JP2020504612A - 動物胚の塩基編集用組成物および塩基編集方法 - Google Patents

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Abstract

デアミナーゼおよび標的特異的ヌクレアーゼを含む塩基編集用組成物、および前記塩基編集用組成物を用いた塩基編集方法および遺伝子改変動物製造方法が提供される。前記塩基編集用組成物は哺乳動物の胚で塩基編集活性を有することを特徴とする。【選択図】図４

Description

デアミナーゼおよび標的特異的ヌクレアーゼを含む塩基編集用組成物、および前記塩基編集用組成物を用いた塩基編集方法および遺伝子改変動物製造方法が提供される。
大多数のヒト遺伝疾患は、いくつかの挿入／欠失（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ／ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ；ｉｎｄｅｌｓ）またはゲノムでの広範囲な染色体再配列よりは、単一塩基置換または点突然変異によって誘発される。ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ、ｒｅｇｕｌａｒ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ、ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）−Ｃａｓ９またはＣｐｆ１システムのようなプログラム可能なヌクレアーゼ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ）によるゲノム編集（ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）は先天的遺伝疾患を起こす遺伝的欠陥を治療するための遺伝子修正（ｇｅｎｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を可能にするが、標的特異的に単一塩基置換を誘導するのには技術的に困難がある。これはプログラム可能なヌクレアーゼ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ）によって生成された大部分のＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）が鋳型ドナーＤＮＡ（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ）を使用する相同性組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ、ＨＲ）でない誤謬が発生しやすい非相同末端結合（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ（ＮＨＥＪ））によって修復されるためである。その結果、単一ヌクレオチド置換よりヌクレアーゼ標的部位でのインデル（ｉｎｄｅｌ）がより頻繁に得られる。
最近、ＡＰＯＢＥＣ１（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｅｄｉｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ １）またはＡＩＤ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）のようなシチジンデアミナーゼ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）がＣａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ ｎｉｃｋａｓｅ；ｎＣａｓ９）または触媒活性欠乏Ｃａｓ９（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｃａｓ９；ｄＣａｓ９）と連結されて、標的部位で、ＤＳＢ生成なく、ＣをＴに（またはＧをＡに）置換させるのが報告されたことがあり、これは酵母および培養された哺乳類細胞での塩基編集（ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）を示すものであると言える。このようなＲＮＡ誘導型プログラム可能なデアミナーゼ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）はゲノム編集の範囲を新たな次元に拡大させ、ヒトを含む全有機体で標的突然変異を誘発するか遺伝子編集を施行できる方法を提案することができる。しかし、ＲＮＡプログラム可能なデアミナーゼ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での塩基編集機能はまだ証明されなかった。
本明細書は、プログラム可能なデアミナーゼ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）を用いてマウスのような真核細胞（例えば、哺乳類などの動物細胞）で単一ヌクレオチド置換を誘導する技術を提供する。
一例は、（１）デアミナーゼ、およびそのコーディング遺伝子、および（２）標的特異的ヌクレアーゼまたはそのコーディング遺伝子を含む塩基編集用組成物を提供する。前記細胞は真核細胞（例えば、真核動物の胚細胞）であってもよく、前記塩基編集方法は真核細胞で塩基編集（例えば、塩基置換）を行うことであってもよい。
前記変形標的特異的ヌクレアーゼは、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼおよび標的遺伝子の標的部位と混成化可能な（相補的核酸配列を有する）ガイドＲＮＡまたはそのコーディングＤＮＡ（またはコーディングＤＮＡを含む組換えベクター）を含むものであってもよい。この場合、前記塩基編集用組成物は、（１）デアミナーゼまたはそのコーディング遺伝子（ｍＲＮＡまたはコーディングＤＮＡを含む組換えベクター）、（２）ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼまたはそのコーディング遺伝子（ｍＲＮＡまたはコーディングＤＮＡを含む組換えベクター）、および（３）ガイドＲＮＡまたはそのコーディング遺伝子（ＤＮＡ）を含むものであってもよい。
前記塩基編集用組成物は、（１）デアミナーゼまたはそのコーディング遺伝子（ｍＲＮＡまたはコーディングＤＮＡを含む組換えベクター）、（２）ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼまたはそのコーディング遺伝子（ｍＲＮＡまたはコーディングＤＮＡを含む組換えベクター）、および（３）ガイドＲＮＡまたはそのコーディング遺伝子（ＤＮＡ）に加えて、（４）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ抑制剤（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＵＧＩ）またはそのコーディング遺伝子および／または（５）核局在化配列（ＮＬＳ）またはそのコーディング遺伝子を追加的に含んでもよい。前記塩基編集用組成物で、前記デアミナーゼ、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼ、および任意にＵＧＩおよび／またはＮＬＳが連結された融合タンパク質またはこれらのコーディング遺伝子が連結された融合遺伝子形態で使用される場合、それぞれのタンパク質または遺伝子の間のうちの一つ以上、例えば、前記デアミナーゼとＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼの間、ヌクレアーゼとＵＧＩの間、およびＵＧＩとＮＬＳの間のうちの一つ以上に適切なリンカー（融合タンパク質の場合、ペプチドリンカー（３−３０、または３−２０アミノ酸）、融合遺伝子の場合、オリゴヌクレオチドリンカー（９〜９０または９−６０ｎｔ））を追加的にを含んでもよい。
他の例は、前記塩基編集用組成物を細胞に導入させる段階を含む、塩基編集方法を提供する。前記細胞は真核細胞であってもよく、前記塩基編集方法は真核細胞で塩基編集（例えば、塩基置換）を行うことであってもよい。
一例で、前記細胞に塩基編集用組成物を導入する段階は、
１）前記細胞をデアミナーゼコーディングＤＮＡ、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼコーディングＤＮＡ、およびガイドＲＮＡコーディング遺伝子をそれぞれ含むか、これらのうちの２以上を含む組換えベクターで形質感染させるか、
２）前記細胞にデアミナーゼ、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼ、およびガイドＲＮＡ（例えば、デアミナーゼ、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼ、およびガイドＲＮＡが複合体を形成したリボ核タンパク質）を直接注入するか、
３）前記細胞にデアミナーゼコーディングｍＲＮＡ、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼコーディングｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡを直接注入して行うことができる。
前述のように、前記塩基編集用組成物を導入する段階１）２）または３）で使用された塩基編集用組成物は、それぞれウラシルＤＮＡグリコシラーゼ抑制剤（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＵＧＩ）またはそのコーディング遺伝子および／または（５）核局在化配列（ＮＬＳ）またはそのコーディング遺伝子を追加的に含んでもよく、場合によって適切なリンカーを追加的に含んでもよい。
他の例は、前記塩基編集方法によって編集された塩基を含む遺伝子改変細胞を提供する。
他の例は、前記遺伝子改変細胞から得られた遺伝子改変動物を提供する。
他の例は、前記塩基編集用組成物が導入された哺乳動物胚を哺乳動物委託母卵管に移植する段階を含む遺伝子改変動物の製造方法を提供する。
本発明者らは、プログラム可能なデアミナーゼ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）を用いてマウスのような真核細胞（例えば、哺乳類などの動物細胞）で単一塩基置換を成功的に誘導することができるのを確認した。
一例は、（１）デアミナーゼ、およびそのコーディング遺伝子、および（２）標的特異的ヌクレアーゼまたはそのコーディング遺伝子を含む塩基編集用組成物を提供する。前記塩基編集用組成物は、真核細胞で塩基編集（例えば、塩基置換）活性を有するものであってもよい。前記真核細胞は、真核動物の細胞、例えば胚細胞であってもよく、一具体例で、哺乳動物細胞、例えば哺乳動物胚細胞であってもよい。
本明細書に使用されたコーディング遺伝子は、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡまたはこれを含む組換えベクター、またはｍＲＮＡ形態で使用され得る。
前記デアミナーゼは真核細胞で特定塩基からアミン基を除去する活性を有する酵素を総称するものであって、例えば、シチジンをウリジンに転換させるシチジンデアミナーゼおよび／またはアデノシンデアミナーゼであってもよい。一例で、前記デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｅｄｉｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ １）、ＡＩＤ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ｔａｄＡ（ｔＲＮＡ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。このような塩基転換（例えば、シチジンをウリジンに転換）によって真核細胞で単一ヌクレオチド置換を誘導することができる。
前記標的特異的ヌクレアーゼは、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼおよび標的遺伝子の標的部位と混成化可能な（または相補的核酸配列を有する）ガイドＲＮＡまたはそのコーディングＤＮＡ（またはコーディングＤＮＡを含む組換えベクター）を含むものであり得る。この場合、前記塩基編集用組成物は、（１）デアミナーゼまたはそのコーディング遺伝子（ｍＲＮＡまたはコーディングＤＮＡを含む組換えベクター）、（２）変形ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼまたはそのコーディング遺伝子（ｍＲＮＡまたはコーディングＤＮＡを含む組換えベクター）、および（３）ガイドＲＮＡまたはそのコーディングＤＮＡを含むものであり得る。
一例で、前記塩基編集用組成物は、（１）デアミナーゼまたはそのコーディング遺伝子（ｍＲＮＡまたはコーディングＤＮＡを含む組換えベクター）、（２）ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼまたはそのコーディング遺伝子（ｍＲＮＡまたはコーディングＤＮＡを含む組換えベクター）、および（３）ガイドＲＮＡまたはそのコーディング遺伝子（ＤＮＡ）に加えて、（４）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ抑制剤（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＵＧＩ）またはそのコーディング遺伝子および／または（５）核局在化配列（ＮＬＳ）またはそのコーディング遺伝子を追加的に含んでもよい。前記塩基編集用組成物で、前記デアミナーゼ、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼ、および任意にＵＧＩおよび／またはＮＬＳが連結された融合タンパク質またはこれらのコーディング遺伝子が連結された融合遺伝子形態で使用される場合、それぞれのタンパク質または遺伝子の間のうちの一つ以上、例えば、前記デアミナーゼとＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼの間、ヌクレアーゼとＵＧＩの間、およびＵＧＩとＮＬＳの間のうちの一つ以上に適切なリンカー（融合タンパク質の場合、ペプチドリンカー（３−３０、または３−２０アミノ酸）、融合遺伝子の場合、オリゴヌクレオチドリンカー（９〜９０または９−６０ｎｔ））を追加的に含んでもよい。
