JP2020065479A - 細胞画像解析方法、細胞画像解析プログラム、及び細胞画像解析装置 - Google Patents

Abstract

【課題】細菌の種類を同定したり、細菌の薬剤感受性を調べたりするために、細菌の面積変化だけでなく細菌の形状の情報や分布の情報を用いることができる方法の提供。【解決手段】細胞の画像を取得する画像取得過程と、画像取得過程において取得された画像のフラクタル次元を算出する算出過程と、算出過程において算出されたフラクタル次元に基づいて画像に撮像されている細胞の状態を判定する判定過程とを備える方法、細胞画像解析プログラム、及び細胞画像解析装置。【選択図】図４

Description

本発明は、細胞画像解析方法、細胞画像解析プログラム、及び細胞画像解析装置に関する。

細菌の形状や増殖の状態、また薬剤を加えたときに細菌に生じる現象に基づいて、細菌の種類を同定したり、細菌の薬剤感受性を調べたりすることが行われている。例えば、細菌の大きさや形態、凝集体の様子を観察することや、特定の薬剤を加えたときの細菌の増殖の有無に基づいて、細菌の種類を同定することができる。また、薬剤の濃度を様々に変えて細菌の増殖の有無を観察することにより、その薬剤における細菌の感受性度合を調べることもできる。
従来、顕微鏡観察において細菌の増殖の有無を観察するために、顕微鏡画像における細菌の画像の面積の変化を検出する方法が用いられている。また、細菌が撮像されている画像のフラクタル次元を算出することにより、細菌の増殖の様子を捉える方法も提案されている（特許文献１）。しかし、同文献には、面積の変化からわかる情報がフラクタル次元でも捉えられることが記載されているにすぎず、同文献は、面積に代えてフラクタル次元を用いることを提案するものである。

特表２０１４−５０４８８２号公報

しかしながら、面積変化のみに基づいた顕微鏡画像の解析では、細菌が分裂して増殖し細菌の数が増加することにより細菌の画像の面積が増加する場合と、細菌が伸びるなどして細菌の個体毎の面積が増加する場合とを判別することができない。また、同じ面積の場合、細菌が凝集しているのか、分散しているのかも判別できない。細菌はその種類により形態や増殖の様子が異なり、特定の薬剤に対する反応も固有である。そのため、細菌の種類を同定したり、細菌の薬剤感受性を調べたりするために、細菌の面積変化だけでなく細菌の形状の情報や分布の情報を用いることが有益である。また細菌の種類や薬剤感受性の情報は、医療における迅速な病原体の検出や細菌を使った食品などにおける迅速な品質管理において重要であることから、細菌の形状の情報や分布の情報もより高速に求めることが求められている。

本発明は上記の点に鑑みてなされたものであり、細胞の形状の情報や分布の情報を高速に求めることができる細胞画像解析方法、細胞画像解析プログラム、及び細胞画像解析装置を提供する。

本発明の一実施態様は、細胞の画像を取得する画像取得過程と、前記画像取得過程において取得された前記画像のフラクタル次元を算出する算出過程と、前記算出過程において算出された前記フラクタル次元に基づいて前記画像に撮像されている細胞の状態を判定する判定過程とを備える細胞画像解析方法である。

本発明の一実施態様は、コンピュータに、細胞の画像を取得する画像取得ステップと、細胞が撮像された画像を取得する画像取得ステップと、前記画像取得ステップにおいて取得された前記画像のフラクタル次元を算出する算出ステップと、前記算出ステップにおいて算出された前記フラクタル次元に基づいて前記画像に撮像されている細胞の状態を判定する判定ステップとを実行させるための細胞画像解析プログラムである。

本発明の一実施態様は、細胞の画像を取得する画像取得部と、前記画像取得部によって取得された前記画像のフラクタル次元を算出するフラクタル次元算出部と、前記フラクタル次元算出部によって算出された前記フラクタル次元に基づいて前記画像に撮像されている細胞の状態を判定する判定部と、を備える細胞画像解析装置である。

本発明の第１の実施形態に係る第１細胞画像の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る第２細胞画像の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る細胞画像解析装置の構成の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る細胞画像解析装置の処理の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係るフラクタル次元の算出方法の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係るフラクタル次元の算出結果の第１例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係るフラクタル次元の算出結果の第２例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係るフラクタル次元の時間変化の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係るフラクタル次元の算出方法の第２例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る第１の半径をもつ円を用いた相関積分の算出の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る第２の半径をもつ円を用いた相関積分の算出の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る第３の半径をもつ円を用いた相関積分の算出の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る第４の半径をもつ円を用いた相関積分の算出の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る第５の半径をもつ円を用いた相関積分の算出の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係るフラクタル次元の算出結果の第３例を示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る細胞画像解析装置の構成を示す概略ブロック図である。 本発明の第２の実施形態に係る細胞画像解析装置の処理の一例を示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る異なる菌種に対するフラクタル次元の時間変化の一例を示す図である。 従来の方法による細胞の面積の時間変化の一例を示す図である。 従来の方法による異なる菌種に対する面積の時間変化の一例を示す図である。

（第１の実施形態）
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について詳しく説明する。
図１は、本実施形態に係る第１細胞画像Ｐ１０の一例を示す図である。第１細胞画像Ｐ１０とは、位相差顕微鏡により第１細胞がタイムラプス撮影された画像である。第１細胞とは、一例として、アンピシリン（ＡＢＰＣ）が１μｇ／ｍＬだけ加えられた大腸菌である。第１細胞Ｃ１とは、第１細胞が撮像された画像である。
第１拡大細胞画像Ｐ１１は、第１細胞画像Ｐ１０の第１領域Ｒ１を拡大して得られる画像である。拡大された第１細胞Ｃ１から、第１細胞が分裂して増加していることがわかる。
なお、本実施形態において細胞画像とは、撮像された細胞の像が画素の集まりによって表現されたもののことである。

