機能の動力学及び／又はターンオーバを調べるために、こうした実験を使用する。一部の実施形態では、異なる遺伝子又は遺伝子産物間の関係又は相互関係を調べるために、こうした実験を使用する。
キット
いくつかの実施形態では、本発明は、１種又は複数の多標的分子を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、こうしたキットは、治療用途のために意図される。いくつかの実施形態では、こうしたキットは、研究用途のために意図される。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載するリンカーを介してリガンドと共役された少なくとも１つのエフェクター分子を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、こうしたキットは、治療用途のために意図される。いくつかの実施形態では、こうしたキットは、研究用途のために意図される。
本明細書に記載する特定の化合物、組成物及び方法をいくつかの実施形態に従って詳細に説明してきたが、以下の実施例は、本明細書に記載する化合物を説明するために用いるに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。本願で引用される参照文献、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号などは、それぞれ全体として参照により本明細書に組み込まれる。
定義
具体的な定義が記載されていない限り、本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、並びに医学及び薬化学に関連して使用される名称、並びにそれらの手順及び技術は、当技術分野でよく知られ、且つ一般に使用されているものである。化学合成及び化学分析のために標準的技術を使用することができる。いくつかのこうした技術及び手順は、例えば、“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓａｎｇｖｉ ａｎｄ Ｃｏｏｋ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９９４；“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０；及び“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓｔａｎｌｅｙ Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．；及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に見出すことができ、これらは、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。認められる限り、本開示で言及される全ての特許、出願、公開出願並びに他の刊行物及び他のデータは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
別に指示されていない限り、下記の用語は下記の意味を有する。
本明細書で使用されるとき、用語「標的核酸」は、発現又は活性がｓｉＲＮＡ化合物により調節され得る任意の核酸分子を指す。標的核酸として、限定しないが、標的タンパク質をコードするＤＮＡから転写されるＲＮＡ（限定しないが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡ又はその部分を含む）並びにそのようなＲＮＡから得られるｃＤＮＡ及びｍｉＲＮＡが挙げられる。例えば、標的核酸は、その発現が特定の障害若しくは病態と関連する細胞遺伝子（又は遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）であり得る。一部の実施形態では、標的核酸は、感染因子由来の核酸分子であり得る。
本明細書で使用されるとき、ＲＮＡ干渉分子による「遺伝子サイレンシング」は、標的遺伝子について、ｍｉＲＮＡ又はＲＮＡ干渉分子が存在しない細胞に見出されるｍＲＮＡレベルの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、１００％までを含む少なくとも約９９％及びこれらの間のあらゆる整数％の、細胞中のｍＲＮＡレベルの減少を指す。１つの好ましい実施形態では、ｍＲＮＡレベルは、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、１００％までを含む少なくとも約９９％及び５％〜１００％のあらゆる整数％だけ減少される。
本明細書で使用されるとき、用語「遺伝子発現を調節する」は、１種又は複数のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現又はＲＮＡ分子若しくは均等なＲＮＡ分子のレベルを上方制御又は下方制御して、発現、レベル若しくは活性がモジュレータの非存在下で観察されるものより高く又は低くなるようにすることを意味する。例えば、用語「調節する」は、「阻害する」を意味し得るが、用語「調節する」の使用は、この定義に限定されない。
本明細書で使用されるとき、遺伝子発現調節は、１種又は複数のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現又はＲＮＡ分子若しくは均等なＲＮＡ分子のレベルが、ｓｉＲＮＡ、例えばＲＮＡｉ剤の非存在下で観察されるものと少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍以上異なる場合に起こる。％及び／又は倍率差は、例えば、対照又は非対照に対して、以下のように計算することができる。
Figure 2020505032
本明細書で使用されるとき、遺伝子発現に関して、「阻害する」、「下方制御する」又は「低減する」という用語は、１種又は複数のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、又はＲＮＡ分子若しくは均等なＲＮＡ分子のレベル、又は１種又は複数のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性がモジュレータの非存在下で観察されるものより低く低減されることを意味する。１種又は複数のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、又はＲＮＡ分子若しくは均等なＲＮＡ分子のレベル、又は１種又は複数のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が、対応する非調節対照に比べ少なくとも１０％低く、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又は最も好ましくは１００％（すなわち遺伝子発現がない）だけ低く低減される場合、遺伝子発現は下方制御される。
本明細書で使用されるとき、遺伝子発現に関して、「増加する」又は「上方制御する」という用語は、１種又は複数のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、又はＲＮＡ分子若しくは均等なＲＮＡ分子のレベル、又は１種又は複数のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性がモジュレータの非存在下で観察されるものより高く増加されることを意味する。１種又は複数のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、又はＲＮＡ分子若しくは均等なＲＮＡ分子のレベル、又は１種又は複数のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が、対応する非調節対照に比べ、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、１００％、１．１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍以上増加される場合、遺伝子発現は上方制御される。
本明細書で使用されるとき、用語「増加した」又は「増加する」は、概して、統計的に有意な量の増加を意味し；誤解を避けるために、「増加した」は、基準レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば基準レベルと比較して少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％又は１００％以下の増加又は１０〜１００％のあらゆる増加或いは基準レベルと比較して少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍又は少なくとも約１０倍の増加、又は２倍〜１０倍以上のあらゆる増加を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「低減した」又は「低減する」は、概して、統計的に有意な量の減少を意味する。しかしながら、誤解を避けるために、「低減した」は、基準レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば基準レベルと比較して少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％又は１００％（すなわち基準サンプルと比較してゼロレベル）以下の減少、又は１０〜１００％のあらゆる減少を意味する。
「特異的にハイブリダイズ可能な」及び「相補的な」は、核酸が、伝統的なワトソン−クリック又は他の非伝統的タイプのいずれかにより、別の核酸配列と水素結合を形成し得ることを意味する。本発明の核酸分子に関連して、核酸分子とその相補的配列との結合自由エネルギーは、核酸の関連機能、例えばＲＮＡｉ活性を進行させるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は、当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８７，ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，／．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照されたい）。相補性パーセントは、第２核酸配列と、水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対合）を形成することができる核酸分子中の連続した残基のパーセンテージ（例えば、１０のうちの５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％相補的である）を示す。「完全に相補的」又は１００％相補性とは、核酸配列の連続した残基の全てが、第２核酸配列中の同数の連続した残基と水素結合することを意味する。完全ではない相補性は、２つの鎖の一部（全部ではない）のヌクレオシド単位が互いに水素結合することができる状況を指す。「実質的な相補性」は、非相補的であるように選択されたポリヌクレオチド鎖の領域（例えば、突出部）を除いて、９０％以上の相補性を呈示するポリヌクレオチド鎖を指す。特異的結合には、特異的結合が要望される条件下、すなわちインビボアッセイ若しくは治療処置の場合、生理学的条件下で、又はインビトロアッセイの場合、アッセイが実施される条件下で、非標的配列とオリゴマー化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が必要である。非標的配列は、典型的に、少なくとも５ヌクレオチド異なる。
用語「オフターゲット」及び語句「オフターゲット効果」は、所与の標的に対するエフェクター分子が、別の標的配列、ＤＮＡ配列又は細胞タンパク質若しくは他の部分と直接若しくは間接的のいずれかで相互作用することにより、意図しない作用を引き起こすあらゆる事例を指す。例えば、「オフターゲット効果」は、他の転写物と、ｓｉＲＮＡのセンス及び／又はアンチセンス鎖との間の部分的な相同性又は相補性により、他の転写物の同時分解が生じるときに起こり得る。
本明細書で使用されるとき、用語「ヌクレオシド」は、核酸塩基及び糖を含むグリコシルアミンを意味する。ヌクレオシドとして、限定しないが、天然に存在するヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド並びに模擬塩基及び／又は糖基を有するヌクレオシドが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、用語「ヌクレオチド」は、核酸塩基と、リン酸基が共有結合した糖とを含むグリコソミン（ｇｌｙｃｏｓｏｍｉｎｅ）を指す。ヌクレオチドは、様々な置換基のいずれかで修飾され得る。
本明細書で使用されるとき、用語「核酸塩基」は、ヌクレオシド又はヌクレオチドの塩基部分を指す。核酸塩基は、別の核酸の塩基に水素結合することができる任意の原子又は原子団を含み得る。
本明細書で使用されるとき、用語「複素環式塩基部分」は、複素環を含む核酸塩基を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「オリゴマー化合物」は、２つ以上のサブ構造を含み、核酸分子の領域とハイブリダイズすることができるポリマー構造を指す。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、オリゴヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、アンチセンス化合物である。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、解毒剤化合物である。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、コンジュゲート基を含む。
本明細書で使用されるとき、「オリゴヌクレオシド」は、ヌクレオシド間結合が、リン原子を含有しないオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の連結ヌクレオシドを含むオリゴマー化合物を指す。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの１つ又は複数のヌクレオチドは、修飾されている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、天然及び／又は若しくは非天然核酸塩基、糖及び共有結合ヌクレオシド間結合から構成され、さらに非核酸コンジュゲートを含み得る。
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド間結合」は、隣接するヌクレオシド同士の共有結合を指す。
本明細書で使用されるとき、「天然に存在するヌクレオシド間結合」は、３’−５’リン酸ジエステル結合を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「ｓｉＲＮＡ性を検出する」又は「ｓｉＲＮＡ活性を測定する」は、ｓｉＲＮＡ活性を検出又は測定するための試験が特定のサンプルについて実施され、対照サンプルのものと比較されることを意味する。このような検出及び／又は測定は、ゼロの値を含み得る。従って、ｓｉＲＮＡ活性の検出のための試験の結果、ｓｉＲＮＡ活性がないこと（ゼロのｓｉＲＮＡ活性）が判明する場合でも、「ｓｉＲＮＡ活性を検出する」ステップはやはり実施されている。
本明細書で使用されるとき、用語「対照サンプル」は、リポータオリゴマー化合物と接触させていないサンプルを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「モチーフ」は、オリゴマー化合物中の非修飾及び修飾ヌクレオチドのパターンを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「キメラオリゴマー」は、同じオリゴマー化合物内の少なくとも１つの他の糖、核酸塩基又はヌクレオシド間結合と比較して、異なる様式で修飾されている少なくとも１つの糖、核酸塩基又はヌクレオシド間結合を有するオリゴマー化合物を指す。糖、核酸塩基及びヌクレオシド間結合の残りは、独立に修飾されていても又は非修飾であり得、同じか又は異なり得る。
本明細書で使用されるとき、用語「キメラオリゴヌクレオチド」は、同じオリゴヌクレオチド内の少なくとも１つの他の糖、核酸塩基又はヌクレオシド間結合と比較して、異なる様式で修飾されている少なくとも１つの糖、核酸塩基又はヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを指す。糖、核酸塩基及びヌクレオシド間結合の残りは、独立に修飾されていても又は非修飾であり得、同じか又は異なり得る。
本明細書で使用されるとき、用語「混合骨格オリゴマー化合物」は、オリゴマー化合物の少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、オリゴマー化合物の少なくとも１つの他のヌクレオシド間結合と異なるオリゴマー化合物を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「標的タンパク質」は、調節が望まれるタンパク質を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「標的遺伝子」は、標的タンパク質をコードする遺伝子を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「ターゲティングする」又は「ターゲティングされる」は、特定の標的核酸分子又は標的核酸分子内のヌクレオチドの特定の領域に対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の会合を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「核酸塩基相補性」は、別の核酸塩基と塩基対合することができる核酸塩基を指す。例えば、ＤＮＡでは、アデニン（Ａ）は、チミン（Ｔ）と相補的である。例えば、ＲＮＡでは、アデニン（Ａ）は、ウラシル（Ｕ）と相補的である。いくつかの実施形態では、相補的核酸塩基は、その標的核酸の核酸塩基と塩基対合することができるアンチセンス化合物の核酸塩基を指す。例えば、アンチセンス化合物の特定の位置の核酸塩基が標的核酸の特定の位置の核酸塩基と水素結合することができれば、オリゴヌクレオチドと標的核酸との水素結合の位置は、その核酸塩基対で相補的であるとみなされる。
本明細書で使用されるとき、用語「非相補的核酸塩基」は、互いに水素結合を形成しないか、或いはハイブリダイゼーションを支持しない核酸塩基の対を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「相補的」は、別のオリゴマー化合物又は核酸と核酸塩基相補性によってハイブリダイズするオリゴマー化合物の能力を指す。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物とその標的とは、各分子内で十分な数の対応する位置が、互いに結合することができる核酸塩基によって占められて、アンチセンス化合物と標的との安定した会合を可能にするとき、互いに相補的である。当業者であれば、会合を維持するオリゴマー化合物の能力を排除することなく、ミスマッチの含有が可能であることは認識される。従って、ミスマッチである（すなわち標的の対応ヌクレオチドに対して相補的な核酸塩基ではない）最大約２０％のヌクレオチドを含み得るオリゴマー化合物（例えば、ｓｉＲＮａ、多標的分子など）が本明細書に記載される。好ましくは、ｓｉＲＮＡ及び多標的分子などのオリゴマー化合物は、約１５％以下、より好ましくは約１０％以下、最も好ましくは５％以下のミスマッチを含有するか、又はミスマッチを一切含有しない。残りのヌクレオチドは、相補的核酸塩基であるか、或いはハイブリダイゼーションを破壊しない（例えば、ユニバーサル塩基）。当業者であれば、本明細書において提供される化合物は、標的核酸に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％相補的であることは認識されるであろう。
本明細書で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」は、相補的オリゴマー化合物（例えば、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とその標的核酸又はｓｉＲＮＡとのアンチセンス鎖及びセンス鎖）の対合を意味する。特定の機構に限定されないが、対合の最も一般的機構は、相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基（核酸塩基）同士の水素結合を含み、これは、ワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）型、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）型若しくは逆フーグスティーン（ｒｅｖｅｒｓｅｄ Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）型水素結合であり得る。例えば、天然の塩基アデニンは、水素結合の形成を介して対合する天然の核酸塩基チミジン及びウラシルと相補的な核酸塩基である。天然の塩基グアニンは、天然の塩基シトシン及び５−メチルシトシンと相補的な核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、様々な状況下で起こり得る。
本明細書で使用されるとき、用語「特異的にハイブリダイズする」は、オリゴマー化合物が１つの核酸部位に、他の核酸部位とハイブリダイズするよりも高い親和性でハイブリダイズする能力を指す。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、２つ以上の標的部位に特異的にハイブリダイズする。
本明細書で使用されるとき、「設計する」又は「設計される」は、選択された核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴマー化合物を設計するプロセスを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「調節」は、調節前の機能又は活性のレベルと比較した機能又は活性の摂動を指す。例えば、調節は、遺伝子発現の変化、すなわち増大（刺激若しくは誘導）又は低減（阻害若しくは抑制）のいずれかを含む。別の例として、発現の調節は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡプロセシングのスプライス部位選択の摂動を含み得る。
本明細書で使用されるとき、用語「発現」は、遺伝子のコードされた情報が、細胞内に存在し、且つ作動する構造へと変換されるあらゆる機能及びステップを指す。こうした構造として、限定しないが、転写及び翻訳の産物が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「変異体」は、ＤＮＡの同じゲノム領域から生成され得る別のＲＮＡ転写物を指す。変異体として、限定しないが、「ｐｒｅ−ｍＲＮＡ変異体」があり、これは、同じゲノムＤＮＡから生成される転写物であり、同じゲノムＤＮＡから生成される他の転写物とその開始位置又は終止位置のいずれかが異なり、イントロン及びエキソン配列の両方を含む。変異体には、限定しないが、別のスプライス部位又は別の開始及び終止コドンを有するものもある。
本明細書で使用されるとき、「高親和性修飾モノマー」は、天然に存在するモノマーと比較して、少なくとも１つの修飾核酸塩基、ヌクレオシド間結合又は糖部分を有し、この修飾が、その標的核酸に対する高親和性修飾モノマーを含むアンチセンス化合物の親和性を高めるようなモノマーを指す。高親和性修飾として、限定しないが、２’−修飾糖を含むモノマー（例えば、ヌクレオシド及びヌクレオチド）がある。
本明細書で使用されるとき、用語「２’−修飾」又は「２’−置換」は、Ｈ又はＯＨ以外の２’位に置換基を含む糖を意味する。２’−修飾モノマーとして、限定しないが、２’−置換基、例えばアリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）又はＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）を有するＢＮＡ及びモノマー（例えば、ヌクレオシド及びヌクレオチド）が挙げられ、ここで、各Ｒｍ及びＲｎが、独立に、Ｈ又は置換若しくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、式２’−Ｏ（ＣＨ２）ｎＨ（ここで、ｎが１〜６である）がない２’修飾モノマーを含む。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、式２’−ＯＣＨ３がない２’修飾モノマーを含む。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、上記式又は別の実施形態では２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３がない２’修飾モノマーを含む。
本明細書で使用されるとき、用語「ロックド核酸」又は「ＬＮＡ」又は「ロックドヌクレオシド」又は「ロックドヌクレオチド」は、ヌクレオシドのフラノース部分が、フラノース環上の２つの炭素原子を連結する架橋を含み、それにより二環式系を形成するヌクレオシド又はヌクレオチドを指す。ロックド核酸は、二環式核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる。
本明細書で使用されるとき、別に指示されない限り、用語「メチレンオキシＬＮＡ」は、単独でβ−Ｄ−メチレンオキシＬＮＡを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「ＭＯＥ」は、２’−Ｏ−メトキシエチル置換基を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「ギャップマー」は、中央領域（「ギャップ」）と、中央領域のいずれかの側の領域（「ウィング」）とを含むキメラオリゴマー化合物を指し、ここで、ギャップは、各ウィングと異なる少なくとも１つの修飾を含む。このような修飾としては、核酸塩基、モノマー結合及び糖修飾並びに修飾の非存在（非修飾）がある。従って、いくつかの実施形態では、ウィングの各々におけるヌクレオチド結合は、ギャップ内のヌクレオチド結合と異なる。いくつかの実施形態では、各ウィングは、高親和性修飾を有するヌクレオチドを含み、ギャップは、その修飾を含まないヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ギャップ内のヌクレオチド及びウィング内のヌクレオチドは、全て高親和性修飾を含むが、ギャップ内の高親和性修飾は、ウィング内の高親和性修飾と異なる。いくつかの実施形態では、ウィング内の修飾は、互いに同じである。いくつかの実施形態では、ウィング内の修飾は、互いに異なる。いくつかの実施形態では、ギャップ内のヌクレオチドは、非修飾であり、ウィング内のヌクレオチドは、修飾されている。いくつかの実施形態では、各ウィング内の修飾は、同じである。いくつかの実施形態では、一方のウィング内の修飾は、他方のウィング内の修飾と異なる。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は、ギャップ内に２’−デオキシヌクレオチドを有し、且つウィング内に高親和性修飾を有するヌクレオチドを有するギャップマーである。
本明細書で使用されるとき、用語「プロドラッグ」は、内在性酵素又はその他の化学薬品及び／又は若しくは条件の作用により、身体又はその細胞内で活性形態（すなわち薬剤）へと変換される不活性形態で調製される治療剤を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容される塩」は、活性化合物の所望の生物活性を保持し、望ましくない毒物学的作用を付与しない活性化合物の塩を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「キャップ構造」又は「末端キャップ部分」は、アンチセンス化合物のいずれかの末端に組み込まれた化学修飾を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「予防」は、数時間から数日、好ましくは数週間から数ヵ月にわたって状態若しくは疾患の発症又は発生を遅延させるか、又は未然に防ぐことを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「改善」は、状態若しくは疾患の少なくとも１つの活性又は１つの重症度の指標の軽減を指す。指標の重症度は、当業者に公知の主観的又は客観的測度により決定することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「治療」は、疾患若しくは状態の変化又は改善をもたらすために、本発明の組成物を投与することを指す。予防、改善及び／又は治療は、疾患若しくは状態の経過を変化させるために、定期的間隔で又は状態若しくは疾患の発症前に複数回用量の投与を必要とし得る。さらに、状態若しくは疾患の予防、改善及び治療のためにそれぞれ１個体に単剤を順次又は同時に用い得る。
本明細書で使用されるとき、用語「医薬剤」は、対象に投与されるとき、治療利益をもたらす物質を指す。いくつかの実施形態では、医薬剤は、活性医薬剤である。いくつかの実施形態では、医薬剤は、プロドラッグである。
本明細書で使用されるとき、用語「治療有効量」は、動物に治療利益をもたらす医薬剤の量を指す。
本明細書で使用されるとき、「投与する」は、動物に医薬剤を提供することを意味し、限定しないが、医療専門家による投与及び自己投与を含む。
本明細書で使用されるとき、用語「共投与する」は、２種以上の医薬剤を動物に提供することを意味する。いくつかの実施形態では、こうした２種以上の医薬剤は、一緒に投与する。いくつかの実施形態では、こうした２種以上の医薬剤は、個別に投与する。いくつかの実施形態では、こうした２種以上の医薬剤は、同時に投与する。いくつかの実施形態では、こうした２種以上の医薬剤は、異なる時点で投与する。いくつかの実施形態では、こうした２種以上の医薬剤は、同じ投与経路により投与する。いくつかの実施形態では、こうした２種以上の医薬剤は、異なる投与経路により投与する。いくつかの実施形態では、こうした２種以上の医薬剤は、同じ医薬製剤に含有されている。いくつかの実施形態では、こうした２種以上の医薬剤は、個別の製剤の形態をしている。
