JP2020027094A - 蛍光検出方法とその蛍光検出を実現するシステム - Google Patents

Abstract

【課題】簡易な構成によって、目的とする蛍光標識を高Ｓ／Ｎ比で検出することを可能とする、蛍光検出システム、および蛍光検出方法を提供する。【解決手段】蛍光検出システムは、所定の伝送情報系列に対してＰＮ符号の符号化方式を適用して得られるＰＮ符号系列によって変調された励起光照射パターンにより励起光を試験片に照射する励起光照射部１７１と、受信情報系列励起光によって受信情報系列試験片にて励起された蛍光を受光する蛍光受光部１７２と、受信情報系列蛍光の受光強度の変化に基づき受光符号系列を特定する受光符号系列特定部と、伝送情報系列と受信情報系列とを照合し、伝送情報系列と受信情報系列とが一致する場合に受信情報系列試験片から受信情報系列励起光照射パターンに応じた蛍光の発光があったと判定する信号処理部とを備える。【選択図】図２

Description

本発明は、蛍光検出システム、イムノクロマトグラフィーデバイス、イムノクロマトグラフィー方法、および蛍光検出方法に関する。

病院・診療所・介護施設・在宅医療といった医療現場においては、臨床検査専門家を要せずに患者にできるだけ近い場所で診断するための検査、すなわちＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ）の必要性が高まっている。ＰＯＣＴによれば、即座に得られる検査情報に基づいて、迅速かつ的確な治療が可能となるからである。そしてＰＯＣＴ用の検査装置として、イムノクロマト法を原理とするイムノクロマトグラフィー装置が、従来から使用されている。

イムノクロマト法は、採取血液・尿・患部組織などの分析対象物（検体）が毛細管現象により多孔質支持体で構成される試験片に浸透する際、金コロイド、カラーラテックス、蛍光物質等の標識抗体と結合し、さらにこの免疫複合体がメンブレン上にライン状固定された捕捉抗体と結合する。この捕捉抗体に結合した最終的な免疫複合体により、標識が付された被験物質が視認可能または可視化可能な集積として検出される。イムノクロマト法は、判定までに要する時間が短く（２０分以下）、迅速な検査が可能であり、また検体を装置に滴下するという簡単な操作のみで測定可能である。

目視よりも高感度で判定を行うことができる方法として、蛍光標識から発せられる蛍光をいわゆる蛍光イムノクロマトリーダにて検出する方法がある。蛍光イムノクロマトリーダでは、捕捉抗体に結合した免疫複合体を検知する際、励起光を試験片に照射する。このとき検体が捕捉され免疫複合体が形成されている場合には、励起光によって蛍光標識から蛍光が発生し、この蛍光の強度を検出器にて検出する。このような蛍光イムノクロマトリーダでは、励起光の照射に伴い、免疫複合体を形成した蛍光標識からの蛍光だけでなく多孔質支持体の自家蛍光や試験片内で免疫複合体を形成せずに存在している蛍光標識等からの不要な蛍光が生じる。このような免疫複合体以外からの蛍光は、バックグラウンドのノイズとなりＳ／Ｎ比を低下させるため、より微少量の被験物質を検出しようとする際の障害となっている。

Ｓ／Ｎ比を向上する方策としては、例えば、燐光を発する物質を用いた時間分解蛍光測定法や、バンドパスフィルタ等により限定した波長領域の光をカットできるフィルタをセンサの前に置いて、多孔質支持体の自家蛍光を取り除く方法等が提案されている。また、特許文献１では、蛍光検出手段としてカラーセンサを用いる手法が提案されている。

特開２０１６−１９１５６７号公報

このように、自家蛍光、残留蛍光といった検出対象波長と同一の蛍光に対しては対策が取られているが、これらのノイズを減少させたとしても、検出器の内部ノイズ、機器ノイズ、外来ノイズといったノイズが残留し、Ｓ／Ｎ比を向上し微小量の被験物質を検出しようとする際の妨げとなっている。そして、同様の課題は、蛍光物質を標識として利用して検出する他の測定手法（例えば、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法）においても、Ｓ／Ｎ比を向上し検出限界を改善しようとする場合に共通して生じるものである。