図２は、本実施形態に係る第２細胞画像Ｐ２０の一例を示す図である。第２細胞画像Ｐ２０とは、位相差顕微鏡により第２細胞がタイムラプス撮影された画像である。第２細胞とは、一例として、アンピシリン（ＡＢＰＣ）が２μｇ／ｍＬだけ加えられた大腸菌である。第２細胞Ｃ２とは、第２細胞が撮像された画像である。
第２拡大細胞画像Ｐ２１は、第２細胞画像Ｐ２０の第２領域Ｒ２を拡大して得られる画像である。拡大された第２細胞Ｃ２から、第２細胞Ｃ２では伸長した細胞が第１細胞Ｃ１より多いことがわかる。

図３は、本実施形態に係る細胞画像解析装置２の構成の一例を示す図である。
画像供給部１は、細胞画像解析装置２に細胞画像を供給する。画像供給部１とは、例えば、位相顕微鏡の撮像部である。
細胞画像解析装置２は、画像供給部１が供給する細胞画像のフラクタル次元に基づいて、この細胞画像に撮像されている細胞の成長の状態を判定する。
提示部３は、細胞画像解析装置２が判定した結果を提示する。提示部３とは、例えば、ディスプレイである。

[細胞画像解析装置の構成]
細胞画像解析装置２の具体的な構成について説明する。細胞画像解析装置２は、画像取得部２０と、画像処理部２１と、フラクタル次元算出部２２と、状態判定部２３と、判定結果出力部２４とを備える。

画像取得部２０は、画像供給部１が供給する細胞画像を取得する。画像取得部２０は、取得した細胞画像を画像処理部２１に供給する。
画像処理部２１は、画像取得部２０が供給する細胞画像から、二値化処理により二値化された細胞画像を生成する。画像処理部２１は、生成した二値化された細胞画像をフラクタル次元算出部２２に供給する。
フラクタル次元算出部２２は、画像処理部２１から取得した二値化された細胞画像のフラクタル次元を算出する。フラクタル次元算出部２２がフラクタル次元を算出する具体的な方法については後述する。フラクタル次元算出部２２は、算出したフラクタル次元を状態判定部２３に供給する。

状態判定部２３は、フラクタル次元算出部２２から取得したフラクタル次元に基づいて細胞画像に撮像されている細胞の状態を判定する。ここで、細胞の状態とは、例えば、細胞の分裂、細胞の大きさ、細胞の凝集若しくは分散などである。状態判定部２３は、例えば、細胞画像に撮像されている細胞が分裂して増加しているのか、伸長しているのかを判定する。
状態判定部２３は、判定した結果を判定結果出力部２４に供給する。
判定結果出力部２４は、状態判定部２３が判定した結果を提示部３に供給する。

[細胞の成長の状態の判定処理]
細胞画像解析装置２の処理の詳細について説明する。
図４は、本実施形態に係る細胞画像解析装置２の処理の一例を示す図である。

画像取得部２０は、画像供給部１が供給する細胞画像を取得する（ステップＳ１００）。画像取得部２０は、取得した細胞画像を画像処理部２１に供給する。

画像処理部２１は、画像取得部２０が供給する細胞画像を取得する。画像処理部２１は、取得した細胞画像に対して二値化処理を行う（ステップＳ１０１）。画像処理部２１は、既知の二値化処理により二値化された細胞画像を生成する。画像処理部２１は、生成した二値化された細胞画像をフラクタル次元算出部２２に供給する。

フラクタル次元算出部２２は、画像処理部２１が供給する二値化された細胞画像を取得する。フラクタル次元算出部２２は、取得した二値化された細胞画像のフラクタル次元を、画像取得部２０が取得した細胞画像のフラクタル次元として算出する（ステップＳ１０２）。フラクタル次元算出部２２は、細胞画像を構成する複数の部分領域のうち、細胞の画像（第１細胞Ｃ１、第２細胞Ｃ２）が存在する部分領域の数に基づいてフラクタル次元を算出する。フラクタル次元算出部２２は、算出したフラクタル次元を状態判定部２３に供給する。
ここで、図５〜図７を参照し、フラクタル次元算出部２２のフラクタル次元の算出方法の詳細について説明する。

[フラクタル次元の算出方法]

図５は、本実施形態に係るフラクタル次元の算出方法の一例を示す図である。
フラクタル次元算出部２２は、一例として、ボックス次元をフラクタル次元として算出する。ここでボックス次元とは、ボックス次元を求める対象である図形を含む空間を所定のサイズをもつ格子に分割するとき、この格子のうち、ボックス次元を求める対象である図形の一部を含む格子の数がいくつになるかを考えるものである。

フラクタル次元算出部２２は、一例として、ボックスカウント法を用いてボックス次元を算出する。なお、フラクタル次元算出部２２は、後述するように相関次元を用いてフラクタル次元を算出してもよい。つまり、ステップＳ１０２の算出過程において、フラクタル次元算出部２２は、ボックスカウント法又は相関次元によりフラクタル次元を算出する。

ここでフラクタル次元を算出する際の計算速度は、ボックス次元を算出する場合の方が、その他の方法によって算出する場合に比べて速い。その他の方法とは、例えば、相関次元を算出する方法である。相関次元を算出する方法については後述する。つまり、フラクタル次元を算出する際、ボックス次元は計算速度の点で他の方法に比べて有利である。

