JP2020054337A - Dnaエンコードライブラリーを提供するための方法、dnaエンコードライブラリー、およびdnaエンコードライブラリーをデコードする方法 - Google Patents
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Abstract
Description
しかし、サンガーシーケンシングは、処理量が低い、すなわちDNAバーコードの“読取り”に多くの時間を消費し、したがって読出しが不経済であるという欠点をもつ。
さらに、HTSはこの数年でより安価になったけれども、それは多くの大学研究者にとって依然としてきわめて高価である。外注によるシーケンシング課題は普通は数週間かかるが、研究者はシーケンシング実験をコントロールできない。
a)異なるDNAバーコード配列を含むことにより互いに異なる多数の異なるDNA分子を合成し、その際、各DNAバーコード配列は少なくとも、少なくとも第1部分、第2部分および第3部分を含む第1コーディング領域DNA配列を含み、その際、第2部分は第1部分と第3部分の間に位置し、第2部分はすべてのDNA分子間で少なくとも2つのヌクレオチドが異なる;そして
b)多数の異なるDNA分子のそれぞれを少なくとも1つの特定の物質に結合させて異なるDNA−物質コンジュゲートを形成し、その際、DNA−物質コンジュゲートは特定の物質およびそれらのDNA分子によって互いに異なる;
第1部分および第3部分は第1コーディング領域の第2部分に関する情報をエンコードし、その際、特定の第1部分および/または特定の第3部分は、DNAエンコードライブラリー中のすべてのDNA−物質コンジュゲートのグループより小さな特定グループのDNA−物質コンジュゲートをユニークにコードすることを特徴とする。
i)第1コーディング領域DNA配列は少なくとも第4部分を含み、その際、第2部分は第4部分と第3部分の間に位置し、その際、第1コーディング領域の第1部分と第4部分の組合わせおよび第1部分と第3部分の組合わせは両方とも第1コーディング領域の第2部分についての情報をエンコードする;ならびに
ii)各バーコード配列は少なくとも、少なくとも第1部分、第2部分、第3部分、および第4部分を含む第2コーディング領域DNA配列を含み、その際、第2部分は第4部分と第3部分の間に位置し、第2部分はすべてのDNA分子間で少なくとも2つのヌクレオチドが異なり、その際、第2コーディング領域の第1部分と第4部分の組合わせおよび第1部分と第3部分の組合わせは両方とも第2コーディング領域の第2部分についての情報をエンコードする;
その際、特定のコーディング領域における第1部分と第4部分の特定の組合わせは、第1部分単独によってエンコードされるすべてのDNA−物質コンジュゲートのグループより小さな特定グループのDNA−物質コンジュゲートをユニークにコードする。
i)各バーコード配列は少なくとも、少なくとも第1部分、第2部分、第3部分、および第4部分を含む第2コーディング領域DNA配列を含み、その際、第2部分は第4部分と第3部分の間に位置し、第2部分はすべてのDNA分子間で少なくとも2つのヌクレオチドが異なり、その際、第2コーディング領域の第1部分と第4部分の組合わせおよび第1部分と第3部分の組合わせは両方とも第2コーディング領域の第2部分についての情報をエンコードする;ならびに
ii)各バーコード配列は少なくとも、少なくとも第1部分、第2部分、第3部分、および第4部分を含む第3コーディング領域DNA配列を含み、その際、第2部分は第4部分と第3部分の間に位置し、第2部分はすべてのDNA分子間で少なくとも2つのヌクレオチドが異なり、その際、第3コーディング領域の第1部分と第4部分の組合わせおよび第1部分と第3部分の組合わせは両方とも第3コーディング領域の第2部分についての情報をエンコードする;
その際、特定のコーディング領域における第1部分と第4部分の特定の組合わせは、第1部分によってエンコードされるDNA−物質コンジュゲートのグループより小さな特定グループのDNA−物質コンジュゲートをユニークにコードする。
i)第1コーディング領域DNA配列は少なくとも第4部分を含み、その際、第2部分は第4部分と第3部分の間に位置し、その際、第1コーディング領域の第1部分と第4部分の組合わせおよび第1部分と第3部分の組合わせは両方とも第1コーディング領域の第2部分についての情報をエンコードする;ならびに
ii)各バーコード配列は少なくとも、少なくとも第1部分、第2部分、第3部分、および第4部分を含む第2コーディング領域DNA配列を含み、その際、第2部分は第4部分と第3部分の間に位置し、第2部分はすべてのDNA分子間で少なくとも2つのヌクレオチドが異なり、その際、第2コーディング領域の第1部分と第4部分の組合わせおよび第1部分と第3部分の組合わせは両方とも第2コーディング領域の第2部分についての情報をエンコードする;
その際、特定のコーディング領域の第1部分と第4部分の特定の組合わせは、第1部分単独によってエンコードされるすべてのDNA−物質コンジュゲートのグループより小さな特定グループのDNA−物質コンジュゲートをユニークにコードする。
さらに、本発明によれば、本発明のDNAエンコードライブラリーをデコードする方法が提供される。その方法は下記を含む:
a)請求項5〜8のうちの1つによるDNAエンコードライブラリーを鋳型として用いてqPCRを実施し、その際、下記のプライマーを使用する:
あらゆるDNA−物質コンジュゲートの第1コーディング領域を増幅するためのプライマーAおよびプライマーB;ならびに
