JP2020058351A - 骨成長の刺激における使用のための組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】骨及び／又は軟骨の健康の維持のため、又は骨及び／又は軟骨障害の防止、緩和及び／又は処置のための組成物の提供。【解決手段】軟骨同化に対するオレウロペインの効果を増強するための使用のための、ビタミンＤを含む組成物。オレウロペインによる軟骨同化の刺激を増強するための使用のための、ビタミンＤ及び前記オレウロペインを含む組成物。前記組成物は、８００〜１２００ＩＵのビタミンＤ、０．０１ｍｇ〜１ｇのオレウロペインを含み、好ましくは、抗酸化剤、抗炎症性化合物、脂肪酸、プレバイオティック繊維、プロバイオティクス、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、ミネラル、微量元素及び／又はビタミンなどの１種又は複数種のさらなる生物活性分子を含む。【選択図】なし

Description

発明の技術分野

本発明は、骨及び／又は軟骨の健康の維持のため、又は骨及び／又は軟骨障害の防止、緩和及び／又は処置のための組成物の使用に関する。

発明の背景

骨量は、生涯を通じて発達し、遺伝的、機械的及びホルモンのメカニズムによって調節されている。骨ミネラルの取得は子供の間に生じ、ピーク骨量は２０歳頃に達成される。この期間中は、骨形成が骨吸収を上回っている。その後の人生で、特に閉経の頃、又は高齢者で、骨量、骨の微小構造、構造及び強度が徐々に失われることにつながる、骨吸収が過剰なより高い骨代謝回転により、骨量と骨質が損なわれる。

骨を維持するためには、骨形成と骨吸収とのバランスを回復することが重要である。この骨の再構築過程は、骨形成細胞（骨芽細胞）と骨吸収細胞（破骨細胞）との緊密な相互作用を含む骨細胞レベルで調節されている。

健康な成長したヒト又は動物では、骨芽細胞と破骨細胞の協調作用が、経時的な骨量の維持を可能にし、骨吸収と骨の新規合成による骨組織の再構築を同時に確かなものとしている。

健康な成人では、破骨細胞と骨芽細胞の形成速度は、骨形成と骨吸収との間でバランスに影響を与える。しかし、骨粗鬆症の個体では、骨の再構築過程におけるアンバランスが生み出され、形成速度よりも速い速度で進行する骨の損失に至る。加齢に伴い、このアンバランスはほとんどの個体においてある程度は存在するが、骨粗鬆症の個体では、それははるかに重度であり、より若い年齢で発生する。

このように、ヒト及び他の哺乳動物では、非常に様々な疾患が骨吸収と骨形成の代謝異常に関連しており、代謝又は骨の再構築のアンバランスにつながる。

さらに、ヒト及び動物では、骨形成を増進させる必要性によって特徴付けられる多くの条件がある。例えば、骨折の場合には、骨の完全な修復を刺激するために骨の成長を刺激することが必要である。この必要性はまた、歯周病、骨の転移性疾患、骨溶解性疾患、及び（例えば、軟骨の欠陥又は外傷性障害の瘢痕又は再生に）結合組織の修復が必要とされる状態、において存在する。骨の成長の刺激はまた、糖尿病に関連する骨粗鬆症及びグルココルチコイドに関連する骨粗鬆症のみならず、１次及び２次性副甲状腺機能亢進症の場合においても必要とされる。

今日では、骨形成を刺激する及び／又は骨吸収を阻害するための非常に様々な活性化合物が存在するが、特に現在の処置の限定的な成功のために、新規な活性化合物について一定の必要性がある。

別の関節疾患は、高齢者の障害の第１の原因である骨関節炎である。現在、骨関節炎の治療法は無く、その治療法は症状の改善を狙った一時しのぎのものである。

驚くべき方法で、本出願人は、ビタミンＤと、オリーブの木に由来するポリフェノールであるヒドロキシチロソール及び／又はオレウロペインとの組み合わせが相乗的に作用して、骨形成及び／又は軟骨同化を刺激できることを示した。この組み合わせは、骨芽細胞の分化及び活性とコラーゲン合成の刺激を介して、軟骨同化のみならず骨形成も刺激できる。ビタミンＤと、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールのいずれか又は両方との組み合わせの添加により、強度が増加し且つ時間的に前方に移動する骨芽細胞の刺激（すなわち、刺激はいずれかの成分自身でよりも早期に誘発される。）が結果として生じる。本出願の内容では、ビタミンＤの添加の効果は、骨形成及び／又は軟骨同化に対するポリフェノールの効果を「増強する」と言われている。

したがって、第１の態様で、本発明は、骨形成及び／又は軟骨同化に対する１以上のポリフェノールの効果を増強するために使用するためのビタミンＤを含む組成物に関する。

さらなる態様では、本発明は、骨形成及び／又は軟骨同化のポリフェノールによる刺激を増強するために使用するための、ビタミンＤ及び１種若しくは複数種のポリフェノールを含む組成物に関する。

さらなる態様では、本発明は、ビタミンＤ及び１種若しくは複数種のポリフェノールを含む、少なくとも２カ月間、好ましくは少なくとも３カ月間で、１日当たり１回投与される、本発明に係る使用のための組成物に関する。

さらなる態様では、本発明は、ビタミンＤ及び１種若しくは複数種のポリフェノールを含む医薬組成物に関する。

またさらなる態様では、本発明は、１種又は複数種のポリフェノールとともに有効量のビタミンＤを、それを必要とする個体に投与することを含む、骨及び／又は軟骨障害の処置、軽減及び／又は予防方法に関する。

すべての図において、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は１０^−９Ｍ １，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；ＯＬＰは１μＭオレウロペイン；ＨＴｙは１μＭヒドロキシチロソール；Ｃ＋は陽性対照としての最適化培地の使用；Ｃ−は陰性対照としての最小培地の使用を示す。

データは、平均±ＳＥＭ（３反復）を表わす。統計：Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定に従ったＫｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定（両側）＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１対陰性対照（Ｃ−）