画像Ｐ５１のフラクタル次元を求める場合を例として、ボックスカウント法について説明する。画像Ｐ５１は１辺の長さが２００の正方形の画像であり、二値化された正方形による格子模様が描かれている。
画像Ｐ５１の１辺の２分の１倍の長さをもつ正方形の部分領域により画像Ｐ５１を分割し、画像Ｐ５２を得る。画像Ｐ５２は４つの正方形の部分領域に分割されている。これらの４つの正方形の部分領域のうち、白の画素が含まれている正方形の部分領域（ボックス）の個数を数える。正方形の部分領域の１辺の長さを長さδとし、白の画素が含まれている正方形の部分領域の個数を個数Ｎ（δ）とする。画像Ｐ５２では、長さδは１００、個数Ｎ（δ）は４となる。
同様に画像Ｐ５２の１辺の２分の１倍の長さをもつ正方形の部分領域により画像Ｐ５２を分割し、画像Ｐ５３を得る。画像Ｐ５３では、長さδは５０、個数Ｎ（δ）は１６となる。
同様に画像Ｐ５３の１辺の２分の１倍の長さをもつ正方形の部分領域により画像Ｐ５３を分割し、画像Ｐ５４を得る。画像Ｐ５４では、長さδは２５、個数Ｎ（δ）は３２となる。
ボックスカウント法では、部分領域の面積が１個の細胞の面積より小さくなるまで以上の操作を繰り返す。以上の操作を繰り返した結果、長さδと個数Ｎ（δ）との複数の組が得られる。個数Ｎ（δ）の対数を、長さδの対数にマイナス１を乗じた数に対して描いたグラフを、直線により近似する。ボックスカウント法では、この直線の傾きをフラクタル次元（ボックス次元）として求める。

上述したように、ボックスカウント法では、画像を二値化する工程と、二値化された画像を部分領域に分割する工程と、分割された部分領域内の二値化に用いられる二値のうちの一方の値に対応する画素を数える工程と、を含む。ボックスカウント法では、部分領域の面積が一細胞の画像の面積より小さくなるまで、分割する工程と、数える工程とを繰り返す。

フラクタル次元の算出結果の具体例について説明する。
図６は、本実施形態に係るフラクタル次元の算出結果の第１例を示す図である。図６では、ボックスカウント法を用いて画像Ｐ６１のフラクタル次元を算出した例である。画像Ｐ６１の１辺の長さは２００である。画像Ｐ６１を部分領域に分割してゆき得られた長さδと個数Ｎ（δ）との複数の組から、グラフＧ６１が描かれる。ただし、図６に示す例では、グラフＧ６１が原点を通るように縦軸を調整している。グラフＧ６１を直線Ｌ６１により近似すると、直線の傾きは１．７８５７となる。したがって、画像Ｐ６１のフラクタル次元は、１．７８５７となる。

図７は、本実施形態に係るフラクタル次元の算出結果の第２例を示す図である。図７では、ボックスカウント法を用いて画像Ｐ７１のフラクタル次元を算出した例である。画像Ｐ７１の１辺の長さは２００である。画像Ｐ７１を部分領域に分割してゆき得られた長さδと個数Ｎ（δ）との複数の組から、グラフＧ７１が描かれる。ただし、図７に示す例では、グラフＧ６１が原点を通るように縦軸を調整している。グラフＧ７１を直線Ｌ７１により近似すると、直線の傾きは１．５７１４となる。したがって、画像Ｐ７１のフラクタル次元は、１．５７１４となる。

画像Ｐ６１（図６）の白い画素が占める面積と画像Ｐ７１（図７）の白い画素が占める面積とは等しいが、フラクタル次元は異なっている。画像Ｐ６１（図６）と画像Ｐ７１（図７）とを比較すると、画像Ｐ６１（図６）の方が白い画素はより均一に散らばっている。白い画素が均一に散らばっている画像Ｐ６１（図６）の方が、画像Ｐ７１（図７）よりもフラクタル次元は大きくなる。

ここで、フラクタル次元算出部２２が細胞画像のフラクタル次元を算出した結果について説明する。
図８は、本実施形態に係るフラクタル次元の時間変化の一例を示す図である。
フラクタル次元算出部２２は、細胞画像のフラクタル次元を、位相差顕微鏡により第１細胞または第２細胞がタイムラプス撮影されてからの所定時間毎に算出する。図８では、一例として、位相差顕微鏡により細胞画像がタイムラプス撮影されてから３６０分が経過するまでの細胞画像のフラクタル次元が所定時間毎に示されている。第１グラフＧ８１は第１細胞Ｃ１のフラクタル次元を示す。第２グラフＧ８２は第２細胞Ｃ２のフラクタル次元を示す。

領域Ｒ８０では、第１グラフＧ８１が示すフラクタル次元と、第２グラフＧ８２が示すフラクタル次元とに有意な差がみられる。領域Ｒ８０は、位相差顕微鏡によりタイムラプス撮影が開始されてから２４０分程度が経過した時間から３６０分程度が経過した時間までの期間に対応する。フラクタル次元を比較すると、第１細胞と第２細胞との間に有意な差がみられる。

ただし、タイムラプス撮影が開始されてから２４０分程度までは、フラクタル次元の差は、第１細胞Ｃ１と、及び第２細胞Ｃ２との初期条件の違いの影響を受けていると考えられる。タイムラプス撮影が開始されてから２４０分程度が経過した時間では、第１細胞Ｃ１、及び第２細胞Ｃ２への初期条件の違いの影響は無視できると考えられる。つまり、領域Ｒ８０では、第１細胞の状態と第２細胞の状態との間の違いがフラクタル次元の差として現れていると考えられる。

ここで本実施形態との比較のために、図１９を参照し、図１の第１細胞Ｃ１の面積と、図２の第２細胞Ｃ２の面積とを比較する。
図１９は、従来の方法による細胞の面積の時間変化の一例を示す図である。第３グラフＧ１９１とは、位相差顕微鏡により第１細胞がタイムラプス撮影されてからの時間毎の第１細胞Ｃ１の面積を示すグラフである。第４グラフＧ１９２とは、位相差顕微鏡により第２細胞がタイムラプス撮影されてからの時間毎の第２細胞Ｃ２の面積を示すグラフである。
領域Ｒ１９では、第３グラフＧ１９１が示す面積と、第４グラフＧ１９２が示す面積とに有意な差はみられない。領域Ｒ１９は、位相差顕微鏡によりタイムラプス撮影が開始されてから２４０分程度が経過した時間に対応する。
したがって、分裂して増加している第１細胞の画像である第１細胞Ｃ１の面積と、伸長している第２細胞の画像である第２細胞Ｃ２の面積には有意な差はみられない。面積のみを測定したのでは、細胞が分裂して増加しているのか、伸長しているのかを区別することは難しい。

