JP2020097601A - タンパク質抽出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年9月24日に出願されたオーストラリア特許出願第2013903669「タンパク質の抽出」の優先権を主張するものである。先の出願の全内容は参照により本明細書の一部をなす。
本開示は微生物からタンパク質を抽出する方法に関するものである。
概要
本明細書の全体を通して、特に他に記載または文脈上他に要求されない限り、一つの工程、組成物、工程群、組成物群への言及は、一つまたは複数の(すなわち、一つ以上の)工程、組成物、工程群、組成物群を包含すると見なされるものとする。
「抽出」という用語は可溶性タンパク質を発現した微生物から取り出すことを意味する。いくつかの例では、可溶性タンパク質の抽出は、例えば微生物において、少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%または約70%の抽出以前に存在した他の物質または組成物から抽出する。
本明細書で考察されている通り、本開示は細胞から可溶性タンパク質を抽出する際にカルボン酸の利用を図るものである。
一例として、カルボン酸は約1:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))から約20:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))の溶解率で添加する。例えば、カルボン酸は約2:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))から約15:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))の溶解率で添加する。例えば、カルボン酸は約3:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))から約10:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))の溶解率で添加する。カルボン酸は約5:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))から約10:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))の溶解率で添加する。例えば、カルボン酸は約5:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))または約6:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))または約7:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))または約8:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))または約9:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))の溶解率で添加する。
本開示に従って抽出する可溶性タンパク質の発現に適した微生物は、当業者には明らかであろう。例えば、微生物は酵母、真菌または細菌である。
一例として、可溶性タンパク質は組換えで、すなわち、組換え工程/手段を用いて発現する。例えば、可溶性タンパク質をコードする核酸は発現構築物においてプロモーターと作動可能に連結される。発現構築物は微生物に導入でき、微生物のゲノムまたはプラスミドに組み込まれる、またはエピソームとして存在する。別の例では、発現構築物が発現ベクターである。
本開示は、微生物中で可溶性が維持される、例えばバクテリア内で封入体を形成しないタンパク質の抽出を包含する。
本開示に記載の方法によって抽出または回収したタンパク質は修飾、例えば別の化合物と結合させることで、修飾可能である。
いくつかの例として、本開示に記載の方法はさらに、タンパク質を精製する方法を含む。様々なタンパク質の精製方法が当業界で知られている。
本明細書に記載の方法で抽出および/または精製したタンパク質は組成物の配合に使用できる。例えば、組成物は非経口投与、局所的投与(topical administration)、経口投与、筋肉内投与、眼内投与、皮下投与、局所投与(local administration)、エアゾールとしての投与、皮内投与、または経皮投与に、予防的処置または治療的処置または美容的処置のために使用できる。
本開示はまた、本明細書に記載の方法の説明書が同封されたカルボン酸を含むキットを提供するものである。
カルボン酸、n-プロパノール、または尿素を用いるプロトコールにて、等電点約7.5、分子量72kDaの組換えタンパク質を微生物細胞から抽出する能力を試験した。
1. 100mM(0.57%(v/v)酢酸(室温)
2. 100mM(0.57%(v/v)酢酸(4oC)
3. 2.2M(10%(v/v))ギ酸(4oC)
4. 60% n-プロパノール
5. 15mM 水酸化ナトリウム
6. 尿素抽出溶液
実施例1に記載の通り、ギ酸は大腸菌(E.coli)からの組換えタンパク質の抽出に使用可能である。酢酸は、比較的弱酸のカルボン酸という限りにおいては、ギ酸に似ている。酢酸はまた安価で安全に保管、取り扱いおよび廃棄できる。したがって、酢酸を、実施例1に記載の組換えタンパク質を大腸菌(E.coli)から抽出する試験に用いた。
2%酢酸:1.12g(湿重量)細胞ペースト+5mL 2%(v/v)酢酸
5%酢酸: 1.01g(湿重量)細胞ペースト+5mL 5%(v/v)酢酸
10%酢酸: 1g(湿重量)細胞ペースト+5mL 10%(v/v)酢酸
尿素: 1.08g(湿重量)細胞ペースト+5mL 尿素バッファー
酢酸濃度、培養時間、溶解率(カルボン酸(ml):細胞の湿重量(g))の効果を測定するために、ボックス−ベッケン計画を展開した。考慮した因子は、以下の通りである。
酢酸(v/v%):最小=10%、最大=25%
培養時間(h):最小=1、最大=5
溶解率(カルボン酸(ml)/細胞の湿重量(g)):最小=1、最大=9
試験した変数は表4に提示の通りである。
様々な酢酸濃度および抽出時間が、大腸菌(E.coli)細胞から抽出した組換えタンパク質の量およびタンパク質の純度に与える影響を測定するために、評価を行った。実施例1と同様のタンパク質を発現する細胞を評価した。
3つのペプチドのコピーを持ち、且つ約4.6の等電点を示す融合タンパク質を発現する微生物細胞を増殖、回収および凍結した。その後細胞を溶解、または、25%(v/v)酢酸溶液と1時間接触させることにより融合タンパク質を抽出し、遠心分離して上清を回収した。得られた組成物のSDS-PAGE解析の結果を図9に表している。本データは酢酸抽出が宿主細胞のタンパク質による夾雑物を実質的に減らしたことを示している。本データはまた、本明細書に記載の抽出方法が融合タンパク質および/または酸性の等電点を示すタンパク質にも適用可能であることを示している。
3つのペプチドのコピーを持ち、且つ約4.6の等電点を示す融合タンパク質を発現する微生物細胞を増殖、回収および凍結した。その後細胞を溶解、または、25%(v/v)酢酸溶液と1時間接触させることにより融合タンパク質を抽出し、遠心分離して上清を回収した。得られた組成物のSDS-PAGE解析の結果を図9に表している。本データは酢酸抽出が宿主細胞のタンパク質による夾雑物を実質的に減らしたことを示している。本データはまた、本明細書に記載の抽出方法が融合タンパク質および/または酸性の等電点を示すタンパク質にも適用可能であることを示している。
