JP2020168027A - 核酸前処理キット、および塩基配列解析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
核酸捕捉粒子は、核酸を選択的に結合可能な粒子である。核酸を選択的に結合可能な粒子としては、シリカ粒子、あるいは表面がシリカコートされた粒子が好ましく用いられる。核酸および夾雑物を含む液体中に、核酸捕捉粒子を存在させると、粒子表面に核酸が選択的に結合する。核酸を結合させた粒子を洗浄液に移動させて表面に付着した夾雑物を除去し、その後に粒子を核酸回収液に移動させることにより、核酸回収液中に核酸を回収できる。
水系液体は、核酸捕捉粒子表面への核酸の固定や、分離等の化学操作の場を提供するものである。粒子操作による生体試料中の核酸の分離精製では、生体試料に含まれる核酸を核酸捕捉粒子に結合させるための核酸捕捉液、および核酸捕捉粒子の表面に結合した核酸を回収するための核酸回収液が用いられる。水系液体として、核酸捕捉液および核酸回収液の他に、洗浄液が用いられることが好ましい。表面に核酸が結合した粒子を洗浄液に曝すことにより、粒子表面に付着した夾雑物等を除去して、核酸の純度を向上できる。
核酸捕捉液は、液中に遊離した核酸を核酸捕捉粒子表面に結合させる場を提供する。核酸捕捉液は、細胞を破壊して液中に核酸を遊離させる作用を兼ね備えるもの、すなわち細胞溶解液であることが好ましい。核酸捕捉液として使用可能な細胞溶解液としては、カオトロピック物質、EDTA等のキレート剤、トリス塩酸等を含有する緩衝液が挙げられる。細胞溶解液には、TritonX−100等の界面活性剤を含めることもできる。カオトロピック物質としては、グアニジン塩酸塩、グアニジンイソチオシアン酸塩、ヨウ化カリウム、尿素等が挙げられる。細胞溶解液は、上記の他に、プロテアーゼK等のタンパク質分解酵素や各種の緩衝剤、塩類、およびその他の各種補助剤、ならびにアルコール等の有機溶剤等を含んでいてもよい。これらの物質の存在下で、核酸は、シリカ粒子等の表面に特異的に結合する。そのため、核酸を含む生体試料と核酸捕捉粒子とを細胞溶解液中に添加すれば、核酸捕捉粒子の表面に核酸が選択的に結合する。
洗浄液は、粒子表面等に付着した夾雑物の除去に用いられる。洗浄液としては、核酸が粒子表面に固定された状態を保持したまま、核酸以外の成分(タンパク質、糖、脂質等)や、細胞の溶解に用いられた試薬等を洗浄液中に遊離させ得るものであればよい。洗浄液としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム等の高塩濃度水溶液、エタノール、イソプロパノール等のアルコール水溶液等が挙げられる。
核酸回収液は、核酸捕捉粒子の表面に結合した核酸を液中に回収するために用いられる。粒子表面に結合した核酸の液中への回収方法としては、核酸が粒子表面に結合したままの状態で粒子を回収する方法、および粒子表面に結合した核酸を液中に溶出させて溶液として回収する方法が挙げられる。核酸が粒子表面に結合したままの状態で回収を行う場合、核酸回収液としては、上記洗浄液と同様の組成を有する水溶液が好ましく用いられる。核酸を液中に溶出させる場合、核酸回収液としては、核酸捕捉粒子の表面に結合した核酸を粒子表面から溶出させるための核酸溶出液が用いられる。
水相分離用媒体は、2以上の水系液体に接するように容器内に配置され、容器内を複数の空間に分離する。分離用媒体により仕切られた空間のそれぞれに、細胞溶解液、洗浄液、核酸回収液等の水系液体が装填される。
粒子操作用容器は、上記の水系液体および水相分離用媒体を収容するものである。粒子操作用容器内での粒子操作により、核酸の分離精製が行われる。粒子操作用容器は、生体試料や核酸捕捉粒子を容器内に装填するための開口を有している。粒子操作用容器の開口は閉鎖可能であってもよい。生体試料および核酸捕捉粒子を容器内に装填後に、開口を閉鎖して容器内を密閉系とすることにより、外部からのコンタミネーションを防止できる。開口の閉鎖は、蓋や栓等の封止部材による封止、開口部分の熱融着等、適宜の方法により行い得る。
本発明のキットには、個体識別用核酸が含まれる。個体識別用核酸は、生体試料に含まれる核酸に対して非相補的な塩基配列からなる識別配列を含んでいる。複数のキットのそれぞれに含まれる個体識別用核酸の識別配列は互いに異なっている。キットを用いて核酸回収液中に回収された核酸は、生体試料由来の核酸と個体識別用核酸とを含んでいる。
<第一形態>
本発明の核酸前処理用キットの第一形態は、キットを構成する水相分離用媒体および水系液体の全てが、粒子操作用容器内に装填されている。このキットを用いた前処理操作では、粒子操作用容器に血液等の生体試料が添加され、粒子操作用容器内で、核酸捕捉粒子に核酸を結合させる。
図2は、第二形態の前処理キットの構成例を示す模式断面図である。第二形態の前処理キットは、粒子操作用容器10に加えて、核酸捕捉操作用容器15を含む。上記第一形態では、核酸捕捉液および核酸回収液を含む全ての水系液体が粒子操作用容器10内に装填されているのに対して、第二形態では、核酸捕捉液35が核酸捕捉操作用容器15に装填されている。すなわち、第二形態の前処理キットは、粒子操作用容器10内に水系液体31,32,38および水相分離用媒体21,22,23が装填された第一キット101と、核酸捕捉操作用容器15内に核酸捕捉液35が装填された第二キット102との組み合わせにより構成される。このキットを用いた前処理操作では、核酸捕捉操作用容器15に血液等の生体試料が添加され、核酸捕捉粒子への核酸の結合が行われる。