図１（Ｆｉｇｕｒｅ １）は、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３、ＯＬＰ及びＨＴｙの組み合わせによる刺激に応答した、培養９日後の骨芽細胞によるコラーゲン合成（全タンパク質のミリグラム当たりの産生コラーゲンのマイクログラムにより測定される。）を示す。 図２（Ｆｉｇｕｒｅ ２）は、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３、ＯＬＰとＨＴｙの組み合わせに応答した、培地の９日後のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性（１時間当たりのタンパク質のミリグラム当たりのマイクロモルのＡＬＰで示される。）を示す。 図３（Ｆｉｇｕｒｅ ３）は、処置の５、９、１２又は１５日後の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の存在下で培養された骨芽細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示す。 図４Ａ（Ｆｉｇｕｒｅ ４Ａ）は、処置の５、９、１２又は１５日後のオレウロペインの存在下で培養された骨芽細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示す。図４Ｂ（Ｆｉｇｕｒｅ ４Ｂ）は、処置の５、９、１２又は１５日後の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３及びオレウロペインの存在下で培養された骨芽細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示す。 図５Ａ（Ｆｉｇｕｒｅ ５Ａ）は、処置の５、９、１２又は１５日後のヒドロキシチロソールの存在下で培養された骨芽細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示す。図５Ｂ（Ｆｉｇｕｒｅ ５Ｂ）は、処置の５、９、１２又は１５日後の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３及びヒドロキシチロソールの存在下で培養された骨芽細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示す。 図６Ａ（Ｆｉｇｕｒｅ ６Ａ）は、処置の５、９、１２又は１５日後のオレウロペイン及びヒドロキシチロソールの存在下で培養された骨芽細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示す。図６Ｂ（Ｆｉｇｕｒｅ ６Ｂ）は、処置の５、９、１２又は１５日後の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールの存在下で培養された骨芽細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示す。

発明の詳細な説明

定義：
本発明をさらに詳細に議論する前に、以下の用語と取り決めが最初に定義されるであろう。

本発明の内容において、特に明記しない限り、記載されるパーセントは重量／重量パーセントである。

「Ｘ及び／又はＹ」の内容において使用される用語「及び／又は」は、「Ｘ」又は「Ｙ」又は「Ｘ及びＹ」と解釈されるべきである。

本明細書で使用される数値範囲は、具体的に開示されているか否かに拘わらず、その範囲内に含まれるすべての数及び数のサブセットを含むことが意図されている。さらに、それらの数値範囲は、その範囲内の任意の数又は数の任意のサブセットに向けられた特許請求の範囲のサポートを提供するものとして解釈されるべきである。例えば、１から１０までの開示は、１から８まで、３から７まで、４から９まで、３．６から４．６まで、３．５から９．９までなどの範囲をサポートするものとして解釈されるべきである。

本発明の単数形の特徴又は限定のすべてについて言及は、他に特定されていない限り、又はその言及されている内容によって逆に明確に暗示されていない限り、対応する複数の特徴又は限定、及びその逆を含むものとされる。

他に定義されていない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、一般に、当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。

使用のための、ビタミンＤを含む組成物：
ポリフェノールは、炎症及び骨代謝に有益な効果を有することが以前に示されていた。

本発明者らは、驚くべきことに、１種又は複数種のポリフェノール（ＨＴｙ及びＯＬＰのうちの１種又は複数種など）とビタミンＤとの組み合わせが、それらのポリフェノールの骨形成及び／又は軟骨同化に対する刺激効果を増強することを示した（実施例２及びその考察と図２を参照）。

「骨形成及び／又は軟骨同化の刺激」とは、ビタミンＤ、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールの組み合わせの能力であって、骨芽細胞の活性を刺激し、ひいては骨及び／又は軟骨のタンパク質ネットワークの合成を刺激する能力を意味する。これは、これらのタンパク質ネットワークにおけるミネラル、特にカルシウムの沈着、すなわち、骨形成とも呼ばれる骨の石灰化の刺激に、また、軟骨同化の刺激につながる。

「ポリフェノールの刺激効果を増強する」とは、１種又は複数種のポリフェノールの刺激効果が、ビタミンＤの添加によって、強度において増加し、及び時間的に前進する（すなわち、ビタミンＤの非存在下でよりも早く誘発される）ことの両方を意味する。

したがって、第１の態様における本発明は、骨形成及び／又は軟骨同化に対する１種又は複数種のポリフェノールの効果を増強するために使用するための、ビタミンＤを含む組成物に関する。ポリフェノールは、例えば、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールのうちの１種又は複数種であり得る。

ビタミンＤは、任意の適切な形態で存在することができる。例えば、コレカルシフェロール（Ｄ３）、エルゴカルシフェロール（Ｄ２）及びそれらの生物学的に活性な代謝物、及び１−α−ヒドロキシビタミンＤ、２５−ヒドロキシビタミンＤ、１、２５−ジヒドロキシビタミンＤなどの前駆体を含むビタミンＤの様々な有用な形態が利用可能である。

本発明のこの態様の一実施形態では、ビタミンＤは、１種又は複数種のポリフェノールの提供と同時に又は連続的に提供することができる。ビタミンＤは、１種又は複数種のポリフェノールと同じ組成物中に提供することができ、又は別々の組成物中で、例えば、キットのパーツ中、一連の相互作用する製品中で提供することができる。ビタミンＤ及び１種若しくは複数種のポリフェノールは、１又は複数の別々の組成物中で提供されている場合には、それらが投与前に混合されてもよく、又は同時若しくは逐次的に投与されてもよい。

ビタミンＤの増強効果は、オレウロペイン又はヒドロキシチロソールとの組み合わせなどの、単一のポリフェノールとの組み合わせで既に明らかである。

ビタミンＤをオレウロペイン及びヒドロキシチロソールの両方と組み合わせて投与されたときに増強効果がさらに増大する。

さらなる態様では、本発明は、骨形成及び／又は軟骨同化に対する１種又は複数種のポリフェノールの効果を増強するための組成物又は医薬の製造におけるビタミンＤの使用に関する。

使用のための組成物：
さらなる態様では、本発明は、ビタミンＤ及び１種若しくは複数種のポリフェノールを含む組成物であって、それらのポリフェノールによる骨形成及び／又は軟骨同化の刺激を増強するための使用のための組成物に関する。

ポリフェノールは、例えば、オレウロペイン、リグストロシド、ヒドロキシチロソール及び／又はチロソールからなる群から選択されるポリフェノールなどのオリーブポリフェノールであってもよい。好ましい実施形態では、オリーブポリフェノールは、オレウロペイン及びヒドロキシチロソールのうちの１種又は複数種を含み、さらに好ましくは、ポリフェノールはオレウロペイン及びヒドロキシチロソールを含む。

本発明に係る組成物は、例えば、１回分当たり（ｐｅｒ ｓｅｒｖｉｎｇ）８００〜１２００ＩＵの量のビタミンＤを含んでいてもよい。１種又は複数種のポリフェノールは、１回分当たり、０．０１ｍｇ〜約１ｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１ｇ、さらにより好ましくは１ｍｇ〜約１ｇの量でそれぞれ存在することができる。

治療効果を達成するために必要とされる本発明の組成物の有効量は、特定の組成物、投与ルート、レシピエントの年齢及び状態、そして処置される特定の障害又は疾患によって変動する。

例として、ビタミンＤ、ヒドロキシチロソール及びオレウロペインの組み合わせで補充されたＲＴＤ（直ぐに飲める（ｒｅａｄｙ ｔｏ ｄｒｉｎｋ））は、１回分当たりそれぞれの活性原材料を０．０１ｍｇ〜５００ｍｇ含むであろう。