本明細書で使用されるとき、用語「医薬組成物」は、個体に投与するのに好適な物質の混合物を指す。例えば、医薬組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び滅菌水溶液を含み得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、医薬剤と希釈剤及び／又は担体を含む。
本明細書で使用されるとき、用語「インビトロ」は、生物（例えば、動物又は植物）内ではなく、人工的環境、例えば試験管又は反応容器内、細胞培養内などで起こる事象を指す。本明細書で使用されるとき、用語「エクスビボ」は、生きた生物から取り出され、生物外部（例えば、試験管内）で培養される細胞を指す。本明細書で使用されるとき、用語「インビボ」は、生物（例えば、動物、植物及び／又は微生物）内で起こる事象を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「対象」又は「患者」は、例えば、実験、診断及び／又は治療を目的として、本明細書に開示の組成物を投与することができる任意の生物を指す。典型的な対象として、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類及びヒトなどの哺乳動物）及び／又は植物が挙げられる。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、家畜又は競技用動物などの脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル及びマカク、例えばアカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ）が挙げられる。げっ歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ及びハムスターが挙げられる。家畜及び競技用動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、スイギュウ、ネコ科種、例えば家ネコ、イヌ科種、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、鳥類種、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ並びに魚類、例えばマス、ナマズ及びサケが挙げられる。患者又は対象は、上に挙げた任意のサブセット、例えば前述の全てを含むが、ヒト、霊長類又はげっ歯類などの１つ又は複数の群若しくは種を除外する。本明細書に記載する態様のいくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。「患者」及び「対象」という用語は、本明細書では同義的に使用される。対象は、男性（雄）又は女性（雌）であり得る。
好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ又はウシであり得るが、これらの例に限定されるわけではない。ヒト以外の哺乳動物は、ヒトの疾患及び障害の動物モデルとなる対象として有利に使用することができる。さらに、本明細書に記載する化合物、組成物及び方法は、家畜及び／又はペットに用いることができる。
一部の実施形態では、対象は、ヒトである。別の実施形態では、対象は、疾患モデルとしての実験動物又は代用動物である。この用語は、特定の年齢又は性別を意味するわけではない。従って、男性（雄）又は女性（雌）にかかわらず、成体及び新生の対象並びに胎児が包含されることが意図される。対象の例として、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ及びマウスが挙げられる。対象という用語は、さらにトランスジェニック種を含むことも意図される。一部の実施形態では、対象は、欧州系であり得る。一部の実施形態では、対象は、アフリカ系アメリカ人であり得る。一部の実施形態では、対象は、アジア系であり得る。
ヒト身体に対して実施される方法の特許付与を禁止する管轄区域では、ヒト対象への組成物の「投与」の意味は、ヒト対象がいずれかの方法（例えば、経口、吸入、局所適用、注射、挿入など）により自己投与する規制物質を処方することに限定されることになる。特許を受けることができる主題を定義する法律又は規制に適合する最も広範且つ合理的な解釈が意図される。ヒト身体に対して実施される方法の特許付与を禁止しない管轄区域では、組成物の「投与」は、ヒト身体に対して実施される方法と、前述した活動との両方を包含する。
本明細書で使用されるとき、用語「非経口投与」は、注射又は注入による投与を指す。非経口投与として、限定しないが、皮下投与、静脈内投与又は筋肉内投与が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、用語「皮下投与」は、皮膚の直下への投与を指す。「静脈内投与」は、静脈への投与を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「用量」は、１回の投与で供給される医薬剤の指定量を指す。いくつかの実施形態では、１用量は、２回以上のボーラス、錠剤又は注射で投与され得る。例えば、皮下投与が望まれるいくつかの実施形態では、所望の用量は、１回の注射によって容易に供給できない量を必要とする。こうした実施形態では、２回以上の注射を用いて所望の用量を達成し得る。いくつかの実施形態では、１用量は、個体の注射部位反応を最小限にするために２回以上の注射で投与し得る。
本明細書で使用されるとき、用語「単位投与剤形」は、医薬剤が提供される形態を指す。いくつかの実施形態では、単位投与剤形は、凍結乾燥したアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むバイアルである。いくつかの実施形態では、単位投与剤形は、再構成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むバイアルである。
本明細書で使用されるとき、用語「医薬品有効成分」は、所望の効果を付与する医薬組成物中の物質を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「副作用」は、所望の効果以外の治療に起因すると考えられる生理反応を指す。いくつかの実施形態では、副作用として、限定しないが、注射部位反応、肝機能試験異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系異常及び筋障害が挙げられる。例えば、血清中のアミノトランスフェラーゼレベル上昇は、肝毒性又は肝機能異常を示し得る。例えば、ビリルビンの増加は、肝毒性又は肝機能異常を示し得る。
本明細書で使用されるとき、用語「アルキル」は、ここで使用される通り、最大２４個の炭素原子を含む飽和直鎖又は分岐状炭化水素ラジカルを指す。アルキル基の例として、限定しないが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｎ−ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシルなどが挙げられる。アルキル基は、典型的に、１〜約２４個の炭素原子、より典型的には１〜約１２個の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ１２アルキル）を含み、１〜約６個の炭素原子がより好ましい。本明細書で使用される用語「低級アルキル」は、１〜約６個の炭素原子を含む。本明細書で使用されるアルキル基は、任意選択で、１個又は複数の別の置換基を含み得る。
本明細書で使用されるとき、用語「アルケニル」は、ここで使用される通り、最大２４個の炭素原子を含み、且つ少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖又は分岐状炭化水素鎖ラジカルを指す。アルケニル基の例として、限定しないが、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イル、１，３−ブタジエンなどのジエンなどが挙げられる。アルケニル基は、典型的に、２〜約２４個の炭素原子、より典型的には２〜約１２個の炭素原子を含み、２〜約６個の炭素原子がより好ましい。本明細書で使用されるアルケニル基は、任意選択で、１個又は複数の別の置換基を含み得る。
本明細書で使用されるとき、用語「アルキニル」は、ここで使用される通り、最大２４個の炭素原子を含み、且つ少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖又は分岐状炭化水素ラジカルを指す。アルキニル基の例として、限定しないが、エチニル、１−プロピニル、１−ブチニルなどが挙げられる。アルキニル基は、典型的に、２〜約２４個の炭素原子、より典型的には２〜約１２個の炭素原子を含み、２〜約６個の炭素原子がより好ましい。本明細書で使用されるアルキニル基は、任意選択で、１個又は複数の別の置換基を含み得る。
本明細書で使用されるとき、用語「アミノアルキル」は、ここで使用される通り、アミノ置換アルキルラジカルを指す。この用語は、任意の位置にアミノ置換基を有するＣ１〜Ｃ１２アルキル基を含むことを意味し、ここで、アルキル基は、アミノアルキル基を親分子に結合する。アミノアルキル基のアルキル及び／又はアミノ部分は、置換基でさらに置換することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「脂肪族」は、ここで使用される通り、最大２４個の炭素原子を含み、いずれか２個の炭素原子間の飽和が単結合、二重結合若しくは三重結合である、直鎖又は分岐状炭化水素ラジカルを指す。脂肪族基は、好ましくは、１〜約２４個の炭素原子、より典型的には１〜約１２個の炭素原子を含み、１〜約６個の炭炭素原子がより好ましい。脂肪族基の直鎖又は分岐鎖は、窒素、酸素、硫黄及びリンを含む１個又は複数のヘテロ原子で分断され得る。ヘテロ原子で分断されたこのような脂肪族基として、限定しないが、ポリアルコキシ、例えばポリアルキレングリコール、ポリアミン及びポリイミンが挙げられる。本明細書で使用される脂肪族基は、任意選択で、別の置換基を含み得る。
本明細書で使用されるとき、用語「脂環式」又は「アリシクリル」は、環が脂肪族の環系を指す。この環系は、少なくとも１つの環が脂肪族である１つ又は複数の環を含み得る。好ましい脂環式化合物は、環内に約５〜約９個の炭素原子を有する環を含む。本明細書で使用される脂環式は、任意選択で、別の置換基を含み得る。本明細書で使用されるとき、用語「アルコキシ」は、ここで使用される通り、アルキル基と酸素原子との間に形成されるラジカルを指し、ここで、酸素原子は、アルコキシ基を親分子に結合するために用いられる。アルコキシ基の例として、限定しないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ネオペントキシ、ｎ−ヘキソキシなどが挙げられる。本明細書で使用されるアルコキシ基は、任意選択で、別の置換基を含み得る。本明細書で使用されるとき、用語「ハロ」及び「ハロゲン」は、ここで使用される通り、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択される原子を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「アリール」及び「芳香族」は、ここで使用される通り、１つ又は複数の芳香環を有する、単環若しくは多環式炭素環系ラジカルを指す。アリール基の例として、限定しないが、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニルなどが挙げられる。好ましいアリール環系は、１つ又は複数の環内に約５〜約２０個の炭素原子を有する。本明細書で使用されるアリール基は、任意選択で、別の置換基を含み得る。
本明細書で使用されるとき、用語「アラルキル」及び「アリールアルキル」は、ここで使用される通り、アルキル基とアリール基との間に形成されるラジカルを指し、ここで、アルキル基は、アラルキル基を親分子に結合するために用いられる。例として、限定しないが、ベンジル、フェネチルなどが挙げられる。本明細書で使用されるアラルキル基は、任意選択で、ラジカル基を形成するアルキル、アリール又はその両方の基に結合した別の置換基を含み得る。
本明細書で使用されるとき、用語「複素環式ラジカル」は、ここで使用される通り、少なくとも１つのヘテロ原子を含み、不飽和、部分的飽和若しくは完全飽和であり、従って、ヘテロアリール基を含む、ラジカル単環式若しくは多環式環系を指す。複素環式は、縮合環系を含むことも意味し、ここで、縮合環の１つ又は複数は、少なくとも１つのヘテロ原子を含み、他の環は、１つ又は複数のヘテロ原子を含有し得るか、或いは任意選択でヘテロ原子を含まない。複素環式基は、典型的に、硫黄、窒素又は酸素から選択される少なくとも１個の原子を含む。複素環式基の例として、［１，３］ジオキソラン、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルなどが挙げられる。本明細書で使用される複素環式基は、任意選択で、別の置換基を含み得る。本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロアリール」及び「ヘテロ芳香族」は、ここで使用される通り、環の少なくとも１つが芳香族であり、１個又は複数のヘテロ原子を含む、単環式若しくは多環式芳香環、環系又は縮合環系を含むラジカルを指す。ヘテロアリールは、縮合環系を含むことも意味し、これには、１つ又は複数の縮合環がヘテロ原子を含まない系が含まれる。ヘテロアリール基は、典型的に、硫黄、窒素又は酸素から選択される１個の環原子を含む。ヘテロアリール基の例として、限定しないが、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノキサリニルなどが挙げられる。ヘテロアリールラジカルは、直接又は脂肪族基若しくはヘテロ原子などの連結部分を介して親分子に結合することができる。本明細書で使用されるヘテロアリール基は、任意選択で、別の置換基を含み得る。
本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロアリールアルキル」は、ここで使用される通り、ヘテロアリールアルキル基を親分子に結合することができるアルキルラジカルを有する、既に定義した通りのヘテロアリール基を指す。例として、限定しないが、ピリジニルメチル、ピリミジニルエチル、ナフチリジニルプロピルなどが挙げられる。本明細書で使用されるヘテロアリールアルキル基は、任意選択で、ヘテロアリール又はアルキル部分の一方又は両方に別の置換基を含み得る。
本明細書で使用されるとき、用語「単環又は多環式構造」は、本発明で使用される通り、単環又は縮合若しくは連結された環を有する多環式である、全ての環系を包含し、脂肪族、脂環式、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アリールアルキル、複素環式、ヘテロアリール、ヘテロ芳香族、ヘテロアリールアルキルから個々に選択される単環又は混合環系を含むものとする。このような単環及び多環式構造は、均質であるか、又は完全飽和、部分的飽和若しくは完全不飽和などの様々な飽和度を有する環を含むことができる。各環は、Ｃ、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される環原子を含み、それにより複素環並びに混合モチーフに存在し得る唯一のＣ環原子のみを含む環、例えば１つの環が炭素環原子のみを有し、縮合環が２つの窒素原子を有するベンズイミダゾールを形成することができる。単環又は多環式構造は、例えば、環の１つに結合した２つの＝Ｏ基を有するフタルイミドなどの置換基でさらに置換することができる。別の態様では、単環又は多環式構造は、環原子を介して直接、置換基又は二官能価連結部分を介して親分子に結合することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「アシル」は、ここで使用される通り、有機酸からのヒドロキシル基の除去により形成されるラジカルを指し、一般式−Ｃ（Ｏ）−Ｘを有し、ここで、Ｘは、典型的には脂肪族、脂環式又は芳香族である。例として、脂肪族カルボニル、芳香族カルボニル、脂肪族スルホニル、芳香族スルフィニル、脂肪族スルフィニル、芳香族リン酸エステル、脂肪族リン酸エステルなどが挙げられる。本明細書で使用されるアシル基は、任意選択で別の置換基を含み得る。
本明細書で使用されるとき、用語「ヒドロカルビル」は、Ｃ、Ｏ及びＨを含む基を含む。任意の飽和度を有する直鎖、分岐状及び環状基が含まれる。こうしたヒドロカルビル基は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含み得、１つ又は複数の置換基でさらに一又は多置換され得る。
本明細書で使用されるとき、用語「置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）」及び「置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ ｇｒｏｕｐ）」は、ここで使用される通り、所望の特性を増強する、又は所望の効果を付与するために、他の基若しくは親化合物に典型的に付加される基を含む。置換基は、保護若しくは非保護のいずれでもあり得、親化合物内の１つの利用可能な部位又は多数の利用可能な部位に付加され得る。置換基も他の置換基でさらに置換され得、直接又はアルキル若しくはヒドロカルビル基などの結合基を介して親化合物に結合され得る。このような基として、限定しないが、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル（−Ｃ（Ｏ）Ｒａａ）、カルボキシル（−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａａ）、脂肪族基、脂環式基、アルコキシ、置換オキソ（−Ｏ−Ｒａａ）、アリール、アラルキル、複素環式、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アミノ（−ＮＲｂｂＲｃｃ）、イミノ（＝ＮＲｂｂ）、アミド（−Ｃ（Ｏ）Ｎ−ＲｂｂＲｃｃ又は−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｏ）Ｒａａ）、アジド（−Ｎ３）、ニトロ（−ＮＯ２）、シアノ（−ＣＮ）、カルバミド（−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｂｂＲｃｃ又は−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｏ）ＯＲａａ）、ウレイド（−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｏ）ＮＲｂｂＲｃｃ）、チオウレイド（−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｓ）ＮＲｂｂＲｃｃ）、グアニジニル（−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＮＲｂｂＲｃｃ）、アミジニル（−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）−ＮＲｂｂＲｃｃ又は−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（ＮＲｂｂ）Ｒａａ）、チオール（−ＳＲｂｂ）、スルフィニル（−Ｓ（Ｏ）Ｒｂｂ）、スルホニル（−Ｓ（Ｏ）２Ｒｂｂ）、スルホンアミジル（−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｂｂＲｃｃ又は−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｓ（Ｏ）２Ｒｂｂ）及びコンジュゲート基が挙げられる。各Ｒａａ、Ｒｂｂ及びＲｃｃは、独立に、Ｈ、任意選択で連結された化学官能基又は別の置換基であり、好ましいリストは、限定しないが、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂肪族、アルコキシ、アシル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、脂環式、複素環式及びヘテロアリールアルキルを含む。
用語「ビス（ｓｉＲＮＡ）」及び「ビス−ｓｉＲＮＡ」は、本明細書では置き換え可能に使用され、共有結合又は非共有結合されて、インビトロ及び／又はインビボでＲＮＡｉ活性を引き起こし得る単一の化学実体を形成する２つのｓｉＲＮＡを指す。２つの結合されたｓｉＲＮＡは、異なる部位における同じ標的遺伝子を標的にすることができ、又は２つの結合されたｓｉＲＮＡは、標的遺伝子における同じ部位を標的にして、ＲＮＡｉ媒介性遺伝子サイレンシングを引き起こし得る。本発明の別の態様では、２つの結合されたｓｉＲＮＡは、２つの異なる遺伝子を標的にし得る。
明確にするために、ビス（ｓｉＲＮＡ）中のｓｉＲＮＡの一方は、第１の標的核酸の遺伝子発現を調節することができ、ビス（ｓｉＲＮＡ）中の他方のｓｉＲＮＡは、第２の標的核酸の遺伝子発現を調節することができる。一部の実施形態では、第１及び第２の標的核酸は、同じである。一部の別の実施形態では、２つのｓｉＲＮＡは、標的核酸中の同じ核酸配列を標的にする。
一部の他の実施形態では、ビス（ｓｉＲＮＡ）中のｓｉＲＮＡの一方は、第１の標的核酸の遺伝子発現を調節することができ、ビス（ｓｉＲＮＡ）中の他方のｓｉＲＮＡは、第２の標的核酸の遺伝子発現を調節することができ、第１及び第２の標的核酸は、異なる遺伝子である。
本明細書で使用されるとき、１つ又は複数の「リンカー」は、分子の２つの部分、例えばビス（ｓｉＲＮＡ）を生成するための２つの個々のｓｉＲＮＡ分子の一方又は両方の鎖を連結するヌクレオチド及び非ヌクレオチドリンカー又はこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、２つの個々のｓｉＲＮＡ間の単なる静電又はスタッキング相互作用がリンカーを表し得る。非ヌクレオチドリンカーは、単糖、二糖、オリゴ糖及びこれらの誘導体、脂肪族、脂環式、複素環式化合物及びこれらの組合せに由来する係留又はリンカーを含む。
切断可能なリンカーは、切断作用剤、例えばｐＨ、酸化還元電位又は分解分子の存在に対して感受性である。一般に、切断作用剤は、血清又は血液中よりも細胞内部でより行き渡っているか、又はより高いレベル若しくは活性で見出される。そのような分解作用剤の例として、特定の基質のために選択される酸化還元剤又は基質特異性のない酸化還元剤が挙げられ、これは、例えば、酸化若しくは還元酵素又は還元によって酸化還元的に切断可能なリンカーを分解することができる、細胞に存在するメルカプタンなどの還元剤；エステラーゼ；アミダーゼ；エンドソーム又は酸性環境を作り出すことができる作用剤、例えば５以下のｐＨをもたらすもの；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）及びプロテアーゼ並びにホスファターゼとして作用することにより、酸で切断可能な結合基を加水分解又は分解することができる酵素を含む。例えば、リンカーは、インビトロ及び／又はインビボで代謝酵素により切断することができる。例示的な代謝酵素として、限定しないが、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、グリコシラーゼ、グリコシダーゼ、ヒドロラーゼ、オキシダーゼのクラスなどが挙げられる。
実施例１：ターゲティングリガンドを有する切断可能なリンカーによるビス（ｓｉＲＮＡ）の合成
Figure 2020505032
 スキーム１に示されるように、ビス（ｓｉＲＮＡ）は、固体担体又は切断可能なリンカーによる合成後において合成され、続いて相補鎖とのハイブリダイゼーションが行われる。
実施例２：ターゲティングリガンドを有する切断可能なリンカーによるｓｉＲＮＡ又はエンドソーム作用剤
Figure 2020505032
実施例３．ターゲティングリガンドを有する切断可能なリンカーによるｓｉＲＮＡ−ＡＳＯの合成
Figure 2020505032
 スキーム３に示されるように、ｓｉＲＮＡ−ＡＳＯ又はＡＳＯ−ｓｉＲＮＡは、固体担体又は切断可能なリンカーによる合成後において合成され、続いて相補鎖とのハイブリダイゼーションが行われる。
実施例４．ターゲティングリガンドを有する切断可能なリンカーによるｓｉＲＮＡ−抗ｍｉＲの合成
Figure 2020505032
 スキーム４に示されるように、ｓｉＲＮＡ−抗ｍｉＲ又は抗ｍｉＲ−ｓｉＲＮＡは、固体担体又は切断可能なリンカーによる合成後において合成され、続いて相補鎖とのハイブリダイゼーションが行われる。
実施例５．ターゲティングリガンドを有する切断可能なリンカーによるビス（ＡＳＯ）の合成
Figure 2020505032
 スキーム５に示されるように、ビス（ＡＳＯ）は、固体担体又は切断可能なリンカーによる合成後において合成され、続いて相補鎖とのハイブリダイゼーションが行われる。
実施例６．ターゲティングリガンドを有する切断可能なリンカーによるビス（抗ｍｉＲ）の合成
Figure 2020505032
 スキーム６に示されるように、ビス（抗ｍｉＲ）は、固体担体又は切断可能なリンカーによる合成後において合成され、続いて相補鎖とのハイブリダイゼーションが行われる。
実施例７．官能化された切断可能なリンカー及びホスホロアミダイト
Figure 2020505032
 実施例１（スキーム１）に示されるように、ビス（ｓｉＲＮＡ）は、これらの切断可能なリンカーの１つ又は複数の逐次添加により固体担体上で合成され、続いて相補鎖とのハイブリダイゼーションが行われる。
実施例８．官能化された切断可能なリンカー及びホスホロアミダイト
Figure 2020505032
 実施例１（スキーム１）に示されるように、ビス（ｓｉＲＮＡ）は、これらの切断可能なリンカーの１つ又は複数の逐次添加により固体担体上で合成され、続いて相補鎖とのハイブリダイゼーションが行われる。
実施例９．官能化された切断可能なリンカー及びホスホロアミダイト
Figure 2020505032
 実施例１（スキーム１）に示されるように、ビス（ｓｉＲＮＡ）は、これらの切断可能なリンカーの１つ又は複数の逐次添加により固体担体上で合成され、続いて相補鎖とのハイブリダイゼーションが行われる。
実施例１０．官能化された切断可能なリンカー及びホスホロアミダイト
Figure 2020505032
 実施例１（スキーム１）に示されるように、ビス（ｓｉＲＮＡ）は、これらの切断可能なリンカーの１つ又は複数の逐次添加により固体担体上で合成され、続いて相補鎖とのハイブリダイゼーションが行われる。
実施例１１．官能化されたプロテアーゼ切断可能なリンカー及びホスホロアミダイト
Figure 2020505032
 実施例１（スキーム１）に示されるように、ビス（ｓｉＲＮＡ）は、これらの切断可能なリンカーの１つ又は複数の逐次添加により固体担体上で合成され、続いて相補鎖とのハイブリダイゼーションが行われる。
実施例１２．ホスホロアミダイト１０６の合成
Figure 2020505032
 化合物（１０１） − 化合物１００（２０ｇ、５１．４ｍｍｏｌ）を無水ジクロロエタン（ＤＣＥ）（２００ｍＬ）中で懸濁させた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（１１．１６ｍｌ、６１．７ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して滴下して加えた。反応物を、水浴を用いて４５℃に加熱し、一晩撹拌して透明な溶液を得た。反応をＴＬＣ（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了し、反応物を氷浴で冷却した。炭酸水素ナトリウム（１２．９５ｇ、１５４．２ｍｌ）を取り、１００ｍｌの水に溶解させた。炭酸水素ナトリウム溶液を反応混合物にゆっくりと加えると、泡立ちが起こった。反応物を２０分間撹拌させて、完全に中和した。混合物を分液漏斗に加え、有機層を分離し、水層をジクロロメタンで洗浄した。有機層を組み合わせて、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮し、高真空下に置いて（１６．６４ｇ）の１０１を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ６．０４（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．２３（ｄｄ，Ｊ＝３．９、２．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．８７（ｄｄ，Ｊ＝６．９、３．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．２５（ｄｄｄ，Ｊ＝７．５、５．０、２．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．１０（ｄｄ，Ｊ＝１１．６、７．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．０２（ｄｄ，Ｊ＝１１．５、５．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．９４（ｔｑ，Ｊ＝６．９、１．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．８９（ｓ，１Ｈ）、２．０６（ｓ，３Ｈ）、２．００（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ、６Ｈ）、１．９４（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ、３Ｈ）．Ｃ１４Ｈ１９ＮＯ８についての質量計算値：３２９．３１、実測値：３３０．１（Ｍ＋Ｈ）