第1コーディング領域の異なる第1部分にアニールする多数の異なるプライマーA−xN、および第1コーディング領域の異なる第3部分にアニールする多数の異なるプライマーB−yN;その際、プライマーA−xNは5’−末端においてx個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーAと同一の長さを有し、プライマーB−yNは5’−末端においてy個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーBと同一の長さを有し、NはA、T、GまたはCを表わし、xおよびyはそれらのプライマーの3’−末端におけるA、T、GまたはCのいずれかの総数を表わし、その際、xは2から6、好ましくは4までの整数である;
b)各プライマーA−xNおよび各プライマーB−xNの信号値の積を下記の方程式により計算する:
数値 (A−xN)i=信号値[(A−xN)i+B]・信号値[(A−xN)i+(B−xN)i];および
数値(B−yN)i=信号値[(B−yN)i+A]・信号値[(B−yN)i+(A−xn)i],
その際、iは整数であり、特定のプライマーを規定し、“+”記号は2つのプライマーの組合わせを示し;その際、信号値は同一領域にアニールした異なるプライマーを用いたqPCR定量の全セットに関する存在量のパーセントである;そして
c)プライマー(A−xN)iおよび(B−yN)iのそれぞれについて得られた積を比較し、その際、高い数値をもつプライマーはそのDNAエンコードライブラリー中に高い濃度で存在するDNA−物質コンジュゲートをコードする。
i)各プライマーA−xNおよび各プライマーB−yNについて得られた数値の積を下記の方程式により計算する:
数値(A−B)i=数値(A−xN)i・数値(B−yN)i;
ii)プライマー(A−xN)iと(B−yN)iの組合わせのそれぞれについて得られた積を比較し、その際、高い数値をもつプライマー組合わせはそのDNAエンコードライブラリー中に高い濃度で存在するDNA−物質コンジュゲートをコードする。
i)下記のプライマーを用いてqPCRを実施する:
あらゆるDNA−物質コンジュゲートの第1コーディング領域を増幅するための第1コーディング領域プライマーAおよび第1コーディング領域プライマーB;ならびに
第1コーディング領域の異なる第1部分、または第1部分および第4部分にアニールする、多数の異なるプライマーA−xN、ならびに第1コーディング領域の異なる第3部分にアニールする多数の異なるプライマーB−yN;その際、A−xNは5’−末端においてx個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーAと同一の長さを有し、B−yNは5’−末端においてy個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーBと同一の長さを有し、NはA、T、GまたはCを表わし、xおよびyはそれらのプライマーの3’−末端におけるA、T、GまたはCのいずれかの総数を表わし、その際、xは6から10、好ましくは8までの整数であり、yは2から6、好ましくは4までの整数である;ならびに
あらゆるDNA−物質コンジュゲートの第2コーディング領域を増幅するための第2コーディング領域プライマーCおよび第2コーディング領域プライマーD;ならびに
第2コーディング領域の異なる第1部分、または第1部分および第4部分にアニールする、多数の異なるプライマーD−yN、ならびに第2コーディング領域の異なる第3部分にアニールする多数の異なるプライマーC−xN;その際、プライマーC−xNは5’−末端においてx個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーCと同一の長さを有し、プライマーD−yNは5’−末端においてy個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーDと同一の長さを有し、NはA、T、GまたはCを表わし、xおよびyはそれらのプライマーの3’−末端におけるA、T、GまたはCのいずれかの総数を表わし、その際、xは6から10、好ましくは8までの整数であり、yは2から6、好ましくは4までの整数である;
ii)各プライマーA−xN、各プライマーB−yN、各プライマーC−xNおよび各プライマーD−yNについて得られた信号値の積を下記の方程式により計算する:
数値(A−xN)i=信号値[(A−xN)i+B]・信号値[(A−xN)i+(B−xN)i];
数値(B−yN)i=信号値[(B−yN)i+A]・信号値[(B−yN)i+(A−xN)i],
数値(C−xN)i=信号値[(C−xN)i+D]・信号値[(C−xN)i+(D−xn)i],
数値(D−yN)i=信号値[(D−yN)i+C]・信号値[(D−yN)i+(C−xn)i],
その際、iは整数であり、特定のプライマーを規定し、“+”記号は2つのプライマーの組合わせを示し;その際、信号値は同一領域にアニールした異なるプライマーを用いたqPCR定量の全セットに関する存在量のパーセントである;そして
iii)プライマー(A−xN)i、(B−yN)i、(C−xN)iおよび(D−yN)iのそれぞれについて得られた積を比較し、その際、高い数値をもつプライマーはそのDNAエンコードライブラリー中に高い濃度で存在するDNA−物質コンジュゲートをコードする。
i)各プライマーA−xNおよび各プライマーB−yN、各プライマーA−xNおよび各プライマーD−xN、ならびに各プライマーC−yNおよびD−xNについて得られた数値の積を下記の方程式により計算する:
数値(A−B)i=数値(A−xN)i・数値(B−yN)i;
数値(A−D)i=数値(A−xN)i・数値(D−yN)i;
数値(C−D)i=数値(C−xN)i・数値(D−yN)i;
ii)各プライマーiについての数値(A−B)i、(A−D)iおよび(C−D)iの積を下記の方程式により計算する:
数値i=数値(A−B)i・数値(A−D)i・数値(C−D)i
iii)得られた積である数値iを比較し、その際、高い数値をもつプライマー組合わせiはそのDNAエンコードライブラリー中に高い濃度で存在するDNA−物質コンジュゲートをコードする。
