CN106068272A - 提取蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了用于从微生物群体提取可溶性蛋白质的方法，所述方法包括使表达所述可溶性蛋白质的微生物群体与一定量的溶液接触，所述溶液包含有效地从所述微生物群体提取所述可溶性蛋白质的约1％(体积/体积)至小于50％(体积/体积)的羧酸。

Description

提取蛋白质的方法
相关的申请数据
本申请要求于2013年9月24日提交的标题为“Method of extracting protein”的澳大利亚临时专利申请No.2013903669的优先权。该申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开内容涉及用于从微生物提取蛋白质的方法。
背景技术
微生物允许在相对短的时间段内以高水平产生重组蛋白质。此外，可相对容易地对许多微生物进行遗传修饰从而以高水平表达目的蛋白质。因此，微生物是为了产生用于工业应用(例如，用于治疗或诊断或美容应用)的蛋白质所选择的细胞类型之一。
对于许多应用，必须提取微生物中表达的蛋白质并纯化到至少某种程度。为了纯化这些蛋白质，常常需要使用本领域已知的方法(例如匀浆化或化学裂解)来裂解细胞。然而，通过这些方法释放蛋白质还导致从该微生物释放大量另外的蛋白质以及核酸、脂质、内毒素和其他细胞组分。尤其是在对在微生物内可溶的蛋白质而非包含在聚集体或包涵体中的蛋白质进行纯化的情况，因为许多污染物在微生物内也是可溶的。这些污染性蛋白质和其他物质常常与目的蛋白质一起被提取。因此，随后必须纯化目的蛋白质以除去这些污染物。较高浓度的污染物可能需要更多个纯化步骤和/或更多种试剂，导致产生纯化的蛋白质的成本增加。
传统的蛋白质提取方法也常常使用昂贵且常常高度易燃的有机溶剂，因此需要用于密闭、防火、防爆和处置的专用设备。因此，期望不使用这样的溶剂，特别是当纯化大量的蛋白质时。
使用苛刻的有机溶剂还可能需要在提取过程中不被降解或腐蚀的专用设备。或者，提取方法中使用的设备由于降解/腐蚀必须定期更换。
用于从微生物中提取蛋白质的一些方法还也使用酶，例如溶菌酶。然而，难以使用这些方法从大量的细胞提取蛋白质，原因是溶菌酶添加效率低下且难以将该酶分散遍布大细胞团块中。
根据上文，对于本领域技术人员显而易见的是，期望允许从微生物提取蛋白质并降低来自细胞的核酸和/或脂质和/或内毒素和/或其他细胞蛋白质的污染水平的方法。理想地，所述方法允许当沉淀污染物时，待提取的蛋白质处于可溶的形式。
发明内容
本公开内容是基于本发明人开发的允许提取蛋白质(例如，从微生物中提取可溶性蛋白质)的方法，其中所述蛋白质保持可溶，同时来自所述微生物的大量的内源蛋白质、核酸和/或脂质沉淀。该方法与一些其他方法相比，允许本发明人以更高的纯度提取可溶性蛋白质，同时提取与那些方法类似水平的蛋白质。因此，由本发明人产生的方法通过回收高产率的具有降低的污染水平之蛋白质而有助于下游纯化步骤。如本文所例证的，本发明人已经使用多种羧酸来从细菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli))提取可溶性蛋白质。这些结果通常被用作微生物的模型。
在一个实例中，发明人已使用足够低浓度的羧酸(例如，小于约50％的羧酸)以高水平的纯度提取了可溶性蛋白质，所述方法可以用标准设备来进行。本发明人产生的方法的一些实例允许提取的蛋白质直接施加到过滤器上，例如，在切向流过滤或深度过滤中常用的过滤膜，而无需添加降低损坏过滤器之风险的缓冲剂。本发明人还发现，将羧酸(例如，乙酸)的浓度增加至高于约37％或50％或62％降低蛋白质的纯度至(例如)小于当用约25％的酸提取蛋白质时的纯度。就这点而言，使用包含约25％羧酸的溶液导致高水平的纯度。使用包含100％的羧酸的溶液进行提取导致用于进一步纯化的足够纯的蛋白质，但是所述蛋白质没有用包含约25％的羧酸的溶液提取的蛋白质那么纯。
在另一个实例中，本发明人发现使用约25％至约100％的羧酸提取所述蛋白质持续多于约(例如)20分钟或30分钟对于提取的蛋白质的量影响不大。因此，本发明人已确定可在相对较短的时间段内进行提取(如果需要的话)。
从上文可明显看出，本发明人已经证明可以用羧酸提取可溶性蛋白质，所述羧酸是廉价的且不需要用于处理、储存和/或处置的专用设备。本发明人使用的示例性的羧酸是乙酸。
本发明人已经表明多种浓度的羧酸在该方法中是有效的。本发明人还表明可通过提高酸的体积与微生物的重量的比率来改进提取的蛋白质的量和/或提取的蛋白质的纯度。
本发明人产生的方法不一定需要专用设备，例如，匀浆器或超声波破碎仪(sonicator)或苛刻的有机溶剂或酶(例如溶菌酶)来提取可溶性蛋白质。
本发明人的发现为用于从微生物提取可溶性蛋白质的方法以及用于纯化用于人或非人动物的蛋白质的方法提供了基础。
基于以上讨论，本公开内容提供了用于从微生物群体提取可溶性蛋白质的方法，所述方法包括使表达可溶性蛋白质的微生物群体与溶液接触，所述溶液包含一定量的有效地从微生物群体提取可溶性蛋白质的羧酸。
在一个实例中，所述羧酸是乙酸。
在一个实例中，所述微生物群体与所述溶液接触足够的时间以提取可溶性蛋白质。例如，使所述微生物群体接触持续少于约48小时或24小时，或20小时，例如，少于约12小时，例如少于约8小时或6小时。例如，使所述微生物群体接触持续少于约2小时或1小时，例如，约20分钟至1小时。
本公开内容提供了用于从微生物群体提取可溶性蛋白质的方法，所述方法包括使表达所述可溶性蛋白质的微生物群体与一定量的溶液接触，所述溶液包含有效地从微生物群体提取可溶性蛋白质的约1％(体积/体积)至约100％(体积/体积)的羧酸。例如，所述溶液包含约1％至约90％或80％或70％或60％或50％的羧酸。例如，所述溶液包含约10％至约90％或80％或70％或60％或50％的羧酸。例如，所述溶液包含约20％至约90％或80％或70％或60％或50％的羧酸。在一些实例中，所述方法包括使所述群体与这样的溶液接触，持续如本文所述的指定时间段(例如，1小时或更少)。
本公开内容提供了用于从微生物群体提取可溶性蛋白质的方法，所述方法包括使表达可溶性蛋白质的微生物群体与一定量的溶液接触，所述溶液包含有效地从微生物群体提取可溶性蛋白质的约1％(体积/体积)至小于50％(体积/体积)的羧酸。
在一个实例中，溶液包含约1％(体积/体积)至约40％(体积/体积)的羧酸。
在一个实例中，溶液包含约1％(体积/体积)至约37.5％(体积/体积)的羧酸。
在一个实例中，溶液包含约1％(体积/体积)至约30％(体积/体积)的羧酸。
在一个实例中，溶液包含约1％(体积/体积)至约25％(体积/体积)的羧酸。
例如，溶液包含约10％(体积/体积)至约40％(体积/体积)的羧酸。
例如，溶液包含约10％(体积/体积)至约37.5％(体积/体积)的羧酸。
例如，溶液包含约10％(体积/体积)至约25％(体积/体积)的羧酸。
例如，溶液包含约20％(体积/体积)至约40％(体积/体积)的羧酸。
例如，溶液包含约20％(体积/体积)至约37.5％(体积/体积)的羧酸。
例如，溶液包含约25％(体积/体积)至约37.5％(体积/体积)的羧酸。
本文描述了另外量的乙酸，并且认为在作必要改变的情况下适用于本公开内容的本实例。
使用包含40％或37.5％或25％或更少的羧酸的溶液有助于以更少的步骤进行下游纯化和/或降低成本。这是因为用于处理提取的蛋白质(例如，通过切向流过滤)的一些过滤器可被高于40％或37.5％或25％的羧酸(例如，乙酸)水平损坏。被这些条件损坏的示例性的过滤器包含复溶纤维素(reconstituted cellulose)或聚醚砜或由其组成。
本公开内容还提供了用于从微生物群体提取可溶性蛋白质的方法，所述方法包括使表达可溶性蛋白质的微生物群体与一定量的溶液接触，持续少于约20小时或15小时或10小时或5小时或4小时或3小时或2小时或1小时，所述溶液包含有效地从微生物群体提取可溶性蛋白质的羧酸。在一个实例中，使微生物群体与溶液接触持续少于约1小时，例如，约10分钟至约1小时。在一个实例中，使微生物群体与溶液接触约20分钟至约1小时。
本文描述了另外的提取时间，并且认为在作必要改变的情况下适用于本公开内容的本实施例。
在一个实例中，所述溶液包含约10％至约100％的羧酸，例如，约10％至90％或80％或75％或70％或本文所述的量。