一例で、前記ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼは、遺伝子二本鎖切断活性を喪失するように変形された変形ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼであってもよい。
前記変形ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼは、標的遺伝子の一本鎖を切断（ニック（ｎｉｃｋ）生成）するように変形された変形Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）または変形Ｃｐｆ１（ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １由来ＣＲＩＳＰＲ）システムであってもよい。一例で、前記変形ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ ｎｉｃｋａｓｅ；ｎＣａｓ９）または触媒活性欠乏Ｃａｓ９（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｃａｓ９；ｄＣａｓ９）などからなる群より選択されたものであってもよい。
前記塩基編集用組成物がデアミナーゼコーディング遺伝子およびＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼコーディング遺伝子を含む場合、前記コーディング遺伝子はコーディングＤＮＡまたはｍＲＮＡであってもよい。また、前記デアミナーゼコーディング遺伝子およびＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼコーディング遺伝子はｍＲＮＡ形態で含まれるか、前記遺伝子（ＤＮＡ）をそれぞれ別個のベクターに含む組換えベクター（即ち、デアミナーゼコーディングＤＮＡを含む組換えベクターおよびＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼコーディングＤＮＡを含む組換えベクター）または一つのベクターに共に含む組換えベクターの形態で含まれてもよい。
前記ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの複合体）を含む二重ガイドＲＮＡ、または単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。一例で、前記塩基編集用組成物は、デアミナーゼおよび変形ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼをコーディングするｍＲＮＡとガイドＲＮＡを含むか、デアミナーゼおよび変形ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼとガイドＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＮＰ）を含むものであってもよい。前記リボ核タンパク質は、デアミナーゼおよび変形ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼとガイドＲＮＡを混合物形態で含むか、デアミナーゼおよび変形ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼとガイドＲＮＡが結合された複合体形態で含んでもよい。
他の例は、前記塩基編集用組成物を細胞に導入させる段階を含む、塩基編集方法を提供する。前記細胞は真核細胞であってもよく、前記塩基編集方法は真核細胞で塩基編集（例えば、塩基置換）を行うことであってもよい。
前記真核細胞は真核動物の細胞、例えば、真核動物の胚細胞であってもよく、一具体例で、哺乳動物細胞、例えば哺乳動物胚細胞であってもよい。前記塩基編集方法によって真核細胞（例えば、真核動物胚細胞）で４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上または１００％の塩基転換率（塩基置換率）を達成することができる。また、前記塩基編集方法は、塩基置換によって遺伝子（例えば、コーディング配列）内に終結コドンを生成して前記遺伝子を不活性化（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）させるか、タンパク質を生成しない非コーディングＤＮＡ配列に変異を導入するなど、多様な突然変異を誘発させることができる。
特に、前記塩基編集用組成物は、哺乳動物胚に適用されて、所望する遺伝子が不活性化されるか所望する突然変異が誘発された哺乳動物成体製作に有用に適用できる。
前記細胞に塩基編集用組成物を導入する段階は、前記細胞にデアミナーゼまたはデアミナーゼコーディング遺伝子、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼまたはＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼコーディング遺伝子、およびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡコーディング遺伝子を導入させる段階であってもよい。前記コーディング遺伝子のうちの一つ以上はそれぞれ別個のまたは一つの組換えベクターに含まれて導入されてもよい。
一例で、前記細胞に塩基編集用組成物を導入する段階は、
１）前記細胞をデアミナーゼコーディングＤＮＡ、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼコーディングＤＮＡ、およびガイドＲＮＡコーディング遺伝子をそれぞれ含むかこれらのうちの２以上を含む組換えベクターで形質感染させるか、
２）前記細胞にデアミナーゼ、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼ、およびガイドＲＮＡ（例えば、デアミナーゼ、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼ、およびガイドＲＮＡを含む混合物または複合体形態のリボ核タンパク質）を直接注入するか、
３）前記細胞にデアミナーゼコーディングｍＲＮＡ、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼコーディングｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡの混合物またはこれらそれぞれを直接注入して行うことができる。
前記直接注入は、前記２）のデアミナーゼ、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼ、およびガイドＲＮＡ（例えば、デアミナーゼ、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼ、およびガイドＲＮＡを含む混合物または複合体形態のリボ核タンパク質）、または３）のデアミナーゼコーディングｍＲＮＡ、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼコーディングｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡが、組換えベクターを使用せず、細胞膜および／または核膜を通過してゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）に伝達されることを意味することができ、例えば、電気穿孔法、リポフェクション、微細注入（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）などによって行われ得る。
他の例は、前記塩基編集方法によって編集された塩基を含む遺伝子改変細胞を提供する。前記遺伝子改変細胞は、前記塩基編集によって標的遺伝子に塩基置換、例えば単一塩基置換または点突然変異が発生した細胞であってもよい。前記細胞は、真核細胞であってもよい。前記真核細胞は、真核動物の細胞、例えば胚細胞であってもよく、一具体例で、人間を含むか人間を除いた哺乳動物細胞、例えば人間を含むか人間を除いた哺乳動物の胚細胞であってもよい。
他の例は、塩基編集用組成物が注入された哺乳動物胚または前記塩基編集方法によって編集された塩基を含む遺伝子改変哺乳動物胚を哺乳動物の卵管に移植して、遺伝子改変動物を生産する段階を含む、遺伝子改変動物の製造方法を提供する。前記遺伝子改変哺乳動物は、前記塩基編集によって標的遺伝子に塩基置換、例えば単一塩基置換または点突然変異が発生した胚から発生した動物であってもよい。
前記胚細胞を卵管に移植を受ける哺乳動物は、前記胚細胞が由来する哺乳動物と同種の哺乳類（委託母）であってもよい。
他の例は、前記遺伝子改変細胞から得られた遺伝子改変動物を提供する。前記遺伝子改変動物は、前記遺伝子改変動物の製造方法によって製造されたものであってもよい。前記動物は、真核動物、例えば人間を含むか人間を除いた哺乳動物であってもよい。
本明細書で、前記塩基編集用組成物が適用される細胞は、真核細胞、例えば、真核動物細胞であってもよい。前記真核動物は、人間などの霊長類、マウスなどのげっ歯類を含む哺乳動物であってもよい。前記真核動物細胞は、哺乳動物の胚であってもよい。例えば、前記胚は、過排卵誘導された雌哺乳動物（例えば、ＰＭＳＧ（Ｐｒｅｇｎａｎｔ Ｍａｒｅ Ｓｅｒｕｍ Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）、ｈＣＧ（ｈｕｍａｎ Ｃｈｏｉｒｉｎｉｃ Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）などのような生殖腺ホルモン注入による過排卵誘導など）と雄哺乳動物を交配して得られた受精した胚を前記雌哺乳動物の卵管から採取したものであってもよい。前記塩基編集用組成物が適用（注入）される胚は、受精された１−細胞期の胚（ｚｙｇｏｔｅ）であってもよい。
本明細書に使用されたものとして、用語“塩基編集（ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）”は標的遺伝子内の標的部位に点突然変異を誘発する塩基変異（置換、欠失または付加）を意味するものであって、少数の塩基（一つまたは二つの塩基、例えば、一つの塩基）のみが変異されるという点で比較的に多数の塩基の変異を伴う遺伝子編集（ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）と区別され得る。前記塩基編集は、遺伝子の二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ）を伴わないものであってもよい。
本明細書に使用されたものとして、用語“塩基変異（または塩基置換）”は該当塩基を含むヌクレオチドに変異（例えば、置換）が起こったことを意味するものであって、“ヌクレオチド変異（またはヌクレオチド置換）”と同一な意味として使用でき、このような塩基変異は対立遺伝子のうちの一つまたは二つの両方ともで起こってもよい。
一例で、前記塩基変異またはこれを伴う塩基編集は、標的部位に終止コドンを生成させるか、野生型と異なるアミノ酸をコーディングするコドンを生成させることによって、標的遺伝子を不活性化（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）させるか、タンパク質を生成しない非コーディングＤＮＡ配列に変異を導入するなど多様な形態であってもよいが、これに制限されるわけではない。
本明細書で、前記塩基編集または塩基変異は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で行われるものであってもよい。
本明細書に使用されたものとして、用語“塩基配列”は、該当塩基を含むヌクレオチドの配列を意味するものであって、ヌクレオチド配列または核酸配列と同一な意味として使用できる。
本明細書に使用されたものとして、
‘標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）’は、塩基編集（または塩基変異）の対象になる遺伝子を意味し、
‘標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ ｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｒｅｇｉｏｎ）’は、標的遺伝子内の標的特異的ヌクレアーゼによる塩基編集が起こる部位を意味するものであって、一例で前記標的特異的ヌクレアーゼがＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ；ＲＧＥＮ）を含むものである場合、標的遺伝子内のＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼが認識する配列（ＰＡＭ配列）の５’末端および／または３’末端に隣接して位置し、最大長さが約５０ｂｐまたは約４０ｂｐである遺伝子部位（二本鎖または二本鎖のうちのいずれか一つの一本鎖）を意味する。
一例で、前記標的特異的ヌクレアーゼがＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼを含む場合、前記ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼと共に、標的化配列を含むガイドＲＮＡを含んでもよい。前記‘標的化配列（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）’は、標的部位内の連続する約１５〜約３０個、約１５〜約３５個、約１７〜約２３個、または約１８個〜約２２個、例えば、約２０個のヌクレオチド（ｎｔ）を含む部位の塩基配列と相補的な塩基配列を含む（混成化可能な）ガイドＲＮＡの部位であってもよい。前記標的化配列と相補的な塩基配列を含む標的部位の塩基配列を‘標的配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）’と称することができ、前記標的配列はＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼが認識するＰＡＭ配列の５’末端および／または３’末端に隣接して位置する連続する約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１７ｎｔ〜約２３ｎｔ、または約１８ｎｔ〜約２２ｎｔ、例えば、約２０ｎｔの長さの塩基配列を意味することができる。
