JP2020173153A - コショウ科コショウ属植物抽出物中のピペリン類化合物の定量方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】コショウ科コショウ属植物抽出物に含まれるピペリン類化合物を高精度に定量する方法を提供する。【解決手段】コショウ科コショウ属植物抽出物に含まれる第１〜第ｎ（ｎ≧２）ピペリン類化合物を定量する方法は、各ピペリン類化合物と内部標準物質とを含むＮＭＲ試料溶液をＮＭＲで処理することで得られるＮＭＲスペクトルから、各ピペリン類化合物の純度を算出する工程と、純度が算出された第１ピペリン類化合物に対する純度が算出された第２〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの相対モル感度を取得する工程と、植物抽出物を含む定量用試料溶液を液体クロマトグラフィーで処理することで得られる定量用クロマトグラム及び純度が算出された第１ピペリン類化合物を含む定量用標準溶液のそれぞれを液体クロマトグラフィーで処理することで得られる標準クロマトグラムから、植物抽出物中の各ピペリン類化合物の総含有量を算出する工程とを有する。【選択図】なし
Description
本発明は、コショウ科コショウ属に属する植物からの抽出物に含まれるピペリン類化合物を定量する方法に関する。
コショウ科コショウ属植物のヒハツ（Ｐｉｐｅｒ ｒｅｔｒｏｆｒａｃｔｕｍ又はＰｉｐｅｒ ｌｏｎｇｕｍ）やコショウ（Ｐｉｐｅｒ ｎｉｇｒｕｍ）は、東南アジアやインド等に分布する常緑のつる植物であり、果穂は香辛料として利用されている。このヒハツやコショウの果穂の抽出物には、主にピペリン、ピペラニン、イソピペリン、シャビシン及びイソシャビシンの５種のピペリン類化合物が含まれ、これらのピペリン類化合物は、優れた冷え改善効果を有することが知られている。そのような効果を期待して、例えば、上記ヒハツ抽出物は、飲食品に配合されて飲用や食用に供されている（特許文献１参照）。
機能性表示食品は、当該機能性表示食品に配合される成分が有する効果（例えば、上記ヒハツ抽出物やコショウ抽出物が有する「冷え改善効果」等）に基づく機能を表示して需要者に提供され得る。上記ヒハツ抽出物や上記コショウ抽出物を配合してなる飲食品を機能性表示食品として需要者に提供しようとする場合、上記機能の有効成分（機能性関与成分）であるピペリン類化合物の含有量やその定量方法を届け出なければならない。しかしながら、ヒハツ抽出物やコショウ抽出物に含まれる上記５種のピペリン類化合物のうち、ピペラニンを除く４種は、互いにシス・トランス異性体であり、非遮光下で光異性化を生じさせることで、抽出物中の各ピペリン類化合物の含有量が変化するとともに、光異性化後は、吸光係数等のレスポンスの応答が変化してしまう。そのため、それらを高精度に定量する方法は、現在のところ確立されておらず、当該定量方法の提案が望まれている。
また、定量対象成分を含む検体を液体クロマトグラフィー処理に付して、それにより得られるクロマトグラムからピーク面積を求めて当該定量対象成分の検量線を作成することで、当該定量対象成分を定量する方法が一般的に知られている。この検量線を作成するためには、定量対象成分の標準品が必要となるが、ヒハツ抽出物やコショウ抽出物に含まれる複数種のピペリン類化合物のうちの一部は、標準品が市販されていないために、検量線を用いて定量することも困難である。仮に、ヒハツ抽出物やコショウ抽出物からピペリン類化合物を単離精製し、当該ピペリン類化合物を用いて検量線を作成したとしても、光異性化による含有量の変化のおそれがあることで、検量線の再現性が低く、定量結果の精度が低くなってしまうという問題もある。
上記課題に鑑みて、本発明は、コショウ科コショウ属に属する植物からの抽出物に含まれるピペリン類化合物を高精度に定量する方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため、本発明は、コショウ科コショウ属に属する植物からの抽出物に含まれる第１〜第ｎ（ｎは２以上の整数である。）ピペリン類化合物を定量する方法であって、第１〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれと内部標準物質とを含む第１〜第ｎＮＭＲ試料溶液をＮＭＲで処理することで得られるＮＭＲスペクトルから、前記第１〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの純度を算出する純度算出工程と、前記純度が算出された第１ピペリン類化合物に対する前記純度が算出された第２〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの相対モル感度を取得する相対モル感度取得工程と、前記抽出物を含む定量用試料溶液を液体クロマトグラフィーで処理することで得られる定量用クロマトグラム及び前記純度が算出された第１ピペリン類化合物を含む定量用標準溶液を液体クロマトグラフィーで処理することで得られる標準クロマトグラムから、前記抽出物中の前記第１〜第ｎピペリン類化合物の総含有量を算出する定量工程とを有し、前記相対モル感度取得工程は、前記第１〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれを複数種のモル濃度で含むＬＣ試料溶液を液体クロマトグラフィーで処理することでＬＣクロマトグラムを得る工程と、前記各種ＬＣ試料溶液における前記第１〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの前記純度に基づくモル濃度と、前記ＬＣクロマトグラムにおける前記第１〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれのピーク面積との関係を示す第１〜第ｎ検量線のそれぞれの傾きを算出する工程と、前記第１検量線の傾きに対する前記第２〜第ｎ検量線のそれぞれの傾きの比を、前記第２〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの前記相対モル感度として算出する工程とを含み、前記定量工程は、前記純度が算出された前記第１ピペリン類化合物を複数種のモル濃度で含む複数の前記定量用標準溶液のそれぞれを前記液体クロマトグラフィーで処理することで得られる複数の前記標準クロマトグラムから、前記純度が算出された第１ピペリン類化合物のピーク面積と前記複数の定量用標準溶液のそれぞれにおける前記第１ピペリン類化合物の前記純度に基づくモル濃度との関係を示す標準検量線を作成する工程と、前記定量用クロマトグラム及び前記標準検量線に基づいて、前記抽出物中の前記第１ピペリン類化合物の含有量を算出する工程と、前記標準検量線の傾き及び前記相対モル感度から、前記抽出物中の前記第２〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの含有量を算出する工程と、前記抽出物中の前記第１〜第ｎピペリン類化合物の総含有量を算出する工程とを含むことを特徴とするピペリン類化合物の定量方法を提供する。