そこで本発明が解決しようとする課題は、かかる従来技術の問題点をなくし、蛍光標識を高Ｓ／Ｎ比で検出することを可能とする蛍光検出システム、および蛍光検出方法を提供することである。

上記の課題を解決すべく、本発明の実施形態に係る蛍光検出システムは、所定の伝送情報系列に対してＰＮ符号の符号化方式を適用して得られるＰＮ符号系列によって変調された励起光照射パターンにより励起光を試験片に照射する励起光照射部と、励起光によって試験片にて励起された蛍光を受光する蛍光受光部と、蛍光の受光強度の変化に基づき受光符号系列を特定する受光符号系列特定部と、伝送情報系列と受信情報系列とを照合し、伝送情報系列と受信情報系列の相関値が高い場合に試験片から励起光照射パターンに応じた蛍光の発光があったと判定する信号処理部とを備える。

本発明では、蛍光検出システムは、伝送情報系列に対してＰＮ符号の符号化方式を適用して、ＰＮ符号系列を生成するＰＮ符号生成部をさらに備えるとよい。

また、本発明の実施形態に係る蛍光検出方法は、所定の伝送情報系列に対してＰＮ符号の符号化方式を適用して得られるＰＮ符号系列によって変調された励起光照射パターンにより励起光を試験片に照射する工程と、励起光によって試験片にて励起された蛍光を受光する工程と、蛍光の受光強度の変化に基づき受光符号系列を特定する工程と、受光符号系列にＰＮ符号を適用して受信情報系列を得る工程と、伝送情報系列と受信情報系列とを照合し、伝送情報系列と受信情報系列とが相関値が大きい場合に試験片から励起光照射パターンに応じた蛍光の発光があったと判定する工程とを備える。

本発明では、伝送情報系列に対してＰＮ符号の符号化方式を適用して、ＰＮ符号系列を生成する工程をさらに備えるとよい。

蛍光検出システム１の外観を示す模式図である。 蛍光検出システム１の機器内部の簡便な構成例を示す図である。 制御部１５の構成を示す機能ブロック図である。 試験片２の構成を示す模式図である。 蛍光検出システム１の動作手順を示すフローチャートである。

以下、図面を参照して本発明の実施の形態に係る蛍光検出システム１を説明する。本実施形態における蛍光検出システム１は、蛍光物質を標識抗体として使用したイムノクロマト法を原理とする測定機器である、いわゆる蛍光イムノクロマトリーダである。

図１は、蛍光検出システム１の外観を示す模式図である。図１に示されるように、蛍光検出システム１は、表示部１１、操作部１２、挿入部１３、及び印刷部１４を備える。

表示部１１は、制御部１５による制御の下で測定結果等を表示する。表示部１１としては、例えば液晶ディスプレイを用いるとよい。操作部１２は、オペレータが操作するための入力手段である。操作部１２としては、押しボタンスイッチ等の物理的なスイッチを用いてもよいし、表示部１１に重ねて配置されたタッチパネルを用いて表示部１１と協働して実現されるタッチパネルディスプレイとしてもよい。挿入部１３は、試験片２を挿入するための挿入口である。挿入部１３は、例えば、蛍光検出システム１の筐体から着脱可能であり、試験片２の外径に合わせた凹部が設けられたトレイ状に構成され、当該凹部に試験片２を嵌め込んだ状態で挿入部１３を筐体に取り付けることにより、試験片２を蛍光検出システム１の内部の適切な位置に挿入できるように構成するとよい。印刷部１４は、制御部１５による制御の下、測定結果を印刷するプリンタであり、例えば感熱式、インクジェット式等のプリンタを用いるとよい。

図２は蛍光検出システム１の機器内部の簡便な構成例を示す図であり、図３は制御部１５の構成を示す機能ブロック図である。図２に示すように蛍光検出システム１は、制御部１５、光学ユニット保持部１６、光学ユニット１７、及び試験片保持部１８を備える。