i)下記のプライマーを用いてqPCRを実施する:
あらゆるDNA−物質コンジュゲートの第1コーディング領域を増幅するための、第1コーディング領域プライマーAおよび第1コーディング領域プライマーB;ならびに
第1コーディング領域の異なる第1部分、または第1部分および第4部分にアニールする、多数の異なるプライマーA−xN、ならびに第1コーディング領域の異なる第3部分にアニールする多数の異なるプライマーB−yN;その際、A−xNは5’−末端においてx個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーAと同一の長さを有し、Bは5’−末端においてy個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーB−yNと同一の長さを有し、NはA、T、GまたはCを表わし、xおよびyはそれらのプライマーの3’−末端におけるA、T、GまたはCのいずれかの総数を表わし、その際、xは6から10、好ましくは8までの整数であり、yは2から6、好ましくは4までの整数である;ならびに
あらゆるDNA−物質コンジュゲートの第2コーディング領域を増幅するための、第2コーディング領域プライマーCおよび第2コーディング領域プライマーD;ならびに
第2コーディング領域の異なる第1部分、または第1部分および第4部分にアニールする、多数の異なるプライマーD−yN、ならびに第2コーディング領域の異なる第3部分にアニールする多数の異なるプライマーC−xN;その際、プライマーC−xNは5’−末端においてx個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーCと同一の長さを有し、プライマーD−yNは5’−末端においてy個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーDと同一の長さを有し、NはA、T、GまたはCを表わし、xおよびyはそれらのプライマーの3’−末端におけるA、T、GまたはCのいずれかの総数を表わし、その際、xは6から10、好ましくは8までの整数であり、yは2から6、好ましくは4までの整数である;
あらゆるDNA−物質コンジュゲートの第3コーディング領域を増幅するための、第3コーディング領域プライマーEおよび第3コーディング領域プライマーF;ならびに
第3コーディング領域の異なる第1部分にアニールする多数の異なるプライマーE−xN、および第3コーディング領域の異なる第3部分にアニールする多数の異なるプライマーF−yN;その際、プライマーE−xNは5’−末端においてx個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーEと同一の長さを有し、プライマーF−yNは5’−末端においてy個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーFと同一の長さを有し、NはA、T、GまたはCを表わし、xおよびyはそれらのプライマーの3’−末端におけるA、T、GまたはCのいずれかの総数を表わし、その際、xは6から10、好ましくは8までの整数であり、yは2から6、好ましくは4までの整数である;
ii)各プライマーA−xN、各プライマーB−yN、各プライマーC−xN、各プライマーD−yN、各プライマーE−xNおよび各プライマーF−yNの信号値の積を下記の方程式により計算する:
数値(A−xN)i=信号値[(A−xN)i+B]・信号値[(A−xN)i+(B−xN)i];
数値(B−yN)i=信号値[(B−yN)i+A]・信号値[(B−yN)i+(A−xN)i],
数値(C−xN)i=信号値[(C−xN)i+D]・信号値[(C−xN)i+(D−xN)i],
数値(D−yN)i=信号値[(D−yN)i+C]・信号値[(D−yN)i+(C−xN)i],
数値(E−xN)i=信号値[(E−xN)i+F]・信号値[(E−xN)i+(F−xn)i],
数値(F−yN)i=信号値[(F−yN)i+E]・信号値[(F−yN)i+(E−xN)i],
その際、iは整数であり、特定のプライマーを規定し、“+”記号は2つのプライマーの組合わせを示し;その際、信号値は同一領域にアニールした異なるプライマーを用いたqPCR定量の全セットに関する存在量のパーセントである;そして
iii)プライマー(A−xN)i、(B−yN)i、(C−xN)i、(D−yN)i、(E−xN)iおよび(N−yN)iのそれぞれについて得られた積を比較し、その際、高い数値をもつプライマーはそのDNAエンコードライブラリー中に高い濃度で存在するDNA−物質コンジュゲートをコードする。
i)各プライマーA−xNおよび各プライマーB−yNについて、各プライマーA−xNおよび各プライマーD−xNについて、各プライマーC−yNおよびD−xNについて、各プライマーA−xNおよびN−yNについて、各プライマーM−xNおよびD−yNについて、ならびに各プライマーM−xNおよびN−yNについて得られた数値の積を下記の方程式により計算する:
数値(A−B)i=数値(A−xN)i・数値(B−yN)i;
数値(A−D)i=数値(A−xN)i・数値(D−yN)i;
数値(C−D)i=数値(C−xN)i・数値(D−yN)i;
数値(A−F)i=数値(A−xN)i・数値(F−yN)i;
数値(E−D)i=数値(E−xN)i・数値(D−yN)i;
数値(E−F)i=数値(E−xN)i・数値(F−yN)i;
ii)各プライマー組合わせiについて、数値(A−B)i、(A−D)i、(C−D)i、(A−F)i、(E−D)iおよび(E−F)iの積を下記の方程式により計算する:
数値i=数値(A−B)i・数値(A−D)i・数値(C−D)i・数値(A−F)i・数値(E−D)i・数値(E−F)i;