前記定量工程において、前記第１ピペリン類化合物の含有量は、下記式（１）及び式（２）に基づいて算出され得る。
上記式（１）及び式（２）において、Ｃｔ1は「前記抽出物中の前記第１ピペリン類化合物の含有量」を表し、Ｃ1は「前記定量用試料溶液中における前記第１ピペリン類化合物のモル濃度」を表し、Ｍ1は「前記第１ピペリン類化合物の分子量」を表し、ＣEは「前記定量用試料溶液中における前記抽出物の濃度」を表し、Ｓ1’は「前記標準検量線の傾き」を表し、ａ1は「前記定量用クロマトグラムにおける前記第１ピペリン類化合物のピーク面積」を表す。
前記定量工程において、前記第２〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの含有量は、下記式（３）〜（５）に基づいて算出され得る。
上記式（３）〜（５）において、Ｃｔ2〜nは「前記抽出物中の前記第２〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの含有量」を表し、Ｃ2〜nは「前記定量用試料溶液中における前記第２〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれのモル濃度」を表し、Ｍ2〜nは「前記第２〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの分子量」を表し、ＣEは「前記定量用試料溶液中における前記抽出物の濃度」を表し、Ｓ2〜n’は「前記第２〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれにおいて前記標準検量線を作成した場合における当該標準検量線の傾き」を表し、ａ2〜nは「前記定量用クロマトグラムにおける前記第２〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれのピーク面積」を表し、ＲＭＳ2〜nは「前記第２〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの前記相対モル感度」を表す。
前記純度算出工程において、下記式（６）に基づいて前記第１〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの純度を算出することができる。
上記式（６）において、Ｐ1〜nは「前記第１〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの純度」を表し、ＰISは「前記内部標準物質の純度」を表し、Ａ1〜nは「前記第１〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの前記ＮＭＲスペクトルにおけるシグナル面積」を表し、ＡISは「前記内部標準物質の前記ＮＭＲスペクトルにおけるシグナル面積」を表し、Ｈ1〜nは「前記第１〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの前記ＮＭＲスペクトルにおける前記シグナル面積Ａ1〜nに由来するプロトン数」を表し、ＨISは「前記内部標準物質の前記ＮＭＲスペクトルにおける前記シグナル面積ＡISに由来するプロトン数」を表し、Ｍ1〜nは「前記第１〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの分子量」を表し、ＭISは「前記内部標準物質の分子量」を表し、Ｗ1〜nは「前記第１〜第ｎＮＭＲ試料溶液のそれぞれにおける前記第１〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの秤量値」を表し、ＷISは「前記第１〜第ｎＮＭＲ試料溶液のそれぞれにおける前記内部標準物質の秤量値」を表す。
前記第１ピペリン類化合物として、ピペリンを用いることができる。前記コショウ科コショウ属に属する植物として、ヒハツ又はコショウを用いることができる。
前記第１ピペリン類化合物として、ピペリンを用いることができる。前記コショウ科コショウ属に属する植物として、ヒハツ又はコショウを用いることができる。
本発明によれば、コショウ科コショウ属に属する植物からの抽出物に含まれるピペリン類化合物を高精度に定量する方法を提供することができる。
本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本実施形態に係るピペリン類化合物の定量方法は、コショウ科コショウ属に属する植物からの抽出物（以下、「コショウ属植物抽出物」という。）に含まれる第１〜第ｎピペリン類化合物（ｎは２以上の整数である。）、具体的には下記に示す化学構造を有するピペリン（第１ピペリン類化合物，構造式（Ａ），piperine，Ｃ17Ｈ19ＮＯ3，分子量：２８５．３４３）、ピペラニン（第２ピペリン類化合物，構造式（Ｂ），piperanine，Ｃ17Ｈ21ＮＯ3，分子量：２８７．３５９）、イソピペリン（第３ピペリン類化合物，構造式（Ｃ），isopiperine，Ｃ17Ｈ19ＮＯ3，分子量：２８５．３４３）、シャビシン（第４ピペリン類化合物，構造式（Ｄ），chavicine，Ｃ17Ｈ19ＮＯ3，分子量：２８５．３４３）及びイソシャビシン（第５ピペリン類化合物，構造式（Ｅ），isochavicine，Ｃ17Ｈ19ＮＯ3，分子量：２８５．３４３）の５種のピペリン類化合物（ｎ＝５）を定量する方法である。かかる定量方法は、純度取得工程と、相対モル感度取得工程と、定量工程とを含む。なお、後述するように、第１ピペリン類化合物は、本実施形態に係る定量方法において、第２〜第ｎ（第５）ピペリン類化合物を定量するための標準物質として用いられるものである。したがって、第１ピペリン類化合物としては、コショウ属植物抽出物に含まれる複数のピペリン類化合物のうちのいずれか１種が用いられ得るが、市場に流通し安定的に入手可能なものが選択されるのが好ましく、ピペリンであるのが好ましい。