図４に戻って、細胞画像解析装置２の処理の説明を続ける。
状態判定部２３は、フラクタル次元算出部２２が算出した細胞画像のフラクタル次元を取得する。状態判定部２３は、フラクタル次元算出部２２が算出したフラクタル次元に基づいて細胞画像に撮像されている細胞の状態を判定する（ステップＳ１０３）。状態判定部２３は、例えば、細胞の分裂、細胞の大きさ、細胞の凝集若しくは分散、および／または細胞の薬剤感受性を細胞の状態として判定する。

状態判定部２３は、細胞画像のフラクタル次元と、閾値とを比較することにより細胞画像に撮像されている細胞の成長の状態を判定する。ここで、閾値は細胞の種類ごとに予め設定される。状態判定部２３は、細胞画像のフラクタル次元が閾値よりも大きい場合、細胞画像に撮像されている細胞が分裂して増加している、もしくは分散していると判定する。一方、状態判定部２３は、細胞画像のフラクタル次元が閾値よりも小さい場合、細胞画像に撮像されている細胞が伸長している、もしくは凝集していると判定する。
状態判定部２３は、判定結果を判定結果出力部２４に供給する。

判定結果出力部２４は、状態判定部２３から判定結果を取得する。判定結果出力部２４は、取得した判定結果を提示部３に供給する。提示部３は、判定結果出力部２４から供給される判定結果を出力する（ステップＳ１０４）。

なお、ステップＳ１０３の判定過程において、状態判定部２３は、フラクタル次元に加え、細胞画像における細胞の画像の面積に基づいて細胞の状態を判定してもよい。

[まとめ]
以上に説明したように、本実施形態に係る細胞画像解析装置２の細胞画像解析方法は、画像取得過程（ステップＳ１００）と、算出過程（ステップＳ１０２）と、判定過程（ステップＳ１０３）とを備える。
画像取得過程（ステップＳ１００）では、細胞の画像を取得する。
算出過程（ステップＳ１０２）では、画像取得過程（ステップＳ１００）において取得された細胞画像のフラクタル次元を算出する。
判定過程（ステップＳ１０３）では、算出過程（ステップＳ１０２）において算出されたフラクタル次元に基づいて細胞画像に撮像されている細胞の状態を判定する。

この構成により、本実施形態に係る細胞画像解析装置２の細胞画像解析方法では、細胞画像のフラクタル次元に基づいて細胞画像に撮像されている細胞の状態を判定することができるため、細胞の形状の情報や分布の情報を高速に求めることができる。このため、本実施形態に係る細胞画像解析装置２の細胞画像解析方法では、菌の薬剤耐性の確認をラべリング処理を行う場合に比べて短時間で行うことができる。本実施形態に係る細胞画像解析装置２の細胞画像解析方法では、菌の薬剤耐性の確認を、例えば６時間程度で行うことができる。

また、本実施形態に係る細胞画像解析装置２の細胞画像解析方法では、判定過程（ステップＳ１０３）では、フラクタル次元に加え、細胞の画像（第１細胞画像Ｐ１０や第２細胞画像Ｐ２０）における細胞（第１細胞Ｃ１や第２細胞Ｃ２）の画像の面積に基づいて細胞（第１細胞Ｃ１や第２細胞Ｃ２）の状態を判定する。
この構成により、本実施形態に係る細胞画像解析装置２の細胞画像解析方法では、細胞の画像における細胞の面積に基づいて細胞の状態を判定できるため、フラクタル次元のみに基づいて細胞の状態を判定する場合に比べて判定の精度を高めることができる。

また、本実施形態に係る細胞画像解析装置２の細胞画像解析方法では、判定過程（ステップＳ１０３）において、細胞の分裂、細胞の大きさ、細胞の凝集若しくは分散、および／または細胞の薬剤感受性を細胞の成長の状態として判定する。
この構成により、本実施形態に係る細胞画像解析装置２の細胞画像解析方法では、細胞画像のフラクタル次元に基づいて、細胞画像に撮像されている細胞の分裂、細胞の大きさ、細胞の凝集若しくは分散、および／または細胞の薬剤感受性を判定することができる。

また、本実施形態に係る細胞画像解析装置２の細胞画像解析方法では、算出過程（ステップＳ１０２）において、ボックスカウント法又は相関次元によりフラクタル次元を算出する。
この構成により、本実施形態に係る細胞画像解析装置２の細胞画像解析方法では、ボックスカウント法又は相関次元を用いない場合に比べてフラクタル次元の計算速度を速くできる。

また、本実施形態に係る細胞画像解析装置２の細胞画像解析方法では、ボックスカウント法は、画像（第１細胞画像Ｐ１０や第２細胞画像Ｐ２０）を二値化する工程と、二値化された画像（第１細胞画像Ｐ１０や第２細胞画像Ｐ２０）を領域（部分領域）に分割する工程と、分割された領域（部分領域）内の二値化に用いられる二値のうちの一方の値に対応する画素を数える工程と、を含み、領域（部分領域）の面積が一細胞の画像の面積より小さくなるまで、分割する工程と、数える工程とを繰り返す。
この構成により、本実施形態に係る細胞画像解析装置２の細胞画像解析方法では、領域（部分領域）の面積が一細胞の画像の面積より小さくなるまで繰り返さない場合に比べて、ボックス次元の算出の精度を高くできる。

［変形例］
なお、本実施形態では、フラクタル次元算出部２２がボックスカウント法を用いて細胞画像のフラクタル次元を算出する場合について説明したが、フラクタル次元算出部２２は、ボックスカウント法以外の方法を用いて細胞画像のフラクタル次元を算出してもよい。
フラクタル次元算出部２２は、例えば、フラクタル次元として相関次元を算出してもよい。相関次元は相関次元法によって算出することができる。

ここでフラクタル次元を算出する際の計算速度は、相関次元を算出する場合の方が、上述したボックス次元を除けばその他の方法によって算出する場合に比べて速い。つまり、フラクタル次元を算出する際、相関次元は計算速度の点でボックス次元を除けば他の方法に比べて有利である。