一実施形態では、本発明の組成物は、例えば、８００〜１２００ＩＵ、例えば、８００〜１１００、８００〜１０００、８５０〜１０００、８５０〜９５０、９００〜９５０ＩＵ、例えば約９００又は約９５０ＩＵのビタミンＤを含む。さらなる実施形態では、本発明の組成物は、ビタミンＤに加えて、０．０１ｍｇ〜１ｇの量、例えば、０．０１ｍｇ〜５００ｍｇ（例えば、０．１ｍｇ〜５００ｍｇ、０．５ｍｇ〜５００ｍｇ、１ｍｇ〜５００ｍｇ、１０ｍｇ〜５００ｍｇ、２０ｍｇ〜５００ｍｇ、５０ｍｇ〜５００ｍｇ、１００ｍｇ〜５００ｍｇ、２５０ｍｇ〜５００ｍｇ、３００ｍｇ〜５００ｍｇ、３５０ｍｇ〜５００ｍｇ、４００ｍｇ〜５００ｍｇ）、又は４００ｍｇ〜１ｇ（例えば、５００ｍｇ〜１ｇ、５５０ｍｇ〜１ｇ、６００ｍｇ〜１ｇ、６５０ｍｇ〜１ｇ、７５０ｍｇ〜１ｇ、８００ｍｇ〜１ｇ、９００ｍｇ〜１ｇ）、又は５５０ｍｇ〜９５０ｍｇ（例えば、６００ｍｇ〜９００ｍｇ、７００ｍｇ〜８００ｍｇ）の量のオレウロペインを含む。該実施形態では、例えば、０．０１ｍｇ〜１ｇの量、例えば、０．０１ｍｇ〜５００ｍｇ（例えば、０．１ｍｇ〜５００ｍｇ、０．５ｍｇ〜５００ｍｇ、１ｍｇ〜５００ｍｇ、１０ｍｇ〜５００ｍｇ、２０ｍｇ〜５００ｍｇ、５０ｍｇ〜５００ｍｇ、１００ｍｇ〜５００ｍｇ、２５０ｍｇ〜５００ｍｇ、３００ｍｇ〜５００ｍｇ、３５０ｍｇ〜５００ｍｇ、４００ｍｇ〜５００ｍｇ）、又は４００ｍｇ〜１ｇ（例えば、５００ｍｇ〜１ｇ、５５０ｍｇ〜１ｇ、６００ｍｇ〜１ｇ、６５０ｍｇ〜１ｇ、７５０ｍｇ〜１ｇ、８００ｍｇ〜１ｇ、９００ｍｇ〜１ｇ）、又は５５０ｍｇ〜９５０ｍｇ（例えば、６００ｍｇ〜９００ｍｇ、７００ｍｇ〜８００ｍｇ）の量のヒドロキシチロソールをさらに含み得る。

好ましい実施形態では、本発明の組成物は、８００〜１２００ＩＵのビタミンＤ、０．０１ｍｇ〜１ｇのオレウロペイン、及び０．０１ｍｇ〜１ｇのヒドロキシチロソールを含む。

栄養組成物：
本発明に係る使用のための組成物は栄養組成物又は医薬組成物であってもよく、また、ヒト又は獣医学的使用のためのものであってもよい。

一実施形態では、本発明に係る使用のための組成物は栄養組成物である。

「栄養組成物」は、本発明によれば、ビタミンＤと、１種又は複数種のオリーブポリフェノール（例えば、オレウロペイン、リグストロシド、ヒドロキシチロソール及び／又はチロソールのうちの１種又は複数種）などの１種又は複数種のポリフェノール、好ましくはオレウロペイン及び／又はヒドロキシチロソールと、の組み合わせを含有する組成物であって、医薬の特性を有しない食餌組成物（ｄｉｅｔａｒｙ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を構成する組成物を意味する。

栄養組成物は、例えば、１種又は複数種の酸味料、追加的増粘剤、ｐＨ調整のための緩衝剤又は薬剤、キレート剤、着色剤、乳化剤、添加剤、香味剤、ミネラル、浸透剤、薬学的に許容し得る担体、保存剤、安定剤、糖、甘味料、調質剤（ｔｅｘｔｕｒｉｚｅｒ）、及び／又はビタミンなどの慣用的な食品添加剤（合成又は天然の）を含む任意の数の任意選択的な追加的原材料を含むと理解される。これらの任意選択的な原材料は、任意の好適な量で添加することができる。本発明の栄養製品又は組成物は、完全な栄養源であってもよく、又は不完全な栄養源であってもよい。

本明細書で使用される場合、「完全な栄養」は、投与される動物のための栄養の唯一の源となるのに十分なタイプ及びレベルの主要栄養素（タンパク質、脂肪及び炭水化物）及び微量栄養素を含有する栄養製品及び組成物を含む。患者は、そのような完全な栄養組成物から自分の栄養要求量の１００％を受け取ることができる。

本明細書で使用される場合、「不完全な栄養」は、投与される動物のための栄養の唯一の源となるのに十分なレベルの主要栄養素（タンパク質、脂肪及び炭水化物）又は微量栄養素を含有しない栄養製品又は組成物を含む。部分的又は不完全な栄養組成物は、栄養サプリメントとして使用することができる。

本発明の栄養組成物は医療用食品とすることができる。医療用食品は、特定の条件の食事管理を提供するように設計された栄養組成物の特別なクラスである。医療用食品は、１９８３年のオーファンドラッグ法の第５節［３６０ｅｅ］（ｂ）（２）（Ｄ）によって設定され、規制された一定の基準を満たす。

成分：
本発明に係る組成物は、抗酸化剤、抗炎症性化合物、脂肪酸、プレバイオティック繊維、プロバイオティクス、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、ミネラル、微量元素及び／又はビタミンなどの１種又は複数種のさらなる生物活性分子を含むことができる。

本発明に係る栄養組成物に含まれ得るミネラル及び微量元素の例としては、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、リン、銅、亜鉛、鉄、セレン、クロム及びモリブテンなどのミネラル元素及び微量元素が挙げられる。

好ましい実施形態では、本発明の組成物はミネラルカルシウムを含む。カルシウムは、例えば、１種又は複数種のカルシウム無機塩（塩化カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム及び／又は炭酸カルシウム）、カルシウム有機塩（クエン酸カルシウム、マレイン酸カルシウム又はそれらの混合物など）、及び／又は、粉末脱脂ミルク又はカルシウムカゼインなどのカルシウムを含む有機成分などの、例えば、１種又は複数種の有機及び／又は無機の生理学的に許容し得る化合物であってもよい。