iii)得られた積である数値iを比較し、その際、高い数値をもつプライマー組合わせiはそのDNAエンコードライブラリー中に高い濃度で存在するDNA−物質コンジュゲートをコードする。
数値i’=log10[数値(A−B)i・数値(A−D)i・数値(C−D)i・数値(A−F)i・数値(E−D)i・数値(E−F)i]。
図1Aは、単一コーディング領域2をもつDNAコード1(コーディング領域III)についてのqPCR−マトリクスを作製するためにコーディングアルゴリズムがどのように作動するかを示す。EおよびFは一次プライマーであり、ExeおよびFxfは二次プライマーである。一次プライマーEは第1領域 #1の上流(すなわち、5’−末端側)に結合し、一次プライマーFは第3領域 #3の上流(すなわち、5’−末端側)に結合する。2つの一次プライマーE、Fのみを用いるqPCRは、コーディング領域IIIをもつDNAエンコードライブラリーのすべてのDNA−物質コンジュゲートのDNAバーコードを増幅する。少なくとも1つの一次プライマーE、F、および少なくとも1つの二次プライマーExe、Fxfを用いるqPCRを、“一次qPCR”と呼ぶ。図1Aは、3つのコード部分(サブコード)#1、#2、#3をもつ単一コーディング領域IIIを含むqPCR鋳型を示す。コーディング領域IIIの第2部分 #2の配列はユニークサブコードである。第1部分 #1と第3部分 #3のそれぞれの組合わせも、ユニークコードを表わすことができる。したがって、第2部分 #2の配列は第1部分 #1と第3部分 #3の組合わせに対応する。各コード部分(サブコード)#1、#2、#3について、いずれかの配列対間(たとえば、2つの異なるxe配列間)の数の差nは最小であるが、nは≧2でなければならない。これは、コード部分#1、#2、#3は互いに少なくとも2つのヌクレオチドが異なることを意味する。
単一コーディング領域のみを含むDNAコードについて、各コードは3つの部分、#1(第1部分)、#2(第2部分)および#3(第3部分)をコードする。それぞれの#2配列はユニークコードであり、一方、#1と#3の組合わせもユニークコードを表わすことができる(参照:たとえば図1A)。したがって、#2の配列は#1と#3の組合わせに対応する。
実施例2 − 2つのコーディング領域をもつDNAバーコードを含むDEL
2つのコーディング領域を含むDNAコードについて、各サブコードは4つの部分、たとえば第1コーディング領域 #1(第1部分)、#2(第2部分)、#3(第3部分)および#4(第4部分)、ならびに第2コーディング領域 #1(第1部分)、#2(第2部分)、#3(第3部分)および#4(第4部分)をもつ(参照:たとえば図1B)。それぞれの#2(第2部分)配列はユニークサブコードであり、一方、#1、#3および#4のそれぞれの組合わせは#2に対応し、#1、#3および#4のそれぞれの組合わせは#2に対応する。
実施例3 − 2つより多いコーディング領域をもつDNAバーコードを含むDEL
2つより多いコーディング領域をもつDNAコード(参照:たとえば図1Bまたは図2)について、両端の2つのサブコードを実施例2に従って設計し、それらの間のサブコード(単数または複数)を実施例1、実施例2または実施例4のいずれかに従って設計する。スプリット&プール(split-and-pool)法を用いて高品質DELを合成できる可能性はきわめて低い。したがって、4未満のサブコードを含むDELが好ましい。
このDELのDNAバーコードは5つの部分、#1(第1部分)、#2(第2部分)、#3(第3部分)、#4(第4部分)および#5(第5部分)をもつ。
実施例5 − デコーディングプロセスの記載:1つの(サブ)コードのデコーディング
プライマーAをu個の異なるプライマーB−xbと共に用い、プライマーBをv個の異なるプライマーA−xaと共に用いて、第1コーディング領域Iについて一次qPCRマトリクスを構築する。したがって、得られるマトリクスのサイズはu・vである(参照:たとえば図3)。同じマトリクスを第2コーディング領域IIおよび第3コーディング領域IIIについても構築することができる。
数値i=数値i マトリクス−A+D・数値i マトリクス−A+B・数値i マトリクス−C+D
に基づいて結論することができ、その際、数値iはDEL中の特定のDNAバーコードに関係しそれの量に比例する数値である。言い換えると、その数値iは2つの構築ブロックおよび2つのサブコードを連結することによるコンビナトリアル合成から得られた個々のDNA配列(バーコード構造)に関係する。
この方法は2より多いサブコードを含むDELについて十分な定量的デコーディング解を提供することはできない。しかし、各種の一次、二次および三次rtPCRマトリクスを組み合わせることにより、幾つかのサブコードを含むDNAコードに対応する特定の化合物iについての数値iを提供することができる。すべてのフォワードおよびバックワードプライマーを組み合わせてマトリクスを構築することができる。
数値i=log10(数値i マトリクス−A+D・数値i マトリクス−A+N・数値i マトリクス−M+D・数値i マトリクス−A+B・数値i マトリクス−C+D・数値i マトリクス−M+N)
に従って計算することができ、その際、数値i マトリクス−A+D、数値i マトリクス−A+Nおよび数値i マトリクス−M+Dは二次もしくは三次マトリクスのいずれかからのものまたはそれらを組み合わせたものであってもよく、数値i マトリクス−A+B・数値i マトリクス−C+D・数値i マトリクス−M+Nは二次マトリクスからのものである。
DBC: DNAバーコード配列;
S: 物質;
I: 第1コーディング領域DNA配列;
II: 第2コーディング領域DNA配列;
III: 第3コーディング領域DNA配列;
#1: コーディング領域DNA配列の第1部分;
#2: コーディング領域DNA配列の第2部分;
#3: コーディング領域DNA配列の第3部分;