前記デアミナーゼは、真核細胞で特定塩基からアミン基を除去する活性を有する酵素を総称するものであって、例えば、シチジンをウリジンに転換させるシチジンデアミナーゼおよび／またはアデノシンデアミナーゼであってもよい。一例で、前記デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｍＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ、ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−ｌｉｋｅ）酵素、ＡＩＤ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ｔａｄＡ（ｔＲＮＡ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＩＤ、およびｔａｄＡは、大腸菌などの原核動物由来、または人間を含む霊長類、マウスを含むげっ歯類などの哺乳動物のような真核動物由来のものであってもよい。
一具体例で、前記ＡＰＯＢＥＣは、哺乳類、例えば人間、ラット、マウスなどに由来するＡＰＯＢＥＣ１（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｅｄｉｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ １）、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
前記ＡＰＯＢＥＣ１は、ヒトＡＰＯＢＥＣ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００５８８０．２（コーディング遺伝子：ＮＭ＿００５８８９．３）、ＮＰ＿００１２９１４９５．１（コーディング遺伝子：ＮＭ＿００１３０４５６６．１）、ＮＰ＿００１６３５．２（コーディング遺伝子：ＮＭ＿００１６４４．４）など）、マウスＡＰＯＢＥＣ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１１２７８６３．１（コーディング遺伝子：ＮＭ＿００１１３４３９１．１）、ＮＰ＿１１２４３６．１（コーディング遺伝子：ＮＭ＿０３１１５９．３）など）、ラットＡＰＯＢＥＣ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０３７０３９．１（配列番号６）（コーディング遺伝子：ＮＭ＿０１２９０７．２）など）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。
前記ＡＩＤは、ヒトＡＩＤ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１３１７２７２．１（コーディング遺伝子：ＮＭ＿００１３３０３４３．１）、ＮＰ＿０６５７１２．１（コーディング遺伝子：ＮＭ＿０２０６６１．３）など）、マウスＡＩＤ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０３３７７５．１（コーディング遺伝子：ＮＭ＿００９６４５．２）など）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。
前記ｔａｄＡは、大腸菌ｔａｄＡ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿４１７０５４．２、ＹＰ＿００２４０８７０１．１、ＹＰ＿００２４１３５８１．３など）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。
このような塩基転換（例えば、シチジンをウリジンに転換）によって真核細胞で単一ヌクレオチド置換を誘導することができる。
前記デアミナーゼは、タンパク質、これをコーディングする遺伝子（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）、または前記遺伝子を含む組換えベクターの形態で使用され得る。
本明細書に使用されたものとして、標的特異的ヌクレアーゼは、遺伝子ハサミ（プログラム可能なヌクレアーゼ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ））とも呼ばれ、目的とするゲノムＤＮＡ上の特定位置を認識して切断（一本鎖切断または二本鎖切断）することができる全ての形態のヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）をひっくるめて称する。
例えば、前記標的特異的ヌクレアーゼは、標的遺伝子の特定配列を認識しヌクレオチド切断活性を有して標的遺伝子でインデル（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ、Ｉｎｄｅｌ）を引き起こすことができる全てのヌクレアーゼから選択された１種以上であってもよい。
例えば、前記標的特異的ヌクレアーゼは、微生物免疫体系であるＣＲＩＳＰＲに由来したＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ；例えば、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９など）、Ｃｐｆ１、など）などからなる群より選択された１種以上を含むものであってもよいが、これに制限されるわけではない。
前記標的特異的ヌクレアーゼは、原核細胞、および／またはヒト細胞をはじめとする動植物細胞（例えば、真核細胞）のゲノムで特定塩基配列を認識して二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ、ＤＳＢ）を起こすことができる。前記二本鎖切断は、ＤＮＡの二本鎖を切断して、平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）または粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）を生成させることができる。ＤＳＢは、細胞内で相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）または非相同末端結合（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）機構によって効率的に修復でき、この過程に所望する変異を標的位置に導入することができる。
一具体例で、前記標的特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ） ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９））、Ｃｐｆ１タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ ｆｒｏｍ Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １）などのようなタイプＩＩおよび／またはタイプＶのＣＲＩＳＰＲシステムに伴うヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。この場合、前記標的特異的ヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡの標的部位に案内するための標的ＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡを追加的に含む。前記ガイドＲＮＡは、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で転写された（ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）ものであってもよく、例えば、オリゴヌクレオチド二本鎖またはプラスミド鋳型から転写されたものであってもよいが、これに制限されない。前記標的特異的ヌクレアーゼは、生体外でまたは生体（細胞）内伝達後、ガイドＲＮＡに結合されたリボ核酸−タンパク質複合体を形成（ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）形態で作用できる。
Ｃａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの主要タンパク質構成要素であって、活性化されたエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）を形成することができるタンパク質である。
Ｃａｓタンパク質または遺伝子情報は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから得ることができる。例えば、前記Ｃａｓタンパク質は、
ストレプトコッカスｓｐ．（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、例えば、ストレプトコッカスピヨゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ Ｑ９９ＺＷ２（ＮＰ＿２６９２１５．１）；
カンピロバクター属、例えば、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質；
ストレプトコッカス属、例えば、ストレプトコッカスサーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）またはストレプトコッカスアウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質；
ナイセリアメニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質；
パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、例えば、パスツレラムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）由来のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質；
フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、例えば、フランシセラノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）由来のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質
などからなる群より選択された一つ以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。
Ｃｐｆ１タンパク質は前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとは区別される新たなＣＲＩＳＰＲシステムのエンドヌクレアーゼであって、Ｃａｓ９に比べて相対的に大きさが小さくｔｒａｃｒＲＮＡが必要なく、単一ガイドＲＮＡによって作用できる。また、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）が豊富なＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ−ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）配列を認識しＤＮＡの二本鎖を切断して粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ；ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）を生成する。
例えば、前記Ｃｐｆ１タンパク質はカンジダツス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ）属、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ）属、ブチリビブリオ（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）属、ペレグリニバクテリア（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）、アシドミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、カンジダツスメタノプラズマ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ）、またはユバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来のものであってもよく、例えば、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＣ２０１７）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｉｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＢＶ３Ｌ６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＮＤ２００６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ（２３７）、Ｓｍｉｉｈｅｌｌａ ｓｐ．（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＡ２０２０）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ（Ｕ１１２）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐａｃｅｉｂａｃｔｅｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓなどの微生物由来のものであってもよいが、これに制限されるわけではない。