好ましい実施形態では、本発明の組成物はミネラルマグネシウムを含む。マグネシウムは、例えば、１種又は複数種のマグネシウム無機塩（塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム及び／又は炭酸マグネシウム）、マグネシウム有機塩（クエン酸マグネシウム、マレイン酸マグネシウム又はそれらの混合物など）、及び／又は、マグネシウムを含む有機成分などの、例えば、１種又は複数種の有機及び／又は無機の生理学的に許容し得る化合物であってもよい。

したがって、本発明の組成物の好ましい実施態様はミネラルカルシウム及び／又はマグネシウムを含む。

１種又は複数種の酸化防止剤はまた栄養組成物中に存在していてもよい。酸化防止剤の非限定的な例としては、アスタキサンチン、カロテノイド、コエンザイムＱ１０（「ＣｏＱ１０」）、フラボノイド、グルタチオン、クコ（ウルフベリー）、ヘスペリジン、ラクトウルフベリー、リグナン、ルテイン、リコペン、ポリフェノール、セレン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ゼアキサンチン、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

実施形態では、栄養組成物は１種又は複数種のプレバイオティクスを含む。プレバイオティクスの非限定的な例としては、アカシアゴム、アルファグルカン、アラビノガラクタン、ベータグルカン、デキストラン、フラクトオリゴ糖、フコシルラクトース、ガラクトオリゴ糖、ガラクトマンナン、ゲンチオオリゴ糖、グルコオリゴ糖、グアーガム、イヌリン、イソマルトオリゴ糖、ラクトネオテトラオース、ラクトスクロース、ラクツロース、レバン、マルトデキストリン、ミルクオリゴ糖、部分的加水分解グアーガム、ペクチン由来オリゴ糖、難消化性デンプン、老化澱粉、シアロオリゴ糖、シアリルラクトース、ダイズオリゴ糖、糖アルコール、キシロオリゴ糖、それらの加水分解物、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

栄養組成物は１種又は複数種のプロバイオティクスを含む。プロバイオティクスの非限定的な例としては、アエロコッカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、デバロマイセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、メリソコッカス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｏｃｏｃｃｕｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プソイドカテヌラタム（Ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）、非複製微生物、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

栄養組成物は繊維又は種々のタイプの繊維のブレンドを含んでもよい。繊維ブレンドは、可溶性及び不溶性の繊維の混合物を含有してもよい。可溶性の繊維としては、例えば、フラクトオリゴ糖、アカシアガム、イヌリン、寒天、アルギン酸塩、イナゴマメ、カラギーナン、アラビアガム、グアーガム、カラヤガム、ペクチン又はキサンタンガムなどを挙げることができ、これらの可溶性の繊維は、加水分解された形態又は非加水分解形態である。不溶性の繊維としては、例えば、エンドウ豆の外側繊維を挙げることができる。

本発明の栄養組成物はまた、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＣ、葉酸、チアミン、リボフラビン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ナイアシン、ビオチン、及びパントテン酸から選択される１種又は複数種のさらなるビタミンを含むことができる。

一実施形態では、栄養組成物はタンパク質源を含む。タンパク質源は、これらに限定されないが、動物性タンパク質（乳タンパク質、食肉タンパク質又は卵タンパク質など）、植物性タンパク質（大豆タンパク質、小麦タンパク質、米タンパク質、及びエンドウ豆タンパク質など）、又はこれらの組み合わせを含む食物タンパク質（ｄｉｅｔａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）であってもよい。実施形態では、タンパク質は、乳清、チキン、トウモロコシ、カゼイン、小麦、亜麻、大豆、イナゴマメ、エンドウ豆、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

一実施形態では、栄養組成物は炭水化物源を含む。任意の適切な炭水化物は、本発明の栄養組成物に使用することができ、これらに限定されないが、デンプン、ショ糖、乳糖、ブドウ糖、果糖、コーンシロップ固形物、マルトデキストリン、加工デンプン、アミロースデンプン、タピオカデンプン、トウモロコシデンプン、キシリトール、ソルビトール、又はそれらの組み合わせを含む。

一実施形態では、栄養組成物は脂肪源を含む。脂肪源は、任意の適切な脂肪又は脂肪混合物を含むことができる。例えば、脂肪源としては、これらに限定されないが、植物性脂肪（オリーブ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、高オレイン酸ヒマワリ油、ナタネ油、キャノーラ油、ヘーゼルナッツ油、ダイズ油、パーム油、ココナッツ油、クロフサスグリ種子油、ルリヂサ油、レシチンなど）、動物性脂肪（乳脂肪などの）、又はそれらの組み合わせを挙げることができる。脂肪源はまた、上に挙げた脂肪のより精製されていない変形（例えば、ポリフェノール含有オリーブオイル）であってもよい。

さらに、本発明に係る栄養組成物はまた、例えば、バナナ、オレンジ、ピーチ、パイナップル若しくはラズベリーのようなフルーツフレーバー、又はバニラ、ココア、コーヒーなどのような他の植物フレーバーなどの、天然又は人工の香味料を含んでいてもよい。

本発明に係る栄養組成物は、０．０１ｍｇ〜５００ｍｇの各成分が含まれる毎日の経口投与に適した、ある量のビタミンＤ、並びにオレウロペイン及びヒドロキシチロソールのうちの１種又は複数種を含み得る。

本発明に係る栄養組成物中に含有されるカルシウムの量は、１００ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは２００ｍｇ〜７００ｍｇ、さらに好ましくは３００ｍｇ〜６００ｍｇのカルシウムが含まれる、該組成物により提供される毎日の投与に適合されている。

栄養組成物の形態：
本開示に係る好適な栄養組成物の形態としては、例えば、乳児用調合乳、溶液、直ぐに消費できる組成物（ｒｅａｄｙ−ｆｏｒ−ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）（例えば、直ぐに飲める組成物（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｄｒｉｎｋ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）又はインスタントドリンク）、液体食料品、ソフトドリンク、ジュース、スポーツドリンク、ミルクドリンク、ミルクシェーク、ヨーグルトドリンク、スープなどが挙げられる。さらなる実施形態では、栄養組成物は、水又は他の液体（例えばミルク又は果汁）で希釈されて、直ぐに消費できる組成物（例えば、直ぐに飲める組成物又はインスタント飲料）を得る濃縮物、粉末又は顆粒（例えば発泡性顆粒）の形態で製造され販売することができる。

さらに、栄養組成物の形態としては、乳製品、焼き製品（ｂａｋｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）、乳製品、デザート、菓子製品、シリアルバー、朝食用シリアルが挙げられる。乳製品の例としては、ミルクとミルクドリンク、ヨーグルト及び他の発酵乳製品、アイスクリーム、チーズが挙げられる。焼き製品の例としては、パン、ビスケット、ケーキが挙げられる。調合乳の例には栄養的に完全な調合乳が含まれる。

一実施形態では、本発明に係る使用のための組成物はまた、特に犬又は猫のために、湿潤形態、半湿潤形態又は乾燥形態に拘わらず、特にビスケットの形態で、動物用食品としてデザインされた非常に様々な形態で利用可能であることもできる。