#4: コーディング領域DNA配列の第4部分;
#5: コーディング領域DNA配列の第5部分;
A、B、C、D、
E、F、M、N: 一次プライマー;
Axa、Bxb、Cxc、
Dxd、Exe、Fxf、
Mxm、Nyn: 二次プライマー;
Axaya、Dxdyd,
Mxmym、Nxnyn: 三次プライマー;
1a、1b: すべてのDBSに結合する一次プライマー;
2a、2b: CBSのDBSのみに結合する二次プライマー;
3a、3b: Theoのみに結合する二次プライマー;
P2’: コーディング領域Iの第1部分 #1に結合するプライマー;
P2Y: コーディング領域Iの第3部分 #3にアニールするプライマー;
P2Y’:コーディング領域IIの第1部分 #1にアニールするプライマー;
P1Y: コーディング領域IIの第3部分 #3にアニールするプライマー;
P4’: コーディング領域IIIの第1部分 #1にアニールするプライマー;
P5: コーディング領域IIIの第3部分 #3にアニールするプライマー
Claims (15)
- DNAエンコードライブラリーを提供するための、下記を含む方法:
a)異なるDNAバーコード配列を含むことにより互いに異なる多数の異なるDNA分子を合成し、その際、各DNAバーコード配列は少なくとも、少なくとも第1部分、第2部分および第3部分を含む第1コーディング領域DNA配列を含み、その際、第2部分は第1部分と第3部分の間に位置し、第2部分はすべてのDNA分子間で少なくとも2つのヌクレオチドが異なる;そして
b)多数の異なるDNA分子のそれぞれを少なくとも1つの特定の物質に結合させて異なるDNA−物質コンジュゲートを形成し、その際、DNA−物質コンジュゲートは特定の物質およびそれらのDNA分子によって互いに異なる;
第1部分および第3部分は第1コーディング領域の第2部分に関する情報をエンコードし、その際、特定の第1部分および/または特定の第3部分は、DNAエンコードライブラリー中のすべてのDNA−物質コンジュゲートのグループより小さな特定グループのDNA−物質コンジュゲートをユニークにコードすることを特徴とする。 - i)第1コーディング領域DNA配列は少なくとも第4部分を含み、その際、第2部分は第4部分と第3部分の間に位置し、その際、第1コーディング領域の第1部分と第4部分の組合わせおよび第1部分と第3部分の組合わせは両方とも第1コーディング領域の第2部分についての情報をエンコードする;ならびに
ii)各バーコード配列は少なくとも、少なくとも第1部分、第2部分、第3部分、および第4部分を含む第2コーディング領域DNA配列を含み、その際、第2部分は第4部分と第3部分の間に位置し、第2部分はすべてのDNA分子間で少なくとも2つのヌクレオチドが異なり、その際、第2コーディング領域の第1部分と第4部分の組合わせおよび第1部分と第3部分の組合わせは両方とも第2コーディング領域の第2部分についての情報をエンコードする;
その際、特定のコーディング領域における第1部分と第4部分の特定の組合わせは、第1部分単独によってエンコードされるすべてのDNA−物質コンジュゲートのグループより小さな特定グループのDNA−物質コンジュゲートをユニークにコードする;
ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - i)各バーコード配列は少なくとも、少なくとも第1部分、第2部分、第3部分、および第4部分を含む第2コーディング領域DNA配列を含み、その際、第2部分は第4部分と第3部分の間に位置し、第2部分はすべてのDNA分子間で少なくとも2つのヌクレオチドが異なり、その際、第2コーディング領域の第1部分と第4部分の組合わせおよび第1部分と第3部分の組合わせは両方とも第2コーディング領域の第2部分についての情報をエンコードする;ならびに
ii)各バーコード配列は少なくとも、少なくとも第1部分、第2部分、第3部分、および第4部分を含む第3コーディング領域DNA配列を含み、その際、第2部分は第4部分と第3部分の間に位置し、第2部分はすべてのDNA分子間で少なくとも2つのヌクレオチドが異なり、その際、第3コーディング領域の第1部分と第4部分の組合わせおよび第1部分と第3部分の組合わせは両方とも第3コーディング領域の第2部分についての情報をエンコードする;
その際、特定のコーディング領域における第1部分と第4部分の特定の組合わせは、第1部分によってエンコードされるDNA−物質コンジュゲートのグループより小さな特定グループのDNA−物質コンジュゲートをユニークにコードする;
ことを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。 - 少なくとも1つのコーディング領域DNA配列、場合によりすべてのコーディング領域DNA配列が、少なくとも第1部分、第2部分、第3部分、第4部分および第5部分を含み、その際、第2部分は第4部分と第5部分の間に位置し、第2部分はすべてのDNA分子間で少なくとも2つのヌクレオチドが異なり、
その際、コーディング領域の第1部分と第4部分の組合わせおよび第5部分と第3部分の組合わせはコーディング領域、好ましくはすべてのコーディング領域の第2部分についての情報をエンコードし、
その際、第1部分と第4部分の特定の組合わせは、第1部分単独によってエンコードされるDNA−物質コンジュゲートのグループより小さな特定グループのDNA−物質コンジュゲートをユニークにコードし、
その際、第5部分と第3部分の特定の組合わせは、第3部分単独によってエンコードされるDNA−物質コンジュゲートのグループより小さな特定グループのDNA−物質コンジュゲートをユニークにコードする;
ことを特徴とする、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。 - 多数の異なるDNA−リガンドコンジュゲートを含むDNAエンコードライブラリーであって、その際、DNA−リガンドコンジュゲートはそれらのリガンドおよびそれらのDNA分子により互いに異なり、