前記標的特異的ヌクレアーゼは、微生物から分離されたものまたは組換え的方法または合成的方法などのように人為的または非自然的生産されたもの（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）であってもよい。前記標的特異的ヌクレアーゼは、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で予め転写されたｍＲＮＡまたは予め生産されたタンパク質形態、または標的細胞または生体内で発現するために組換えベクターに含まれた形態で使用され得る。一例で、前記標的特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、など）は、組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ；ｒＤＮＡ）によって作られた組換えタンパク質であってもよい。組換えＤＮＡは多様な有機体から得られた異種または同種遺伝物質を含むために分子クローニングのような遺伝子組換え方法によって人工的に作られたＤＮＡ分子を意味する。例えば、組換えＤＮＡを適切な有機体で発現させて標的特異的ヌクレアーゼを生産（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）する場合、組換えＤＮＡは、製造しようとするタンパク質をコーディングするコドンのうちから前記有機体に発現するに最適化されたコドンを選択して再構成されたヌクレオチド配列を有するものであってもよい。
本明細書で使用された前記標的特異的ヌクレアーゼは、変異された形態の変異標的特異的ヌクレアーゼであってもよい。前記変異標的特異的ヌクレアーゼは、ＤＮＡ二本鎖を切断するエンドヌクレアーゼ活性を喪失するように変異されたものを意味することができ、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を喪失しニッカーゼ活性を有するように変異された変異標的特異的ヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ活性とニッカーゼ活性を全て喪失するように変異された変異標的特異的ヌクレアーゼのうちから選択された１種以上であってもよい。前記変異標的特異的ヌクレアーゼがニッカーゼ活性を有するものである場合、前記デアミナーゼによる塩基変換（例えば、シチジンがウリジンに変換）と同時または順序と関係なく順次に、前記塩基変換が起こった鎖またはその反対鎖（例えば、塩基変換が起こった鎖の反対鎖）でニック（ｎｉｃｋ）が導入されてもよい（例えば、ＰＡＭ配列の５’末端方向に３番目ヌクレオチドと４番目ヌクレオチドの間にニック（ｎｉｃｋ）が導入される）。このような標的特異的ヌクレアーゼの変異（例えば、アミノ酸置換など）は、少なくともヌクレアーゼの触媒活性ドメイン（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＲｕｖＣ触媒ドメイン）で起こるものであってもよい。一例で、前記標的特異的ヌクレアーゼがストレプトコッカスピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｑ９９ＺＷ２（ＮＰ＿２６９２１５．１）；配列番号４）である場合、前記変異は触媒活性を有するアスパラギン酸残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｓｐａｒｔａｔｅ ｒｅｓｉｄｕｅ；例えば、配列番号４の場合、１０番目位置のアスパラギン酸（Ｄ１０）など）、配列番号４の７６２番目位置のグルタミン酸（Ｅ７６２）、８４０番目位置のヒスチジン（Ｈ８４０）、８５４番目位置のアスパラギン（Ｎ８５４）、８６３番目位置のアスパラギン（Ｎ８６３）、９８６番目位置のアスパラギン酸（Ｄ９８６）などからなる群より選択された一つ以上が任意の他のアミノ酸で置換された突然変異を含んでもよい。この時、置換される任意の他のアミノ酸はアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）であってもよいが、これに制限されない。
他の例で、前記変異標的特異的ヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９タンパク質と異なるＰＡＭ配列を認識するように変異されたものであってもよい。例えば、前記変異標的特異的ヌクレアーゼは、ストレプトコッカスピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質の１１３５番目位置のアスパラギン酸（Ｄ１１３５）、１３３５番目位置のアルギニン（Ｒ１３３５）、および１３３７番目位置のトレオニン（Ｔ１３３７）のうちの一つ以上、例えば３個ともが他のアミノ酸で置換されて、野生型Ｃａｓ９のＰＡＭ配列（ＮＧＧ）と異なるＮＧＡ（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、およびＣの中から選択された任意の塩基である）を認識するように変異されたものであってもよい。
一例で、前記変異標的特異的ヌクレアーゼは、ストレプトコッカスピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）中、
（１）Ｄ１０、Ｈ８４０、またはＤ１０＋Ｈ８４０；
（２）Ｄ１１３５、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７、またはＤ１１３５＋Ｒ１３３５＋Ｔ１３３７；または
（３）（１）と（２）残基全て
でアミノ酸置換が起こったものであってもよい。
本明細書に使用されたものとして、前記‘他のアミノ酸’は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、ライシン、前記アミノ酸の公知された全ての変形体のうち、野生型タンパク質が元来変異位置に有するアミノ酸を除いたアミノ酸のうちから選択されたアミノ酸を意味する。一例で、前記‘他のアミノ酸’は、アラニン、バリン、グルタミン、またはアルギニンであってもよい。
一例で、前記変異標的特異的ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ活性を喪失（例えば、ニッカーゼ活性を有するか、エンドヌクレアーゼ活性およびニッカーゼ活性を全て喪失）した変形Ｃａｓ９タンパク質、または野生型Ｃａｓ９と異なるＰＡＭ配列を認識するものであってもよい。例えば、前記変形Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質（配列番号４）において、
（１）Ｄ１０またはＨ８４０位置に突然変異（例えば、他のアミノ酸での置換）が導入されてエンドヌクレアーゼ活性が喪失されニッカーゼ活性を有する変形Ｃａｓ９、またはストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質にＤ１０およびＨ８４０位置に全て突然変異（例えば、他のアミノ酸での置換）が導入されてエンドヌクレアーゼ活性およびニッカーゼ活性を全て喪失した変形Ｃａｓ９タンパク質；
（２）Ｄ１１３５、Ｒ１３３５およびＴ１３３７のうちの一つ以上またはこれら全てに突然変異（例えば、他のアミノ酸での置換）が導入されて野生型と異なるＰＡＭ配列を認識する変形Ｃａｓ９タンパク質；または
（３）（１）および（２）の突然変異が全て導入されてニッカーゼ活性を有し野生型と異なるＰＡＭ配列を認識するか、エンドヌクレアーゼ活性およびニッカーゼ活性を全て喪失し野生型と異なるＰＡＭ配列を認識する変形Ｃａｓ９タンパク質
であってもよい。
例えば、前記ＣＡｓ９タンパク質のＤ１０位置での突然変異はＤ１０Ａ突然変異（Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸の中の１０番目アミノ酸であるＤがＡで置換された突然変異を意味する；以下、Ｃａｓ９に導入された突然変異は同様な方法で表記される）であってもよく、前記Ｈ８４０位置での突然変異はＨ８４０Ａ突然変異であってもよく、Ｄ１１３５、Ｒ１３３５、およびＴ１３３７位置での突然変異はそれぞれＤ１１３５Ｖ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒであってもよい。
本明細書で、“ヌクレアーゼ”は、他の言及がない限り、前述の、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、などのような“標的特異的ヌクレアーゼ”を意味する。
前記ヌクレアーゼは、微生物から分離されたものまたは組換え的方法または合成的方法などのように人為的または非自然的生産されたもの（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）であってもよい。一例で、前記ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、など）は組換えＤＮＡによって作られた組換えタンパク質であってもよい。組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ；ｒＤＮＡ）は多様な有機体から得られた異種または同種遺伝物質を含むために分子クローニングのような遺伝子組換え方法によって人工的に作られたＤＮＡ分子を意味する。例えば、組換えＤＮＡを適切な有機体で発現させてタンパク質（ヌクレアーゼ）を生産（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）する場合、組換えＤＮＡは、製造しようとするタンパク質をコーディングするコドンのうちから前記有機体に発現するのに最適化されたコドンを選択して再構成されたヌクレオチド配列を有するものであってもよい。
前記ヌクレアーゼは、タンパク質、これをコーディングする核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）、ガイドＲＮＡと結合されたリボ核タンパク質、前記リボ核タンパク質をコーディングする核酸分子、または前記核酸分子を含む組換えベクターの形態で使用され得る。
前記デアミナーゼおよびヌクレアーゼ、および／またはこれらをコーディングする核酸分子は、核内に伝達、作用、および／または核内で発現できる形態であってもよい。
前記デアミナーゼおよびヌクレアーゼは、細胞内に導入されるのに容易な形態であってもよい。一例として、前記デアミナーゼおよびヌクレアーゼは、細胞浸透ペプチドおよび／またはタンパク質伝達ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）と連結され得る。前記タンパク質伝達ドメインはポリ−アルギニンまたはＨＩＶ由来のＴＡＴタンパク質であってもよいが、これに制限されない。細胞浸透ペプチドまたはタンパク質伝達ドメインは、前述の例以外にも多様な種類が当業界に公知されているので、当業者は前記例に制限されず多様な例を適用することができる。
また、前記デアミナーゼおよびヌクレアーゼ、および／またはこれらをコーディングする核酸分子は、核位置信号（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ、ＮＬＳ）配列またはこれをコーディングする核酸配列を追加的に含んでもよい。したがって、前記デアミナーゼコーディング核酸分子および／またはヌクレアーゼコーディング核酸分子を含む発現カセットは、前記デアミナーゼおよび／またはヌクレアーゼを発現させるためのプロモーター配列などの調節配列、および、任意に、ＮＬＳ配列（配列番号１３）を追加的に含むことができる。前記ＮＬＳ配列は、当業界によく知られている。
前記デアミナーゼおよびヌクレアーゼ、および／またはこれをコーディングする核酸分子は分離および／または精製のためのタグまたは前記タグをコーディングする核酸配列と連結され得る。一例として、前記タグは、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｓタグなどのような小さなペプチドタグ、ＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）タグ、ＭＢＰ（Ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）タグなどからなる群より適切に選択できるが、これに制限されない。
また、本明細書に使用された塩基編集用組成物は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ抑制剤（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＵＧＩ）またはそのコーディング遺伝子（コーディングＤＮＡを含む組換えベクター形態またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡ形態など）を追加的に含んでもよい。前記塩基編集用組成物がウラシルＤＮＡグリコシラーゼ抑制剤を追加的に含む場合、これを含まない場合と比較して、デアミナーゼによる特定塩基置換（例えば、シトシンデアミナーゼによるＣからＴへの置換）の比率が高まり、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ抑制剤を追加的に含まない場合には特定塩基置換（例えば、シトシンデアミナーゼによるＣからＴへの置換）以外の形態の塩基置換比率が高まる（即ち、多様な形態の塩基置換が起こる）。一例で、前記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ抑制剤は、配列番号１２によってコーディングされるものであってもよいが、これに制限されるわけではない。
本発明で、用語“ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）”は、標的遺伝子内の標的部位内の特異な塩基配列（標的配列）に混成化可能な標的化配列を含むＲＮＡを意味し、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体（または細胞）内でＣａｓタンパク質、Ｃｐｆ１などのようなヌクレアーゼと結合してこれを標的遺伝子（または標的部位）に導く役割を果たす。
前記ガイドＲＮＡは、複合体を形成するヌクレアーゼの種類および／またはその由来微生物によって適切に選択できる。
例えば、前記ガイドＲＮＡは、
標的配列と混成化可能な部位（標的化配列）を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）；
Ｃａｓタンパク質、Ｃｐｆ１などのようなヌクレアーゼと相互作用する部位を含むｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）；および
前記ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主要部位（例えば、標的化配列を含むｃｒＲＮＡ部位およびヌクレアーゼと相互作用するｔｒａｃｒＲＮＡの部位）が融合された形態の単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）
からなる群より選択された１種以上であってもよく、
具体的に、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む二重ＲＮＡ（ｄｕａｌ ＲＮＡ）、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主要部位を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。