投与ルート：
本開示の栄養組成物は、ヒトへの投与に、特に、胃腸管の任意の部分での投与に適切な任意の手段によって投与することができる。腸内投与、経口投与、及びチューブ又はカテーテルを通した投与はすべて、本開示でカバーされる。栄養組成物はまた、経口、直腸、舌下、唇下、口腔内、局所などから選択される手段により投与することができる。

栄養組成物が経口投与するように処方される場合、該組成物は、液体の経口栄養サプリメント（例えば不完全栄養補給剤（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ｆｅｅｄｉｎｇ））又は完全栄養補給剤（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｆｅｅｄｉｎｇ）であってもよい。この方法では、栄養組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、液剤、チュアブル、ソフトゲル、サシェ剤、散剤、シロップ剤、液体懸濁剤、乳剤及び便利な剤形の液剤などを含む、任意の知られている形態で投与することができる。軟カプセルでは、活性原材料は、好ましくは、例えば、脂肪油、パラフィン油又は液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解又は懸濁される。任意選択で安定剤が添加されてもよい。

本開示の栄養組成物は、不完全又は完全な栄養の源のいずれであってもよい。栄養組成物は、経口投与又は経管栄養によって投与してもよい。栄養組成物は、経口投与するように処方される場合には、液体の経口栄養サプリメント又は補給剤であってもよい。栄養組成物はまた、短期又は長期経管栄養のために使用することができる。

使用のための組成物（障害及びターゲットグループ）：
本発明者は、本発明に係る組成物は、増進した骨形成及び／又は軟骨同化を示す骨芽細胞の増進した刺激をもたらすことを示した。

一実施形態では、本発明に係る使用は、骨形成と骨吸収との関係のアンバランスに関連する、及び／又は軟骨ターンオーバーに関連する障害の、骨形成及び／又は軟骨同化の刺激を増強することによる、防止、緩和及び／又は予防への使用である。

本発明に係る使用のための組成物は、例えば、本発明に係る組成物の投与により投与される個体の骨及び／又は軟骨の状態の維持に使用するためのものであってもよい。

本発明に係る組成物は、成人年齢の始めで達成される骨密度を増加させ、成人年齢の始めでの最大骨量（ピーク骨量）を増加させるために、例えば、成長期の若い個体での骨形成及び軟骨同化を刺激するために有用であり得る。

組成物はさらに、最大骨量を増加させるために、成人の骨形成及び／又は軟骨同化を刺激するのに有用であり得る。したがって、組成物は、例えば、閉経周辺期の女性、健康な成人及び／又は前骨関節炎である健康な高齢化成人などの健康な成人及び／又は健康な高齢化成人、又は、骨関節炎、骨粗鬆症及び／又は骨折事象などの骨及び／又は軟骨の障害と診断された成人における、骨形成及び／又は軟骨同化を刺激するのに有用であり得る。

本発明に係る組成物は、他の実施形態では、例えば、加齢に伴って発生する骨損失の防止に有用であり得る。

本発明に係る組成物は、他の実施形態では、加齢の間に骨及び軟骨の機能を含む、関節の機能を維持し改善するために有用であり得る。

本発明に係る組成物は、いくつかの実施形態では、骨強度を改善するのに有用であり得る。

さらなる実施形態では、本発明に係る使用のための組成物は、骨粗鬆症、ページェット病、人工器官の近くに観察される骨損失若しくは骨溶解、転移性骨疾患、甲状腺機能亢進症、がんによる低カルシウム血症、多発性骨髄腫、歯周病、骨関節炎、骨折若しくは骨折治癒に起因する骨欠損などの、骨形成及び／又は軟骨同化における障害の処置における使用に関する。

好ましい実施形態では、本発明は、障害が骨粗鬆症及び／又は骨関節炎である、本発明に係る使用のための組成物に関する。

さらなる実施形態では、本発明に係る使用のための組成物は、骨折に起因する骨欠損を処置するための使用に関する。

本発明に係る使用のための組成物は、骨折治癒中の改善された骨形成及び／又は再生、及び／又は軟骨同化をもたらすことができる。それは、骨粗鬆症のリスクを低減し、骨折後の回復を改善するために有用であり得る。

本発明の組成物は、骨損失、特に、哺乳動物の加齢に関連した骨損失、又は長期間の入院に関連した骨損失を防止するのに役立ち得る。

さらに、それは、哺乳動物における軟骨を構築し、ペット及びヒトにおける骨関節炎を防止するのに役立つことができ、個体（例えば、ペット及び／又はヒト）のより良い活動性又は運動性にいたる。

したがって、特に、本発明に係る組成物は、例えば、骨関節炎を処置、緩和若しくは防止することにより、及び／又は骨強度を改善することにより、個体の活動性及び／又は運動性を改善するために使用するためのものであってもよい。

本発明の特定の実施形態は、例えば、高齢又は高齢化個体において、骨関節炎を処置、緩和若しくは防止することにより、及び／又は骨強度を改善することにより、個体の活動性及び／又は運動性を改善するために使用するための組成物に関する。

さらなる実施形態では、本発明に係る使用のための組成物は、ヒト又はペットなどの哺乳動物において使用するためのものであり得る。ペットの例としては、ネコ、イヌ及びウマが挙げられる。

本発明は、多くの種々の年齢層において有用であり得るが、好ましい実施形態では、本発明に係る使用のための組成物は、高齢化集団、特に高齢患者を標的としている。

本発明の栄養組成物の製造方法：
本発明は、さらなる態様では、本発明の栄養組成物を製造するための方法に関し、該方法は、
栄養組成物を提供するステップ、及び
調製された栄養組成物がビタミンＤと１種又は複数種のポリフェノールとの組み合わせを含むように、該栄養組成物に、ビタミンＤのうちの１種若しくは複数種、及び１種若しくは複数種のポリフェノールを加えるステップ
を含む。

本発明のこの態様の実施形態では、ポリフェノールは、例えばオリーブポリフェノールであってもよく、例えば、オレウロペイン、リグストロシド、ヒドロキシチロソール及び／又はチロソールから選択される１種又は複数種、好ましくはオレウロペイン及びヒドロキシチロソールのうちの１種又は複数種、さらにより好ましくはオレウロペイン及びヒドロキシチロソールの両方であり得る。

医薬組成物：
さらなる態様では、本発明は、ビタミンＤと、（例えば、オレウロペイン、リグストロシド、ヒドロキシチロソール及び／又はチロソールから選択される）オリーブポリフェノールなどの１種又は複数種のポリフェノール、好ましくはオレウロペイン及び／又はヒドロキシチロソールと、を含む医薬品に関する。医薬品はヒト用組成物であってもよい。それは、代わりに、例えば、イヌ、ネコ又はウマ、特にサラブレッド馬に適切な獣医用組成物であってもよい。