その際、DNA−リガンドコンジュゲートのDNA分子は異なるDNAバーコード配列を含むことにより互いに異なり、その際、各DNAバーコード配列は少なくとも、少なくとも第1部分、第2部分および第3部分を含む第1コーディング領域DNA配列を含み、その際、第2部分は第1部分と第3部分の間に位置し、第2部分はすべてのDNA分子間で少なくとも2つのヌクレオチドが異なり;
第1コーディング領域の第1部分および第3部分は第2部分に関する情報をエンコードすることを特徴とし、その際、特定の第1部分および/または特定の第3部分は、DNAエンコードライブラリーのすべてのDNA−リガンドコンジュゲートのグループより小さな特定グループのDNA−リガンドコンジュゲートをユニークにコードする。 - i)第1コーディング領域DNA配列は少なくとも第4部分を含み、その際、第2部分は第4部分と第3部分の間に位置し、その際、第1コーディング領域の第1部分と第4部分の組合わせおよび第1部分と第3部分の組合わせは両方とも第1コーディング領域の第2部分についての情報をエンコードする;ならびに
ii)各バーコード配列は少なくとも、少なくとも第1部分、第2部分、第3部分、および第4部分を含む第2コーディング領域DNA配列を含み、その際、第2部分は第4部分と第3部分の間に位置し、第2部分はすべてのDNA分子間で少なくとも2つのヌクレオチドが異なり、その際、第2コーディング領域の第1部分と第4部分の組合わせおよび第1部分と第3部分の組合わせは両方とも第2コーディング領域の第2部分についての情報をエンコードする;
その際、特定のコーディング領域の第1部分と第4部分の特定の組合わせは、第1部分単独によってエンコードされるすべてのDNA−リガンドコンジュゲートのグループより小さな特定グループのDNA−リガンドコンジュゲートをユニークにコードする;
ことを特徴とする、請求項5に記載のDNAエンコードライブラリー。 - 各バーコード配列は少なくとも第3コーディング領域DNA配列を含み、それは第2コーディング領域と同じDNA鎖上にあり、少なくとも第1部分、第2部分、第3部分、および第4部分を含み、その際、第2部分は第4部分と第3部分の間に位置し、第2部分はすべてのDNA分子間で少なくとも2つのヌクレオチドが異なり、その際、第3コーディング領域の第1部分と第4部分の組合わせおよび第1部分と第3部分の組合わせは両方とも第3コーディング領域の第2部分についての情報をエンコードし、その際、第2コーディング領域およ第3コーディング領域における第1部分と第4部分の特定の組合わせは、第1部分単独によってエンコードされるすべてのDNA−リガンドコンジュゲートのグループより小さな特定グループのDNA−リガンドコンジュゲートをユニークにコードする
ことを特徴とする、請求項6に記載のDNAエンコードライブラリー。 - 少なくとも1つのコーディング領域DNA配列、場合によりすべてのコーディング領域DNA配列は、少なくとも第1部分、第2部分、第3部分、第4部分および第5部分を含み、その際、第2部分は第4部分と第5部分の間に位置し、第2部分はすべてのDNA分子間で少なくとも2つのヌクレオチドが異なり、
その際、コーディング領域の第1部分と第4部分の組合わせおよび第5部分と第3部分の組合わせはコーディング領域、好ましくはすべてのコーディング領域の第2部分についての情報をエンコードし、
その際、第1部分と第4部分の特定の組合わせは、第1部分単独によってエンコードされるすべてのDNA−リガンドコンジュゲートのグループより小さな特定グループのDNA−リガンドコンジュゲートをユニークにコードし、
その際、第5部分と第3部分の特定の組合わせは、第3部分単独によってエンコードされるすべてのDNA−リガンドコンジュゲートのグループより小さな特定グループのDNA−リガンドコンジュゲートをユニークにコードする;
ことを特徴とする、請求項5〜7のいずれか1項に記載のDNAエンコードライブラリー。 - 請求項5〜8のいずれか1項に記載のDNAエンコードライブラリーをデコードする、下記を含む方法:
a)請求項5〜8のうちの1つによるDNAエンコードライブラリーを鋳型として用いてqPCRを実施し、その際、下記のプライマーを使用する:
あらゆるDNA−リガンドコンジュゲートの第1コーディング領域を増幅するためのプライマーAおよびプライマーB;ならびに
第1コーディング領域の異なる第1部分にアニールする多数の異なるプライマーA−xN、および第1コーディング領域の異なる第3部分にアニールする多数の異なるプライマーB−yN;その際、プライマーA−xNは5’−末端においてx個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーAと同一の長さを有し、プライマーB−yNは5’−末端においてy個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーBと同一の長さを有し、NはA、T、GまたはCを表わし、xおよびyはそれらのプライマーの3’−末端におけるA、T、GまたはCのいずれかの総数を表わし、その際、xは2から6、好ましくは4までの整数である;
b)各プライマーA−xNおよび各プライマーB−xNの信号値の積を下記の方程式により計算する:
数値 (A−xN)i=信号値[(A−xN)i+B]・信号値[(A−xN)i+(B−xN)i];および
数値(B−yN)i=信号値[(B−yN)i+A]・信号値[(B−yN)i+(A−xn)i],
その際、iは整数であり、特定のプライマーを規定し、“+”記号は2つのプライマーの組合わせを示し;その際、信号値は同一領域にアニールした異なるプライマーを用いたqPCR定量の全セットに関する存在量のパーセントである;そして
