JP2020129976A - AHL lactonase activity measurement method and water treatment method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、Ｎ−アシル化ホモセリンラクトン（Ｎ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトン：ＡＨＬ）ラクトナーゼの活性測定方法と、このＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法を用いた水処理方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring the activity of N-acylated homoserine lactone (N-acyl-L-homoserin lactone: AHL) lactone and a water treatment method using this method for measuring AHL lactase activity.
バイオフィルムは、細菌が物質固相表面に付着及び増殖して、多糖類などの高分子有機物を生産することにより形成される。バイオフィルムは、膜状の構造体であり、生物膜やスライムとも呼ばれる。
バイオフィルムは、冷却水系などの循環水系において、伝熱効率の低下や配管の目詰まりの要因となることが知られている。また、バイオフィルムは、製紙工程において生産性低下や品質の劣化などの障害（スライム障害）の要因となることが知られ、逆浸透膜（ＲＯ膜）を利用した水処理工程においてＲＯ膜のフラックスの低下の要因となることが知られている。
Biofilms are formed by bacteria adhering to and multiplying on the surface of a solid phase substance to produce high molecular weight organic substances such as polysaccharides. A biofilm is a membranous structure, also called a biofilm or slime.
Biofilms are known to cause a decrease in heat transfer efficiency and clogging of pipes in a circulating water system such as a cooling water system. In addition, biofilm is known to cause obstacles (slime obstacles) such as deterioration of productivity and quality in the papermaking process, and flux of RO membranes in water treatment processes using reverse osmosis membranes (RO membranes). It is known to be a factor in the decline of.
上記の循環水系、製紙工程、水処理工程など（以下、まとめて「水処理系」という）においてバイオフィルムに起因する上記の各問題を防止するために、様々な処置方法が考案されている。 Various treatment methods have been devised in order to prevent the above-mentioned problems caused by biofilms in the above-mentioned circulating water system, papermaking process, water treatment process and the like (hereinafter collectively referred to as "water treatment system").
それら様々な処置方法のうち、最も一般的なものは、殺菌剤や増殖抑制剤を用いて細菌の繁殖を防止する方法である。これら殺菌剤や増殖抑制剤を用いる方法では、従来、塩素、臭素ならびにその派生物、Ｃｌ−ＭＩＴ（５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン）やＤＢＮＰＡ（２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミド）といった有機抗菌剤、オゾンや過酸化水素などの酸化性の殺菌剤が利用されている。その他、界面活性剤を利用した分散処理や剥離処理も行われており、これらの方法では、アルキルベンゼンスルホン酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリエチレンイミンなどが利用されている。 Of these various treatment methods, the most common is a method of preventing the growth of bacteria by using a fungicide or a growth inhibitor. Conventional methods using these disinfectants and growth inhibitors include chlorine, bromine and its derivatives, Cl-MIT (5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one) and DBNPA (2,2-dibromo). -3-Nitrilopropionamide) and other organic antibacterial agents and oxidizing bactericides such as ozone and hydrogen peroxide are used. In addition, dispersion treatment and peeling treatment using a surfactant are also performed, and in these methods, alkylbenzene sulfonic acid, polyoxyethylene alkyl ethers, polyethyleneimine and the like are used.
また近年、細胞間情報伝達物質がバイオフィルム形成のシグナルとして重要な役割を担っていることが明らかになり、細胞間情報伝達物質を分解してバイオフィルムの形成を抑制する技術開発も進んでいる。
細胞間情報伝達物質を分解してバイオフィルムの形成を抑制する技術として、グラム陰性細菌の中で幅広く使われている細胞間情報伝達物質であるＮ−アシル化ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）に着目した技術が開示されている。
In recent years, it has become clear that cell-cell communication substances play an important role as a signal for biofilm formation, and technological developments that decompose cell-cell communication substances and suppress biofilm formation are also progressing. ..
A technology focusing on N-acylated homoserine lactone (AHL), which is an intercellular signal transmitter widely used in Gram-negative bacteria, as a technology for decomposing intercellular signal transmitters and suppressing the formation of biofilms. Is disclosed.
具体的には、例えば、水処理プロセスにおいて、磁気微粒子に固定化したＡＨＬ分解酵素を用いてバイオフィルムの形成を抑制する方法（Environmental Science & Technology，43巻、7403-7409頁、2009年）が開示されている。また、系内に導入したＡＨＬ分解菌が産生するＡＨＬ分解酵素によりバイオフィルムの形成を低減する技術はすでに実験室レベルで実証されている（特許第５８５０４４１号公報、Environmental Science & Technology，47巻、836‐842頁、2013年）。 Specifically, for example, in a water treatment process, a method of suppressing the formation of a biofilm by using an AHL degrading enzyme immobilized on magnetic fine particles (Environmental Science & Technology, Vol. 43, pp. 7403-7409, 2009) It is disclosed. In addition, a technique for reducing biofilm formation by the AHL-degrading enzyme produced by the AHL-degrading bacteria introduced into the system has already been demonstrated at the laboratory level (Patent No. 5850441, Environmental Science & Technology, Vol. 47, 836-842, 2013).