相関次元法では、まず、式（１）を用いて、任意の点における半径ｒの超球に対して相関積分Ｃ（ｒ）の値を計算する。

ここで、整数Ｍは、フラクタル次元を求める対象となる図形（図形Ａと呼ぶ）を構成する点の数である。位置ベクトルＰ_ｉ、及び位置ベクトルＰ_ｊは、図形Ａを構成する点の位置を示す位置ベクトルである。式（１）では、図形Ａを構成する任意の点を中心とする半径ｒの超球内に含まれる、図形Ａを構成する点の数を数えている。式（１）では、この操作を、図形Ａを構成する全ての点について、半径ｒの超球の中心となる点として選んでゆき、繰り返したときの和を規格化した値を算出している。本実施形態においては、半径ｒの超球は半径ｒの円である。
半径ｒの対数に対する相関積分Ｃ（ｒ）の対数をグラフにしたときのグラフを直線により近似した場合の傾きが相関次元となる。ここで、図９を参照し、フラクタル次元として相関次元を算出する場合について説明する。

図９は、本実施形態に係るフラクタル次元の算出方法の第２例を示す図である。本実施形態に係るフラクタル次元では、細胞画像を二値化しラべリング処理した画像を用いて相関次元を算出する。ここでラべリング処理とは、細胞画像に撮像されている細胞の像を、細胞の個体に対応する領域に分ける処理である。分けられた各領域にはラベルが対応づけられる。ラベルが対応づけられた各領域について、代表点を決定する。ここで代表点は、例えばラベルが対応づけられた領域の重心である。

図９では、代表点ＰＴ１〜代表点ＰＴ５に対する相関積分を、円ＣＲ１〜円ＣＲ５を用いて算出する。円ＣＲ１の半径ｒの値は１である。円ＣＲ２の半径ｒの値は２である。円ＣＲ３の半径ｒの値は３である。円ＣＲ４の半径ｒの値は４である。円ＣＲ５の半径ｒの値は５である。
図１０〜図１４を参照し、図９の代表点ＰＴ１〜代表点ＰＴ５に対する相関積分の算出について説明する。

図１０は、第１の半径をもつ円ＣＲ１を用いた相関積分の算出の一例を示す図である。着目点ＲＰ１を中心とする円ＣＲ１には、代表点が含まれていない。着目点ＲＰ２を中心とする円ＣＲ１には、代表点ＰＴ３が含まれている。着目点ＲＰ３を中心とする円ＣＲ１には、代表点ＰＴ２が含まれている。着目点ＲＰ４を中心とする円ＣＲ１には、代表点が含まれていない。着目点ＲＰ５を中心とする円ＣＲ１には、代表点が含まれていない。
従って、円ＣＲ１に含まれる代表点の数は２である。円ＣＲ１を用いた相関積分の値は０．０８となる。

図１１は、第２の半径をもつ円ＣＲ２を用いた相関積分の算出の一例を示す図である。着目点ＲＰ１を中心とする円ＣＲ２には、代表点が含まれていない。着目点ＲＰ２を中心とする円ＣＲ２には、代表点ＰＴ３が含まれている。着目点ＲＰ３を中心とする円ＣＲ２には、代表点ＰＴ２が含まれている。着目点ＲＰ４を中心とする円ＣＲ２には、代表点ＰＴ５が含まれている。着目点ＲＰ５を中心とする円ＣＲ２には、代表点ＰＴ４が含まれている。
従って、円ＣＲ２に含まれる代表点の数は４である。円ＣＲ２を用いた相関積分の値は０．１６となる。

図１２は、第３の半径をもつ円ＣＲ３を用いた相関積分の算出の一例を示す図である。着目点ＲＰ１を中心とする円ＣＲ３には、代表点ＰＴ４が含まれている。着目点ＲＰ２を中心とする円ＣＲ３には、代表点ＰＴ３が含まれている。着目点ＲＰ３を中心とする円ＣＲ３には、代表点ＰＴ２が含まれている。着目点ＲＰ４を中心とする円ＣＲ３には、代表点ＰＴ１と、代表点ＰＴ５とが含まれている。着目点ＲＰ５を中心とする円ＣＲ３には、代表点ＰＴ４が含まれている。
従って、円ＣＲ３に含まれる代表点の数は６である。円ＣＲ３を用いた相関積分の値は０．２４となる。

図１３は、第４の半径をもつ円ＣＲ４を用いた相関積分の算出の一例を示す図である。着目点ＲＰ１を中心とする円ＣＲ４には、代表点ＰＴ４が含まれている。着目点ＲＰ２を中心とする円ＣＲ４には、代表点ＰＴ３が含まれている。着目点ＲＰ３を中心とする円ＣＲ４には、代表点ＰＴ２と、代表点ＰＴ４とが含まれている。着目点ＲＰ４を中心とする円ＣＲ４には、代表点ＰＴ１と、代表点ＰＴ３と、代表点ＰＴ５とが含まれている。着目点ＲＰ５を中心とする円ＣＲ４には、代表点ＰＴ４が含まれている。
従って、円ＣＲ４に含まれる代表点の数は８である。円ＣＲ４を用いた相関積分の値は０．３２となる。

図１４は、第５の半径をもつ円ＣＲ５を用いた相関積分の算出の一例を示す図である。着目点ＲＰ１を中心とする円ＣＲ５には、代表点ＰＴ２と、代表点ＰＴ３と、代表点ＰＴ４と、代表点ＰＴ５とが含まれている。着目点ＲＰ２を中心とする円ＣＲ５には、代表点ＰＴ１と、代表点ＰＴ３と、代表点ＰＴ４とが含まれている。着目点ＲＰ３を中心とする円ＣＲ５には、代表点ＰＴ１と、代表点ＰＴ２と、代表点ＰＴ４とが含まれている。着目点ＲＰ４を中心とする円ＣＲ５には、代表点ＰＴ１と、代表点ＰＴ２と、代表点ＰＴ３と、代表点ＰＴ５とが含まれている。着目点ＲＰ５を中心とする円ＣＲ５には、代表点ＰＴ１と、代表点ＰＴ４とが含まれている。
従って、円ＣＲ５に含まれる代表点の数は１６である。円ＣＲ５を用いた相関積分の値は０．６４となる。