c)プライマー(A−xN)iおよび(B−yN)iのそれぞれについて得られた積を比較し、その際、高い数値をもつプライマーはそのDNAエンコードライブラリー中に高い濃度で存在するDNA−リガンドコンジュゲートをコードする。 - i)各プライマーA−xNおよび各プライマーB−yNについて得られた数値の積を下記の方程式により計算する:
数値(A−B)i=数値(A−xN)i・数値(B−yN)i;
ii)プライマー(A−xN)iと(B−yN)iの組合わせのそれぞれについて得られた積を比較し、その際、高い数値をもつプライマー組合わせはそのDNAエンコードライブラリー中に高い濃度で存在するDNA−リガンドコンジュゲートをコードする;
ことを特徴とする、請求項9に記載の方法。 - qPCRが請求項6〜8のいずれか1項に記載のDNAエンコードライブラリーを用いて実施されることを特徴とし、その方法は下記を含む:
i)下記のプライマーを用いてqPCRを実施する:
あらゆるDNA−リガンドコンジュゲートの第1コーディング領域を増幅するための第1コーディング領域プライマーAおよび第1コーディング領域プライマーB;ならびに
第1コーディング領域の異なる第1部分、または第1部分および第4部分にアニールする、多数の異なるプライマーA−xN、ならびに第1コーディング領域の異なる第3部分にアニールする多数の異なるプライマーB−yN;その際、A−xNは5’−末端においてx個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーAと同一の長さを有し、B−yNは5’−末端においてy個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーBと同一の長さを有し、NはA、T、GまたはCを表わし、xおよびyはそれらのプライマーの3’−末端におけるA、T、GまたはCのいずれかの総数を表わし、その際、xは6から10、好ましくは8までの整数であり、yは2から6、好ましくは4までの整数である;ならびに
あらゆるDNA−リガンドコンジュゲートの第2コーディング領域を増幅するための第2コーディング領域プライマーCおよび第2コーディング領域プライマーD;ならびに
第2コーディング領域の異なる第1部分、または第1部分および第4部分にアニールする、多数の異なるプライマーD−yN、ならびに第2コーディング領域の異なる第3部分にアニールする多数の異なるプライマーC−xN;その際、プライマーC−xNは5’−末端においてx個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーCと同一の長さを有し、プライマーD−yNは5’−末端においてy個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーDと同一の長さを有し、NはA、T、GまたはCを表わし、xおよびyはそれらのプライマーの3’−末端におけるA、T、GまたはCのいずれかの総数を表わし、その際、xは6から10、好ましくは8までの整数であり、yは2から6、好ましくは4までの整数である;
ii)各プライマーA−xN、各プライマーB−yN、各プライマーC−xNおよび各プライマーD−yNについて得られた信号値の積を下記の方程式により計算する:
数値(A−xN)i=信号値[(A−xN)i+B]・信号値[(A−xN)i+(B−xN)i];
数値(B−yN)i=信号値[(B−yN)i+A]・信号値[(B−yN)i+(A−xN)i],
数値(C−xN)i=信号値[(C−xN)i+D]・信号値[(C−xN)i+(D−xn)i],
数値(D−yN)i=信号値[(D−yN)i+C]・信号値[(D−yN)i+(C−xn)i],
その際、iは整数であり、特定のプライマーを規定し、“+”記号は2つのプライマーの組合わせを示し;その際、信号値は同一領域にアニールした異なるプライマーを用いたqPCR定量の全セットに関する存在量のパーセントである;そして
iii)プライマー(A−xN)i、(B−yN)i、(C−xN)iおよび(D−yN)iのそれぞれについて得られた積を比較し、その際、高い数値をもつプライマーはそのDNAエンコードライブラリー中に高い濃度で存在するDNA−リガンドコンジュゲートをコードする;
ことを特徴とする、請求項9または10に記載の方法。 - i)各プライマーA−xNおよび各プライマーB−yN、各プライマーA−xNおよび各プライマーD−xN、ならびに各プライマーC−yNおよびD−xNについて得られた数値の積を下記の方程式により計算する:
数値(A−B)i=数値(A−xN)i・数値(B−yN)i;
数値(A−D)i=数値(A−xN)i・数値(D−yN)i;
数値(C−D)i=数値(C−xN)i・数値(D−yN)i;
ii)各プライマーiについての数値(A−B)i、(A−D)iおよび(C−D)iの積を下記の方程式により計算する:
数値i=数値(A−B)i・数値(A−D)i・数値(C−D)i
iii)得られた積である数値iを比較し、その際、高い数値をもつプライマー組合わせiはそのDNAエンコードライブラリー中に高い濃度で存在するDNA−リガンドコンジュゲートをコードする;
前記請求項のいずれか1項に記載の方法。 - 請求項7または8に記載のDNAエンコードライブラリーを鋳型として用いてqPCRを実施することを特徴とし、その方法は下記を含む:
i)下記のプライマーを用いてqPCRを実施する:
あらゆるDNA−リガンドコンジュゲートの第1コーディング領域を増幅するための、第1コーディング領域プライマーAおよび第1コーディング領域プライマーB;ならびに