本実施形態に係るピペリン類化合物の定量方法は、コショウ科コショウ属に属する植物からの抽出物（以下、「コショウ属植物抽出物」という。）に含まれる第１〜第ｎピペリン類化合物（ｎは２以上の整数である。）、具体的には下記に示す化学構造を有するピペリン（第１ピペリン類化合物，構造式（Ａ），piperine，Ｃ17Ｈ19ＮＯ3，分子量：２８５．３４３）、ピペラニン（第２ピペリン類化合物，構造式（Ｂ），piperanine，Ｃ17Ｈ21ＮＯ3，分子量：２８７．３５９）、イソピペリン（第３ピペリン類化合物，構造式（Ｃ），isopiperine，Ｃ17Ｈ19ＮＯ3，分子量：２８５．３４３）、シャビシン（第４ピペリン類化合物，構造式（Ｄ），chavicine，Ｃ17Ｈ19ＮＯ3，分子量：２８５．３４３）及びイソシャビシン（第５ピペリン類化合物，構造式（Ｅ），isochavicine，Ｃ17Ｈ19ＮＯ3，分子量：２８５．３４３）の５種のピペリン類化合物（ｎ＝５）を定量する方法である。かかる定量方法は、純度取得工程と、相対モル感度取得工程と、定量工程とを含む。なお、後述するように、第１ピペリン類化合物は、本実施形態に係る定量方法において、第２〜第ｎ（第５）ピペリン類化合物を定量するための標準物質として用いられるものである。したがって、第１ピペリン類化合物としては、コショウ属植物抽出物に含まれる複数のピペリン類化合物のうちのいずれか１種が用いられ得るが、市場に流通し安定的に入手可能なものが選択されるのが好ましく、ピペリンであるのが好ましい。
［純度取得工程］
上記第１〜第５ピペリン類化合物のそれぞれと、純度が既知の内部標準物質（例えばＤＳＳ−ｄ6等）とを溶媒（例えばＤＭＳＯ−ｄ6等）に溶解させて第１〜第５ＮＭＲ試料溶液を調製する。各ＮＭＲ試料溶液を調製するために用いられる各ピペリン類化合物は、市販の純品であってもよいし、コショウ属植物抽出物から単離精製して得られる精製物であってもよい。
上記第１〜第５ピペリン類化合物のそれぞれと、純度が既知の内部標準物質（例えばＤＳＳ−ｄ6等）とを溶媒（例えばＤＭＳＯ−ｄ6等）に溶解させて第１〜第５ＮＭＲ試料溶液を調製する。各ＮＭＲ試料溶液を調製するために用いられる各ピペリン類化合物は、市販の純品であってもよいし、コショウ属植物抽出物から単離精製して得られる精製物であってもよい。
抽出原料であるコショウ科コショウ属に属する植物としては、例えば、ヒハツ（学名：Ｐｉｐｅｒ ｒｅｔｒｏｆｒａｃｔｕｍ又はＰｉｐｅｒ ｌｏｎｇｕｍ）、コショウ（学名：Ｐｉｐｅｒ ｎｉｇｒｕｍ）等が用いられ得る。
ヒハツ（Ｐｉｐｅｒ ｒｅｔｒｏｆｒａｃｔｕｍ又はＰｉｐｅｒ ｌｏｎｇｕｍ）又はコショウ（Ｐｉｐｅｒ ｎｉｇｒｕｍ）は、コショウ科コショウ属の蔓性の常緑木本であり、東南アジアやインド等の地域から容易に入手可能である。ヒハツやコショウの果穂の乾燥物は、香辛料として広く用いられている。
ヒハツ又はコショウの抽出部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、果穂部、葉部、茎部、花部、根部などが挙げられるが、これらの中でも、果穂部が好ましい。
コショウ属植物抽出物は、抽出原料を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより調製され得る。抽出原料の乾燥は、天日で行われてもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行われてもよい。
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用することが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられる。抽出処理においては、これらの抽出溶媒を単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用するのが好ましい。
抽出溶媒として使用され得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、恩泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれ得る。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本実施形態において抽出溶媒として使用され得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
抽出溶媒として使用され得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整され得る。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０容量部を混合するのが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０容量部を混合するのが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して多価アルコール１０〜９０容量部を混合するのが好ましい。
抽出処理は、抽出原料に含まれる第１〜第５ピペリン類化合物を抽出溶媒に溶出させ得る限りにおいて特に制限はなく、常法に従って行われ得る。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬させ、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去することでペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥させることで乾燥物が得られる。
以上のようにして得られる抽出液、当該抽出液の濃縮物又は当該抽出液の乾燥物から第１〜第５ピペリン類化合物を単離・精製する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、抽出物を展開溶媒に溶解し、シリカゲルやアルミナ等の多孔質物質、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体やポリメタクリレート等の多孔性樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付して、第１〜第５ピペリン類化合物のそれぞれを含む画分を回収する方法等が挙げられる。この場合、展開溶媒は使用する固定相に応じて適宜選択すればよいが、例えば、多孔質性合成吸着樹脂であるダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）等の多孔性合成吸着剤を用いたカラムクロマトグラフィーにより抽出物を分離する場合、展開溶媒としては、水、メタノール又はこれらの混合溶媒等が挙げられる。さらに、カラムクロマトグラフィーにより得られる第１〜第５ピペリン類化合物のそれぞれを含む画分を、有機シリカハイブリッド材料（YMC-Actus Triart C18，ＹＭＣ社製）等を充填剤として用いた分取カラムクロマトグラフィー、再結晶、液−液向流抽出等の任意の有機化合物精製手段を用いて精製してもよい。