在本公开内容的方法的一个实例中，以约1∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)至约20∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)的溶解比率添加所述羧酸。例如，以约5∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)至约20∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)，例如至以约10∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)的溶解比率添加所述羧酸。在本公开内容的一个示例性形式中，以约9∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)的溶解比率添加所述羧酸。
在一个实例中，将所述羧酸添加到未悬浮于溶液(例如细胞培养基)中的微生物。例如，所述微生物已通过离心被沉淀。
在一个实例中，将所述羧酸添加到包含微生物的溶液，例如，细胞培养基或其他溶液，使得其包含约1％(体积/体积)至小于50％(体积/体积)的羧酸。
羧酸对于本领域技术人员将是显而易见的。示例性的羧酸列于表1。
在一个实例中，羧酸的pKa为至少约3。如本文所例证的，合适的羧酸包括乙酸或甲酸。本发明人已经示出，与尿素或氢氧化钠或异丙醇相比，乙酸对于可用于以更高回收率和/或纯度水平提取可溶性蛋白质。
在一个实例中并且视情况而定，本文所述的根据任何实例的方法包括使微生物群体与溶液接触约5小时或更少，例如4小时或更少，例如3小时或更少或者2小时或更少。在一个实例中，所述方法包括使微生物群体与于溶液接触约1小时或更少。本领域的技术人员将理解，该方法需要群体与酸进行实际接触。因此，术语“或更少”意指至少1分钟，例如，至少5分钟或10分钟或15分钟。
在一个实例中，所述方法还包括使微生物群体与洗涤剂，例如Tween(聚氧乙烯-山梨糖醇单油酸酯，例如，Tween20或Tween80)或来自TritonX类洗涤剂(聚乙二醇对-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯基醚)的洗涤剂接触。在一个实例中，所述洗涤剂与羧酸一起添加。在一个实例中，在羧酸之后添加洗涤剂。在一个实例中，在羧酸之前添加洗涤剂。
在一个实例中，可溶性蛋白质是由微生物群体重组表达的。
示例性的微生物包括细菌、酵母或真菌。示例性的微生物包括细菌，例如革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌。
在一个实例中，可溶性蛋白质具有当从微生物群体提取该蛋白质时允许该蛋白质保持可溶的pI。在一个实例中，蛋白质具有中性的pI，例如，约6至约8，例如，约6.5至约7.5。
在另一个实例中，蛋白质具有碱性的pI。例如，可溶性蛋白质的pI为7.5或更大。在另一个实例中，可溶性蛋白质的pI为约10.4。
在另一个实例中，蛋白质具有酸性的pI。例如，蛋白质的pI为约6.5或更小。在另一个实例中，蛋白质的pI为6或更小或者5.5或更小。例如，蛋白质的pI为5或更小。例如，蛋白质的pI为约4.7或更小，例如，约4.65或4.6。
在一个实例中，蛋白质选自硬蛋白、伴侣蛋白、热休克蛋白、肽(例如，利尿钠肽)以及包含抗体的可变结构域的蛋白质。
在一个实例中，所述蛋白质是融合蛋白。例如，所述蛋白质包含肽或多肽的多个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。在另一个实例中，所述蛋白质包含彼此融合的两个多肽，例如，肽或多肽与帮助纯化的标签(例如，六-组氨酸标签)或抗体(例如，IgG1抗体)的Fc区融合。
在一个实例中，所述方法还包括将包含可溶性蛋白质的溶液与微生物群体的不溶性组分分离。例如，所述方法还包括离心和/或过滤溶液并通过离心回收可溶性级分(例如，上清液)。
本公开内容还提供了用于从微生物群体纯化可溶性蛋白质的方法，所述方法包括执行如本文所述的用于提取蛋白质的方法以及纯化通过所述方法提取的可溶性蛋白质。
在一个实例中，本文所述的方法还包括修饰经纯化或经提取的蛋白质。例如，通过将所述蛋白质与另一个蛋白质缀合或将其切割(例如，以除去标签和/或切割融合蛋白内的肽的多个拷贝)而对其进行修饰。
本公开内容还提供了用于产生经修饰的蛋白质的方法，所述方法包括获得通过如本文所述的方法纯化的蛋白质或通过如本文所述的方法提取的蛋白质以及并修饰所述蛋白质。在一个实例中，修饰所述蛋白质包括使另一个化合物与所述蛋白质缀合。在另一个实例中，修饰所述蛋白质包括使其与蛋白酶接触，从而切割所述蛋白质。
在一个实例中，如本文所述的方法还包括将治疗性蛋白质配制成药物组合物或化妆品组合物(cosmetic composition)或兽医用组合物(veterinary composition)。
在一个实例中，如本文所述的方法还包括将所述蛋白质固定到固体支持物或半固体支持物上或者固体支持物或半固体支持物中。示例性的支持物是贴剂和/或植入物和/或医疗装置。
本公开内容还提供了用于产生药物组合物或化妆品组合物或兽医用组合物的方法，所述方法包括获得通过本文所述的方法提取、纯化或产生的蛋白质并将所述蛋白质配制成药物组合物或化妆品组合物或兽医用组合物。
本公开内容还提供了用于产生固体或半固体支持物的方法，所述方法包括获得通过根据任何实例的本文所述的方法提取、纯化或产生的蛋白质，并将所述蛋白质固定到固体支持物或半固体支持物上或者固体支持物或半固体支持物中。
在一个实例中，所述组合物、固体支持物或半固体支持物是用于向人或非人动物施用或应用，或者在人或非人动物上施用或应用。
在一个实例中，所述组合物、固体支持物或半固体支持物用作药物或用作化妆品。
在一个实例中，所述组合物、固体支持物或半固体支持物用于药物用途、化妆品用途、药物化妆品用途(cosmaceutical use)、兽医用途或用于植入。
在一个实例中，所述组合物、固体支持物或半固体支持物是用于经口、通过植入、皮内、肌内、皮下、静脉内、动脉内、肌内、作为气雾剂或眼内施用。
本公开内容还提供通过执行本文所述的方法而产生的蛋白质或组合物或固体支持物或半固体支持物。
在一个实例中，所述蛋白质(包括经修饰的蛋白质)、组合物、固体支持物或半固体支持物是用于制药用途、化妆品用途、药物化妆品用途、兽医用途或用于植入。在一个实例中，所述组合物是药物组合物。在一个实例中，所述组合物是化妆品组合物。本文所述的方法还可用于生产用于培养或固定细胞(例如，干细胞或祖细胞或皮肤细胞)的支架或用于生产用于工业应用(例如，在食品或纺织工业中)的酶。
本公开内容还提供了包含如本文所述的蛋白质、组合物、固体支持物或半固体支持物的装置。在一个实例中，所述装置是注射器、贴剂(patch)或植入物。
附图说明
图1是示出了从大肠杆菌(E.coli.)提取重组蛋白质的多种处理的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果之照片图像副本。泳道1，大小标准；泳道2，15mM NaOH提取；泳道3，0.57(体积/体积)乙酸提取(室温)；泳道4，0.57％(体积/体积)乙酸提取(4℃)；泳道5，10％(重量/体积)甲酸提取；泳道6，尿素提取；泳道7，正丙醇提取。
图2是示出了从大肠杆菌提取重组蛋白质的多种处理的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果之照片图像副本。泳道1，大小标准；泳道2，10％(体积/体积)乙酸提取；泳道3，5％(体积/体积)乙酸提取；泳道4，2％(体积/体积)乙酸提取；泳道5，尿素提取。
图3是示出了乙酸的浓度(体积/体积)、溶解比率和每升发酵物回收的重组蛋白质的量(g)之间关系的图示。
图4是示出了乙酸的浓度(体积/体积)、溶解比率和提取的重组蛋白质的纯度之间的关系的图示。
图5是示出了表达重组蛋白质的大肠杆菌的提取物之SDS-PAGE分析结果之照片图像副本。使用如在该图的上方所示的不同浓度的乙酸(体积/体积)产生提取物。
图6是示出了如使用RP-HPLC测定的大肠杆菌的提取物中重组蛋白质的产率和纯度的图示。使用如所示的不同浓度的乙酸(体积/体积)产生提取物。
图7包括两个图示，其示出了如使用RP-HPLC测定的大肠杆菌的提取物中重组蛋白质的产率(左侧图)和纯度(右侧图)。使用如所示的不同浓度的乙酸(体积/体积)以及在不同的时间段内产生提取物。
图8是示出了表达重组蛋白质的大肠杆菌的提取物的SDS-PAGE分析结果之照片图像副本。使用如在该图的上方所示的不同浓度的乙酸(体积/体积)在20分钟的时间内产生提取物。
图9是示出了表达含有肽的多个拷贝的重组融合蛋白质的大肠杆菌提取物SDS-PAGE分析结果之照片图像副本。泳道1，大小标准；泳道2，细胞裂解物；泳道3，25％(体积/体积)乙酸提取。
具体实施方式