化合物（１０２） − 化合物１０１（５ｇ、１５．１９ｍｍｏｌ）及び５−ベンジルオキシ−１−ペンタノール（３．２１ｍｌ、１６．７１ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロエタン（ＤＣＥ）（６０ｍｌ）と共に溶解させた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージし、氷浴中で冷却した。トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（０．５５０ｍｌ、３．０４ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。反応を３．５時間後にＴＬＣ（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した。炭酸水素ナトリウム（３８３ｍｇ、４．５６ｍｍｏｌ）を１００ｍＬに溶解させ、氷浴中で冷却した。反応混合物を撹拌炭酸水素ナトリウム溶液に滴下して加えた。反応物を２０分間撹拌させて、完全に中和した。混合物を分液漏斗に加え、有機層を分離し、水層をジクロロメタンで洗浄した。有機層を組み合わせて、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮し、高真空下に置いて（８．８８ｇ）の１０２を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ７．８１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．３８−７．２１（ｍ，６Ｈ）、５．２０（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．９４（ｄｄ，Ｊ＝１１．３、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．４７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．０８−３．９３（ｍ，３Ｈ）、３．８９（ｓ，２Ｈ）、３．８９−３．８０（ｍ，１Ｈ）、３．６９（ｄｔ，Ｊ＝９．９、６．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．４５−３．３４（ｍ，５Ｈ）、３．３３（ｓ，３Ｈ）、２．０９（ｓ，３Ｈ）、１．９８（ｓ，３Ｈ）、１．８８（ｓ，３Ｈ）、１．７３（ｓ，２Ｈ）、１．５８−１．２４（ｍ，８Ｈ）。
化合物（１０２ａ） − 化合物１０２（７．９５ｇ、１５．１９ｍｍｏｌ）を１５０ｍｌの無水メタノールに溶解させた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。メタノール中のナトリウムメトキシド（０．５Ｍ、３．０４ｍｌ、６．０７ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。反応物を室温で一晩撹拌させた。反応をＴＬＣ（１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。氷酢酸を反応物に加えて、ｐＨを７に低下させ、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を、最小限のメタノールを含む１００ｍｌのジクロロメタン中で懸濁させて、粗生成物を溶解させた。この粗製溶液を５０／５０のエーテル／ヘキサン（５００ｍｌ）溶液に滴下して加えることによって生成物を沈殿させた。沈殿物が形成され、それをさらに１０分間撹拌し、生成物をろ過して取り出し、高真空下で乾燥させて（５．２６ｇ）の１０２ａを得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ７．６２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．３８−７．２１（ｍ，５Ｈ）、４．６２（ｓ，３Ｈ）、４．４２（ｓ，２Ｈ）、４．２０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．７５−３．６０（ｍ，３Ｈ）、３．５７−３．４３（ｍ，３Ｈ）、３．３９（ｑ，Ｊ＝６．５、５．３Ｈｚ、４Ｈ）、３．３１（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、８Ｈ）、３．２６（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ、１Ｈ）、１．７５（ｓ，３Ｈ）、１．４７（ｄｑ，Ｊ＝２８．９、６．９、６．５Ｈｚ、４Ｈ）、１．３７−１．２６（ｍ，２Ｈ）．Ｃ２０Ｈ３１ＮＯ７についての質量計算値：３９７．４７、実測値：４２０．２（Ｍ＋Ｎａ）
化合物（１０３） − 化合物１０２ａ（５．２０ｇ、１３．０９ｍｍｏｌ）及び５０ｍｌの無水ピリジンを反応フラスコに加えた。ピリジンを減圧下で除去した。これを３回繰り返し、高真空下で一晩、乾燥させた。翌日、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．１６０ｇ、１．３１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１．７８ｍｌ、１３．０９ｍｍｏｌ）及び無水ピリジンを反応フラスコに加えた。反応物を、氷浴を用いて０℃に冷却した。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（４．９２ｇ、１４．５３ｍｍｏｌ）を無水ピリジンに溶解させ、得られた溶液を、シリンジを介して反応フラスコに加えた。反応物を室温に到達させ、一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（１００％のＥｔＯＡｃ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。メタノールを加えて、反応をクエンチし、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮し、高真空下に置いて（８．７０ｇ）の１０３を得た。化合物１０３ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ７．６３（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．４４−７．３７（ｍ，３Ｈ）、７．３６−７．１５（ｍ，１７Ｈ）、７．０９−７．０１（ｍ，１Ｈ）、６．９２−６．７８（ｍ，７Ｈ）、４．６２（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．５２（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．３９（ｓ，２Ｈ）、４．２７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．６９（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、１１Ｈ）、３．６７−３．６２（ｍ，１Ｈ）、３．５９（ｔ，Ｊ＝３．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．５２（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．４３（ｄｄｄ，Ｊ＝９．９、６．１、３．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．３７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、３Ｈ）、３．３３（ｓ，５Ｈ）、３．１８（ｄｄ，Ｊ＝９．３、７．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．００（ｄｄ，Ｊ＝９．３、４．８Ｈｚ、１Ｈ）、２．９２（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ、２Ｈ）、１．７７（ｓ，３Ｈ）、１．５４−１．４５（ｍ，４Ｈ）、１．３９−１．２８（ｍ，２Ｈ）．Ｃ４１Ｈ４９ＮＯ９についての質量計算値：６９９．８４、実測値：７２２．３（Ｍ＋Ｎａ）
化合物（１０４） − 化合物１０３（８．７０ｇ、１２．４４ｍｍｏｌ）及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１．５２ｇ、１２．４４ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。無水ピリジン（２３０ｍｌ）を、シリンジを介して加えた。安息香酸無水物（７．０３ｇ、３１．１ｍｍｏｌ）のピリジン溶液を、シリンジを介して反応混合物に加え、反応物を室温で一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、水を加えて、反応をクエンチし、１０分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。ＥｔＯＡｃ及び水を加え、分液漏斗に入れた。有機層を分離し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮し、高真空下に置いて（８．３５ｇ）の１０４を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ８．０１−７．８８（ｍ，２Ｈ）、７．７３（ｄｄｄ，Ｊ＝８．２、３．９、１．４Ｈｚ、４Ｈ）、７．７１−７．５５（ｍ，３Ｈ）、７．４５（ｄｔ，Ｊ＝３９．３、７．８Ｈｚ、５Ｈ）、７．３７−７．２０（ｍ，８Ｈ）、７．２０−７．０４（ｍ，８Ｈ）、６．７６−６．５８（ｍ，５Ｈ）、５．８４（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．３３（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．６４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４１（ｓ，２Ｈ）、４．３１（ｄｄ，Ｊ＝８．６、５．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．１６（ｄｔ，Ｊ＝１１．０、８．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．７９−３．６６（ｍ，２Ｈ）、３．６４（ｓ，７Ｈ）、３．４４（ｄｔ，Ｊ＝９．８、６．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．３７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．３３（ｓ，１Ｈ）、３．１６（ｄｄ，Ｊ＝８．５、５．４Ｈｚ、１Ｈ）、２．９５（ｔ，Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、１．６５（ｓ，３Ｈ）、１．５０（ｄｄｔ、Ｊ＝１４．９、１０．６、６．５Ｈｚ、４Ｈ）、１．３２（ｑｄ，Ｊ＝１０．５、９．３、６．３Ｈｚ、２Ｈ）．Ｃ５５Ｈ５７ＮＯ１１についての質量計算値：９０８．０６、実測値：９３０．３（Ｍ＋Ｎａ）
化合物（１０５） − 化合物１０４（３．７４ｇ、４．１２ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。シリンジを介して無水テトラヒドロフランを加えることによって出発材料を溶解させた。次に、１０％のパラジウム炭素、デグサタイプ、（３７４ｍｇ、１０重量％）を加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。次に、反応フラスコを排気し、バルーンからの水素で２回パージした。反応物を室温で一晩撹拌させた。反応をＴＬＣ（５０／５０のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、リンモリブデン酸を用いて発色させた。反応が完了した後、フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。反応混合物をセライトに通してろ過して、パラジウム炭素を除去し、メタノールで洗浄した。母液を減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（１０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して（２．００ｇ ５９％）の１０５を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ８．０４−７．８５（ｍ，１Ｈ）、７．７９−７．６４（ｍ，４Ｈ）、７．６４−７．５４（ｍ，１Ｈ）、７．５１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４０（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．３４−７．２１（ｍ，２Ｈ）、７．２２−７．０１（ｍ，６Ｈ）、６．７５−６．５９（ｍ，４Ｈ）、５．８４（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．３３（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．６４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．３２（ｄｔ，Ｊ＝９．７、５．６Ｈｚ、２Ｈ）、３．７１（ｄｔ，Ｊ＝９．７、６．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．６１（ｓ，５Ｈ）、３．４３（ｄｔ，Ｊ＝１０．０、６．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．３９−３．２９（ｍ，２Ｈ）、３．１６（ｄｄ，Ｊ＝８．６、５．４Ｈｚ、１Ｈ）、２．９４（ｔ，Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、１．６７（ｓ，３Ｈ）、１．５５−１．４３（ｍ，２Ｈ）、１．３８（ｄｔ，Ｊ＝１３．０、５．８Ｈｚ、２Ｈ）、１．２８（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）．Ｃ４８Ｈ５１ＮＯ１１についての質量計算値：８１７．９３、実測値：８４０．３（Ｍ＋Ｎａ）
化合物（１０６） − 化合物１０５を反応フラスコに加え、この反応フラスコを排気し、アルゴンでパージする。出発材料をジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルアミンを加え、反応物を室温で１〜２時間撹拌する。完全性についてＴＬＣを確認した後、反応物を、標準的な抽出条件を用いて後処理する。粗残渣をシリカゲルにおいて精製して化合物１０６を得る。
実施例１３．ホスホロアミダイト１１３の合成
Figure 2020505032
 化合物（１０７）：化合物１０１（５．０ｇ、１５．１９ｍｍｏｌ）及び２−（ベンジルオキシ）エタノール（２．８０ｍｌ、１９．７５ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロエタン（ＤＣＥ）（６０ｍｌ）と共に溶解させた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージし、氷浴中で冷却した。トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（０．５５０ｍｌ、３．０４ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。反応を３．５時間後にＴＬＣ（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した。炭酸水素ナトリウム（３８３ｍｇ、４．５６ｍｍｏｌ）を１００ｍＬに溶解させ、氷浴中で冷却した。反応混合物を撹拌炭酸水素ナトリウム溶液に滴下して加えた。反応物を２０分間撹拌させて、完全に中和した。混合物を分液漏斗に加え、有機層を分離し、水層をジクロロメタンで洗浄した。有機層を組み合わせて、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮し、高真空下に置いて（８．６４ｇ）の１０７を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ７．３８−７．２２（ｍ，４Ｈ）、５．２１（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．９７（ｄｄ，Ｊ＝１１．２、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．５６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４７（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ、２Ｈ）、４．０９−３．９５（ｍ，２Ｈ）、３．８９（ｓ，１Ｈ）、３．８４（ｄｄｄ，Ｊ＝１４．７、７．５、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．６３（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．８、６．４、３．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．５４（ｄｑ，Ｊ＝１０．７、５．２Ｈｚ、２Ｈ）、３．４４（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、２．０９（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．９８（ｓ，２Ｈ）、１．８８（ｓ，２Ｈ）、１．７３（ｓ，１Ｈ）。
化合物（１０７ａ） − 化合物１０７（７．３１ｇ、１５．１９ｍｍｏｌ）を１５０ｍｌの無水メタノールに溶解させた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。メタノール中のナトリウムメトキシド（０．５Ｍ、２．２７５ｍｌ、４．５５ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。反応物を室温で一晩撹拌させた。反応をＴＬＣ（１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、氷酢酸を反応物に加えて、ｐＨを７に低下させ、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を、最小限のメタノールを含む１００ｍｌのジクロロメタン中で懸濁させて、粗生成物を溶解させた。この粗製溶液を５０／５０のエーテル／ヘキサン（５００ｍｌ）溶液に滴下して加えることによって生成物を沈殿させた。沈殿物が形成され、それをさらに１０分間撹拌し、生成物をろ過して取り出し、高真空下で乾燥させて（５．０５ｇ）の１０７ａを得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ７．６５（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．３８−７．２１（ｍ，５Ｈ）、４．６３（ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．４７（ｓ，２Ｈ）、４．２８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．８３（ｄｔ，Ｊ＝９．１、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．７２（ｄｔ，Ｊ＝１０．７、８．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．６４（ｓ，１Ｈ）、３．６２−３．４５（ｍ，６Ｈ）、３．４１（ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．３６−３．２５（ｍ，７Ｈ）、１．９０−１．７８（ｍ，１Ｈ）、１．７５（ｓ，２Ｈ）。
化合物（１０８）：化合物１０７ａ（５．０ｇ、１４．０８ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（２．８８ｇ、４２．２４ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。無水ピリジンを、シリンジを介して加え、出発材料を溶解させた。反応物を室温で１０分間撹拌し、次にピリジン中のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（３．１８ｇ、２１．１２ｍｍｏｌ）の溶液を、シリンジを介して加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（１００％のＥｔＯＡｃ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、メタノールを加えて、反応をクエンチし、１０分間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン及び水を加えた。混合物を分液漏斗に加え、有機層を分離し、水層をジクロロメタンで洗浄した。有機層を組み合わせて、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮して（８．８０ｇ）の１０８を得た。これを粗生成物として次の反応に使用した。
化合物（１０９）：化合物１０８（６．６１ｇ、１４．０９ｍｍｏｌ）及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１．７２ｇ、１４．０９ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。無水ピリジン（２００ｍｌ）を、シリンジを介して加えた。安息香酸無水物（１１．１５ｇ、４９．３１ｍｍｏｌ）のピリジン溶液を、シリンジを介して反応混合物に加え、反応物を室温で一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、水を加えて、反応をクエンチし、１０分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。ＥｔＯＡｃ及び水を加え、分液漏斗に入れた。有機層を分離し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して（４．２２ｇ ４４％）の１０９を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ７．９７（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．９４−７．８６（ｍ，２Ｈ）、７．７５−７．６３（ｍ，３Ｈ）、７．５６（ｄｔ，Ｊ＝１５．１、７．５Ｈｚ、４Ｈ）、７．４４−７．３５（ｍ，２Ｈ）、７．３３（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ、４Ｈ）、７．３０−７．２３（ｍ，１Ｈ）、５．６７（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．２７（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．５１（ｓ，２Ｈ）、４．３５−４．１６（ｍ，１Ｈ）、４．０８（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ、１Ｈ）、３．９７−３．８５（ｍ，１Ｈ）、３．７６−３．６７（ｍ，２Ｈ）、３．６７−３．５３（ｍ，４Ｈ）、１．６５（ｓ，３Ｈ）、０．８９−０．７７（ｍ，２Ｈ）、０．７６（ｓ，８Ｈ）、０．６４（ｓ，１Ｈ）、−０．０６（ｓ，３Ｈ）、−０．１４（ｓ，３Ｈ）．Ｃ３７Ｈ４７ＮＯ９Ｓｉについての質量計算値：６７７．８７、実測値：６７８．３（Ｍ＋Ｈ）、７００．３（Ｍ＋Ｎａ）
化合物（１１０）：化合物１０９（３．０ｇ、４．４３ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。シリンジを介して無水メタノールを加えることによって出発材料を溶解させた。次に、１０％のパラジウム炭素、デグサタイプ、（３００ｍｇ、１０重量％）を加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。次に、反応フラスコを排気し、バルーンからの水素で２回パージした。反応物を室温で一晩撹拌させた。反応をＴＬＣ（６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。反応混合物をセライトに通してろ過して、パラジウム炭素を除去し、メタノールで洗浄した。母液を減圧下で濃縮して（２．７５ｇ）の１１０を得た。Ｃ３０Ｈ４１ＮＯ９Ｓｉについての質量計算値：５８７．７４、実測値：５８８．３（Ｍ＋Ｈ）、６１０．３（Ｍ＋Ｎａ）
化合物（１１１）：化合物１１０（２．６０ｇ、４．４３ｍｍｏｌ）及び５０ｍｌの無水ピリジンを反応フラスコに加えた。ピリジンを減圧下で除去した。残渣を３回ピリジンと同時蒸発させ、高真空下で一晩乾燥させた。翌日、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．０５４ｇ、０．４４３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．６０４ｍｌ、４．４３ｍｍｏｌ）及び無水ピリジンを反応フラスコに加えた。反応物を、氷浴を用いて０℃に冷却した。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１．６７ｇ、４．９２ｍｍｏｌ）を無水ピリジンに溶解させ、得られた溶液を、シリンジを介して反応フラスコに加えた。反応物を室温に到達させ、一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、メタノールを加えて、反応をクエンチし、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して（１．９６ｇ、４９．７％）の１１１を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ８．０４（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．９５−７．８５（ｍ，２Ｈ）、７．７６−７．７１（ｍ，２Ｈ）、７．７１−７．６３（ｍ，１Ｈ）、７．６３−７．５６（ｍ，１Ｈ）、７．５３（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４５−７．３６（ｍ，４Ｈ）、７．３４−７．２３（ｍ，６Ｈ）、７．２３−７．１５（ｍ，１Ｈ）、６．９１−６．８３（ｍ，４Ｈ）、５．７０（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．３０（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．７５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４１−４．２８（ｍ，１Ｈ）、４．１１（ｓ，１Ｈ）、３．７７−３．６７（ｍ，７Ｈ）、３．６７−３．５６（ｍ，２Ｈ）、３．３３（ｓ，１Ｈ）、３．２０（ｓ，１Ｈ）、２．９８−２．９１（ｍ，１Ｈ）、１．６０（ｓ，３Ｈ）、０．８４（ｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ、１Ｈ）、０．７６（ｓ，８Ｈ）、０．７３−０．６４（ｍ，１Ｈ）、−０．０７（ｓ，３Ｈ）、−０．１５（ｓ，３Ｈ）．Ｃ５１Ｈ５９ＮＯ１１Ｓｉについての質量計算値：８９０．１１、実測値：９１２．４（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物（１１２）：化合物１１１（１．８６ｇ、２．０９ｍｍｏｌ）をプラスチック製反応容器に加えた。ジクロロメタン（１８．３ｍｌ）を加えて、出発材料を溶解させた。アセトニトリル（５５．８ｍｌ）、ピリジン（３７．２ｍｌ）及びトリメチルアミン（９．３ｍｌ）を加えた。反応容器をパージし、氷浴中で冷却した。反応物を撹拌し、次にフッ化水素ピリジン錯体（９．３ｍｌ）を慎重に加えた。反応物を撹拌し、５時間にわたって室温に温めた。反応をＴＬＣ（３５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、リンモリブデン酸を用いて発色させた。反応は、９０％完了していた。２００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムを氷浴中で冷却し、撹拌した。反応混合物を、冷却された重炭酸塩溶液にゆっくりと加えて、反応をクエンチした。いくらかの泡立ちがあり、混合物をさらに３０分間撹拌した。ジクロロメタンを加え、混合物を分液漏斗に移した。有機層を分離し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して（１．１３ｇ、６９％）の１１２を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ８．０１（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．９５−７．８３（ｍ，２Ｈ）、７．７９−７．７２（ｍ，１Ｈ）、７．７２−７．５５（ｍ，３Ｈ）、７．５２（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４７−７．３５（ｍ，４Ｈ）、７．３５−７．２４（ｍ，６Ｈ）、７．２４−７．１４（ｍ，１Ｈ）、６．９６−６．７９（ｍ，４Ｈ）、５．７０（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．２７（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．９３（ｄｄ，Ｊ＝６．４、４．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．７４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．３４（ｄｔ，Ｊ＝１１．１、８．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．９９（ｄｑ，Ｊ＝２０．８、６．８Ｈｚ、３Ｈ）、３．７２（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ、６Ｈ）、３．５９−３．３７（ｍ，２Ｈ）、３．２０（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．０、７．８、３．６Ｈｚ、１Ｈ）、２．９５（ｄｔ，Ｊ＝１０．２、４．１Ｈｚ、１Ｈ）、１．９８（ｓ，２Ｈ）、１．６０（ｓ，３Ｈ）、１．１６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）．Ｃ４５Ｈ４５ＮＯ１１についての質量計算値：７７５．８５、実測値：７９８．３（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物（１１３） − 化合物１１２を反応フラスコに加え、この反応フラスコを排気し、アルゴンでパージする。出発材料をジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルアミンを、シリンジを介して加える。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを加え、反応物を室温で１〜２時間撹拌する。完全性についてＴＬＣを確認した後、反応物を、標準的な抽出条件を用いて後処理する。粗残渣をシリカゲルにおいて精製して化合物１１３を得る。