ＡＨＬのラクトン環を開裂するＡＨＬラクトナーゼは、ＡＨＬアシラーゼと並ぶ、ＡＨＬ分解酵素のひとつであり、酵素や生産菌の産業利用が期待されている。例えば、本出願人は、先に、ＡＨＬ分解菌を用いた水処理システム（特開２０１８−１４３１０７号公報）や、ＡＨＬラクトナーゼを用いた水処理剤及び水処理方法（特願２０１８−５６７３９）を提案している。 AHL lactonase, which cleaves the lactone ring of AHL, is one of the AHL degrading enzymes along with AHL acylase, and is expected to be used industrially for enzymes and producing bacteria. For example, the applicant has previously provided a water treatment system using AHL-degrading bacteria (Japanese Patent Laid-Open No. 2018-143107), a water treatment agent using AHL lactonase, and a water treatment method (Japanese Patent Application No. 2018-56739). is suggesting.
ＡＨＬラクトナーゼを産業用途で利用する上で、ラクトナーゼの量や濃度を定量する必要がある。特にバイオフィルム抑制剤として利用する場合、適切な添加量を決め、正しく添加するために定量方法は必須である。また系内に添加した薬剤の残留を測定することも、効果確認や管理において重要である。あるいは、酵素製剤や、酵素を産生する微生物製剤を製造・販売する際の品質管理においても、酵素量を測定することは必要である。 In order to use AHL lactonase for industrial purposes, it is necessary to quantify the amount and concentration of lactonase. In particular, when used as a biofilm inhibitor, a quantification method is indispensable in order to determine an appropriate addition amount and add it correctly. It is also important to measure the residue of the drug added in the system in confirming the effect and managing it. Alternatively, it is necessary to measure the amount of enzyme in quality control when manufacturing and selling enzyme preparations and microbial preparations that produce enzymes.
酵素量の測定には、一般的に酵素活性測定が用いられる。こうした方法としては、ＡＨＬそのものを酵素で直接分解し、残存するＡＨＬ量をＨＰＬＣで測定する方法が報告されている（Infect.Immun.,74巻、1673‐1681、2006年）。しかし、この方法は、残存ＡＨＬの抽出操作やＨＰＬＣ分析に多大な時間と手間を要することから一般的ではない。 Enzyme activity measurement is generally used to measure the amount of enzyme. As such a method, a method in which AHL itself is directly decomposed by an enzyme and the remaining amount of AHL is measured by HPLC has been reported (Infect. Immun., Vol. 74, 1673-1681, 2006). However, this method is not common because it takes a lot of time and effort for the extraction operation of residual AHL and the HPLC analysis.
より簡易な測定方法として、ＡＨＬ存在下で色素を産生するChromobacterium violaceum等のレポーター細菌を用いた定量法が報告されている（FEMS Microbiol.Let.,279巻、124‐130頁、2008年）。ＡＨＬラクトナーゼによりＡＨＬが分解されると色素の生産が低下するので、色素濃度の違いから酵素量を推測することができる。しかし、酵素量と色素濃度には正確な比例関係がなく、レポーター細菌の培養状態によっても色素産生量は異なるので、この方法では正しい定量は難しい。 As a simpler measurement method, a quantification method using a reporter bacterium such as Chromobacterium violaceum that produces a pigment in the presence of AHL has been reported (FEMS Microbiol. Let., Vol. 279, pp. 124-130, 2008). When AHL is decomposed by AHL lactase, the production of dye decreases, so the amount of enzyme can be estimated from the difference in dye concentration. However, since there is no exact proportional relationship between the amount of enzyme and the pigment concentration, and the amount of pigment produced differs depending on the culture state of the reporter bacteria, it is difficult to accurately quantify by this method.
こうした問題点をふまえて、ＡＨＬラクトナーゼの加水分解で得られたＮ−ａｃｙｌ−Ｌ−ホモセリンをアミノアシラーゼ反応によりＬ−ホモセリンに変換し、さらに銅−カルセイン複合体との反応により形成されるカルセインの蛍光量を測定する方法が、より簡便な手法として報告されている（Appl．Environ．Microbiol.,82巻、4145‐4154頁、2016年）。しかし、ＡＨＬ試薬や酵素は高価であるばかりでなく、市販のアミノアシラーゼには蛍光に影響を与える夾雑物が含まれており、その除去が必要となるため操作が煩雑であり、一般的ではない。 Based on these problems, N-acyl-L-homoserin obtained by hydrolysis of AHL lactonase is converted to L-homoserin by aminoacylase reaction, and further, calcein formed by reaction with copper-calcane complex. A method for measuring the amount of fluorescence has been reported as a simpler method (Appl. Environment. Microbiol., Vol. 82, pp. 4145-4154, 2016). However, not only are AHL reagents and enzymes expensive, but commercially available aminoacylases contain impurities that affect fluorescence, and the operation is complicated because they need to be removed, which is not common. ..
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、上記した従来技術の問題を解決し、より簡便で定量性に優れたＡＨＬラクトナーゼ活性の測定方法と、この測定結果に基づいて、効率的かつ的確な処理を行う水処理方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of such circumstances, solves the above-mentioned problems of the prior art, is a simpler and more quantitative method for measuring AHL lactonase activity, and is efficient based on the measurement results. It is an object of the present invention to provide a water treatment method for performing accurate and accurate treatment.