一般定义
在整个本说明书中，除非另有明确说明或上下文另有要求，否则提及单个步骤、物质组合(composition of matter)、步骤的组或物质组合的组应认为包含一个或多个(即，一个或更多个)这些步骤、物质组合、步骤的组或物质组合的组。
本领域技术人员将理解，除了具体描述的那些之外，本公开内容易于进行多种变化和修改。应理解，本公开内容涵盖所有这样的变化和修改。本公开内容还单独地或共同地包括本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何两个或更多个或者任何和所有的组合。
本公开内容并不限于本文所述的具体实例的范围，这些实例仅意在示例的目的。功能等同的产物、组合物和方法显然在本公开内容的范围之内。
除非另有明确说明，否则本文的任何实例都应认为在作必要改变的情况下(mutatis mutandis)适用于任何其他实施方案。
除非另有明确定义，否则应认为本文使用的所有技术和科学术语具有如本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)普通技术人员通常理解的相同含义。
除非另外指明，否则本发明中使用的重组蛋白质和细胞培养技术是本领域技术人员已知的标准方法。在贯穿以下来源的文献中描述并解释了这样的技术，例如，J.Perbal，APractical Guide to Molecular Cloning，John Wiley和Sons(1984)，J.Sambrook等.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(编辑)，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，第1卷和第2卷，IRL Press(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编辑)，DNA Cloning：A PracticalApproach，1-4卷，IRL Press(1995和1996)，以及F.M.Ausubel等(编辑)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience(1988，包括目前为止所有的更新)。
术语“和/或”，例如，“X和/或Y”应被理解为意指“X和Y”或“X或Y”并且应认为其为两种含义或任一含义提供了明确的支持。
在整个本说明书中，词语“包括”或变体例如“包含”或“含有”应被理解为暗示包含所述元素、整体或步骤，或者元素、整体或步骤的组，但并不排除任何其他的元素、整体或步骤，或元素、整体或步骤的组。
如本文使用的术语“来自”应被认为表示从指定来源获得的特定整体，但是不是必需从该来源直接获得。
选定的定义
术语“提取”意指从表达可溶性蛋白质的微生物移出可溶性蛋白质。在一些实例中，提取可溶性蛋白质是将蛋白质(例如)与在提取之前微生物中存在的其他物质或组分的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％分离。
如本文使用的术语“可溶性蛋白质”将被理解为意指当在微生物(例如，微生物的胞质溶胶或周质内)中表达时，蛋白质是可溶的形式。例如，所述蛋白质在细胞的胞质溶胶或周质中不形成不溶性聚集体，例如，包涵体。
术语“微生物”对本领域技术人员是显而易见的，如指任何微小单细胞的或多细胞的生物体。示例性的微生物是单细胞的。在本公开内容的方法中有用的微生物的实例包括酵母、真菌和细菌。
术语“微生物群体”包括在培养或发酵过程中产生的微生物。在一个实例中，在培养物中的微生物源自一个克隆，即，是克隆的。例如，细胞在遗传上基本上相同，除了在培养过程中产生的突变。
如本文使用的术语“羧酸”涵盖包含至少一个羧基基团的任何有机酸，包括表1中列出的羧酸。在一个实例中，羧酸的pKa大于2或2.5或3或3.5或3.6或3.7或3.8或3.9或4或4.1或4.2或4.3或4.4或4.5。例如，羧酸是乙酸或甲酸或柠檬酸或乳酸或尿酸或苯甲酸或氯乙酸或丙酸。在一个实例中，羧酸是甲酸或乙酸或苯甲酸或丙酸。在一个实例中，羧酸是乙酸或苯甲酸或丙酸。在一个实例中，羧酸是乙酸。
本领域技术人员将理解术语“％(体积/体积)”(同义词“体积百分比”或“体积百分比的体积”)将被理解为通过式((溶质(羧酸)的总体积/溶液的总体积)×100％)所计算的。
术语“湿重”仅意指没有首先干燥微生物而测量的微生物群体的重量。例如，微生物的重量是在从细胞培养物收获后(例如，通过离心和/或过滤)测定的，但是没有干燥所述细胞。
根据本文所述，术语“溶解比率”的含义对于本领域技术人员将是显而易见的。特别地，该术语指的是包含羧酸的溶液的体积与微生物群体的湿重的比率。
羧酸
如本文中所讨论的，本公开内容考虑使用任何羧酸来从细胞提取可溶性蛋白质。
在一个实例中，所述羧酸具有足够低的pKa值以允许当以本文所讨论的％(体积/体积)使用时进行提取。
在一个实例中，所述羧酸具有足够高的pKa值，当以约1％至小于50％，例如以1％至约37.5％的％(体积/体积)使用时，其不损坏用于提取蛋白质的设备，例如，反应容器。
示例性的羧酸及其pKa列于表1中。
表1：示例性的羧酸及其pKa
在一个实例中，羧酸的pKa大于2。例如，羧酸是戊酸、三甲基乙酸、柠檬酸、异柠檬酸、己二酸、adiparnic酸、己酸、2-溴苯甲酸、3-溴苯甲酸、2-氯苯甲酸、3-氯苯甲酸、4-氯苯甲酸、2-碘苯甲酸、3-碘苯甲酸、喹啉酸、苯甲酸、庚酸、辛酸、甲酸、溴乙酸、氯乙酸、碘乙酸、硫代乙酸、乙酸、乙醇酸、丙烯酸、丙酸、乳酸、甘油酸、草酰乙酸、乙酰乙酸、琥珀酸、苹果酸、丁酸、2-甲基丙酸、3-羟基丁酸、4-羟基丁酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、尿酸、戊二酸或l-谷氨酸。
在一个实例中，羧酸的pKa小于3。例如，羧酸是甲酸、碘乙酸、硫代乙酸、乙酸、乙醇酸、丙烯酸、丙酸、乳酸、甘油酸、乙酰乙酸、琥珀酸、苹果酸、丁酸、2-甲基丙酸、3-羟基丁酸、4-羟基丁酸、4-氨基丁酸、尿酸、戊二酸、戊酸、三甲基乙酸、柠檬酸、异柠檬酸、己二酸、adiparnic酸、己酸、3-氯苯甲酸、4-氯苯甲酸、3-碘苯甲酸、苯甲酸、庚酸或辛酸。
在一个实例中，羧酸的pKa大于4。例如，羧酸是乙酸、丙烯酸、丙酸、琥珀酸、丁酸、2-甲基丙酸、3-羟基丁酸、4-羟基丁酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、戊二酸、戊酸、己二酸、己酸、庚酸、辛酸或苯甲酸。
在一个实例中，羧酸的pKa大于4.5。例如，羧酸是乙酸、丙酸、丁酸、2-甲基丙酸、3-羟基丁酸、4-羟基丁酸、戊酸、三甲基乙酸、adiparnic酸、己酸或辛酸。
在一个实例中，羧酸是乙酸或甲酸。
在本公开内容的一个示例性形式中，羧酸是乙酸。本发明人已经表明这种酸提供了优异的提取性质(例如，产率和/或纯度)，甚至与另一种羧酸(甲酸)相比也是如此。该羧酸也相对便宜(例如，与某些有机溶剂相比)，且通常不需要用于处理、储存或处置的专用设备。
在其中微生物群体与组合物接触指定时间段之本公开内容的实例中，以约1％至小于100％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约1％至约95％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约1％至约90％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约1％至约85％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约1％至约80％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约1％至约75％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约1％至约70％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约1％至约65％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约1％至约60％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约1％至约55％的％(体积/体积)使用羧酸。