さらに本願発明は次の態様を含む。
項1. 微生物集団から可溶性タンパク質を抽出する方法であって、可溶性タンパク質を発現する微生物集団と、微生物集団から可溶性タンパク質を抽出するのに有効な量の、約1%(v/v)以上50%(v/v)未満のカルボン酸を含む溶液とを接触させることを含む方法。
項2. 溶液が約1%(v/v)〜約40%(v/v)のカルボン酸を含む、項1に記載の方法。
項3. 溶液が約25%(v/v)〜約37.5%(v/v)のカルボン酸を含む、項1に記載の方法。
項4. カルボン酸を約1:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))〜約20:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))の溶解率で添加する、項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
項5. カルボン酸を約5:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))〜約10:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))の溶解率で添加する、項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
項6. カルボン酸が少なくとも約3のpKaを示す、項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
項7. カルボン酸が酢酸またはギ酸である、項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
項8. カルボン酸が酢酸である、項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
項9. 微生物集団と溶液とを約5時間以下接触させることを含む、項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
項10. 微生物集団と溶液とを約1時間以下接触させることを含む、項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
項11. さらに微生物集団と界面活性剤とを接触させる、項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
項12. 可溶性タンパク質が微生物集団によって組換えタンパク質として発現される、項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
項13. 微生物集団が細菌、酵母または真菌である、項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
項14. 微生物集団が細菌である、項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
項15. 微生物集団がグラム陰性細菌である、項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
項16. 微生物集団が大腸菌(Escherichia coli)である、項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
項17. 可溶性タンパク質が微生物集団から抽出される際に溶液中で可溶性を維持できる等電点を示す、項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
項18. 可溶性タンパク質が7.5以上の等電点を示す、項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
項19. 可溶性タンパク質が6以下の等電点を示す、項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
項20. タンパク質が、硬タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド、シャペロニン、熱ショックタンパク質、インターロイキン、インターフェロン、融合タンパク質および抗体の様々なドメインを含むタンパク質からなる群から選択される、項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
項21. 微生物集団から可溶性タンパク質を精製する方法であって、項1〜20のいずれか1項に記載の方法を実施することおよび前記の方法によって抽出した可溶性タンパク質を精製することを含む方法。
項22. 可溶性タンパク質を他の化合物と混合することをさらに含む、項21に記載の方法。
項23. 精製または抽出したタンパク質を修飾することをさらに含む、項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
項24. 修飾タンパク質を製造する方法であって、項21〜23のいずれか1項に記載の方法によって精製したタンパク質を取得して修飾すること、または項1〜20のいずれか1項に記載の方法によって抽出したタンパク質を取得して修飾することを含む方法。
項25. タンパク質の修飾が別の化合物をタンパク質へ結合させることを含む、項23または24に記載の方法。
項26. タンパク質を組成物に配合することをさらに含む、項21〜25のいずれか1項に記載の方法。
項27. タンパク質を固体支持体または半固体支持体の上部または内部に固定化することをさらに含む、項21〜25のいずれか1項に記載の方法。
項28. 組成物を製造する方法であって、項1〜25のいずれか1項に記載の方法によって抽出、精製または製造したタンパク質を取得すること、および前記タンパク質を組成物に配合することを含む方法。
項29. 固体または半固体支持体を製造する方法であって、項1〜25のいずれか1項に記載の方法によって抽出、精製、または製造したタンパク質を取得すること、およびタンパク質を固体支持体または半固体支持体の上部または内部に固定化することを含む方法。
項30. 組成物、固体支持体または半固体支持体がヒトまたは非ヒト動物への投与または適用に用いられる、項26〜29のいずれか1項に記載の方法。
項31. 組成物、固体支持体または半固体支持体が医薬用途、化粧用途、薬用化粧用途、動物薬用途、または移植に用いられる、項26〜31のいずれか1項に記載の方法。
項32. 項1〜31のいずれか1項に記載の方法を実施することを含む方法を実施することによって製造される、タンパク質、組成物、固体支持体または半固体支持体。
項33. 医薬品に用いられる、項32に記載のタンパク質、組成物、固体支持体または半固体支持体。
項34. 医薬用途、化粧用途、薬用化粧品途、動物薬用途、または移植に用いられる、項32に記載のタンパク質、組成物、固体支持体または半固体支持体。
項35. 病態を治療する方法であって、項32に記載のタンパク質、組成物、固体支持体または半固体支持体を、それを必要とする対象者に投与することを含む方法。
項36. 病態を治療するための医薬の製造のための、項32に記載のタンパク質、組成物、固体支持体または半固体支持体の使用。
項37. 項32に記載のタンパク質、組成物、固体支持体または半固体支持体を含む装置。
項38. 注射器、パッチ、またはインプラントである項35に記載の装置。
Claims (38)