医薬品は、ヒト又は動物の疾患を医療で防止、診断、緩和、処置又は治療するために物質が体に接して又は体内で使用される、栄養組成物以外の組成物を意味する。

好ましい一実施形態では、本発明の医薬組成物は、ビタミンＤと、オレウロペイン及び／又はヒドロキシチロソールを含む。

本発明は、本発明の組成物の使用として上述されたような、本発明に係る医薬品の使用にさらに関する。

本発明に係る医薬組成物は、ビタミンＤ及び１種若しくは複数種のポリフェノールと、薬学的に許容し得る添加剤で構成される群から選択される少なくとも１種の添加剤と、の組み合わせを含む。本発明に係る医薬組成物の調製のための手順は、当業者により、例えば、ハンドブックＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｉｄ．Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ＵＳＡにおいて、容易に見出すことができる。生理学的に許容される添加剤、ビヒクル及びアジュバントもまた、「医薬添加剤のハンドブック、第２版、米国薬剤師会、１９９４年」と題するハンドブックに記載されている。本発明に係る医薬組成物を製剤化するために、当業者は、欧州薬局方又は米国薬局方（ＵＳＰ）の最新版を有利に参照することができるであろう。当業者は、特に、欧州薬局方第４版「２００２年」を、また、米国薬局方のＵＳＰ２５−ＮＦ２０（米国薬局方）版を有利に参照できるであろう。

有利には、上記で定義されたような医薬組成物は、経口、非経口又は静脈内投与に適している。本発明に係る医薬組成物は、少なくとも１種の薬学的又は生理学的に許容し得る添加剤を含む場合には、それは、特に、経口経路による組成物の投与に適した添加剤、又は非経口ルートによる組成物の投与に適した添加剤である。

本発明に係るビタミンＤ及び１種若しくは複数種のポリフェノールを含む医薬組成物は固体又は液体の形態で通常使用可能である。経口投与のために、錠剤、カプセル又はゼラチンカプセル剤の形態の固体医薬組成物が好ましいであろう。

液体形態では、水性又は非水性懸濁液の形態、あるいはまた、油中水型又は水中油型エマルジョンの形態の医薬組成物が好ましいであろう。固体の医薬形態は、ビヒクル、アジュバント又は添加剤として、少なくとも１種の希釈剤、１種の香味剤、１種の安定化剤、１種の滑沢剤、１種の懸濁剤、１種の結合剤、１種の崩壊剤及び１種の封入剤を含んでもよい。このような化合物は、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース系材料、ココアバターなどである。液体形態の組成物はまた、おそらくプロピレングリコール又はポリエチレングリコール、そして、おそらくまた着色剤、香味剤、安定化剤及び増粘剤との混合物として、水を含んでもよい。

処置方法：
本発明はまた、骨及び／又は軟骨代謝のアンバランスに関連する障害、特に、骨量の損失及び／又は軟骨の損失に関連した障害の処置、緩和及び／又は予防方法に関し、該方法は、それを必要とする個体に有効量の本発明の組成物を投与することを含む。例えば、この方法は、１種又は複数種のポリフェノールと組み合わせて有効量のビタミンＤを投与することを含む。

本明細書で使用される場合、「有効量」は、欠乏を防止し、個体における疾患若しくは医学的状態を処置し、又は、より一般的に、症状を減少させ、疾患の進行を管理し、又は栄養的、生理学的若しくは医学的利益を個体に提供する量である。

治療効果を達成するために必要とされる本発明に係る組成物の有効量は、特定の組成物、投与ルート、レシピエントの年齢及び状態、そして処置される特定の障害又は疾患によって変動する。

本発明は、個体に有効量の本発明の組成物を投与することを含む、骨形成及び／又は軟骨同化を増進させ、成長中の骨ミネラル密度を増加させ、そして最大骨量を最適化する方法、骨関節炎を処置又は防止する方法、及び／又は骨折治癒中の骨形成及び／又は軟骨同化を刺激する方法をさらに提供する。

一実施形態では、本発明は、骨代謝におけるアンバランスに関連する障害、特に、骨量の損失に関連した障害の処置、軽減及び／又は予防のための方法に関し、該方法は、治療有効量のビタミンＤ及び１種若しくは複数種のポリフェノール、又はビタミンＤ及び１種若しくは複数種のポリフェノールを含有する医薬組成物を、それらを必要とする個体に投与することを含む。

一実施形態では、本発明に係る処置方法は、骨関節炎の処置、軽減及び／又は予防に関する。

本発明に係る処置方法は、ヒト又はペット、例えば、イヌ、ネコ及び／又はウマのような哺乳動物におけるものであってもよい。

特定の実施形態では、処置方法において投与される本発明の組成物は、１又は複数の本発明の栄養組成物及び／又は本発明の医薬組成物であってもよい。

投与計画：
本発明は、ビタミンＤと、ヒドロキシチロソール及び／又はオレウロペインなどの１種又は複数種のポリフェノールと、の組み合わせが、それらのポリフェノールの骨形成及び／又は軟骨同化効果を増強するという驚くべき知見に関する。

その組み合わせは、ポリフェノールの効果を増進させ、骨芽細胞からの早期応答を誘発することの両方ができる。したがって、本発明の組成物は、例えば、骨関節炎の従来の処置に使用された長期間とは対照的に、より短い期間での処置に有用であり得る。

したがって、本発明はまた、少なくとも２か月、好ましくは少なくとも３か月などの少なくとも１か月の期間にわたって少なくとも１日１回本発明の組成物が投与される、本発明に係る使用に関する。

他の実施形態では、本発明は、組成物が少なくとも１か月間で少なくとも１日に１回投与される、本発明に係る使用に関する。

なお、本発明の態様の１つの内容で記載される実施形態及び特徴は、本発明の他の態様にも適用されることに留意すべきである。

本出願において引用されたすべての特許及び非特許参考文献は、本明細書にその全体が参照により組み込まれる。

本発明は、以下の非限定的な実施例においてさらに詳細に記載される。

実施例１（骨芽細胞によるコラーゲン合成）：
２００４年にＤｅｃｌｅｒｃｑらにより記載された酵素消化によって、新生Ｗｉｓｔａｒラットの頭蓋冠から１次骨芽細胞を単離した。すべての実験の間、５％ＣＯ_２で３７℃の条件下で、１０％加熱不活化ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むα−最少必須培地中で細胞を維持した。３５００細胞／ウェルの密度でコル−１でコーティングした９６−ウェルプレート上に、又は、３×１０^４細胞胞／ウェルの密度で２４−ウェルプレート中に、細胞を播種し、コンフルエンスに到達するまでα−ＭＥＭ中で２日間培養した。次いで、種々の条件：最少培地（Ｃ−）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸及び５ｍＭβグリセロリン酸を含有する最少培地（最適化された培地Ｃ＋）、及び１μＭオレウロペイン（ＯＬＰ）又は／及び１μＭヒドロキシチロソール（ＨＴｙ）又は／及び１０^−９Ｍ１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）が補充された最小培地に、細胞をさらした。ＯＬＰ及びＨＴｙはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３はエタノールに溶解した。培地中のＤＭＳＯとエタノールの最終濃度はそれぞれ０．１％であった。培地は２日ごとに交換した。