図１５は、本実施形態に係るフラクタル次元の算出結果の第３例を示す図である。図１０〜図１４において説明した相関積分Ｃ（ｒ）の算出結果を用いて、半径ｒの対数に対する相関積分Ｃ（ｒ）の対数をグラフにするとグラフＧ１５１が得られる。グラフＧ１５１を直線Ｌ１５１により近似した場合、直線Ｌ１５１の傾きは１．１８９７である。代表点ＰＴ１〜代表点ＰＴ５を細胞の像が含んでいる細胞画像の相関次元は、１．１８９７となる。

なお、本実施形態においてフラクタル次元として相関次元を算出する場合においては、ラべリング処理を行う場合について説明をしたが、ラべリング処理を行わなくてもよい。ラべリング処理を行わない場合、相関次元は、例えば、細胞の画像に含まれる画素から所定の数だけ画素を選択し、選択された画素のうち細胞画像の部分領域に含まれる画素の数を数える。ここで所定の数は、例えば、部分領域の大きさの２乗に反比例する割合に基づいて決められる。

なお、本実施形態においては、細胞画像がタイムラプス撮影により生成される場合について説明したが、細胞の増殖が十分に進んでいれば、細胞画像はタイムラプス撮影によって生成されていなくてもよい。

（第２の実施形態）
以下、図面を参照しながら本発明の第２の実施形態について詳しく説明する。
上記第１の実施形態では、細胞画像解析装置は、フラクタル次元に基づいて細胞画像に撮像されている細胞の成長の状態を判定する場合について説明をした。本実施形態では、細胞画像解析装置が、フラクタル次元に基づいて細胞の種類を判定する場合について説明をする。本実施形態に係る細胞画像解析装置では、６時間程度の時間で薬剤感受性や細菌の種類の判定を行うことができる。
本発明者らは、分裂した細菌の連なりの仕方が菌種によって異なることに気がつき、細菌の積分面積が同一である場合であっても、分裂した細菌の連なりの仕方を定量的に表現できるフラクタル次元解析を適用することによって菌種同定が可能であることを見出した。
本実施形態に係る細胞画像解析装置を細胞画像解析装置２ａという。本実施形態においては、細胞とは細菌のことである。

図１６は、本実施形態に係る細胞画像解析装置２ａの構成を示す概略ブロック図である。本実施形態に係る細胞画像解析装置２ａ（図１６）と第１の実施形態に係る細胞画像解析装置２（図３）とを比較すると、画像処理部２１ａと、菌種判定部２３ａ、判定結果出力部２４ａ、特徴量算出部２５、及び記憶部２６が異なる。しかし、他の構成要素（画像取得部２０、フラクタル次元算出部２２）が持つ機能は第１の実施形態と同じである。第１の実施形態と同じ機能の説明は省略し、第２の実施形態では、第１の実施形態と異なる部分を中心に説明する。

細胞画像解析装置２ａは、画像取得部２０と、画像処理部２１ａと、フラクタル次元算出部２２と、菌種判定部２３ａと、判定結果出力部２４ａと、特徴量算出部２５と、記憶部２６とを備える。

画像処理部２１ａは、生成した二値化された細胞画像を、フラクタル次元算出部２２、及び特徴量算出部２５に供給する。
特徴量算出部２５は、画像処理部２１ａから取得した二値化された細胞画像から細胞画像に撮像されている細胞の特徴量を算出する。ここで、細胞の特徴量とは、例えば、面積、面積比、中心座標、縦の長さ、横の長さ、縦横比、周囲長、及び方位などである。特徴量算出部２５は、算出した特徴量を菌種判定部２３ａに供給する。

記憶部２６には、フラクタル次元情報と、特徴量情報とが記憶される。ここでフラクタル次元情報とは、細菌の種類ごとに、細胞画像のフラクタル次元が取り得る値の範囲を示す情報である。また、特徴量情報とは、細菌の種類ごとに、細胞画像に含まれる細胞の特徴量の値の範囲を示す情報である。特徴量情報は、例えば、面積、面積比、中心座標、縦の長さ、横の長さ、縦横比、周囲長、及び方位などが取り得る値の範囲を、細菌の種類ごとに示す。ただし、これらの細胞画像とは、所定の濃度の薬剤を加えて所定の時間が経過した後に撮像された細胞画像である。

菌種判定部２３ａは、フラクタル次元算出部２２が算出したフラクタル次元と、記憶部２６に記憶されたとフラクタル次元情報と、特徴量算出部２５が算出した細胞の特徴量と、記憶部２６に記憶された特徴量情報とに基づいて、細胞画像に撮像されている細菌の種類を判定する。菌種判定部２３ａは、判定した結果を判定結果出力部２４ａに供給する。
判定結果出力部２４ａは、菌種判定部２３ａが判定した結果を提示部３に供給する。
なお、本実施形態においては菌種判定部２３ａがフラクタル次元と、フラクタル次元情報と、細胞の特徴量と、特徴量情報とに基づいて細胞画像に撮像されている細菌の種類を判定する場合について説明しているが、菌種判定部２３ａはフラクタル次元と、フラクタル次元情報とに基づいて細菌の種類を判定してもよい。その場合、細胞画像解析装置２ａは、特徴量算出部２５を備えていなくてもよく、特徴量情報は記憶部２６に記憶されていなくてもよい。

[菌種の判定処理]
細胞画像解析装置２ａの処理の詳細について説明する。
図１７は、本実施形態に係る細胞画像解析装置２ａの処理の一例を示す図である。なお、ステップＳ２００、ステップＳ２０１、及びステップＳ２０２の各処理は、図４におけるステップＳ１００、ステップＳ１０１、及びステップＳ１０３の各処理と同様であるため、説明を省略する。