前記ｓｇＲＮＡは、標的遺伝子（標的部位）内の標的配列と相補的な配列（標的化配列）を有する部分（これをＳｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ、Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎなどとも命名する）およびＣａｓタンパク質結合のためのヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を含むことができる。より具体的に、標的遺伝子内の標的配列と相補的な配列（標的化配列）を含む部分、Ｃａｓタンパク質結合のためのヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造、およびターミネーター（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）配列を含むことができる。前述の構造は、５’から３’順に順次に存在するものであってもよいが、これに制限されるわけではない。前記ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主要部分および標的ＤＮＡの相補的な部分を含む場合であれば、いかなる形態のガイドＲＮＡも本発明で使用できる。
例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、標的遺伝子編集のために二つのガイドＲＮＡ、即ち、標的遺伝子の標的部位と混成化可能なヌクレオチド配列を有するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とＣａｓ９タンパク質と相互作用するｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ；Ｃａｓ９タンパク質と相互作用する）を必要とし、これらｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは互いに結合された二本鎖ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体形態、またはリンカーを通じて連結されて単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）形態で使用され得る。一例で、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質を使用する場合、ｓｇＲＮＡは少なくとも前記ｃｒＲＮＡの混成化可能なヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡ一部または全部と前記Ｃａｓ９のｔｒａｃｒＲＮＡのＣａｓ９タンパク質と相互作用する部位を少なくとも含むｔｒａｃｒＲＮＡ一部または全部がヌクレオチドリンカーを通じてヘアピン構造（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ構造）を形成するものであってもよい（この時、ヌクレオチドリンカーがループ構造に該当できる）。
前記ガイドＲＮＡ、具体的にｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは標的遺伝子内標的配列と相補的な配列（標的化配列）を含み、ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのアップストリーム部位、具体的にｓｇＲＮＡまたは二重ＲＮＡ（ｄｕａｌ ＲＮＡ）のｃｒＲＮＡの５’末端に一つ以上、例えば、１−１０個、１−５個、または１−３個の追加のヌクレオチドを含むことができる。前記追加のヌクレオチドはグアニン（ｇｕａｎｉｎｅ、Ｇ）であってもよいが、これに制限されるわけではない。
他の例で、前記ヌクレアーゼがＣｐｆ１である場合、前記ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡを含むものであってもよく、複合体を形成するＣｐｆ１タンパク質種類および／またはその由来微生物によって適切に選択できる。
前記ガイドＲＮＡの具体的配列は、ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）の種類（即ち、由来微生物）によって適切に選択でき、これはこの発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に理解できる事項である。
一例で、標的特異的ヌクレアーゼとしてストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質を使用する場合、ｃｒＲＮＡは次の一般式１で表現できる：
５’−（Ｎｃａｓ９）ｌ−（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）−（Ｘｃａｓ９）ｍ−３’（一般式１）
上記一般式１中、
Ｎｃａｓ９は標的化配列、即ち、標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）の標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）の配列によって決定される部位（標的部位の標的配列と混成化可能）であり、ｌは前記標的化配列に含まれたヌクレオチドの数を示すものであって、１５〜３０、１７〜２３、または１８〜２２の整数、例えば２０であってもよく、
前記標的化配列の３’方向に隣接して位置する連続する１２個のヌクレオチド（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）（配列番号１）を含む部位は、ｃｒＲＮＡの必須的部分であり、
Ｘｃａｓ９はｃｒＲＮＡの３’末端側に位置する（即ち、前記ｃｒＲＮＡの必須的部分の３’方向に隣接して位置する）ｍ個のヌクレオチドを含む部位であって、ｍは８〜１２の整数、例えば１１であってもよく、前記ｍ個のヌクレオチドは互いに同じであるか異なってもよく、それぞれ独立してＡ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群より選択できる。
一例で、前記Ｘｃａｓ９は、ＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２）を含んでもよいが、これに制限されない。
また、前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、次の一般式２で表現できる：
５’−（Ｙｃａｓ９）ｐ−（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ）−３’（一般式２）
上記一般式２中、
６０個のヌクレオチド（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ）（配列番号３）で示された部位はｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分であり、
Ｙｃａｓ９は前記ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分の５’末端に隣接して位置するｐ個のヌクレオチドを含む部位であって、ｐは６〜２０の整数、例えば８〜１９の整数であってもよく、前記ｐ個のヌクレオチドは互いに同じであるか異なってもよく、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群よりそれぞれ独立して選択できる。
また、ｓｇＲＮＡは、前記ｃｒＲＮＡの標的化配列と必須的部位を含むｃｒＲＮＡ部分と前記ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分（６０個ヌクレオチド）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分がオリゴヌクレオチドリンカーを通じてヘアピン構造（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ構造）を形成するものであってもよい（この時、オリゴヌクレオチドリンカーがループ構造に該当する）。より具体的に、前記ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの標的化配列と必須的部分を含むｃｒＲＮＡ部分とｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分が互いに結合された二本鎖ＲＮＡ分子で、ｃｒＲＮＡ部位の３’末端とｔｒａｃｒＲＮＡ部位の５’末端がオリゴヌクレオチドリンカーを通じて連結されたヘアピン構造を有するものであってもよい。
一例で、ｓｇＲＮＡは、次の一般式３で表現できる：
５’−（Ｎｃａｓ９）ｌ−（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）−（オリゴヌクレオチドリンカー）−（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ）−３’（一般式３）
前記一般式３で、（Ｎｃａｓ９）ｌは標的化配列であって、前述の一般式１で説明したとおりである。
前記ｓｇＲＮＡに含まれるオリゴヌクレオチドリンカーは３〜５個、例えば４個のヌクレオチドを含むものであってもよく、前記ヌクレオチドは互いに同じであるか異なってもよく、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群よりそれぞれ独立して選択できる。
前記ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端（即ち、ｃｒＲＮＡのターゲッティング配列部位の５’末端）に１〜３個のグアニン（Ｇ）を追加的に含んでもよい。
前記ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分（６０ｎｔ）の３’末端に５個〜７個のウラシル（Ｕ）を含む終結部位を追加的に含んでもよい。
前記ガイドＲＮＡの標的配列は、標的ＤＮＡ上のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ配列（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の場合、５’−ＮＧＧ−３’（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣである））の５’に隣接して位置する約１７個〜約２３個または約１８個〜約２２個、例えば２０個の連続する核酸配列であってもよい。
前記ガイドＲＮＡの標的配列と混成化可能なガイドＲＮＡの標的化配列は、前記標的配列が位置するＤＮＡ鎖（即ち、ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである）が位置するＤＮＡ鎖）またはその相補的な鎖のヌクレオチド配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％の配列相補性を有するヌクレオチド配列を意味するものであって、前記相補的鎖のヌクレオチド配列と相補的結合が可能である。
本明細書で、標的部位の核酸配列（標的配列）は、標的遺伝子の該当遺伝子部位の二つのＤＮＡ鎖のうちのＰＡＭ配列が位置する鎖の核酸配列で表示される。この時、実際にガイドＲＮＡが結合するＤＮＡ鎖はＰＡＭ配列が位置する鎖の相補的鎖であり得るので、前記ガイドＲＮＡに含まれた標的化配列は、ＲＮＡ特性上ＴをＵに変更することを除いて、標的配列と同一な核酸配列を有することができる。したがって、本明細書で、ガイドＲＮＡの標的化配列と標的配列はＴとＵが相互変更されることを除いて同一な核酸配列で表示される。
前記ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ形態で使用され（または前記組成物に含まれ）るか、これをコーディングするＤＮＡを含むプラスミド形態で使用され（または前記組成物に含まれ）てもよい。
本明細書に記述されたところによって、デアミナーゼおよび標的特異的ヌクレアーゼを、例えば、ｍＲＮＡまたはＲＮＰの形態で微細注入（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）または電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）方法で、哺乳動物（例えば、マウス）細胞に注入することによって、哺乳動物細胞内の標的遺伝子または標的部位で効率的に塩基編集（例えば、単一塩基置換）を行うことができ、このような塩基編集が哺乳動物胚で行われる場合、前記塩基編集による点突然変異が誘発された個体として成功的に発生させることができる。このような結果は、デアミナーゼおよび標的特異的ヌクレアーゼを用いて単一アミノ酸置換またはナンセンス突然変異が誘発された多様な動物モデルを製作することができるだけでなく、ヒト胚の遺伝的欠陥修正への適用可能性を示す。