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ね、特定のラクトン系化合物を基質として用い、この基質からＡＨＬラクトナーゼ分解によって生成される分解生成物量を吸光度計等で定量することにより、簡便かつ定量的にＡＨＬラクトナーゼ活性を測定することができることを見出した。
本発明はこのような知見に基づいて達成されたものであり、以下を要旨とする。
The present inventor has made extensive studies to solve the above problems, and by using a specific lactone-based compound as a substrate and quantifying the amount of decomposition products produced by decomposition of AHL lactonase from this substrate with an absorptiometer or the like, it is convenient. Moreover, it was found that the AHL lactonase activity can be measured quantitatively.
The present invention has been achieved based on such findings, and the gist thereof is as follows.
［１］ 試料と、下記式（１）で表される化合物とを混合して混合液を得る混合工程と、前記混合液に対して、Ｎ−アシル化ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）ラクトナーゼが触媒する酵素反応を行う反応工程と、前記酵素反応後の前記混合液における、前記式（１）で表される化合物由来の前記酵素反応生成物量の指標となる指標値を計測する計測工程と、を備える、ＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法。 [1] A mixing step of mixing a sample and a compound represented by the following formula (1) to obtain a mixed solution, and an enzyme catalyzed by N-acylated homoserine lactone (AHL) lactase with respect to the mixed solution. It comprises a reaction step of carrying out the reaction and a measurement step of measuring an index value as an index of the amount of the enzyme reaction product derived from the compound represented by the formula (1) in the mixed solution after the enzyme reaction. AHL lactase activity measuring method.
（式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子、水酸基、ハロゲン基又は有機基を表し、ｎは１以上の整数を表す。） (In formula (1), R1 and R2 independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen group or an organic group, and n represents an integer of 1 or more.)
［２］ 前記式（１）で表される化合物が、下記式（１Ａ）又は（１Ｂ）で表される化合物である、［１］に記載のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法。 [2] The method for measuring AHL lactase activity according to [1], wherein the compound represented by the formula (1) is a compound represented by the following formula (1A) or (1B).
（式（１Ａ）中、Ｒ３及びＲ４は、各々独立に、水素原子、水酸基、ハロゲン基又は有機基を表す。） (In formula (1A), R3 and R4 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen group or an organic group.)
（式（１Ｂ）中、Ｒ５及びＲ６は、各々独立に、水素原子、水酸基、ハロゲン基又は有機基を表す。） (In formula (1B), R5 and R6 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen group or an organic group.)
［３］ 前記指標値が、前記酵素反応前後での前記混合液における前記生成物の吸収波長の吸光度の変化量である、［１］又は［２］に記載のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法。 [3] The method for measuring AHL lactonase activity according to [1] or [2], wherein the index value is the amount of change in the absorbance of the absorption wavelength of the product in the mixed solution before and after the enzymatic reaction.
［４］ 前記吸収波長が２６０〜３００ｎｍである、［３］に記載のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法。 [4] The method for measuring AHL lactonase activity according to [3], wherein the absorption wavelength is 260 to 300 nm.
［５］ 前記混合工程において、トリス塩酸緩衝液を更に混合して前記混合液を得る、［１］〜［４］のいずれかに記載のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法。 [5] The method for measuring AHL lactase activity according to any one of [1] to [4], wherein in the mixing step, a Tris-hydrochloric acid buffer solution is further mixed to obtain the mixed solution.
［６］ ［１］〜［５］のいずれかに記載のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法によって、水系のＡＨＬラクトナーゼ活性を測定する活性測定工程と、前記水系に、ＡＨＬラクトナーゼ及びＡＨＬ分解菌からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む水処理剤を添加する添加工程と、を備え、前記添加工程における前記水処理剤の添加量を、前記ＡＨＬラクトナーゼ活性の測定結果に基づいて調整する、水処理方法。 [6] From the activity measuring step of measuring the AHL lactonase activity of an aqueous system by the AHL lactonase activity measuring method according to any one of [1] to [5], and the group consisting of AHL lactonase and AHL degrading bacteria in the aqueous system. A water treatment method comprising an addition step of adding a water treatment agent containing at least one selected, and adjusting the addition amount of the water treatment agent in the addition step based on the measurement result of the AHL lactonase activity.
本発明のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法によれば、ＡＨＬラクトナーゼ活性を、ＡＨＬの代替基質を用いて簡便かつ精度よく定量的に測定することができる。また、ＡＨＬよりも安価な代替基質を用いる場合には、ＡＨＬラクトナーゼ活性をより安価に測定することもできる。
さらに、本発明の水処理方法によれば、この測定結果に基づいて、水系へのＡＨＬラクトナーゼ及び／又はＡＨＬ分解菌よりなる水処理剤の添加量を的確に調整して効率的な水処理を行える。
According to the method for measuring AHL lactonase activity of the present invention, AHL lactonase activity can be quantitatively measured easily and accurately using an alternative substrate for AHL. In addition, when an alternative substrate that is cheaper than AHL is used, AHL lactonase activity can be measured at a lower cost.