特徴量算出部２５は、画像処理部２１ａが生成する二値化された細胞画像を取得する。特徴量算出部２５は、取得した二値化された細胞画像から細胞画像に撮像されている細胞の特徴量を算出する（ステップＳ２０３）。特徴量算出部２５は、例えば、面積、面積比、中心座標、縦の長さ、横の長さ、縦横比、周囲長、及び方位などの特徴量のうち１つ以上の特徴量を算出する。特徴量算出部２５は、算出した特徴量を菌種判定部２３ａに供給する。

菌種判定部２３ａは、フラクタル次元算出部２２が算出したフラクタル次元を取得する。菌種判定部２３ａは、特徴量算出部２５が算出した特徴量を取得する。菌種判定部２３ａは、記憶部２６からフラクタル次元情報を取得する。菌種判定部２３ａは、記憶部２６から特徴量情報を取得する。菌種判定部２３ａは、取得したフラクタル次元と、取得したフラクタル次元情報と、取得した特徴量と、取得した特徴量情報とに基づいて、細胞画像に撮像されている細菌の種類を判定する（ステップＳ２０４）。
つまり、菌種判定部２３ａは、細菌の種類を細胞の状態として判定する。ここで菌種判定部２３ａは、判定部の一例である。

ここで、図１８を参照し細胞画像のフラクタル次元が細菌の種類ごとに異なることについて説明する。
図１８は、本実施形態に係る異なる菌種に対するフラクタル次元の時間変化の一例を示す図である。図１８では、異なる菌種として、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ：ｂｃ）と大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｅｃ）とを扱っている。
グラフＢ１〜グラフＢ６は、ｂｃが撮像された細胞画像のフラクタル次元を、タイムラプス観察の開始から経過した時間に対して示すグラフである。グラフＢ１〜グラフＢ６は、各々異なるウェルにおけるｂｃに対応する。
グラフＡ１〜グラフＡ６は、ｅｃが撮像された細胞画像のフラクタル次元を、タイムラプス観察の開始から経過した時間に対して示すグラフである。グラフＡ１〜グラフＡ６は、各々異なるウェルにおけるｅｃに対応する。

領域Ｒ１８において、第１グループＧＡと、第２グループＧＢとが形成されている。領域Ｒ１８は、タイムラプス観察の開始から約３３０分が経過した時間に対応する。グラフＢ１〜グラフＢ６は、第２グループＧＢを形成する。領域Ｒ１８において、グラフＡ１〜グラフＡ６は、第１グループＧＡを形成する。

図１８に示すように、ｂｃが撮像された細胞画像のフラクタル次元を示すグラフＢ１〜グラフＢ６と、ｅｃが撮像された細胞画像のフラクタル次元を示すグラフＡ１〜グラフＡ６とは、領域Ｒ１８において異なる値を示す。つまり、ｂｃとｅｃとを比較した場合、所定の時間（例えば、３３０分）が経過した後の細胞画像のフラクタル次元は、細菌の種類ごとに異なる。したがって、細胞画像解析装置２ａの細胞画像解析方法によれば、例えば６時間程度の時間で薬剤感受性や細菌の種類の判定を行うことができる。

ここで本実施形態との比較のために、図２０を参照し、異なる菌種に対する面積の時間変化を比較する。
図２０は、従来の方法による異なる菌種に対する面積の時間変化の一例を示す図である。
グラフＢ７〜グラフＢ１２は、ｂｃが撮像された細胞画像のフラクタル次元を、タイムラプス観察の開始から経過した時間に対して示すグラフである。グラフＢ７〜グラフＢ１２は、各々異なるウェルにおけるｂｃに対応する。
グラフＡ７〜グラフＡ１２は、ｅｃが撮像された細胞画像のフラクタル次元を、タイムラプス観察の開始から経過した時間に対して示すグラフである。グラフＡ７〜グラフＡ１２は、各々異なるウェルにおけるｅｃに対応する。

第２グラフ領域Ｒ２０において、グラフＢ７〜グラフＢ１２の各々が示す面積の値と、グラフＡ７〜グラフＡ１２の各々が示す面積の値とは、範囲が重なっている。そのため、グラフＢ７〜グラフＢ１２の各々が示す面積の値と、グラフＡ７〜グラフＡ１２の各々が示す面積の値とを判別することは難しい。つまり、ｂｃが撮像された細胞画像の面積と、ｅｃが撮像された細胞画像の面積とを判別することは難しい。このように、図１８において示したようにフラクタル次元が細菌の種類ごとに異なる場合であっても、面積は細菌の種類ごとに異ならない場合がある。

図１７に戻って、細胞画像解析装置２ａの処理の説明を続ける。
菌種判定部２３ａは、フラクタル次元算出部２２から取得したフラクタル次元と、フラクタル次元情報が示す細菌の種類ごとの細胞画像のフラクタル次元が取り得る値の範囲とを照合し、細菌の種類を判定する。菌種判定部２３ａは、判定した細菌の種類を示す情報を判定結果として判定結果出力部２４に供給する。なお、菌種判定部２３ａは、判定された細菌の種類がない場合、判定された細菌の種類がないことを示す情報を判定結果として判定結果出力部２４に供給する。

菌種判定部２３ａは、判定した細菌の種類が複数ある場合、フラクタル次元に基づいて判定した細菌の種類の中から、特徴量に基づいて細菌の種類を判定する。菌種判定部２３ａは、特徴量算出部２５から取得した特徴量と、特徴量情報が示す細菌の種類ごとの細胞画像の特徴量が取り得る値の範囲とを照合し、細菌の種類を判定する。菌種判定部２３ａは、特徴量の中から１つ以上の特徴量に基づいて判定を行う。

判定結果出力部２４ａは、菌種判定部２３ａから、細菌の種類を示す情報を判定結果として取得する。判定結果出力部２４ａは、取得した細菌の種類を示す情報を判定結果として提示部３に供給する。提示部３は、判定結果出力部２４ａから供給される細菌の種類を示す情報を出力する（ステップＳ２０５）。