シチジンデアミナーゼ媒介塩基編集によって生成されたジストロフィン欠乏変異マウス（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｍｉｃｅ）と関連したものであって、図１ａは、ジストロフィン遺伝子（Ｄｍｄ）の標的部位の核酸配列を示し（ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）は青色で、ｓｇＲＮＡの標的配列は黒色で示し、シチジンデアミナーゼ媒介塩基編集によって置換された塩基は赤色で表示する）、図１ｂは、塩基編集剤３（ＢＥ３）（ｒＡＰＯＢＥＣ１−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ）コーディングｍＲＮＡおよび図１ａのＤｍｄ遺伝子の標的配列と混成化可能なｓｇＲＮＡをマウス接合体（ｚｙｇｏｔｅ）に微細注入した後に発生された新生個体のＤｍｄ遺伝子標的部位核酸配列を整列した結果を示し（Ｗｔ、野生型；標的配列は下線で表示する；ＰＡＭ配列は青色で、置換された塩基は赤色でそれぞれ表示する；右側列の‘ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ（％）’は変異（塩基置換）された対立遺伝子の頻度を示し、‘−’は該当位置にヌクレオチドが存在しないの（欠失）を示す；左側列の数値はＤｍｄ突然変異マウス番号である）。 図１ｃは、シチジンデアミナーゼ媒介塩基編集によって生成されたジストロフィン欠乏変異マウス（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｍｉｃｅ）と関連したものであって、野生型およびＤｍｄ突然変異マウスＤ１０８のＤＮＡのサンガーシークエンシングクロマトグラム（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ）を示す（矢印は置換された塩基を示し、塩基置換によってＧｌｎコーディングコドンが終止コドンに変異されたことを示す）。 図１ｄは、シチジンデアミナーゼ媒介塩基編集によって生成されたジストロフィン欠乏変異マウス（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｍｉｃｅ）と関連したものであって、野生型およびＤｍｄ突然変異マウスＤ１０８の前方脛骨（ｔｉｂｉａｌｉｓ ａｎｔｅｒｉｏｒ；ＴＡ）筋肉の組織学的分析（蛍光分析）結果を示す（ラミニン（Ｌａｍｉｎｉｎ）：対照群；４週齢の野生型マウスまたはＤｍｄ突然変異マウス（Ｄ１０８）から筋肉を採取し、液体ニトロゲン−冷却されたイソペンタン（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｃｏｏｌｅｄ ｉｓｏｐｅｎｔａｎｅ）で凍結させて筋肉試料を準備する；スケールバー：５０μｍ）。 図１ｅは、シチジンデアミナーゼ媒介塩基編集によって生成されたジストロフィン欠乏変異マウス（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｍｉｃｅ）と関連したものであって、Ｄｍｄ遺伝子の標的部位に塩基置換突然変異を誘導した過程および結果を整理して示す。 シチジンデアミナーゼ媒介塩基編集によって生成された白色症マウスと関連したものであって、図２ａは、チロシナーゼ遺伝子（Ｔｙｒ）の標的部位の核酸配列を示し（ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）は青色で、ｓｇＲＮＡの標的配列は黒色で示し、シチジンデアミナーゼ媒介塩基編集によって置換された塩基は赤色で表示する）、図２ｂは、塩基編集剤３（ＢＥ３）（ｒＡＰＯＢＥＣ１−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ）ＲＮＰ（ＢＥ３と図２ａのＴｙｒ遺伝子の標的配列と混成化可能なｓｇＲＮＡとの複合体）の電気穿孔法によるマウス接合体（ｚｙｇｏｔｅ）内への導入後に発生した新生個体のＴｙｒ遺伝子標的部位の核酸配列を整列した結果を示す（Ｗｔ、野生型；標的配列は下線で表示する；ＰＡＭ配列は青色で、置換された塩基は赤色でそれぞれ表示する；右側列の‘ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ（％）’は変異（塩基置換）された対立遺伝子の頻度を示し、‘−’は該当位置にヌクレオチドが存在しないのを示す；左側列の数値はＴｙｒ突然変異マウス番号である）。 図２ｃは、シチジンデアミナーゼ媒介塩基編集によって生成された白色症マウスと関連したものであって、野生型およびＴｙｒ突然変異マウスＴ１１３およびＴ１１４のＤＮＡのサンガーシークエンシングクロマトグラム（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ）を示す（矢印は置換された塩基を示し、塩基置換によってＧｌｎコーディングコドンが終止コドンに変異されたことを示す）。 図２ｄは、シチジンデアミナーゼ媒介塩基編集によって生成された白色症マウスと関連したものであって、ＢＥ３ ＲＮＰの電気穿孔注入後に発生したＴｙｒ突然変異マウスの目に白色症（矢印、Ｔ１１３およびＴ１１４）が現れるのを示す。 図２ｅは、シチジンデアミナーゼ媒介塩基編集によって生成された白色症マウスと関連したものであって、Ｔｙｒ遺伝子の標的部位に塩基置換突然変異を誘導した過程および結果を整理して示す。 図３ａおよび３ｂは、ＢＥ３（デアミナーゼ−Ｃａｓ９）ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡのマウス胚への微細注入によるマウス胚での標的突然変異誘発を示すものであって、より具体的に、ＢＥ３コーディングｍＲＮＡとｓｇＲＮＡをマウス接合体に微細注入後に発生された胞胚（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）の標的遺伝子（ＤｍｄおよびＴｙｒ）の標的部位の核酸配列を整列した結果を示す（３ａ：Ｄｍｄ変異結果；３ｂ：Ｔｙｒ変異結果；Ｗｔ、野生型；標的配列は下線で表示する；ＰＡＭ配列は青色で、置換された塩基は赤色でそれぞれ表示する；右側列の‘ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ（％）’は変異（塩基置換）された対立遺伝子の頻度を示し、‘−’は該当位置にヌクレオチドが存在しない（欠失される）のを示す；左側列の数値は突然変異マウス胚細胞の番号である）。図３は、野生型およびＤｍｄ突然変異マウスのＤＮＡのサンガーシークエンシングクロマトグラム（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ）を示す（矢印は置換された塩基を示す）。 潜在的な非標的部位（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）でのＤｍｄ突然変異有無を試験した結果を示すグラフであって、非標的部位で突然変異がほとんど誘発されないのを確認することができる（Ｄｍｄ突然変異マウス（ｎ＝３）の非標的部位での突然変異（塩基編集）比率（％）は 標的深層シークエンシング（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって測定される；ミスマッチヌクレオチドおよびＰＡＭ配列はそれぞれ赤色および青色で表示される）。 潜在的な非標的部位（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）でのＴｙｒ突然変異有無を試験した結果を示すグラフであって、非標的部位で突然変異がほとんど誘発されないのを確認することができる（Ｔｙｒ突然変異マウス（ｎ＝２）の非標的部位での突然変異（塩基編集）比率（％）は 標的深層シークエンシング（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって測定される；ミスマッチヌクレオチドおよびＰＡＭ配列はそれぞれ赤色および青色で表示される）。 ｐＣＭＶ−ＢＥ３ベクターの開裂地図である。 ｐＥＴ−Ｈｉｓｘ６−ｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳベクターの開裂地図である。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これは例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするものではない。下記の実施例は発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形できるのは当業者に自明である。
実施例１：ＢＥ３ ｍＲＮＡ準備
ｐＣＭＶ−ＢＥ３（Ａｄｄｇｅｎｅ；ｃａｔ．＃７３０２１；図６）からｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ（リンカー）およびＵＧＩ（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を切断して分離した後、ｐＥＴ−ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）−ＮＬＳベクター（Ｃｈｏ、Ｓ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ２４、１３２−１４１（２０１４）参照）に挿入して、ｐＥＴ−Ｈｉｓｘ６−ｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ（配列番号７；図７）を製作し、これをＢＥ３ ｍＲＮＡ鋳型として使用した。
ｐＥＴ−Ｈｉｓｘ６−ｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ（配列番号７）の各部位の配列を整理すれば、次の通りである：
Ｈｉｓｘ６：配列番号８；
ｒＡＰＯＢＥＣ１：配列番号９；
ＸＴＥＮ（リンカー）：配列番号１０；
ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）：配列番号１１；
リンカー：ＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴ（配列番号１４）
ＵＧＩ：配列番号１２；
リンカー：ＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴ（配列番号１４）
ＮＬＳ：配列番号１３．
前記ｐＥＴ−Ｈｉｓｘ６−ｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳベクターに対して、プライマー（Ｆ：５’−ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＴＣ ＧＧＣ ＧＡＴ ＡＴＡ ＧＧ−３’、Ｒ：５’−ＣＣＣ ＣＡＡ ＧＧＧ ＧＴＴ ＡＴＧ ＣＴＡ ＧＴ−３’）およびＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティーＤＮＡポリメラーゼ（Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するＰＣＲを行って、前記ｍＲＮＡ鋳型を準備した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写キット（ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ ｋｉｔ、Ａｍｂｉｏｎ）を使用して前記準備されたｍＲＮＡ鋳型からＢＥ３ ｍＲＮＡ合成し、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）で精製した。
実施例２：ｓｇＲＮＡ準備
次の核酸配列を有するジストロフィン遺伝子Ｄｍｄまたはチロシナーゼ遺伝子Ｔｙｒ標的ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をそれぞれ合成して、下記の試験に使用した：
５’−（標的配列）−（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ；配列番号１）−（ヌクレオチドリンカー）−（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ；配列番号３）−３’
（前記標的配列は、下記の図１ａ（Ｄｍｄ）または図２ａ（Ｔｙｒ）に下線で表示された核酸配列で“Ｔ”を“Ｕ”に変換した配列であり、
前記ヌクレオチドリンカーは、ＧＡＡＡのヌクレオチド配列を有する）。
前記ｓｇＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって製作した（Ｃｈｏ、Ｓ．Ｗ．、Ｋｉｍ、Ｓ．、Ｋｉｍ、Ｊ．Ｍ．＆ Ｋｉｍ、Ｊ．Ｓ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃａｓ９ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ。Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１、２３０−２３２（２０１３）参照）
実施例３：リボ核タンパク質（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ；ＲＮＰｓ）の準備
Ｒｏｓｅｔｔａ発現細胞（ＥＭＤ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を前記実施例１で準備されたｐＥＴ２８−Ｈｉｓｘ６−ｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）−ＵＧＩ−ＮＬＳ（ＢＥ３）発現ベクターで形質転換させ、１８℃で１２〜１４時間０．５ｍＭイソプロピルベータ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｂｅｔａ−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；ＩＰＴＧ）を処理してタンパク質発現を誘導した。タンパク質発現誘導後、遠心分離してバクテリア細胞を収穫し、ペレット化された細胞を溶解緩衝液［５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＤＴＴ、ａｎｄ １ｍｇ／ｍｌ ｌｙｓｏｚｙｍｅ］でソニケーションして溶解させた。
前記得られた細胞溶解物を５，２５１ｘｇで３０分間遠心分離して除去し、可溶性溶解物をＮｉ−ＮＴＡビード（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して４℃で１時間培養した。その後、Ｎｉ−ＮＴＡビードを洗浄緩衝液［５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ａｎｄ ２０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］で３回洗浄し、溶出緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０−５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０−２５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、ａｎｄ ０．２Ｍ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］でＢＥ３タンパク質を溶出させた。精製されたＢＥ３タンパク質をＵｌｔｒａｃｅｌｌ １００Ｋセルロースカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して保存緩衝液［２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ａｎｄ １０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ］で交換および濃縮させた。前記タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定した。ｓｇＲＮＡは実施例３に記載された通りＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって準備した。