Further, according to the water treatment method of the present invention, based on this measurement result, the amount of the water treatment agent consisting of AHL lactonase and / or AHL degrading bacteria added to the water system is accurately adjusted to perform efficient water treatment. You can.
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明する。 Embodiments of the present invention will be described in detail below.
［ＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法］
本発明のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法は、試料と、下記式（１）で表される化合物（以下、「化合物（１）」と称す。）とを混合して混合液を得る混合工程と、前記混合液に対して、Ｎ−アシル化ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）ラクトナーゼが触媒する酵素反応を行う反応工程と、前記酵素反応後の前記混合液における、前記化合物（１）由来の前記酵素反応生成物量の指標となる指標値を計測する計測工程とを備える。
[Method for measuring AHL lactase activity]
The method for measuring AHL lactonase activity of the present invention includes a mixing step of mixing a sample and a compound represented by the following formula (1) (hereinafter referred to as "compound (1)") to obtain a mixed solution, and the above-mentioned method. The reaction step of carrying out an enzymatic reaction catalyzed by N-acylated homoserine lactone (AHL) lactase with the mixed solution, and the amount of the enzymatic reaction product derived from the compound (1) in the mixed solution after the enzymatic reaction. It is provided with a measurement process for measuring an index value as an index.
式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子、水酸基、ハロゲン基又は有機基を表し、ｎは１以上の整数を表す。 In the formula (1), R1 and R2 independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen group or an organic group, and n represents an integer of 1 or more.
ここで、試料とは、ＡＨＬラクトナーゼ活性を測定すべき、酵素液、水処理すべき水系の水、ＡＨＬ分解菌を含有する微生物製剤等である。 Here, the sample is an enzyme solution for which AHL lactonase activity should be measured, aqueous water to be treated with water, a microbial preparation containing AHL-degrading bacteria, and the like.
＜メカニズム＞
本発明において、基質として用いる上記化合物（１）は、ＡＨＬラクトナーゼの触媒作用による加水分解反応でラクトン環が開環し、酵素反応生成物として有機物を生成する。
例えば、３，４−ジヒドロクマリンは、ＡＨＬラクトナーゼの触媒作用による加水分解反応で、下記反応式に示すようにラクトン環が開環し、酵素反応生成物として３−（２−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸を生じる。この酵素分解で生成する有機酸の量から試料のＡＨＬラクトナーゼ活性を求めることができる。
<Mechanism>
In the above compound (1) used as a substrate in the present invention, the lactone ring is opened by the hydrolysis reaction catalyzed by AHL lactonase to produce an organic substance as an enzymatic reaction product.
For example, 3,4-dihydrocoumarin is a hydrolysis reaction catalyzed by AHL lactonase, and the lactone ring is opened as shown in the reaction formula below, and 3- (2-hydroxyphenyl) propionic acid is used as an enzymatic reaction product. Produces. The AHL lactase activity of the sample can be determined from the amount of organic acid produced by this enzymatic decomposition.
本発明における指標値は、酵素反応生成物の生成量に基づく指標であってもよく、基質の減少量に基づく指標であってもよい。 The index value in the present invention may be an index based on the amount of enzyme reaction product produced, or may be an index based on the amount of substrate decrease.
＜基質＞
本発明において、基質として用いる化合物（１）は、前記式（１）で表されるラクトン系化合物である。
式（１）において、Ｒ１，Ｒ２は、各々独立に、水素原子、水酸基、ハロゲン基又は有機基を表す。本発明で言う有機基とは炭酸原子を含む基を言い、具体的には、置換基を有していてもよいアルキル基、カルボキシ基、置換基を有していてもよいアルコキシカルボニル基等が挙げられる。
<Substrate>
In the present invention, the compound (1) used as a substrate is a lactone-based compound represented by the above formula (1).
In the formula (1), R1 and R2 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen group or an organic group. The organic group referred to in the present invention means a group containing a carbonic acid atom, and specifically, an alkyl group which may have a substituent, a carboxy group, an alkoxycarbonyl group which may have a substituent and the like may be used. Can be mentioned.
入手の容易性の観点からＲ１，Ｒ２は各々独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましい。 From the viewpoint of easy availability, it is preferable that R1 and R2 are independently hydrogen atoms, hydroxyl groups, and alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms.
また、式（１）において、ｎは１以上の整数であるが、入手の容易性の観点から、１又は２であることが好ましい。 Further, in the formula (1), n is an integer of 1 or more, but it is preferably 1 or 2 from the viewpoint of easy availability.
本発明において、基質として用いる化合物（１）としては、特に、下記式（１Ａ）で表されるジヒドロクマリン系化合物又は（１Ｂ）で表されるクマラノン系化合物が好ましい。 In the present invention, as the compound (1) used as a substrate, a dihydrocoumarin-based compound represented by the following formula (1A) or a coumarinon-based compound represented by (1B) is particularly preferable.