９日後、細胞のコラーゲン含有量を、ＢｉｏｃｏｌｏｒからのＳｉｒｃｏｌアッセイを用いて測定した。このＳｉｒｃｏｌコラーゲンアッセイは、インビトロ培養中の哺乳動物の組織と細胞から抽出したコラーゲンの分析のために設計された定量的色素結合方法である。色素試薬が、哺乳動物のコラーゲン（タイプＩ−Ｖ）で見出される［Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ］ｎらせん構造に特異的に結合する。

図１は、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３、ＯＬＰ及びＨＴｙの組み合わせによる刺激に応答した、培養の９日後の骨芽細胞によるコラーゲン合成（全タンパク質のミリグラム当たりの産生コラーゲンのマイクログラムにより測定される。）を示す。

１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は１０^−９Ｍ１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；ＯＬＰは１μＭオレウロペイン；ＨＴｙは１μＭヒドロキシチロソール；Ｃ＋は、陽性対照としての最適化培地の使用を示す。

データは平均±ＳＥＭ（３反復）を表わす。統計：Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定に従ったＫｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定（両側） ＊ Ｐ＜０．０５；＊＊ Ｐ＜０．０１；＊＊＊ Ｐ＜０．００１対陰性対照（Ｃ−）

図１に示されるように、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３、ＯＬＰ及びＨＴｙの組み合わせが、培養の９日後の骨芽細胞の細胞コラーゲン合成を有意に刺激する。

実施例２（骨芽細胞のアルカリホスファターゼ活性）：
２００４年にＤｅｃｌｅｒｃｑらにより記載された酵素消化によって、新生Ｗｉｓｔａｒラットの頭蓋冠から１次骨芽細胞を単離した。すべての実験の間、５％ＣＯ_２で３７℃の条件下で、１０％加熱不活化ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むα−最少必須培地中で細胞を維持した。３５００細胞／ウェルの密度でコル−１でコーティングした９６−ウェルプレート上に、又は、３×１０^４細胞／ウェルの密度で２４−ウェルプレート中に、細胞を播種し、コンフルエンスに到達するまでα−ＭＥＭ中で２日間培養した。次いで、種々の条件：最少培地（Ｃ−）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、５ｍＭβグリセロリン酸を含有する最少培地（最適化された培地Ｃ＋）、及び１μＭオレウロペイン（ＯＬＰ）又は／及び１μＭヒドロキシチロソール（ＨＴｙ）又は／及び１０^−９Ｍ１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）が補充された最小培地に、細胞をさらした。ＯＬＰ及びＨＴｙはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３はエタノールに溶解した。培地中のＤＭＳＯとエタノールの最終濃度はそれぞれ０．１％であった。培地は２日ごとに交換した。

アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の酵素活性は、処置０、５、９、１２及び１５日目に、速度論的に測定した。骨芽細胞を、ドライアイスで凍結する前にＰＢＳで２回洗浄した。次いで、凍結融解サイクル、及び１Ｍジエタノールアミンと０．２４ｍＭ塩化マグネシウムの緩衝液ｐＨ９．８（ＡＬＰ緩衝液）の２００μｌへのホモジネーションにより、細胞を溶解した。細胞溶解物（１０μｌ）を、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐ−ＮＰＰ）の６ｍｇ／ｍｌＡＬＰ緩衝液溶液の２００μｌに加えた。吸光度を、ＶａｒｉｏＳｋｌａｎフラッシュマイクロプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍ、３０℃で、２分３０秒ごとに３０分間測定した。ＡＬＰ活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１時間当たりのｐ−ＮＰＰのマイクロモルとして表した。タンパク質の測定は、Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイを使用して、ブラッドフォードの方法に従って行った。

図２は、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３、ＯＬＰ及びＨＴｙの組み合わせに応答した、９日後のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性（１時間当たりのタンパク質のミリグラム当たりのマイクロモルのＡＬＰで示しされる。）を示す。

Ｃ−は、陰性対照としての最小培地の使用；１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は１０^−９Ｍ１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；ＯＬＰは１μＭオレウロペイン；ＨＴｙは１μＭヒドロキシチロソール；Ｃ＋は、陽性対照としての最適化培地の使用を示す。

データは、平均±ＳＥＭを表わす。統計：Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定に従ったＫｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定（両側）＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１対陰性対照（Ｃ−）

図２は、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３、ＯＬＰ及びＨＴｙの組み合わせの添加が、培養９日後に有意に骨芽細胞の細胞コラーゲン合成を刺激することをさらに示している。

図３〜６は、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３、オレウロペイン（ＯＬＰ）、ヒドロキシチロソール（ＨＴｙ）の存在下で培養した骨芽細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を、経時的モデルで別々に又は組み合わせで、示している。

Ｃ−は、陰性対照としての最小培地の使用；１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は１０^−９Ｍ１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；ＯＬＰは１μＭオレウロペイン；ＨＴｙは１μＭヒドロキシチロソール；Ｃ＋は、陽性対照としての最適化培地の使用を示す。

データは、平均±ＳＥＭを表わす。統計：Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定に従ったＫｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定（両側）＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１対陰性対照（Ｃ−）

結論：
図３に示されるデータから分かるように、ビタミンＤ３の添加それ自体で、骨芽細胞活性並びに骨形成及び／又は軟骨同化を示すＡＰ活性の小さいが統計的に有意な増加を、１５日目で誘発する。同様に、ＨＴｙそれ自体又はＯＬＰそれ自体のいずれかの添加はまた、ビタミンＤ３の効果に匹敵する小さな増加を１５日目でもたらす（それぞれの図を参照）。

ＨＴｙとＯＬＰの両方の組み合わせはまた、骨芽細胞の活性を増加させる（１５日目参照）が、ビタミンＤとＨＴｙ又はＯＬＰのいずれかとの組み合わせと同程度ではない。対照と統計学的に有意な差を有するポイントは１２日目及び１５日目のみである。５日目及び９日目の早期の測定値は陰性対照と統計的に異ならない。

したがって、本データは、ビタミンＤの添加の二つの効果を例示している。第１に、ＨＴｙ及びＯＬＰのいずれか一方又は両方と一緒にビタミンＤが添加されると、骨芽細胞の応答が増加する。これは、例えば１５日目のレベルの比較で見られる。