実施例４：動物の準備
マウスを対象にする実験は、ソウル大学校の動物実験倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ；ＩＡＣＵＣ）の承認を受けて行った。マウスをＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ）施設で１２時間の暗影周期で維持させた。Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＩＣＲマウスをそれぞれ胚寄贈者（ｅｍｂｒｙｏ ｄｏｎｏｒ）および委託母（ｆｏｓｔｅｒ ｍｏｔｈｅｒ）として使用した。
実施例５：マウス接合体（ｚｙｇｏｔｅ）への微細注入および電気穿孔
過排卵、胚採取、微細注入および電気穿孔は“Ｈｕｒ、Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．、Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｐｆ１ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４、８０７−８０８（２０１６）”を参照して行った。
微細注入の場合、ＢＥ３ ｍＲＮＡ（１０ｎｇ／ｕｌ）とｓｇＲＮＡ（１００ｎｇ／ｕｌ）の複合体を含む溶液をＤＥＰＣ−処理された注入緩衝液（０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）を使用して希釈させ（Ｓｕｎｇ、Ｙ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｗｉｔｈ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２４、１２５−１３１（２０１４）参照）、Ｎｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ Ｔｉ ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒおよびＦｅｍｔｏＪｅｔ ４ｉ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて受精された１−細胞期胚の前核（ｐｒｏｎｕｃｌｅｉ）内に注入した。
電気穿孔の場合、ＢＥ３−ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体（それぞれ１０μｇ／１００μｌおよび６．５μｇ／１００μｌ含有）を含有するｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１００μｌで充填されたガラスチャンバーを含むＮＥＰＡ ２１ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（ＮＥＰＡ ＧＥＮＥ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して前記ＲＮＰ複合体を１−細胞期のマウス胚細胞に電気穿孔で注入した（Ｈｕｒ、Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｐｆ１ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４、８０７−８０８（２０１６）参照）。
ＢＥ３ ＲＮＰまたはｍＲＮＡ伝達後、前記胚をＫＳＯＭ＋ＡＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の微細液滴（ｍｉｃｒｏｄｒｏｐ）で培養し、前記培養は３７℃および５％ＣＯ２の加湿条件下で４日間行った。２−細胞期胚を０．５−ｄｐｃ ｐｓｅｕｄｏ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｆｏｓｔｅｒ ｍｏｔｈｅｒの卵管に移植した。
前記過程を下記の図に要約した：
実施例６：Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ
ＰＣＲ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇのために、参考例４で卵管に移植された胚から得られた胞胚期胚またはマウス新生個体のｅａｒ ｃｌｉｐからゲノムＤＮＡを抽出して、これに対する標的深層シークエンシング（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）およびサンガーシークエンシング（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。
実施例７：標的深層シークエンシング（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
下記実施例での核酸配列分析は、以下のような標的深層シークエンシングによって行った。
Ｐｈｕｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して前記参考例５で抽出されたゲノムＤＮＡから標的部位または非標的部位を増幅させた。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを使用してＰＣＲ増幅産物（ＰＣＲ ａｍｐｌｉｃｏｎｓ）のｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄシークエンシングを行った（ＬＡＳ、Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）に依頼して遂行）。非標的部位増幅に使用されたプライマーを下記の表１および表２に示した。
実施例８：免疫蛍光染色（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ）
マウスから切除した前方脛骨（ｔｉｂｉａｌｉｓ ａｎｔｅｒｉｏｒ；ＴＡ）筋肉切片をラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）またはジストロフィン（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）抗体で免疫染色したた。ラミニンはラビット多クローン抗体（ａｂｃａｍ、ａｂ１１５７５）の１：５００希釈液とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８抗−ラビット二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１：１０００希釈液を順次に使用して検出した。ジストロフィンはラビット多クローン抗体（ａｂｃａｍ、ａｂ１５２７７）の１：５００希釈液とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗−ラビット二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１：１０００希釈液を順次に使用して検出した。前記免疫蛍光染色された切片をＬｅｉｃａ ＤＭＩ４０００ Ｂ 蛍光顕微鏡で観察した。
実施例９：ＢＥ３を使用して突然変異が誘導されたマウス胚の配列分析
実施例１−５に記載された通り、マウス胚細胞にＢａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ ３（ＢＥ３（ｒＡＰＯＢＥＣ１−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ）を微細注入によって注入して、ジストロフィンコーディング遺伝子Ｄｍｄおよびチロシナーゼコーディング遺伝子Ｔｙｒでそれぞれ点突然変異を誘導した。
図１ａ（Ｄｍｄ）および図２ａ（Ｔｙｒ）に示したように、各遺伝子の標的部位（図１ａおよび図２ａで、上に記載された核酸配列の中の下線で表示した配列部位）で単一塩基置換（Ｃ→Ｔ）によって終止コドンが生成されると予想された（図１ａおよび図２ａで、下に記載された核酸配列が単一塩基置換が起こった核酸配列であり、置換（Ｃ→Ｔ）された塩基を赤色で表示）。
図１ｅおよび図２ｅは、前記行われたＤｍｄまたはＴｙｒ遺伝子での標的特異的単一塩基置換突然変異過程（微細注入または電気穿孔）および結果を要約して示す。図１ｅおよび図２ｅに示されているように、ＤｍｄまたはＴｙｒ遺伝子の標的部位でそれぞれ７３％（Ｄｍｄ；１５個のうちの１１個）または１００％（Ｔｙｒ；１０個のうちの１０個）の頻度に胚で変異が観察された。
また、ＢＥ３ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡの微細注入によって突然変異が誘発されたマウス胚の標的部位の核酸配列を標的深層シークエンシング（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で確認した。より具体的に、ＢＥ３（ｒＡＰＯＢＥＣ１−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ）ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡのマウス胚への微細注入によるマウス胚での標的突然変異誘発を示すものであって、ＢＥ３コーディングｍＲＮＡとｓｇＲＮＡをマウス接合体に微細注入後に発生された胞胚（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）の標的遺伝子（ＤｍｄおよびＴｙｒ）の標的部位の核酸配列を整列した。
前記に示されているように、前記二つの遺伝子（ＤｍｄまたはＴｙｒ）の標的部位全てで、Ｃ→Ｔ塩基置換が主な突然変異誘発パターンであるのを確認することができる。
実施例１０：ＢＥ３およびＤｍｄ標的ｓｇＲＮＡの微細注入によって突然変異が誘導されたマウス個体の突然変異誘発確認
マウス胚にＢＥ３ ｍＲＮＡとＴｙｒ標的ｓｇＲＮＡの微細注入後、委託母（ｆｏｓｔｅｒ ｍｏｔｈｅｒ）卵管に移植して（実施例５参照）、Ｄｍｄ遺伝子に点突然変異を有する新生突然変異マウス（Ｆ０）を得た。
図１ｂおよび図３は、ＢＥ３（ｒＡＰＯＢＥＣ１−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ）コーディングｍＲＮＡおよびＤｍｄ遺伝子の標的部位の核酸配列と混成化可能なｓｇＲＮＡをマウス接合体（ｚｙｇｏｔｅ）に微細注入した後に発生された新生個体の標的遺伝子（Ｄｍｄ）の標的部位の核酸配列を分析した結果を示す。図１ｂに示されているように、Ｄｍｄ遺伝子に点突然変異を誘発した場合、総９匹ハツカネズミのうちの５匹（Ｄ１０２、Ｄ１０３、Ｄ１０７、Ｄ１０８、およびＤ１０９）がＤｍｄ遺伝子の標的部位に突然変異を有し、これら５個の突然変異マウスのうちの３個個体（Ｄ１０２、Ｄ１０３、Ｄ１０８）は一つまたは二つの突然変異対立遺伝子を有しており、野生型対立形質が欠如していると確認された。他の二つの突然変異マウス（Ｄ１０７およびＤ１０９）はモザイク形態で１０％の頻度に野生型対立遺伝子を有していた。また、図１ｂおよび図３に示されているように、突然変異マウスＤ１０９は点突然変異でない２０−塩基対（ｂｐ）欠失を示し、これはＢＥ３に含まれているＣａｓ９ニッカーゼが標的部位でインデル（ｉｎｄｅｌｓ）を誘導する活性を有しているのを示す。
図１ｃは、野生型およびＤｍｄ突然変異マウスＤ１０８の標的遺伝子の標的部位のサンガーシークエンシングクロマトグラム（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ）を示す。図１ｃで示されているように、野生型対立遺伝子がない突然変異Ｆ０マウスであるＤ１０８は、単一塩基置換（Ｃ→Ｔ）によってＤｍｄ遺伝子に早期終止コドン（ＴＡＧ）が導入された。
図１ｄは、野生型およびＤｍｄ突然変異マウスＤ１０８のＴＡ筋肉切片に対する免疫蛍光染色（実施例８参照）結果を示したものであって、突然変異個体（Ｄ１０８）の筋肉でジストロフィンがほとんど発現されないのを確認することができる。これは、ＢＥ３ｍＲＮＡおよびＤｍｄ標的ｓｇＲＮＡの注入（微細注入）によってＤｍｄ遺伝子が成功的にノックダウン（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）されるのを示す。
実施例１１：ＢＥ３およびｓｇＲＮＡを含むＲＮＡの電気穿孔によって突然変異が誘導されたマウス胚の突然変異誘発確認
実施例３で準備された組換えＢＥ３タンパク質とｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｓｇＲＮＡの混合物（ｒＡＰＯＢＥＣ１−ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）−ＵＧＩ ＲＮＰ）を含むＢＥ３リボ核タンパク質（ＲＮＰｓ）を電気穿孔法でマウス胚に伝達した（実施例５参照）。電気穿孔後４日目に、マウス胚の各標的遺伝子（ＤｍｄまたはＴｙｒ）の標的部位の核酸配列を分析してその結果を以下に示した：
前記結果および図１ｅおよび図２ｅに示されているように、ＢＥ３ ＲＮＰの電気穿孔注入によって、胞胚期胚のＤｍｄおよびＴｙｒ標的部位でそれぞれ８１％（Ｄｍｄ：１６個のうちの１３個）および８５％（Ｔｙｒ：１３個のうちの１１個）の頻度で突然変異が誘導された。
実施例１２：ＢＥ３およびＴｙｒ標的ｓｇＲＮＡを含むＲＮＰの電気穿孔注入によって突然変異が誘導されたマウス個体の突然変異誘発確認
マウス胚にＢＥ３およびＴｙｒ特異的ｓｇＲＮＡを含むＲＮＰを電気穿孔によってマウス胚に注入した後、委託母（ｆｏｓｔｅｒ ｍｏｔｈｅｒ）卵管に移植して（実施例５参照）、Ｔｙｒ遺伝子に点突然変異を有するマウス（Ｆ０）を得た。
図２ｂは、前記得られた新生突然変異マウスのＴｙｒ遺伝子の標的部位の核酸配列を整列した結果を示す。図２ｂに示されているように、得られた新生突然変異マウス７匹（Ｔ１１０、Ｔ１１１、Ｔ１１２、Ｔ１１３、Ｔ１１４、Ｔ１１７、およびＴ１１８）全てＴｙｒ遺伝子の標的部位で多様な突然変異が誘発されるのを確認することができる。
図２ｃは、野生型および新生突然変異マウス（Ｔ１１３およびＴ１１４）の標的遺伝子の標的部位のサンガーシークエンシングクロマトグラム（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ）を示すものであって、前記新生突然変異マウスの標的部位での単一塩基置換（Ｃ→Ｔ）によって終止コドン（ＴＡＧ）が生成されるのを確認することができる。