式（１Ａ）中、Ｒ３及びＲ４は、各々独立に、水素原子、水酸基、ハロゲン基又は有機基を表す。
ここで、有機基は、例えば、置換基を有していてもよいアルキル基、カルボキシ基、置換基を有していてもよいアルコキシカルボニル基等であってよい。
入手の容易性の観点からＲ３，Ｒ４は各々独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましい。
In formula (1A), R3 and R4 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen group or an organic group.
Here, the organic group may be, for example, an alkyl group which may have a substituent, a carboxy group, an alkoxycarbonyl group which may have a substituent, or the like.
From the viewpoint of easy availability, it is preferable that R3 and R4 are independently hydrogen atoms, hydroxyl groups, and alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms.
式（１Ｂ）中、Ｒ５及びＲ６は、各々独立に、水素原子、水酸基、ハロゲン基又は有機基を表す。
ここで、有機基は、例えば、置換基を有していてもよいアルキル基、カルボキシ基、置換基を有していてもよいアルコキシカルボニル基等であってよい。
入手の容易性の観点からＲ５，Ｒ６は各々独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましい。
In formula (1B), R5 and R6 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen group or an organic group.
Here, the organic group may be, for example, an alkyl group which may have a substituent, a carboxy group, an alkoxycarbonyl group which may have a substituent, or the like.
From the viewpoint of availability, it is preferable that R5 and R6 are independently hydrogen atoms, hydroxyl groups, and alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms.
これらの化合物のうち、特に３，４−ジヒドロクマリン、２−クマラノン、５−ヒドロキシ−２−クマラノン等は市販品を用いることができる。 Among these compounds, commercially available products such as 3,4-dihydrocoumarin, 2-cumalanone, and 5-hydroxy-2-cumalanone can be used.
酵素反応時の基質濃度は特に制限されるものではないが、０．５ｍＭ〜５ｍＭの終濃度で行うことが望ましい。 The substrate concentration during the enzymatic reaction is not particularly limited, but it is desirable to carry out the final concentration of 0.5 mM to 5 mM.
＜反応ｐＨ＞
本発明における反応ｐＨ（酵素反応を行う混合液のｐＨ）は、ＡＨＬラクトナーゼの作用最適ｐＨで試験することが望ましく、一概には限定されないが、アルカリ域のｐＨでは、基質である化合物（１）の自己分解が進むため、反応ｐＨはおおむね４〜８、特に６〜７．５の範囲とすることが好ましい。
<Reaction pH>
The reaction pH (pH of the mixed solution for performing the enzymatic reaction) in the present invention is preferably tested at the optimum pH for the action of AHL lactonase, and is not unconditionally limited, but is a substrate compound (1) at an alkaline pH. The reaction pH is preferably in the range of about 4 to 8, particularly 6 to 7.5, because the self-decomposition of the compound proceeds.
また、上記の反応ｐＨを一定とするために緩衝液を添加することが好ましい。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ピペス緩衝液などを利用することができるが、トリス緩衝液（具体的にはトリス塩酸緩衝液）を用いると感度を高め、微量のＡＨＬ分解活性を評価することができることから、好ましい。 Further, it is preferable to add a buffer solution in order to keep the above reaction pH constant. As the buffer solution, phosphate buffer solution, Tris buffer solution, Pipes buffer solution, etc. can be used, but when Tris buffer solution (specifically, Tris hydrochloric acid buffer solution) is used, the sensitivity is increased and a small amount of AHL decomposition is performed. It is preferable because the activity can be evaluated.
＜酵素反応条件＞
本発明における酵素反応温度は、ＡＨＬラクトナーゼの作用最適温度付近で試験することが望ましく、一概には限定されないが、一般には３０℃〜４０℃の範囲で実施する。
反応時間も特に制限されるものではないが、通常５分〜３０分程度が適切である。
<Enzyme reaction conditions>
The enzyme reaction temperature in the present invention is preferably tested in the vicinity of the optimum temperature at which AHL lactonase acts, and is not generally limited, but is generally carried out in the range of 30 ° C to 40 ° C.
The reaction time is not particularly limited, but usually about 5 to 30 minutes is appropriate.
＜ＡＨＬラクトナーゼ活性の指標値＞
本発明において、ＡＨＬラクトナーゼ活性は、基質として用いる化合物（１）由来のＡＨＬラクトナーゼに触媒された酵素反応の生成物の量を定量することで求められる。
ここで、酵素反応生成物は、前述の通り、化合物（１）の加水分解で生成する有機酸であり、この有機酸の生成量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等による分析、或いは、酸生成によるｐＨの低下を指標として定量することも可能であるが、ベンゼン環構造を有する有機酸の吸収極大波長（最大吸収波長）である波長２６０〜３００ｎｍ、特に２７０〜３００ｎｍの吸光度を測定することがより簡便かつ的確であり、好ましい。
<Index value of AHL lactonase activity>
In the present invention, AHL lactonase activity is determined by quantifying the amount of product of an enzymatic reaction catalyzed by AHL lactonase derived from compound (1) used as a substrate.
Here, the enzyme reaction product is an organic acid produced by hydrolysis of compound (1) as described above, and the amount of this organic acid produced is analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) or the like, or an acid. Although it is possible to quantify by using the decrease in pH due to formation as an index, the absorbance at a wavelength of 260 to 300 nm, which is the maximum absorption wavelength (maximum absorption wavelength) of an organic acid having a benzene ring structure, particularly 270 to 300 nm, should be measured. Is more convenient and accurate, and is preferable.