実施例１４．ホスホロアミダイト５０８の合成
Figure 2020505032
 化合物（５０１）：化合物５００（６ｇ、７．７０ｍｍｏｌ）及び２−（ベンジルオキシ）エタノール（１．２０ｍｌ、８．１１７ｍｍｏｌ）を反応フラスコ中に加え、無水トルエンに溶解させた。溶媒を減圧下で除去した。これを３回繰り返し、高真空下に置いて一晩乾燥させた。翌日、撹拌子及び分子篩を加え、排気し、アルゴンで３回パージした。無水エーテルを、シリンジを介して加え、反応物を、氷浴を用いて０℃に冷却した。それを１０分間撹拌し、次にトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（０．１３９ｍｌ、０．７７ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。反応物を３時間撹拌させ、次にＴＬＣ（２０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了し、それをトリメチルアミンでクエンチした。溶液を酢酸エチルで希釈し、分子篩をろ過して取り除いた。溶液を分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して（５．８７ｇ）の５０１を得た。Ｃ４３Ｈ３８Ｏ１１についての質量計算値：７３０．７７、実測値：７５３．２（Ｍ＋Ｎａ）
化合物（５０２）：化合物５０１（５．６２ｇ、７．７０ｍｍｏｌ）を１５０ｍｌの無水メタノールに溶解させた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。メタノール中のナトリウムメトキシド（０．５Ｍ、６．１６ｍｌ、３．０８ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。反応物を室温で一晩撹拌させた。反応をＴＬＣ（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、２０滴の氷酢酸を加えることにより、それをｐＨ７に中和した。溶媒を減圧下で除去して（３．６３ｇ）の５０２を得た。Ｃ１５Ｈ２２Ｏ７についての質量計算値：３１４．３３、実測値：３３７．１（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物（５０３）：化合物５０２（２．４２ｇ、７．７０ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（１．５７ｇ、２３．１ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。無水ピリジンを、シリンジを介して加え、出発材料を溶解させた。反応物を室温で１０分間撹拌し、次にピリジン中のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１．７４ｇ、１１．５５ｍｍｏｌ）の溶液を、シリンジを介して加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（１００％のＥｔＯＡｃ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、メタノールを加えて、反応をクエンチし、１０分間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン及び水を加えた。混合物を分液漏斗に加え、有機層を分離し、水層をジクロロメタンで洗浄した。有機層を組み合わせて、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して（２．５７ｇ、７８．１％）の５０３を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ７．４０−７．１６（ｍ，２Ｈ）、４．７４（ｄｄ，Ｊ＝５．８、４．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．６７−４．５４（ｍ，１Ｈ）、４．４８（ｓ，１Ｈ）、３．７８−３．６７（ｍ，１Ｈ）、３．６５−３．４８（ｍ，２Ｈ）、３．４５（ｄｄｄ，Ｊ＝９．３、６．１、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．４２−３．２３（ｍ，１Ｈ）、０．８４（ｓ，４Ｈ）、０．０２（ｓ，３Ｈ）．Ｃ２１Ｈ３６Ｏ７Ｓｉについての質量計算値：４２８．６０、実測値：４５１．２（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物（５０４）：化合物５０３（２．５０ｇ、５．８４ｍｍｏｌ）及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．７１４ｇ、５．８４ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。無水ピリジン（１００ｍｌ）を、シリンジを介して加えた。安息香酸無水物（５．２８ｇ、２３．３６ｍｍｏｌ）のピリジン溶液を、シリンジを介して反応混合物に加え、反応物を室温で一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（２０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、水を加えて、反応をクエンチし、１０分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。ＥｔＯＡｃ及び水を加え、分液漏斗に入れた。有機層を分離し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して（３．７８ｇ、８７．５％）の５０４を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ８．０９−７．８９（ｍ，２Ｈ）、７．９１−７．７８（ｍ，２Ｈ）、７．７８−７．６５（ｍ，３Ｈ）、７．６５−７．５１（ｍ，４Ｈ）、７．４６（ｑ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４１−７．３１（ｍ，６Ｈ）、７．３１−７．２１（ｍ，１Ｈ）、５．９６（ｔ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．７０−５．５３（ｍ，２Ｈ）、５．２０（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．５８（ｓ，２Ｈ）、４．２１（ｄｔ，Ｊ＝１０．１、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．９６−３．７５（ｍ，２Ｈ）、３．７５−３．６０（ｍ，４Ｈ）、０．８６（ｓ，８Ｈ）、−０．１２（ｓ，５Ｈ）．Ｃ４２Ｈ４８Ｏ１０Ｓｉについての質量計算値：７４０．９２、実測値：７６３．３（Ｍ＋Ｎａ）
化合物（５０５）：化合物５０４（２．３２ｇ、３．１３ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。シリンジを介して無水テトラヒドロフランを加えることによって出発材料を溶解させた。次に、１０％のパラジウム炭素、デグサタイプ、（２７８ｍｇ、１０重量％）を加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。次に、反応フラスコを排気し、バルーンからの水素で２回パージした。反応物を室温で一晩撹拌させた。反応をＴＬＣ（３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、反応混合物を排気し、アルゴンで３回パージした。反応混合物をセライトに通してろ過して、パラジウム炭素を除去し、メタノールで洗浄した。母液を減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して（１．２０ｇ、５９．１％）の５０５を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ８．０６−７．９５（ｍ，２Ｈ）、７．９５−７．８２（ｍ，２Ｈ）、７．７９−７．６３（ｍ，２Ｈ）、７．６４−７．５０（ｍ，３Ｈ）、７．４５（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．３６（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ）、５．９６（ｔ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．６７（ｄｄ，Ｊ＝１０．２、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．６０（ｄｄ，Ｊ＝３．３、１．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．１６（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．８５（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．２３（ｄｔ，Ｊ＝１０．１、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．８０（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ、３Ｈ）、３．７１−３．５４（ｍ，３Ｈ）、０．８７（ｓ，７Ｈ）、−０．０９（ｓ，４Ｈ）．Ｃ３５Ｈ４２Ｏ１０Ｓｉについての質量計算値：６５０．８０、実測値：６７３．３（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物（５０６）：化合物５０５（１．２０ｇ、１．８４ｍｍｏｌ）及び５０ｍｌの無水ピリジンを反応フラスコに加えた。ピリジンを減圧下で除去し、これを３回繰り返し、残渣を高真空下で一晩乾燥させた。翌日、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．０２２ｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．２５１ｍｌ、１．８４ｍｍｏｌ）及び無水ピリジンを反応フラスコに加えた。反応物を、氷浴を用いて０℃に冷却した。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．６９１ｇ、２．０４ｍｍｏｌ）を無水ピリジンに溶解させ、得られた溶液を、シリンジを介して反応フラスコに加えた。反応物を室温に到達させ、一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（２０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した。メタノールを加えて、反応をクエンチし、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して（１．６８ｇ、９６％）の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−（２−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）エトキシ）−６−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４，５−トリイルトリベンゾエート５０６を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ８．０７−７．９２（ｍ，２Ｈ）、７．８１−７．６２（ｍ，５Ｈ）、７．５６（ｔｄｄ，Ｊ＝７．６、７．０、６．３、１．８Ｈｚ、４Ｈ）、７．５０−７．４１（ｍ，２Ｈ）、７．４１−７．２７（ｍ，１０Ｈ）、７．２８−７．１９（ｍ，２Ｈ）、６．９８−６．８６（ｍ，４Ｈ）、５．９８（ｔ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．７６（ｄｄ，Ｊ＝１０．２、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．６４（ｄｄ，Ｊ＝３．３、１．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．２２（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．３６（ｄｔ，Ｊ＝１０．２、２．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．０１（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．９３（ｔｄ，Ｊ＝７．６、７．１、３．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．７９（ｔｄ，Ｊ＝１０．６、９．３、２．７Ｈｚ、３Ｈ）、３．７１（ｓ，７Ｈ）、３．３１−３．１６（ｍ，２Ｈ）、１．１６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）、０．８８（ｓ，９Ｈ）、−０．０８（ｓ，５Ｈ）．Ｃ５６Ｈ６０Ｏ１２Ｓｉについての質量計算値：９５３．１７、実測値：９７５．４（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物（５０７）：化合物５０６（１．６０ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）をプラスチック製反応容器に加えた。ジクロロメタン（１６ｍｌ）を加えて、出発材料を溶解させた。アセトニトリル（４８ｍｌ）、ピリジン（３２ｍｌ）及びトリメチルアミン（８ｍｌ）を加えた。反応容器をパージし、氷浴中で冷却した。反応物を撹拌し、次にフッ化水素ピリジン錯体（８ｍｌ）を慎重に加えた。反応物を撹拌し、５時間にわたって室温に温めた。反応をＴＬＣ（３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、リンモリブデン酸を用いて発色させた。２００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムを氷浴中で冷却し、撹拌した。反応混合物を、冷却された重炭酸塩溶液にゆっくりと加えて、反応をクエンチした。いくらかの泡立ちがあったため、注意しなければならない。これを３０分間撹拌した。溶液を減圧下で濃縮した。ジクロロメタンを加え、分液漏斗に加えた。有機層を分離し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して（１．２９ｇ、９１．４％）の５０７を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ８．０５−７．９８（ｍ，２Ｈ）、７．７３（ｄｔｔ，Ｊ＝８．６、３．７、１．５Ｈｚ、５Ｈ）、７．６６−７．５１（ｍ，４Ｈ）、７．５１−７．４４（ｍ，２Ｈ）、７．４４−７．３０（ｍ，１０Ｈ）、７．２８−７．１９（ｍ，１Ｈ）、６．９７−６．８８（ｍ，４Ｈ）、５．９０−５．７５（ｍ，２Ｈ）、５．６６（ｄｄ，Ｊ＝３．２、１．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．２２（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．０６（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．３１（ｄｄｄ，Ｊ＝９．６、４．４、２．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．０２（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．９５（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．０、６．８、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．７５（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．８、５．３、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．６８−３．５５（ｍ，２Ｈ）、３．３２−３．１５（ｍ，２Ｈ）、１．９８（ｓ，１Ｈ）、１．１６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）．Ｃ５０Ｈ４６Ｏ１２についての質量計算値：８３８．９１、実測値：８６１．３（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物（５０８）：化合物５０７を反応フラスコに加え、この反応フラスコを排気し、アルゴンでパージする。出発材料をジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルアミンを、シリンジを介して加える。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを加え、反応混合物を室温で１〜２時間撹拌する。完全性についてＴＬＣを確認した後、反応物を、標準的な抽出条件を用いて後処理する。粗残渣をシリカゲルにおいて精製して化合物５０８を得る。
実施例１５．ホスホロアミダイト１０６の合成
Figure 2020505032
 化合物１０１：化合物１００（２０ｇ、５１．４ｍｍｏｌ）を無水ジクロロエタン（ＤＣＥ）（２００ｍＬ）中で懸濁させた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（１１．１６ｍＬ、６１．７ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して滴下して加えた。反応物を、水浴を用いて４５℃に加熱し、一晩撹拌して透明な溶液を得た。反応をＴＬＣ（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了し、反応物を氷浴で冷却した。炭酸水素ナトリウム（１２．９５ｇ、１５４．２ｍＬ）を取り、１００ｍＬの水に溶解させた。炭酸水素ナトリウム溶液を反応混合物にゆっくりと加えると、泡立ちが起こった。反応物を２０分間撹拌させて、完全に中和した。混合物を分液漏斗に加え、有機層を分離し、水層をジクロロメタンで洗浄した。有機層を組み合わせて、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮し、高真空下に置いて１６．６４ｇの１０１を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ６．０４（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．２３（ｄｄ，Ｊ＝３．９、２．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．８７（ｄｄ，Ｊ＝６．９、３．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．２５（ｍ，１Ｈ）、４．１０（ｄｄ，Ｊ＝１１．６、７．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．０２（ｄｄ，Ｊ＝１１．５、５．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．９４（ｍ，１Ｈ）、３．８９（ｓ，１Ｈ）、２．０６（ｓ，３Ｈ）、２．００（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ、６Ｈ）、１．９４（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ、３Ｈ）．Ｃ１４Ｈ１９ＮＯ８についての質量計算値：３２９．３１、実測値：３３０．１（Ｍ＋Ｈ）。
化合物１０２：化合物１０１（５ｇ、１５．１９ｍｍｏｌ）及び５−ベンジルオキシ−１−ペンタノール（３．２１ｍＬ、１６．７１ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロエタン（ＤＣＥ）（６０ｍＬ）と共に溶解させた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージし、氷浴中で冷却した。トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（０．５５０ｍＬ、３．０４ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。反応を３．５時間後にＴＬＣ（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した。炭酸水素ナトリウム（３８３ｍｇ、４．５６ｍｍｏｌ）を１００ｍＬに溶解させ、氷浴中で冷却した。反応混合物を撹拌炭酸水素ナトリウム溶液に滴下して加えた。反応物を２０分間撹拌させて、完全に中和した。混合物を分液漏斗に加え、有機層を分離し、水層をジクロロメタンで洗浄した。有機層を組み合わせて、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮し、高真空下に置いて８．８８ｇの１０２を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ７．８１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．３８−７．２１（ｍ，６Ｈ）、５．２０（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．９４（ｄｄ，Ｊ＝１１．３、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．４７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．０８−３．９３（ｍ，３Ｈ）、３．８９（ｓ，２Ｈ）、３．８９−３．８０（ｍ，１Ｈ）、３．６９（ｍ，１Ｈ）、３．４５−３．３４（ｍ，５Ｈ）、３．３３（ｓ，３Ｈ）、２．０９（ｓ，３Ｈ）、１．９８（ｓ，３Ｈ）、１．８８（ｓ，３Ｈ）、１．７３（ｓ，２Ｈ）、１．５８−１．２４（ｍ，８Ｈ）。
化合物１０２ａ：化合物１０２（７．９５ｇ、１５．１９ｍｍｏｌ）を１５０ｍＬの無水メタノールに溶解させた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。メタノール中のナトリウムメトキシド（０．５Ｍ、３．０４ｍＬ、６．０７ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。反応物を室温で一晩撹拌させた。反応をＴＬＣ（１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。氷酢酸を反応物に加えて、ｐＨを７に低下させ、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を、最小限のメタノールを含む１００ｍＬのジクロロメタン中で懸濁させて、粗生成物を溶解させた。この粗製溶液を５０／５０のエーテル／ヘキサン（５００ｍＬ）溶液に滴下して加えることによって生成物を沈殿させた。沈殿物が形成され、それをさらに１０分間撹拌し、生成物をろ過して取り出し、高真空下で乾燥させて５．２６ｇの１０２ａを得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ７．６２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．３８−７．２１（ｍ，５Ｈ）、４．６２（ｓ，３Ｈ）、４．４２（ｓ，２Ｈ）、４．２０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．７５−３．６０（ｍ，３Ｈ）、３．５７−３．４３（ｍ，３Ｈ）、３．３９（ｑ，Ｊ＝６．５、５．３Ｈｚ、４Ｈ）、３．３１（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、８Ｈ）、３．２６（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ、１Ｈ）、１．７５（ｓ，３Ｈ）、１．４７（ｍ，４Ｈ）、１．３７−１．２６（ｍ，２Ｈ）．Ｃ２０Ｈ３１ＮＯ７についての質量計算値：３９７．４７、実測値：４２０．２（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物１０３：化合物１０２ａ（５．２０ｇ、１３．０９ｍｍｏｌ）及び５０ｍＬの無水ピリジンを反応フラスコに加えた。ピリジンを減圧下で除去した。これを３回繰り返し、高真空下で一晩、乾燥させた。翌日、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．１６０ｇ、１．３１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１．７８ｍＬ、１３．０９ｍｍｏｌ）及び無水ピリジンを反応フラスコに加えた。反応物を、氷浴を用いて０℃に冷却した。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（４．９２ｇ、１４．５３ｍｍｏｌ）を無水ピリジンに溶解させ、得られた溶液を、シリンジを介して反応フラスコに加えた。反応物を室温に到達させ、一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（１００％のＥｔＯＡｃ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。メタノールを加えて、反応をクエンチし、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮し、高真空下に置いて化合物１０３（８．７０ｇ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ７．６３（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．４４−７．３７（ｍ，３Ｈ）、７．３６−７．１５（ｍ，１７Ｈ）、７．０９−７．０１（ｍ，１Ｈ）、６．９２−６．７８（ｍ，７Ｈ）、４．６２（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．５２（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．３９（ｓ，２Ｈ）、４．２７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．６９（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、１１Ｈ）、３．６７−３．６２（ｍ，１Ｈ）、３．５９（ｔ，Ｊ＝３．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．５２（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．４３（ｍｍ、２Ｈ）、３．３７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、３Ｈ）、３．３３（ｓ，５Ｈ）、３．１８（ｄｄ，Ｊ＝９．３、７．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．００（ｄｄ，Ｊ＝９．３、４．８Ｈｚ、１Ｈ）、２．９２（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ、２Ｈ）、１．７７（ｓ，３Ｈ）、１．５４−１．４５（ｍ，４Ｈ）、１．３９−１．２８（ｍ，２Ｈ）．Ｃ４１Ｈ４９ＮＯ９：６９９．８４についての質量計算値、実測値：７２２．３（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物１０４：化合物１０３（８．７０ｇ、１２．４４ｍｍｏｌ）及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１．５２ｇ、１２．４４ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。無水ピリジン（２３０ｍＬ）を、シリンジを介して加えた。安息香酸無水物（７．０３ｇ、３１．１ｍｍｏｌ）のピリジン溶液を、シリンジを介して反応混合物に加え、反応物を室温で一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、水を加えて、反応をクエンチし、１０分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。ＥｔＯＡｃ及び水を加え、分液漏斗に入れた。有機層を分離し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮し、高真空下に置いて８．３５ｇの１０４を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．０１−７．８８（ｍ，２Ｈ）、７．７３（ｍ，４Ｈ）、７．７１−７．５５（ｍ，３Ｈ）、７．４５（ｍ，５Ｈ）、７．３７−７．２０（ｍ，８Ｈ）、７．２０−７．０４（ｍ，８Ｈ）、６．７６−６．５８（ｍ，５Ｈ）、５．８４（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．３３（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．６４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４１（ｓ，２Ｈ）、４．３１（ｄｄ，Ｊ＝８．６、５．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．１６（ｍ，３．７９−３．６６（ｍ，２Ｈ）、３．６４（ｓ，７Ｈ）、３．４４（ｍ，３．３７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．３３（ｓ，１Ｈ）、３．１６（ｄｄ，Ｊ＝８．５、５．４Ｈｚ、１Ｈ）、２．９５（ｔ，Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、１．