在本公开内容的方法的一个实例中，以约1％至约50％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约1％至约45％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约2％至约50％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约2％至约40％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约2％至约37.5％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约3％至约37.5％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约3％至约30％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约5％至约30％的％(体积/体积)使用羧酸。例如以约6％至约30％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约7％至约30％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约8％至约30％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约9％至约30％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约10％至约37.5％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以约10％至约25％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以1％或2％或5％或10％或15％或17.5％或25％或37.5％的％(体积/体积)使用羧酸。例如，以25％的％(体积/体积)使用羧酸。
在一个实例中，使羧酸在不具有显著的或可检测的缓冲能力的溶液中稀释。
在一个实例中，将羧酸在水中稀释。
在一个实例中，含有羧酸的溶液的pH为2至6，例如，2至5，例如2至4。例如，含有羧酸的溶液的pH值为2至3。在一个实例中，含有羧酸的溶液的H为2至2.5。
提取
在一个实例中，以约1∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)至约20∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)的溶解比率添加羧酸。例如，以约2∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)至约15∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)的溶解比率添加羧酸。例如，以约3∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)至约10∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)的溶解比率添加羧酸。以约5∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)至约10∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)的溶解比率添加羧酸。例如，以约5∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)或约6∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)或约7∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)或约8∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)或约9∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)的溶解比率添加羧酸。
在本公开内容的一个示例性形式中，以约9∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)的溶解比率添加羧酸。
对于本领域技术人员显而易见的是，在一些实例中，需要在对微生物进行称重之前收获微生物。用于收获微生物的方法对于本领域的技术人员将是显而易见的，且包括例如，连续流动离心(例如，使用圆盘堆叠式(disc-stack)离心机，例如购自Alfa Laval或GEAWestfalia Separator Group GmbH的那些)、微过滤(microfiltration)或切向流过滤。
在收获之后可容易地确定微生物的重量。或者，确定微生物的样品的重量并使用该重量来计算或估计全部微生物群体的重量。
在一个替代性实例中，收获微生物的培养物的样品并称重，并使用该重量来计算或估计培养物中微生物的重量。然后向培养物直接添加所需量的含有羧酸的溶液。
在另一个实例中，基于向培养物(例如，培养基和进料)中添加的每种组分的已知重量来估计微生物的培养物的重量，并且使用这些重量来计算或估计培养物中微生物的重量。然后向培养物直接添加所需量的含有羧酸的溶液。
在一个实例中，使微生物群体与溶液接触一段时间并且置于足以提取可溶性蛋白质的条件下。
如本文以上所讨论的，本发明人已经确定根据任何实例的本文公开的方法帮助从微生物群体快速提取可溶性蛋白质。例如，发明人发现当将微生物群体与包含羧酸的溶液接触约20分钟或约1小时或约20小时时，从微生物群体中提取了类似量的蛋白质。在一个实例中，方法包括使微生物群体与包含羧酸的溶液接触少于五小时或四小时或三小时或两小时。例如，方法包括使微生物群体与包含羧酸的溶液接触一小时或更少，例如45分钟或30分钟或20分钟。本公开内容还考虑更长的提取时间。例如，使微生物群体与羧酸接触约1小时至约20小时，例如1至5小时，例如，1至3小时。在一个实例中，使微生物群体与羧酸接触约1小时。
可将微生物群体与羧酸在2℃至40℃的温度(例如4℃至约30℃)下接触，例如，在室温下。本领域技术人员将理解室温将取决于进行提取的环境。例如，在制造设施中，温度可以是16℃至26℃，例如18℃至25℃，例如，19℃或20℃或21℃或22℃或23℃或24℃。
可使用用于混合的标准技术来搅拌包含羧酸的溶液和微生物群体。
在与羧酸接触后，可从污染物中分离出含有可溶性蛋白质的溶液。例如，可使含有羧酸的溶液、微生物群体和可溶性蛋白质进行离心和/或微过滤。然后回收含有可溶性蛋白质的可溶性级分。
在一个实例中，本文所述的提取方法不包括使微生物群体与无机酸接触。
在一个实例中，本文所述的提取方法不包括使微生物群体与除羧酸之外的有机溶剂或水接触。在一个实例中，所述方法不包括使微生物群体与醇(例如，丁醇或丙醇)接触。
在一个实例中，本文所述的提取方法不包括超声破碎和/或匀浆化。
在一个实例中，本文所述的提取方法不包括添加增溶剂(solubilizationenhancer)例如聚乙烯亚胺、硫酸镁(MgSO4)、氯化镁(MgCl2)、硫酸钙(CaSO4)或氯化钙(CaCl2)。
微生物
适合用于表达根据本公开内容进行提取的可溶性蛋白质的微生物对于本领域技术人员将是显而易见的。例如，所述微生物是酵母、真菌或细菌。
示例性的酵母包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、Pichia finlandica、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)、Pichia minuta(Ogataea minuta，Pichia lindneri)、Pichiaopuntiae、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、Pichia salictaria、Pichiaguercuum、Pichia pijperi、树干毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、毕赤酵母属(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酿酒酵母属(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(luyveromyces lactis)和白色念珠菌(Candidaalbicans)。