本発明の塩基配列解析方法では、上記の前処理キットで回収された核酸の塩基配列の解析が行われる。塩基配列の解析方法は特に限定されない。前処理キットから回収された核酸は、塩基配列解析に供する前に、断片化、ライゲーション、増幅等のさらなる処理が行われてもよい。これらの処理は、塩基配列の解析方法に応じて適宜に行い得る。これらの処理に供するために、キットから回収した核酸が別の容器に移し替えられた場合でも、検体由来の核酸と個体識別用核酸との共存状態が保持される。
15 核酸捕捉操作用容器
21,22,23 水相分離用媒体
31,32 洗浄液
35 核酸捕捉液
38 核酸回収液
14,19 識別情報
70 核酸捕捉粒子
Claims (16)
- 核酸および夾雑物を含む生体試料から核酸を分離するための核酸前処理キットであって、
閉鎖可能であってよい開口を有する粒子操作用容器;核酸と選択的に結合可能な核酸捕捉粒子;水に不溶または難溶である水相分離用媒体;複数種の水系液体;および個体識別用核酸を含み、
前記複数種の水系液体のうちの2種は、前記生体試料に含まれる核酸を前記核酸捕捉粒子に結合させるための核酸捕捉液、および前記核酸捕捉粒子の表面に結合した核酸を回収するための核酸回収液であり、
少なくとも、前記水相分離用媒体、および前記核酸回収液は、前記粒子操作用容器内に装填されており、
前記個体識別用核酸は、前記複数種の水系液体のうちの少なくとも1つに含まれているか、または前記核酸捕捉粒子の表面に結合しており、
前記個体識別用核酸の塩基配列は、前記生体試料に含まれる核酸に対して非相補的な塩基配列からなる識別配列を含む、核酸前処理キット。 - 前記水相分離用媒体、および前記水系液体の全てが、前記粒子操作用容器内に装填されている、請求項1に記載の核酸前処理キット。
- さらに、核酸捕捉操作用容器を含み、
前記核酸捕捉液が、前記核酸捕捉操作用容器に装填されている、請求項1に記載の核酸前処理キット。 - 前記核酸捕捉粒子が、前記核酸捕捉液中に含まれている、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸前処理キット。
- 前記個体識別用核酸が、核酸回収液中に含まれている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸前処理キット。
- 前記粒子操作用容器に、容器外部から認識可能な識別情報が付されており、
前記粒子操作用容器に付された前記識別情報と前記識別配列の塩基配列とが関連付けされている、請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸前処理キット。 - 前記個体識別用核酸が、前記核酸捕捉液に含まれているか、または前記核酸捕捉粒子の表面に結合しており、
前記核酸捕捉操作用容器に、容器外部から認識可能な識別情報が付されており、
前記核酸捕捉操作用容器に付された前記識別情報と前記識別配列の塩基配列とが関連付けされている、請求項4に記載の核酸前処理キット。 - 前記粒子操作用容器に、容器外部から認識可能な識別情報が付されており、
前記核酸捕捉操作用容器に付された前記識別情報と、前記粒子操作用容器に付された前記識別情報とが対応付け可能である、請求項7に記載の核酸前処理キット。 - 前記粒子操作用容器の識別情報が、前記核酸回収液の装填箇所に付されている、請求項6または8に記載の核酸前処理キット。
- 前記識別情報が、光学的手法または電磁気的手法により認識可能な形態で付されている、請求項6〜9のいずれか1項に記載の核酸前処理キット。
- 前記水相分離用媒体がゲルである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸前処理キット。
- 前記核酸捕捉粒子が磁性粒子である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の核酸前処理キット。
- 前記核酸回収液は、前記核酸捕捉粒子の表面に結合した核酸を粒子表面から溶出させるための核酸溶出液である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の核酸前処理キット。
- 前記粒子操作用容器は、前記核酸回収液の装填箇所の近傍で分離可能に構成されている、請求項1〜13のいずれか1項に記載の核酸前処理キット。
- 前記個体識別用核酸は、前記識別配列の3’側および5’側の少なくともいずれか一方に、前記生体試料に含まれる核酸に対して相補的な塩基配列を含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の核酸前処理キット。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載のキットを用いて、前記核酸回収液中に、生体試料中の核酸および前記個体識別用核酸を回収するステップ;および
前記回収した核酸の塩基配列を解析するステップ、を有し
塩基配列の解析において、生体試料中の核酸の塩基配列に加えて、前記個体識別用核酸の識別配列の塩基配列を解析し、
塩基配列解析により得られた識別配列部分の塩基配列が、前記キットに含まれていた個体識別用核酸の識別配列の塩基配列と一致するか否かの照合を行う、塩基配列解析方法。
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