６５（ｓ，３Ｈ）、１．５０（ｍ，４Ｈ）、１．３２（ｍ，２Ｈ）．Ｃ５５Ｈ５７ＮＯ１１についての質量計算値：９０８．０６、実測値：９３０．３（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物１０５：化合物１０４（３．７４ｇ、４．１２ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。シリンジを介して無水テトラヒドロフランを加えることによって出発材料を溶解させた。次に、１０％のパラジウム炭素、デグサタイプ、（３７４ｍｇ、１０重量％）を加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。次に、反応フラスコを排気し、バルーンからの水素で２回パージした。反応物を室温で一晩撹拌させた。反応をＴＬＣ（５０／５０のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、リンモリブデン酸を用いて発色させた。反応が完了した後、フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。反応混合物をセライトに通してろ過して、パラジウム炭素を除去し、メタノールで洗浄した。母液を減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（１０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して２．００ｇ（５９％）の１０５を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．０４−７．８５（ｍ，１Ｈ）、７．７９−７．６４（ｍ，４Ｈ）、７．６４−７．５４（ｍ，１Ｈ）、７．５１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４０（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．３４−７．２１（ｍ，２Ｈ）、７．２２−７．０１（ｍ，６Ｈ）、６．７５−６．５９（ｍ，４Ｈ）、５．８４（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．３３（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．６４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．３２（ｍ，３．７１（ｍ，１Ｈ）、３．６１（ｓ，５Ｈ）、３．４３（ｍ，１Ｈ）、３．３９−３．２９（ｍ，２Ｈ）、３．１６（ｄｄ，Ｊ＝８．６、５．４Ｈｚ、１Ｈ）、２．９４（ｔ，Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、１．６７（ｓ，３Ｈ）、１．５５−１．４３（ｍ，２Ｈ）、１．３８（ｍ，１．２８（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）．Ｃ４８Ｈ５１ＮＯ１１についての質量計算値：８１７．９３、実測値：８４０．３（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物１０６：化合物１０５（１．５０ｇ、１．８４ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。出発材料をジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（０．６４１ｍＬ、３．６８ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．４９１ｍＬ、２．２１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応をＴＬＣ（５０／５０のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、反応物を減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣を最小限のジクロロメタンに溶解させ、９０／１０のヘキサン／エーテルの溶液に滴下して加えた。油性の沈殿物が形成され、それを１０分間撹拌した。溶媒をデカントして取り除き、残っている残渣をジクロロメタンに溶解させ、フラスコに移した。溶媒を減圧下で除去して化合物１．６２ｇ、（８７％）の１０６を得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）：δ ７．７９（ｍ，Ｊ＝８．４、１．７Ｈｚ、４Ｈ）、７．６９−７．６２（ｍ，１Ｈ）、７．６２−７．４９（ｍ，２Ｈ）、７．４７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．４１−７．３１（ｍ，４Ｈ）、７．２４−７．１０（ｍ，７Ｈ）、６．７４−６．５９（ｍ，４Ｈ）、５．８９（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．４１（ｄｄ，Ｊ＝１１．２、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．７０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．２３−４．１３（ｍ，２Ｈ）、３．８５−３．７２（ｍ，３Ｈ）、３．６６（ｔ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ、８Ｈ）、３．５７（ｍ，２．９Ｈｚ、３Ｈ）、３．２９（ｄｄ，Ｊ＝８．８、５．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．０１（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、２．６７−２．５９（ｍ，２Ｈ）、１．７４（ｓ，３Ｈ）、１．５８（ｍ，４Ｈ）、１．４５−１．３７（ｍ，２Ｈ）、１．２３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）、１．１６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、１１Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）：δ １４７．９３、１４７．６８。
実施例１６．ホスホロアミダイト１１３の合成
Figure 2020505032
 化合物１０７：化合物１０１（５．０ｇ、１５．１９ｍｍｏｌ）及び２−（ベンジルオキシ）エタノール（２．８０ｍＬ、１９．７５ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロエタン（ＤＣＥ）（６０ｍＬ）と共に溶解させた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージし、氷浴中で冷却した。トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（０．５５０ｍＬ、３．０４ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。反応を３．５時間後にＴＬＣ（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した。炭酸水素ナトリウム（３８３ｍｇ、４．５６ｍｍｏｌ）を１００ｍＬに溶解させ、氷浴中で冷却した。反応混合物を撹拌炭酸水素ナトリウム溶液に滴下して加えた。反応物を２０分間撹拌させて、完全に中和した。混合物を分液漏斗に加え、有機層を分離し、水層をジクロロメタンで洗浄した。有機層を組み合わせて、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮し、高真空下に置いて８．６４ｇの１０７を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ７．３８−７．２２（ｍ，４Ｈ）、５．２１（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．９７（ｄｄ，Ｊ＝１１．２、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．５６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４７（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ、２Ｈ）、４．０９−３．９５（ｍ，２Ｈ）、３．８９（ｓ，１Ｈ）、３．８４（ｍ，１Ｈ）、３．６３（ｍ，１Ｈ）、３．５４（ｍ，２Ｈ）、３．４４（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、２．０９（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．９８（ｓ，２Ｈ）、１．８８（ｓ，２Ｈ）、１．７３（ｓ，１Ｈ）。
化合物１０７ａ：化合物１０７（７．３１ｇ、１５．１９ｍｍｏｌ）を１５０ｍＬの無水メタノールに溶解させた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。メタノール中のナトリウムメトキシド（０．５Ｍ、２．２７５ｍＬ、４．５５ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。反応物を室温で一晩撹拌させた。反応をＴＬＣ（１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、氷酢酸を反応物に加えて、ｐＨを７に低下させ、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を、最小限のメタノールを含む１００ｍＬのジクロロメタン中で懸濁させて、粗生成物を溶解させた。この粗製溶液を５０／５０のエーテル／ヘキサン（５００ｍＬ）溶液に滴下して加えることによって生成物を沈殿させた。沈殿物が形成され、それをさらに１０分間撹拌し、生成物をろ過して取り出し、高真空下で乾燥させて５．０５ｇの１０７ａを得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ７．６５（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．３８−７．２１（ｍ，５Ｈ）、４．６３（ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．４７（ｓ，２Ｈ）、４．２８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．８３（ｍ，１Ｈ）、３．７２（ｍ，１Ｈ）、３．６４（ｓ，１Ｈ）、３．６２−３．４５（ｍ，６Ｈ）、３．４１（ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．３６−３．２５（ｍ，７Ｈ）、１．９０−１．７８（ｍ，１Ｈ）、１．７５（ｓ，２Ｈ）。
化合物１０８：化合物１０７ａ（５．０ｇ、１４．０８ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（２．８８ｇ、４２．２４ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。無水ピリジンを、シリンジを介して加え、出発材料を溶解させた。反応物を室温で１０分間撹拌し、次にピリジン中のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（３．１８ｇ、２１．１２ｍｍｏｌ）の溶液を、シリンジを介して加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（１００％のＥｔＯＡｃ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、メタノールを加えて、反応をクエンチし、１０分間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン及び水を加えた。混合物を分液漏斗に加え、有機層を分離し、水層をジクロロメタンで洗浄した。有機層を組み合わせて、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮して８．８０ｇの１０８を得た。これを粗生成物として次の反応に使用した。
化合物１０９：化合物１０８（６．６１ｇ、１４．０９ｍｍｏｌ）及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１．７２ｇ、１４．０９ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。無水ピリジン（２００ｍＬ）を、シリンジを介して加えた。安息香酸無水物（１１．１５ｇ、４９．３１ｍｍｏｌ）のピリジン溶液を、シリンジを介して反応混合物に加え、反応物を室温で一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、水を加えて、反応をクエンチし、１０分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。ＥｔＯＡｃ及び水を加え、分液漏斗に入れた。有機層を分離し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して４．２２ｇ（４４％）の１０９を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ７．９７（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．９４−７．８６（ｍ，２Ｈ）、７．７５−７．６３（ｍ，３Ｈ）、７．５６（ｍ，４Ｈ）、７．４４−７．３５（ｍ，２Ｈ）、７．３３（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ、４Ｈ）、７．３０−７．２３（ｍ，１Ｈ）、５．６７（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．２７（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．５１（ｓ，２Ｈ）、４．３５−４．１６（ｍ，１Ｈ）、４．０８（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ、１Ｈ）、３．９７−３．８５（ｍ，１Ｈ）、３．７６−３．６７（ｍ，２Ｈ）、３．６７−３．５３（ｍ，４Ｈ）、１．６５（ｓ，３Ｈ）、０．８９−０．７７（ｍ，２Ｈ）、０．７６（ｓ，８Ｈ）、０．６４（ｓ，１Ｈ）、−０．０６（ｓ，３Ｈ）、−０．１４（ｓ，３Ｈ）．Ｃ３７Ｈ４７ＮＯ９Ｓｉについての質量計算値：６７７．８７、実測値：６７８．３（Ｍ＋Ｈ）、７００．３（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物１１０：化合物１０９（３．０ｇ、４．４３ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。シリンジを介して無水メタノールを加えることによって出発材料を溶解させた。次に、１０％のパラジウム炭素、デグサタイプ、（３００ｍｇ、１０重量％）を加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。次に、反応フラスコを排気し、バルーンからの水素で２回パージした。反応物を室温で一晩撹拌させた。反応をＴＬＣ（６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。反応混合物をセライトに通してろ過して、パラジウム炭素を除去し、メタノールで洗浄した。母液を減圧下で濃縮して２．７５ｇの１１０を得た。Ｃ３０Ｈ４１ＮＯ９Ｓｉについての質量計算値：５８７．７４、実測値：５８８．３（Ｍ＋Ｈ）、６１０．３（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物１１１：化合物１１０（２．６０ｇ、４．４３ｍｍｏｌ）及び５０ｍＬの無水ピリジンを反応フラスコに加えた。ピリジンを減圧下で除去した。残渣を３回ピリジンと同時蒸発させ、高真空下で一晩乾燥させた。翌日、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．０５４ｇ、０．４４３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．６０４ｍＬ、４．４３ｍｍｏｌ）及び無水ピリジンを反応フラスコに加えた。反応物を、氷浴を用いて０℃に冷却した。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１．６７ｇ、４．９２ｍｍｏｌ）を無水ピリジンに溶解させ、得られた溶液を、シリンジを介して反応フラスコに加えた。反応物を室温に到達させ、一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、メタノールを加えて、反応をクエンチし、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して１．９６ｇ（４９．７％）の１１１を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．０４（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．９５−７．８５（ｍ，２Ｈ）、７．７６−７．７１（ｍ，２Ｈ）、７．７１−７．６３（ｍ，１Ｈ）、７．６３−７．５６（ｍ，１Ｈ）、７．５３（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４５−７．３６（ｍ，４Ｈ）、７．３４−７．２３（ｍ，６Ｈ）、７．２３−７．１５（ｍ，１Ｈ）、６．９１−６．８３（ｍ，４Ｈ）、５．７０（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．３０（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．７５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４１−４．２８（ｍ，１Ｈ）、４．１１（ｓ，１Ｈ）、３．７７−３．６７（ｍ，７Ｈ）、３．６７−３．５６（ｍ，２Ｈ）、３．３３（ｓ，１Ｈ）、３．２０（ｓ，１Ｈ）、２．９８−２．９１（ｍ，１Ｈ）、１．６０（ｓ，３Ｈ）、０．８４（ｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ、１Ｈ）、０．７６（ｓ，８Ｈ）、０．７３−０．６４（ｍ，１Ｈ）、−０．０７（ｓ，３Ｈ）、−０．１５（ｓ，３Ｈ）．Ｃ５１Ｈ５９ＮＯ１１Ｓｉについての質量計算値：８９０．１１、実測値：９１２．４（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物１１２：化合物１１１（１．８６ｇ、２．０９ｍｍｏｌ）をプラスチック製反応容器に加えた。ジクロロメタン（１８．３ｍＬ）を加えて、出発材料を溶解させた。アセトニトリル（５５．８ｍＬ）、ピリジン（３７．２ｍＬ）及びトリメチルアミン（９．３ｍＬ）を加えた。反応容器をパージし、氷浴中で冷却した。反応物を撹拌し、次にフッ化水素ピリジン錯体（９．３ｍＬ）を慎重に加えた。反応物を撹拌し、５時間にわたって室温に温めた。反応をＴＬＣ（３５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、リンモリブデン酸を用いて発色させた。反応は、９０％完了していた。２００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムを氷浴中で冷却し、撹拌した。反応混合物を、冷却された重炭酸塩溶液にゆっくりと加えて、反応をクエンチした。いくらかの泡立ちがあり、混合物をさらに３０分間撹拌した。ジクロロメタンを加え、混合物を分液漏斗に移した。有機層を分離し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して１．１３ｇ（６９％）の１１２を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．０１（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．９５−７．８３（ｍ，２Ｈ）、７．７９−７．７２（ｍ，１Ｈ）、７．７２−７．５５（ｍ，３Ｈ）、７．５２（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４７−７．３５（ｍ，４Ｈ）、７．３５−７．２４（ｍ，６Ｈ）、７．２４−７．１４（ｍ，１Ｈ）、６．９６−６．７９（ｍ，４Ｈ）、５．７０（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．２７（ｄｄ，Ｊ＝１１．１、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．９３（ｄｄ，Ｊ＝６．４、４．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．７４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．３４（ｍ，１Ｈ）、３．９９（ｍ，３Ｈ）、３．７２（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ、６Ｈ）、３．５９−３．３７（ｍ，２Ｈ）、３．２０（ｍ，１Ｈ）、２．９５（ｍ，１Ｈ）、１．９８（ｓ，２Ｈ）、１．６０（ｓ，３Ｈ）、１．１６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）．Ｃ４５Ｈ４５ＮＯ１１についての質量計算値：７７５．８５、実測値：７９８．３（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物１１３：化合物１１２（１．１３ｇ、１．４６ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。出発材料をジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミンジイソプロピルエチルアミン（０．５０９ｍＬ、２．９２ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．３８９ｍＬ、１．７５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応をＴＬＣ（５０／５０のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、反応物を減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣を最小限のジクロロメタンに溶解させ、９０／１０のヘキサン／エーテルの溶液に滴下して加えた。油性の沈殿物が形成され、それを１０分間撹拌した。溶媒をデカントして取り除き、残っている残渣をジクロロメタンに溶解させ、フラスコに移した。溶媒を減圧下で除去して１．１ｇ（７７％）の１１３を得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）：δ ７．９８（ｍ，２Ｈ）、７．８３−７．７７（ｍ，２Ｈ）、７．６６（ｍ，１Ｈ）、７．６０−７．４６（ｍ，５Ｈ）、７．４２−７．２８（ｍ，８Ｈ）、７．２２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ、１Ｈ）、６．８８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ、４Ｈ）、５．８０（ｄｄ，Ｊ＝５．７、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．４７−５．３６（ｍ，１Ｈ）、４．８３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４０（ｍ，１Ｈ）、４．１６（ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ、１Ｈ）、３．９９（ｍ，１Ｈ）、３．８５−３．７７（ｍ，１Ｈ）、３．７６（ｓ，６Ｈ）、３．７５−３．６３（ｍ，４Ｈ）、３．５４（ｍ，２Ｈ）、３．３０（ｍ，１Ｈ）、３．１１−３．０３（ｍ，１Ｈ）、２．５９−２．４４（ｍ，１Ｈ）、１．６５（ｓ，３Ｈ）、１．２３（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、１Ｈ）、１．１１（ｄｄ，Ｊ＝６．７、２．２Ｈｚ、９Ｈ）、１．０３（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）：δ １５０．０６、１４９．６１、１５．１３（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ）。
実施例１７．ホスホロアミダイト５０８の合成
Figure 2020505032
 化合物５０１：化合物５００（６ｇ、７．７０ｍｍｏｌ）及び２−（ベンジルオキシ）エタノール（１．２０ｍＬ、８．１１７ｍｍｏｌ）を反応フラスコ中に加え、無水トルエンに溶解させた。溶媒を減圧下で除去した。これを３回繰り返し、高真空下に置いて一晩乾燥させた。翌日、撹拌子及び分子篩を加え、排気し、アルゴンで３回パージした。無水エーテルを、シリンジを介して加え、反応物を、氷浴を用いて０℃に冷却した。それを１０分間撹拌し、次にトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（０．１３９ｍＬ、０．７７ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。反応物を３時間撹拌させ、次にＴＬＣ（２０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了し、それをトリメチルアミンでクエンチした。溶液を酢酸エチルで希釈し、分子篩をろ過して取り除いた。溶液を分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して５．８７ｇの５０１を得た。Ｃ４３Ｈ３８Ｏ１１についての質量計算値：７３０．７７、実測値：７５３．２（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物５０２：化合物５０１（５．６２ｇ、７．７０ｍｍｏｌ）を１５０ｍＬの無水メタノールに溶解させた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。メタノール中のナトリウムメトキシド（０．５Ｍ、６．１６ｍＬ、３．０８ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。反応物を室温で一晩撹拌させた。反応をＴＬＣ（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、２０滴の氷酢酸を加えることにより、それをｐＨ７に中和した。溶媒を減圧下で除去して３．６３ｇの５０２を得た。Ｃ１５Ｈ２２Ｏ７についての質量計算値：３１４．３３、実測値：３３７．１（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物５０３：化合物５０２（２．４２ｇ、７．７０ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（１．５７ｇ、２３．１ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。無水ピリジンを、シリンジを介して加え、出発材料を溶解させた。反応物を室温で１０分間撹拌し、次にピリジン中のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１．７４ｇ、１１．５５ｍｍｏｌ）の溶液を、シリンジを介して加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（１００％のＥｔＯＡｃ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、メタノールを加えて、反応をクエンチし、１０分間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン及び水を加えた。混合物を分液漏斗に加え、有機層を分離し、水層をジクロロメタンで洗浄した。有機層を組み合わせて、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して２．５７ｇ（７８．１％）の５０３を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ７．４０−７．１６（ｍ，２Ｈ）、４．７４（ｄｄ，Ｊ＝５．８、４．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．６７−４．５４（ｍ，１Ｈ）、４．４８（ｓ，１Ｈ）、３．７８−３．６７（ｍ，１Ｈ）、３．６５−３．４８（ｍ，２Ｈ）、３．４５（ｍ，１Ｈ）、３．４２−３．２３（ｍ，１Ｈ）、０．８４（ｓ，４Ｈ）、０．０２（ｓ，３Ｈ）．Ｃ２１Ｈ３６Ｏ７Ｓｉについての質量計算値：４２８．６０、実測値：４５１．２（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物５０４：化合物５０３（２．５０ｇ、５．８４ｍｍｏｌ）及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．７１４ｇ、５．８４ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。無水ピリジン（１００ｍＬ）を、シリンジを介して加えた。安息香酸無水物（５．２８ｇ、２３．３６ｍｍｏｌ）のピリジン溶液を、シリンジを介して反応混合物に加え、反応物を室温で一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（２０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、水を加えて、反応をクエンチし、１０分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。ＥｔＯＡｃ及び水を加え、分液漏斗に入れた。有機層を分離し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して３．７８ｇ（８７．