図２ｄは、新生突然変異マウスの目の表現型を示すものであって、突然変異マウス（Ｔ１１３、Ｔ１１４）で眼白色症が現れるのを確認することができる。これは、ＢＥ３ ｍＲＮＡおよびＴｙｒ標的ｓｇＲＮＡのＲＮＰの注入（電気穿孔）によってＴｙｒ遺伝子が成功的にノックダウン（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）されるのを示す。
実施例１３：非標的効果（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ）試験
ＢＥ３の非標的（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）効果を評価するために、Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／ｃａｓ−ｏｆｆｉｎｄｅｒ／）を使用してマウスゲノムで最大３−ヌクレオチド不一致（３−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｓｍａｔｃｈｅ）を有する潜在的な非標的部位（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）を確認し、標的深層シークエンシングを通じて新生突然変異マウス個体から分離されたゲノムＤＮＡを分析した。
ｓｇＲＮＡ配列および標的深層シークエンシングに使用されたプライマー配列を下記の表３に整理した。
前記の確認されたマウスゲノムでの非標的部位（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）および前記標的深層シークエンシング結果を下記の表４（Ｄｍｄ）および表５（Ｔｙｒ）、および図４（Ｄｍｄ）および図５（Ｔｙｒ）に示した：
（前記表５および６で、非標的（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）部位中の標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）配列と不一致のヌクレオチドは小文字で表示する；３’末端のＮＧＧはＰＡＭ配列を示す）
表４、表５、図４および図５に示したように、本試験で使用された標的部位（ｏｎ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）はマウスゲノム内で有意味な非標的（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）変異を誘発しないのを確認することができ、これは、前記標的部位を標的とするＢＥ３システムが生体内で非常に標的特異的であるのを示す。
前記ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ形態で使用され（または前記組成物に含まれ）るか、これをコーディングするＤＮＡを含むプラスミド形態で使用され（または前記組成物に含まれ）てもよい。本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．シチジンデアミナーゼまたはそのコーディング遺伝子、および
標的特異的ヌクレアーゼまたはそのコーディング遺伝子を含む、
哺乳動物細胞の塩基編集用組成物。
２．前記標的特異的ヌクレアーゼは、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含むものである、上記１に記載の塩基編集用組成物。
３．前記ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質である、上記２に記載の塩基編集用組成物。
４．前記ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ、触媒活性欠乏Ｃａｓ９タンパク質、または野生型Ｃａｓ９タンパク質と異なるＰＡＭ配列を認識するＣａｓ９タンパク質である、上記２に記載の塩基編集用組成物。
５．前記ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼは、以下のアミノ酸残基が野生型アミノ酸残基と異なるアミノ酸残基で置換されたものである：
（１）Ｄ１０、Ｈ８４０、またはＤ１０およびＨ８４０；
（２）Ｄ１１３５、Ｒ１３３５、およびＴ１３３７からなる群より選択された一つ以上；または
（３）前記（１）および（２）のアミノ酸残基の両方、
ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含む、
上記４に記載の塩基編集用組成物。
６．前記ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む二重ＲＮＡ、または単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、上記２に記載の塩基編集用組成物。
７．前記シチジンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｍＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ、ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−ｌｉｋｅ）、ＡＩＤ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ｔａｄＡ（ｔＲＮＡ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）またはこれらの組み合わせである、上記１に記載の塩基編集用組成物。
８．前記哺乳動物細胞の塩基編集用組成物は、シチジンデアミナーゼコーディングｍＲＮＡ、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼコーディングｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡを含むものである、上記２〜７のうちのいずれかに記載の塩基編集用組成物。
９．前記哺乳動物細胞の塩基編集用組成物は、シチジンデアミナーゼ、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼ、およびガイドＲＮＡが複合体を形成するリボ核タンパク質を含むものである、上記２〜７のうちのいずれかに記載の塩基編集用組成物。
１０．ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ抑制剤（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＵＧＩ）またはそのコーディング遺伝子、核局在化配列（ＮＬＳ）またはそのコーディング遺伝子、またはこれら全てを追加的に含む、上記１〜７のうちのいずれかに記載の塩基編集用組成物。
１１．前記哺乳動物細胞は、哺乳動物胚である、上記１〜７のうちのいずれかに記載の塩基編集用組成物。
１２．上記１〜７のうちのいずれかの塩基編集用組成物を哺乳動物細胞に注入する段階を含む、哺乳動物細胞の塩基編集方法。
１３．前記塩基編集用組成物は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ抑制剤（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＵＧＩ）またはそのコーディング遺伝子、核局在化配列（ＮＬＳ）またはそのコーディング遺伝子、またはこれら全てを追加的に含むものである、上記１２に記載の塩基編集方法。
１４．前記注入は、微細注入または電気穿孔によって行われるものである、上記１２に記載の塩基編集方法。
１５．前記哺乳動物細胞は、哺乳動物胚である、上記１２に記載の塩基編集方法。
１６．上記１〜７のうちのいずれかの塩基編集用組成物が注入された、遺伝子改変哺乳動物細胞。
１７．前記塩基編集用組成物は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ抑制剤（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＵＧＩ）またはそのコーディング遺伝子、核局在化配列（ＮＬＳ）またはそのコーディング遺伝子、またはこれら全てを追加的に含むものである、上記１６に記載の遺伝子改変哺乳動物細胞。
１８．前記哺乳動物細胞は、哺乳動物胚である、上記１６に記載の遺伝子改変哺乳動物細胞。
１９．上記１８の遺伝子改変哺乳動物胚を哺乳動物代理母卵管に移植して発生させた、遺伝子改変哺乳動物。
２０．上記１８の遺伝子改変哺乳動物胚を哺乳動物代理母卵管に移植する段階を含む、遺伝子改変哺乳動物の製造方法。

Claims (20)

  1. シチジンデアミナーゼまたはそのコーディング遺伝子、および
    標的特異的ヌクレアーゼまたはそのコーディング遺伝子を含む、
    哺乳動物細胞の塩基編集用組成物。
  2. 前記標的特異的ヌクレアーゼは、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含むものである、請求項１に記載の塩基編集用組成物。
  3. 前記ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質である、請求項２に記載の塩基編集用組成物。
  4. 前記ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ、触媒活性欠乏Ｃａｓ９タンパク質、または野生型Ｃａｓ９タンパク質と異なるＰＡＭ配列を認識するＣａｓ９タンパク質である、請求項２に記載の塩基編集用組成物。
  5. 前記ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼは、以下のアミノ酸残基が野生型アミノ酸残基と異なるアミノ酸残基で置換されたものである：
    （１）Ｄ１０、Ｈ８４０、またはＤ１０およびＨ８４０；
    （２）Ｄ１１３５、Ｒ１３３５、およびＴ１３３７からなる群より選択された一つ以上；または
    （３）前記（１）および（２）のアミノ酸残基の両方、
    ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含む、
    請求項４に記載の塩基編集用組成物。
  6. 前記ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む二重ＲＮＡ、または単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項２に記載の塩基編集用組成物。
  7. 前記シチジンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｍＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ、ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−ｌｉｋｅ）、ＡＩＤ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ｔａｄＡ（ｔＲＮＡ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）またはこれらの組み合わせである、請求項１に記載の塩基編集用組成物。
  8. 前記哺乳動物細胞の塩基編集用組成物は、シチジンデアミナーゼコーディングｍＲＮＡ、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼコーディングｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡを含むものである、請求項２〜７のうちのいずれか一項に記載の塩基編集用組成物。
  9. 前記哺乳動物細胞の塩基編集用組成物は、シチジンデアミナーゼ、ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼ、およびガイドＲＮＡが複合体を形成するリボ核タンパク質を含むものである、請求項２〜７のうちのいずれか一項に記載の塩基編集用組成物。
  10. ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ抑制剤（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＵＧＩ）またはそのコーディング遺伝子、核局在化配列（ＮＬＳ）またはそのコーディング遺伝子、またはこれら全てを追加的に含む、請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載の塩基編集用組成物。
  11. 前記哺乳動物細胞は、哺乳動物胚である、請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載の塩基編集用組成物。
  12. 請求項１〜７のうちのいずれか一項の塩基編集用組成物を哺乳動物細胞に注入する段階を含む、哺乳動物細胞の塩基編集方法。
  13. 前記塩基編集用組成物は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ抑制剤（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＵＧＩ）またはそのコーディング遺伝子、核局在化配列（ＮＬＳ）またはそのコーディング遺伝子、またはこれら全てを追加的に含むものである、請求項１２に記載の塩基編集方法。
  14. 前記注入は、微細注入または電気穿孔によって行われるものである、請求項１２に記載の塩基編集方法。
  15. 前記哺乳動物細胞は、哺乳動物胚である、請求項１２に記載の塩基編集方法。
  16. 請求項１〜７のうちのいずれか一項の塩基編集用組成物が注入された、遺伝子改変哺乳動物細胞。
  17. 前記塩基編集用組成物は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ抑制剤（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＵＧＩ）またはそのコーディング遺伝子、核局在化配列（ＮＬＳ）またはそのコーディング遺伝子、またはこれら全てを追加的に含むものである、請求項１６に記載の遺伝子改変哺乳動物細胞。
  18. 前記哺乳動物細胞は、哺乳動物胚である、請求項１６に記載の遺伝子改変哺乳動物細胞。
  19. 請求項１８の遺伝子改変哺乳動物胚を哺乳動物代理母卵管に移植して発生させた、遺伝子改変哺乳動物。
  20. 請求項１８の遺伝子改変哺乳動物胚を哺乳動物代理母卵管に移植する段階を含む、遺伝子改変哺乳動物の製造方法。
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