続いて、第１〜第５ＮＭＲ試料溶液のそれぞれを定量ＮＭＲ処理に付することで第１〜第５ＮＭＲスペクトルを取得し、各ＮＭＲスペクトルから、第１〜第５ピペリン類化合物のそれぞれの純度Ｐ1〜Ｐ5を下記数式（６−１）〜（６−５）により算出する。
上記式（６−１）〜（６−５）において、Ｐ1〜Ｐ5は「各ピペリン類化合物の純度」を表し、ＰISは「内部標準物質（例えばＤＳＳ−ｄ6）の純度」を表し、Ａ1〜Ａ5は「各ＮＭＲスペクトルにおける各ピペリン類化合物のシグナル面積」を表し、ＡISは「各ＮＭＲスペクトルにおける内部標準物質（例えばＤＳＳ−ｄ6）のシグナル面積」を表し、Ｈ1〜Ｈ5は「各ＮＭＲスペクトルにおける各ピペリン類化合物のシグナル面積Ａ1〜Ａ5に由来するプロトン数」を表し、ＨISは「各ＮＭＲスペクトルにおける内部標準物質（例えばＤＳＳ−ｄ6）のシグナル面積ＡDSSに由来するプロトン数」を表し、Ｍ1〜Ｍ5は「第１〜第５ピペリン類化合物のそれぞれの分子量」を表し、ＭISは「内部標準物質（例えばＤＳＳ−ｄ6）の分子量」を表し、Ｗ1〜Ｗ5は「各ＮＭＲ試料溶液の調製時における各ピペリン類化合物の秤量値（ｍｇ）」を表し、ＷISは「各ＮＭＲ試料溶液の調製時における内部標準物質（例えばＤＳＳ−ｄ6）の秤量値（ｍｇ）」を表す。
各ＮＭＲスペクトルにおける各ピペリン類化合物及び内部標準物質（例えばＤＳＳ−ｄ6）のシグナル面積Ａ1〜Ａ5，ＡISと当該シグナル面積Ａ1〜Ａ5，ＡISに由来するプロトン数Ｈ1〜Ｈ5，ＨISとは、例えば、ＮＭＲ解析ソフト（ＶｎｍｒＪ３．２，Ｖａｒｉａｎ社製）等を用いて算出され得る。
［相対モル感度取得工程］
上記のようにして純度を取得した第１〜第５ピペリン類化合物のそれぞれを所定の溶媒（例えば、水とアセトニトリルとの混合溶媒等）に溶解させ、複数種（例えば６種）のモル濃度で各ピペリン類化合物を含む第１〜第５ＬＣ試料溶液を調製する。
上記のようにして純度を取得した第１〜第５ピペリン類化合物のそれぞれを所定の溶媒（例えば、水とアセトニトリルとの混合溶媒等）に溶解させ、複数種（例えば６種）のモル濃度で各ピペリン類化合物を含む第１〜第５ＬＣ試料溶液を調製する。
次に、各種モル濃度の第１〜第５ＬＣ試料溶液のそれぞれを液体クロマトグラフィー処理に付すことでＬＣクロマトグラムを取得し、当該ＬＣクロマトグラムにおける第１〜第５ピペリン類化合物のそれぞれのピーク面積を求める。各ＬＣ試料溶液の液体クロマトグラフィー処理条件（例えば、液体クロマトグラフ装置、固定相、移動相等）は同一である。
そして、第１〜第５ピペリン類化合物のそれぞれのピーク面積を従属変数とし、第１〜第５ＬＣ試料溶液のそれぞれにおける各ピペリン類化合物の上記純度に基づくモル濃度を独立変数とし、定数項を０とした回帰分析を行い、各ピペリン類化合物の回帰直線（第１〜第５検量線）を作成し、各回帰直線（各検量線）の傾きＳ1〜Ｓ5を算出する。第２〜第５ピペリン類化合物のそれぞれの相対モル感度ＲＭＳ2〜ＲＭＳ5は、第１検量線の傾きＳ1に対する第２〜第５検量線の傾きＳ2〜Ｓ5のそれぞれの比として、下記式により算出される。
ＲＭＳ2＝Ｓ2／Ｓ1
ＲＭＳ3＝Ｓ3／Ｓ1
ＲＭＳ4＝Ｓ4／Ｓ1
ＲＭＳ5＝Ｓ5／Ｓ1
ＲＭＳ2＝Ｓ2／Ｓ1
ＲＭＳ3＝Ｓ3／Ｓ1
ＲＭＳ4＝Ｓ4／Ｓ1
ＲＭＳ5＝Ｓ5／Ｓ1
［定量工程］
コショウ属植物抽出物を所定の溶媒（例えば水とアセトニトリルとの混合溶媒等）に溶解させ、定量用試料溶液を調製する。定量用試料溶液の調製に用いられるコショウ属植物抽出物は、上記純度取得工程において用いられ得るコショウ属植物抽出物と同様にして抽出原料から抽出して得られるものであってもよいし、それを従来公知の手法により精製して得られるものであってもよい。また、定量用試料溶液の調製には、コショウ属植物抽出物が配合された飲食品等であってもよい。このような飲食品を用いて定量用試料溶液を調製する場合、例えば、飲食品を上記溶媒（例えば水とアセトニトリルとの混合溶媒等）に溶解又は分散させ、フィルタ等で濾過した濾液を上記定量用試料溶液として調製すればよい。
コショウ属植物抽出物を所定の溶媒（例えば水とアセトニトリルとの混合溶媒等）に溶解させ、定量用試料溶液を調製する。定量用試料溶液の調製に用いられるコショウ属植物抽出物は、上記純度取得工程において用いられ得るコショウ属植物抽出物と同様にして抽出原料から抽出して得られるものであってもよいし、それを従来公知の手法により精製して得られるものであってもよい。また、定量用試料溶液の調製には、コショウ属植物抽出物が配合された飲食品等であってもよい。このような飲食品を用いて定量用試料溶液を調製する場合、例えば、飲食品を上記溶媒（例えば水とアセトニトリルとの混合溶媒等）に溶解又は分散させ、フィルタ等で濾過した濾液を上記定量用試料溶液として調製すればよい。
純度が求められた第１ピペリン類化合物を所定の溶媒（例えば水とアセトニトリルとの混合溶媒等）に溶解させて、複数種（例えば６種）のモル濃度で第１ピペリン類化合物を含む定量用標準溶液を調製する。
定量用試料溶液を液体クロマトグラフィー処理に付すことで定量用クロマトグラムを取得して、当該定量用クロマトグラムにおける第１〜第５ピペリン類化合物のそれぞれのピーク面積ａ1〜ａ5を求める。それとともに、各定量用標準溶液を液体クロマトグラフィー処理に付すことで複数の標準クロマトグラムを取得し、各標準クロマトグラムにおける第１ピペリン類化合物のピーク面積を求める。定量用試料溶液及び定量用標準溶液の液体クロマトグラフィー処理条件（例えば、液体クロマトグラフ装置、固定相、移動相等）は同一とする。
各標準クロマトグラムにおけるピーク面積を従属変数とし、定量用標準溶液における第１ピペリン類化合物の純度に基づくモル濃度を独立変数とし、定数項を０とした回帰分析を行い、第１ピペリン類化合物の回帰直線（定量用検量線）を作成し、当該回帰直線（定量用検量線）の傾きＳ1’を算出する。それとともに、第２〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれについても第１ピペリン類化合物と同様の回帰直線（定量用検量線）を作成したと仮定した場合における当該回帰直線（定量用検量線）の傾きＳ2’〜Ｓ5’を下記式（５−１）〜（５−４）により算出する。