示例性的丝状真菌包括构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporiumlucknowense、镰孢菌属(Fusarium sp.)、禾赤镰孢(Fusarium gramineum)、镰孢霉(Fusarium venenatum)和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)。
适合用于本公开内容的细菌包括古细菌和真细菌，特别是真细菌。例如，革兰氏阴性细菌，例如肠杆菌科在本公开内容的方法中是有用的。有用的细菌的实例包括埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)和副球菌属(Paracoccus)。
在一个实例中，微生物为大肠杆菌。合适的大肠杆菌宿主包括E.coli W3110(ATCC27,325)、E.coli 294(ATCC 31,446或33,625)、E.coli B和E.coli XI 776(ATCC 31,537)。这些实例是说明性的而不是限制性的。也可使用任何上述微生物的突变体细胞。当利用重组表达的优点时，可通过考虑微生物中表达载体的可复制性来选择合适的微生物。例如，当使用已知的质粒例如pBR322、pBR325、pACYC177或pK410时，大肠杆菌属、沙雷氏菌属或沙门氏菌属物种可适合用作宿主。
当提取内源蛋白质时，选择表达所述蛋白质的微生物是十分重要的。
重组表达
在一个实例中，可溶性蛋白质被重组(即使用重组方法/手段)表达。例如，在表达构建体内将编码可溶性蛋白质的核酸与启动子有效地连接。表达构建体可被引入到微生物中，在那里其可并入微生物的基因组或其中的质粒中或可保持游离(episomal)。在一些实例中，表达构建体是表达载体。
如本文使用的术语“启动子”应以其最广的范围进行理解，并且包括基因组基因的转录调控序列，包括精确的转录启始需要的TATA盒或起始元件，可有或不具有另外的调控元件(例如，上游激活序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子)，其例如应答发育和/或外部刺激或以组织特异性方式改变核酸的表达。在本文的上下文中，术语“启动子”还用于描述重组的、合成的或融合的核酸或衍生物，其赋予、激活或增强与其有效地连接的核酸的表达。优选的启动子可含有一个或更多个特异性调控元件的另外拷贝以进一步增强所述核酸的表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。
如本文使用的术语“有效地连接”意指相对于核酸来定位启动子以使核酸的表达被该启动子控制。
术语“表达构建体”应以其最广的范围进行理解，并且包括这样的核酸，其包含与编码可溶性蛋白质的核酸有效地连接的启动子和表达该可溶性蛋白质的所需的任何其他元件。
术语“表达载体”指这样的核酸，其包含与编码可溶性蛋白质的核酸有效地连接的至少一个启动子和表达可溶性蛋白质所需的任何其他元件以及允许该载体在微生物中复制的序列以及任选地编码选择标记的序列。在本发明的上下文中，应理解，表达载体可以是质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒亚基因组或基因组片段或能够以可表达形式保持和/或复制异源DNA的其他核酸。用于在多种细胞中进行表达的许多表达载体是可商购的。合适的载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。
适合于在细菌细胞的病毒和细菌细胞(例如选自大肠杆菌属、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、棒杆菌属(Corynebacterium sp.)、沙门氏菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属的细菌细胞)中表达的典型的启动子包括但不限于：laez启动子、Ipp启动子、温度敏感型λL或λR启动子、T7启动子、T3启动子、SP6启动子或半人工启动子例如IPTG诱导型tac启动子或lacUV5启动子。用于在细菌细胞中表达本发明的核酸片段的许多其他基因构建体系统是本领域中已知的并且在例如Ausubel等(在：Current Protocols in MolecularBiology.Wiley Interscience，ISBN 047 150338，1987)和/或Sambrook等(在：MolecularCloning：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratories，New York，第三版2001)中进行了描述。
已经描述用于在细菌细胞中表达重组多肽的许多表达载体以及有效的核糖体结合位点，例如，PKC30(Shimatake和Rosenberg，Nature 292，128，1981)；pKK173-3(Amann和Brosius，Gene 40，183，1985)，pET-3(Studier和Moffat，J Mol.Biol.189，113，1986)；pCR载体套件(Invitrogen)、pGEM-T Easy载体(Promega)、pL表达载体套件(Invitrogen)、包含阿拉伯糖诱导型启动子的pBAD/TOPO或pBAD/thio-TOPO载体系列(Invitrogen，Carlsbad，CA)，其中后者被设计为还产生具有Trx环的融合蛋白用于对所表达的蛋白质进行构象约束；pFLEX表达载体系列(Pfizer nc，CT，USA)；pQE表达载体系列(QIAGEN，CA，USA)，或PL表达载体系列(Invitrogen)等。
适于在酵母细胞(例如，选自包含巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母和粟酒裂殖酵母(S.pombe)的组的酵母细胞)中表达的典型的启动子包括但不限于：ADH1启动子、GAL1启动子、GAL4启动子、CUPI启动子、PH05启动子、nmt启动子、RPR1启动子或TEF1启动子。
用于在酵母细胞中表达的表达载体包括但不限于：pACT载体(Clontech)、pDBleu-X载体、pPIC载体套件(Invitrogen)、pGAPZ载体套件(Invitrogen)、pHYB载体(Invitrogen)、pYD1载体(Invitrogen)和pNMT1、pNMT41、pNMT81 TOPO载体(Invitrogen)、pPC86-Y载体(Invitrogen)、pRH载体系列(Invitrogen)、pYESTrp载体系列(Invitrogen)。许多其他表达构建体及其使用方法在本领域中是已知的并且在例如在Giga-Hama和Kumagai(在：Foreign Gene Expression in Fission Yeast：Schizosaccharomycespombe，Springer Verlag，ISBN 3540632700，1997)以及Guthrie和Fink(在：Guide toYeast Genetics and Molecular and Cell Biology Academic Press，ISBN0121822540，2002)中进行了描述。
使用本领域已知的标准方法将表达构建体或表达载体引入微生物中。例如，如在Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中描述的，使用多价阳离子(例如钙)的处理通常用于含有坚实细壁障碍的细菌细胞。用于转化的另一种方法采用聚乙二醇/DMSO，如在Chung和Miller，Nucleic Acids Res.，16：3580(1988)中描述的。其他方法包括电穿孔、使用阳离子脂质转染、病毒递送和真菌的接合策略(mating strategies)。
在产生重组的微生物后，将所述微生物在足以产生表达可溶性蛋白质的微生物群体的条件下进行培养。因此，本发明的方法还涵盖产生重组细胞和/或表达所述可溶性蛋白质。
将用于产生可溶性蛋白质的微生物培养在合适的培养基中，在其中启动子可按照例如在Sambrook等(同上)和/或Ausubel等(同上)一般描述的和/或为可商购的启动子那样被诱导。也可包括除了碳、氮和无机磷酸盐来源之外的适当浓度的任何其他必要的补充剂，单独地引入或作为与另一种补充剂或培养基的混合物(例如复合氮源)引入。培养基的pH可以是约5至9的任何pH值，这主要取决于宿主生物体。对于可溶性蛋白质的积累，将微生物在足以积累可溶性蛋白质的条件下培养。这样的条件包括，例如，允许通过微生物表达和积累蛋白质的温度、营养物(nutrient)和细胞密度条件。此外，这样的条件是在其下微生物可以进行转录、翻译以及从一个细胞区室向另一个细胞区室递送蛋白质的基本细胞功能的那些条件，如本领域技术人员已知的。