- 微生物集団から可溶性タンパク質を抽出する方法であって、可溶性タンパク質を発現する微生物集団と、微生物集団から可溶性タンパク質を抽出するのに有効な量の、約1%(v/v)以上50%(v/v)未満のカルボン酸を含む溶液とを接触させることを含む方法。
- 溶液が約1%(v/v)〜約40%(v/v)のカルボン酸を含む、請求項1に記載の方法。
- 溶液が約25%(v/v)〜約37.5%(v/v)のカルボン酸を含む、請求項1に記載の方法。
- カルボン酸を約1:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))〜約20:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))の溶解率で添加する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- カルボン酸を約5:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))〜約10:1(カルボン酸(ml):微生物(湿重量,g))の溶解率で添加する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- カルボン酸が少なくとも約3のpKaを示す、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- カルボン酸が酢酸またはギ酸である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- カルボン酸が酢酸である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 微生物集団と溶液とを約5時間以下接触させることを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 微生物集団と溶液とを約1時間以下接触させることを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- さらに微生物集団と界面活性剤とを接触させる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 可溶性タンパク質が微生物集団によって組換えタンパク質として発現される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 微生物集団が細菌、酵母または真菌である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 微生物集団が細菌である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 微生物集団がグラム陰性細菌である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 微生物集団が大腸菌(Escherichia coli)である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 可溶性タンパク質が微生物集団から抽出される際に溶液中で可溶性を維持できる等電点を示す、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 可溶性タンパク質が7.5以上の等電点を示す、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 可溶性タンパク質が6以下の等電点を示す、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質が、硬タンパク質、ナトリウム利尿ペプチド、シャペロニン、熱ショックタンパク質、インターロイキン、インターフェロン、融合タンパク質および抗体の様々なドメインを含むタンパク質からなる群から選択される、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 微生物集団から可溶性タンパク質を精製する方法であって、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法を実施することおよび前記の方法によって抽出した可溶性タンパク質を精製することを含む方法。
- 可溶性タンパク質を他の化合物と混合することをさらに含む、請求項21に記載の方法。
- 精製または抽出したタンパク質を修飾することをさらに含む、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 修飾タンパク質を製造する方法であって、請求項21〜23のいずれか1項に記載の方法によって精製したタンパク質を取得して修飾すること、または請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法によって抽出したタンパク質を取得して修飾することを含む方法。
- タンパク質の修飾が別の化合物をタンパク質へ結合させることを含む、請求項23または24に記載の方法。
- タンパク質を組成物に配合することをさらに含む、請求項21〜25のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質を固体支持体または半固体支持体の上部または内部に固定化することをさらに含む、請求項21〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 組成物を製造する方法であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法によって抽出、精製または製造したタンパク質を取得すること、および前記タンパク質を組成物に配合することを含む方法。
- 固体または半固体支持体を製造する方法であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法によって抽出、精製、または製造したタンパク質を取得すること、およびタンパク質を固体支持体または半固体支持体の上部または内部に固定化することを含む方法。
- 組成物、固体支持体または半固体支持体がヒトまたは非ヒト動物への投与または適用に用いられる、請求項26〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 組成物、固体支持体または半固体支持体が医薬用途、化粧用途、薬用化粧用途、動物薬用途、または移植に用いられる、請求項26〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法を実施することを含む方法を実施することによって製造される、タンパク質、組成物、固体支持体または半固体支持体。
- 医薬品に用いられる、請求項32に記載のタンパク質、組成物、固体支持体または半固体支持体。
- 医薬用途、化粧用途、薬用化粧品途、動物薬用途、または移植に用いられる、請求項32
に記載のタンパク質、組成物、固体支持体または半固体支持体。 - 病態を治療する方法であって、請求項32に記載のタンパク質、組成物、固体支持体または半固体支持体を、それを必要とする対象者に投与することを含む方法。
- 病態を治療するための医薬の製造のための、請求項32に記載のタンパク質、組成物、固体支持体または半固体支持体の使用。
- 請求項32に記載のタンパク質、組成物、固体支持体または半固体支持体を含む装置。
- 注射器、パッチ、またはインプラントである請求項35に記載の装置。
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