相対モル感度ＲＭＳ2〜ＲＭＳ5を求める際に行われる液体クロマトグラフィー処理の処理条件（例えば、液体クロマトグラフ装置、固定相の種類、移動相の種類等）は、第１〜第５ＬＣ試料溶液のいずれにおいても同一である。第１ピペリン類化合物に関連する第１検量線の傾きＳ1に対する、第２〜第５ピペリン類化合物に関連する第２〜第５検量線の傾きＳ2〜Ｓ5の比で表される相対モル感度ＲＭＳ2〜ＲＭＳ5は、液体クロマトグラフィー処理の処理条件が変化したとしても、一定であると考えられる。そのため、定量用検量線の傾きＳ1’に各相対モル感度ＲＭＳ2〜ＲＭＳ5を乗じることで、第２〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれについても第１ピペリン類化合物と同様の回帰直線（定量用検量線）を作成したと仮定した場合における当該回帰直線（定量用検量線）の傾きＳ2’〜Ｓ5’を高精度に算出することができる。
そして、上記のようにして算出された傾きＳ１’〜Ｓ５’と定量用クロマトグラムにおける第１〜第５ピペリン類化合物のそれぞれのピーク面積ａ1〜ａ5とから、コショウ属植物抽出物中における第１〜第５ピペリン類化合物のそれぞれの含有量Ｃｔ1〜Ｃｔ5を下記式（３−１）〜（３−５）及び式（４−１）〜（４−５）により算出する。
上記式（３−１）〜（３−５）及び式（４−１）〜（４−５）において、Ｃｔ1〜Ｃｔ5は「コショウ属植物抽出物１ｇあたりの第１〜第５ピペリン類化合物のそれぞれの含有量（ｍｇ／ｇ）」を表し、Ｃ1〜Ｃ5は「定量用試料溶液中における第１〜第５ピペリン類化合物のそれぞれのモル濃度（μｍｏｌ／Ｌ）」を表し、Ｍ1〜Ｍ5は「第１〜第５ピペリン類化合物のそれぞれの分子量」を表し、ＣEは「定量用試料溶液中におけるコショウ属植物抽出物の濃度（μｇ／ｍＬ）」を表し、ａ1〜ａ5は「定量用クロマトグラムにおける第１〜第５ピペリン類化合物のそれぞれのピーク面積」を表す。
上記のようにして算出された第１〜第５ピペリン類化合物のそれぞれの含有量の総和を算出する。これにより、コショウ属植物抽出物に含まれるピペリン類化合物を定量することができる。コショウ属植物抽出物に含まれる第１〜第５ピペリン類化合物は、光照射等によって光異性化を生じさせること等があるため、同一ロットのコショウ属植物抽出物を用いたとしても、各ピペリン類化合物の含有量は、定量を行うごとに変動する場合がある。しかしながら、それらの総和はほとんど変動しない。そのため、定量を行ったときの各ピペリン類化合物の含有量の総和を求めることで、コショウ属植物抽出物中のピペリン類化合物を高い精度で定量することができる。
上述したように、本実施形態においては、コショウ属植物抽出物中に含まれるピペリン類化合物のうちの１種（第１ピペリン類化合物）を標準物質として利用し、当該標準物質としての第１ピペリン類化合物を、検量線を用いて定量するとともに、他のピペリン類化合物（第２〜第５ピペリン類化合物）は、標準物質との間の関係性として表される相対モル感度ＲＭＳを用いた算出により定量される。したがって、本実施形態によれば、コショウ属植物抽出物に含まれる複数種類のピペリン類化合物のうちの１種類のピペリン類化合物を定量するだけで、他のピペリン類化合物を含む、コショウ属植物抽出物中のピペリン類化合物の総含有量を簡易に、かつ高精度に求めることができる。
以上説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするために記載されたものであって、本発明を限定するために記載されたものではない。したがって、上記実施形態に開示された各要素は、本発明の技術的範囲に属する全ての設計変更や均等物をも含む趣旨である。
上記実施形態において、第１〜第５ピペリン類化合物が市販の純品であって、それらの純度が既知である場合、各ピペリン類化合物の純度を算出する純度取得工程を行わなくてもよく、相対モル感度を取得すればよい。なお、当該純度が既知の市販の純品を用いて、各ピペリン類化合物の純度を算出してもよいことは言うまでもない。
以下、試験例等を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の試験例等に何ら限定されるものではない。
〔実施例１〕ピペリン類化合物の純度測定
（１）ピペリン類化合物の準備
上記構造式（Ａ）〜（Ｅ）に示す５種のピペリン類化合物（ピペリン（第１ピペリン類化合物，構造式（Ａ），piperine，Ｃ17Ｈ19ＮＯ3，分子量：２８５．３４３）、ピペラニン（第２ピペリン類化合物，構造式（Ｂ），piperanine，Ｃ17Ｈ21ＮＯ3，分子量：２８７．３５９）、イソピペリン（第３ピペリン類化合物，構造式（Ｃ），isopiperine，Ｃ17Ｈ19ＮＯ3，分子量：２８５．３４３）、シャビシン（第４ピペリン類化合物，構造式（Ｄ），chavicine，Ｃ17Ｈ19ＮＯ3，分子量：２８５．３４３）及びイソシャビシン（第５ピペリン類化合物，構造式（Ｅ），isochavicine，Ｃ17Ｈ19ＮＯ3，分子量：２８５．３４３））のそれぞれを準備した。
（１）ピペリン類化合物の準備
上記構造式（Ａ）〜（Ｅ）に示す５種のピペリン類化合物（ピペリン（第１ピペリン類化合物，構造式（Ａ），piperine，Ｃ17Ｈ19ＮＯ3，分子量：２８５．３４３）、ピペラニン（第２ピペリン類化合物，構造式（Ｂ），piperanine，Ｃ17Ｈ21ＮＯ3，分子量：２８７．３５９）、イソピペリン（第３ピペリン類化合物，構造式（Ｃ），isopiperine，Ｃ17Ｈ19ＮＯ3，分子量：２８５．３４３）、シャビシン（第４ピペリン類化合物，構造式（Ｄ），chavicine，Ｃ17Ｈ19ＮＯ3，分子量：２８５．３４３）及びイソシャビシン（第５ピペリン類化合物，構造式（Ｅ），isochavicine，Ｃ17Ｈ19ＮＯ3，分子量：２８５．３４３））のそれぞれを準備した。
第１ピペリン類化合物としてのピペリンは、市販の試薬（富士フイルム和光純薬社製）を準備した。第２ピペリン類化合物としてのピペラニンは、ヒハツ抽出物（製品名：ヒハツエキスパウダーＭＦ，丸善製薬社製）から、以下のようにして単離精製して得た。
上記ヒハツ抽出物をヘキサン及び水で液−液分配し、得られたヘキサン層についてシリカゲル６０（メルク・ミリポア社製）を用い、移動相としてヘキサンと酢酸エチルとの混合溶液（容量比１：１）を用いて分画し、次いで、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８（ＹＭＣ社製）、移動相：アセトニトリルと水との混合溶液（容量比４３：５７））により精製した。
第３〜第５ピペリン類化合物としてのイソピペラニン、シャビシン及びイソシャビシンは、上記ヒハツ抽出物をメタノールに溶解させて調製したピペリン溶液に光源としての日光を照射した後（照射照度：９００００ルクス）、以下のようにして当該ピペリン溶液から単離精製して得た。