即ち、酵素反応前後での上記好適波長における吸光度の変化量（吸光度差）から、酵素反応生成物の生成量を求めることができる。この場合、酵素反応前の吸光度は、酵素反応を行う反応液と同様にして調製した未反応の反応液（混合工程の混合液）を用意して、この未反応の反応液について測定することにより、酵素反応前の吸光度とすることができる。また、酵素反応前の吸光度は、ＡＨＬラクトナーゼを添加して反応液を調製する場合は、ＡＨＬラクトナーゼを添加していないこと以外は同様にして調製した反応液（混合工程の混合液）について測定することにより、酵素反応前の吸光度としてもよい。 That is, the amount of the enzyme reaction product produced can be obtained from the amount of change in absorbance (absorbance difference) at the above-mentioned suitable wavelength before and after the enzyme reaction. In this case, the absorbance before the enzymatic reaction is measured by preparing an unreacted reaction solution (mixed solution in the mixing step) prepared in the same manner as the reaction solution for performing the enzymatic reaction and measuring the unreacted reaction solution. , The absorbance before the enzymatic reaction can be used. In addition, the absorbance before the enzymatic reaction is measured for the reaction solution (mixed solution in the mixing step) prepared in the same manner except that AHL lactonase is not added when the reaction solution is prepared by adding AHL lactonase. Therefore, the absorbance before the enzymatic reaction may be used.
ＡＨＬラクトナーゼ活性は、予め作成した検量線に、測定、算出された吸光度差を当てはめて求めることができる。また、吸光度差から、ＡＨＬラクトナーゼ活性の程度を評価することもできる。 The AHL lactonase activity can be obtained by applying the measured and calculated absorbance difference to the calibration curve prepared in advance. It is also possible to evaluate the degree of AHL lactonase activity from the difference in absorbance.
なお、前述の通り、本発明における指標値は、酵素反応生成物の生成量に基づく指標であってもよく、基質の減少量に基づく指標であってもよい。
また、上記の吸光度等の測定に当たり、酵素活性阻害剤等を含む反応停止剤を添加して酵素の活性を止めたのちに、上記の測定を行うこともできる。この場合、反応停止剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、塩酸グアニジン、エチルアルコール等を用いることができる。
As described above, the index value in the present invention may be an index based on the amount of enzyme reaction product produced, or may be an index based on the amount of substrate decrease.
In addition, in measuring the above-mentioned absorbance and the like, the above-mentioned measurement can be performed after adding a reaction terminator containing an enzyme activity inhibitor or the like to stop the activity of the enzyme. In this case, as the reaction terminator, sodium dodecyl sulfate (SDS), guanidine hydrochloride, ethyl alcohol and the like can be used.
［水処理方法］
本発明の水処理方法は、上記の本発明のＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法により、水系のＡＨＬラクトナーゼ活性を測定する活性測定工程と、ＡＨＬラクトナーゼ活性を測定した水系に、ＡＨＬラクトナーゼ及びＡＨＬ分解菌からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む水処理剤を添加する添加工程とを備え、この添加工程における水処理剤の添加量を、ＡＨＬラクトナーゼ活性の測定結果に基づいて調整することを特徴とするものであり、ＡＨＬラクトナーゼ活性の測定結果に基づいて水処理剤の添加量を制御することにより、水処理剤の過不足を防止して効率的かつ的確な水処理を行える。
[Water treatment method]
The water treatment method of the present invention comprises an activity measuring step for measuring the AHL lactonase activity of an aqueous system by the above-mentioned method for measuring the AHL lactonase activity of the present invention, and an aqueous system for measuring the AHL lactonase activity, which comprises AHL lactonase and AHL degrading bacteria. It includes an addition step of adding a water treatment agent containing at least one selected from the group, and is characterized in that the amount of the water treatment agent added in this addition step is adjusted based on the measurement result of AHL lactonase activity. By controlling the amount of the water treatment agent added based on the measurement result of the AHL lactonase activity, it is possible to prevent excess or deficiency of the water treatment agent and perform efficient and accurate water treatment.
ここで、ＡＨＬラクトナーゼ及び／又はＡＨＬ分解菌を含む水処理剤としては特に制限はないが、前述の特開２０１８−１４３１０７号公報や特願２０１８−５６７３９で提案されているものを用いることができる。 Here, the water treatment agent containing AHL lactonase and / or AHL degrading bacteria is not particularly limited, but those proposed in JP-A-2018-143107 and Japanese Patent Application No. 2018-56739 can be used. ..
本発明の水処理方法は、例えば、冷却水系などの循環水系、或いは製紙工程、或いは逆浸透膜（ＲＯ膜）を利用した水処理水系等、各種の水系におけるバイオフィルムの形成を抑制する水処理方法として好適に用いられる。 The water treatment method of the present invention is a water treatment that suppresses the formation of a biofilm in various water systems such as a circulating water system such as a cooling water system, a paper making process, or a water treatment water system using a reverse osmosis membrane (RO membrane). It is preferably used as a method.