第1コーディング領域の異なる第1部分、または第1部分および第4部分にアニールする、多数の異なるプライマーA−xN、ならびに第1コーディング領域の異なる第3部分にアニールする多数の異なるプライマーB−yN;その際、A−xNは5’−末端においてx個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーAと同一の長さを有し、Bは5’−末端においてy個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーB−yNと同一の長さを有し、NはA、T、GまたはCを表わし、xおよびyはそれらのプライマーの3’−末端におけるA、T、GまたはCのいずれかの総数を表わし、その際、xは6から10、好ましくは8までの整数であり、yは2から6、好ましくは4までの整数である;ならびに
あらゆるDNA−リガンドコンジュゲートの第2コーディング領域を増幅するための、第2コーディング領域プライマーCおよび第2コーディング領域プライマーD;ならびに
第2コーディング領域の異なる第1部分、または第1部分および第4部分にアニールする、多数の異なるプライマーD−yN、ならびに第2コーディング領域の異なる第3部分にアニールする多数の異なるプライマーC−xN;その際、プライマーC−xNは5’−末端においてx個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーCと同一の長さを有し、プライマーD−yNは5’−末端においてy個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーDと同一の長さを有し、NはA、T、GまたはCを表わし、xおよびyはそれらのプライマーの3’−末端におけるA、T、GまたはCのいずれかの総数を表わし、その際、xは6から10、好ましくは8までの整数であり、yは2から6、好ましくは4までの整数である;
あらゆるDNA−リガンドコンジュゲートの第3コーディング領域を増幅するための、第3コーディング領域プライマーEおよび第3コーディング領域プライマーF;ならびに
第3コーディング領域の異なる第1部分にアニールする多数の異なるプライマーE−xN、および第3コーディング領域の異なる第3部分にアニールする多数の異なるプライマーF−yN;その際、プライマーE−xNは5’−末端においてx個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーEと同一の長さを有し、プライマーF−yNは5’−末端においてy個のヌクレオチドを短縮することによるコーディング領域プライマーFと同一の長さを有し、NはA、T、GまたはCを表わし、xおよびyはそれらのプライマーの3’−末端におけるA、T、GまたはCのいずれかの総数を表わし、その際、xは6から10、好ましくは8までの整数であり、yは2から6、好ましくは4までの整数である;
ii)各プライマーA−xN、各プライマーB−yN、各プライマーC−xN、各プライマーD−yN、各プライマーE−xNおよび各プライマーF−yNの信号値の積を下記の方程式により計算する:
数値(A−xN)i=信号値[(A−xN)i+B]・信号値[(A−xN)i+(B−xN)i];
数値(B−yN)i=信号値[(B−yN)i+A]・信号値[(B−yN)i+(A−xN)i],
数値(C−xN)i=信号値[(C−xN)i+D]・信号値[(C−xN)i+(D−xN)i],
数値(D−yN)i=信号値[(D−yN)i+C]・信号値[(D−yN)i+(C−xN)i],
数値(E−xN)i=信号値[(E−xN)i+F]・信号値[(E−xN)i+(F−xn)i],
数値(F−yN)i=信号値[(F−yN)i+E]・信号値[(F−yN)i+(E−xN)i],
その際、iは整数であり、特定のプライマーを規定し、“+”記号は2つのプライマーの組合わせを示し;その際、信号値は同一領域にアニールした異なるプライマーを用いたqPCR定量の全セットに関する存在量のパーセントである;そして
iii)プライマー(A−xN)i、(B−yN)i、(C−xN)i、(D−yN)i、(E−xN)iおよび(N−yN)iのそれぞれについて得られた積を比較し、その際、高い数値をもつプライマーはそのDNAエンコードライブラリー中に高い濃度で存在するDNA−リガンドコンジュゲートをコードする;
請求項9〜12のいずれか1項に記載の方法。 - i)各プライマーA−xNおよび各プライマーB−yNについて、各プライマーA−xNおよび各プライマーD−xNについて、各プライマーC−yNおよびD−xNについて、各プライマーA−xNおよびN−yNについて、各プライマーM−xNおよびD−yNについて、ならびに各プライマーM−xNおよびN−yNについて得られた数値の積を下記の方程式により計算する:
数値(A−B)i=数値(A−xN)i・数値(B−yN)i;
数値(A−D)i=数値(A−xN)i・数値(D−yN)i;
数値(C−D)i=数値(C−xN)i・数値(D−yN)i;
数値(A−F)i=数値(A−xN)i・数値(F−yN)i;
数値(E−D)i=数値(E−xN)i・数値(D−yN)i;
数値(E−F)i=数値(E−xN)i・数値(F−yN)i;
ii)各プライマー組合わせiについて、数値(A−B)i、(A−D)i、(C−D)i、(A−F)i、(E−D)iおよび(E−F)iの積を下記の方程式により計算する:
数値i=数値(A−B)i・数値(A−D)i・数値(C−D)i・数値(A−F)i・数値(E−D)i・数値(E−F)i;
iii)得られた積である数値iを比較し、その際、高い数値をもつプライマー組合わせiはそのDNAエンコードライブラリー中に高い濃度で存在するDNA−リガンドコンジュゲートをコードする;
請求項13に記載の方法。 - 下記の計算:
数値i’=log10[数値(A−B)i・数値(A−D)i・数値(C−D)i・数値(A−F)i・数値(E−D)i・数値(E−F)i]
による数値i’の計算を含むことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
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