５％）の５０４を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．０９−７．８９（ｍ，２Ｈ）、７．９１−７．７８（ｍ，２Ｈ）、７．７８−７．６５（ｍ，３Ｈ）、７．６５−７．５１（ｍ，４Ｈ）、７．４６（ｑ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４１−７．３１（ｍ，６Ｈ）、７．３１−７．２１（ｍ，１Ｈ）、５．９６（ｔ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．７０−５．５３（ｍ，２Ｈ）、５．２０（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．５８（ｓ，２Ｈ）、４．２１（ｍ，１Ｈ）、３．９６−３．７５（ｍ，２Ｈ）、３．７５−３．６０（ｍ，４Ｈ）、０．８６（ｓ，８Ｈ）、−０．１２（ｓ，５Ｈ）．Ｃ４２Ｈ４８Ｏ１０Ｓｉについての質量計算値：７４０．９２、実測値：７６３．３（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物５０５：化合物５０４（２．３２ｇ、３．１３ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。シリンジを介して無水テトラヒドロフランを加えることによって出発材料を溶解させた。次に、１０％のパラジウム炭素、デグサタイプ、（２７８ｍｇ、１０重量％）を加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。次に、反応フラスコを排気し、バルーンからの水素で２回パージした。反応物を室温で一晩撹拌させた。反応をＴＬＣ（３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した後、反応混合物を排気し、アルゴンで３回パージした。反応混合物をセライトに通してろ過して、パラジウム炭素を除去し、メタノールで洗浄した。母液を減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して１．２０ｇ（５９．１％）の５０５を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．０６−７．９５（ｍ，２Ｈ）、７．９５−７．８２（ｍ，２Ｈ）、７．７９−７．６３（ｍ，２Ｈ）、７．６４−７．５０（ｍ，３Ｈ）、７．４５（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．３６（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ）、５．９６（ｔ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．６７（ｄｄ，Ｊ＝１０．２、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．６０（ｄｄ，Ｊ＝３．３、１．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．１６（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．８５（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．２３（ｍ，１Ｈ）、３．８０（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ、３Ｈ）、３．７１−３．５４（ｍ，３Ｈ）、０．８７（ｓ，７Ｈ）、−０．０９（ｓ，４Ｈ）．Ｃ３５Ｈ４２Ｏ１０Ｓｉについての質量計算値：６５０．８０、実測値：６７３．３（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物５０６：化合物５０５（１．２０ｇ、１．８４ｍｍｏｌ）及び５０ｍＬの無水ピリジンを反応フラスコに加えた。ピリジンを減圧下で除去し、これを３回繰り返し、残渣を高真空下で一晩乾燥させた。翌日、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．０２２ｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．２５１ｍＬ、１．８４ｍｍｏｌ）及び無水ピリジンを反応フラスコに加えた。反応物を、氷浴を用いて０℃に冷却した。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．６９１ｇ、２．０４ｍｍｏｌ）を無水ピリジンに溶解させ、得られた溶液を、シリンジを介して反応フラスコに加えた。反応物を室温に到達させ、一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（２０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了した。メタノールを加えて、反応をクエンチし、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して１．６８ｇ（９６％）の５０６を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．０７−７．９２（ｍ，２Ｈ）、７．８１−７．６２（ｍ，５Ｈ）、７．５６（ｍ，４Ｈ）、７．５０−７．４１（ｍ，２Ｈ）、７．４１−７．２７（ｍ，１０Ｈ）、７．２８−７．１９（ｍ，２Ｈ）、６．９８−６．８６（ｍ，４Ｈ）、５．９８（ｔ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．７６（ｄｄ，Ｊ＝１０．２、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．６４（ｄｄ，Ｊ＝３．３、１．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．２２（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．３６（ｍ，１Ｈ）、４．０１（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．９３（ｍ，１Ｈ）、３．７９（ｍ，３Ｈ）、３．７１（ｓ，７Ｈ）、３．３１−３．１６（ｍ，２Ｈ）、１．１６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）、０．８８（ｓ，９Ｈ）、−０．０８（ｓ，５Ｈ）．Ｃ５６Ｈ６０Ｏ１２Ｓｉについての質量計算値：９５３．１７、実測値：９７５．４（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物５０７：化合物５０６（１．６０ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）をプラスチック製反応容器に加えた。ジクロロメタン（１６ｍＬ）を加えて、出発材料を溶解させた。アセトニトリル（４８ｍＬ）、ピリジン（３２ｍＬ）及びトリメチルアミン（８ｍＬ）を加えた。反応容器をパージし、氷浴中で冷却した。反応物を撹拌し、次にフッ化水素ピリジン錯体（８ｍＬ）を慎重に加えた。反応物を撹拌し、５時間にわたって室温に温めた。反応をＴＬＣ（３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、リンモリブデン酸を用いて発色させた。２００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムを氷浴中で冷却し、撹拌した。反応混合物を、冷却された重炭酸塩溶液にゆっくりと加えて、反応をクエンチした。いくらかの泡立ちがあったため、注意しなければならない。これを３０分間撹拌した。溶液を減圧下で濃縮した。ジクロロメタンを加え、分液漏斗に加えた。有機層を分離し、飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して１．２９ｇ（９１．４％）の５０７を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．０５−７．９８（ｍ，２Ｈ）、７．７３（ｍ，５Ｈ）、７．６６−７．５１（ｍ，４Ｈ）、７．５１−７．４４（ｍ，２Ｈ）、７．４４−７．３０（ｍ，１０Ｈ）、７．２８−７．１９（ｍ，１Ｈ）、６．９７−６．８８（ｍ，４Ｈ）、５．９０−５．７５（ｍ，２Ｈ）、５．６６（ｄｄ，Ｊ＝３．２、１．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．２２（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．０６（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．３１（ｍ，１Ｈ）、４．０２（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．９５（ｍ，１Ｈ）、３．７５（ｍ，１Ｈ）、３．６８−３．５５（ｍ，２Ｈ）、３．３２−３．１５（ｍ，２Ｈ）、１．９８（ｓ，１Ｈ）、１．１６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）．Ｃ５０Ｈ４６Ｏ１２についての質量計算値：８３８．９１、実測値：８６１．３（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物５０８：化合物５０７（１．１９ｇ、１．４２ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。出発材料をジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミンジイソプロピルエチルアミン（０．４９５ｍＬ、２．８４ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．３７８ｍＬ、１．７０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応をＴＬＣ（３５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、反応物を減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して０．４２７ｇ（２９％）の５０８を得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）：δ ８．０６（ｍ，２Ｈ）、７．８１−７．７３（ｍ，３Ｈ）、７．７０（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．６０−７．４８（ｍ，５Ｈ）、７．４３（ｍ，４Ｈ）、７．３９−７．３０（ｍ，５Ｈ）、７．２８−７．２１（ｍ，１Ｈ）、６．９６−６．８９（ｍ，３Ｈ）、５．９８−５．８１（ｍ，２Ｈ）、４．５６（ｍ，１Ｈ）、４．０４（ｍ，１Ｈ）、３．９７−３．７６（ｍ，４Ｈ）、３．７４（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ、６Ｈ）、３．６１（ｍ，２Ｈ）、３．３７（ｍ，１Ｈ）、３．２８（ｍ，１Ｈ）、２．５３（ｍ，２Ｈ）、２．１４（ｓ，７Ｈ）、１．１８−１．１１（ｍ，７Ｈ）、１．１０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、３Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）：δ １４９．８５、１４９．５６。
実施例１８．ホスホロアミダイト５１５の合成
Figure 2020505032
 化合物５０９：化合物５００（６．０ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）及び５−ベンジルオキシ−１−ペンタノール（２．０３ｍＬ、１０．５５ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、無水トルエンに溶解させた。溶媒を減圧下で除去した。これを３回繰り返し、高真空下に置いて一晩乾燥させた。翌日、撹拌子及び分子篩を加え、排気し、アルゴンで３回パージした。無水エーテルを、シリンジを介して加え、反応物を、氷浴を用いて０℃に冷却した。反応物を１０分間撹拌し、次にトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（０．２９３ｍＬ、１．６２ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。反応物を４時間撹拌させ、次にＴＬＣ（３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。反応が完了し、それをトリメチルアミンでクエンチした。溶液を酢酸エチルで希釈し、分子篩をろ過して取り除いた。溶液を分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して５．４６ｇ（８７％）の５０９を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．３６（ｄ，Ｊ＝４５．３Ｈｚ、２Ｈ）、８．０４（ｄｄ，Ｊ＝８．３、１．４Ｈｚ、２Ｈ）、７．９２（ｍ，４Ｈ）、７．７８−７．６３（ｍ，４Ｈ）、７．６３−７．３７（ｍ，８Ｈ）、７．３４（ｄｄ，Ｊ＝１５．６、６．１Ｈｚ、６Ｈ）、５．９８（ｔ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．７１（ｄｄ，Ｊ＝１０．１、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．６１（ｄｄ，Ｊ＝３．３、１．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．２０（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．７２−４．５６（ｍ，１Ｈ）、４．５５−４．４０（ｍ，４Ｈ）、３．８０（ｍ，１Ｈ）、３．５８（ｍ，１Ｈ）、３．４４（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ、２Ｈ）、１．９７（ｓ，１Ｈ）、１．７６−１．５１（ｍ，４Ｈ）、１．４５（ｍ，２Ｈ）、１．１５（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）．Ｃ４６Ｈ４４Ｏ１１についての質量計算値：７７２．８５、実測値：７９５．３（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物５１０：化合物５０９（６．３９ｇ、８．２７ｍｍｏｌ）を１５０ｍＬの乾燥メタノールに溶解させた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。メタノール中のナトリウムメトキシド（０．５Ｍ、６．６２ｍＬ、３．３１ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。反応物を室温で一晩撹拌させた。反応をＴＬＣ（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。２０滴の氷酢酸を加えることにより、反応物をｐＨ７に中和し、溶媒を減圧下で濃縮して２．９５ｇ（１００％）の５１０を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．００−７．９２（ｍ，４Ｈ）、７．６５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、７．５２（ｄｄ，Ｊ＝８．４、７．１Ｈｚ、４Ｈ）、７．３８−７．２１（ｍ，４Ｈ）、４．５７（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．４３（ｓ，２Ｈ）、３．８４（ｓ，７Ｈ）、３．６７−３．５３（ｍ，３Ｈ）、３．４８−３．３３（ｍ，５Ｈ）、３．２７（ｍ，２Ｈ）、１．６７（ｓ，１Ｈ）、１．５１（ｍ，４Ｈ）、１．４１−１．２８（ｍ，２Ｈ）．Ｃ１８Ｈ２８Ｏ７についての質量計算値：３５６．４２、実測値：３７９．２（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物５１１：化合物５１０（２．９５ｇ、８．２８ｍｍｏｌ）及び無水ピリジンを反応フラスコに加えた。ピリジンを減圧下で除去した。これを３回行い、一晩、高真空下に置いた。翌日、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．１０１ｇ、０．８２８ｍｍｏｌ）、トリメチルアミン（１．１３ｍＬ、８．２８ｍｍｏｌ）及び無水ピリジンを反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージし、氷浴を用いて０℃に冷却した。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（３．０９ｇ、９．１１ｍｍｏｌ）を無水ピリジンに溶解させ、シリンジを介して反応フラスコに加えた。反応物を室温に到達させ、一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（３％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。メタノールを加えて、反応をクエンチし、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮し、高真空下に置いて３．０ｇ（５５％）の５１１を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ７．４４−７．３７（ｍ，２Ｈ）、７．３３−７．２１（ｍ，１０Ｈ）、７．２０−７．１３（ｍ，１Ｈ）、６．９０−６．８１（ｍ，４Ｈ）、４．７３（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．６９−４．６０（ｍ，２Ｈ）、４．５５（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．４２（ｓ，２Ｈ）、３．８１（ｍ，１Ｈ）、３．７１（ｓ，６Ｈ）、３．６７−３．５６（ｍ，２Ｈ）、３．５１−３．３９（ｍ，４Ｈ）、３．３１（ｓ，１Ｈ）、３．３０−３．１６（ｍ，２Ｈ）、１．６２（ｍ，４Ｈ）、１．５３−１．３８（ｍ，２Ｈ）．Ｃ３９Ｈ４６Ｏ９についての質量計算値：６５８．７９、実測値：６８１．３（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物５１２：化合物５１１（３．０ｇ、４．５６ｍｍｏｌ）及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．５５７ｇ、４．５６ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。無水ピリジンを、シリンジを介して加えた。安息香酸無水物（４．１３ｇ、１８．２４ｍｍｏｌ）のピリジン溶液を、シリンジを介して反応混合物に加え、反応物を室温で一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（２０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。水を加えて、反応をクエンチし、１０分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。残渣を酢酸エチルに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を減圧下で濃縮して化合物５１２を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．１１−８．０４（ｍ，２Ｈ）、７．７７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．７１（ｍ，４Ｈ）、７．６６−７．４９（ｍ，４Ｈ）、７．４３−７．３４（ｍ，６Ｈ）、７．２９（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ、４Ｈ）、７．２５−７．０８（ｍ，８Ｈ）、６．７３−６．６１（ｍ，４Ｈ）、５．６４−５．５６（ｍ，２Ｈ）、５．２４（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４３（ｓ，２Ｈ）、４．２４（ｍ，１Ｈ）、３．７７（ｍ，１Ｈ）、３．６０（ｓ，７Ｈ）、３．４４（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ、２Ｈ）、３．３７−３．２９（ｍ，２Ｈ）、３．０８（ｄｄ，Ｊ＝１０．６、３．６Ｈｚ、１Ｈ）、１．７４−１．５４（ｍ，４Ｈ）、１．５２−１．３９（ｍ，２Ｈ）．Ｃ６０Ｈ５８Ｏ１２についての質量計算値：９７１．１１、実測値：９９３．４（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物５１３：化合物５１２（１．５ｇ、１．５５ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。シリンジを介して無水テトラヒドロフランを加えることによって出発材料を溶解させた。次に、１０％のパラジウム炭素（１５０ｍｇ、１０重量％）、デグサタイプを加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。次に、反応フラスコを排気し、バルーンからの水素で２回パージした。反応物を室温で一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、リンモリブデン酸を用いて発色させた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。反応混合物をセライトに通してろ過して、パラジウム炭素を除去し、メタノールで洗浄した。母液を減圧下で濃縮し、シリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（１０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製した。生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して０．７７９ｇ（５７％）の５１３を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．０５（ｍ，３Ｈ）、７．９６−７．８８（ｍ，１Ｈ）、７．８４−７．７６（ｍ，２Ｈ）、７．７２（ｍ，５Ｈ）、７．６６−７．５１（ｍ，６Ｈ）、７．４９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．４５−７．３３（ｍ，７Ｈ）、７．２６−７．０８（ｍ，７Ｈ）、６．７４−６．６０（ｍ，４Ｈ）、５．７８（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．６４−５．５３（ｍ，２Ｈ）、５．２４（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．５７（ｄｄ，Ｊ＝１１．９、４．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．３７（ｍ，２Ｈ）、４．２９−４．１１（ｍ，２Ｈ）、４．０１（ｍ，１Ｈ）、３．７４（ｍ，６．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．６０（ｓ，７Ｈ）、３．５６−３．４８（ｍ，１Ｈ）、３．５０−３．３８（ｍ，３Ｈ）、３．３８−３．２９（ｍ，２Ｈ）、３．０８（ｄｄ，Ｊ＝１０．６、３．７Ｈｚ、１Ｈ）、１．６４（ｍ，３Ｈ）、１．５４−１．３３（ｍ，６Ｈ）．Ｃ５３Ｈ５２Ｏ１２についての質量計算値：８８０．９９、実測値：９０３．３（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物５１５：化合物５１３（０．７７６ｇ、０．８８２ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミンジイソプロピルエチルアミン（０．３０７ｍＬ、１．７６ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．２３６ｍＬ、１．０６ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で１時間撹拌した。反応をＴＬＣによって確認し、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して０．３２４ｇ（３４％）の５１５を得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）：δ ８．１５−８．０７（ｍ，３Ｈ）、８．０４−７．８８（ｍ，２Ｈ）、７．８１−７．７４（ｍ，４Ｈ）、７．６９（ｍ，２Ｈ）、７．６０−７．５４（ｍ，４Ｈ）、７．５４−７．４９（ｍ，２Ｈ）、７．４９−７．４２（ｍ，３Ｈ）、７．４０（ｑ，Ｊ＝８．０Ｈｚ、３Ｈ）、７．３３（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．２８（ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ、４Ｈ）、７．１８（ｍ，３Ｈ）、６．７３−６．６３（ｍ，４Ｈ）、６．１１（ｔ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．６９−５．６２（ｍ，２Ｈ）、５．１５（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．３２−４．２５（ｍ，１Ｈ）、３．９０−３．７９（ｍ，２Ｈ）、３．８０−３．６８（ｍ，４Ｈ）、３．６６（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ、７Ｈ）、３．６４−３．４８（ｍ，６Ｈ）、３．４４−３．３３（ｍ，１Ｈ）、３．１４（ｄｄ，Ｊ＝１０．６、３．９Ｈｚ、１Ｈ）、２．６１（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．１３（ｓ，１Ｈ）、１．８０−１．５９（ｍ，６Ｈ）、１．５９−１．４３（ｍ，３Ｈ）、１．２０−１．１２（ｍ，１６Ｈ）、１．１０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、１Ｈ）、１．００（ｄｄ，Ｊ＝６．８、４．３Ｈｚ、２Ｈ）、０．９２（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、１Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）：δ １５２．５５、１５１．９０、１４８．３６。
実施例１９．ホスホロアミダイト６１０の合成
Figure 2020505032
 化合物６１０：出発化合物６０９（１．５ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をアセトニトリルに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミンジイソプロピルエチルアミン（０．３２６ｍＬ、１．８７ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．８４４ｍＬ、２．５６ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。１Ｈ−テトラゾールの溶液（４．１６ｍＬ、１．８７ｍｍｏｌ、０．４５Ｍ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応をＴＬＣ（６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（１０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して１．３３ｇ（７２％）の６１０を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）：δ ７．９７−７．８７（ｍ，３Ｈ）、７．８３−７．７６（ｍ，２Ｈ）、７．６２−７．４６（ｍ，２Ｈ）、７．４６−７．３２（ｍ，６Ｈ）、７．３０−７．０７（ｍ，８Ｈ）、６．７２−６．６１（ｍ，３Ｈ）、６．０６（ｄｄ，Ｊ＝２．９、１．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．６９−５．５６（ｍ，２Ｈ）、４．７２（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．０８（ｄｄ，Ｊ＝８．３、５．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．９３（ｍ，１Ｈ）、３．８４−３．７４（ｍ，２Ｈ）、３．６９（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、５Ｈ）、３．６２−３．４９（ｍ，３Ｈ）、３．４９−３．３９（ｍ，２Ｈ）、３．３９−３．２２（ｍ，２Ｈ）、２．５９（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．５１−１．３７（ｍ，２Ｈ）、１．２３（ｄ，Ｊ＝２１．３Ｈｚ、２Ｈ）、１．１４（ｄｄ，Ｊ＝１６．６、６．８Ｈｚ、９Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）：δ １４７．８０、１４７．７８
実施例２０．ホスホロアミダイト６１８の合成
Figure 2020505032