光照射したピペリン溶液について、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０，日本分析工業社製，移動相：メタノール）、及び分取ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ Ｔｒｉａｒｔ ＰＦＰ，ＹＭＣ社製，移動相：アセトニトリルと水との混合溶液（容量比４０：６０））により、イソピペリン、シャビシン及びイソシャビシンを精製した。
（２）第１〜第５ＮＭＲ試料溶液の調製
上記のようにして得られたピペリン、ピペラニン、イソピペリン、シャビシン及びイソシャビシンをそれぞれ５ｍｇ、ＤＳＳ−ｄ6（富士フイルム和光純薬社製）２ｍｇを精確に量り取り、ＤＭＳＯ−ｄ6（メルク社製）０．７５ｍＬに溶解させて第１〜第５ＮＭＲ試料溶液を調製した。
上記のようにして得られたピペリン、ピペラニン、イソピペリン、シャビシン及びイソシャビシンをそれぞれ５ｍｇ、ＤＳＳ−ｄ6（富士フイルム和光純薬社製）２ｍｇを精確に量り取り、ＤＭＳＯ−ｄ6（メルク社製）０．７５ｍＬに溶解させて第１〜第５ＮＭＲ試料溶液を調製した。
（３）定量ＮＭＲ測定
上記第１〜第５ＮＭＲ試料溶液を、ＮＭＲ装置（Ｖａｒｉａｎ ＮＭＲ Ｓｙｓｔｅｍ ５００，Ｖａｒｉａｎ社製）を用いて1Ｈ−ｑＮＭＲ測定を行い、ＮＭＲスペクトルを得た（図１（Ａ）〜（Ｅ）参照）。なお、図１（Ａ）はピペリンのＮＭＲスペクトル、図１（Ｂ）はシャビシンのＮＭＲスペクトル、図１（Ｃ）はイソピペリンのＮＭＲスペクトル、図１（Ｄ）はイソシャビシンのＮＭＲスペクトル、図１（Ｅ）はピペラニンのＮＭＲスペクトルである。得られたＮＭＲスペクトルから、ＮＭＲ解析ソフト（ＶｎｍｒＪ３．２，Ｖａｒｉａｎ社製）を用いてピペリン、ピペラニン、イソピペリン、シャビシン及びイソシャビシン、並びにＤＳＳ−ｄ6の各シグナル面積Ａ1〜Ａ5，ＡISと、各シグナル面積Ａ1〜Ａ5，ＡISに由来するプロトン数とＨ1〜Ｈ5，ＨISを求めた。そして、下記式（６−１）〜（６−５）により、ピペリンの純度Ｐ1、ピペラニンの純度Ｐ2、イソピペリンの純度Ｐ3、シャビシンの純度Ｐ4及びイソシャビシンの純度Ｐ5を算出した。結果を表１に示す。
上記第１〜第５ＮＭＲ試料溶液を、ＮＭＲ装置（Ｖａｒｉａｎ ＮＭＲ Ｓｙｓｔｅｍ ５００，Ｖａｒｉａｎ社製）を用いて1Ｈ−ｑＮＭＲ測定を行い、ＮＭＲスペクトルを得た（図１（Ａ）〜（Ｅ）参照）。なお、図１（Ａ）はピペリンのＮＭＲスペクトル、図１（Ｂ）はシャビシンのＮＭＲスペクトル、図１（Ｃ）はイソピペリンのＮＭＲスペクトル、図１（Ｄ）はイソシャビシンのＮＭＲスペクトル、図１（Ｅ）はピペラニンのＮＭＲスペクトルである。得られたＮＭＲスペクトルから、ＮＭＲ解析ソフト（ＶｎｍｒＪ３．２，Ｖａｒｉａｎ社製）を用いてピペリン、ピペラニン、イソピペリン、シャビシン及びイソシャビシン、並びにＤＳＳ−ｄ6の各シグナル面積Ａ1〜Ａ5，ＡISと、各シグナル面積Ａ1〜Ａ5，ＡISに由来するプロトン数とＨ1〜Ｈ5，ＨISを求めた。そして、下記式（６−１）〜（６−５）により、ピペリンの純度Ｐ1、ピペラニンの純度Ｐ2、イソピペリンの純度Ｐ3、シャビシンの純度Ｐ4及びイソシャビシンの純度Ｐ5を算出した。結果を表１に示す。
上記式（６−１）〜（６−５）において、ＰISは「ＤＳＳ−ｄ6の純度」を、Ｈ1は「ＮＭＲスペクトルにおけるピペリンのシグナル面積Ａ1に由来するプロトン数」を、Ｈ2は「ＮＭＲスペクトルにおけるピペリラニンのシグナル面積Ａ2に由来するプロトン数」を、Ｈ3は「ＮＭＲスペクトルにおけるイソピペリンのシグナル面積Ａ3に由来するプロトン数」を、Ｈ4は「ＮＭＲスペクトルにおけるシャビシンのシグナル面積Ａ4に由来するプロトン数」を、Ｈ5は「ＮＭＲスペクトルにおけるイソシャビシンのシグナル面積Ａ5に由来するプロトン数」を、ＨISは「各ＮＭＲスペクトルにおけるＤＳＳ−ｄ6のシグナル面積ＡDSSに由来するプロトン数」を、Ｍ1は「ピペリンの分子量」を、Ｍ2は「ピペラニンの分子量」を、Ｍ3は「イソピペリンの分子量」を、Ｍ4は「シャビシンの分子量」を、Ｍ5は「イソシャビシンの分子量」を、ＭISは「ＤＳＳ−ｄ6の分子量」を、Ｗ1は「ＮＭＲ試料溶液の調製時におけるピペリンの秤量値（ｍｇ）」を、Ｗ2は「ＮＭＲ試料溶液の調製時におけるピペラニンの秤量値（ｍｇ）」を、Ｗ3は「ＮＭＲ試料溶液の調製時におけるイソピペリンの秤量値（ｍｇ）」を、Ｗ4は「ＮＭＲ試料溶液の調製時におけるシャビシンの秤量値（ｍｇ）」を、Ｗ5は「ＮＭＲ試料溶液の調製時におけるイソシャビシンの秤量値（ｍｇ）」を、ＷISは「各ＮＭＲ試料溶液の調製時におけるＤＳＳ−ｄ6の秤量値（ｍｇ）」を表す。
〔実施例２〕相対モル感度の算出
上記のようにして純度を算出したピペリン、ピペラニン、イソピペリン、シャビシン及びイソシャビシンのそれぞれを、水５５容量部及びアセトニトリル４５容量部の混合溶媒に溶解してメンブレンフィルターで濾過し、第１〜第５ＬＣ試料溶液をそれぞれ６種類の濃度（０．１μｇ／ｍＬ，０．２μｇ／ｍＬ，０．４μｇ／ｍＬ，０．８μｇ／ｍＬ，１．６μｇ／ｍＬ，３．２μｇ／ｍＬ）で調製した。
上記のようにして純度を算出したピペリン、ピペラニン、イソピペリン、シャビシン及びイソシャビシンのそれぞれを、水５５容量部及びアセトニトリル４５容量部の混合溶媒に溶解してメンブレンフィルターで濾過し、第１〜第５ＬＣ試料溶液をそれぞれ６種類の濃度（０．１μｇ／ｍＬ，０．２μｇ／ｍＬ，０．４μｇ／ｍＬ，０．８μｇ／ｍＬ，１．６μｇ／ｍＬ，３．２μｇ／ｍＬ）で調製した。
各種濃度の第１〜第５ＬＣ試料溶液を、下記条件の液体クロマトグラフィー処理に付してＬＣクロマトグラムを得た。
＜液体クロマトグラフィー条件＞
液体クロマトグラフ装置：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（製品名，島津製作所社製）
検出器：ＳＰＤ−２０Ａ（ＵＶ，波長２７０ｎｍ，島津製作所社製）
注入量：２０μＬ
カラム：Ｍｅｔｅｏｒｉｃ Ｃｏｒｅ Ｃ１８（１００ｍｍ×４．６ｍｍ，ＹＭＣ社製）
カラム温度：４０℃
移動相：水／アセトニトリル／ギ酸（容量比５５０：４５０：１）
流速：１．４ｍＬ／ｍｉｎ
分析時間（Ｒｕｎ ｔｉｍｅ）：５ｍｉｎ
＜液体クロマトグラフィー条件＞
液体クロマトグラフ装置：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（製品名，島津製作所社製）
検出器：ＳＰＤ−２０Ａ（ＵＶ，波長２７０ｎｍ，島津製作所社製）
注入量：２０μＬ
カラム：Ｍｅｔｅｏｒｉｃ Ｃｏｒｅ Ｃ１８（１００ｍｍ×４．６ｍｍ，ＹＭＣ社製）
カラム温度：４０℃