光学ユニット保持部１６は、蛍光検出システム１の内部において、光学ユニット１７を保持する。光学ユニット保持部１６は、モータ（不図示）を備え、制御部１５による制御の下で、光学ユニット１７を試験片保持部１８に対して相対的に移動させる。

試験片保持部１８は、蛍光検出システム１の内部において、挿入部１３から挿入された試験片２を、光学ユニット１７と対向する位置に保持する。試験片保持部１８は、モータ（不図示）を備え、制御部１５による制御の下で、試験片２を光学ユニット１７に対して相対的に移動させる。光学ユニット１７と試験片２の位置関係は、光学ユニット保持部１６及び試験片保持部１８が備えるモータによって試験片の長手方向に移動可能とされる。実際に移動するのが光学ユニット１７か試験片か２あるいは両方かは限定されない。

光学ユニット１７は、励起光照射部１７１と蛍光受光部１７２とを備える。励起光照射部１７１は、蛍光標識からの蛍光を励起することのできる波長の励起光を発する光源であり、本実施形態では発光ダイオード（ＬＥＤ）が用いられる。後述するように、励起光照射部１７１は、制御部１５が備えるＰＮ符号発生器１５１が生成するＰＮ符号系列によって変調された励起光照射パターンで励起光を断続的に照射する。励起光照射部１７１として、ＬＥＤ以外の変調されたパターンでの断続的な照射が可能な発光素子（例えばレーザダイオード等）を用いてもよい。また、励起光照射部１７１は、水銀ランプ、ハロゲンランプ及びキセノンランプの断続的な照射が困難な光源に、チョッパ、シャッタ等の照射光を遮断可能な部材を組み合わせて、変調されたパターンで励起光を断続的に照射する構成としてもよい。また、励起光照射部１７１から発せられる光のうち蛍光標識の励起に適した特定の波長成分のみを透過するフィルタを備えていることがより好ましい。

蛍光受光部１７２は、励起された蛍光を受光する受光素子を備える。受光素子としては、例えば光電子増倍管（ＰＭＴ）、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、フォトダイオード（ＰＤ）、ＭＰＰＣ（Ｍｕｌｔｉ−Ｐｉｘｅｌ Ｐｈｏｔｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ）等を用いることが好ましい。光受光部１７２として、これらの高感度の受光素子を用いれば、目視では確認できない微弱な蛍光や非可視光の波長の蛍光を検出することができる。また、検出した蛍光の強度を定量的に測定できることから標的物質の定量も可能となる。蛍光受光部１７２は、受光強度を示すアナログ信号を制御部１５のＡ／Ｄ変換機１５４に出力する。

制御部１５は、蛍光検出システム１の各部の制御を司る。図３に示すように、制御部１５は、ＰＮ符号生成器１５１、ＬＥＤドライバ１５２、Ａ／Ｄ変換器１５３、信号処理部１５４、及びモータ駆動部１５５を備える。制御部１５は、これらの他、表示部１１を制御し測定結果や操作インタフェースを表示させる表示制御部１５６、印刷部１２を制御し測定結果を印刷させる印刷制御部１５７、及び操作部１４に対する入力操作を受け付ける操作インタフェース部１５８を備える。

ＰＮ符号生成部１５１は、ＰＮ符号を生成する。ＰＮ符号は、Ｐｓｅｕｄｏ Ｒａｎｄｏｍ Ｎｏｉｓｅ：疑似ランダム雑音であり、自己相関が大きいことが特徴である符号系列で、デジタル信号における「１」と「０」のビットがほとんどランダムに並んだ信号であり、位相差がないときに自己相関値が大きく、それ以外の位相差がある場合は、自己相関値が小さく、比較する符号列のすべてのビットが一致した時に自己相関値が最も高くなることが特徴であり、この性質を利用する信号処理を相関処理という。図６は、符号長＝ＮビットのＰＮ符号のビットずれ量と相関値の関係を示し、位相差がない場合、あるいは、符号長が符号長の整数倍のとき、相関値が最大となり、それ以外の時は最小となる。ＰＮ符号生成部１５１は、生成したＰＮ符号系列をＬＥＤドライバ１５２に与える。また、ＰＮ符号生成部１５１は、符号化前の伝送情報系列を信号処理部１５４に与える。