在诱导型表达的情况下，例如，利用诱导型启动子，通常培养细胞直到达到一定的光密度，在该点启动诱导(例如，通过添加诱导剂、通过耗尽阻抑物或培养基成分等)以诱导编码可溶性蛋白质的基因的表达。
蛋白质
本公开内容涵盖在微生物中保持可溶的(例如，在细菌中不形成包涵体的)任何蛋白质的提取。
在一个实例中，可溶性蛋白质具有当从微生物群体提取蛋白质时允许蛋白保持可溶的pI。
在一个实例中，可溶性蛋白质的pI为约7.5或更大或者8或更大或者8.5或更大或者9或更大或者9.5或更大或者10或更大或者10.5或更大或者11或更大或者11.5或更大或者12或更大或者12.5或更大或13或更大。
在一个实例中，可溶性蛋白质的pI为约6.5或更小或者6或更小或者5.5或更小或者5或更少或者4.5或更小或者4或更少或者3.5或更或者3或更少或者2.5或更小或者2或更小。例如，所述蛋白质的pI为约3至6，例如约4至5，例如约4.6。
在一个实例中，可溶性蛋白质的pI为约7，例如，约6至7。
用于确定或估计蛋白质的pI的方法对于本领域的技术人员将是显而易见的。使用如在Biellqvist等Electrophoresis，14：1023-1031，1993中描述的方法可预测蛋白质的理论pI。在从购自Swiss Institute of Bioinformatics之ExPasy Proteomics Server可得的Compute pI工具中实现了由Bjellqvist等描述的算法。
或者，使用等电点聚焦(isoelectric focusing，IEF)来测定蛋白质的pI。IEF包括向固定的pH梯度(IPG)凝胶添加两性电解质溶液。IPG是与pH梯度共聚合的丙烯酰胺凝胶基质。电流通过所述凝胶，产生“正”阳极和“负”阴极端。带负电荷的蛋白质在介质中通过pH梯度朝“正”端移动而带正电荷的蛋白质朝向“负”端移动。随着蛋白质朝向其电荷的相反电极移动，其移动通过变化着的pH梯度，直到达到某个点，在这个点中达到了所述蛋白质等电点的pH。在该点处该蛋白质不再具有净电荷(因为相关的官能团的质子化或去质子化)，因此在凝胶内不再继续前进。
在一个实例中，蛋白质用于治疗目的，例如，在人中。示例性的蛋白质包括重组人白介素-11(Opreleukin；pI 11.85)、干扰素(alfacon 1；pI9)、干扰素β(PI 8.9)、干扰素γ、组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tPA)、尿激酶、奥曲肽(pI8.29)或角质形成细胞生长因子(pI 10.42)。
在一个实例中，蛋白质是干扰素，例如，干扰素β。
在一个实例中，蛋白质是白细胞介素，例如，淋巴因子，例如，IL-2。
在一个实例中，蛋白质包含抗体的可变结构域。示例性的含有可变结构域的蛋白质包括，例如，结构域抗体(例如，US6248516)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)片段、scFv(例如，如在US5260203中描述的)、双抗体、三抗体、四抗体或高阶复合物(例如，如在WO98/044001和/或WO94/007921中描述的)。例如，蛋白质是抗体的Fab片段。例如，蛋白质是阿昔单抗(abciximab)、兰尼单抗(ranibizumab)或赛妥珠单抗(certolizumab)(其可与聚乙二醇缀合以产生聚乙二醇化赛妥珠单抗(certolizumab pegol))。
在一个实例中，蛋白质是硬蛋白。例如，蛋白质是胶原(例如，I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原蛋白、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原或XII型胶原)、生腱蛋白(例如，生腱蛋白C或生腱蛋白X)、层粘连蛋白(例如，层粘连蛋白α、层粘连蛋白β或层粘连蛋白γ)、肌原纤蛋白、ALCAM、玻连蛋白、饰胶蛋白聚糖、基质gla蛋白、弹性蛋白、弹性蛋白原或覆膜蛋白。
在一个实例中，蛋白质包含或具有卷曲螺旋结构。例如，蛋白质选自纤维蛋白原、未交联的角蛋白(表皮素)、肌球蛋白、原肌球蛋白和胶原。
在另一个实例中，蛋白质是伴侣蛋白或热休克蛋白。在一个实例中，蛋白质是I型伴侣蛋白或II型伴侣蛋白。在Hill等，Genome Res.14：1669-1675，2004中描述了示例性的伴侣蛋白。在一个实例中，蛋白质是伴侣蛋白10，例如，如在US7618935中描述的。
在另一个实例中，可溶性蛋白质是利尿钠肽或其活性片段。
在另一个实例中，可溶性蛋白质是蛋白质的免疫原性片段，例如，如在疫苗中使用的。
在一个实例中，蛋白质是融合蛋白。
例如，这样的融合蛋白可包含肽或多肽的多个拷贝，例如，以帮助大规模生产。
在另一个实例中，融合蛋白包含标签例如以帮助纯化或检测，例如，六-组氨酸标签。
在另一个实例中，融合蛋白包含彼此融合的两个肽或多肽。例如，融合蛋白包含与抗体(例如，IgG抗体)的Fc区融合的肽或多肽。例如，融合蛋白包含与抗体的Fc区融合的一个或更多个(例如，两个)血小板生成素受体结合结构域。例如，融合蛋白是罗米司亭(romiplostim)。
本文中提及的蛋白质包括该蛋白质的突变体，例如，包含一个或更多个保守氨基酸替换、一个或更多个缺失和/或一个或更多个插入。在一个实例中，蛋白质包含少于20个替换和/或缺失和/或插入。
蛋白质修饰
通过本公开内容的方法提取或回收的蛋白质可以被修饰，例如，通过与另一种化合物缀合。
例如，所述另一种化合物选自：放射性同位素、可检测标记、治疗性化合物、胶体、毒素、核酸、肽、蛋白质，增加了对象中蛋白质的半衰期的化合物及其混合物。
示例性的化合物列于表2中。
表2.用于缀合的化合物。
蛋白质纯化
在一些实例中，本公开内容的方法包括另外地纯化所述蛋白质。用于纯化蛋白质的多种方法是本领域中已知的。
可使用例如，离子交换色谱、羟磷灰石色谱、氟磷灰石色谱、置换色谱、凝胶电泳、透析、超滤或亲和色谱来纯化从微生物制备的蛋白质。这些技术在本领域中是已知的，并且，在例如Scopes(在：Protein purification：principles and practice，第三版，1994)中进行了描述。取决于要回收的蛋白质，用于蛋白质纯化的其他技术例如乙醇沉淀、反相HPLC、在硅胶上的色谱、在肝素上的色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可用的。
本领域技术人员还将意识到可修饰可溶性蛋白质以包含帮助纯化或检测的标签，例如，聚-组氨酸标签，例如，六-组氨酸标签、或流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)标签、或猿猴病毒5(Simian Virus 5，V5)标签、或FLAG标签、或谷胱甘肽S转移酶(glutathioneS-transferase，GST)标签。优选地，所述标签是六-组氨酸标签。然后使用本领域中已知的方法(例如，亲和纯化)对所得的蛋白质进行纯化。例如，通过以下纯化包含六-组氨酸标签的蛋白质：使包含蛋白质的样品与固定在固体或半固体支持物上的特异性地结合六-组氨酸标签的镍-氨三乙酸(Ni-NTA)接触，洗涤所述样品以除去未结合的蛋白质，随后洗脱结合的蛋白质。
制剂
如本文所述提取和/或纯化的蛋白质可以配制成组合物。例如，所述组合物可用于胃肠外施用、局部施用(topical administration)、经口施用、肌内施用、眼内施用、皮下施用、局部施用(local administration)、气雾剂施用、皮内施用或透皮施用以用于预防性或治疗性治疗或美容治疗。
通常，治疗有效量的蛋白质配制成用于向对象施用的组合物。短语“治疗有效量”指的是足以促进、诱导和/或增强对象中的治疗或其他治疗效果的量。如明显可以看出，在这样的组合物中蛋白质的浓度可以广泛变化，并且按照所选择的特定施用方式和患者的需求，主要基于流体体积、粘度、体重等进行选择。根据疾病的类型和严重性，治疗有效量可以是约1μg/kg至150mg/kg的蛋白质，无论是例如通过一次或更多次单独的施用或是通过连续的输注。通常日剂量可以是约1μg/kg至100mg/kg或更高。向患者施用的蛋白质的示例性剂量是约0.1mg/kg患者体重至约10mg/kg患者体重。