なお、本実施形態では、位相差顕微鏡を用いて撮像された細菌画像を扱ったが、細菌画像は、位相差顕微鏡以外の顕微鏡を用いて撮像された細菌画像であってもよい。細菌画像が位相差顕微鏡以外の顕微鏡を用いて撮像された細菌画像である場合、特徴量として、上述した特徴量の他に、高輝度、低輝度、平均輝度、中央輝度、輝度の標準偏差、及び輝度合計などを特徴量に含めて、細菌の種類の判定を行ってもよい。

［まとめ］
以上に説明したように、本実施形態に係る細胞画像解析装置２ａの細胞画像解析方法によれば、細菌の種類の判定をラべリング処理を行う場合に比べて短時間で行うことができる。本実施形態に係る細胞画像解析装置２ａの細胞画像解析方法によれば、例えば６時間程度の時間で薬剤感受性や細菌の種類の判定を行うことができる。
本実施形態に係る細胞画像解析装置２ａの細胞画像解析方法は、分布が異なる細菌同士を判定する場合に用いられることが好ましい。ここで分布とは、例えば、細菌の広がり方であり、例えば、面状に広がる広がり方や、線状に広がる広がり方などがある。

なお、上述した実施形態における細胞画像解析装置２、及び細胞画像解析装置２ａの一部、例えば、画像取得部２０、画像処理部２１、画像処理部２１ａ、フラクタル次元算出部２２、状態判定部２３、菌種判定部２３ａ、判定結果出力部２４、判定結果出力部２４ａ、及び特徴量算出部２５をコンピュータで実現するようにしてもよい。その場合、この制御機能を実現するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することによって実現してもよい。なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、細胞画像解析装置２、または細胞画像解析装置２ａに内蔵されたコンピュータシステムであって、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持しているものも含んでもよい。また上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであってもよく、さらに前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであってもよい。
また、上述した実施形態における細胞画像解析装置２、及び細胞画像解析装置２ａの一部、または全部を、ＬＳＩ（Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）等の集積回路として実現してもよい。細胞画像解析装置２、及び細胞画像解析装置２ａの各機能ブロックは個別にプロセッサ化してもよいし、一部、または全部を集積してプロセッサ化してもよい。また、集積回路化の手法はＬＳＩに限らず専用回路、または汎用プロセッサで実現してもよい。また、半導体技術の進歩によりＬＳＩに代替する集積回路化の技術が出現した場合、当該技術による集積回路を用いてもよい。

以上、図面を参照してこの発明の一実施形態について詳しく説明してきたが、具体的な構成は上述のものに限られることはなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲内において様々な設計変更等をすることが可能である。

Ｐ１０…第１細胞画像、Ｐ１１…第１拡大細胞画像、Ｃ１…第１細胞、Ｒ１…第１領域、Ｐ２０…第２細胞画像、Ｐ２１…第２拡大細胞画像、Ｃ２…第２細胞、Ｒ２…第２領域、１…画像供給部、２、２ａ…細胞画像解析装置、２０…画像取得部、２１、２１ａ…画像処理部、２２…フラクタル次元算出部、２３…状態判定部、２３ａ…菌種判定部、２４、２４ａ…判定結果出力部、２５…特徴量算出部、２６…記憶部、３…提示部、Ｐ５１、Ｐ５２、Ｐ５３、Ｐ５４、Ｐ６１、Ｐ７１…画像、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、ＣＲ４、ＣＲ５…円、ＰＴ１、ＰＴ２、ＰＴ３、ＰＴ４、ＰＴ５…代表点

Claims (9)

1. 細胞の画像を取得する画像取得過程と、
   前記画像取得過程において取得された前記画像のフラクタル次元を算出する算出過程と、
   前記算出過程において算出された前記フラクタル次元に基づいて前記画像に撮像されている細胞の状態を判定する判定過程と
   を備える細胞画像解析方法。
2. 前記判定過程において、前記フラクタル次元に加え、前記画像における細胞の画像の面積に基づいて細胞の状態を判定する、請求項１に記載の細胞画像解析方法。
3. 前記判定過程において、前記細胞の分裂、前記細胞の大きさ、前記細胞の凝集若しくは分散、前記細胞の薬剤感受性、および／または前記細胞の種類を前記細胞の状態として判定する、請求項１又は２に記載の細胞画像解析方法。
4. 前記算出過程において、ボックスカウント法又は相関次元により前記フラクタル次元を算出する、請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞画像解析方法。
5. 前記ボックスカウント法は、前記画像を二値化する工程と、二値化された前記画像を領域に分割する工程と、分割された前記領域内の二値化に用いられる二値のうちの一方の値に対応する画素を数える工程と、を含み、
   前記領域の面積が一細胞の画像の面積より小さくなるまで、前記分割する工程と、前記数える工程とを繰り返す、請求項４に記載の細胞画像解析方法。
6. コンピュータに、
   細胞の画像を取得する画像取得ステップと、
   前記画像取得ステップにおいて取得された前記画像のフラクタル次元を算出する算出ステップと、
   前記算出ステップにおいて算出された前記フラクタル次元に基づいて前記画像に撮像されている細胞の状態を判定する判定ステップと
   を実行させるための細胞画像解析プログラム。
7. 前記判定ステップにおいて、前記フラクタル次元に加え、前記画像における細胞の画像の面積に基づいて細胞の状態を判定する、請求項６に記載の細胞画像解析プログラム。
8. 細胞の画像を取得する画像取得部と、
   前記画像取得部によって取得された前記画像のフラクタル次元を算出するフラクタル次元算出部と、
   前記フラクタル次元算出部によって算出された前記フラクタル次元に基づいて前記画像に撮像されている細胞の状態を判定する判定部と、を備える細胞画像解析装置。
9. 前記判定部は、前記フラクタル次元に加え、前記画像における細胞の画像の面積に基づいて細胞の状態を判定する、請求項８に記載の細胞画像解析装置。