ＬＥＤドライバ１５２は、励起光照射部１７１を構成するＬＥＤを駆動する。ＬＥＤドライバ１５２は、ＰＮ符号生成部１５１が生成したＰＮ符号系列によって変調された励起光照射パターンで励起光照射部１７１のＬＥＤを明滅させる。このＰＮ符号生成部１５１が生成した同一のＰＮ符号系列は、信号処理部１５４にも入力される。ＬＥＤドライバ１５２は、励起光照射部１７１、試験片２内の標識物質、及び蛍光受光部１７２が応答可能なレートで変調を行う。

Ａ／Ｄ変換器１５３は、蛍光受光部１７２から受光強度を示すアナログ信号を受け取り、これをデジタル信号に変換して受信符号系列として信号処理部１５２に供給する。Ａ／Ｄ変換部１５３は、本発明における受光符号系列特定部の一例であり、蛍光の受光強度の変化に基づき受光符号系列を特定する。Ａ／Ｄ変換器１５４は、ＬＥＤドライバ１５２による変調レートと同一またはそれ以上のレートでＡ／Ｄ変換を行う。

信号処理部１５４は、Ａ／Ｄ変換器１５４から受信符号系列を受け取り、それとこのＰＮ符号生成部１５１が生成した同一のＰＮ符号系列との相関値を、否定排他的論理和の演算に基づいて求める処理を行う。このときの信号処理部１５４が、Ａ／Ｄ変換器１５４から受信符号系列は、図７に示す蛍光寿命：長の蛍光がもつ受信符号系列であり、排他的論理和では、図８に示すとおり２つの入力値のどちらか片方が真でもう片方が偽の場合、結果は偽であり、２つの入力値がそれぞれ真、あるいは、偽である場合は、真となる論理演算である。受信情報系列受信情報系列受信情報系列受信情報系列と伝送情報系列とが一致する場合、信号処理部１５４は、励起光に応じた蛍光の発光があった（すなわち被験物質が検体中に含まれていた）という測定結果を示す信号を出力する。信号処理部１５４は、例えばデジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）により構成されるとよい。

モータ駆動部１５５は、光学ユニット保持部１６及び試験片保持部１８が備えるモータを駆動制御する。

上記のように構成される蛍光検出システム１で測定対象とされる試験片２は、標識物質として蛍光物質とするものであれば、一般的なイムノクロマトグラフィー検査法で用いられるものと同様でよく、特に限定されることはない。また、当該試験片に用いられる各種素材についても一般的な部材であればよい。

例えば、試験片２は、図４に示すように、サンプルパッド２１、コンジュゲートパッド２２、メンブレン２３、吸収パッド２４、および支持体（バッキングシート）２５から構成される。

サンプルパッド２１は、患者等から採取した検体が滴下される部位である。検体は、検体を直接、あるいはスポイトや滴下チューブ等で滴下される。サンプルパッド２１に供給された検体は毛細管現象によりコンジュゲートパッド２２へ移行する。

コンジュゲートパッド２２には標識物質が含浸されており、この標識物質がサンプルパッド２１から移行してきた検体中の被験物質（抗原）と結合しつつ当該パッドを通過してメンブレン２３上へと移行する。標識物質として使用される蛍光物質は、ユウロピウム、テルビウム、フルオレセインなどが挙げられるが、これらに限定されない。

メンブレン２３上には、検体中に含まれる被験物質を抗原抗体反応により捕捉する捕捉抗体が塗布されたサンプルライン２３１と、検体がサンプルライン２３１を越えてメンブレン上を展開したことを確認するためのコントロールライン２３２とが設けられる。吸収パッド２４は、メンブレン２３を通過した検体を吸収し保持するパッドである。支持体２５は、サンプルパッド２１、コンジュゲートパッド２２、メンブレン２３、及び吸収パッド２４を背面側から支持する基材である。