移動相：水／アセトニトリル／ギ酸（容量比５５０：４５０：１）
流速：１．４ｍＬ／ｍｉｎ
分析時間（Ｒｕｎ ｔｉｍｅ）：５ｍｉｎ
そして、各ＬＣクロマトグラムから算出した各ピペリン類化合物（ピペリン、ピペラニン、イソピペリン、シャビシン及びイソシャビシン）のピーク面積を従属変数とし、第１〜第５ＬＣ試料溶液のそれぞれにおける各ピペリン類化合物の上記純度に基づくモル濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を独立変数とし、定数項を０とした回帰分析を行い、各ピペリン類化合物の回帰直線（第１〜第５検量線）を作成し、各回帰直線（各検量線）の傾きＳ1〜Ｓ5を算出した。続いて、ピペラニン、イソピペリン、シャビシン及びイソシャビシンのそれぞれの相対モル感度ＲＭＳ2〜ＲＭＳ5を、第１検量線の傾きＳ1に対する第２〜第５検量線の傾きＳ2〜Ｓ5のそれぞれの比として、下記式により算出した。結果を表１に示す。
ＲＭＳ2＝Ｓ2／Ｓ1
ＲＭＳ3＝Ｓ3／Ｓ1
ＲＭＳ4＝Ｓ4／Ｓ1
ＲＭＳ5＝Ｓ5／Ｓ1
ＲＭＳ2＝Ｓ2／Ｓ1
ＲＭＳ3＝Ｓ3／Ｓ1
ＲＭＳ4＝Ｓ4／Ｓ1
ＲＭＳ5＝Ｓ5／Ｓ1
〔実施例３〕ヒハツ抽出物の定量
ヒハツ抽出物（製品名：ヒハツエキスパウダーＭＦ，丸善製薬社製）を水５５容量部及びアセトニトリル４５容量部の混合溶媒に溶解してメンブレンフィルターで濾過し、定量用試料溶液をそれぞれ２種類の濃度（２０００μｇ／ｍＬ，２００００μｇ／ｍＬ）で調製した。
ヒハツ抽出物（製品名：ヒハツエキスパウダーＭＦ，丸善製薬社製）を水５５容量部及びアセトニトリル４５容量部の混合溶媒に溶解してメンブレンフィルターで濾過し、定量用試料溶液をそれぞれ２種類の濃度（２０００μｇ／ｍＬ，２００００μｇ／ｍＬ）で調製した。
実施例１にて純度を求めたピペリンを水５５容量部及びアセトニトリル４５容量部の混合溶媒に溶解してメンブレンフィルターで濾過し、定量用標準溶液をそれぞれ６種類の濃度（０．１μｇ／ｍＬ，０．２μｇ／ｍＬ，０．４μｇ／ｍＬ，０．８μｇ／ｍＬ，１．６μｇ／ｍＬ，３．２μｇ／ｍＬ）で調製した。
定量用試料溶液及び定量用標準溶液のそれぞれにつき、上記条件の液体クロマトグラフィー処理に付して定量用クロマトグラム及び標準クロマトグラムを得た。得られた各標準クロマトグラムから得られたピーク面積を従属変数とし、各定量用標準溶液におけるピペリンの上記純度に基づくモル濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を独立変数とし、定数項を０とした回帰分析を行い、ピペリンの回帰直線（定量用検量線）を作成し、各回帰直線（定量用検量線）の傾きＳ1’を算出した。当該傾きＳ1’及び実施例２で算出した相対モル感度ＲＭＳ2〜ＲＭＳ5から、ピペラニン、イソピペリン、シャビシン及びイソシャビシンのそれぞれについてもピペリンと同様の回帰直線（定量用検量線）を作成したと仮定した場合における当該回帰直線（定量用検量線）の傾きＳ2’〜Ｓ5’を下記式（５−１）〜（５−４）により算出した。
上記のようにして得られた定量用クロマトグラムから、ピペリン、ピペラニン、イソピペリン、シャビシン及びイソシャビシンのそれぞれのピーク面積ａ1〜ａ5を求め、傾きＳ1’〜Ｓ5’とピーク面積ａ1〜ａ5とから、ヒハツ抽出物１ｇあたりのピペリン、ピペラニン、イソピペリン、シャビシン及びイソシャビシンのそれぞれの含有量Ｃｔ1〜Ｃｔ5（ｍｇ／ｇ）を下記式（３−１）〜（３−５）及び式（４−１）〜（４−５）により算出し、総含有量（ｍｇ／ｇ）を算出した。結果を表１に示す。なお、ピペリン及びピペラニンの含有量Ｃｔ1，Ｃｔ2は、濃度２０００μｇ／ｍＬの定量用試料溶液について得られた定量用クロマトグラムのピーク面積ａ1，ａ2を用いて算出された値であり、イソピペリン、シャビシン及びイソシャビシンの含有量Ｃｔ3〜Ｃｔ5は、濃度２００００μｇ／ｍＬの定量用試料溶液について得られた定量用クロマトグラムのピーク面積ａ3〜ａ5を用いて算出された値である。
上記式（３−１）〜（３−５）及び式（４−１）〜（４−５）において、Ｃｔ1は「ヒハツ抽出物１ｇあたりのピペリンの含有量（ｍｇ／ｇ）」を、Ｃｔ2は「ヒハツ抽出物１ｇあたりのピペラニンの含有量（ｍｇ／ｇ）」を、Ｃｔ3は「ヒハツ抽出物１ｇあたりのイソピペリンの含有量（ｍｇ／ｇ）」を、Ｃｔ4は「ヒハツ抽出物１ｇあたりのシャビシンの含有量（ｍｇ／ｇ）」を、Ｃｔ5は「ヒハツ抽出物１ｇあたりのイソシャビシンの含有量（ｍｇ／ｇ）」を、Ｃ1は「定量用試料溶液中におけるピペリンのモル濃度（μｍｏｌ／Ｌ）」を、Ｃ2は「定量用試料溶液中におけるピペラニンのモル濃度（μｍｏｌ／Ｌ）」を、Ｃ3は「定量用試料溶液中におけるイソピペリンのモル濃度（μｍｏｌ／Ｌ）」を、Ｃ4は「定量用試料溶液中におけるシャビシンのモル濃度（μｍｏｌ／Ｌ）」を、Ｃ5は「定量用試料溶液中におけるイソシャビシンのモル濃度（μｍｏｌ／Ｌ）」を、Ｍ1は「ピペリンの分子量」を、Ｍ2は「ピペラニンの分子量」を、Ｍ3は「イソピペリンの分子量」を、Ｍ4は「シャビシンの分子量」を、Ｍ5は「イソシャビシンの分子量」を、ＣEは「定量用試料溶液中におけるヒハツ抽出物の濃度（μｇ／ｍＬ）」を、ａ1は「定量用クロマトグラムにおけるピペリンのピーク面積」を、ａ2は「定量用クロマトグラムにおけるピペラニンのピーク面積」を、ａ3は「定量用クロマトグラムにおけるイソピペリンのピーク面積」を、ａ4は「定量用クロマトグラムにおけるシャビシンのピーク面積」を、ａ5は「定量用クロマトグラムにおけるイソシャビシンのピーク面積」を表す。
〔参考例１〕ＮＭＲによるピペリン類化合物の定量
ヒハツ抽出物（製品名：ヒハツエキスパウダーＭＦ，丸善製薬社製）８ｇを２０ｍＬの水に溶解し、固相抽出カートリッジ（ＯＡＳＩＳ ＨＬＢ ６ｃｃ（５００ｍｇ），ウォーターズ社製）に付し、水４０ｍＬ、水／メタノール（容量比１：１）１０ｍＬ、メタノール１０ｍＬの順に通液して、メタノール画分を得た。当該メタノール画分を濃縮乾燥後、ＤＳＳ−ｄ6（富士フイルム和光純薬社製）２ｍｇを精確に量り取って加え、ＤＭＳＯ−ｄ6（メルク社製）０．８０ｍＬに溶解させてＮＭＲ試料溶液を調製した。
ヒハツ抽出物（製品名：ヒハツエキスパウダーＭＦ，丸善製薬社製）８ｇを２０ｍＬの水に溶解し、固相抽出カートリッジ（ＯＡＳＩＳ ＨＬＢ ６ｃｃ（５００ｍｇ），ウォーターズ社製）に付し、水４０ｍＬ、水／メタノール（容量比１：１）１０ｍＬ、メタノール１０ｍＬの順に通液して、メタノール画分を得た。当該メタノール画分を濃縮乾燥後、ＤＳＳ−ｄ6（富士フイルム和光純薬社製）２ｍｇを精確に量り取って加え、ＤＭＳＯ−ｄ6（メルク社製）０．８０ｍＬに溶解させてＮＭＲ試料溶液を調製した。