 化合物６１８：出発化合物６１７（１．５ｇ、１．７９ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をアセトニトリルに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミンジイソプロピルエチルアミン（０．３４３ｍＬ、１．９７ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．８８７ｍＬ、２．６９ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。１Ｈ−テトラゾールの溶液（４．３７ｍＬ、１．９７ｍｍｏｌ、０．４５Ｍ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応をＴＬＣ（６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（１０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して１．５４ｇ（８３％）の化合物６１７を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）：δ ８．１１−８．０３（ｍ，２Ｈ）、７．９２−７．８４（ｍ，２Ｈ）、７．８３−７．７５（ｍ，２Ｈ）、７．６５−７．５５（ｍ，１Ｈ）、７．５０−７．３９（ｍ，４Ｈ）、７．３６（ｍ，２Ｈ）、７．２９−７．１２（ｍ，１１Ｈ）、６．７８−６．６８（ｍ，４Ｈ）、５．９６（ｍ，１Ｈ）、５．８１（ｍ，１Ｈ）、５．６０（ｍ，１Ｈ）、４．９６（ｄｄ，Ｊ＝８．０、５．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．１７（ｍ，１Ｈ）、４．０８−３．９９（ｍ，１Ｈ）、３．９７−３．８７（ｍ，１Ｈ）、３．８７−３．７９（ｍ，２Ｈ）、３．７６（ｓ，８Ｈ）、３．７３−３．６８（ｍ，１Ｈ）、３．５４（ｍ，２Ｈ）、３．３３（ｍ，１Ｈ）、３．１３（ｄｄ，Ｊ＝１０．２、４．７Ｈｚ、１Ｈ）、２．６２（ｍ，１Ｈ）、２．５０（ｍ，１Ｈ）、１．１３（ｄｄ，Ｊ＝６．８、１．４Ｈｚ、８Ｈ）、１．０６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）：δ １４９．７１、１４９．５３。
実施例２１．ホスホロアミダイト６２９の合成
Figure 2020505032
 化合物６２９：出発化合物６２８（１．５ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をアセトニトリルに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミンジイソプロピルエチルアミン（０．３２６ｍＬ、１．８７ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．８４５ｍＬ、２．５６ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。１Ｈ−テトラゾールの溶液（４．１５ｍＬ、１．８７ｍｍｏｌ、０．４５Ｍ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応をＴＬＣ（７０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（１０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して１．２１ｇ、（６６％）の６２９を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）：δ ８．００−７．９２（ｍ，２Ｈ）、７．８７−７．７９（ｍ，２Ｈ）、７．７５−７．６８（ｍ，２Ｈ）、７．５６−７．４６（ｍ，２Ｈ）、７．４６−７．３６（ｍ，５Ｈ）、７．３０（ｍ，８Ｈ）、７．２３−７．０７（ｍ，３Ｈ）、６．７３−６．６３（ｍ，４Ｈ）、５．７８（ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．６４（ｑ，Ｊ＝９．７、９．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．５２（ｄｄ，Ｊ＝９．７、７．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．８０（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．００（ｍ，１Ｈ）、３．８６（ｍ，１Ｈ）、３．７７（ｍ，６．４、２．３、１．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．７０（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ、６Ｈ）、３．６６−３．４５（ｍ，４Ｈ）、３．４２（ｔ，Ｊ＝８．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．３４（ｄｄ，Ｊ＝１０．６、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．２５（ｄｄ，Ｊ＝１０．５、４．９Ｈｚ、１Ｈ）、２．６３−２．５１（ｍ，２Ｈ）、１．７３−１．５９（ｍ，３Ｈ）、１．５８（ｓ，３Ｈ）、１．３６（ｓ，１Ｈ）、１．１５（ｄｄ，Ｊ＝１３．５、６．８Ｈｚ、１２Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）：δ １４７．７８。
実施例２２．ホスホロアミダイト６３７の合成
Figure 2020505032
 化合物６３７：ホスホロアミダイト前駆体６３６を、上記のスキームに記載されるように、保護された糖６２３から調製した。化合物６３６（１．５ｇ、１．７９ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をアセトニトリルに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（０．３４３ｍＬ、１．９７ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．８８７ｍＬ、２．６９ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。１Ｈ−テトラゾールの溶液（４．３８ｍＬ、１．９７ｍｍｏｌ、０．４５Ｍ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応をＴＬＣ（７０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（１０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して１．５７ｇ、（８４％）の６３７を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）：δ ７．９３（ｍ，２Ｈ）、７．９１−７．７９（ｍ，４Ｈ）、７．６０−７．４８（ｍ，１Ｈ）、７．４８−７．３７（ｍ，４Ｈ）、７．３７−７．３２（ｍ，２Ｈ）、７．３２−７．１０（ｍ，１１Ｈ）、６．７７−６．６６（ｍ，４Ｈ）、５．８８（ｍ，１Ｈ）、５．６３−５．４５（ｍ，２Ｈ）、４．９９−４．８５（ｍ，１Ｈ）、４．０８−３．８４（ｍ，３Ｈ）、３．８４−３．６９（ｍ，１０Ｈ）、３．５５（ｍ，２Ｈ）、３．３６−３．２４（ｍ，１Ｈ）、３．１４−３．０３（ｍ，１Ｈ）、２．５２（ｍ，２Ｈ）、１．２６（ｓ，１Ｈ）、１．１８−１．０５（ｍ，１０Ｈ）、１．０５−０．９１（ｍ，１Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）：δ １５１．９４、１５１．７６、１４９．６２。
実施例２３．ホスホロアミダイト６４５の合成
Figure 2020505032
 化合物６４５：ホスホロアミダイト前駆体６４４を、上記のスキームに記載されるように、保護された糖６３８から調製した。化合物６４４（１．５ｇ、１．８４ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をアセトニトリルに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（０．３５２ｍＬ、２．０２ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．９１０ｍＬ、２．７６ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。１Ｈ−テトラゾールの溶液（４．４９ｍＬ、２．０２ｍｍｏｌ、０．４５Ｍ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応をＴＬＣ（６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（１０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して０．９５１ｇ、（５１％）の６４５を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）：δ ７．９７−７．８９（ｍ，２Ｈ）、７．７２−７．６５（ｍ，２Ｈ）、７．５３−７．３９（ｍ，４Ｈ）、７．３６（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．３２−７．２３（ｍ，６Ｈ）、７．２２−７．０５（ｍ，３Ｈ）、６．７１−６．６１（ｍ，４Ｈ）、５．７９（ｄｄ，Ｊ＝１５．９、９．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．６３−５．５３（ｍ，２Ｈ）、４．７７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．２５−４．１３（ｍ，１Ｈ）、４．０５−３．９４（ｍ，１Ｈ）、３．８８−３．７２（ｍ，３Ｈ）、３．６９（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ、７Ｈ）、３．５９（ｍ，４Ｈ）、３．３１（ｄｄ，Ｊ＝１０．５、２．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．１７（ｄｄ，Ｊ＝１０．５、４．８Ｈｚ、１Ｈ）、２．５９（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．８９（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ、３Ｈ）、１．７８−１．６１（ｍ，６Ｈ）、１．４９（ｑ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、１．１７（ｄｄ，Ｊ＝６．８、４．４Ｈｚ、１１Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）：δ １４７．８２、１４７．６６
実施例２４．ホスホロアミダイト６５３の合成
Figure 2020505032
 化合物６５３−ホスホロアミダイト前駆体６５２を、上記のスキームに記載されるように、保護された糖６３８から調製した。化合物６５２（１．５ｇ、１．９３ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をアセトニトリルに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（０．３６９ｍＬ、２．１２ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．９５３ｍＬ、２．８９ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。１Ｈ−テトラゾールの溶液（４．７１ｍＬ、２．１２ｍｍｏｌ、０．４５Ｍ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応をＴＬＣ（７０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。粗残渣を最小限のジクロロメタンに溶解させ、９０／１０のヘキサン／エーテルの溶液に滴下して加えた。油性の沈殿物が形成され、それを１０分間撹拌し、溶媒をデカントして取り除いた。残っている残渣をジクロロメタンに溶解させ、フラスコに移し、それを減圧下で濃縮して化合物１．６８ｇ、（８９％）の６５３を得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）：δ ７．９１（ｍ，４Ｈ）、７．５４−７．４７（ｍ，２Ｈ）、７．４７−７．３８（ｍ，３Ｈ）、７．３８−７．３２（ｍ，７Ｈ）、７．３２−７．２４（ｍ，３Ｈ）、６．８９−６．７９（ｍ，４Ｈ）、５．６１（ｍ，１Ｈ）、５．５７−５．４２（ｍ，２Ｈ）、４．８３（ｄｄ，Ｊ＝８．３、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．３１−４．１５（ｍ，２Ｈ）、４．０８−３．９８（ｍ，１Ｈ）、３．９４−３．８１（ｍ，２Ｈ）、３．８２−３．７２（ｍ，１１Ｈ）、３．６０−３．４５（ｍ，３Ｈ）、３．３８（ｍ，１Ｈ）、３．２２−３．１４（ｍ，１Ｈ）、２．５７−２．４５（ｍ，２Ｈ）、１．６９（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ、４Ｈ）、１．３６−１．２０（ｍ，６Ｈ）、１．２０−１．０５（ｍ，１２Ｈ）、０．８８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）：δ １４９．７３、１４９．５４。
実施例２５．ホスホロアミダイト６５９の合成
Figure 2020505032
 化合物６５９：出発材料６５４をイソプロピルシリル誘導体で処理して化合物６５５を得る。これをグルコーストリクロロアセトイミダートとさらに反応させた後、シリル脱保護及びＤＭＴｒの導入を行って化合物６５８を得る。実施例２１において前述される通常のプロトコルを用いて、これからアミダイトを合成する。
実施例２６．ホスホロアミダイト１００９の合成
Figure 2020505032
 化合物１００１ − 出発化合物１０００（１０ｇ、８５．３８ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をジクロロメタンに溶解させ、トリエチルアミン（２３．７９ｍＬ、１７０．７ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（３１．９ｇ、１２８ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタンに溶解させ、次にシリンジを介して反応混合物に加えた。反応物を室温で１時間撹拌した。反応をＴＬＣ（５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、反応物を減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を１０％のクエン酸溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（１０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して１７．９ｇ、（８３％）の１００１を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ７．４０−７．２５（ｍ，４Ｈ）、７．２１（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．９９（ｓ，２Ｈ）、４．３１（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．３６（ｍ，２Ｈ）、２．９６（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、１．３８（ｍ，４Ｈ）、１．３２−１．１７（ｍ，Ｊ＝５．２、４．６Ｈｚ、４Ｈ）。
化合物１００２ − 化合物１００１（１７．５ｇ、６９．７ｍｍｏｌ）及び５０ｍＬの無水ピリジンを反応フラスコに加えた。ピリジンを減圧下で除去した。これを３回繰り返し、高真空下で一晩乾燥させた。翌日、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．８５１ｇ、６．９７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（９．７１ｍＬ、６９．７ｍｍｏｌ）及び無水ピリジンを反応フラスコに加えた。反応物を、氷浴を用いて０℃に冷却した。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（２６．２ｇ、７７．４ｍｍｏｌ）を無水ピリジンに溶解させ、得られた溶液を、シリンジを介して反応フラスコに加えた。反応物を室温に到達させ、一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、反応物を減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（１０％〜５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して３７．２ｇ、（９６％）の１００２を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ７．４１−７．２６（ｍ，９Ｈ）、７．２１（ｄｄ，Ｊ＝８．７、６．７Ｈｚ、７Ｈ）、６．９１−６．７９（ｍ，５Ｈ）、４．９８（ｓ，２Ｈ）、３．７２（ｓ，７Ｈ）、２．９３（ｍ，４Ｈ）、１．５１（ｍ，２Ｈ）、１．３６（ｍ，２Ｈ）、１．２９（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ、２Ｈ）
化合物１００３ − 化合物１００２（３６ｇ、６５．０７ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。無水メタノール、酢酸エチル及び１滴のトリメチルアミンを加えることによって出発材料を溶解させた。次に、１０％のパラジウム炭素、デグサタイプ、（３．６ｇ、１０重量％）を加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。次に、反応フラスコを排気し、バルーンからの水素で２回パージした。反応物を室温で３時間撹拌させた。反応をＴＬＣ（３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、排気し、アルゴンで３回パージした。反応混合物をセライトに通してろ過して、パラジウム炭素を除去し、メタノールで洗浄した。母液を減圧下で濃縮して２７．３ｇ、（１００％）の１００３を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ７．３９−７．３２（ｍ，２Ｈ）、７．２９（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．２６−７．１６（ｍ，５Ｈ）、６．９１−６．８４（ｍ，４Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、２．９３（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、３Ｈ）、２．４６（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、１．５２（ｍ，２Ｈ）、１．２９（ｍ，３Ｈ）、１．２１（ｄ，Ｊ＝１３．８Ｈｚ、２Ｈ）。
化合物１００６ − 出発化合物１００４（５ｇ、１５．４７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（６．１６ｇ、１６．２４ｍｍｏｌ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（２．０９ｇ、１５．４７ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。化合物１００３（６．８１ｇ、１６．２４ｍｍｏｌ）を別個のフラスコに加え、ジメチルホルムアミドに溶解させた。シリンジを介してジイソプロピルエチルアミン（８．０８ｍＬ、４６．４１ｍｍｏｌ）を加えることによって反応物を予め活性化し、反応物が黄色に変化した。室温で５分間撹拌させ、次にシリンジを介して化合物１００３の溶液を加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、水中で沈殿させた。沈殿物をろ過して取り出し、水で洗浄した。固体を高真空下で一晩乾燥させた。残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭに溶解させ、シリカゲルを加えることにより、残渣をシリカ上に予め充填した。このスラリーを減圧下で濃縮し、高真空下で乾燥させた。これをシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して８．９ｇ、（７９％）の１００６を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．１６（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．０８（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．６９（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．４８（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．３８−７．２６（ｍ，９Ｈ）、７．２５−７．１６（ｍ，５Ｈ）、６．９２−６．８３（ｍ，４Ｈ）、５．０２（ｓ，２Ｈ）、３．７２（ｓ，８Ｈ）、３．６５（ｄｄ，Ｊ＝７．９、５．４Ｈｚ、４Ｈ）、３．００（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、２．９２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．５１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、１．３７（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、１．３３−１．２４（ｍ，２Ｈ）、１．２４−１．１３（ｍ，２Ｈ）。
化合物１００７ − 化合物１００６（７．８７ｇ、１０．８６ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。無水メタノールを加えることによって出発材料を溶解させた。次に、１０％のパラジウム炭素、デグサタイプ、（０．７８７ｇ、１０重量％）を加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。次に、反応フラスコを排気し、バルーンからの水素で２回パージした。反応物を室温で３時間撹拌させた。反応をＴＬＣ（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、排気し、アルゴンで３回パージした。反応混合物をセライトに通してろ過して、パラジウム炭素を除去し、メタノールで洗浄した。母液を減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して５．２０ｇ、（８１％）の１００７を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．１０（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．６９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．３８−７．３３（ｍ，１Ｈ）、７．３０（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．２５−７．１７（ｍ，２Ｈ）、６．９２−６．８３（ｍ，２Ｈ）、３．７２（ｓ，４Ｈ）、３．６４（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．１２（ｓ，１Ｈ）、３．０１（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、１Ｈ）、２．９３（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ）、２．４１（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）、１．８５（ｓ，１Ｈ）、１．５２（ｍ，１Ｈ）、１．３６（ｍ，１Ｈ）、１．２９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、１．１９（ｍ，１Ｈ）、０．９２（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）。
化合物１００８ − 化合物１００７（１．５８ｇ、２．６８ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。カプロラクトンを加えて、出発材料を溶解させ、１滴のトリメチルアミンを加えて、反応物を塩基性に保った。反応物を４０℃で４日間加熱した。反応をＴＬＣ（１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、減圧下で濃縮した。残渣をエーテル中で沈殿させ、スラリーを３０分間撹拌して良好な固体を得た。沈殿物をろ過して取り出し、エーテルで洗浄し、高真空下で乾燥させて１．３８ｇ、（７３％）の１００８を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）：δ ７．４５−７．３７（ｍ，２Ｈ）、７．３２−７．２３（ｍ，６Ｈ）、７．２２−７．１４（ｍ，１Ｈ）、６．８８−６．７９（ｍ，４Ｈ）、３．９３−３．８１（ｍ，７Ｈ）、３．７７（ｓ，６Ｈ）、３．５４（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．１７（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、３．０４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．２８（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．７１（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ）、１．６８−１．４５（ｍ，９Ｈ）、１．３９（ｍ，４Ｈ）、１．３４−１．２２（ｍ，２Ｈ）。
化合物１００９ − 化合物１００８（１．３８ｇ、１．９６ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をＤＣＭとアセトニトリルとの混合物に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（０．３７５ｍＬ、２．１５ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．９６９ｍＬ、２．９４ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。１Ｈ−テトラゾールの溶液（４．７８ｍＬ、２．１５ｍｍｏｌ、０．４５Ｍ）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応をＴＬＣ（１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣を最小限のＤＣＭに溶解させ、エーテルで沈殿させた。生成物をろ過して取り出し、エーテルで洗浄し、高真空下で乾燥させて化合物１．７７ｇ、（１００％）の１００９を得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）：δ ７．５０（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．４１（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．３０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、５Ｈ）、７．２６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ、４Ｈ）、７．２２−７．１５（ｍ，２Ｈ）、６．８８（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．８１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、４Ｈ）、６．７０（ｓ，１Ｈ）、４．０８−３．９８（ｍ，６Ｈ）、３．７８（ｓ，６Ｈ）、３．６９−３．５２（ｍ，４Ｈ）、３．２１（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．０２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．６２（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．２７（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、１．６６（ｄ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ、１５Ｈ）、１．５０（ｍ，３Ｈ）、１．３９（ｍ，５Ｈ）、１．２８（ｄｄ，Ｊ＝１５．７、８．４Ｈｚ、４Ｈ）、１．１６（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、１０Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）：δ １４７．９０、１４８．２９。
実施例２７．ホスホロアミダイト１０１７の合成
Figure 2020505032
 化合物１０１１ − 出発材料１０１０（５ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）及び５０ｍＬの無水ピリジンを反応フラスコに加えた。ピリジンを減圧下で除去した。これを３回繰り返し、高真空下で一晩乾燥させた。翌日、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．１８７ｇ、１．５３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２．１３ｍＬ、１５．３ｍｍｏｌ）及び無水ピリジンを反応フラスコに加えた。反応物を、氷浴を用いて０℃に冷却した。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（５．７６ｇ、１７ｍｍｏｌ）を無水ピリジンに溶解させ、得られた溶液を、シリンジを介して反応フラスコに加えた。反応物を室温に到達させ、一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（１０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して６．６１ｇ、（６９％）の１０１１を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ７．４３−７．１５（ｍ，１４Ｈ）、６．９１−６．８３（ｍ，４Ｈ）、４．９９（ｓ，２Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．５２（ｑ，Ｊ＝７．８、６．９Ｈｚ、１０Ｈ）、３．３９（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ）、３．１２（ｑ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ）、３．０４（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、２Ｈ）。