続いて、以上のように構成される蛍光検出システム１の動作及び使用方法について説明する。図５は、蛍光検出システム１を用いた蛍光検出方法の手順を示すフローチャートである。

蛍光検出システム１での測定に先立ち、医師、看護師等のオペレータは、被験者から検体を採取する。そして、被験者から採取した検体を試験片２のサンプルパッド２１に滴下する（ステップＳ０１）。コントロールライン２３２が変色し検体がサンプルライン２３１を超えてメンブレン２３に展開されたことを確認後（ステップＳ０２）、オペレータは試験片２を挿入部１３に挿入する（ステップＳ０３）。そして、操作部１２を操作して測定を開始する（ステップＳ０４）。

測定が開始されると、制御部１５はモータ駆動部１５５によりモータを駆動して、光学ユニット１７と試験片２のサンプルライン１３２が設けられた位置とが対向するよう位置合わせを行う（ステップＳ０５）。

続いて、ＰＮ符号生成部１５１が伝送情報系列に対して所定の符号化方式を適用し、ＰＮ符号系列を生成して出力する（ステップＳ０６）。このとき、伝送情報系列は信号処理部１５４に送られ、ＰＮ符号系列はＬＥＤドライバ１５２に送られる。そして、ＬＥＤドライバ１５２が、励起光照射部１７１の光源であるＬＥＤを駆動し、ＰＮ符号系列によって変調された励起光照射パターンに従って明滅する励起光を試験片２のサンプルライン２３１を含む領域に照射させる。

励起光が照射されると、試験片２のサンプルライン２３１に被験物質が捕捉されていない場合には、励起光の明滅に従って蛍光は発光しないが、サンプルライン２３１に被験物質が捕捉されている場合には、励起光の明滅に従って蛍光が発光する。

蛍光受光部１７２は、励起光の明滅に応じて試験片２から発せられる蛍光を受光し、受光強度に応じたアナログ信号をＡ／Ｄ変換器１５３に出力する（ステップＳ０７）。Ａ／Ｄ変換器１５３は、受光強度に応じたアナログ信号をデジタル信号に変換して受信符号系列として信号処理部１５４に供給する（ステップＳ０８）。

信号処理部１５４は、系列に対し受信情報系列を生成する（ステップＳ０９）。そして、信号処理部１５４は、受信情報系列をＰＮ符号生成部１５１から受け取った伝送情報系列と照合し（ステップＳ１０）、演算して両者の符号の相関値が大きい場合には励起光に応じた蛍光の発光があった（すなわち被験物質が検体中に含まれていた）という測定結果を示す信号を出力する。この測定結果に応じて、表示部１１は測定結果を表示し、印刷部は測定結果を印刷する（ステップＳ１１）。

以上で説明した本発明に係る蛍光検出システム１及び蛍光検出方法によれば、信号処理部１５４が受信した蛍光のＰＮ符号とＰＮ符号生成部１５１が生成したＰＮ符号との相関値を演算し、その相関が高ければ、受信情報系列受信情報系列試験片２のサンプルライン２３１に捕捉された被験物質が極微量であり、蛍光の強度が微弱であってノイズの影響により受信符号系列に誤りが混入した場合でも、蛍光の発光があったこと（すなわち被験物質が検体中に含まれていたこと）を検知することができる。

このようにノイズに埋もれてしまうほど微弱が蛍光を検出することができるので、本発明に係る蛍光検出システム１及び蛍光検出方法は、極微量の被験物質を検出することが可能である。したがって、例えば、被験物質が感染後に時間とともに増殖するような性質のものである場合には、感染後の初期段階で被験物質を検出することが可能となる。また、従来と比べて採取する検体の量を少量にすることも可能となる。