当該ＮＭＲ試料溶液を、ＮＭＲ装置（Ｖａｒｉａｎ ＮＭＲ Ｓｙｓｔｅｍ ７００，Ｖａｒｉａｎ社製）を用いて1Ｈ−ｑＮＭＲ測定を行い、ＮＭＲスペクトルを得た（図１（Ｆ）参照）。得られたＮＭＲスペクトルから、下記式（７）により、ヒハツ抽出物中の５種のピペリン類化合物（ピペリン、ピペラニン、イソピペリン、シャビシン及びイソシャビシン）の総含有量Ｃｔall（ｍｇ／ｇ）を算出した。結果を表１に示す。
上記式（７）において、ＰISは「ＤＳＳ−ｄ6の純度」を、Ａallは「ＮＭＲスペクトルにおけるピペリン類化合物のシグナル面積」を、ＡISは「ＮＭＲスペクトルにおけるＤＳＳ−ｄ6のシグナル面積」を、Ｈallは「ＮＭＲスペクトルにおけるピペリン類化合物のシグナル面積Ａallに由来するプロトン数」を、ＨISは「ＮＭＲスペクトルにおけるＤＳＳ−ｄ6のシグナル面積ＡISに由来するプロトン数」を、Ｍ1は「ピペリンの分子量」を、ＭISは「ＤＳＳ−ｄ6の分子量」を、Ｗallは「ＮＭＲ試料溶液の調製時におけるヒハツ抽出物の秤量値（ｍｇ）」を、ＷISは「ＮＭＲ試料溶液の調製時におけるＤＳＳ−ｄ6の秤量値（ｍｇ）」を表す。
なお、ピペリン、イソピペリン、シャビシン及びイソシャビシンの分子量（２８５．３４３）と、ピペラニンの分子量（２８７．３５９）との差はわずかであり、ヒハツ抽出物中のピペラニン含有量はピペリンの１／２以下であることから（下記表１参照）、当該分子量の差がピペリン類化合物の総含有量Ｃｔallに与える影響は小さいと考え、上記式（７）においては、ピペリンの分子量Ｍ1を使用した。
表１に示す結果から明確であるが、実施例１〜３のようにして算出された、ヒハツ抽出物に含まれるピペリン類化合物の総含有量は、参考例１にて算出されたピペリン類化合物の総含有量と同等であることが確認された。この結果から、コショウ属植物抽出物に含まれる各ピペリン類化合物の相対モル感度ＲＭＳを予め求めておけば、コショウ属植物抽出物中のピペリンを標準物質として利用した液体クロマトグラフィー処理により、ピペリン類化合物を高精度に定量可能であると理解することができる。
Claims (6)
- コショウ科コショウ属に属する植物からの抽出物に含まれる第１〜第ｎ（ｎは２以上の整数である。）ピペリン類化合物を定量する方法であって、
第１〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれと内部標準物質とを含む第１〜第ｎＮＭＲ試料溶液をＮＭＲで処理することで得られるＮＭＲスペクトルから、前記第１〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの純度を算出する純度算出工程と、
前記純度が算出された第１ピペリン類化合物に対する前記純度が算出された第２〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの相対モル感度を取得する相対モル感度取得工程と、
前記抽出物を含む定量用試料溶液を液体クロマトグラフィーで処理することで得られる定量用クロマトグラム及び前記純度が算出された第１ピペリン類化合物を含む定量用標準溶液のそれぞれを液体クロマトグラフィーで処理することで得られる標準クロマトグラムから、前記抽出物中の前記第１〜第ｎピペリン類化合物の総含有量を算出する定量工程と
を有し、
前記相対モル感度取得工程は、
前記第１〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれを複数種のモル濃度で含むＬＣ試料溶液を液体クロマトグラフィーで処理することでＬＣクロマトグラムを得る工程と、
前記各種ＬＣ試料溶液における前記第１〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの前記純度に基づくモル濃度と、前記ＬＣクロマトグラムにおける前記第１〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれのピーク面積との関係を示す第１〜第ｎ検量線のそれぞれの傾きを算出する工程と、
前記第１検量線の傾きに対する前記第２〜第ｎ検量線のそれぞれの傾きの比を、前記第２〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの前記相対モル感度として算出する工程と
を含み、
前記定量工程は、
前記純度が算出された前記第１ピペリン類化合物を複数種のモル濃度で含む複数の前記定量用標準溶液のそれぞれを前記液体クロマトグラフィーで処理することで得られる複数の前記標準クロマトグラムから、前記純度が算出された第１ピペリン類化合物のピーク面積と前記複数の定量用標準溶液のそれぞれにおける前記第１ピペリン類化合物の前記純度に基づくモル濃度との関係を示す標準検量線を作成する工程と、
前記定量用クロマトグラム及び前記標準検量線に基づいて、前記抽出物中の前記第１ピペリン類化合物の含有量を算出する工程と、
前記標準検量線の傾き及び前記相対モル感度から、前記抽出物中の前記第２〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの含有量を算出する工程と、
前記抽出物中の前記第１〜第ｎピペリン類化合物の総含有量を算出する工程と
を含むことを特徴とするピペリン類化合物の定量方法。 - 前記定量工程において、前記第１ピペリン類化合物の含有量は、下記式（１）及び式（２）に基づいて算出されることを特徴とする請求項１に記載のピペリン類化合物の定量方法。
- 前記定量工程において、前記第２〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの含有量は、下記式（３）〜（５）に基づいて算出されることを特徴とする請求項２に記載のピペリン類化合物の定量方法。
- 前記純度算出工程において、下記式（６）に基づいて前記第１〜第ｎピペリン類化合物のそれぞれの純度を算出することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のピペリン類化合物の定量方法。
- 前記第１ピペリン類化合物が、ピペリンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のピペリン類化合物の定量方法。
- 前記コショウ科コショウ属に属する植物が、ヒハツ又はコショウであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のピペリン類化合物の定量方法。
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