化合物１０１２ − 化合物１０１１（６．６１ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。無水メタノールを加えることによって出発材料を溶解させた。次に、１０％のパラジウム炭素、デグサタイプ、（６６１ｍｇ、１０重量％）を加えた。反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。次に、反応フラスコを排気し、バルーンからの水素で２回パージした。反応物を室温で３時間撹拌させた。反応をＴＬＣ（１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、反応フラスコを排気し、アルゴンで３回パージした。反応混合物をセライトに通してろ過して、パラジウム炭素を除去し、メタノールで洗浄した。母液を減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルにおけるフラッシュクロマトグラフィー（０％〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して４．４ｇ、（８５％）の１０１２を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ７．４３−７．３５（ｍ，２Ｈ）、７．３４−７．１６（ｍ，７Ｈ）、６．９２−６．８３（ｍ，４Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．５５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、８Ｈ）、３．５１−３．４４（ｍ，２Ｈ）、３．０４（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．６１（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ、２Ｈ）。
化合物１０１４ − 出発化合物１０１３（２ｇ、２．６１ｍｍｏｌ）及び化合物１０１２（１．３６ｇ、２．７４ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応物を排気し、アルゴンで３回パージした。ジメチルスルホキシドを加えることによって出発材料を溶解させ、次にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．９０９ｍＬ、５．２２ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。反応をＴＬＣ（１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、反応物をジクロロメタンで希釈し、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を減圧下で濃縮して２．９１ｇ、（９９％）の１０１４を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．１２（ｓ，１Ｈ）、７．９４−７．８０（ｍ，２Ｈ）、７．５７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．４５−７．３４（ｍ，３Ｈ）、７．２７（ｍ，１０Ｈ）、６．９１−６．８２（ｍ，４Ｈ）、６．４２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．２７（ｓ，１Ｈ）、５．４１（ｓ，１Ｈ）、４．９１（ｓ，１Ｈ）、３．７２（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ、６Ｈ）、３．５９−３．４５（ｍ，１２Ｈ）、３．１０（ｍ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ）、３．０６−２．８６（ｍ，５Ｈ）、２．５３（ｓ，３７Ｈ）、１．２２（ｓ，１Ｈ）、０．８７（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）、０．７６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）。
化合物１０１５ − 化合物１０１４（２．９１ｇ、２．５９ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。反応物を排気し、アルゴンで３回パージした。無水ジメチルホルムアミドを加えることによって出発材料を溶解させ、シリンジを介してピペリジン（２０％ ｖ／ｖ）も加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。反応をＭＳによって確認し、反応物を減圧によって濃縮した。残渣を酢酸エチルと共に溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体をろ過して取り除き、母液を減圧下で濃縮し、エーテル中で沈殿させて１．６７ｇ、（７２％）の１０１５を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．１１（ｓ，１Ｈ）、８．１３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．０６−７．９７（ｍ，１Ｈ）、７．５７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、７．３８（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、３Ｈ）、７．３５−７．１５（ｍ，１２Ｈ）、６．８７（ｄｄ，Ｊ＝９．０、２．５Ｈｚ、５Ｈ）、６．７４−６．６５（ｍ，１Ｈ）、５．９６（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．３９（ｓ，２Ｈ）、４．９２（ｓ，２Ｈ）、４．４６（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．７２（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ、７Ｈ）、３．５９−３．５３（ｍ，６Ｈ）、３．５３−３．４２（ｍ，７Ｈ）、３．３８（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．１１（ｑ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ）、３．０３（ｍ，４Ｈ）、３．０１−２．８６（ｍ，２Ｈ）、１．９１（ｍ，１Ｈ）、１．６６（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、１．５７（ｄｄ，Ｊ＝９．２、４．９Ｈｚ、１Ｈ）、１．３６（ｍ，２Ｈ）、０．８２（ｄｄ，Ｊ＝３９．２、６．８Ｈｚ、５Ｈ）．Ｃ４８Ｈ６４Ｎ６Ｏ１１についての質量計算値：９０１．０７、実測値：９２３．３（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物１０１６ − 化合物１０１５（１．６７ｇ、１．８５ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。カプロラクトンを加えて、出発材料を溶解させ、１滴のトリメチルアミンを加えて、反応物を塩基性に保った。反応物を４０℃で４日間加熱した。反応をＴＬＣ（１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、減圧下で濃縮した。残渣をエーテル中で沈殿させ、スラリーを３０分間撹拌して良好な固体を得た。沈殿物をろ過して取り出し、エーテルで洗浄し、高真空下で乾燥させて１．２２ｇ、（６５％）の１０１６を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ９．９８（ｓ，１Ｈ）、８．０７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．８０（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．５８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．３８（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．３３−７．１６（ｍ，１０Ｈ）、６．９１−６．８３（ｍ，４Ｈ）、５．９７（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．４０（ｓ，２Ｈ）、４．９２（ｓ，２Ｈ）、４．３４（ｍ，２Ｈ）、４．２３−４．１４（ｍ，１Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．５２（ｑ，Ｊ＝８．７、７．５Ｈｚ、１０Ｈ）、３．３７（ｍ，７Ｈ）、３．１１（ｑ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ）、３．０４（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ、２Ｈ）、２．９５（ｍ，２Ｈ）、２．２８−２．０６（ｍ，２Ｈ）、１．９６（ｍ，１Ｈ）、１．６９（ｓ，１Ｈ）、１．５４−１．３０（ｍ，６Ｈ）、１．３０−１．２０（ｍ，２Ｈ）、０．８３（ｄｄ，Ｊ＝１１．４、６．７Ｈｚ、５Ｈ）。
化合物１０１７ − 化合物１０１６を反応フラスコに加え、この反応フラスコを排気し、アルゴンでパージする。出発材料をＤＣＭとアセトニトリルとの混合物に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン及び２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを、シリンジを介して加える。１Ｈ−テトラゾールの溶液を加え、室温で３０分間撹拌する。反応をＴＬＣ（１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、反応物を、標準的な抽出条件を用いて後処理する。残渣を最小限のＤＣＭに溶解させ、エーテルで沈殿させる。生成物をろ過して取り出し、エーテルで洗浄し、高真空下で乾燥させて、化合物１０１７を得る。
実施例２８．ラット血漿、肝サイトゾル及び肝トリトソーム中のＥＭＳＡを用いたビス（ｓｉＲＮＡ）定性的安定性
ビス（ｓｉＲＮＡ）多重鎖を非変性１０％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＴＢＥゲル中で電気泳動移動度シフトアッセイによってリンカーの安定性について評価した。ビス−ｓｉＲＮＡサンプルをＰＢＳ中２μＭで調製し、次に基質中で０．１μＭに希釈した。基質は、（ａ）スプラーグドーリー（Ｓ．Ｄ．）ラット又はカニクイザル血漿（リチウムヘパリン中、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）（ｂ）２０ｍＭのクエン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ４．５中で１：２に希釈された雄雌混合（Ｍｉｘｅｄ Ｇｅｎｄｅｒ）ラット肝トリトソーム（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ）又は（ｃ）５０ｍＭのトリス、５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４中で１：１０に希釈された、雌Ｓ．Ｄ．ラット肝サイトゾル又は雄雌混合カニクイザル肝サイトゾル（１０ｍｇ／ｍＬとして供給される、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ）のいずれかであった。ビス−ｓｉＲＮＡ／基質混合物に２単位のヘパリンを加えた。次に、サンプルを０又は２４時間にわたって３７℃でインキュベートした。インキュベーションの最後に２５ｍＭのＥＤＴＡを加えて、反応をクエンチした。サンプルを−８０℃で貯蔵した。
ゲルを充填する前にビス−ｓｉＲＮＡサンプルを室温で解凍し、ＴｒａｃｋＩｔ ６Ｘ Ｃｙａｎ／Ｏｒａｎｇｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１：６の比率でサンプルに加えた。ラダーを１：１：１０の比率の１０ｂｐのラダー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１０４８８−０１９）、ＢｌｕｅＪｕｉｃｅ（商標）Ｇｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び脱イオン水で調製した。ラダー及びビス−ｓｉＲＮＡサンプルを、４℃で２時間にわたって１００ボルトで電気泳動される１０％のＴＢＥゲル上に充填した。ゲルを室温で１０分間にわたって１０％のＴＢＥ及びＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（１０，０００倍ストック）で染色した。画像を、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアと共にＧｅｌ Ｄｏｃ（商標）ＸＲ＋ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて読み取った。
材料：
・ゲル：１０％のＴＢＥ、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ、Ｃａｔ．＃３４５−００５３
・＊最近、１０％のＴＢＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｃａｔ．＃ＥＣ６２７５５ＢＯＸに変更した。
・ラット血漿（リチウムヘパリン）、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、Ｃａｔ．＃ＲＡＴＬＬＩＨＰ
・スプラーグドーリー（ＳＤ）ラット肝トリトソーム、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ．＃Ｒ０６１０．ＬＴ、チロキサポール処理された、雄雌混合、６０匹のプール
・ラット肝サイトゾル、雌、ＩＧＳスプラーグドーリー、１１５匹のプール、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ．＃Ｒ１５００．Ｃ、１０ｍｇ／ｍＬで１ｍＬとして供給される
・１０倍のＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４、Ａｍｂｉｏｎ、Ｃａｔ．＃ＡＭ９６２５（１倍に希釈される）
・ヘパリン１０００Ｕ／ｍＬ、Ｓａｇｅｎｔ
・ＥＤＴＡ ５００ｍＭ（５０ｍＭに希釈される）
・１０ｂｐのＤＮＡラダー、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．＃１０４８８−０１９
・ＢｌｕｅＪｕｉｃｅ（商標）Ｇｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（１０倍）−ブロモフェノールブルー、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．＃１０８１６−０１５
○５４％（ｗ／ｖ）のスクロース、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．３％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルーから構成される。
・１０×ＴＢＥ（トリス／ホウ酸／ＥＤＴＡ）、ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｓ、Ｃａｔ．＃１７１−００７０
・ＴｒａｃｋＩｔ ６×Ｃｙａｎ／Ｏｒａｎｇｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．＃１０４８２−０２８
○３０％（ｗ／ｖ）のグリセロール、６０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６０ｍＭのＥＤＴＡ、．３６％（ｗ／ｖ）のＸＣＦＦ及び２．４％（ｗ／ｖ）のＯｒａｎｇｅ Ｇから構成される。
・ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．＃Ｓ１１４９４、１０，０００倍ストック
・Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアと共にＧｅｌ Ｄｏｃ（商標）ＸＲ＋ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、ＢｉｏＲａｄ
対照：ＰＢＳ（基質のみ、サンプルなし）
ＡＤ−７７７４８．１（ｄＡ及びｄＴ２０量体の二重鎖）
２つの二重鎖：ＦＶＩＩ（ＡＤ−６８２６９）及びＴＴＲ（ＡＤ−６９２２８）の混合物。
手順：
１．サンプルを１×ＰＢＳ中で２μＭに希釈する。
２．ＰＣＲチューブ中で１μＬのｓｉＲＮＡを１９μＬの基質に加える。
ａ．トリトソームについて、まず２０ｍＭのクエン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ４．５中で１：２に希釈する。
ｂ．サイトゾルについて、まず５０ｍＭのトリス、５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４中で１０倍に希釈する。
３．２μＬのヘパリンを加える。
ａ．血漿について、このステップを省略することができる（ヘパリンが既に仕込まれている）
４．０時間、４時間又は２４時間にわたって３７℃でインキュベートする。
５．インキュベーションの最後に２０μＬの５０ｍＭのＥＤＴＡを加える。
６．８．６μＬのシアン／オレンジ色のローディング色素をチューブに加える。
７．ラダーを調製する。４μＬの１０ｂｐのラダー、４μＬのＢｌｕｅＪｕｉｃｅ及び４１μＬのＤＩ Ｈ２Ｏを希釈する。
８．希釈されたサンプルを沈降させる。
９．１０％のＴＢＥゲル上で電気泳動する（１００Ｖ、４℃で２時間）。
ａ．ラダーのために５μＬを充填する。
ｂ．各ビス（ｓｉＲＮＡ）サンプルのために１２μＬを充填する。
１０．室温で１０分間にわたって５０ｍＬの１×ＴＢＥ及び５μＬのＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ中で染色する。
１１．１×ＴＢＥ中で洗浄し、読み取る。
各ビス（ｓｉＲＮＡ）の切断速度を非処理のサンプル又は０時間の時点でのサンプルと比較する。この値から概算切断速度を計算する。例示的な切断可能なリンカーを評価するためのビス（ｓｉＲＮＡ）設計が表１に示される。結果が図７〜１０に示され、表２にまとめられている。
図７は、２４時間のインキュベーション後のラットトリトソームにおけるビス（ｓｉＲＮＡ）設計ＡＭ−１０６〜ＡＭ−１２９の分解を示す。化合物をラットトリトソームと共にインキュベートし、生成物をゲル電気泳動によって分析して、上述されるようにリンカーの切断性を決定した。全ての糖組合せは、２４時間で分解した。ＡＭ−１１２（Ｑ４８ｓの横に配置された２ｘＱ３０３）及びＡＭ−１１８（Ｑ１９８＋２ｘＱ３０３）についてあまり示されない。ＤＮＡ及び２’−フルオロ構築物は、２４時間で分解を示さなかった。
図８は、ビス（ｓｉＲＮＡ）設計ＡＭ−１３０〜ＡＭ−１４７の分解を示す。化合物をラットトリトソームと共にインキュベートし、生成物をゲル電気泳動によって分析して、上述されるようにリンカーの切断性を決定した。Ｃ５リンカーは、Ｃ２リンカーを上回る切断についての利点を提供する。ＧｌｕＮＡｃ−Ｃ５及びＧａｌＮＡｃ−Ｃ５は、最も速い切断速度（４時間までに完全に切断される）を示す一方、マンノース糖リンカーは、４時間で最も安定していた。ガラクトース及びグルコース由来のリンカーは、切断を起こしたが、無傷のリンカーがラットトリトソーム中に４時間のインキュベーション後に存在していた。２４時間で糖ベースのリンカーの全ての組合せが分解した。ＡＭ−１１２（Ｑ４８ｓの横に配置された２ｘＱ３０３）及びＡＭ−１１８（Ｑ１９８＋２ｘＱ３０３）についてあまり示されない。ＤＮＡ及び２’−フルオロ構築物は、２４時間で分解を示さなかった。
図９は、ビス（ｓｉＲＮＡ）設計ＡＭ−１４８〜ＡＭ−１５４の分解を示す。化合物をラットトリトソームと共にインキュベートし、生成物をゲル電気泳動によって分析して、上述されるようにリンカーの切断性を決定した。ＲＮＡベースのリンカーは、糖ベースのリンカーのものと同様の切断速度を示した。
図１０は、ビス（ｓｉＲＮＡ）設計ＡＭ−１５５〜ＡＭ−１６１の分解を示す。化合物をラットトリトソームと共にインキュベートし、生成物をゲル電気泳動によって分析して、上述されるようにリンカーの切断性を決定した。
Figure 2020505032
Figure 2020505032
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Figure 2020505032
Figure 2020505032
本明細書及び実施例に明示される全ての特許及び他の刊行物は、あらゆる目的のために参照により明示的に本明細書に組み込まれる。これらの刊行物は、本願の出願日より前に開示のために提供されたに過ぎない。これに関するいかなることも、本発明者らが、先行発明のために又は別の何らかの理由で、こうした開示に先行する資格がないという承認として解釈すべきではない。日付に関する記載又はこれらの文献の内容に関する表示は、全て本出願人が入手可能な情報に基づくものであり、これらの文献の日付又は内容の正確さに関する何らの承認をなすものではない。
本明細書において好ましい実施形態を示し、詳細に説明してきたが、当業者には、様々な改変形態、追加形態、代替形態などが本発明の趣旨を逸脱することなくなされ得、従って、これらは、以下の特許請求の範囲に定義する通り、本発明の範囲内であるとみなされることは明らかであろう。さらに、当業者であれば、既述していない範囲まで本明細書で説明及び例示した様々な実施形態のいずれか１つをさらに改変して、本明細書に開示する他の実施形態のいずれかに示される特徴を組み込み得ることが理解されるであろう。

Claims (30)

  1. 少なくとも２つのエフェクター分子を含む多標的分子であって、前記エフェクター分子は、エンドソーム切断可能なリンカー又はプロテアーゼ切断可能なリンカーを介して一緒に連結され、前記リンカーは、炭水化物リンカーであり、前記リンカーは、血液若しくは血清（又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞内（又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）で少なくとも１．２５倍速く切断される、多標的分子。
  2. 少なくとも１つのリガンドは、前記多標的分子と共役される、請求項１に記載の多標的分子。
  3. 前記エフェクター分子は、独立に、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡ又は抗ｍｉｒ、スーパーｍｉｒ、アンタゴｍｉｒ、リボザイム、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、免疫刺激オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ活性化剤、Ｕ１アダプター、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の多標的分子。
  4. 前記エフェクター分子が一緒に連結されていない場合と比べてそれぞれ少なくとも７５％だけ少なくとも２つの標的核酸の遺伝子発現を調節する、請求項１に記載の多標的分子。
  5. 前記少なくとも２つのエフェクター分子の１つは、第１の標的核酸の遺伝子発現を調節し、及び前記少なくとも２つのエフェクター分子のもう１つは、第２の核酸の遺伝子発現を調節する、請求項４に記載の多標的分子。
  6. 前記第１の標的核酸及び前記第２の標的核酸は、同じである、請求項５に記載の多標的分子。
  7. 前記第１の標的核酸及び前記第２の標的核酸は、同じヌクレオチド配列をターゲティングする、請求項６に記載の多標的分子。
  8. 前記リガンドは、前記少なくとも２つのエフェクター分子の１つの３’末端において共役される、請求項１に記載の多標的分子。
  9. 前記リガンドは、前記少なくとも２つのエフェクター分子の１つの５’末端において共役される、請求項１に記載の多標的分子。
  10. 前記第１のエフェクター分子は、第１の二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、及び前記第２のエフェクター分子は、第２の二本鎖ｓｉＲＮＡ分子である、請求項１に記載の多標的分子。
  11. 前記第１のｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖は、前記第２のｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖に共有結合される、請求項１０に記載の多標的分子。
  12. 前記第１のｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖は、前記第２のｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖に共有結合される、請求項１０に記載の多標的分子。
  13. 前記第１のｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、前記第２のｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖に共有結合される、請求項１０に記載の多標的分子。
  14. 前記第１及び第２のｓｉＲＮＡは、独立に、前記第１のｓｉＲＮＡ及び前記第２のｓｉＲＮＡが前記多標的分子の一部でない場合と比べて少なくとも７０％だけそれらのそれぞれの標的核酸の遺伝子発現を調節する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の多標的分子。
  15. 前記第１のｓｉＲＮＡは、第１の標的核酸の遺伝子発現を調節し、及び前記第２のｓｉＲＮＡは、第２の核酸の遺伝子発現を調節する、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の多標的分子。
  16. 前記第１の標的核酸及び前記第２の標的核酸は、同じである、請求項１５に記載の多標的分子。
  17. 前記第１のｓｉＲＮＡ及び前記第２のｓｉＲＮＡは、同じ核酸配列をターゲティングする、請求項１６に記載の多標的分子。
  18. 前記リガンドは、前記センス鎖の１つと共役される、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の多標的分子。
  19. 前記リガンドは、前記センス鎖の１つの３’末端において共役される、請求項１８に記載の多標的分子。
  20. 前記リガンドは、前記センス鎖の１つの５’末端において共役される、請求項１９に記載の多標的分子。
  21. 前記リガンドは、前記アンチセンス鎖の１つの３’末端において共役される、請求項１９に記載の多標的分子。
  22. 前記リガンドは、前記アンチセンス鎖の１つの５’末端において共役される、請求項１９に記載の多標的分子。
  23. 修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基、修飾糖及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含む、請求項１０〜２２のいずれか一項に記載の多標的分子。
  24. 前記少なくとも１つの修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖に含まれる、請求項２３に記載の多標的分子。
  25. 前記リンカーは、
    Figure 2020505032
    Figure 2020505032
    Figure 2020505032
     からなる群から選択される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の多標的分子。
  26. エンドソーム切断可能なリンカー又はプロテアーゼ切断可能なリンカーを介してリガンドに結合されたエフェクター分子を含むコンジュゲートであって、前記リンカーは、炭水化物リンカーであり、前記リンカーは、血液若しくは血清（又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞内（又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）で少なくとも１．２５倍速く切断される、コンジュゲート。
  27. 前記エフェクター分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡ又は抗ｍｉｒ、スーパーｍｉｒ、アンタゴｍｉｒ、リボザイム、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、免疫刺激オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ活性化剤、Ｕ１アダプター及びＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓからなる群から選択される、請求項２６に記載のコンジュゲート。
  28. エンドソーム切断可能なリンカー又はプロテアーゼ切断可能なリンカーを介してリガンドと結合されたエンドソーム作用剤を含むコンジュゲート。
  29. 前記リンカーは、図１〜６に示されるリンカーから選択される、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  30. 図１〜６に示されるリンカーから選択されるエンドソーム切断可能なリンカー又はプロテアーゼ切断可能なリンカーを含むプロドラッグ。
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