このように、本発明に係る蛍光検出システム１及び蛍光検出方法によれば、簡易な構成によって、目的とする蛍光標識を高Ｓ／Ｎ比で検出することが可能となる。

なお、上記に本発明の実施形態を説明したが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。例えば、上記の実施形態では、本発明の蛍光検出システム及び蛍光検出方法を蛍光イムノクロマトリーダに適用する場合を例に説明したが、本発明の蛍光検出システム及び蛍光検出方法は、蛍光物質を標識として利用して検出する他の測定装置・測定手法（例えば、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法）にも適用することが可能である。

また、上記の実施形態では、測定結果として励起光に応じた蛍光の発光があったか否かという定性的な判定の結果を出力したが、蛍光の発光があった場合に、その強度についての定量的な情報も測定結果として出力するようにしてもよい。

また、上記の実施形態では、蛍光検出システムがＰＮ符号生成部を備え、伝送情報系列にＰＮ符号の符号化方式を適用して冗長ビットを付加することによりＰＮ符号系列を生成したが、伝送情報系列が固定である場合にはＰＮ符号生成部を設けなくてもよい。この場合、例えば、予め伝送情報系列とそれを符号化したＰＮ符号系列とを記憶素子等に格納しておき、必要に応じてこれを読みだして使用するようにするとよい。

また、前述の実施形態に対して、当業者が適宜、構成要素の追加、削除、設計変更を行ったものや、各実施形態の特徴を適宜組み合わせたものも、本発明の要旨を備えている限り、本発明の範囲に含有される。

１ 蛍光検出システム
１１ 表示部
１２ 操作部
１３ 挿入部
１４ 印刷部
１５ 制御部
１５１ ＰＮ符号生成器
１５２ ＬＥＤドライバ
１５３ ＡＤ変換器
１５４ 信号処理部
１５５ モータ駆動部
１６ 光学ユニット保持部
１７ 光学ユニット
１７１ 励起光照射部
１７２ 蛍光受光部
１８ 試験片保持部
２ 試験片

蛍光検出システム１の外観を示す模式図である 蛍光検出システム１の機器内部の簡便な構成例を示す図である 制御部１５の構成を示す機能ブロック図である 試験片２の構成を示す模式図である 蛍光検出システム１の動作手順を示すフローチャートである ビットずれ量と相関値 Ｓ／Ｎ比を改善の概念図 真理値表とベン図

Claims (4)

1. 所定の伝送情報系列に対してＰＮ符号の符号化方式を適用して得られるＰＮ符号系列によって変調された励起光照射パターンにより励起光を試験片に照射する励起光照射部と、
   前記励起光によって前記試験片にて励起された蛍光を受光する蛍光受光部と、
   前記蛍光の受光強度の変化に基づき受光符号系列を特定する受光符号系列特定部と、
   前記伝送情報系列と前記受信情報系列とを照合し、前記伝送情報系列と前記受信情報系列の相関値が最大となる場合に前記試験片から前記励起光照射パターンに応じた蛍光の発光があったと判定する信号処理部と
   を備えることを特徴とする蛍光検出システム。
2. 前記伝送情報系列に対してＰＮ符号の符号化方式を適用して、ＰＮ符号系列を生成するＰＮ符号生成部をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出システム。
3. 所定の伝送情報系列に対してＰＮ符号の符号化方式を適用して得られるＰＮ符号系列によって変調された励起光照射パターンにより励起光を試験片に照射する工程と、
   前記励起光によって前記試験片にて励起された蛍光を受光する工程と、
   前記蛍光の受光強度の変化に基づき受光符号系列を特定する工程と、
   受信情報系列
   前記伝送情報系列と前記受信情報系列とを照合し、前記伝送情報系列と前記受信情報系列とが一致する場合に前記試験片から前記励起光照射パターンに応じた蛍光の発光があったと判定する工程と
   を備える蛍光検出方法。
4. 前記伝送情報系列に対してＰＮ符号の符号化方式を適用して冗長ビットを付加することにより、ＰＮ符号系列を生成する工程をさらに備えることを特徴とする請求項３に記載の蛍光検出方法。