用于施用的组合物通常包含蛋白质溶解在可药用载体(优选水性载体)中的溶液。可使用多种水性载体，例如，缓冲盐水等。另一些示例性的载体包括水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用非水性载剂，例如，混合的油和油酸乙酯。脂质体也可用作载体。载体可含有少量的提高等张性和化学稳定性的添加剂，例如，缓冲剂和防腐剂。所述组合物可包含如接近生理条件所需的可药用的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。
用于制备药物组合物的技术在本领域中通常是已知的，如由Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版，Mack Publishing Company，1980所举例说明的。
根据任何实施例由本文所述的方法提取、分离或产生的蛋白质也可固定到固体或半固体支持物中或者固定到固体或半固体支持物上。示例性的半固体支持物通常是由材料(通常是聚合物)制成的基质，其可通过酶或酸/碱水解降解或者通过溶解降解。一旦插入到身体中，酶和体液便对所述基质发挥作用。缓释的基质理想地是选自生物相容性材料，例如脂质体、聚丙交酯(聚乳酸)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚丙交酯共-乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)聚酸酐、聚(原酸)酯(poly(ortho)ester)、聚蛋白、透明质酸、胶原、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。
示例性的固体支持物包括塑料、绷带、缝线、支架、起搏器、耳蜗植入物或骨和/或脊柱植入物。
本文所述的组合物、半固体支持物和固体支持物可包含另外的组分。例如，另外的组分是化合物(例如，蛋白质)，其提供治疗或美容益处或者增加所提取蛋白质的治疗或美容益处或者与所提取的蛋白质相互作用或结合例如以形成复合物。
本文所述的组合物、半固体支持物和固体支持物适用于多种用途，包括制药、兽医、化妆品、药物化妆品或用于植入或施用到对象上。半固体和固体支持物对于填充组织、矫正组织缺损以及密封伤口是有用的。类似地，为组织基质的组合物可用于填充组织、矫正组织缺损以及密封伤口。
可通过注射、植入、喷雾、擦拭、浇(pouring)、涂或接触来施用本文所述的组合物、固体支持物或半固体支持物。
本公开内容还涵盖包含通过本文所述的方法分离、提取或产生的蛋白质的医疗装置。术语“医疗装置”涵盖管理机构归类为医疗装置的任何物质组合。因此，该术语可涵盖绷带和其他敷料、缝线、植入物、注射器、支架、无针头喷射器和起搏器等。
试剂盒
本公开内容还提供了与用于本文所述的方法的说明书一起包装的包含羧酸的试剂盒。
在一个实例中，试剂盒还包含用于产生表达待提取的可溶性蛋白质之微生物群体的微生物。
在另一个实例中，试剂盒包含产生表达待提取的可溶性蛋白质之微生物群体的微生物和通过执行本文所述的方法提取蛋白质的说明书。
在另一个实例中，试剂盒包含通过执行本公开内容的方法中提取的蛋白质。
在另一个实例中，试剂盒包含根据本公开内容的固体支持物或半固体支持物或医疗装置。
实施例
以下的实施例证明不同的羧酸可用于从微生物(例如，大肠杆菌)提取可溶性蛋白质(例如，重组可溶性蛋白质)。
实施例1：用于提取重组蛋白质的不同方法的比较
测试了使用羧酸、正丙醇或尿素的方案从细菌细胞提取pI为约7.5且MW为约72kDa的重组蛋白质的能力。
经测试的提取方案为：
1.100mM(0.57％(体积/体积))乙酸(室温)；
2.100mM乙酸(0.57％(体积/体积))(在4℃)；
3.2.2M(10％(重量/体积))甲酸(4℃)；
4.60％正丙醇；
5.15mM NaOH；和
6.尿素提取溶液。
表3示出了用每种溶液处理的细胞的重量。
表3：处理组
处理 细胞的重量
100mM(0.57％(体积/体积))乙酸(室温) 1.14g
100mM乙酸(0.57％(体积/体积))(在4℃) 1.22g
2.2M(10％(重量/体积))甲酸(4℃) 1.32g
60％正丙醇 1.23g
15mM NaOH 1.26g
尿素提取溶液 1.32g
向1g(湿重)细胞添加5mL溶液并混合1小时。然后使用离心沉淀溶液并回收上清液。
将用15mM NaOH处理的细胞孵育15分钟，之后添加100μL 1M硼酸盐(pH 8.0)以将pH调节至约8.0，并使该溶液达到约20mM硼酸盐。
在处理后，使用hemovac干燥10μL的正丙醇提取液并重悬浮于13μL的十二烷基硫酸锂(LDS)样品缓冲液中以加载到4-12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上。对于所有其他样品，将10μL的上清液与3μL LDS样品缓冲液混合，并加载到凝胶上。结果在图1中示出。
结果表明NaOH或0.57％(体积/体积)乙酸没有显著程度地将重组蛋白质溶解。甲酸提取液特异性溶解蛋白质，正丙醇也一样。尿素溶解了许多细胞蛋白质导致图1的过载结果。尿素的结果也可能受到预期溶解的大量核酸的不利影响。
实施例2：重组蛋白质的乙酸提取
如实施例1中所证明的，可使用甲酸从大肠杆菌提取重组蛋白质。乙酸类似于甲酸，到目前为止乙酸是相对较弱的羧酸。乙酸还是廉价的，其储存、处理和处置是安全的。因此，测试了乙酸从大肠杆菌提取实施例1中所述的重组蛋白质。
在2％(体积/体积)，pH 2.71；5％(体积/体积)，pH值2.47；和10％(体积/体积)，pH2.22条件下测试了乙酸。
如下溶解细胞：
2％乙酸：1.12g(湿)细胞糊(cell paste)+5mL 2％(体积/体积)乙酸。
5％乙酸：1.01g(湿)细胞糊+5mL 5％(体积/体积)乙酸。
10％乙酸：1g(湿)细胞糊+5mL 10％(体积/体积)乙酸。
脲：1.08g(湿)细胞糊+5mL尿素缓冲液。
将样品进行涡旋并用刮铲(spatula)破坏细胞糊以使其混合。然后将样品置于旋转混合器上混合约1.5小时。从每种样品中取出1mL的样品，并通过在EppendorfTM台式离心机中在14,000rpm下离心沉淀。取出10μL的上清液用于通过SDS-PAGE分析进行分析。结果示于图2。
SDS-PAGE分析表明乙酸溶解对于蛋白质是非常特异的，即来自细胞的其他蛋白质没有很大程度的溶解。这与用尿素提取相反。
离心后，乙酸提取溶解易于沉淀且上清液的颜色为浅黄色。与此相反，在尿素提取和离心后，上清液为暗黄色且具有软的或“粘稠”的颗粒状物。
HPLC分析表明在色谱图上用2％(体积/体积)、5％(体积/体积)或10％(体积/体积)乙酸洗脱提取的重组蛋白质与对照蛋白(即，使用另一种方法产生的)在相同的点上。这些数据表明正确形成了该蛋白质并且不会出现被酸提取破坏。
HPLC和SDS-PAGE两项分析表明10％乙酸提取比5％提取产生更多的重组蛋白质，并且5％提取比2％提取产生更多。此外，乙酸提取的蛋白质比用尿素提取的蛋白质基本上更纯(如通过HPLC分析判断的用10％乙酸提取的70.6％纯度相对于尿素提取的48.6％纯度)。
实施例3：乙酸提取条件的表征
为了确定乙酸浓度、孵育时间和溶解比率(mL酸∶g湿细胞)的影响，开发了Box-Behnken设计。考虑的因素有：
乙酸浓度(％体积/体积)：最小值＝10％，最大值＝25％
孵育时间(小时)：最小值＝1，最大值＝5
溶解比率(mL酸/g湿细胞)：最小值＝1，最大值＝9
测试的变量在表4中列出。
表4.试验设计
将所有的反应物均进行涡旋，并用玻璃巴斯德移液管将粘附到反应管的任何细胞块混合，之后放置在旋转混合器上持续反应时间。
对反应1进行取样，然后返回旋转混合器再持续19小时。
在取样之前涡旋反应物以确保溶液完全混合。在每个时间点，从反应中取出1mL的溶液，在EppendorfTM离心机中以14000rpm离心4分钟，取出约500μL的上清液并储存，之后通过HPLC进行分析。结果总结于表5中。
表5.提取的结果
结果还示于图3和4中。
结果表明乙酸在不同时间长度的孵育后能够提取重组蛋白质，并且孵育时间基本上不影响回收或纯度。因此，这些结果证明，在所测试条件下细胞的裂解和/或蛋白质提取快速发生，即，在1小时的裂解和/或提取水平类似于在3、5或20小时的水平。这似乎违反直觉，原因是预期更长的孵育时间将导致更高水平的细胞裂解。结果还证明乙酸浓度和溶解比率对产率(浓度：估计的回归系数0.22；p＜0.005；比率：估计的回归系数0.16，p＜0.05)和纯度(浓度：估计的回归系数12.05；p＜0.005，比率：估计的回归系数13.65，p＜0.005)具有最强的影响。纯度和产率两者随浓度和溶解比率的增加而增加。
实施例4：乙酸的量对蛋白质回收率和纯度的影响