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples as long as the gist of the present invention is not exceeded.
［基質］
以下の実施例及び比較例で基質として用いた化合物の構造式を以下に示す。
[Substrate]
The structural formulas of the compounds used as substrates in the following examples and comparative examples are shown below.
［ＡＨＬ分解酵素の調製］
以下の実施例及び比較例で用いたＡＨＬラクトナーゼは、公知の方法（J Biosci Bioeng．2018 Oct31．pii：S1389-1723(18)30610-8．doi：10．1016/j．jbiosc．2018．10．005.）に従い、Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ ｓｐ．ＥＧ６株由来のＡＨＬラクトナーゼ遺伝子を保持する、大腸菌ＤＨ５α（ｐＱＳＤ−ＥＧ６Ｈ）株のライセートより、ＨｉｓＴＲａｐアフィニティクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア社）を用いて精製することで調製した。
[Preparation of AHL degrading enzyme]
The AHL lactonase used in the following examples and comparative examples is a known method (J Biosci Bioeng. 2018 Oct31. Pii: S1389-1723 (18) 30610-8. Doi: 10.1016 / j. Jbiosc. 2018.10 .005.), Sphingopyxis sp. It was prepared by purification from lysate of Escherichia coli DH5α (pQSD-EG6H) strain carrying the AHL lactonase gene derived from EG6 strain using HisTrap affinity chromatography (GE Healthcare).
［実施例１］
ＡＨＬラクトナーゼは、２０ｎｇ−protein／ｍｌ〜１０μｇ−protein／ｍｌとなるように純水に溶解したのち適宜希釈した。尚、蛋白質の濃度はＴａＫａＲａ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて測定し、牛血清アルブミン換算で表した。
予め３０℃に保温しておいた１００ｍｌの５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）に、１ｍｌの１００ｍＭ ３，４−ジヒドロクマリン／メタノール溶液を加え良く混合したのち（基質濃度１ｍＭ）、その１ｍｌを試験管に分注した。３０℃のウォーターバスで試験管を１分間保温したのち、表１のＡＨＬラクトナーゼ濃度となるように、０．０５ｍｌのＡＨＬラクトナーゼ水溶液を添加し１０分間反応させた。ここへ、１ｍｌの５％ＳＤＳ水溶液を添加して酵素反応を停止したのち、吸光度計で波長２７０ｎｍの吸光度を測定した。
ブランク試験として、ＡＨＬラクトナーゼ水溶液の代わりに水を用いたこと以外は上記と同様に行ったときの波長２７０ｎｍの吸光度も測定し、その差（Δ２７０ｎｍ）を求めた。
表１及び図１にＡＨＬラクトナーゼ濃度とΔ２７０ｎｍの値を示す。
表１及び図１よりＡＨＬラクトナーゼ濃度の増大とともにΔ２７０ｎｍの上昇が観察され、その値も安定しており、ＡＨＬラクトナーゼ活性の定量が可能であることがわかる。
[Example 1]
AHL lactonase was dissolved in pure water to a concentration of 20 ng-protein / ml to 10 μg-protein / ml, and then diluted appropriately. The protein concentration was measured using TaKaRa BCA Protein Assay Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) and expressed in terms of bovine serum albumin.
Add 1 ml of 100 mM 3,4-dihydrocoumarin / methanol solution to 100 ml of 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.2) that has been kept warm at 30 ° C in advance, mix well (substrate concentration 1 mM), and then add 1 ml of the solution. It was dispensed into a test tube. After keeping the test tube warm for 1 minute in a water bath at 30 ° C., 0.05 ml of an AHL lactonase aqueous solution was added and reacted for 10 minutes so as to have the AHL lactonase concentration shown in Table 1. After stopping the enzymatic reaction by adding 1 ml of a 5% SDS aqueous solution, the absorbance at a wavelength of 270 nm was measured with an absorptiometer.
As a blank test, the absorbance at a wavelength of 270 nm was also measured in the same manner as above except that water was used instead of the AHL lactonase aqueous solution, and the difference (Δ270 nm) was determined.
Table 1 and FIG. 1 show the AHL lactonase concentration and the value at Δ270 nm.
From Table 1 and FIG. 1, an increase of Δ270 nm was observed with increasing AHL lactonase concentration, and the value was stable, indicating that the AHL lactonase activity could be quantified.
［実施例２］
実施例１において、ＡＨＬラクトナーゼの濃度を表２の通り変えると共に、緩衝液として５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）又は５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて同様に試験を行った。
その結果、表２及び図２に示す通り、リン酸ナトリウム緩衝液を用いた場合はΔ２７０ｎｍの値は、トリス塩酸緩衝液を用いた時と比較して１／１０以下であった。
この結果から、緩衝液としては、リン酸ナトリウム緩衝液よりもトリス緩衝液を用いた方が酵素反応を鋭敏に検知することが可能であることが分かる。
[Example 2]
In Example 1, the concentration of AHL lactonase was changed as shown in Table 2, and the same test was carried out using 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.2) or 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.2) as a buffer. It was.
As a result, as shown in Table 2 and FIG. 2, the value of Δ270 nm when the sodium phosphate buffer solution was used was 1/10 or less as compared with the case where the Tris hydrochloric acid buffer solution was used.