第２に、ＨＴｙ及びＯＬＰのいずれか一方又は両方と一緒にビタミンＤが添加されると、より早く骨芽細胞活性が誘発される。結論としては、ビタミンＤの添加はより早期の応答及びより強い応答をもたらす。ビタミンＤの添加は、ＯＬＰ及び／又はＨＴｙによって誘発される骨形成及び／又は軟骨同化応答を増強することが結論される。

なお、本発明の態様の１つの内容で記載される実施形態及び特徴は、本発明の他の態様にも適用されることに留意すべきである。
本発明の実施形態は例えば下記実施形態１〜１８を含む。
実施形態１：
骨形成及び／又は軟骨同化に対する１種又は複数種のポリフェノールの効果を増強するための使用のための、ビタミンＤを含む組成物。
実施形態２：
前記ポリフェノールはオレウロペイン及びヒドロキシチロソールのうちの１種又は複数種である、実施形態１に記載の使用のための組成物。
実施形態３：
１種又は複数種のポリフェノールによる骨形成及び／又は軟骨同化の刺激を増強するための使用のための、ビタミンＤ及び前記ポリフェノールを含む組成物。
実施形態４：
前記ポリフェノールはオレウロペイン及びヒドロキシチロソールのうちの１種又は複数種を含む、実施形態３に記載の使用のための組成物。
実施形態５：
前記ポリフェノールはオレウロペイン及びヒドロキシチロソールを含む、実施形態３又は４に記載の使用のための組成物。
実施形態６：
８００〜１２００ＩＵのビタミンＤ、０．０１ｍｇ〜１ｇのオレウロペイン、及び０．０１ｍｇ〜１ｇのヒドロキシチロソールを含む、実施形態５に記載の使用のための組成物。
実施形態７：
抗酸化剤、抗炎症性化合物、脂肪酸、プレバイオティック繊維、プロバイオティクス、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、ミネラル、微量元素及び／又はビタミンなどの１種又は複数種のさらなる生物活性分子を含む、実施形態１〜６のいずれかに記載の使用のための組成物。
実施形態８：
ミネラルカルシウム及び／又はマグネシウムを含む、実施形態７に記載の使用のための組成物。
実施形態９：
前記使用は高齢化集団、特に高齢患者を対象とする、実施形態１〜８のいずれかに記載の使用のための組成物。
実施形態１０：
前記使用は、骨形成及び／又は軟骨同化の刺激を増強することによる、骨形成及び／又は軟骨同化と骨吸収との関係のアンバランスに関連する障害の処置、緩和及び／又は予防における使用である、実施形態１〜９のいずれかに記載の使用のための組成物。
実施形態１１：
前記使用は、運動性を維持する及び／又は改善するためのものである、実施形態１〜１０のいずれかに記載の使用のための組成物。
実施形態１２：
前記使用は、骨の強度を改善するためのものである、実施形態１〜１１のいずれかに記載の使用のための組成物。
実施形態１３：
前記障害は、骨粗鬆症、ページェット病、人工器官の近くに観察される骨損失若しくは骨溶解、転移性骨疾患、甲状腺機能亢進症、がんによる高カルシウム血症、多発性骨髄腫、歯周病、骨関節炎、骨折若しくは骨折治癒に起因する骨欠損から選択される、実施形態１〜１２のいずれかに記載の使用のための組成物。
実施形態１４：
前記障害は骨粗鬆症である、実施形態１３に記載の使用のための組成物。
実施形態１５：
栄養組成物である、実施形態１〜１４のいずれかに記載の使用のための組成物。
実施形態１６：
少なくとも２か月、好ましくは少なくとも３か月の期間にわたって、少なくとも１日１回投与される、実施形態１〜１５のいずれかに記載の使用のための組成物。
実施形態１７：
ビタミンＤ及び１種若しくは複数種のポリフェノールを含む医薬組成物。
実施形態１８：
骨及び／又は軟骨代謝のアンバランスに関連する障害の処置、緩和及び／又は予防の方法であって、それを必要とする個体に、１種又は複数種のポリフェノールと組み合わせて有効量のビタミンＤを投与することを含む方法。

Claims (18)

1. 骨形成及び／又は軟骨同化に対する１種又は複数種のポリフェノールの効果を増強するための使用のための、ビタミンＤを含む組成物。
2. 前記ポリフェノールはオレウロペイン及びヒドロキシチロソールのうちの１種又は複数種である、請求項１に記載の使用。
3. １種又は複数種のポリフェノールによる骨形成及び／又は軟骨同化の刺激を増強するための使用のための、ビタミンＤ及び前記ポリフェノールを含む組成物。
4. 前記ポリフェノールはオレウロペイン及びヒドロキシチロソールのうちの１種又は複数種を含む、請求項３に記載の使用のための組成物。
5. 前記ポリフェノールはオレウロペイン及びヒドロキシチロソールを含む、請求項３又は４に記載の使用のための組成物。
6. ８００〜１２００ＩＵのビタミンＤ、０．０１ｍｇ〜１ｇのオレウロペイン、及び０．０１ｍｇ〜１ｇのヒドロキシチロソールを含む、請求項５に記載の使用のための組成物。
7. 抗酸化剤、抗炎症性化合物、脂肪酸、プレバイオティック繊維、プロバイオティクス、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、ミネラル、微量元素及び／又はビタミンなどの１種又は複数種のさらなる生物活性分子を含む、請求項１、２又は３〜６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
8. ミネラルカルシウム及び／又はマグネシウムを含む、請求項７に記載の使用のための組成物。
9. 前記使用は高齢化集団、特に高齢患者を対象とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
10. 前記使用は、骨形成及び／又は軟骨同化の刺激を増強することによる、骨形成及び／又は軟骨同化と骨吸収との関係のアンバランスに関連する障害の処置、緩和及び／又は予防における使用である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
11. 前記使用は、運動性を維持する及び／又は改善するためのものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
12. 前記使用は、骨の強度を改善するためのものである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
13. 前記障害は、骨粗鬆症、ページェット病、人工器官の近くに観察される骨損失若しくは骨溶解、転移性骨疾患、甲状腺機能亢進症、がんによる高カルシウム血症、多発性骨髄腫、歯周病、骨関節炎、骨折若しくは骨折治癒に起因する骨欠損から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
14. 前記障害は骨粗鬆症である、請求項１３に記載の使用のための組成物。
15. 栄養組成物である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
16. 少なくとも２か月、好ましくは少なくとも３か月の期間にわたって、少なくとも１日１回投与される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
17. ビタミンＤ及び１種若しくは複数種のポリフェノールを含む医薬組成物。
18. 骨及び／又は軟骨代謝のアンバランスに関連する障害の処置、緩和及び／又は予防の方法であって、それを必要とする個体に、１種又は複数種のポリフェノールと組み合わせて有効量のビタミンＤを投与することを含む方法。