进行测定以确定不同的乙酸浓度和提取时间对从大肠杆菌提取的重组蛋白质的量和蛋白质的纯度的影响。测定了实施例1中表达相同蛋白质的细胞。
使提取(使用乙酸浓度(％)：25％、37.5％、50％、62.5％、75％、87.5％、100％)进行完全(即，过夜提取20±4小时)。然后通过RP-HPLC分析上清液以及通过与参考标准的峰面积和纯度进行比较来测定提取的重组蛋白质的量和产生的纯度。
图5示出的SDS-PAGE分析表明，增加提取的乙酸浓度增加了重组蛋白质的水平，但是提取的污染物水平也增加。
使用RP-HPLC对提取物进行分析的结果示于表6中，这些数据表明，高于约62.5％时，纯度开始降低。
表6：在过夜孵育后，如通过RP-HPLC分析的乙酸浓度对从大肠杆菌细胞提取重组蛋白质的影响
表6中列出的数据在图6中以图形示出，其示出乙酸浓度与重组蛋白质的产率之间的相关性以及一旦达到阈值浓度，乙酸浓度与纯度之间逆相关。
在多个时间点(5分钟、10分钟、20分钟、40分钟和60分钟)取样100μL如上所述制备的反应物，立即离心并取出上清液。通过RP-HPLC分析上清液，并与参考标准进行比较以确定量和纯度。该分析的结果在表7和8以及图7中示出。还进行SDS-PAGE分析以提供比较产生的蛋白质的纯度的正交方法，结果示于图8中。
表7：在5分钟、10分钟、20分钟、40分钟和60分钟孵育后，乙酸浓度对从大肠杆菌细胞提取重组蛋白质的影响
表8：在5分钟、10分钟、20分钟、40分钟和60分钟孵育后，乙酸浓度对从大肠杆菌细胞提取的重组蛋白质之纯度的影响
实施例5：使用乙酸提取融合蛋白
培养、收获并冷冻表达融合蛋白的细菌细胞，所述融合蛋白包含肽的三个拷贝且pI为约4.6。然后裂解细胞或通过使细胞与25％乙酸(体积/体积)的溶液接触1小时来提取融合蛋白，离心并收集上清液。所得组合物的SDS-PAGE分析在图9中示出。这些数据表明，用乙酸进行提取基本上降低了宿主细胞蛋白质的污染。这些数据还说明，本文所述的提取方法适用于融合蛋白和/或具有酸性pI的蛋白质。

Claims (38)

1.用于从微生物群体提取可溶性蛋白质的方法，所述方法包括使表达所述可溶性蛋白质的微生物群体与一定量的溶液接触，所述溶液包含有效地从所述微生物群体提取所述可溶性蛋白质的约1％(体积/体积)至小于50％(体积/体积)的羧酸。
2.权利要求1所述的方法，其中所述溶液包含约1％(体积/体积)至约40％(体积/体积)的羧酸。
3.权利要求1所述的方法，其中所述溶液包含约25％(体积/体积)至约37.5％(体积/体积)的羧酸。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中以约1∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)至约20∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)的溶解比率添加所述羧酸。
5.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中以约5∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)至约10∶1(酸的毫升数∶微生物(湿)的克数)的溶解比率添加所述羧酸。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述羧酸的pKa为至少约3。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述羧酸是乙酸或甲酸。
8.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述羧酸是乙酸。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其包括使所述微生物群体与所述溶液接触约5小时或更少。
10.权利要求1至8中任一项所述的方法，其包括使所述微生物群体与所述溶液接触约1小时或更少。
11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其还使所述微生物群体与洗涤剂接触。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述可溶性蛋白质是由所述微生物群体重组表达的。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述微生物群体是细菌、酵母或真菌。
14.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述微生物群体是细菌。
15.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述微生物群体是革兰氏阴性细菌。
16.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述微生物群体是大肠杆菌(Escherichia coli)。
17.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述可溶性蛋白质具有当从所述微生物群体中提取所述蛋白质时允许所述蛋白质在所述溶液中保持可溶的pI。
18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述可溶性蛋白质的pI为7.5或更大。
19.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述可溶性蛋白质的pI为6或更小。
20.权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述蛋白质选自：硬蛋白、利尿钠肽、伴侣蛋白、热休克蛋白、白细胞介素、干扰素、融合蛋白和包含抗体之可变结构域的蛋白。
21.用于从微生物群体纯化可溶性蛋白质的方法，所述方法包括执行权利要求1至20中任一项所述的方法以及纯化由所述方法提取的所述可溶性蛋白质。
22.权利要求的21所述的方法，其还包括将所述可溶性蛋白质与另一种化合物混合。
23.权利要求1至22中任一项所述的方法，其还包括修饰经纯化的或经提取的蛋白质。
24.用于产生经修饰的蛋白质的方法，所述方法包括获得通过权利要求21至23中任一项所述的方法纯化的蛋白质和修饰所述蛋白质，或者获得通过权利要求1至20中任一项所述的方法提取的蛋白质和修饰所述蛋白质。
25.权利要求23或24所述的方法，其中修饰所述蛋白质包括使另一种化合物与所述蛋白质缀合。
26.权利要求21至25中任一项所述的方法，其还包括将所述蛋白质配制成组合物。
27.权利要求21至25中任一项所述的方法，其还包括将所述蛋白质固定到固体支持物或半固体支持物上或者固体支持物或半固体支持物中。
28.用于产生组合物的方法，所述方法包括获得通过权利要求1至25中任一项所述的方法提取、纯化或产生的蛋白质以及将所述蛋白质配制成组合物。
29.用于产生固体或半固体支持物的方法，所述方法包括获得通过权利要求1至25中任一项所述的方法提取、纯化或产生的蛋白质，以及将所述蛋白质固定到固体支持物或半固体支持物上或者固体支持物或半固体支持物中。
30.权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述组合物、固体支持物或半固体支持物是用于向人或非人动物施用或应用，或者在人或非人动物上施用或应用。
31.权利要求26至31中任一项所述的方法，其中所述组合物、固体支持物或半固体支持物是用于制药用途、化妆品用途、药物化妆品用途、兽医用途或用于植入。
32.通过执行包括执行权利要求1至31中任一项所述的方法的过程产生的蛋白质、组合物、固体支持物或半固体支持物。
33.权利要求32所述的蛋白质、组合物、固体支持物或半固体支持物，其用于医学。
34.权利要求32所述的蛋白质、组合物、固体支持物或半固体支持物，其用于药物用途、化妆品用途、药物化妆品用途、兽医用途或用于植入。
35.治疗病症的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用权利要求32所述的蛋白质、组合物、固体支持物或半固体支持物。
36.权利要求32所述的蛋白质、组合物、固体支持物或半固体支持物在制造用于治疗病症的药物中的用途。
37.装置，其包含权利要求32所述的蛋白质、组合物、固体支持物或半固体支持物。
38.权利要求35所述的装置，其是注射器、贴剂或植入物。
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