From this result, it can be seen that the enzyme reaction can be detected more sensitively by using the Tris buffer solution as the buffer solution than by using the sodium phosphate buffer solution.
［実施例３，４、比較例１，２］
実施例１において３，４−ジヒドロクマリン（実施例１）の代わりに、２−クマラノン（実施例３）、５−ヒドロキシ−２−クマラノン（実施例４）、１−イソクロマノン（比較例１）又は３−イソクロマノン（比較例２）を用いて同様にＡＨＬラクトナーゼ活性を測定した。ＡＨＬラクトナーゼ濃度を１００ｎｇ／ｍｌとした場合のそれぞれのΔ２７０ｎｍを測定した。
実施例４では、Δ２７０ｎｍと同様にして波長２９０ｎｍにおける吸光度差（Δ２９０ｎｍ）も測定した。
これらの結果を表３に示す。なお、表３において、「｜Δ２７０ｎｍ｜＜０．０１」は、Δ２７０ｎｍの絶対値が０．０１よりも小さいことを表す。
[Examples 3 and 4, Comparative Examples 1 and 2]
In Example 1, instead of 3,4-dihydrocoumarin (Example 1), 2-cumalanone (Example 3), 5-hydroxy-2-cumalanone (Example 4), 1-isochromanone (Comparative Example 1) or AHL lactonase activity was measured in the same manner using 3-isochromanone (Comparative Example 2). When the AHL lactonase concentration was 100 ng / ml, each Δ270 nm was measured.
In Example 4, the absorbance difference (Δ290 nm) at a wavelength of 290 nm was also measured in the same manner as for Δ270 nm.
These results are shown in Table 3. In Table 3, "| Δ270 nm | <0.01" indicates that the absolute value of Δ270 nm is smaller than 0.01.
表３より、５−ヒドロキシ−２−クマラノン以外の化合物（１）である基質を用いた場合、波長２７０ｎｍにおける吸光度の増大が観察され、ＡＨＬラクトナーゼ活性の測定用基質として利用できることがわかった。
５−ヒドロキシ−２−クマラノン（ホモゲンチジン酸ラクトン）については、波長２７０ｎｍにおける吸光度は減少したが、波長２９０ｎｍにおける吸光度の増大が観察された。ホモゲンチジン酸の吸収極大は２９０ｎｍであり、基質の分解によって２７０ｎｍの吸光度が低下し、２９０ｎｍの吸光度が増大したと考えられる。
これに対して、化合物（１）ではない１−イソクロマノン又は３−イソクロマノンを用いた場合は、吸光度の変化は小さく、ＡＨＬラクトナーゼ活性を求めることはできない。これらのイソクロマノンは、ＡＨＬラクトナーゼが触媒する酵素反応で分解され難く、基質として適していないと考えられる。
From Table 3, when a substrate which is a compound (1) other than 5-hydroxy-2-cumalanone was used, an increase in absorbance at a wavelength of 270 nm was observed, and it was found that it can be used as a substrate for measuring AHL lactonase activity.
For 5-hydroxy-2-cumalanone (homogentisic acid lactone), the absorbance at a wavelength of 270 nm decreased, but an increase in absorbance at a wavelength of 290 nm was observed. The absorption maximum of homogentisic acid was 290 nm, and it is considered that the absorbance at 270 nm decreased and the absorbance at 290 nm increased due to the decomposition of the substrate.
On the other hand, when 1-isochromanone or 3-isochromanone other than compound (1) is used, the change in absorbance is small and the AHL lactonase activity cannot be determined. These isochromanones are not easily decomposed by an enzymatic reaction catalyzed by AHL lactonase and are considered to be unsuitable as a substrate.
Claims (6)
前記混合液に対して、Ｎ−アシル化ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）ラクトナーゼが触媒する酵素反応を行う反応工程と、
前記酵素反応後の前記混合液における、前記式（１）で表される化合物由来の前記酵素反応生成物量の指標となる指標値を計測する計測工程と、
を備える、ＡＨＬラクトナーゼ活性測定方法。
A reaction step of carrying out an enzymatic reaction catalyzed by N-acylated homoserine lactone (AHL) lactase with the mixed solution, and
A measurement step of measuring an index value as an index of the amount of the enzyme reaction product derived from the compound represented by the formula (1) in the mixed solution after the enzyme reaction.
A method for measuring AHL lactonase activity.
前記水系に、ＡＨＬラクトナーゼ及びＡＨＬ分解菌からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む水処理剤を添加する添加工程と、
を備え、
前記添加工程における前記水処理剤の添加量を、前記ＡＨＬラクトナーゼ活性の測定結果に基づいて調整する、水処理方法。 An activity measuring step of measuring the AHL lactonase activity of an aqueous system by the AHL lactonase activity measuring method according to any one of claims 1 to 5.
An addition step of adding a water treatment agent containing at least one selected from the group consisting of AHL lactonase and AHL degrading bacteria to the water system, and
With
A water treatment method in which the amount of the water treatment agent added in the addition step is adjusted based on the measurement result of the AHL lactonase activity.
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